特許 6808940 アレイデバイス、生体分子解析用キット及び溶媒の封止方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6808940

(24)【登録日】2020年12月14日

(45)【発行日】2021年1月6日

(54)【発明の名称】アレイデバイス、生体分子解析用キット及び溶媒の封止方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 35/02 20060101AFI20201221BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20201221BHJP

【ＦＩ】

   G01N35/02 A

   G01N37/00 101

【請求項の数】5

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2016-15815(P2016-15815)

(22)【出願日】2016年1月29日

(65)【公開番号】特開2017-134005(P2017-134005A)

(43)【公開日】2017年8月3日

【審査請求日】2018年12月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003193

【氏名又は名称】凸版印刷株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100105854

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 一

(74)【代理人】

【識別番号】100116012

【弁理士】

【氏名又は名称】宮坂 徹

(72)【発明者】

【氏名】牧野 洋一

【審査官】 瓦井 秀憲

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／１２１３１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−１１２８３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３５８６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０１３５４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２８８０５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３５／００−３７／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

粒子が分散された溶媒が導入される流路と、
微小孔が形成され前記流路の一部をなす基材と、を備え、
前記溶媒を前記流路に導入して前記溶媒中の前記粒子を前記微小孔に収容させるようにしたアレイデバイスであって、
前記微小孔の開口部は、開口側から見て、一の前記微小孔に一の前記粒子が収容された状態における前記開口部の形状と前記粒子の形状とが非相似形状であり、前記粒子は球体であり前記開口部は多角形状又は楕円であって、
前記粒子が前記微小孔に収容される過程で、前記粒子と前記微小孔の開口部との間に、前記微小孔内の溶媒の排出路が形成されるようになっていることを特徴とするアレイデバイス。

【請求項2】

前記粒子は球体であり、前記開口部は五角形又は四隅を面取りした四角形である請求項１に記載のアレイデバイス。

【請求項3】

前記微小孔の容積は１００ピコリットル以下であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のアレイデバイス。

【請求項4】

請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のアレイデバイスと、
前記粒子が分散され、検出対象の物質と混合される溶媒と、
前記溶媒を前記微小孔に封止するための、前記溶媒と混合しない特性を有する封止液と、
を備えることを特徴とする生体分子解析用キット。

【請求項5】

請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のアレイデバイスの前記流路に前記粒子が分散された溶媒を導入して前記溶媒中の前記粒子を前記微小孔に収容させ、
前記粒子を前記微小孔に収容させた後、油性封止液を前記流路に導入して前記溶媒を前記微小孔に封止することを特徴とする微小孔内への溶媒の封止方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アレイデバイス、生体分子解析用キット及び溶媒の封止方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体分子の測定方法として、微小孔の中で酵素反応を行うことで迅速に分析する手法が特許文献１や特許文献２、また非特許文献１等に記載されている。これらの手法では、マイクロビーズにより生体物質を捕捉し、液体中に拡散させたマイクロビーズをマイクロ微小孔内へ重力や磁力を使って落とし込むことが記載されている。また、これらの手法においては、マイクロ微小孔の中に入るマイクロビーズの割合が多い方がより低濃度の生体分子を検出することが可能であるため、例えば重力で沈降させる時間や磁力で沈降させる際の磁力のかけ方、また遠心力によりマイクロビーズを沈降させる方法等も検討されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許第５５５１７９８号公報

