特許 6808210 抗肥満用組成物及びこれを用いた抗肥満用サプリメント及び抗肥満用飲料

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6808210

(24)【登録日】2020年12月11日

(45)【発行日】2021年1月6日

(54)【発明の名称】抗肥満用組成物及びこれを用いた抗肥満用サプリメント及び抗肥満用飲料

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/07 20060101AFI20201221BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20201221BHJP

   A23L 2/52 20060101ALI20201221BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20201221BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/07

   A61P3/04

   A61K9/14

   A61K9/20

   A61K9/16

   A61K9/48

   A61K9/08

   A61K9/06

   A23L2/00 F

   A23L33/135

【請求項の数】4

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2016-82424(P2016-82424)

(22)【出願日】2016年4月15日

(65)【公開番号】特開2017-190317(P2017-190317A)

(43)【公開日】2017年10月19日

【審査請求日】2019年4月3日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第６回越後白雪茸研究会 平成２７年度通常総会、平成２７年１０月１７日 〔刊行物等〕 掲載年月日：平成２７年１１月１３日 掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｅｃｈｉｇｏｓｈｉｒａｙｕｋｉｄａｋｅ．ｃｏｍ／ｂｌｏｇ／ａｒｃｈｉｖｅｓ／２４５ ：ｈｔｔｐ：／／ｅｃｈｉｇｏｓｈｉｒａｙｕｋｉｄａｋｅ．ｃｏｍ／ｂｌｏｇ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１５／１１／４３ｄ７ｆ４０２ｆ３７ｆ６３１ｆ６６５５０４ｂ８８４ｄｅ８６４ｃ．ｐｄｆ

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-10011

(73)【特許権者】

【識別番号】503360159

【氏名又は名称】マイコロジーテクノ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100101236

【弁理士】

【氏名又は名称】栗原 浩之

(74)【代理人】

【識別番号】100166914

【弁理士】

【氏名又は名称】山▲崎▼ 雄一郎

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 眞治

(72)【発明者】

【氏名】小西 徹也

(72)【発明者】

【氏名】渡辺 哲男

【審査官】 岩下 直人

(56)【参考文献】

【文献】 再公表特許第２００４／０９７００７（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 再公表特許第２００８／１２９９９６（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−１０２２８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−３３２３３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biol. Pharm. Bull.，２００８年，Vol.31, No.1，p.111-117

【文献】 大城 華，ファム ティ ベトゥ，石井 貴広，多和田 眞吉，２Ｅ２３ｐ１７ ヘンナの抗肥満および抗糖尿病効果，日本農芸化学会２０１５年度大会講演要旨集（オンライン） Proceedings (online) of the Annual Meeting 2015 Okayama of Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry，公益社団法人日本農芸化学会 JSBBA，２０１５年

【文献】 Int. J. food Nutr.，２０１０年，Vol.61, No.7，p.713-721

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／０７

Ａ２３Ｌ ２／５２

Ａ２３Ｌ ３３／１３５

Ａ６１Ｋ ９／０６

Ａ６１Ｋ ９／０８

Ａ６１Ｋ ９／１４

Ａ６１Ｋ ９／１６

Ａ６１Ｋ ９／２０

Ａ６１Ｋ ９／４８

Ａ６１Ｐ ３／０４

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１の菌糸塊及びその抽出組成物から選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする抗肥満用組成物。

【請求項2】

粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状及びゲル状から選択される何れかの形態であることを特徴とする請求項１に記載の抗肥満用組成物。

【請求項3】

バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１の菌糸塊及びその抽出組成物から選択される少なくとも１種を含有する抗肥満用組成物を含むことを特徴とする抗肥満用サプリメント。

【請求項4】

バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１の菌糸塊及びその抽出組成物から選択される少なくとも１種を含有する抗肥満用組成物を含むことを特徴とする抗肥満用飲料。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗肥満用組成物及びこれを用いた抗肥満用サプリメント及び抗肥満用飲料に関する。

【背景技術】

【0002】

古来より、きのこ類は独特の風味や香りを有する食材として汎用されると共に、免疫力の向上、抗菌、体調リズムの調節、老化防止等の生理機能活性化作用等を有するとして漢方薬又はある種の疾患の民間薬としても用いられてきた。また、きのこに関する薬効成分の研究も進歩してきており、抗菌・抗ウイルス作用、強心作用、血糖降下作用、コレステロール低下作用、抗血栓作用、血圧降下作用を示す成分が見出されている。そして、本出願人は、新規なきのこであるバシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１の抽出組成物（以下、「ＢＸ抽出組成物」という。）について、以前に出願した（特許文献１参照）。ＢＸ抽出組成物は、多量の多糖類（β−Ｄ−グルカン）が含まれており、抗酸化力が高く、ＯＨラジカル消去活性を有しているため、老化防止等の効能が期待できるものである。また、ＢＸ抽出組成物は、免疫調整効果を有しているため、免疫賦活剤等として用いて好適なものである。また、本出願人は、ＢＸ抽出組成物を用いた、アトピー性疾患の治療・予防に対して優れた効果を有するアトピー性疾患組成物についても、以前に出願した（特許文献２参照）。

【0003】

ところで、近年、肥満の健康被害に対する国際的な取り組みの中で、日常生活において手軽に摂取可能なサプリメントや飲料等が、肥満予防対策の一つとして注目されている。しかしながら、特許文献１，２には、ＢＸ抽出組成物の抗肥満効果については全く記載されておらず、肥満の予防対策については、全く考慮されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２００４／０９７００７号パンフレット

