特許 6808632 黒色腫における疾患進行についてのバイオマーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6808632

(24)【登録日】2020年12月11日

(45)【発行日】2021年1月6日

(54)【発明の名称】黒色腫における疾患進行についてのバイオマーカー

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20201221BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20201221BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20201221BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 D

   G01N33/68

   C12Q1/04ZNA

【請求項の数】11

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2017-544052(P2017-544052)

(86)(22)【出願日】2015年11月5日

(65)【公表番号】特表2017-537148(P2017-537148A)

(43)【公表日】2017年12月14日

(86)【国際出願番号】GB2015053347

(87)【国際公開番号】WO2016075440

(87)【国際公開日】20160519

【審査請求日】2018年11月5日

(31)【優先権主張番号】1419976.4

(32)【優先日】2014年11月10日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】518362812

【氏名又は名称】アムロ・バイオサイエンシーズ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】マリー・ラバス

(72)【発明者】

【氏名】ペニー・ロヴァット

(72)【発明者】

【氏名】ロバート・エリス

【審査官】 中村 浩

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５３６２８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Investigative Dermatology，２０１３年，Vol.133, Suppl，p.S232

【文献】 BMC MEDICAL GENOMICS，英国，２００８年，VOL.1, No.1，p.1-16，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18442402

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ３３／００−３３／９８

Ａ６１Ｋ３１／００−５１／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

AJCCステージ1a、ステージ1b、ステージ2a、ステージ2b、又はステージ2cの黒色腫に罹患している対象の転移リスクが増大しているかどうかを判定するためのインビトロ方法であって、
(i)対象から得た、原発性黒色腫を覆う組織を含む組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現を判定する工程、並びに
(ii)(i)で得られた発現と、参照組織又はそれから得られた参照レベルとを比較する工程、
を含み、
組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が参照組織若しくは参照レベルと比較して低下しているか、又は、組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が喪失していることが、転移リスクの増大の指標であり、
参照組織が、原発性黒色腫に隣接する部位から得られる正常組織である、
方法。

【請求項2】

参照レベルが、正常組織に特徴的なAmbra-1及びロリクリンの発現レベルである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】

組織試料が、原発性黒色腫を覆う組織、及び原発性黒色腫に隣接する正常な表皮の一部を含む、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】

組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が、それぞれの参照レベルの25から75%である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が、それぞれの参照レベルの25%未満であり、場合により、組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が、視覚的評価又は自動スライドスキャナーによって判定される、請求項4に記載の方法。

【請求項6】

組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現を判定する工程が、
組織試料とAmbra-1に特異的な第1のリガンドとを接触させる工程であって、Ambra-1が存在するとAmbra-1-リガンド複合体が生じる工程、
組織試料とロリクリンに特異的な第2のリガンドとを接触させる工程であって、ロリクリンが存在するとロリクリン-リガンド複合体が生じる工程、並びに
Ambra-1-リガンド複合体及びロリクリン-リガンド複合体を検出及び/又は定量する工程
を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

組織試料の第1の切片と第1のリガンドとを接触させる工程、及び組織試料の第2の切片と第2のリガンドとを接触させる工程を含む、請求項6に記載の方法。

【請求項8】

組織試料が、原発性黒色腫を覆う腫瘍周辺表皮の少なくとも一部を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

組織試料が、原発性黒色腫を覆うケラチン生成細胞を含み、且つ、方法が、ケラチン生成細胞におけるAmbra-1及びロリクリンの発現を判定する工程を含み、場合により、対象がヒト又は動物である、請求項8に記載の方法。

【請求項10】

請求項1から9のいずれか一項に記載の方法において使用するための、黒色腫に罹患している対象の転移発症リスクの増大を予測するためのキットであって、
Ambra-1に特異的な第1のリガンド、及び
ロリクリンに特異的な第2のリガンド
を含むキット。

【請求項11】

第1のリガンドが抗-Ambra-1抗体若しくはアプタマーを含み、及び/又は、第2のリガンドが抗-ロリクリン抗体若しくはアプタマーを含み、場合により、キットが、少なくとも1つの捕捉剤を更に含み、少なくとも1つの捕捉剤が検出部分並びに第1の及び/又は第2のリガンドに特異的な結合部分を含む、請求項10に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、とりわけ、黒色腫の治療において用いるための治療剤、黒色腫に罹患している対象における転移リスクの増大を診断する方法、このような対象を治療する方法、診断アッセイ、及びキットに関する。更に具体的には、特定の実施形態において、本発明は、黒色腫に罹患している対象の転移リスクが増大しているかどうかを、対象から得た組織試料におけるAmbra-1及びロリクリン(Loricrin)の発現を判定することによって同定することに関する。

【背景技術】

【0002】

黒色腫は、全ての皮膚癌のわずか2.3%にすぎないが、最も生命に関わる形態であり、皮膚癌による死亡の75%超を占める。皮膚黒色腫は、現在、世界中で発生率が上昇し、毎年英国だけで2000を超える人の命を奪っていることから、公衆衛生上の主要な懸案事項となっている。増大率は、あらゆる他の癌よりも高く、それは流行病に例えられている。増大の一部は、サーベイランスの向上、及び早期の検出、並びに診断基準の変化に起因し得るが、増大の大部分は実質的なものであると考えられている。増大は、日光への暴露の増加及び/又は人工サンベッドの使用の増大に関連している。

【0003】

欧州の、年齢を標準化した発生率は、ここ30年で女性では4倍、男性では7倍増大している。黒色腫は、今や英国で5番目に一般的な癌であり、全ての新たな癌症例の4%に相当する。死亡率もまた増大しているが、その割合は発生率よりも格段に低く、そのため、患者症例に対する死亡の割合は、ここ50年で着実に低下している。それでも、黒色腫は、毎年世界中で5万件近くの死亡に相当する。

【0004】

予後に影響する因子には、ミリメートル単位の腫瘍の厚さ(ブレスローの厚さ)、皮膚構造に関連する深さ(クラークレベル)、黒色腫のタイプ、転移の存在、及び潰瘍の存在が含まれる。原発性黒色腫が診断の時点で表皮潰瘍を示す場合、非潰瘍性腫瘍と比較して高い転移率及び不良な転帰が予測される。しかし、潰瘍の根本的な仕組みは依然として不可解なままである。

【0005】

早期(AJCCステージ1a又は1b)黒色腫の治療は、広範囲局所切除として知られている、黒色腫の周辺組織の除去を伴う。この後、典型的には、疾患の再発について患者の定期検診を1〜5年の期間にわたり行う。化学療法等の治療法は、早期黒色腫の患者には行われない。

【0006】

より厚い腫瘍(AJCCステージ2a、2b、又は2c)を有する患者では、広範囲局所切除の後に、疾患がリンパ節まで広がっているかどうかを判定するためのセンチネルリンパ節生検が行われ得る。もしリンパ節まで広がっている場合には、リンパ節の切開が行われ得る。黒色腫の再発又は広がりの防止を助ける、外科手術の後の治療は、補助療法として知られている。補助療法は、化学療法又は生物学的療法(例えば、インターフェロン治療)であり得る。しかし、補助療法は、通常、ステージ2の黒色腫を有する患者にのみ、臨床試験の一環として行われる。

【0007】

化学療法、放射線療法、及び/又は生物学的療法は、ステージ2の腫瘍が除去された患者における再発性黒色腫を治療するため、リンパ節に限られた疾患(ステージ3)を有する患者における更なる転移性進行の制御を助けるため、又は進行した転移性疾患(AJCCステージ4)を有する患者における黒色腫を小さくして症候を低減させるために用いられ得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

黒色腫に罹患している患者の治療を向上させること、及び転移への進行の可能性を低下させることが依然として必要である。

【0009】

本発明の一部の実施形態の目的は、先行技術において同定される問題の一部を少なくとも部分的に軽減することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の特定の実施形態の概要
本発明の第1の態様によると、対象から得た組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が低下又は喪失していると同定されている対象における黒色腫の治療において用いるための治療剤が提供される。