【特許文献2】特表２０１４−５０３８３１号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、第１２巻、２０１２年、４９８６〜４９９１頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ところで、マイクロ微小孔の開口部が円形であり、マイクロビーズが球体である場合等、マイクロ微小孔の開口側から見て、開口部の形状が、マイクロビーズの形状と同じである場合には、マイクロビーズがマイクロ微小孔に収容される際に、マイクロビーズによりマイクロ微小孔内から外に押し出される液体の抜け道が小さい。そのため、マイクロビーズがマイクロ微小孔に入る効率が悪い。
本発明は、上記未解決の課題に着目してなされたものであり、微小孔に、ビーズ等の粒子を効率よく収容させることの可能なアレイデバイス及び生体分子解析用キットを提供することを目的としている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一実施形態によれば、粒子が分散された溶媒が導入される流路と、微小孔が形成され流路の一部をなす基材と、を備え、溶媒を流路に導入して溶媒中の粒子を微小孔に収容させるようにしたアレイデバイスであって、微小孔の開口部は、開口側から見て、一の微小孔に一の粒子が収容された状態における開口部の形状と粒子の形状とが非相似形状であり、粒子は球体であり開口部は多角形状又は楕円であって、粒子が微小孔に収容される過程で、粒子と微小孔の開口部との間に、微小孔内の溶媒の排出路が形成されるようになっているアレイデバイスが提供される。

【発明の効果】

【0007】

本発明の一態様によれば、微小孔の開口部が、開口側から見て、一の微小孔に一の粒子が収容された状態における開口部の形状と粒子の形状とが非相似形状となるようにしたため、微小孔に粒子が収容される過程において、微小孔と粒子との間に微小孔内の溶媒が抜け出る流路を確保することができる。そのため、重力や磁力や遠心力等により微小孔内に粒子を入りやすくさせることができ、粒子が微小孔内に入る効率を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】開口部の形状が円形である微小孔に球体の粒子を収容する際の溶媒の排出路の一例を示す模式図である。

【図2】開口部の形状が五角形である微小孔に球体の粒子を収容する際の溶媒の排出路の一例を示す模式図である。

【図3】開口部の形状が面取りされた正方形である微小孔に球体の粒子を収容する際の溶媒の排出路の一例を示す模式図である。

【図4】開口部の形状が楕円形である微小孔に球体の粒子を収容する際の溶媒の排出路の一例を示す模式図である。

【図5】本発明を適用したアレイデバイスを用いた生体分子解析用キットの一例を示す構成図である。

【図6】微小孔の配置例を示す基体部の上面図である。

【図7】蛍光測定により得られた画像の一例である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下に、本発明の一実施形態におけるアレイデバイスを図面に基づいて説明する。
以下の詳細な説明では、本発明の実施形態の完全な理解を提供するように多くの特定の細部について記載される。しかしながら、かかる特定の細部がなくても１つ以上の実施態様が実施できることは明らかである。
図１から図４は、マイクロビーズ等の球体のビーズを、各種形状の開口部を有する微小孔に収容する場合に、微小孔内の溶媒が微小孔外に排出される際の流路（以後、溶媒の排出路という。）の一例を模式的に示したものである。なお、１つの微小孔に１つのビーズを収容するようになっている。

【0010】

図１は、微小孔（貫通孔）２の開口部２ａの形状が円形である場合を示したものである。図１に示すように、ビーズ１は球体であるため、ビーズ１が微小孔２に収容される場合、微小孔２内の溶媒は、微小孔２の円形状の開口部２ａと球体のビーズ１との隙間を通って微小孔２の外に排出されることになる。そのため、開口部２ａの直径とビーズ１の直径との差が小さいほど溶媒の排出路１０は狭くなり、微小孔２内の溶媒が微小孔２外に排出されにくくなる。つまり、微小孔２内の溶媒とビーズ１との置換がされにくくなり、ビーズ１が微小孔２内に取り込まれにくい。
微小孔２の開口部２ａの直径をビーズ１の直径に対してより大きくすれば、溶媒の排出路１０は広くなるが、流路内に微小孔２を設ける場合、微小孔２の開口部２ａの直径を大きくするほど、限られた流路内に設けることのできる微小孔２の数も少なくなる。つまり、ビーズ１を微小孔２に取り込みやすくはなるが、流路全体でみると、微小孔２に取り込むことのできるビーズ１の数が減少することになる。

