特許 6809704 酸化ストレスマーカー及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6809704

(24)【登録日】2020年12月14日

(45)【発行日】2021年1月6日

(54)【発明の名称】酸化ストレスマーカー及びその使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20201221BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20201221BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20201221BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20201221BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68ZNA

   G01N33/53 D

   G01N27/62 V

   !C07K14/47

【請求項の数】9

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2016-232947(P2016-232947)

(22)【出願日】2016年11月30日

(65)【公開番号】特開2018-91649(P2018-91649A)

(43)【公開日】2018年6月14日

【審査請求日】2019年11月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】598041566

【氏名又は名称】学校法人北里研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(72)【発明者】

【氏名】小寺 義男

(72)【発明者】

【氏名】七里 眞義

【審査官】 三好 貴大

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０６９５３６６６（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 OIEN, D.B. et al.，Detection of oxidized methionine in selected proteins, cellular extracts, and blood serums by novel anti-methionine sulfoxide antibodies，Archives of Biochemistry and Biophysics，２００９年，Vol.485,No.1，35-40

【文献】 MOSKOVITZ, J.，Detection and Localization of Methionine Sulfoxide Residues of Specific Proteins in Brain Tissue，Protein & Peptide Letters，２０１４年，Vol. 21, No. 1，p52-55

【文献】 LANGE, V. et al.，Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial，Molecular Systems Biology，２００８年，4(222)，1-14

【文献】 GALLIEN, S. et al，Selected reaction monitoring applied to proteomics，Journal of Mass Spectrometry，２０１１年，46，298-312

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト由来の生体試料中のタンパク質の酸化されたメチオニン残基からなる酸化ストレスマーカーであって、
前記タンパク質がヒト血清アルブミンであり、前記メチオニン残基が配列番号１に示されるヒト血清アルブミンのアミノ酸配列の第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であるか、又は、
前記タンパク質がヒトイムノグロブリンであり、前記メチオニン残基が、配列番号２に示されるヒトイムノグロブリンＧ１の定常領域のアミノ酸配列の第１３５番目のメチオニン残基、配列番号３に示されるヒトイムノグロブリンＧ２の定常領域のアミノ酸配列の第１３１番目のメチオニン残基、配列番号４に示されるヒトイムノグロブリンＧ３の定常領域のアミノ酸配列の第１８２番目のメチオニン残基、若しくは配列番号５に示されるヒトイムノグロブリンＧ４の定常領域のアミノ酸配列の第１３２番目のメチオニン残基である、酸化ストレスマーカー。

【請求項2】

前記生体試料が、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗、組織、細胞培養上清又は細胞破砕物である、請求項１に記載の酸化ストレスマーカー。

【請求項3】

被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程を備え、
前記量比又は前記濃度が、前記被験者の酸化ストレスレベルを示し、
前記タンパク質がヒト血清アルブミンであり、前記メチオニン残基が配列番号１に示されるヒト血清アルブミンのアミノ酸配列の第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であるか、又は、
前記タンパク質がヒトイムノグロブリンであり、前記メチオニン残基が、配列番号２に示されるヒトイムノグロブリンＧ１の定常領域のアミノ酸配列の第１３５番目のメチオニン残基、配列番号３に示されるヒトイムノグロブリンＧ２の定常領域のアミノ酸配列の第１３１番目のメチオニン残基、配列番号４に示されるヒトイムノグロブリンＧ３の定常領域のアミノ酸配列の第１８２番目のメチオニン残基、若しくは配列番号５に示されるヒトイムノグロブリンＧ４の定常領域のアミノ酸配列の第１３２番目のメチオニン残基である、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定方法。

【請求項4】

前記生体試料が、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗又は生検組織である、請求項３に記載の測定方法。

【請求項5】

前記量比又は前記濃度が、質量分析、又は対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体により測定される、請求項３又は４に記載の測定方法。

【請求項6】

前記濃度が質量分析により測定され、前記測定する工程において、前記生体試料に、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドが添加される、請求項３又は４に記載の測定方法。

【請求項7】

被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定するための試薬を備え、
前記タンパク質がヒト血清アルブミンであり、前記メチオニン残基が配列番号１に示されるヒト血清アルブミンのアミノ酸配列の第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であるか、又は、
前記タンパク質がヒトイムノグロブリンであり、前記メチオニン残基が、配列番号２に示されるヒトイムノグロブリンＧ１の定常領域のアミノ酸配列の第１３５番目のメチオニン残基、配列番号３に示されるヒトイムノグロブリンＧ２の定常領域のアミノ酸配列の第１３１番目のメチオニン残基、配列番号４に示されるヒトイムノグロブリンＧ３の定常領域のアミノ酸配列の第１８２番目のメチオニン残基、若しくは配列番号５に示されるヒトイムノグロブリンＧ４の定常領域のアミノ酸配列の第１３２番目のメチオニン残基である、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定用キット。

【請求項8】

前記試薬が、対象タンパク質を質量分析するための試薬、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチド又は対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体である、請求項７に記載のキット。