【0011】

Ambra-1(ベクリン1調節型自食作用タンパク質1における活性化分子)は、WD40含有タンパク質である。研究によると、Ambra-1は自食作用の制御に関与し、この制御において、Ambra-1は、タンパク質-タンパク質相互作用プラットフォームとして機能すると考えられている。自食作用の間のAmbra-1の主な役割は、自食作用の核形成相の間のPI3Kに富んだ膜の形成に関与するベクリン-1/VPS34複合体のメンバーであることと考えられる。研究によると、Ambra-1はまた、自食作用活性の上流調節因子として直接的に作用することも示唆されている。Ambra-1のアミノ酸配列を図に示す。

【0012】

Ambra-1は、更に、細胞分化において役割を有することが示されている。マウスモデルにおけるAmbra-1の機能不活化は、自食作用の障害及び不安定な細胞増殖に関連する重篤な神経管異常を伴う、子宮内での致死をもたらす。逆に、Ambra-1の過剰発現は神経組織における細胞増殖速度を低下させ、そうして上皮増殖における中心的存在としてのその役割をサポートすることが示されている。

【0013】

ロリクリンはグリシン-セリン-システインに富んだタンパク質であり、これは、ヒトにおいて、LOR遺伝子によってコードされている。LOR遺伝子は、表皮分化複合体と呼ばれる、1番染色体上の遺伝子のクラスターの一部である。これらの遺伝子は、皮膚の外層(表皮)、特にその堅い外表面(角質層)の形成及び維持に関与する。角化として知られているプロセスにおいて形成される角質層は、身体とその環境との間の頑丈なバリアを提供する。角質細胞と呼ばれる、角質層の各細胞は、角化外膜(CE)と呼ばれるタンパク質殻に囲まれている。ロリクリンは角化外膜の主要なタンパク質である。ロリクリンと外膜の他の成分との間の連結は、角質細胞同士をまとめ、角質層に強度が与えられるのを助ける。ロリクリンのアミノ酸配列を図に示す。

【0014】

本発明の第2の態様によると、転移リスクが増大していると同定されている対象における黒色腫の治療において用いるための治療剤であって、リスクの増大の同定が、
(i)対象から得た、原発性黒色腫を覆う組織を含む組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現を判定する工程、並びに
(ii)(i)で得られた発現と、参照組織又はそれから得られたレベルとを比較する工程、
によって判定され、
組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が参照組織若しくはレベルと比較して低下しているか、又は、組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が喪失していることが、対象における転移リスクの増大の指標である、
治療剤が提供される。

【0015】

一部の実施形態において、組織試料と参照とにおけるAmbra-1及びロリクリンの発現の比較が不要でよいことが理解され、それは例えば、発現が喪失していると判定される場合である。したがって、特定の実施形態において、Ambra-1及びロリクリンの発現の低下又は喪失は、発現を参照組織と比較することなく明らかである。

【0016】

本発明の第3の態様によると、黒色腫に罹患し、転移に進行するリスクが増大していると同定されている対象における、転移への進行を予防又はその可能性を低減するために用いるための治療剤であって、前記同定が、その対象の、対象の原発性黒色腫を覆うケラチン生成細胞におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が低下又は喪失していることを判定することを含む、治療剤が提供される。

【0017】

本発明の第4の態様によると、黒色腫を有する対象の転移リスクが増大しているかどうかを判定するためのインビトロ方法であって、
(i)対象から得た、原発性黒色腫を覆う組織を含む組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現を判定する工程、並びに
(ii)(i)で得られた発現と、参照組織又はそれから得られたレベルとを比較する工程、
を含み、
組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が参照組織若しくはレベルと比較して低下しているか、又は、組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が喪失していることが、転移リスクの増大の指標である
方法が提供される。

【0018】

本発明の第5の態様によると、黒色腫に罹患している対象のための治療レジメを決定する方法であって、
a)原発性黒色腫を覆う組織を含む組織試料を対象から得る工程、
b)組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現を判定する工程、
c)(b)で得られた発現と、参照組織又はそれから得られたレベルとを比較する工程、並びに
d)(i)Ambra-1及びロリクリンの発現が正常であるか若しくは増大していれば、標準的な認識されているケアパスウェイに従う、又は
(ii)Ambra-1及びロリクリンの発現が低下若しくは喪失していれば、対象を全身的抗癌治療レジメで治療する工程
を含む方法が提供される。

【0019】

本発明の第6の態様によると、黒色腫に罹患している対象を治療する方法であって、対象から得た組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が低下又は喪失していると同定されている対象に治療剤を投与する工程を含む方法が提供される。

【0020】

本発明の第7の態様によると、黒色腫に罹患している対象を治療する方法であって、
(i)対象から得た、原発性黒色腫を覆う組織を含む組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現を判定する工程、
(ii)(i)で得られた発現と、参照組織又はそれから得られたレベルとを比較する工程、並びに
組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が参照組織若しくはレベルと比較して低下しているか、又は、組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が喪失していれば、治療剤を対象に投与する工程を含む方法が提供される。

【0021】

本発明の第8の態様によると、黒色腫に罹患している対象の転移リスクの増大を予測するためのインビトロアッセイであって、
(i)対象から得た組織試料と、Ambra-1に特異的な第1のリガンドとを接触させる工程であって、Ambra-1が存在するとAmbra-1-リガンド複合体が生じる工程、
(ii)組織試料と、ロリクリンに特異的な第2のリガンドとを接触させる工程であって、ロリクリンが存在するとロリクリン-リガンド複合体が生じる工程、並びに
(iii)Ambra-1-リガンド複合体及びロリクリン-リガンド複合体を検出及び/又は定量する工程
を含む、インビトロアッセイが提供される。

【0022】

対象は、黒色腫に罹患しているヒト又は動物であり得る。一部の実施形態において、対象はヒト患者である。一部の実施形態において、対象は、黒色腫を有すると既に診断されている。

【0023】

一部の実施形態において、対象は、AJCCステージ1、ステージ2、ステージ3、又はステージ4の黒色腫に罹患している。一部の実施形態において、対象は、AJCCステージ1a、ステージ1b、ステージ2a、ステージ2b、又はステージ2cの黒色腫に罹患している。一部の実施形態において、対象は、AJCCステージ1a又はステージ1bの黒色腫に罹患している。一部の実施形態において、本明細書において記載される方法は、対象から得た組織試料内に存在する原発性腫瘍を、AJCCステージングに従ってステージングすることを更に含む。

【0024】

早期黒色腫の治療は、典型的には、腫瘍を切除するための外科手術を伴う。治療法は、通常、その時点では予後が典型的に不良である疾患後期における転移の広がりを制御するために用いられる。早期疾患であるが転移リスクが高いか又は増大しているそれらの対象の同定によって、有利には、治療を適宜適合させることができる。例えば、治療法は、通常投与されるよりも早くこれらの対象に投与され得、それによって、これらの対象の転移を阻害し、予防し、又は遅延させ、及び予後を向上させることができる。

【0025】

したがって、一部の実施形態において、同定前の対象は、治療剤による治療に不適格である。特定の実施形態において、対象は、AJCCステージ3若しくは4の黒色腫に罹患しているか又はAJCCステージ2若しくは3の黒色腫の後に疾患が再発している場合に患者が治療剤で治療されるのみである、黒色腫を治療する先行技術方法と比較して、より早期で又はあまり進行していないステージで治療レジメを提案され得る。

【0026】

一部の実施形態において、対象は、潰瘍性黒色腫を有する。

【0027】

予想外に、本発明者らは、黒色腫を有する対象におけるAmbra-1及びロリクリン両方の発現レベルと転移の可能性との間の相関を同定した。特に、Ambra-1及びロリクリン両方の発現レベルの低下又は発現の喪失が、その対象の転移リスクが増大していることを示すと考えられる。

【0028】

本明細書において用いられる場合、Ambra-1及びロリクリンの発現の低下又は喪失とは、Ambra-1及びロリクリン両方の発現レベルがそれぞれの参照レベルの約75%未満であることを意味することが理解されよう。