【0011】

図２から図４は、本発明の一実施形態におけるアレイデバイスを用いた場合の一例である。
図２は、微小孔２の開口部２ａの形状が五角形である場合を示したものである。
開口部２ａの形状が五角形である場合、微小孔２にビーズ１が収容される過程において、微小孔２の開口側から見て、開口部２ａとビーズ１との間の、開口部２ａの、五角形の角部に相当する部分に空間２ｂが形成され、この空間２ｂが微小孔２内の溶媒の排出路となる。開口部２ａの形状が五角形である場合、開口部２ａを、ビーズ１が五角形の各辺に接する程度の大きさに形成したとしても空間２ｂは必ず形成されるため、排出路を容易に確保することができる。

【0012】

図３は、微小孔２の開口部２ａの形状が正方形であり且つ四隅を面取りしたものである。
開口部２ａが面取りした正方形である場合、微小孔２にビーズ１が収容される過程において、開口側から見て、開口部２ａとビーズ１との間の、開口部２ａの面取り部分の両側に相当する部分に空間２ｂが形成され、この空間２ｂが微小孔２内の溶媒の排出路となる。開口部２ａの形状が面取りした正方形である場合、開口部２ａを、ビーズ１が面取り部分に接する程度の大きさに形成したとしても空間２ｂは必ず形成されるため、排出路を容易に確保することができる。

【0013】

図４は、微小孔２の開口部２ａの形状が楕円形である場合を示したものである。
開口部２ａの形状が楕円形である場合、微小孔２にビーズ１が収容される過程において、開口部２ａとビーズ１との間の、開口部２ａの長軸方向の両端に相当する部分に空間２ｂが形成され、この空間２ｂが微小孔２内の溶媒の排出路となる。開口部２ａが楕円形である場合、開口部２ａを、ビーズ１が楕円形の短軸方向の曲面に接する程度の大きさに形成したとしても空間２ｂは必ず形成されるため、排出路を容易に確保することができる。また、微小孔２の数を増やすことなく実現することができるため、例えば、生体分子解析用キットに適用した場合等には、アレイデバイスの増大を伴うことなく検出精度の向上を図ることができる。

【0014】

なお、図２〜図４では、球体のビーズ１を収容する際に、開口部２ａの形状が、五角形、面取りした正方形、楕円形である場合について説明したがこれに限るものではなく、開口部２ａの形状が多角形であってもよい。また、ビーズ１は、球体に限るものではなく、微小孔２の開口側から見てビーズ１が多角形であり、開口部２ａの形状が円であってもよく、図２〜図４で説明したように、ビーズ１を微小孔２に収容する過程において、ビーズ１と微小孔２の開口部２ａとの間に、微小孔２内の溶媒の排出路となる隙間が形成されればよい。すなわち、一つの微小孔２に一つのビーズ１が収容された状態において、微小孔２の開口側から見て、開口部２ａの形状とビーズ１の形状とが異なっていればよい。なお、ここでいう形状が異なるとは、図１に示すように相似形状である場合は含まず、図２〜図４に示すように、非相似形状である場合をいう。

【0015】

このように、一つの微小孔２に一つのビーズ１が収容された状態において、微小孔２の開口側から見て、開口部２ａの形状とビーズ１の形状とを非相似形状とすることによって、ビーズ１を微小孔２に収容する過程において、排出路を確保することができる。したがって、微小孔２内の溶媒により、微小孔２内へのビーズ１の移動が妨げられることを抑制することができ、結果的に、微小孔２内にビーズ１を効率よく収容させることができる。

【0016】

図５は、本発明を適用したアレイデバイスを用いた生体分子解析用キットの一例を示す構成図である。生体分子解析方法では、解析する生体分子として、細胞、エクソソーム、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡ）（以下、ＲＮＡ類と言うことがある。）、タンパク質のいずれかが選ばれる。
ここでは、核酸定量用のアレイデバイスを用いた場合について説明するが、本発明におけるアレイデバイスは、核酸定量用に限定されるものではない。例えばタンパク質を解析するためのアレイデバイスとして適用することもできる。