【請求項9】

被験物質の投与下及び非投与下の被験者からそれぞれ採取された生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程と、
前記量比又は前記濃度が、前記被験物質の投与下及び非投与下で有意に異なる場合に、前記被験物質は被験者の酸化ストレスレベルに影響を与える物質であると判定する工程と、
を備え、
前記タンパク質がヒト血清アルブミンであり、前記メチオニン残基が配列番号１に示されるヒト血清アルブミンのアミノ酸配列の第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であるか、又は、
前記タンパク質がヒトイムノグロブリンであり、前記メチオニン残基が、配列番号２に示されるヒトイムノグロブリンＧ１の定常領域のアミノ酸配列の第１３５番目のメチオニン残基、配列番号３に示されるヒトイムノグロブリンＧ２の定常領域のアミノ酸配列の第１３１番目のメチオニン残基、配列番号４に示されるヒトイムノグロブリンＧ３の定常領域のアミノ酸配列の第１８２番目のメチオニン残基、若しくは配列番号５に示されるヒトイムノグロブリンＧ４の定常領域のアミノ酸配列の第１３２番目のメチオニン残基である、前記被験者の酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、酸化ストレスマーカー及びその使用に関する。より詳細には、酸化ストレスマーカー、酸化ストレスレベルの測定方法、酸化ストレスレベルの測定用キット及び生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

酸化ストレスは、老化現象のみならず、癌・糖尿病・心血管病・神経変性疾患等の様々な疾患の発症・進展に関連することが明らかになりつつある。特に、罹患率が増加している糖尿病等の生活習慣病においては、酸化ストレスの亢進が重要な臓器障害の進展因子として注目されている。

【0003】

このため、生体の酸化ストレスレベルを正確に評価できるバイオマーカーの開発が求められている。従来、生体の酸化ストレスレベルを評価する方法としては、生体試料中の活性酸素種又は活性窒素種の定量、活性酸素種又は活性窒素種により傷害された生体分子の定量等が試みられてきた（例えば、非特許文献１を参照。）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ho E., et al., Biological markers of oxidative stress: Applications to cardiovascular research and practice, Redox Biol., 1, 483-491, 2013.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、活性酸素種及び活性窒素種は、半減期が非常に短く高い化学反応性を有しているため、測定が困難な場合がある。このため、生体の酸化ストレスレベルの評価は、活性酸素種又は活性窒素種により傷害された生体分子の定量により行われる場合が多い。しかしながら、従来のバイオマーカーでは、生体の酸化ストレスレベルを正確に捉えることが困難である。そこで、本発明は、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、以下の態様を含む。
［１］生体試料中のタンパク質の酸化されたメチオニン残基からなる酸化ストレスマーカー。
［２］前記生体試料が、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗、組織、細胞培養上清又は細胞破砕物である、［１］に記載の酸化ストレスマーカー。
［３］前記タンパク質が血清アルブミン又はイムノグロブリンである、［１］又は［２］に記載の酸化ストレスマーカー。
［４］前記タンパク質が血清アルブミンであり、前記メチオニン残基が前記血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基である、［１］〜［３］のいずれかに記載の酸化ストレスマーカー。
［５］前記タンパク質がイムノグロブリンであり、前記イムノグロブリンがイムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であり、前記メチオニン残基が、前記イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基、前記イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基、前記イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基、又は前記イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基である、［１］〜［３］のいずれかに記載の酸化ストレスマーカー。
［６］被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程を備え、前記量比又は前記濃度が、前記被験者の酸化ストレスレベルを示す、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定方法。
［７］前記生体試料が、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗又は生検組織である、［６］に記載の測定方法。
［８］前記対象タンパク質が血清アルブミン又はイムノグロブリンである、［６］又は［７］に記載の測定方法。
［９］前記対象タンパク質が血清アルブミンであり、前記対象メチオニン残基が前記血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基である、［６］〜［８］のいずれかに記載の測定方法。
［１０］前記対象タンパク質がイムノグロブリンであり、前記イムノグロブリンがイムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であり、前記メチオニン残基が、前記イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基、前記イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基、前記イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基、又は前記イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基である、［６］〜［８］のいずれかに記載の測定方法。
［１１］前記量比又は前記濃度が、質量分析、又は対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体により測定される、［６］〜［１０］のいずれかに記載の測定方法。
［１２］前記濃度が質量分析により測定され、前記測定する工程において、前記生体試料に、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドが添加される、［６］〜［１１］のいずれかに記載の測定方法。
［１３］被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定するための試薬を備える、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定用キット。
［１４］前記試薬が、対象タンパク質を質量分析するための試薬、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチド又は対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体である、［１３］に記載のキット。
［１５］被験物質の投与下及び非投与下の対象からそれぞれ採取された生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程と、前記量比又は前記濃度が、前記被験物質の投与下及び非投与下で有意に異なる場合に、前記被験物質は生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質であると判定する工程と、を備える、生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法。

【発明の効果】

【0007】

本発明により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定する技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１におけるメチオニン残基の酸化比の測定結果を示すグラフである。

【図2】（ａ）は、実験例２の血糖標準偏差低値群及び血糖標準偏差高値群のＨｂＡ１ｃ（％）の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２の血糖標準偏差低値群及び血糖標準偏差高値群におけるメチオニン残基の酸化比の測定結果を示すグラフである。

【図3】（ａ）〜（ｄ）は、実験例３の結果を示すＭＳクロマトグラムである。

【図4】（ａ）〜（ｃ）は、実験例４におけるメチオニン残基の酸化比の測定結果を示すグラフである。

【図5】（ａ）〜（ｃ）は、実験例５におけるメチオニン残基の酸化比の測定結果を示すグラフである。

【図6】（ａ）〜（ｄ）は、実験例６における酸化されたメチオニン残基の濃度の測定結果を示すＭＳクロマトグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0009】