【特許文献2】特開２００７−１０９４４９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、このような事情に鑑み、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１の抽出組成物を用いた抗肥満用組成物及びこれを含有する抗肥満用サプリメント及び抗肥満用飲料を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成する本発明の第１の態様は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１の菌糸塊及びその抽出組成物から選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする抗肥満用組成物にある。

【0007】

本発明の第２の態様は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状及びゲル状から選択される何れかの形態であることを特徴とする第１の態様に記載の抗肥満用組成物にある。

【0008】

本発明の第３の態様は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１の菌糸塊及びその抽出組成物から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する抗肥満用組成物を含むことを特徴とする抗肥満用サプリメントにある。

【0009】

本発明の第４の態様は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１の菌糸塊及びその抽出組成物から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する抗肥満用組成物を含むことを特徴とする抗肥満用飲料にある。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１を培養した菌糸塊又はその抽出組成物若しくは抽出残渣を含有する抗肥満組成物、又は当該組成物を含有させたサプリメントや飲料等を摂取することにより、肥満を予防及び防止することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】試験例１の測定結果であり、（ａ）は１日あたりの平均摂餌量の推移の測定結果であり、（ｂ）は累積摂餌量の測定結果である。

【図2】試験例１の測定結果であり、（ａ）は平均体重の推移の測定結果であり、（ｂ）は試験期間終了時の平均体重の測定結果である。

【図3】試験例２の測定結果であり、（ａ）は血漿中中性脂肪濃度の測定結果であり、（ｂ）は血漿中総コレステロール濃度の測定結果であり、（ｃ）は血漿中ＨＤＬ−コレステロール濃度の測定結果であり、（ｄ）は血漿中ＬＤＬ−コレステロール濃度の測定結果である。

【図4】試験例２の測定結果であり、（ａ）は血漿中ＡＳＴ濃度の測定結果を示しており、（ｂ）は血漿中ＡＬＴ濃度の測定結果を示しており、（ｃ）は血漿中ＬＤＨ濃度の測定結果を示している。

【図5】試験例３の測定結果であり、（ａ）は腸間膜脂肪の平均重量の測定結果であり、（ｂ）は精巣上体周囲脂肪の平均重量の測定結果であり、（ｃ）は腎臓周囲脂肪の平均重量の測定結果であり、（ｄ）は内臓脂肪の平均重量の測定結果である。

【図6】試験例４の測定結果であり、（ａ）は摂餌試験期間中の累積摂餌量の測定結果を示しており、（ｂ）は摂餌試験期間中の累積摂取カロリーの測定結果を示している。

【図7】試験例４の測定結果であり、（ａ）はＢＸ群の体重の推移の測定結果を示しており、（ｂ）はＢＸ−Ｅｘ．群の体重の推移の測定結果を示しており、（ｃ）はＢＸ−Ｒｅｓ．群の体重の推移の測定結果を示している。

【図8】試験例４の測定結果であり、摂餌試験終了時における各群の平均体重の測定結果である。

【図9】試験例５の測定結果であり、（ａ）は２４時間の糞排泄量の測定結果であり、（ｂ）は糞中の総脂質濃度の測定結果であり、（ｃ）は糞中の中性脂肪濃度の測定結果である。

【図10】試験例６の測定結果であり、（ａ）は腸間膜脂肪の重量の測定結果であり、（ｂ）は精巣上体周囲脂肪の重量の測定結果であり、（ｃ）は腎臓周囲脂肪の重量の測定結果であり、（ｄ）は内臓脂肪の重量の測定結果である。

【図11】試験例７の測定結果であり、（ａ）は血漿中ＡＳＴ濃度の測定結果を示しており、（ｂ）は血漿中ＡＬＴ濃度の測定結果を示しており、（ｃ）は血漿中ＬＤＨ濃度の測定結果を示している。

【図12】試験例７の測定結果であり、（ａ）は肝臓中の総脂質量の測定結果であり、（ｂ）は肝臓中の中性脂肪量の測定結果であり、（ｃ）は肝臓中の総コレステロール量の測定結果である。

【図13】試験例７の肝臓の組織的観察を行った結果であり、（ａ）はＣｏｎｔ．群の肝臓の組織像であり、（ｂ）はＨＦＨＳ群の肝臓の組織像であり、（ｃ）はＢＸ群の肝臓の組織像であり、（ｄ）はＢＸ−Ｅｘ．群の肝臓の組織像であり、（ｅ）はＢＸ−Ｒｅｓ．群の肝臓の組織像である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明の抗肥満組成物は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）を培養した菌糸塊（以下、「ＢＸ菌糸塊」という。）、又は、バシディオマイセテスＸを培養した菌糸塊の抽出組成物（以下、「ＢＸ抽出組成物」という。）若しくは抽出残渣（以下、「ＢＸ抽出残渣」という。）を有効成分として含有する。

【0015】

ここで、本発明でいうバシディオマイセテスは、担子菌であり、嘴状突起（クランプ）は観察されるが、担子器形成能を有しないという特性を有しており、他の担子菌と区別される。即ち、培養しても、担子器を形成せずに、菌核（菌糸塊）を形成するだけである。かかるバシディオマイセテスは、菌を自然界から探索した結果得たものであり、単離し、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）として独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ） ＮＩＴＥ特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１）。