【0017】

本実施形態における生体分子解析用キットは、図５に示すように、核酸定量用アレイデバイス５を備え、この核酸定量用アレイデバイス５の流路内に、マイクロビーズ等の粒子が分散された溶媒からなる検出反応試薬２１を導入した後、油性封止液２２を導入することによって、検出反応試薬２１を反応容器５ａ内に封止するようになっている。
なお、ここでは、粒子の一例としてマイクロビーズを用いているが、細胞、菌、ウィルス、ゲル、エマルジョン、ミセル等を、検査対象を捕捉する粒子として用いることも可能である。
核酸定量用アレイデバイス５は、図５に示すように、基体部（基材）１１と、基体部１１と共に流路１２を形成するカバー部１３とを備え、流路１２に溶媒を導入するための注入口部（図示せず）と排出口部（図示せず）とを備える。基体部１１は、基板１１ａと、基板１１ａ上に形成された微小孔アレイ層１１ｂとを備える。

【0018】

微小孔アレイ層１１ｂは、例えば、基板１１ａ上に形成された微小孔アレイ層を形成するために形成した層を基板１１ａが露出するまでパターニングすること等により微小孔２となるパターンが形成されている。そして、基板１１ａの、微小孔アレイ層１１ｂが除去されて露出した部分を底面、基板１１ａが露出した部分を囲む微小孔アレイ層１１ｂとで囲まれた領域が微小孔２となり、核酸定量用アレイデバイス５における反応容器５ａとなる。
微小孔アレイ層１１ｂは、基板１１ａに直接形成してもよいし、微小孔アレイ層１１ｂを形成した部材を基板１１ａに接着する、又は溶着する等の手段で固定して設けてもよい。

【0019】

基板１１ａは、実質的に透明な材料からなる板状部材である。基板１１ａの材質としては、例えば樹脂やガラス等を適用することができる。具体的には、基板１１ａは、ポリスチレンやポリプロピレンから形成されていてもよい。また、基板１１ａは、核酸定量用アレイデバイスを搬送する装置や作業者の手作業による取扱い時に破損しない程度の剛性を持ったものであればよい。
微小孔アレイ層１１ｂは、複数の貫通孔が配列されて形成されている層である。微小孔アレイ層１１ｂの層厚は例えば３μｍであり、微小孔アレイ層１１ｂとこの微小孔アレイ層１１ｂと向かい合うカバー部１３との間には例えば１００μｍの間隔が空けられている。反応容器５ａは、一端に開口部を有する有底楕円形など、球体のビーズとは異なる形状を有する。

【0020】

反応容器５ａは、例えば開口部の形状が楕円形であれば、例えば長径が７μｍ、短径が３．５μｍであり、深さが３μｍの断面が楕円の中空の柱状に形成される。
反応容器５ａの容積は適宜設定されてよいが、反応容器５ａの容積が小さい方がシグナル検出可能となるまでの反応時間を短縮することができる。反応容器５ａの容積は、一例として１００ピコリットル又はそれ以下とすることができる。つまり、微小空間内で生体分子の識別を行う場合、反応容器５ａの容積が大きくなるとシグナルが希釈されて検出感度が落ちる。したがって、反応容器５ａの容積を、１００ピコリットル以下とすることによって、微小空間内で生体分子の識別を行う場合であっても、検出感度を維持することができる。

【0021】

反応容器５ａの容積は、具体的には、シグナルを飽和させて十分なシグナルを発生させるのにかかる時間を短縮する目的がある場合には、解析対象の分子が１つの反応容器５ａに１つ以下となる液量に基づいて設定される。
各反応容器５ａ同士の中心線間の距離（ピッチ）は、各反応容器５ａの直径よりも大きければよい。なお、ここでいう反応容器５ａの中心線とは、反応容器５ａの開口部の重心を通る、反応容器５ａの深さ方向と並行な線のことをいう。

【0022】

各反応容器５ａの間隔（隙間）の大きさは、各反応容器５ａにおいて独立してシグナル検出ができる分解能に応じて設定される。
各反応容器５ａは微小孔アレイ層１１ｂに対して三角格子状をなして配列されている。
なお、各反応容器５ａの配列方法は特に限定されない。微小孔アレイ層１１ｂに形成された貫通孔と、基板１１ａの表面とによって、基板１１ａを底面部とする有底筒状の微小な反応容器５ａが形成されている。