［酸化ストレスマーカー］
１実施形態において、本発明は、生体試料中のタンパク質の酸化されたメチオニン残基からなる酸化ストレスマーカーを提供する。

【0010】

タンパク質のメチオニン残基の酸化は可逆的な酸化反応であり、微弱な酸化ストレスを鋭敏に反映し得る。しかしながら、血液等の生体試料中には膨大な種類と量のタンパク質がダイナミックに存在している。このため、従来、生体試料中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルを定量することは、未知の多くの酵素反応等の影響により不可能であると考えられてきた。

【0011】

これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、生体試料中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルを安定的に測定することが可能であり、メチオニン残基の酸化レベルを、生体の酸化ストレスレベルを示す指標として用いることができることを明らかにした。したがって、生体試料中のタンパク質の酸化されたメチオニン残基は酸化ストレスマーカーであるということができる。

【0012】

生体試料としては、特に制限されず、生体由来の試料であってもよく、培養細胞由来の試料であってもよい。より具体的には、例えば、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗等の体液、生検組織等の組織、細胞培養上清、細胞破砕物等が挙げられる。また、生体試料は、タンパク質抽出液、組織又は細胞の薄切切片、ろ紙等の素材に吸着させたタンパク質抽出液又は体液等の形態であってもよい。また、メチオニン残基の酸化レベルを測定する対象のタンパク質としては、血清アルブミン、イムノグロブリン等を好適に用いることができるがこれらに限定されない。

【0013】

対象タンパク質が血清アルブミンである場合、酸化レベルを測定する対象のメチオニン残基は、血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であってもよい。

【0014】

また、対象タンパク質がイムノグロブリンである場合、イムノグロブリンは、イムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であってもよい。

【0015】

また、酸化レベルを測定する対象のメチオニン残基は、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基であってもよい。

【0016】

血清アルブミンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、イムノグロブリンＧ１の定常領域のアミノ酸配列を配列番号２に示し、イムノグロブリンＧ２の定常領域のアミノ酸配列を配列番号３に示し、イムノグロブリンＧ３の定常領域のアミノ酸配列を配列番号４に示し、イムノグロブリンＧ４の定常領域のアミノ酸配列を配列番号５に示す。

【0017】

実施例において後述するように、発明者らは、血清アルブミンの第１１１番目及び第１４７番目のメチオニン残基、並びにイムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基、イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基の酸化レベルを、生体の酸化ストレスレベルのマーカーとして用いることができることを明らかにした。

【0018】

メチオニン残基の酸化レベルは、例えば、対象タンパク質の酵素消化ペプチドを液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）で解析し、対象メチオニン残基を含むペプチドにおいて、メチオニン残基が酸化されていないペプチドの信号強度とメチオニン残基が酸化されているペプチドの信号強度とを比較することにより求めることができる。以下、対象メチオニン残基が酸化されているペプチドと対象メチオニン残基が酸化されていないペプチドとの量比、又は酸化されていない対象メチオニン残基と酸化された対象メチオニン残基との量比のことを「酸化比」という場合がある。

【0019】

なお、質量分析計を用いてペプチドを測定する場合、ペプチドによってイオン化効率が違うため、正確なモル比を求めることが困難な場合がある。本明細書において、「量比」とは、ＭＳクロマトグラムにおける信号強度の比（ピーク面積の比）を意味する。

【0020】

あるいは、酸化されたメチオニン残基の濃度を定量し、当該濃度を生体の酸化ストレスレベルの指標として用いることもできる。

【0021】

具体的には、まず、生体試料に、内部標準として対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドを添加する。ここで、安定同位体標識ペプチドは、対象メチオニン残基が酸化されていても酸化されていなくてもよいが、対象メチオニン残基が酸化されたペプチドの標準であることから、対象メチオニン残基が酸化されているものであることが好ましい。続いて、生体試料を酵素消化し、対象タンパク質の酵素消化ペプチドをＬＣ−ＭＳで解析する。なお、安定同位体標識ペプチドを添加するタイミングはこれに限られず、試料調製のいずれかの段階で添加すればよい。例えば、生体試料の酵素消化後であってもよいし、試料をＬＣ−ＭＳに供する直前であってもよい。

【0022】

そして、メチオニン残基が酸化されているペプチドと内部標準の信号強度を比較することにより、メチオニン残基が酸化されているペプチドの濃度を定量することができる。

【0023】

上記の安定同位体標識ペプチドは、生体試料の酵素消化に用いる酵素と同じ酵素で得られるペプチド断片のアミノ酸配列を有しているか、あるいは、生体試料を酵素消化する時に、対象タンパク質と同時に酵素消化され、対象タンパク質の酵素消化ペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチド断片となるペプチドである必要がある。

【0024】

［酸化ストレスレベルの測定方法］
１実施形態において、本発明は、被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程を備え、前記量比又は前記濃度が、前記被験者の酸化ストレスレベルを示す、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定方法を提供する。

【0025】

本実施形態の測定方法において、生体試料としては、例えば、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗、生検組織等が挙げられる。また、生体試料は、タンパク質抽出液、組織又は細胞の薄切切片、ろ紙等の素材に吸着させたタンパク質抽出液又は体液等の形態であってもよい。また、対象タンパク質は、血清アルブミン又はイムノグロブリンであってもよい。対象タンパク質が血清アルブミンである場合、対象メチオニン残基は血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であってもよい。