【0029】

一部の実施形態において、Ambra-1及びロリクリンの発現の低下とは、Ambra-1及びロリクリン両方の発現レベルがそれぞれの参照レベルの約25から約75%であることを意味することが理解されよう。一部の実施形態において、Ambra-1及びロリクリンの発現の喪失とは、Ambra-1及びロリクリン両方の発現レベルが関連タンパク質の参照レベルの約25%未満であることを意味することが理解されよう。正常な発現とは、Ambra-1及びロリクリン両方の発現がそれぞれの参照レベルの約75%超であることを意味すると理解される。

【0030】

したがって、一部の実施形態において、組織試料におけるAmbra-1の発現レベルは、参照レベルの約25%から約75%である。一部の実施形態において、Ambra-1の発現レベルは、参照レベルの75%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、又は30%以下である。

【0031】

一部の実施形態において、組織試料におけるロリクリンの発現レベルは、参照レベルの約25%から約75%である。一部の実施形態において、ロリクリンの発現レベルは、参照レベルの75%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、又は30%以下である。

【0032】

一部の実施形態において、組織試料におけるAmbra-1及び/又はロリクリンの発現は実質的に喪失している。特定の実施形態において、Ambra-1及び/又はロリクリンの発現は、25%未満である。

【0033】

一部の実施形態において、転移リスクの増大は、7年無転移(「無病」としても知られている)生存率が50%未満、例えば40%未満、例えば30%未満、例えば20%未満、例えば10%未満、又は例えば5%未満であることを意味する。

【0034】

したがって、Ambra-1及びロリクリンは、黒色腫の転移への疾患進行についてのバイオマーカーであると考えられ得る。したがって、本発明の実施形態は、対象における黒色腫の転移への進行を予測するための方法を提供することであると考えられ得る。一部の実施形態において、本発明は更に、原発性黒色腫を覆う組織を含む組織試料における、黒色腫の転移への疾患進行についての予後バイオマーカーとしてのAmbra-1及びロリクリンの使用を提供する。適切には、Ambra-1及びロリクリンは、黒色腫を有する対象を、転移を発症する可能性がより高い対象及び転移を発症する可能性があまり高くない対象に層別化するためのバイオマーカーであると考えられ得る。有利には、本発明の特定の実施形態の方法は、黒色腫を有するどの対象が治療剤での治療の効果を最も得やすいかを同定することを助ける。適切には、本発明の特定の実施形態は、さもなければ治療剤での治療に適していないであろう患者の治療剤での治療を可能にし得る。

【0035】

腫瘍自体におけるバイオマーカーの発現レベルを決定することよりもむしろ、本発明の特定の実施形態の方法は、原発性黒色腫を覆う組織におけるAmbra-1及びロリクリンの発現レベルを決定することを含む。理論に束縛されることなく、これらのタンパク質の発現の低下又は喪失は、腫瘍を覆う表皮、及び、腫瘍の下部にある血管又はリンパ管の内膜を形成している内皮組織の破壊を示し得ると考えられ、このことは、癌細胞が原発性腫瘍から移動し得るか、又は既に移動している可能性があることを示唆している。このような移動は、転移をもたらし得る。

【0036】

一部の実施形態において、組織試料は、原発性黒色腫を覆う組織を含む。一部の実施形態において、組織試料は、原発性黒色腫を覆う腫瘍周辺表皮の少なくとも一部を含む。一部の実施形態において、組織試料は更に、原発性黒色腫に隣接する正常組織の一部を含む。一部の実施形態において、正常組織の一部は参照となる。適切には、参照は、参照組織であり、且つ/又はAmbra-1及びロリクリンの参照レベルを提供する。

【0037】

一部の実施形態において、本方法は、表皮におけるAmbra-1及びロリクリンの発現レベルを決定することを含む。ケラチン生成細胞は、表皮の約90%を占める細胞である。したがって、一部の実施形態において、組織試料は、原発性黒色腫を覆うケラチン生成細胞を含む。適切には、対象は、転移リスクが増大していると同定され得、ここで、前記同定は、対象の原発性黒色腫を覆うケラチン生成細胞におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が低下又は喪失している対象を決定することを含む。

【0038】

一部の実施形態において、組織試料は対象から事前に得られており、そのため、試料採取自体は本発明の方法の一部を形成しない。試料は、本方法の直前、又は本方法の何時間も前、何日も前、若しくは何週間も前に得てよい。他の実施形態において、本発明の方法は、対象から組織試料を得る工程を更に含み得る。

【0039】

適切には、組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現は、1つ又は複数の参照と比較される。適切には、参照は、組織、又は組織から得られた発現のレベルである。

【0040】

一部の実施形態において、参照は、正常組織に特徴的なAmbra-1及びロリクリンの発現レベルを含む。適切には、ロリクリン及びAmbra-1の参照レベルは、参照組織におけるロリクリン及びAmbra-1の発現を判定することによって得られ得る。一部の実施形態において、参照組織におけるロリクリン及びAmbra-1の発現レベルは、視覚的評価又は自動評価によって決定される。

【0041】

一部の実施形態において、正常組織に特徴的なAmbra-1及びロリクリンの発現の参照レベルは、1人又は複数人の(例えばコホート)健康な対象から得られた組織試料における発現レベルを決定することによって得られる。

【0042】

一部の実施形態において、参照組織は正常組織を含む。一部の実施形態において、正常組織は、原発性黒色腫を含まない部位から得られた表皮を含む。一部の実施形態において、参照組織(又はそれから得られたレベル)は、内部参照(すなわち、対象から得られたもの)である。一部の実施形態において、参照組織は、原発性黒色腫に隣接する部位から得られた正常組織である。他の実施形態において、参照組織は、対象の、原発性黒色腫から遠く離れた部位から得られる。したがって、一部の実施形態において、参照レベルは、正常組織におけるロリクリン及び/又はAmbra-1の発現レベルである。参照組織は、適切には、正常な表皮から採取され、参照レベルは、正常な表皮のケラチン生成細胞における発現レベルである。例えば参照レベルを得るための、参照組織におけるAmbra-1及び/又はロリクリンの発現は、本明細書において記載される方法を用いて判定され得る。

【0043】

適切には、組織試料は、対象から得られた生検又はその切片であり得る。生検等の組織試料は、パンチ生検、薄片生検、広範囲局所切除、及び他の手段を含む、当業者に知られている様々な試料採取方法を介して得ることができる。適切には、腫瘍試料は、原発性黒色腫が対象から切除された手術部位から採取される。

【0044】

適切には、組織試料は、凍結されてもよく、新鮮であってもよく、固定(例えばホルマリン固定)、遠心分離、及び/又は包埋(例えばパラフィン包埋)等をされてもよい。組織試料は、試料におけるAmbra-1及びロリクリンの量を評価する前に、様々な周知の回収後の分取及び保存技術(例えば、核酸及び/又はタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離等)をされても、又はされていてもよい。同様に、生検もまた、回収後の分取及び保存技術、例えば固定をされてもよい。組織試料又はその切片は、スライド等の固体担体上に載せることができる。

【0045】

一部の実施形態において、組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現の判定は、組織試料内に存在する各タンパク質のレベルを測定することを含む。これは、当業者に知られている方法によって行うことができる。このような方法には、免疫アッセイ、例えば、免疫組織化学、ELISA、ウェスタンブロット、免疫沈降とその後のSDS-PAGE、及び免疫細胞化学等が含まれる。

【0046】

したがって、一部の実施形態において、Ambra-1及びロリクリンの発現レベルの決定は、アッセイを行うことを含む。一部の実施形態において、アッセイはインビトロアッセイである。

【0047】

一部の実施形態において、対象は、
組織試料と、Ambra-1に特異的な第1のリガンドとを接触させる工程であって、Ambra-1が存在するとAmbra-1-リガンド複合体が生じる工程、
組織試料と、ロリクリンに特異的な第2のリガンドとを接触させる工程であって、ロリクリンが存在するとロリクリン-リガンド複合体が生じる工程、並びに
Ambra-1-リガンド複合体及びロリクリン-リガンド複合体を検出及び/又は定量する工程
を含む方法で組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現を判定することによって、転移リスクが増大していると同定される。