【0016】

このバシディオマイセテスＸは、分生子を形成しない、即ち、無性世代を有しないものである。例えば、ポテトグルコース寒天培地で培養すると、培養菌糸は、クランプを有し、平滑であるが、分生子を形成せず、子実体を形成しない。コロニー表面の形状色調を観察すると、コロニー内に淡桃色菌糸塊を形成しており、植菌部位から同心円状に生長したコロニー内に複数の菌糸塊を形成した場合、菌糸塊相互は菌糸束により連結される。なお、コロニーの裏面の色調は淡桃色である。また、グルコース・ドライイースト寒天培地で培養すると、培養菌糸はクランプを有し、平滑であるが、分生子を形成せず、子実体を形成しない。コロニー表面の形状色調を観察すると、コロニー内に淡桃〜白色の菌糸塊を形成し、植菌部位を中心とするように厚さ５ｍｍ〜６ｍｍの菌糸塊を形成している。なお、コロニーの裏面の色調は、淡桃〜白色である。

【0017】

バシディオマイセテスＸの最適生育条件は、例えば、ｐＨ５．０〜６．０で、温度２２℃〜２６℃である。また、生育範囲は、例えば、ｐＨ４．０〜７．５で、温度５℃〜３０℃である。

【0018】

また、バシディオマイセテスＸは、上述したように一般的な方法により培養でき、培養方法は特に限定されるものではないが、例えば、適当な栄養源を添加して滅菌した寒天培地、おがくず培地、液体培地等に、培養済の菌株或いは種菌を無菌的に植菌し、適温条件下で培養することにより、バシディオマイセテスＸの菌糸塊を得ることができる。なお、バシディオマイセテスＸを培養すると、培養した環境に応じて菌糸塊を形成する。

【0019】

このようなＢＸ菌糸塊を、必要に応じて乾燥し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状、ゲル状等にすることにより、本発明の抗肥満組成物となる。

【0020】

また、上記ＢＸ菌糸塊から細胞内容物を抽出したＢＸ抽出組成物又はＢＸ抽出残渣を、本発明の抗肥満組成物の有効成分としてもよい。ＢＸ菌糸塊からの抽出方法は特に限定されない。例えば、ＢＸ菌糸塊から細胞内容物を効率よく抽出するには、好適には、必要に応じてＢＸ菌糸塊を凍結する等して細胞壁に損傷を与えて解凍した後、ミキサー等により破砕し、エキスを抽出する。エキス（ＢＸ抽出組成物）の抽出も特に限定されないが、水、低級アルコール等、更には、酸、アルカリ、その他の添加剤を添加した抽出液を用いて常温又は加熱条件下、又は加圧下にて抽出する。一般的には、熱水で煮出して抽出するか、或いは、水又はアルコールやアルカリを添加した水と破砕物を混合した状態で、例えば、１００ＭＰａ〜７００ＭＰａ程度、好ましくは、３００ＭＰａ〜６００ＭＰａ程度加圧して抽出するのがよい。

【0021】

ここで、抽出方法の一例を説明する。まず、例えば、凍結しているＢＸ菌糸塊を常温解凍し、ミキサーを用いて破砕し、破砕したＢＸ菌糸塊と抽出溶媒である水との割合を、例えば、１：５程度とし、例えば、破砕ＢＸ菌糸塊５０ｇをガラス瓶に入れ、水２５０ｍｌを加えて蓋を締め、これを鍋の底にタオルを敷いた上に水を注ぎ、破砕ＢＸ菌糸塊の入ったガラス瓶を置いて加熱・沸騰させる。沸騰してから９０分間加熱を継続し、冷却後固液分離し、抽出液（ＢＸ抽出組成物）及び残渣（ＢＸ抽出残渣）を得る。抽出液のｐＨは例えば、６．３〜６．５を示す。

【0022】

このように得た抽出液は、必要に応じて濃縮し、ＢＸ菌糸塊から抽出したＢＸ抽出組成物とする。なお、エキスの濃縮は特に限定されないが、例えば、以下のように行う。

【0023】

得られた抽出液をビーカーに移し、加熱・蒸発させて濃縮する。このとき、抽出液は淡いベージュ色から褐色を呈するようになり、盛んに発泡をはじめるようになるが、更に蒸発・濃縮を継続し、例えば、ｐＨ４．９、密度１．２５ｇ／ｃｍ^３のタール状となった時点で、濃縮を終了させる。この濃縮エキスは、醤油様の芳香を発する。なお、この時点における、ＢＸ菌糸塊からの濃縮エキスの収率は平均１２％である。このように得た濃縮エキスは冷却するに従い、粘性が非常に高まるため、濃縮終了と同時に保存容器に移す必要がある。また、保存容器に移した濃縮エキスは、そのまま冷却後、冷凍・凍結保存とするのが好ましい。

【0024】

このＢＸ菌糸塊から抽出したＢＸ抽出組成物又はＢＸ抽出残渣を、必要に応じて乾燥し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状、ゲル状等にしたものが、本発明の抗肥満組成物である。また、ＢＸ菌糸塊から抽出したＢＸ抽出組成物又はＢＸ抽出残渣そのものを、本発明の抗肥満組成物としてもよい。なお、抗肥満組成物中の、ＢＸ菌糸塊から抽出したＢＸ抽出組成物又はＢＸ抽出残渣の含有割合は、用途に応じて適宜設定すればよく、特に限定されない。

【0025】

本発明の抗肥満組成物は、上記の粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状、ゲル状等の形態でサプリメント等の食品に含有することができ、或いは、本発明の抗肥満組成物を飲料に含有することもできる。なお、サプリメント及び飲料中の、ＢＸ菌糸塊から抽出したＢＸ抽出組成物又はＢＸ抽出残渣の含有割合は、必要に応じて適宜設定すればよく、特に限定されない。勿論、ＢＸ菌糸塊そのものを、上記食品や飲料等に含有することもできる。