【0026】

また、前記タンパク質がイムノグロブリンである場合、イムノグロブリンは、イムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であってもよい。

【0027】

また、対象メチオニン残基は、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基であってもよい。

【0028】

本実施形態の測定方法において、前記量比又は前記濃度は、質量分析、又は対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体等により測定することができる。質量分析は、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）で行うことが好ましい。

【0029】

より具体的には、メチオニン残基の酸化レベルは、例えば、対象タンパク質の酵素消化ペプチドをＬＣ−ＭＳで解析し、対象メチオニン残基を含むペプチドにおいて、メチオニン残基が酸化されているペプチド及びメチオニン残基が酸化されていないペプチドの信号強度をそれぞれ比較し、上述した酸化比を算出することにより求めることができる。

【0030】

あるいは、被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されたメチオニン残基の濃度を定量し、被験者の酸化ストレスレベルの指標として用いることもできる。

【0031】

酸化されたメチオニン残基の濃度の定量方法は上述したものと同様である。具体的には、まず、生体試料に、内部標準として対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドを添加する。続いて、生体試料を酵素消化し、対象タンパク質の酵素消化ペプチドをＬＣ−ＭＳで解析する。なお、安定同位体標識ペプチドを添加するタイミングはこれに限られず、試料調製のいずれかの段階で添加すればよい。例えば、生体試料の酵素消化後であってもよいし、試料をＬＣ−ＭＳに供する直前であってもよい。

【0032】

そして、メチオニン残基が酸化されているペプチドと内部標準の信号強度を比較することにより、メチオニン残基が酸化されているペプチドの濃度を定量することができる。

【0033】

被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比又は濃度を測定する場合、対象タンパク質に特異的な抗体を用いて、生体試料中の対象タンパク質を精製する工程を実施してもよい。これにより、夾雑タンパク質を除去し、より信頼性の高い測定を行うことが可能になる。

【0034】

具体的には、対象タンパク質に特異的な抗体を結合したビーズを生体試料に添加し、対象タンパク質を抗体に結合させて回収することが挙げられる。ビーズの回収は、遠心分離、又は磁気ビーズを使用した場合にはマグネティックスタンド等を用いて行うことができる。この場合、対象タンパク質に特異的な抗体は、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体であってもよく、対象メチオニン残基が酸化されているか否かに関わらず対象タンパク質を特異的に認識する抗体であってもよい。

【0035】

あるいは、対象タンパク質を特異的に認識する抗体と、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法、ドットブロット法、ＥＬＩＳＡ法等を行うことにより、生体試料中の対象タンパク質の存在量と、生体試料中の、対象メチオニン残基が酸化された対象タンパク質の存在量を定量し、対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（酸化比）を求めてもよい。

【0036】

あるいは、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法、ドットブロット法、ＥＬＩＳＡ法等を行うことにより、生体試料中の対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基の濃度を定量し、当該濃度を生体の酸化ストレスレベルの指標として用いてもよい。

【0037】

［酸化ストレスレベルの測定用キット］
１実施形態において、本発明は、被験者由来の生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定するための試薬を備える、前記被験者の酸化ストレスレベルの測定用キットを提供する。

【0038】

本実施形態のキットにより、生体の酸化ストレスレベルを測定することができる。本実施形態のキットが備える試薬としては、例えば、タンパク質を質量分析するための試薬、内部標準物質として使用する、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチド、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体、対象メチオニン残基が酸化されているか否かに関わらず対象タンパク質を特異的に認識する抗体等が挙げられる。

【0039】

タンパク質を質量分析するための試薬としては、例えばタンパク質のシステイン残基の還元剤、システイン残基のアルキル化剤、タンパク質をペプチドに分解する酵素等が挙げられる。

【0040】

タンパク質のシステイン残基の還元剤としては、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール等が挙げられる。また、システイン残基のアルキル化剤としては、ヨードアセトアミド等が挙げられる。また、タンパク質をペプチドに分解する酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ等が挙げられる。

【0041】

すなわち、本実施形態のキットは、システイン残基の還元剤、システイン残基のアルキル化剤、及びタンパク質をペプチドに分解する酵素を備えるものであってもよい。

【0042】

本実施形態のキットは、対象タンパク質の対象メチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドを含んでいてもよい。安定同位体としては、例えば、^２Ｈ、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ等が挙げられるがこれらに限定されない。安定同位体標識ペプチドは、配列番号６、７又は８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。安定同位体標識ペプチドは、対象メチオニン残基が酸化されていても酸化されていなくてもよいが、対象メチオニン残基が酸化されたペプチドの標準であることから、対象メチオニン残基が酸化されているものであることが好ましい。上述したように、これらのペプチドは、生体の酸化ストレスレベルの測定用に好適に用いることができる。

【0043】

対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体、対象メチオニン残基が酸化されているか否かに関わらず対象タンパク質を特異的に認識する抗体としては、血清アルブミンを特異的に認識する抗体、血清アルブミンの第１１１番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、血清アルブミンの第１４７番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧを特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ１を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ２を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ３を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ４を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ１の第１３５番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ２の第１３１番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ３の第１８２番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、イムノグロブリンＧ４の第１３２番目の酸化されたメチオニン残基を特異的に認識する抗体、メチオニン残基が酸化されているか否かに関わらず、配列番号６、７又は８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識する抗体等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0044】