【0048】

一部の実施形態において、第1のリガンドは、抗Ambra-1抗体又はアプタマーを含む。一部の実施形態において、抗Ambra-1抗体又はアプタマーは、配列番号1で示される配列を有するタンパク質に特異的に結合する。

【0049】

一部の実施形態において、第2のリガンドは、抗ロリクリン抗体又はアプタマーを含む。一部の実施形態において、抗ロリクリン抗体又はアプタマーは、配列番号2で示される配列を有するタンパク質に特異的に結合する。

【0050】

ヒトAmbra-1及びロリクリンのアミノ酸配列は、本明細書において例として提供されるが、これらの配列の変異体が知られ得るか又は同定され得ることが理解されよう。一部の実施形態において、対象は、非ヒト哺乳動物である。したがって、Ambra-1(又は配列番号1)及びロリクリン(又は配列番号2)に対する本明細書における参照に、その非ヒトホモログの配列が含まれることも理解すべきである。

【0051】

一部の実施形態において、第1の及び/又は第2のリガンドは、検出部分(例えば蛍光標識)を含む。検出部分は、形成された複合体の直接的又は間接的な検出及び/又は定量を可能にする。

【0052】

一部の実施形態において、第1のリガンドは第1の検出部分を含み、第2のリガンドは第2の検出部分を含む。第1の検出部分は、第2の検出部分と同一であってもよいし、又は異なっていてもよい。

【0053】

一部の実施形態において、本方法は、組織試料の第1の部分又は切片と第1のリガンドとを接触させる工程、及び組織試料の第2の部分又は切片と第2のリガンドとを接触させることを含む。これは特に、第1の検出部分が第2の検出部分と同一である実施形態に適している。一部の代替的な実施形態において、本方法は、組織試料又はその部分若しくは切片と第1のリガンドとを接触させる工程、及び同一の組織試料又はその部分若しくは切片と第2のリガンドとを接触させる工程を含む。特に第1の及び第2の検出部分が異なる場合、Ambra-1-リガンド複合体及びロリクリン-リガンド複合体の両方を同一の試料又はその部分若しくは切片において検出及び/又は定量することが可能であり得る。

【0054】

適切には、第1の及び/又は第2のリガンドを、1つ又は複数の捕捉剤と組み合わせて用いることができる。したがって、一部の実施形態において、Ambra-1-リガンド複合体及びロリクリン-リガンド複合体を検出及び/又は定量する工程は、組織試料(又はその切片若しくは部分)と少なくとも1つの捕捉剤とを接触させる工程を含む。適切には、第1のリガンドに特異的に結合する第1の捕捉剤は、Ambra-1-リガンド複合体を検出及び/又は定量するために用いることができ、一方、第2のリガンドに特異的に結合する第2の捕捉剤は、ロリクリン-リガンド複合体を検出及び/又は定量するために用いることができる。或いは、第1のリガンド及び第2のリガンドの両方に特異的に結合し得る単一の捕捉剤を用いることができる。

【0055】

一部の実施形態において、捕捉剤は、結合部分及び検出部分を含む。

【0056】

一部の実施形態において、結合部分は、第1の及び/又は第2のリガンドに特異的に結合する二次抗体である。例えば、結合部分は、第1の及び第2のリガンドとして用いられる一次抗体に結合し得るユニバーサル抗IgG抗体であり得る。

【0057】

一部の実施形態において、本方法は更に、未結合の第1の及び第2のリガンド、及び場合によって未結合の捕捉剤を除去するための、1つ又は複数の洗浄工程を含む。

【0058】

一部の特別な実施形態において、黒色腫に罹患している対象における転移リスクの増大を予測するためのインビトロアッセイであって、
対象から得た組織試料の第1の部分と、Ambra-1に特異的な第1のリガンドとを接触させる工程であって、Ambra-1が存在するとAmbra-1-リガンド複合体が生じる工程、
組織試料の第2の部分と、ロリクリンに特異的な第2のリガンドとを接触させる工程であって、ロリクリンが存在するとロリクリン-リガンド複合体が生じる工程、
組織試料の第1の及び第2の部分を洗浄して、未結合のリガンドを除去する工程、
組織試料の第1の及び第2の部分と、第1の及び第2のリガンドに特異的な検出部分及び結合部分を含む捕捉剤とを接触させる工程、
組織試料の第1の及び第2の部分を洗浄して、未結合の捕捉剤を除去する工程、並びに
組織試料の第1の及び第2の部分内に存在する捕捉剤を検出及び/又は定量する工程
を含む、インビトロアッセイが提供される。

【0059】

適切には、適切な検出部分は、蛍光部分、発光部分、生物発光部分、放射性物質、比色分析部分、適切な検出可能な特性を有するナノ粒子、色素生成性部分、ビオチン、又は酵素から選択される。

【0060】

適切な蛍光部分には、蛍光タンパク質(フィコエリトリン(PE)、ペリジニン-クロロフィル-タンパク質複合体(PerCP)、及びアロフィコシアニン(APC)等)、蛍光染料(フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン(Rs)、及びシアニン(Cys)等)、蛍光タンデム複合体(アロフィコシアニン-シアニン7(APC-Cy7)、ペリジニン-クロロフィル-タンパク質複合体-シアニン5(PerCP-cy5)、及びフィコエリトリン-テキサスレッド(PE-TexasRed)等)、及びナノ結晶(QDot 525、QDot 545、及びQDot625等)が含まれる。Ambra-1-リガンド複合体及びロリクリン-リガンド複合体の存在は、蛍光リガンド、又は蛍光検出部分を含む捕捉剤の使用を介する、蛍光顕微鏡法を用いて検出され得る。

【0061】

検出部分が酵素を含む実施形態において、Ambra-1-リガンド複合体及びロリクリン-リガンド複合体の存在は、酵素によって触媒される基質の反応の反応生成物を検出及び/又は定量することによって検出及び/又は定量され得る。これらの実施形態において、本方法は更に、酵素の基質を添加する工程、並びに、酵素によって基質に対して行われる反応の生成物を検出及び/又は定量する工程を含む。例えば、反応は着色沈殿物を生じさせ得、この沈殿物は、光学顕微鏡法を用いて検出される。適切な酵素には、例えば、アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼが含まれる。アルカリホスファターゼの色素生成性基質は、PNPP(p-ニトロフェニルリン酸塩、ジナトリウム塩)である。PNPPは、405nmの光を吸収する黄色の水溶性反応生成物を生じさせる。ホースラディッシュペルオキシダーゼの色素生成性基質には、緑色の反応生成物を生じさせるABTS(2,2'-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩)、黄色-オレンジ色の反応生成物を生じさせるOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)が含まれ、また、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)可溶性基質は、HRPを検出すると青色を生じさせる。他の適切な酵素-基質の組合せ、Ambra-1-リガンド複合体及びロリクリン-リガンド複合体を検出する方法、並びに適切な検出部分は、当業者には分かるであろう。

【0062】

一部の実施形態において、第1の及び/又は第2のリガンド又は捕捉剤は、固相表面、例えば、マイクロアレイ、スライド、ウェル、又はビーズに固定されている。

【0063】

一部の実施形態において、Ambra-1及びロリクリンの発現は、視覚的評価、例えば顕微鏡法によって検出及び/又は定量される。他の実施形態において、Ambra-1及びロリクリンの発現は、自動スライドスキャナーによって検出及び/又は定量される。

【0064】

本発明の第9の態様によると、黒色腫に罹患している対象の転移発症リスクの増大を予測するためのキットであって、
Ambra-1に特異的な第1のリガンド、及び
ロリクリンに特異的な第2のリガンド
を含むキットが提供される。