【0026】

本発明の抗肥満組成物は、ＢＸ菌糸塊、又は、そのＢＸ抽出組成物若しくはＢＸ抽出残渣を有するため、後述する実施例に示すように、肥満を予防及び防止するために用いることができる。これは、ＢＸ菌糸塊、ＢＸ抽出組成物又はＢＸ抽出残渣が、体内代謝を促進させ、或いは、摂取物由来の脂質の吸収を阻害するように機能するためと推測される。このため、本発明の抗肥満組成物の投与により、肥満を予防及び防止することができる。

【0027】

即ち、本発明の肥満防止方法は、上述した抗肥満組成物を、摂取させることにより肥満を防止するものである。当該方法では、摂取方法に特に制限はなく、肥満の程度や肥満に由来する諸症状等に合わせて有効量を適宜決定し、内服又は外用することができるが、日常生活において手軽に摂取可能であることから、経口摂取させることが好ましい。また、摂取条件としては、例えば、ＢＸ菌糸塊を乾燥して粉末化し、打錠して１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度、好ましくは２００ｍｇ〜３００ｍｇの錠剤としたものを、１日１回〜３回、好ましくは３回経口摂取する方法が挙げられる。服用期間は特に限定されないが、長期間とすることが好ましく、例えば、１週間以上が好ましく、更に８週間以上が好ましい。

【実施例】

【0028】

以下、本発明を実施例、及び、ＢＸ菌糸塊から抽出したＢＸ抽出組成物の製造例を参照しながら更に具体的に説明する。なお、製造例１〜４でバシディオマイセテスＸの培養例を、製造例５，６で乾燥例を、製造例７〜１１で抽出例を示す。

【0029】

（製造例１）
＜菌糸塊からの分離＞
（１）培地の調製
下記表１に示す配合で、ＰＳＡ培地及びＰＤＡ培地を調製し、試験管又は三角フラスコに分注した後、シリコセン（又は綿栓）を施しオートクレーブにより１２１℃２０分高圧蒸気滅菌した。その後、試験管の場合は、滅菌後熱いうちに傾斜させてスラント（斜面）培地とし、三角フラスコの場合は、そのまま静置してプレート（平面）培地とした。

【0030】

【表1】

【0031】

（２）菌糸塊からの分離
大きめのＢＸ菌糸塊を手で割り、火炎滅菌したメスを冷却させてからバシディオマイセテスＸ断面より切片を切断し、火炎滅菌冷却後のピンセットで、（１）のＰＳＡ培地及びＰＤＡ培地スラントにバシディオマイセテスＸ切片を植菌した。なお操作は、無菌箱又はクリーンベンチ内の、無菌処理済み条件下で行った。

【0032】

（３）培養
２４℃条件下でインキュベーターにおいて培養させたところ、２４時間〜４８時間後には発菌した。発菌後、２４℃条件下で培養を継続すると、１４日間でＡｇａｒ培地上に菌糸が生育した。

【0033】

（製造例２）
＜菌糸塊生産のためのおがくず培地による培養＞
（１）種菌の培養
おがくず１Ｌ、脱脂ぬか１５ｇ、ふすま１５ｇ及びサンパール（菌糸活性剤・日本製紙製）５ｇに、水を加えて十分に攪拌し、培地を強く握って水がにじむ程度（湿式含水率７０％程度）として、おがくず培地を調製した。この培地を三角フラスコに入れ、シリコセンを施した後、オートクレーブにより１２１℃４０分高圧蒸気滅菌した。滅菌後２４時間後に、製造例１のスラントにて培養中のバシディオマイセテスＸ菌糸を無菌箱内にて無菌操作によっておがくず培地に植菌した。なお、植菌は滅菌三角刀でスラントの一部を切除するようにし、菌糸にダメージを与えないよう行った。また、植菌の密度は、おがくず培地表面積の２０％〜３０％とした。２４℃条件下で培養したところ３日後（遅くとも５日後）に発菌し、３０日後には三角フラスコおがくず培地に菌糸が充満した。

【0034】

（２）菌糸塊の発生
（１）と同様にしたおがくず培地を調製し、この培地をポリプロピレン製ビンに入れ、フタをして、オートクレーブにより１２１℃４０分高圧蒸気滅菌した。滅菌後２４時間後、無菌処理済みの無菌箱内において無菌操作により、（１）で培養した種菌をポリプロピレン製ビンのおがくず培地に植菌した。なお、植菌の密度は、おがくず培地表面積がほぼ覆われる程度とした。２４℃条件下で培養したところ、４８時間後に発菌し、６０日後にはポリプロピレン製ビン内のおがくず培地全体に菌糸が充満した。更に４０〜５０日経過すると、ポリプロピレン製ビン内壁に菌糸が展開し、菌糸束を形成、更に培養を継続すると菌糸塊を形成した。

【0035】

（製造例３）
＜菌糸塊生産のための液体培地による培養＞
１ｃｍ角としたジャガイモ２００ｇを精製水を用いて煮沸後２０分継続、冷却後、固液分離したジャガイモ浸出液、スクロース２０ｇに蒸留水を全量１Ｌとなるように加え液体培地を調製した。この液体培地を試験管に各５ｍｌに分注し、シリコセンを施し滅菌（１２１℃２０分高圧蒸気滅菌或いは１００℃８時間常圧蒸気滅菌）した。その後、無菌処理済の無菌箱内において無菌操作により、製造例１のスラントにおいて培養中のバシディオマイセテスＸ切片の下端が接するよう植菌した。２４℃条件下で培養したところ、４８時間で発菌し、更に培養を継続すると、液体培地に接するように菌糸塊を形成した。