すなわち、本実施形態のキットは、これらの抗体のうちのいずれか１つ以上を備えるものであってもよい。

【0045】

［酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の投与下及び非投与下の対象からそれぞれ採取された生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程と、前記量比又は前記濃度が、前記被験物質の投与下及び非投与下で有意に異なる場合に、前記被験物質は生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質であると判定する工程と、を備える、生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質のスクリーニング方法を提供する。

【0046】

生体の酸化ストレスレベルに影響を与える物質としては、生体の酸化ストレスレベルを低下させる物質、生体の酸化ストレスレベルを上昇させる物質等が挙げられる。

【0047】

本実施形態のスクリーニング方法において、対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を低下させる被験物質は、生体の酸化ストレスレベルを低下させる物質であるということができる。

【0048】

また、対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を上昇させる被験物質は、生体の酸化ストレスレベルを上昇させる物質であるということができる。

【0049】

例えば、投与することにより生体の酸化ストレスレベルを低下させる物質は、老化現象、癌・糖尿病・心血管病・神経変性疾患等の様々な疾患の発症・進展を抑制又は改善する医薬として用いることができる。

【0050】

また、投与することにより生体の酸化ストレスレベルを上昇させる物質は、上述した各種疾患を憎悪させる物質であると考えられる。このため、例えば、このような物質を含む飲食物の摂取を控えるべきである等の判断の指標とすることができる。

【0051】

本実施形態のスクリーニング方法は、インビトロで細胞レベルで行ってもよいし、ヒト又は非ヒト動物に被験物質を投与して生体レベルで行ってもよい。

【0052】

本実施形態のスクリーニング方法において、生体試料としては、生検組織を含む各種組織、臓器、細胞培養上清、細胞破砕物、血液、尿、脳脊髄液、唾液、汗等が挙げられるがこれらに限定されない。また、生体試料は、タンパク質抽出液、組織又は細胞の薄切切片、ろ紙等の素材に吸着させたタンパク質抽出液又は体液等の形態であってもよい。

【0053】

また、対象タンパク質及び対象メチオニン残基としては上述したものと同様のものを用いることができる。すなわち、対象タンパク質は、血清アルブミン又はイムノグロブリンであってもよい。また、対象タンパク質が血清アルブミンである場合、対象メチオニン残基は血清アルブミンの第１１１番目又は第１４７番目のメチオニン残基であってもよい。

【0054】

また、前記タンパク質がイムノグロブリンである場合、イムノグロブリンは、イムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３又はイムノグロブリンＧ４であってもよい。また、対象メチオニン残基は、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン残基であってもよく、イムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン残基であってもよい。

【0055】

本実施形態のスクリーニング方法において、対象タンパク質の対象メチオニン残基について、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比、又は酸化されたメチオニン残基の濃度を測定する工程は、上述したものと同様の方法により実施することができ、例えば、質量分析、対象タンパク質の酸化された対象メチオニン残基を特異的に認識する抗体等により測定することができる。質量分析は、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）で行うことが好ましい。

【実施例】

【0056】

次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

【0057】

［実験例１］
（生体試料中の対象タンパク質の対象メチオニン残基の酸化レベルの検討）
健常非喫煙者（Ｃ）１８名と２型糖尿病患者（ＤＭ）２３名、腎不全合併２型糖尿病患者（ＲＦ）１２名、健常喫煙者（Ｓ）９名の血清を対象に、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域の後述するメチオニン残基における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％）、以下「酸化比」という。）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。

【0058】

なお、イムノグロブリンＧには、イムノグロブリンＧ１、イムノグロブリンＧ２、イムノグロブリンＧ３及びイムノグロブリンＧ４の４種類のアイソフォームが存在する。本実験例では、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１３５）、イムノグロブリンＧ２の定常領域の第１３１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１３１）、イムノグロブリンＧ３の定常領域の第１８２番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１８２）、及びイムノグロブリンＧ４の定常領域の第１３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１３２）を対象メチオニン残基とした。これらのイムノグロブリンのメチオニン残基は、後述する酵素消化後に、同一のアミノ酸配列を有するペプチド上に存在することになるため、混合物として測定した。

【0059】

表１に、被験者の医学的特徴を示す。実験は、北里大学医学部の倫理委員会に承認を得（Ｂ１５−１８１）、全ての被験者から書面で同意を得たうえで行った。

【0060】

【表1】

【0061】

（血清試料の採取）
まず、各被験者から血液試料を採取した。血液は肘正中静脈から採取し、凝血促進剤を含む容器に入れて室温で凝固させた後、２，０００×ｇで１５分間、室温で遠心した。続いて、血清を回収し、使用するまで−３０℃で保存した。

【0062】

（血清試料の還元アルキル化）
続いて、凍結保存していた血清を融解し、融解した血清２μＬに、２００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム／１２ｍＭデオキシコール酸ナトリウム／１２ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを２０μＬ添加し、更に２００ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩／１２０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウムを２μＬ添加し、５０℃で３０分間インキュベートした。この結果、還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩により、血清試料中のタンパク質のチオール基が還元された。

【0063】

続いて、３７５ｍＭヨードアセトアミドを２μＬ添加し、得られた混合液を暗所で３０分間インキュベートした。この結果、アルキル化剤であるヨードアセトアミドにより、血清試料中のタンパク質のチオール基がアルキル化された。