【0023】

微小孔アレイ層１１ｂの材質は、樹脂やガラス等であってよい。微小孔アレイ層１１ｂの材質は、基板１１ａの材質と同じでもよいし基板１１ａの材質と異なっていてもよい。また、微小孔アレイ層１１ｂは基板１１ａと同じ材料で一体化されていてもよい。また、微小孔アレイ層１１ｂは基板１１ａと同じ材料で一体成型されていてもよい。樹脂からなる微小孔アレイ層１１ｂの材質の例としては、シクロオレフィンポリマーや、シリコン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂などが挙げられる。なお、微小孔アレイ層１１ｂの例として示されたこれらの材質はあくまでも例であり、微小孔アレイ層１１ｂの材質はこれらには限られない。

【0024】

また、微小孔アレイ層１１ｂは着色されていてもよい。微小孔アレイ層１１ｂが着色されていると、反応容器５ａ内で蛍光、発光、吸光度等の光の測定をする場合に、測定対象となる反応容器５ａに近接する他の反応容器５ａからの光の影響が軽減される。
微小孔アレイ層１１ｂは、基板１１ａ上に積層された疎水性膜のベタパターンに対してエッチング、エンボス形成、又は切削等の加工が施されることによって反応容器５ａが形成される。

【0025】

また、微小孔アレイ層１１ｂが基板１１ａと一体成型される場合は、基板１１ａにエッチング、エンボス形成、又は切削等の加工が施されることによって、微小孔アレイ層１１ｂに、反応容器５ａに相当する部分が形成される。これによって、疎水部及び親水部を有するパターンを基板に形成することができる。
後述する実施例では、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が疎水部、ガラスが親水部に相当する。
疎水部及び親水部を有するパターンを有する基板は、油性封止液２２によって、検出反応試薬２１(ビーズ等の粒子、検出対象物質を含んでいてよい)を、各反応容器５ａに区分するときに効率的である。

【0026】

しかしながら、基体部１１、すなわち基板１１ａ及び微小孔アレイ層１１ｂの両方を疎水部（疎水性の材料）で構成するか、又は親水部（親水性の材料）で構成しても良いし、疎水性、親水性を特に考慮せず構成しても良い。
カバー部１３は、微小孔アレイ層１１ｂとの間に隙間を有して複数の反応容器５ａの開口部分を覆うように配置され、微小孔アレイ層１１ｂとカバー部１３との間に、各種の液体が流れる流路を形成する。本実施形態では、微小孔アレイ層１１ｂとカバー部１３との間を、注入口部から排出口部へ向かって各種の液体が流れる。例えば、微小孔アレイ層１１ｂと向かい合うように板状のカバー部１３を配置し、微小孔アレイ層１１ｂとカバー部１３とを、これらの間に所定の隙間をもって別部材により位置決めすることによって、上下が微小孔アレイ層１１ｂとカバー部１３に囲まれ、側面が別部材により囲まれた流路を形成している。

【0027】

次に、本実施形態に係る生体分子解析用キットに好適な試薬の組成について説明する。
検出反応試薬２１は、微小孔アレイ層１１ｂとカバー部１３との間に形成された流路に、注入口部から送液可能な溶液である。検出反応試薬２１は、解析対象物質に関連する鋳型核酸に対する酵素反応などの生化学的反応を行うための試薬である。
鋳型核酸に対する生化学的反応は、例えば、鋳型核酸が存在する条件下でシグナル増幅が起こるような反応である。検出反応試薬２１は、例えば核酸を検出可能な方法に応じて選択される。具体的には、インベーダー（登録商標）法や、ＬＡＭＰ法（商標登録）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法、又は蛍光プローブ法やその他の方法に使用される試薬が本実施形態の検出反応試薬２１に含まれる。