【0036】

（製造例４）
＜菌糸塊生産のためのＡｇａｒ培地による培養＞
１ｃｍ角としたジャガイモ２００ｇを精製水を用いて煮沸後２０分継続、冷却後、固液分離したジャガイモ浸出液、スクロース２０ｇ及びＡｇａｒ１ｇ（０．１％）に蒸留水を全量１Ｌとなるように加えて、Ａｇａｒ培地を調整した。なお、通常Ａｇａｒ培地は１．５〜２．０（培地１Ｌに対し、１５ｇ〜２０ｇ）のＡｇａｒ添加するが、培養後の菌糸塊と、Ａｇａｒ培地の分離を容易にするため、また液体培地ではバシディオマイセテスＸの切片が沈降しやすいため物理的強度を維持する目的で、０．１％添加する事とした。この０．１％Ａｇａｒ培地を試験管に各５ｍｌに分注し、シリコセンを施した後オートクレーブにより１２１℃２０分間高圧蒸気滅菌した。その後、無菌処理済みの無菌箱内において、製造例１のスラントにおいて培養中のＢＸ菌糸塊から切片を切除し、０．１％Ａｇａｒ培地に無菌操作により植菌した。２４℃条件下で培養すると、４８時間で発菌し更に培養を継続することにより、菌糸塊を形成した。

【0037】

（製造例５）
＜バシディオマイセテスＸ乾燥粉末の製造＞
菌糸の細胞壁に損傷を与え、細胞内容物が浸出することを容易にするため、製造例２で得られた生鮮ＢＸ菌糸塊を冷凍・凍結させ、凍結しているＢＸ菌糸塊を常温解凍し、ミキサーを用いて破砕したものを乾燥して粉末に加工し、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末（以下、「ＢＸ乾燥粉末」という。）とした。

【0038】

（製造例６）
＜バシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末の水抽出による製造＞
製造例５で得られたＢＸ乾燥粉末（乾燥重量２０ｇ）を計りとり、水１００ｍｌを加えた後、適宜撹拌しながら４〜６時間静置培養した。その後、吸引濾過により固形物（以下、「ＢＸ抽出残渣」という。）を除いた後に密封、冷蔵庫に保存したものをＢＸ抽出組成物（固形分：８．０％）とした。さらにＢＸ抽出組成物に対して、ＢＸ抽出組成物固形分量（ｋｇ）と等量のデキストリンを混合した（固形分：１４．７％）。最後に−４０℃で予備凍結の後、フリーズドライ（以下、「ＦＤ」という。）乾燥に供し、バシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末（以下、「ＢＸ抽出物乾燥粉末」という。）とした。

【0039】

（製造例７）
＜濃縮ＢＸ抽出組成物の煮出しによる製造＞
菌糸の細胞壁に損傷を与え、細胞内容物が浸出することを容易にするため、生鮮ＢＸ菌糸塊を冷凍・凍結させ、凍結しているＢＸ菌糸塊を常温解凍し、ミキサーを用いて破砕した。破砕ＢＸ菌糸塊５０ｇをガラス瓶に入れ、水２５０ｍｌを加えて蓋を締め、鍋の底にタオルを敷いた上に水を注ぎ、破砕菌糸塊の入ったガラス瓶を置いて加熱・沸騰させ、沸騰してから９０分間加熱を継続した。冷却後固液分離し、ＢＸ抽出組成物とＢＸ抽出残渣を得た。なお、抽出液のｐＨは６．３〜６．５であった。

【0040】

得られたＢＸ抽出組成物をビーカーに移し、加熱・蒸発させて濃縮した。ＢＸ抽出組成物は淡いベージュ色から褐色を呈するようになり、盛んに発泡をはじめるようになったが、更に蒸発・濃縮を継続した。ｐＨ４．９、密度１．２５ｇ／ｃｍ^３のタール状となった時点で、濃縮を終了させた。この濃縮ＢＸ抽出組成物は、醤油様の芳香を発した。なお、この時点における、ＢＸ菌糸塊からの濃縮ＢＸ抽出組成物の収率は１２％であった。ＢＸ抽出組成物は冷却するに従い、粘性が非常に高まるため、濃縮終了と同時に保存容器に移し、そのまま冷却後、冷凍・凍結保存した。

【0041】

（製造例８）
＜ＢＸ抽出組成物の煮出しによる製造＞
菌糸の細胞壁に損傷を与え、細胞内容物が浸出することを容易にするため、生鮮ＢＸ菌糸塊を冷凍・凍結させた後、凍結しているＢＸ菌糸塊を常温解凍した。

【0042】

この解凍後のＢＸ菌糸塊（湿重量２０ｇ）を計りとり、０．５ｃｍ角に刻んだものをビーカーに入れ、水１００ｍｌを加えてから、９０℃で弱く煮沸し、溶液が最初の量の１／２になるまで煮詰めた。その後水を加えて元の用量に戻し、ガーゼでろ過して固形物を除いた後に密封、冷蔵庫に保存したものを製造例８のＢＸ抽出組成物とした。

【0043】

（製造例９）
＜ＢＸ抽出組成物の高圧処理による製造＞
製造例７と同様に処理したＢＸ菌糸塊（湿重量２０ｇ）をビニール袋にとり、水１００ｍｌを加えた後、減圧脱気して封入した。これを超高圧装置（神戸製鋼製７００ＭＰａ処理可能タイプ）にセットして、静水圧４００ＭＰａで１０分間処理し、ガーゼろ過し、冷蔵保存したものを製造例９のＢＸ抽出組成物とした。

【0044】

（製造例１０）
＜ＢＸ抽出組成物の高圧処理による製造＞
静水圧６００ＭＰａで処理した以外は、製造例９と同様にして製造した組成物を製造例１０のＢＸ抽出組成物とした。