【0064】

（血清試料のトリプシン消化）
続いて、１００ｎｇ／μＬのリシルエンドペプチダーゼを２μＬ及び１００ｎｇ／μＬのトリプシンを２μＬ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。この結果、血清試料中のタンパク質がペプチドに分解された。続いて、アセトニトリル５０μＬと５％トリフルオロ酢酸５０μＬを添加し、１９，０００×ｇで１５分間遠心し、上清をＬＣ−ＭＳ解析に供した。

【0065】

（酸化比の解析）
Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％）（酸化比）を測定するためには、まず、トリプシン消化した血清試料を、ＨＰＬＣ装置（型式「Ｎａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ」、資生堂）に取り付けた内径２．０ｍｍ×５０ｍｍのカラム（型式「ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＣＫ ＭＧＩＩＩ−Ｈ Ｓ３」、資生堂）に注入した。カラム温度は４５℃に維持した。

【0066】

移動相Ａとして０．０５％ギ酸を使用し、移動相Ｂとして０．０５％ギ酸／９０％アセトニトリルを使用した。移動相の流速を２００μＬ／分とし、移動相のグラジエントを次のようにプログラムした。０％Ｂ（０〜３分）、０〜５５．５％Ｂ（３〜４０分）、５５．５〜８０％Ｂ（４０〜４０．１分）、８０％Ｂ（４０．１〜４５分）。

【0067】

続いて、ペプチドを、ＨＰＬＣからイオントラップ・フーリエ変換ハイブリッド質量分析装置（型式「ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に導入し、ｍ／ｚ ４００における質量分解能３０，０００でフルスキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ ３００〜２，０００）を取得し、目的のペプチドのメチオニン残基のＭｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％）（酸化比）を解析した。

【0068】

血清アルブミンの第１１１番目のメチオニンの酸化比は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの酸化型及び非酸化型の量比に基づいて算出した。また、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニンの酸化比は、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの酸化型及び非酸化型の量比に基づいて算出した。また、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニンの酸化比は、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの酸化型及び非酸化型の量比に基づいて算出した。

【0069】

図１（ａ）は、各被験者の血清アルブミンの第１１１番目のメチオニンにおける酸化比の解析結果を示すグラフである。また、図１（ｂ）は、各被験者の血清アルブミンの第１４７番目のメチオニンにおける酸化比の解析結果を示すグラフである。また、図１（ｃ）は、各被験者のイムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニンにおける酸化比の解析結果を示すグラフである。

【0070】

図１中、「Ｃ」は健常非喫煙者の結果であることを表し、「ＤＭ」は２型糖尿病患者の結果であることを表し、「ＲＦ」は腎不全合併２型糖尿病患者の結果であることを表し、「Ｓ」は健常喫煙者の結果であることを表す。

【0071】

また、各群の酸化比のレベルを比較するために、Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｐｏｓｔ ｈｏｃテストを行った。図１中、「＊」は相関係数（ｐ値）５％未満で有意差があることを表し、「＊＊」はｐ値０．５％未満で有意差があることを表し、「＊＊＊」はｐ値０．０１％未満で有意差があることを表す。

【0072】

その結果、血清アルブミンの２種類のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１１１、Ｍｅｔ−１４７）の酸化比は、健常非喫煙者群より２型糖尿病の両群（腎不全なし、腎不全合併）で有意に高値を示すことが明らかとなった。また、健常喫煙者群の酸化比も、健常非喫煙群と比較して有意に高値を示すことが明らかとなった。また、イムノグロブリンＧ１の定常領域のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１３５）の酸化比も、糖尿病患者群では健常者群に比べて有意に高値を示すことが明らかとなった。

【0073】

また、この結果から、血清アルブミンの２種類のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１１１、Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧ１の定常領域のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１３５）の酸化比を、２型糖尿病の診断に応用できることが明らかとなった。

【0074】

また、血清アルブミンの２種類のメチオニン残基（Ｍｅｔ−１１１、Ｍｅｔ−１４７）の酸化比により、糖尿病と腎不全の病態を区別できることが明らかとなった。

【0075】

［実験例２］
（血糖値の変動が酸化ストレスレベルに与える影響の検討）
糖尿病では血糖値の変動が大きくなると酸化ストレスレベルを上昇させることが知られている。そこで、血糖値の変動と酸化比との関連を検討した。

【0076】

まず、持続血糖計測装置を用いて、糖尿病患者の血糖値を４８時間にわたって測定した。続いて、血糖値の変動の最も正確な指標として、全ての血糖値のデータの標準偏差（４８時間血糖標準偏差）を求めた。

【0077】

続いて、得られた４８時間血糖標準偏差の数値に基づいて、糖尿病患者を、血糖標準偏差低値群（ｎ＝１１）、中間群、高値群（ｎ＝１２）の３群に分類し、低値群と高値群を比較した。

【0078】

図２（ａ）は、低値群及び高値群の糖尿病患者の平均血糖値を表すＨｂＡ１ｃ（％）を示すグラフである。また、図２（ｂ）は、低値群及び高値群の糖尿病患者の血清アルブミン（Ｍｅｔ−１１１）の酸化比の測定結果を示すグラフである。図２中、「＊」は相関係数（ｐ値）５％未満で有意差があることを表す。