【0028】

例えば、特定の遺伝子が解析（検出）対象の場合、鋳型核酸そのもの、又は鋳型核酸の一部分が解析対象となる。
そして、検出対象の物質（生体分子）は、検出反応試薬２１に混合して、核酸定量用アレルデバイス５に送液される。このとき、マイクロビーズ等の粒子を検出反応試薬２１に分散させることによって、マイクロビーズ等の粒子により、検出対象の物質が、捕捉される。マイクロビーズの例としては、後述する標識ビーズなどが挙げられる。

【0029】

次に、本実施形態に係る生体分子解析用キットに適用可能な生体物質を捕捉するビーズ１について説明する。
生体分子は、それ自体は水の中に分散しているため、反応容器５ａの中に重力等の外力で落ちることは無い。そこで、水と比重の異なるビーズ１に生体分子を捕捉させて反応容器５ａ内に落とし込む。ビーズ１の材質は特に限定されるものではないが、磁性ビーズを使うことで磁力により反応容器５ａの中に引き込むことも可能である。また、生体分子がＤＮＡの場合には、ビーズ１にＤＮＡプローブの標識を行い、生体分子がタンパク質の場合には、ビーズ１に抗体標識を行うことができる。ビーズ１の形状は、反応容器５ａの開口部から反応容器５ａ内にビーズ１を収容可能な大きさであればよく、且つ、１つのビーズ１が１つの反応容器５ａに収容されたときに、反応容器５ａの開口側から見て、反応容器５ａの開口部（つまり、微小孔２の開口部２ａ）の形状と、ビーズ１の形状とが非相似形状であればよい。

【0030】

次に、本実施形態に係る生体分子解析用キットに適用可能な油性封止液２２の組成について説明する。
油性封止液２２は、微小孔アレイ層１１ｂとカバー部１３との間に注入口部から送液可能な溶液である。油性封止液２２は、解析対象物質を含む試料と混合しない材料から選ぶことができる。油性封止液２２としてはミネラルオイルやクロロホルム、スクアレン、ヘキサデカン、フッ素系液体のＦＣ−４０等を用いることができる。

【0031】

解析シグナル（検出対象）が蛍光の場合、反応容器５ａ中に収容された検出反応試薬に含まれる蛍光色素などに測定用の励起光を当て、発生した蛍光を測定する。このとき、カバー部１３が励起光を受けて、蛍光を発することがある。これを自家蛍光という。
このようなとき、本来測定すべき反応容器５ａ中の蛍光が自家蛍光によって、Ｓ／Ｎ比が悪くなり、測定精度が下がることがある。このようなことを防止し、Ｓ／Ｎ比を向上させるために、光吸収性の物質を使用することができる。光吸収性の物質を油性封止液２２に混合することも可能である。

【0032】

光吸収性の物質は、励起光又は観察する波長を吸収するもので、油性封止液に溶解する材料から選ぶことができる。光吸収性の物質としては、顔料、染料、クエンチャー（励起エネルギー吸収剤）などから選ぶことができる。
光吸収性の物質を含む油性封止液２２を使用することで、次のような効果を得ることができる。つまり、例えば基体部１１側から励起光を照射し、反応容器５ａ内に存在する検出対象からの蛍光を測定する場合、光吸収性の物質を含む油性封止液２２によって、カバー部１３側に入射される励起光が吸収され、また、カバー部１３が励起光を受けて蛍光した光が吸収されるため、自家蛍光の発生を抑制でき、また、発生した自家蛍光が測定側（基体部１１）に到達しないため、Ｓ／Ｎ比の悪化を防止し、測定精度を高くすることが可能となる。

【実施例】

【0033】

次に、本発明のアレイデバイスを適用した生体分子解析用キットの作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
＜アレイデバイスの作製＞
０．５ｍｍ厚のガラス製の基板にＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子製）をスピンコートした後、１８０℃で１時間ベークした。形成されたＣＹＴＯＰの厚みは３μｍだった。ＣＹＴＯＰを基板にスピンコートによってコートした後、ポジティブフォトレジストをコートし、フォトマスクを用いて反応容器５ａとなる微小孔のパターンを形成した。その後、Ｏ_２（酸素）プラズマによってＣＹＴＯＰをドライエッチングした。表面に残ったフォトレジストを除去するためにアセトンとエタノールにより表面を洗浄し、リンスした。