【0045】

（製造例１１）
＜ＢＸ抽出組成物の高圧処理による製造＞
水１００ｍｌの代わりに０．１％ＫＣｌ水溶液１００ｍｌを用いた以外は、製造例８と同様にして製造した組成物を製造例１１のＢＸ抽出組成物とした。

【0046】

（実施例１）
菌糸の細胞壁に損傷を与え、細胞内容物が浸出することを容易にするため、製造例２で得られた生鮮ＢＸ菌糸塊を冷凍・凍結させ、凍結しているＢＸ菌糸塊を常温解凍し、ミキサーを用いて破砕したものを乾燥して粉末に加工し、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末（以下、「ＢＸ乾燥粉末」という。）とした。

【0047】

（実施例２）
製造例５で得られたＢＸ乾燥粉末（乾燥重量４ｋｇ）を計りとり、水２０Ｌを加えた後、適宜撹拌しながら４〜６時間静置培養した。その後、吸引濾過により固形物（以下、「ＢＸ抽出残渣」という。）を除き、ＢＸ抽出組成物１７．６ｋｇ（固形分：８．０％）を得た。さらにＢＸ抽出組成物に対して、ＢＸ抽出組成物固形分量（ｋｇ）と等量のデキストリン１．４ｋｇを混合した（固形分：１４．７％）。最後に−４０℃で予備凍結の後、ＦＤ乾燥に供し、バシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末（以下、「ＢＸ抽出物乾燥粉末」という。）とした（粉末出来高例２．５１ｋｇ）。

【0048】

（実施例３）
製造例６で得られたＢＸ抽出残渣をＦＤ乾燥して粉末に加工し、バシディオマイセテスＸ抽出残渣乾燥粉末（以下、「ＢＸ抽出残渣乾燥粉末」という。）とした。

【0049】

（試験例１）
試験例１では、Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット４週齢を用いた。２週間の予備飼育後、下記に示す各試験群に分け、下記表２に示す各飼料を経口摂取させて１００日間飼育を行い、各個体の摂餌量及び体重の変化を測定し、その測定結果を図１及び図２に示した。即ち、図１は、平均摂餌量の推移と累積摂餌量の測定結果を示しており、（ａ）は、１日あたりの平均摂餌量の推移の測定結果を示しており、（ｂ）は、試験期間中における累積摂餌量の測定結果を示している。図１に示した通り、ＢＸ群の試験期間中における摂餌量の推移及び累積摂餌量は、ＨＦＨＳ群と比較してほぼ同等であった。図２は、試験期間中における平均体重の推移と試験終了時における平均体重の測定結果を示しており、（ａ）は、各群の試験期間中における平均体重の推移を示しており、（ｂ）は、試験終了時における各群の平均体重の測定結果を示している。図２では、０．０５水準でＨＦＨＳ群に対してＢＸ群が有意ならば「＊」、同様に０．０１水準に対しては「＊＊」と表示した。図２に示した通り、ＢＸ群の体重は、ＨＦＨＳ群と比較して有意に減少した。ＨＦＨＳ飼料とＢＸ飼料は同一のカロリーであることから、ＢＸ乾燥粉末の摂取により体重増加が抑制されることが明らかになった。

【0050】

試験群（各群 ｎ＝９〜１０）
Ｃｏｎｔ．（コントロール）群：ＡＩＮ−９３Ｍ飼料
ＨＦＨＳ群：高脂肪高ショ糖飼料
ＢＸ（バシディオマイセテスＸ）群：５％ＢＸ乾燥粉末（実施例１）＋高脂肪高ショ糖飼料

【0051】

【表2】

【0052】

（試験例２）
試験例２では、試験例１で各個体の摂餌量及び体重の変化を測定した後に、一晩絶食をかけて空腹時の採血を行い生化学検査に供した（各群 ｎ＝８）。これらの結果を図３及び図４に示した。図３は空腹時の血漿成分の測定結果を示しており、（ａ）は中性脂肪濃度を示しており、（ｂ）は総コレステロール濃度を示しており、（ｃ）はＨＤＬ−コレステロール濃度を示しており、（ｄ）はＬＤＬ−コレステロール濃度を示している。図３では、０．０５水準でＣｏｎｔ．群又はＨＦＨＳ群に対してＢＸ群が有意ならば「＊」と表示した。図３に示すように、ＢＸ群では血漿中の中性脂肪濃度がＨＦＨＳ群よりも低い傾向がみられ、総コレステロール及びＬＤＬ−コレステロール濃度ではＨＦＨＳ群と比較して有意に低下した。その一方で、ＨＤＬ−コレステロール濃度には、両者に差が見られなかった。つまり、ＢＸ群では、高脂肪高ショ糖飼料によるＬＤＬ−コレステロールの増加が、実施例１で得られたＢＸ乾燥粉末により、選択的に抑制されたと考えられる。

【0053】

ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）及びＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）の何れも肝臓組織中に存在し、細胞が傷害されると細胞外へ漏出するため（逸脱酵素）、血漿中のこれらの成分の濃度は肝機能の状態を示す重要な指標となる。図４は、肝機能に関わる血液生化学検査の結果を示しており、（ａ）は、血漿中ＡＳＴ濃度の測定結果を示しており、（ｂ）は、血漿中ＡＬＴ濃度の測定結果を示しており、（ｃ）は血漿中ＬＤＨ濃度の測定結果を示している。図４では、０．０５水準でＨＦＨＳ群に対してＣｏｎｔ．群又はＢＸ群が有意ならば「＊」、同様に０．０１水準に対しては「＊＊」と表示した。図４に示すように、ＢＸ群の肝機能パラメータは、ＨＦＨＳ群と比較して有意に減少していた。