【0079】

その結果、低値群及び高値群の糖尿病患者の間で、ＨｂＡ１ｃの値には有意差が認められなかったにもかかわらず、高値群では血清アルブミン（Ｍｅｔ−１１１）の酸化比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ値）が低値群より有意に高値を示すことが明らかとなった。

【0080】

以上の結果から、血清アルブミン（Ｍｅｔ−１１１）の酸化比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））を測定することにより、血糖値の変動による酸化ストレスレベルの上昇も検出することができることが明らかとなった。この結果は、実験例１の方法により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定できることを更に支持するものである。

【0081】

［実験例３］
（メチオニン残基の酸化レベルの安定性の検討１）
メチオニン残基の酸化レベルは多くの実験条件下で変動しやすいと考えられている。そこで、試料中のタンパク質の還元アルキル化工程及び酵素消化工程において、メチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。

【0082】

モニター用のペプチドとして、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を使用し、これに含まれる、配列番号６に記載のペプチド及び配列番号７に記載のペプチドを解析の対象とした。

【0083】

β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、そのまま、又はヒト血清に血清１μＬあたり２．５μｇ添加し、実験例１と同様にして還元アルキル化及びトリプシン消化した後に、それぞれＬＣ−ＭＳ解析した。

【0084】

図３（ａ）は、β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、そのままＬＣ−ＭＳ解析し、酸化状態及び非酸化状態の配列番号９に記載のペプチドを定量した結果を示すＭＳクロマトグラムである。

【0085】

また、図３（ｂ）は、β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、血清に添加して還元アルキル化及びトリプシン消化した後にＬＣ−ＭＳ解析し、酸化状態及び非酸化状態の配列番号９に記載のペプチドを定量した結果を示すＭＳクロマトグラムである。

【0086】

また、図３（ｃ）は、β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、そのままＬＣ−ＭＳ解析し、酸化状態及び非酸化状態の配列番号１０に記載のペプチドを定量した結果を示すＭＳクロマトグラムである。

【0087】

また、図３（ｄ）は、β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物を、血清に添加して還元アルキル化及びトリプシン消化した後にＬＣ−ＭＳ解析し、酸化状態及び非酸化状態の配列番号１０に記載のペプチドを定量した結果を示すＭＳクロマトグラムである。

【0088】

図３中、酸化されたメチオニン残基を「（Ｏ）」で示す。また、図３中、酸化されたメチオニン残基を含む各ペプチドのピークの上に、縦軸を１０倍に拡大したピークを示す。

【0089】

その結果、図３（ａ）及び図３（ｂ）を比較して、酸化状態と非酸化状態の配列番号９に記載のペプチドのＭＳクロマトグラムのピーク面積の比がほぼ同じであることが明らかとなった。

【0090】

また、同様に、図３（ｃ）及び図３（ｄ）を比較して、酸化状態と非酸化状態の配列番号１０に記載のペプチドのＭＳクロマトグラムのピーク面積の比がほぼ同じであることが明らかとなった。

【0091】

この結果から、還元アルキル化工程及び酵素消化工程を含む試料調製工程では、メチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことが明らかとなった。この結果は、メチオニン残基の酸化レベルは変動しやすいと考えられていることから意外なものであった。この結果は、実験例１の方法により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定できることを更に支持するものである。

【0092】

［実験例４］
（メチオニン残基の酸化レベルの安定性の検討２）
試料調製時間、血清調製条件、試料の凍結融解により、メチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。

【0093】

《試料調製時間の検討》
メチオニン残基の酸化比を正確に測定するためには、試料中のタンパク質を完全に酵素消化することが必要である。そこで、４人の健常非喫煙者由来の血清試料のトリプシン消化時間を、１８、２１及び２４時間と変化させた以外は実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。

【0094】

図４（ａ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。

【0095】

その結果、酵素消化時間を変化させても、メチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことが明らかとなった。

【0096】

《血清調製条件の検討》
血清調製時の血液凝固時間を変えることにより、血清中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。

【0097】

６人の健常非喫煙者由来の血液の凝固時間を、０、０．５、１、２及び６時間と変化させて血清試料を調製し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。

【0098】

図４（ｂ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。

【0099】

その結果、血清調製時の血液凝固時間を変化させても、メチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことが明らかとなった。

【0100】

《試料の凍結融解の検討》
試料を繰り返し凍結融解することにより、血清中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。

【0101】

４人の健常非喫煙者由来の血清試料を、０、１及び４回凍結融解し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。

【0102】

図４（ｃ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。

【0103】

その結果、試料の凍結融解を繰り返しても、メチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことが明らかとなった。

【0104】

以上の結果は、様々な条件下においても生体試料中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことを更に支持するものである。この結果は、メチオニン残基の酸化レベルは変動しやすいと考えられていることから意外なものであった。この結果は、実験例１の方法により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定できることを更に支持するものである。

【0105】

［実験例５］
（メチオニン残基の酸化レベルの安定性の検討３）
採血時間、喫煙、ビタミンＣの摂取により、血清試料中のメチオニン残基の酸化レベルが変動するか否かについて検討した。

【0106】

《採血時間の検討》
４人の健常非喫煙者から、１日に９回（午前３時、午前６時、午前７時、午前８時、午前９時、午後４時、午後６時、午後８時及び午後１１時）採血して血清試料を調製し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。