【0065】

一部の実施形態において、キットは更に、黒色腫に罹患している対象における転移リスクを予測するためにキットを用いるための指示を含む。

【0066】

一部の実施形態において、キットは更に、少なくとも1つの捕捉剤を含む。適切には、捕捉剤は、第1の及び/又は第2のリガンドに特異的な検出部分及び結合部分を含み得る。

【0067】

一部の実施形態において、第1の及び/又は第2のリガンド及び/又は捕捉剤は、酵素を検出部分として含み、キットは更に、酵素の基質を含む。

【0068】

適切には、キットは更に、インビトロアッセイを行うために必要な試薬及び/又は器具等の1つ又は複数の更なる成分、例えば、緩衝液、固定剤、洗浄溶液、ブロック試薬、希釈剤、色原体、酵素、基質、試験管、プレート、ピペット等を含み得る。

【0069】

本発明の特定の実施形態のキットは、有利には、本発明の特定の実施形態の方法を行うために用られ得、様々な適用において、例えば、診断分野において、又はリサーチツールとして採用され得る。キットの部分は、バイアル内に個別に、又は容器内に若しくは複数の容器からなる単位内に組み合わせて、包装することができることが理解されよう。適切には、キットの製造は、当業者に知られている標準的な手順に従う。

【0070】

一部の実施形態において、治療剤は、組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現が低下又は喪失していると対象が同定された後、12週間以内、10週間以内、6週間以内、4週間以内、2週間以内、又は1週間以内に対象に投与される。

【0071】

一部の実施形態において、治療剤は化学療法剤である。あらゆる利用可能な適切な化学療法剤を対象に投与することができる。本明細書において用いられる場合、「化学療法剤」とは、癌の治療に有用なあらゆる治療剤を意味し、低分子や生物学的薬剤、例えば抗体を包含する。一部の実施形態において、化学療法剤は、ダカルバジン(DTIC)、テモゾロミド、Nab-パクリタキセル、パクリタキセル、カルムスチン(BCNU)、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、インターロイキン2、インターフェロンアルファ、抗体(例えば、イピリムマブ、抗PD1抗体)、及びB-Raf阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ)から選択される。

【0072】

治療剤の非限定的な投与経路には、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局部的、皮内、鼻腔内、又は気管支内投与(例えば、吸入によって行われるもの)が含まれる。一部の実施形態において、治療剤は、非経口投与、例えば静脈内投与される。治療剤が投与され得る一般的な投与態様には、例えば、ボーラス用量としての投与、又は一定期間にわたる注入としての投与が含まれる。

【0073】

治療剤は、転移の発症を予防する、阻害する、又は遅延させるために有効な量で投与され得る。

【0074】

所与の対象及び治療剤のための適切な用量及び投与量レジメは、体表面積若しくは体重等の様々な異なる方法を用いて、又は専門家の文献及び/若しくは個別の病院のプロトコルに従って、決定され得る。用量は更に、対象の好中球数、腎臓及び肝臓の機能、並びに治療剤に対するあらゆる過去の副作用の既往歴を考慮して調整され得る。用量はまた、治療剤が単独で用いられるか又は組み合わせて用いられるかに応じても異なり得る。

【0075】

当業者には、更なる投与態様、治療剤の投与量、及び治療レジメンが、当技術分野において知られている方法に従って治療医によって決定され得ることが認識されよう。

【0076】

本発明の特定の実施形態は、黒色腫に罹患している対象のための治療レジメを決定する方法であって、
a)原発性黒色腫を覆う組織を含む組織試料を対象から得る工程、
b)組織試料におけるAmbra-1及びロリクリンの発現を判定する工程、
c)(b)で得られた発現と、参照組織又はそれから得られたレベルとを比較する工程、並びに
d)(i)Ambra-1及びロリクリンの発現が正常であるか若しくは増大していれば、標準的な認識されているケアパスウェイに従う、又は
(ii)Ambra-1及びロリクリンの発現が低下若しくは喪失していれば、対象を全身的抗癌治療レジメで治療する工程
を含む方法が提供される。

【0077】

「標準的な認識されているケアパスウェイ」は、当業者には分かるであろうが、原発性黒色腫の切除によって残った瘢痕のより広い切除を対象に対して行うことを意味することが理解されよう。より広い切除のサイズは、原発性黒色腫のブレスロー深さに基づいて、臨床医又は執刀医によって決定される。標準的な認識されているケアパスウェイは、最大5年にわたる対象の通常の(例えば3〜12ヶ月ごとの)臨床的評価を更に含み得る。一部の実施形態において、原発性黒色腫がステージ2b又は2cである場合、標準的な認識されているケアパスウェイは、診断時に頭から骨盤までのステージングCTスキャンを対象に対して行うことを更に含み得る。一部の治療センターは、ステージ2a、2b、及び2cの腫瘍全てのステージングセンチネルリンパ節生検を行う。したがって、一部の実施形態において、標準的な認識されているケアパスウェイは、センチネルリンパ節生検を行うことを更に含み得る。

【0078】

一部の実施形態において、全身的抗癌治療レジメは、治療剤を対象に投与する工程を含む。

【0079】

本発明の特定の実施形態は、黒色腫に罹患している対象を治療するための方法を提供する。

【0080】

理想的には、転移リスクが増大していると同定された対象は、転移の発症の機会を最小にするためになるべく早く治療される。したがって、一部の実施形態において、方法又は治療レジメは、対象における転移を予防する、阻害する、若しくは遅延させる、又は転移リスクを低下させるためのものである。

【0081】

一部の実施形態において、対象は、転移リスクが増大していると同定された直後又は少し後に治療される。

【0082】

一部の実施形態において、治療剤での治療は、原発性黒色腫を切除するための外科手術の後に行われる。

【0083】

一部の実施形態において、治療方法又は治療レジメは、対象の増感画像化(例えば、CTスキャン、PET、MRI、X線)、センチネルリンパ節生検の議論及び/若しくは提案、又は実行、部分的な又は完全なリンパ節切除、対象を臨床試験に含めること、並びに放射線照射療法の1つ又は複数を更に含み得る。

【0084】

特定の実施形態の詳細な説明
本発明の実施形態を以下に例としてのみ、添付の図面を参照しながら、記載する。

【図面の簡単な説明】

【0085】

【図1】図1A〜図1Dは、正常な表皮(図1A)及びAJCCステージ1の黒色腫を覆う腫瘍周辺表皮(図1B〜図1D)におけるAmbra-1発現を示す光学顕微鏡画像である。スケールバーは50μmである。

【図2】図2A〜図2Cは、正常な表皮(図2A)及びAJCCステージ1の黒色腫を覆う腫瘍周辺表皮(図2B〜図2C)におけるロリクリン発現を示す免疫蛍光顕微鏡画像である。スケールバーは50μmである。

【図3A】全AJCCステージの黒色腫における表皮のAmbra-1発現の単変量分析を示す。Ambra-1発現が不変である場合(一番上の線)、Ambra-1発現が低下しているか若しくは不在である場合(点線)、又は潰瘍性腫瘍の場合(一番下の線)の、原発性黒色腫の表皮における7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線。ログランク(Mantel-Cox)検定P<0.0001。DFSは、Ambra-1の喪失がないものでは100%、低下しているか又は不在のAmbra-1では72.1%、潰瘍性では35.7%である。Ambra-1の喪失がないもの及びAmbra-1が低下している/不在であるものの直接的分析のログランク(Mantel-Cox)検定P=0.0270、HR 3.56(95% CI 1.16〜10.93)。

【図3B】AJCCステージ1の黒色腫のパイロットコホートにおけるAmbra-1発現の多変量分析を示す。Ambra-1発現が不変であることが明らかになったAJCCステージ1の原発性黒色腫の表皮(上部の線)と、その比較としての表皮Ambra-1が不在であるステージ1腫瘍(下部の線)とにおける、7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線。DFSは、Ambra-1の喪失がないものでは100%、Ambra-1が低下しているか又は不在であるものでは83.3%である。ログランク(Mantel-Cox)検定P=0.0575、HR 4.29(95% CI 0.95〜19.25)。

【図4A】全腫瘍タイプにわたる、Ambra-1発現が維持されていた表皮(一番上の線)と、その比較としてのAmbra-1の発現が喪失していた表皮(一番下の線)とにおける、7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線である。P=0.0007、HR 10.1(95% CI 2.65〜38.5)。