【0054】

（試験例３）
試験例３では、試験例２で各試験を行い各個体の体重が回復したことを確認した後に解剖して、内臓脂肪（腸間膜脂肪、精巣上体周囲脂肪、腎臓周囲脂肪）の平均重量の測定を行い（各群 ｎ＝６〜９）、結果を図５に示した。図５は、内臓脂肪平均重量をそれぞれ測定した結果を示しており、（ａ）は、腸間膜脂肪の測定結果を示しており、（ｂ）は、精巣上体周囲脂肪の測定結果を示しており、（ｃ）は、腎臓周囲脂肪の測定結果を示しており、（ｄ）は、内臓脂肪として（ａ）〜（ｃ）の脂肪の合算値の測定結果を示している。図５では、０．０５水準でＣｏｎｔ．群に対してＢＸ群が有意ならば、或いは、ＨＦＨＳ群に対してＣｏｎｔ．群が有意ならば「＊」、同様に０．０１水準でＨＦＨＳ群に対してＣｏｎｔ．群又はＢＸ群が有意ならば「＊＊」と表示した。図５に示すように、ＢＸ群の何れの内臓脂肪についてもＨＦＨＳ群と比較して重量が有意に減少していた。

【0055】

（試験例４）
試験例４では、Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット４週齢を用いた。１週間の予備飼育後、下記に示す各試験群に分け、下記表３に示す各飼料を経口摂取させて１５週間飼育を行い、各個体の摂餌量及び体重の変化を測定し、その測定結果を図６〜図８に示した。即ち、図６は、累積摂餌量と累積摂取カロリーの測定結果を示しており、（ａ）は、摂餌試験期間中の累積摂取量の測定結果を示しており、（ｂ）は、摂餌試験期間中の累積摂取カロリーの測定結果を示している。図７は、体重の推移の測定結果を示しており、（ａ）は、ＢＸ群の体重の推移の測定結果を示しており、（ｂ）は、ＢＸ−Ｅｘ．群の体重の推移の測定結果を示しており、（ｃ）は、ＢＸ−Ｒｅｓ．群の体重の推移の測定結果を示している。図７では、０．０５水準でＨＦＨＳ群に対してＢＸ群又はＢＸ−Ｅｘ．群が有意ならば「＊」、同様に０．０１水準に対しては「＊＊」と表示した。図８は、摂餌試験終了時における各群の平均体重の測定結果を示している。図８では、０．０５水準でＨＦＨＳ群に対してＢＸ群又はＢＸ−Ｅｘ．群が有意ならば「＊」と表示した。図６（ａ）に示した通り、累積摂取量ではＣｏｎｔ．群が多いが、図６（ｂ）に示した通り、カロリーに換算するとＨＦＨＳ群以外はほぼ横ばいであった。また、図７に示した通り、ＢＸ群、ＢＸ−Ｅｘ．群及びＢＸ−Ｒｅｓ．群はＨＦＨＳ群と比較して体重増加を抑制する傾向がみられ、特にＢＸ群とＢＸ−Ｅｘ．群では有意に体重増加を抑制した。また、試験終了時の体重を比較すると、図８に示した通り、体重増加の抑制効果は、ＢＸ−Ｒｅｓ．群がやや弱い傾向にあることがわかった。

【0056】

試験群（各群 ｎ＝８〜１０）
Ｃｏｎｔ．（コントロール）群：標準飼料（改変ＡＩＮ−９３Ｍ）
ＨＦＨＳ群：高脂肪高ショ糖飼料
ＢＸ（バシディオマイセテスＸ）群：５％ＢＸ乾燥粉末（実施例１）＋高脂肪高ショ糖飼料
ＢＸ−Ｅｘ．群：５％ＢＸ抽出物乾燥粉末（実施例２）＋高脂肪高ショ糖飼料
ＢＸ−Ｒｅｓ．群：５％ＢＸ抽出残渣乾燥粉末（実施例３）＋高脂肪高ショ糖飼料

【0057】

【表3】

【0058】

（試験例５）
試験例５では、試験例４で各個体の摂餌量及び体重の変化を測定した後に、各個体の糞排泄量及び糞中に含まれる脂質の分析を行った（各群 ｎ＝８〜１０）。また、これらの試験結果を図９に示した。図９は、糞排泄量の測定及び糞含有脂質濃度の測定を行った結果を示しており、（ａ）は、２４時間の糞排泄量の測定結果を示しており、（ｂ）は、糞中の総脂質濃度の測定結果を示しており、（ｃ）は、糞中の中性脂肪濃度の測定結果を示している。図９では、０．０１水準でＨＦＨＳ群に対してＢＸ−Ｒｅｓ．群が有意ならば「＊＊」と表示した。図９（ａ）に示した通り、各群の２４時間の糞排泄量は差がみられなかった。一方、図９（ｂ）及び（ｃ）に示した通り、ＢＸ−Ｒｅｓ．群の糞中に含まれる中性脂肪はＨＦＨＳ群と比較して有意に高値であり、糞中への中性脂肪の排泄は、主として実施例３で得られたＢＸ抽出残渣乾燥粉末の画分が作用していることがわかった。