【0034】

図６（ａ）に示すようにＣＹＴＯＰによって形成された開口部の形状が正方形の微小孔（微小空間）である反応容器５ａの直径（１辺の長さ）は５μｍである。また、図６（ｂ）に示す、比較例として作製したＣＹＴＯＰによって形成された開口部の形状が円形の微小孔である反応容器５ａの直径は５μｍである。
本実施例では、基板１１ａがガラス、微小孔アレイ層１１ｂがＣＹＴＯＰ（登録商標）で構成された基体部１１が得られる。

【0035】

アレイデバイス５は、上述のようにして作製した１つのブロックに１０，０００個の反応容器５ａとしての微小孔を有する。このブロックがアレイデバイス５に複数個形成されており、合計１００万個の微小孔が形成された。図５に示すように、送液ポート（注入口部、排出口部：図示せず）を有するガラス製の板（カバー部１３）と基体部１１（基板１１ａ、微小孔アレイ層１１ｂを含む部分）とを、５０μｍの厚みを有し、流路形状に加工された両面テープを用いて接着した。

【0036】

＜ビーズと検出反応試薬との混合液の送液＞
まず、インベーダー反応のターゲットＤＮＡを標識した直径３μｍの球体の蛍光ビーズとインベーダー反応試薬（１μＭ アレルプローブ、１μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０Ｕ／μＬ クリベース、Ｔｗｅｅｎ ２０）２２μl及びＤＮＡ（検出反応試薬）を、送液ポートを通じてアレイデバイスに送液した。
その後、油性封止液としての検出反応試薬と混ざり合わないＦＣ−４０（Ｓｉｇｍａ）を、送液ポートを通じて８０μl送液することで各微小孔内に試薬を分割して封入した。これを６３℃のホットプレート上で１５分間加熱し、インベーダー反応を実施した。

【0037】

次に、蛍光顕微鏡（オリンパス製）を使用し、ＮＩＢＡの蛍光フィルタを用いて各微小孔の蛍光を検出した。露光時間は、１０００ｍｓｅｃとした。
開口部の形状が正方形の微小孔を用いたときの蛍光画像を図７（ａ）に示し、開口部の形状が円形の微小孔を用いたときの蛍光画像を図７（ｂ）に示す。また、開口部の形状が、正方形の微小孔と円形の微小孔とを用いたときの全ての微小孔数に対する反応が起こった微小孔の数を表１に示す。また、蛍光ビーズを数えた後、蛍光ビーズが入っている微小孔の中でインベーダー反応による蛍光が観察された微小孔を数えることでターゲットＤＮＡが含まれていたかを計算することができる。

【0038】

【表1】

【0039】

表１に示すように、同数の微小孔に対し、蛍光ビーズが入った微小孔数は、開口部の形状が正方形である方が円形である場合に比較して倍程度であり、微小孔に蛍光ビーズが入った割合は、開口部の形状が正方形である場合の方が大きいことが確認された。
開口部の形状が正方形の微小孔では、微小孔に蛍光ビーズが収容される際に、微小孔の角部分に必ず隙間ができる。そのため、この隙間が微小孔内の反応試薬の排出路となり、微小孔に入っていた反応試薬が抜けて蛍光ビーズと入れ替わりやすい。これにより微小孔に収容される蛍光ビーズの数が増えるため、蛍光観察の精度が向上することが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0040】

本発明は、生体分子解析用の反応容器にビーズ等の粒子を収容して、生体分子解析を行うようにした生体分子解析用キットや、核酸定量用のアレイデバイス等への利用が可能である。

【符号の説明】

【0041】

１ ビーズ
２ 微小孔
２ａ 開口部
２ｂ 空間
５ アレイデバイス
５ａ 反応容器
１０ 溶媒の排出路
１１ 基体部
１１ａ 基板
１１ｂ 微小孔アレイ層
１３ カバー部
２１ 検出反応試薬
２２ 油性封止液

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】