【図4B】全腫瘍タイプにわたる、ロリクリン発現が維持されていた表皮(一番上の線)と、その比較としてのロリクリンの発現が喪失していた表皮(一番下の線)とにおける、7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線である。P=0.0006、HR 18.4(95% CI 3.5〜96.2)。

【図4C】全腫瘍タイプにわたる、Ambra-1及びロリクリン両方の発現が維持されていた表皮(一番上の線)と、その比較としてのAmbra-1及びロリクリンの発現が喪失していた表皮(一番下の線)とにおける、7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線である。P=<0.0001、HR 39.6(95% CI 6.4〜243.9)。

【図5A】Ambra-1発現が維持されていたAJCCステージ1の原発性黒色腫の表皮(一番上の線)と、その比較としてのAmbra-1発現が喪失していた表皮(一番下の線)とにおける、7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線である。P=0.001、HR 24.12(95% CI 3.6〜161)。

【図5B】ロリクリン発現が維持されていたAJCCステージ1の原発性黒色腫の表皮(一番上の線)と、その比較としてのロリクリン発現が喪失していた表皮(一番下の線)とにおける、7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線である。P<0.0001、HR 210(95% CI 16.86〜2624)。

【図5C】Ambra-1及びロリクリン両方の発現が維持されていたAJCCステージ1の原発性黒色腫の表皮(一番上の線)と、その比較としてのAmbra-1及びロリクリンの発現が喪失していた表皮(一番下の線)とにおける、7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線である。P=0.0002、HR 93.5(95% CI 8.67〜1008)。

【図6】UniProtKBから入手されるホモサピエンスAmbra-1のアミノ酸配列を示す(一次受託番号Q9C0C7-1、アイソフォーム1)(配列番号1)。

【図7】UniProtKBから入手されるホモサピエンスロリクリンのアミノ酸配列(一次受託番号P23490)(配列番号2)を示す。

【図8】正常な表皮(a)、又は、(b)Ambra-1が維持されている、(c)Ambra-1が低下している、及び(d)Ambra-1完全に喪失している、ステージ1の黒色腫を覆う表皮における、Ambra-1(抗Ambra-1抗体(Abcam Biochemicals社、Cambridge、UK、69501、1:200))発現の様々な顕微鏡画像を示す図である。

【図9】正常な表皮(a)、又は、(b)ロリクリンが維持されている、(c)ロリクリンが完全に喪失している、ステージ1の黒色腫を覆う表皮における、ロリクリン(抗ロリクリン抗体(Abcam Biochemicals社、Cambridge、UK、24722、1:500))発現の様々な顕微鏡画像を示す図である。

【図10】腫瘍周辺のAmbra-1の変化(喪失なし、ある程度の喪失、又は完全な喪失)に付与された視覚的スコアリングと、正常な表皮と比較した腫瘍周辺表皮における染色陽性度の低下のパーセンテージの定量分析の結果との間の関連を示す図である。水平な線は、スコアリングのパーセンテージの平均±平均の標準誤差を表す(0=12.05、1=25.16、3=46.92)。一方向ANOVA P<0.0001^****。

【図11】腫瘍周辺のAmbra-1の変化、すなわち染色が喪失していないか又はある程度喪失したものと、染色が完全に喪失したものとに付与された視覚的スコアリングの間の関連を示す図である。水平な線は、スコアリングのパーセンテージの平均±標準偏差を表す(喪失なし/ある程度の喪失の平均=18.12 SD 12.97、完全な喪失の平均=46.92 SD 15.34)。マン-ホイットニーP<0.0001^****。

【図12】全AJCCステージ1の黒色腫における表皮のAmbra-1発現の単変量分析を示す図である。Ambra-1発現が喪失していないか又は低減している原発性黒色腫の表皮(黒い線)と、Ambra-1発現が不在である表皮(赤い線)とにおける、7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線。Ambra-1が喪失/低下していないものではDFS=97.7%(n=44)、Ambra-1が不在であるものでは94.3%(n=35)である。ログランク(Mantel-Cox)検定 P=0.411、HR 2.59(95% CI 0.26〜25.05)。

【図13】全AJCCステージ1の黒色腫における、表皮のAmbra-1及びロリクリンの組合せ発現の単変量分析を示す。ある程度の表皮のAmbra-1又はロリクリン発現が維持された原発性黒色腫の表皮(「低リスク」黒い線)と、Ambra-1及びロリクリン両方の表皮発現が喪失しているもの(「高リスク」赤い線)とにおける、7年無病生存(最初の転移が検出されるまでの月数)を示すカプラン-マイヤー曲線。DFSは、低リスクでは98.46%(n=65)であり、高リスクでは86.67%(n=15)である。ログランク(Mantel-Cox)検定 P=0.025、HR 9.29(95% CI 1.49〜558.0)。

【発明を実施するための形態】

【0086】

本発明の特定の実施形態の更なる詳細を以下に提供する。

【0087】

定義
用語「抗体」は、本明細書において用いられる場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、抗体-薬剤コンジュゲート、並びに、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFvを含む抗体のドメイン及び断片、並びにその二量体、ミニボディ、ダイアボディ、及びこれらの多量体を含むことを意図したものである。抗体は、従来の技術を用いて断片化され得る。抗体は、鳥類及び哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ)、トランスジェニック動物を含む、あらゆる動物に由来し得るか、又は、組換えした由来源に由来し得る。抗体は、当業者に知られている方法を用いて調製され得る。

【0088】

本明細書において用いられる場合、用語「原発性黒色腫」は、厚みに関わらず、領域的又は遠隔的な転移性疾患の臨床的又は組織学的証拠がない患者における、発生部位の皮膚上の悪性腫瘍を指す。

【0089】

本明細書において用いられる場合、「原発性黒色腫を覆う組織」という表現は、原発性黒色腫と皮膚表面との間に位置する表皮組織を指す。

【0090】

本明細書において用いられる場合、用語「正常組織」には、例えば、健康な(すなわち無病の)表皮である「正常な表皮」が含まれる。一部の実施形態において、正常組織は、例えば、原発性黒色腫試料と共に採取された正常な皮膚の断端(cuff)内の、原発性黒色腫に隣接している表皮である。

【0091】

本明細書において用いられる場合、「腫瘍周辺表皮」は、腫瘍を覆う、又は腫瘍の周りに位置する表皮組織を指す。

【0092】

本明細書において用いられる場合、「転移」は、局所的に(局所的再発及びイントランジット(in transit)疾患等)、領域的に(リンパ節微小転移又はマクロ転移等)、又は遠隔的に(脳、肺、及び他の組織等)生じ得る再発又は疾患進行であると定義される。一部の実施形態において、用語「転移」は、原発性黒色腫の後の転移性疾患を指すために用いられる。典型的には、原発性黒色腫から生じる転移は、対象の肺及び/又は脳並びに他の場所に広がり得る。

【0093】

本明細書において用いられる用語「比較する(comparing)」及び「比較する(compare)」は、通常、対応するパラメータ又はレベルの比較を指すことが理解され、例えば、絶対量は絶対参照量と比較され、一方、濃度は参照濃度と比較され、又は、組織試料から得られたシグナルのシグナル強度は、参照から得られた同一のタイプのシグナル強度と比較される。比較は、手動で、例えば視覚的評価によって行われ得るか、又は自動化されていてもよい(例えば、自動スキャナーを用いて、又はコンピュータを利用して)。したがって、比較は、コンピューティング装置によって行うことができる。

【0094】

黒色腫のステージは、その広がりの程度を説明するものである。これには、皮膚におけるその厚さ、それがリンパ節又はあらゆる他の器官のそばまで広がっているかどうか、及び特定の他の因子が含まれる。ステージは、身体検査、生検、及びあらゆる画像化試験(CT又はMRIスキャン等)、又は行われてきた他の試験の結果に基づく。このような試験は、当業者には分かるであろう。黒色腫をステージングするために最も多く用いられる系は、American Joint Commission on Cancer(AJCC)TNM系である。Table 1(表1)は、各ステージを同定する特徴を記載する。