【0059】

（試験例６）
試験例６では、試験例５において各個体の糞を採取した後に、解剖を行って内臓脂肪（腸間膜脂肪、精巣上体周囲脂肪、腎臓周囲脂肪）重量の測定を行い（各群 ｎ＝８〜１０）、結果を図１０に示した。図１０は、内臓脂肪重量をそれぞれ測定した結果を示しており、（ａ）は、腸間膜脂肪の測定結果を示しており、（ｂ）は、精巣上体周囲脂肪の測定結果を示しており、（ｃ）は、腎臓周囲脂肪の測定結果を示しており、（ｄ）は、内臓脂肪として（ａ）〜（ｃ）の脂肪の合算値を示している。図１０では、０．０５水準でＨＦＨＳ群に対してＢＸ群又はＢＸ−Ｅｘ．群が有意ならば「＊」と表示した。図１０に示すように、ＢＸ群及びＢＸ−Ｅｘ．群において、ＨＦＨＳ群と比較して有意に内臓脂肪の蓄積を抑制していた。一方、ＢＸ−Ｒｅｓ．群では、ＨＦＨＳ群と比較して内臓脂肪量は減少していたものの、その効果はＢＸ群及びＢＸ−Ｅｘ．群と比較して弱いものであった。

【0060】

（試験例７）
試験例７では肝臓の状態を明らかにするため、肝機能に関わる血液生化学検査を行うと共に、試験例６の解剖時に肝臓を採取し、肝臓中の脂質及びコレステロール量の測定を行い（各群 ｎ＝８〜１０）、その結果を図１１〜図１３に示した。即ち、図１１は、肝機能に関わる血液生化学検査の結果を示しており、（ａ）は、血漿中ＡＳＴ濃度の測定結果を示しており、（ｂ）は、血漿中ＡＬＴ濃度の測定結果を示しており、（ｃ）は血漿中ＬＤＨ濃度の測定結果を示している。図１２は肝臓中の脂質及びコレステロール量の測定結果を示しており、（ａ）は、肝臓中の総脂質量の測定結果を示しており、（ｂ）は、肝臓中の中性脂肪量の測定結果を示しており、（ｃ）は、肝臓中の総コレステロール量の測定結果を示している。図１２では、０．０５水準でＨＦＨＳ群に対してＢＸ群が有意ならば「＊」、０．０１水準でＨＦＨＳ群に対してＢＸ−Ｅｘ．群が有意ならば「＊＊」と表示した。図１３は、ＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行った肝臓の組織的観察を行った結果であり、（ａ）はＣｏｎｔ．群の肝臓の組織像であり、（ｂ）はＨＦＨＳ群の肝臓の組織像であり、（ｃ）はＢＸ群の肝臓の組織像であり、（ｄ）は、ＢＸ−Ｅｘ．群の肝臓の組織像であり、（ｅ）はＢＸ−Ｒｅｓ．群の肝臓の組織像である。

【0061】

図１１及び図１２に示すように、実施例２で得られたＢＸ抽出物乾燥粉末を経口摂取することによって、肝臓中の中性脂肪及びコレステロールの肝臓への蓄積を抑制し、肝機能の低下を抑制することが明らかになった。また、図１３（ａ）に示すように、Ｃｏｎｔ．群は比較的正常に近い細胞であり、細胞全体が赤く染色され、肝細胞の風船状腫大（バルーンニング）は確認されなかった。図１３（ｂ）に示すように、ＨＦＨＳ群は顕著なバルーンニングが確認され、肝細胞内に微細な脂肪滴が集積し、細胞が白っぽく見えた。なお、ＨＥ染色においては、脂肪は染色されないため、細胞内の白く抜けている部分が脂肪である。図１３（ｃ）〜（ｅ）に示すように、（ｃ）のＢＸ群と（ｅ）のＢＸ−Ｒｅｓ．群で若干脂肪の蓄積やバルーンニングが認められたが、ＨＦＨＳ群と比較すると軽微であった。また、（ｄ）のＢＸ−Ｅｘ．群については脂肪肝の所見はほとんど見られず、Ｃｏｎｔ．群と同程度に肝細胞が正常を保っていた。

【0062】

以上の結果より、ＢＸ群、ＢＸ−Ｅｘ．群及びＢＸ−Ｒｅｓ．群の何れも、ＨＦＨＳ飼料によって惹起された肝臓への異常な脂質沈着を抑制し、その効果はエキス（ＢＸ−Ｅｘ．群）において最も高いということが明らかとなった。

【0063】

以上より、実施例１で得られたＢＸ乾燥粉末を経口摂取することによる作用として、（１）内臓脂肪及び肝臓脂質の減少、（２）肝機能の改善が明らかとなった。

【0064】

また、その作用に寄与する機能性成分について、ＢＸ乾燥粉末の分画の効果を調べた結果、実施例２で得られたＢＸ抽出物乾燥粉末を経口摂取することによって、体重の増加を抑制するが、脂質の排泄を促進する作用は弱いことが明らかとなった。その一方で、内臓脂肪の蓄積や肝臓への脂質の蓄積を抑制することが明らかになった。従って、ＢＸ抽出物乾燥粉末には、体内代謝の促進効果があると考えられる。

【0065】

一方、実施例３で得られたＢＸ抽出残渣乾燥粉末を経口摂取することによって、体重の増加を抑制し、体外への脂質の排泄量が増加する傾向にあることが明らかとなった。従って、ＢＸ抽出残渣乾燥粉末には、食餌由来の脂質の吸収阻害効果があると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0066】

本発明の抗肥満組成物は、以上で説明した通り、長期間経口摂取させることによって、抗肥満効果、抗内臓脂肪蓄積効果、肝機能改善効果が期待できる。従って、日常生活で使用可能なサプリメント等の食品や飲料に含有して経口摂取させることにより、高血糖、高血圧、脂質代謝異常等を伴う内臓脂肪型肥満、所謂メタボリックシンドローム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を惹起する主要な疾患である、内臓脂肪型肥満を抑制すると共に、近年問題となっている、非アルコール性脂肪肝の予防及び防止に有用である。

【受託番号】

【0067】

バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】