【0095】

【表1】

【実施例】

【0096】

材料及び方法
(実施例1)
Ambra-1及びロリクリンについての免疫組織化学
Table 2(表2)で示される患者コホートから得た原発性黒色腫組織の分析を、ホルマリン固定されパラフィン包埋された切片の免疫組織化学的染色によって行った。5〜6μm厚さの組織切片を、X-tra顕微鏡スライド(Leica Microsystems社、Milton Keynes、UK)上で、56℃で一晩焼いた。これらを次いで、ヒストクリア(AGTC Bioproducts社、Hessle、UK)内で20分インキュベートし、その後、100%、75%、50%エタノール内で、次いで蒸留水で、それぞれ5秒ずつ再水和した。抗原回復を、予め加熱した抗原回復緩衝液(Ambra-1(10mM Tris-HCl(pH7.6))、ロリクリン(10mMクエン酸ナトリウム(pH6.0))内で12分マイクロ波加熱して行い、その後、20分冷却させた。各切片を乾燥させ、組織を、ImmEdge疎水性ペン(Vector Laboratories Inc.社、Burlingame、USA)で単離した。切片を次いで、PBS/0.05% Tween(PBS/T)と3分インキュベートして再水和させ、その後、PBS/T内の0.2%トリトンX-100(Sigma社、St.Louis、USA)と10分インキュベートした。PBS/Tで洗浄した後、切片を水中の3%H₂O₂内で10分インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。内因性アビジンを、Avidin/Biotin Blockingキット(Vector Laboratories Inc.社、Burlingame、USA)のアビジン溶液で15分ブロックし、その後、PBS/Tで更に洗浄し、キットのビオチン部分と15分インキュベートし、その後、PBS/Tで洗浄した。タンパク質のブロックは、動物特異的なVectastain Eliteキット(Vector Laboratories Inc.社、Burlingame、USA)の2%ブロック血清内で切片をインキュベートすることによって行った。

【0097】

更なるPBS/T洗浄の後、切片を、一次抗体と室温で1時間、抗Ambra-1抗体(Abcam Biochemicals社、Cambridge、UK、69501、1:200)又は抗ロリクリン抗体(Abcam Biochemicals社、Cambridge、UK、24722、1:500)とインキュベートした。PBS/Tで3回洗浄した後、一次抗体を、ビオチン化された動物特異的な二次抗体で30分、室温で検出し、その後、PBS/Tで3回洗浄した。染色は、Vectastain EliteキットのABC試薬(使用の30分前に予め混合された)と30分インキュベートすることを介して行い、その後、PBS/Tで3回洗浄し、次いで、VIP溶液(Vector Laboratories Inc.社、Burlingame、USA)と10分間インキュベートした。スライドを水道水で5分すすぎ、その後、ヘマトキシリン(Sigma Diagnostics社、St.Louis、USA)で2分対比染色し、その後、水道水を頻繁に変えて最後の10分間の洗浄を行った。75%及び100%エタノールに通して5秒脱水を行った後、切片をヒストクリア内で2分清掃し、乾燥させ、次いで、カバーガラスにDPX封入剤(VWR International Ltd.社、Poole、UK)と共に載せた。

【0098】

発現の判定
正常な表皮と腫瘍周辺表皮との間のAmbra-1及び/又はロリクリンの発現レベルの差を、まずは、3人の皮膚科医及び1人の組織病理学者のコンセンサス合意によって判定した。発現は、Leica QWin画像分析ソフトウェア(Leica Microsystems社)を用いて、腫瘍周辺における染色陽性細胞のパーセンテージを、隣接する正常な表皮の内部対照参照において判定されたAmbra-1/ロリクリン発現に対するパーセンテージとして評価することによって定量した。これらの観察は、「維持されている」(正常な発現の>75%)、「低下している」(正常な発現の25〜75%)、又は「喪失している」(正常な発現の<25%)のいずれかとしてカテゴライズされた。各切片の評価は、最終的な疾患転帰の事前の知識なく行った。

【0099】

【表2】

【0100】

統計
全ての統計分析及び画像作成は、GraphPad Prism 5(GraphPad Software社、San Diego、USA)統計分析ソフトウェアを用いて行った。

【0101】

無病生存についての研究変数の全ての単変量及び多変量分析は、8年間のフォローアップに対するカプラン-マイヤー曲線の構築、及び比較データのログランク(Mantel-Cox)分析を用いて行った。

【0102】

(実施例1)
結果及び考察
本発明者らは、黒色腫、特にAJCCステージ1の黒色腫を覆う腫瘍周辺表皮におけるAmbra-1発現の低下が、7年にわたる無病生存の低下と有意に相関することを同定した。図1Aに示すように、Ambra-1発現は、AJCCステージ1の黒色腫に隣接して位置する正常な表皮において、基底層から角質層に向かって増大しており、維持された分化と一致している。しかし、Ambra-1発現は、様々なAJCCステージ1の腫瘍を覆う表皮において維持され(図1B)、低下し(図1C)、又は更には喪失している(図1D)。

【0103】

図3を参照すると、表皮のAmbra-1発現の喪失又は低下は、転移リスクの増大と相関する。全AJCC黒色腫で(図3A)、Ambra-1発現の喪失を示さない患者の100%が7年後に無病であった。これは、Ambra-1の発現が低下しているか又は不在である患者では72.1%に低下した。潰瘍性黒色腫を有する患者の35.7%のみが、7年後に無病であった。これは、Ambra-1の喪失、及び腫瘍の最終的な関連する明らかな潰瘍で、疾患リスクが段階的に増大することを強調するものである。

【0104】

AJCCステージ1の黒色腫のみを考慮すると(図3B)、7年後に無病であった患者のパーセンテージは、Ambra-1発現が喪失していない患者では100%であり、Ambra-1発現が低下しているか又は不在である患者では83.3%に低減した。

【0105】

図4A及び図5Aは、全腫瘍タイプ(図4A)又はステージ1のみ(図5A)で7年にわたり、Ambra-1及びロリクリン両方の発現が評価された小さめのコホートにおける、Ambra-1の発現と対象の無病生存との間の相関を示す。全腫瘍タイプ(図4A)で、Ambra-1の発現が維持された全ての患者は、7年後に無病であった。Ambra-1発現が喪失した患者では、7年後に無病であったのはわずか18%であった。ステージ1腫瘍では、ここでも、Ambra-1の発現が維持された患者の100%が転移を発症せず、一方、無病生存率は、Ambra-1発現が喪失した患者では17%であった。

【0106】

Ambra-1が自食作用の制御に関与するとする、当技術分野における現在の刊行物に反して、本文脈におけるAmbra-1の役割は、完全性の喪失をもたらす、正常な表皮での分化の下方調節にあると考えられる。本発明者らによって、ATG1等の他の自食作用タンパク質の下方調節が分化プロセスに影響しないことが実証され、このことは、このプロセスが自食作用に関与しないという仮説を裏付けるものである。

【0107】

予想外に、ロリクリン発現の喪失もまた、転移リスクの増大に相関することが見出された。図2A〜図Cは、角質層における正常なロリクリン発現(図2A)、及びロリクリン発現が喪失した(図2B)又は維持されている(図2C)腫瘍周辺表皮における発現の代表的な画像を示す。

【0108】

図4B及び図5Bを参照すると、表皮のロリクリン発現の喪失又は低下は、7年にわたる無病生存の低下と相関する。全AJCC黒色腫(図4B)で、ロリクリン発現が維持された患者の64%が7年後に無病であった。しかし、ロリクリン発現が喪失した患者のいずれも、5年後に無病ではなかった。AJCCステージ1の黒色腫(図5B)では、ロリクリン発現が維持された患者の100%が7年後に無病であった。ロリクリン発現が喪失した患者のいずれも、5年後に無病ではなかった。このことは、黒色腫患者におけるロリクリン発現と無病生存率との間の統計上有意な相関を示す。しかし、Ambra-1と同様に、ロリクリンのみの喪失は、AJCCステージ1の黒色腫又は全ての腫瘍ステージのいずれでも、100%の正確度で疾患進行を予測するものではない(Table 3(表3)を参照されたい)。

【0109】

しかし、本発明者らは、Ambra-1及びロリクリン両方の発現の判定が、転移への疾患進行を強く代表するものであると判定した。これらの実験の結果を図4C及び図5Cに示し、Table 3(表3)にまとめる。

【0110】

【表3】

【0111】

したがって、Ambra-1の喪失とロリクリンの喪失との組合せが、100%の正確度で、転移の発症に進んだ患者を同定することが見出された。

【0112】

(実施例2)
更なる分析を、独立したJames Cook University Hospital黒色腫コホートに集められた80の後ろ向きなAJCCステージ1の黒色腫患者の試料で行った(Table 4(表4))。分析によって、上記で詳述した最初の後ろ向きコホートにおける所見と一致するデータが明らかになる。

【0113】

【表4】

【0114】

免疫組織化学的染色を、臨床的使用で最も広く用いられる専門的染色であるDAB対比染色を用いて行った。全ての試料は、Newcastle University Biobank内のLeica SCN400デジタルスライドスキャナー(Leica Biosystems社)でのスライドの自動スキャンを用いて、デジタル画像化した(図8及び図9)。

【0115】

表皮のAmbra-1の喪失の視覚的分析を2人の個別の皮膚科医によって行い、スコアを、同一切片内の正常な表皮と比較した、腫瘍周辺表皮における表皮のAmbra-1の喪失の程度に基づいて、各スライドに割り当てた。皮膚科医間で付与されたスコアの95%の一致があり、これらのスライドの更なる再考によって、それぞれについて合意されたスコアが得られた。

【0116】

同様に、同じ2人の皮膚科医が表皮のロリクリン喪失の視覚的分析を独立して行った。上面表皮の直接的な腫瘍浸潤に起因するものではない、腫瘍周辺表皮におけるロリクリン染色の連続性のあらゆる中断を、ロリクリン喪失としてスコア付けした。一致は97.5%であり、合意は全ての試料で得られた。

【0117】

表皮Ambra-1の定量分析を、Leica Slidepath系の、事前にバリデートされた分析ソフトウェアを用いて行った。正常な表皮の5つの代表的区域を200倍の倍率で選択し、DAB陽性のピクセルのパーセンテージの平均を得た。これを、200倍の倍率での腫瘍周辺表皮の10の代表的区域におけるDAB陽性のピクセルのパーセンテージの平均と比較した。腫瘍周辺の発現と正常な表皮の発現との間のAmbra-1発現における全体的なパーセンテージの低下を次いで計算した。

【0118】

視覚的及び定量的スコアの比較(図10)によって、定量的スコアの統計上有意な(P<0.0001)段階的増大と、視覚的に分析された腫瘍周辺のAmbra-1の低下とが明らかになる。このことは、視覚的スコアリングを、Ambra-1表皮染色の分析のための強固で信頼性のある方法であると確証するものである。

【0119】

生存分析のためのカットポイントを決定するために、視覚的及び定量的スコアを、腫瘍周辺のAmbra-1の喪失なし又はある程度の喪失と完全な喪失とを比較して再分析した(図11)。これは、Ambra-1が完全に喪失したと視覚的にスコア付けされた試料において、定性的スコアの統計上有意な増大を示す(P<0.0001)。これは更に、腫瘍周辺のAmbra-1が完全に喪失した試料を同定するための視覚的スコアリングの適切性を確証し、完全なAmbra-1の喪失の平均を下回る1つの標準偏差(平均46.92、SD 15.34)は、Ambra-1の喪失の更なる定性分析を決定するための30%の適切なカットオフをもたらす。

【0120】

全ての患者における腫瘍周辺のAmbra-1の喪失の単変量分析によって、「高リスク」腫瘍(発現の>30%の定性的低下によって判定される、腫瘍周辺のAmbra-1が完全に喪失した腫瘍)と「低リスク」腫瘍(<30%の定性的発現低下)との間の無病生存に全体的な差がないことが明らかになった(図5)。低リスク腫瘍ではDFS=97.7%であり(n=44)、高リスク腫瘍では94.3%である(n=35)。ログランク(Mantel-Cox)検定 P=0.411、HR 2.59(95% CI 0.26〜25.05)。これらの結果は、Ambra-1がこの患者サブセットにおける予後バイオマーカーであることを裏付けるものではない。

【0121】

表皮のAmbra-1発現とロリクリン発現との組合せの、予後バイオマーカーとしての妥当性を評価するために、単変量分析を全ての試料において行った。「高リスク」試料を、腫瘍周辺のAmbra-1が完全に喪失しており(>30%の定量的低下)、且つロリクリンが喪失していると判定した。Ambra-1又はロリクリンのいずれかが喪失している全ての他の腫瘍は、「低リスク」であると見なされた。これらの結果は、高リスク腫瘍群において、たとえ転移事象の総数は少なくても、転移リスクが統計上有意に増大していることを示し、Ambra-1とロリクリンとの組合せの、AJCCステージ1の疾患における組合せ予後バイオマーカーとしての有用性を更に強める。低リスクではDFS=98.46%(n=65)、高リスクでは86.67%(n=15)である。ログランク(Mantel-Cox)検定 P=0.025、HR 9.29(95% CI 1.49〜558.0)。

【0122】

【表5】

【0123】

Ambra-1/ロリクリンバイオマーカーの最終分析は、組み合わされたAmbra-1/ロリクリンの、Ambra-1又はロリクリンいずれか単独よりも増大した特異性(83%)、陽性及び陰性適中率(それぞれ13%及び98.4%)を強調する(Table 5(表5))。このことは、組合せバイオマーカーが、増大するサーベイランスのための高リスク患者の同定における、及び予後についてより確実に患者を安心させ得る低リスク患者の同定における予後値を追加するであろうことを示す。

【0124】

これらの2つのタンパク質の発現の低下又は喪失が、腫瘍を覆う表皮及び腫瘍の下部にある血管系の破壊を示し得るということは、癌細胞が腫瘍切除の時点で原発性腫瘍から既に移動している可能性があることを意味しており、重要な所見である。

【0125】

本発明の特定の実施形態は、したがって、黒色腫に罹患している対象の転移リスクが増大しているかどうかを判定するための手段を提供する。これによって、治療レジメを適宜適合させることが可能になり、これによって、対象が転移を発症するリスクが低減し、対象の予後が向上する。

【0126】

本明細書の明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、「含む(comprise)」及び「含有する(contain]」という語並びにそれらの変型は、「限定はしないが含む」を意味し、これらは、他の部分、添加物、成分、整数、又は工程を排除することを意図したものではない(また排除しない)。本明細書の明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、単数形は、文脈により別段の要求がない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、明細書は、文脈により別段の要求がない限り、複数形及び単数形を考慮することが理解される。

【0127】

本発明の特定の態様、実施形態、又は実施例と併せて記載される特性、整数、特徴、又は群は、本明細書において記載されるあらゆる他の態様、実施形態、又は実施例に不適合でない限り、それらに適用可能であることが理解される。本明細書(あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書、及び図面を含む)において開示される特性の全て、及び/又はそのように開示されたあらゆる方法若しくはプロセスの工程の全ては、少なくとも一部の特性及び/又は工程が相互排他的である組合せを除いて、あらゆる組合せで組み合わせることができる。本発明は、いかなる前述の実施形態のいかなる詳細にも制限されない。本発明は、本明細書(あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書、及び図面を含む)において開示される特性のあらゆる新規な1つ若しくは新規な組合せに、又はそのように開示されたあらゆる方法若しくはプロセスの工程のあらゆる新規な1つ若しくはあらゆる新規な組合せに拡大適用される。

【0128】

読者の注意は、本願に関連して本明細書と同時に又は本明細書に先立って出願された、及び本明細書と共に公開された、全ての書類及び文献に向けられ、全てのこれらの書類及び文献の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図8d】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]