【0107】

図５（ａ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。

【0108】

その結果、メチオニン残基の酸化レベルが日内であまり変動しないことが明らかとなった。

【0109】

《喫煙の検討》
６人の健常喫煙者から、喫煙直前、喫煙後１５分、喫煙後３０分及び喫煙後６０分に採血して血清試料を調製し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧ１の定常領域の第１３５番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１３５）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。

【0110】

図５（ｂ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）の酸化比の測定結果を示すグラフである。図５（ｂ）中、矢印は喫煙した時間を示す。

【0111】

その結果、喫煙によりメチオニン残基の酸化レベルがあまり急激には変動しないことが明らかとなった。

【0112】

《ビタミンＣの摂取の検討》
６人の健常非喫煙者に１０００ｍｇのビタミンＣを含有するタブレットを１日１個、４日間摂取させ、ビタミンＣの摂取開始の直前、摂取開始の２、４、６、２４及び９６時間後に採血して血清試料を調製し、実験例１と同様にして、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）、イムノグロブリンＧの定常領域のメチオニン（イムノグロブリンＧ１のＭｅｔ−１３５、イムノグロブリンＧ２のＭｅｔ−１３１、イムノグロブリンＧ３のＭｅｔ−１８２及びイムノグロブリンＧ４のＭｅｔ−１３２の合計）における、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比（Ｍｅｔ（Ｏ）／Ｍｅｔ（％））（酸化比）をＬＣ−ＭＳ分析により測定した。

【0113】

図５（ｃ）は、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）及びイムノグロブリンＧの定常領域のメチオニンの酸化比の測定結果を示すグラフである。図５（ｃ）中、矢印はビタミンＣを１０００ｍｇ摂取した時間を示す。

【0114】

その結果、ビタミンＣの摂取によりメチオニン残基の酸化レベルがあまり急激には変動しないことが明らかとなった。

【0115】

以上の結果は、様々な条件下においても生体試料中のタンパク質のメチオニン残基の酸化レベルがあまり変動しないことを更に支持するものである。この結果は、メチオニン残基の酸化レベルは変動しやすいと考えられていることから意外なものであった。この結果は、実験例１の方法により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定できることを更に支持するものである。

【0116】

［実験例６］
（生体試料中の対象タンパク質の酸化されたメチオニン残基の定量分析）
健常非喫煙者の血清を対象に、血清アルブミンの第１１１番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１１１）、血清アルブミンの第１４７番目のメチオニン（Ｍｅｔ−１４７）における、酸化されたメチオニン残基の濃度を、酸化された上記のメチオニン残基を含む安定同位体標識ペプチドを内部標準として利用してＬＣ−ＭＳ分析により測定した。

【0117】

内部標準用のペプチドとして、配列番号６に記載のペプチドの第１１番目のアラニン残基及び第１２番目のリジン残基の全ての炭素原子並びに窒素原子を安定同位体原子（^１３Ｃ及び^１５Ｎ）に置換した安定同位体標識ペプチド、及び配列番号７に記載のペプチドに含まれる２つのフェニルアラニン残基の全ての炭素原子及び窒素原子を安定同位体原子（^１３Ｃ及び^１５Ｎ）に置換した安定同位体標識ペプチドを調製した。

【0118】

血清を実験例１と同様にして還元アルキル化及びトリプシン消化した後に、上述した２種類の安定同位体標識ペプチドを血清１μＬあたり１００ｐｍｏｌ（配列番号６）又は２００ｐｍｏｌ（配列番号７）添加した。すなわち、血清中の濃度がそれぞれ１００μＭ又は２００μＭとなるように添加し、実験例１と同様にして、界面活性剤の除去処理を行った後にＬＣ−ＭＳ分析した。

【0119】

図６（ａ）は、血清中に存在していた、酸化されたメチオニン残基を含む配列番号６のペプチドのＭＳクロマトグラムである。また、図６（ｂ）は、内部標準として血清中の濃度が１００μＭとなるように血清に添加した、酸化されたメチオニン残基を含む配列番号６の安定同位体標識ペプチドのＭＳクロマトグラムである。図６（ａ）のＭＳクロマトグラムのピークは、図６（ｂ）のＭＳクロマトグラムのピークに比べて非常に強度が小さかったため、図６（ａ）のピークの上に、縦軸を２０倍に拡大したピークを示した。

【0120】

また、図６（ｃ）は、血清中に存在していた、酸化されたメチオニン残基を含む配列番号７のペプチドのＭＳクロマトグラムである。また、図６（ｄ）は、内部標準として血清中の濃度が２００μＭとなるように血清に添加した、酸化されたメチオニン残基を含む配列番号７の安定同位体標識ペプチドのＭＳクロマトグラムである。図６（ｃ）のＭＳクロマトグラムのピークは、図６（ｄ）に比べて非常に強度が小さかったため、図６（ｃ）のピークの上に、縦軸を４０倍に拡大したピークを示した。

【0121】

その結果、図６（ａ）及び図６（ｂ）を比較して、配列番号６のペプチドと配列番号６の安定同位体標識ペプチドのＭＳクロマトグラムのピーク面積の比から、酸化されたＭｅｔ−１１１を含むトリプシン消化血清アルブミン由来ペプチドの血清中の濃度が、約２．７μＭであることが明らかとなった。

【0122】

また、図６（ｃ）及び図６（ｄ）を比較して、配列番号７のペプチドと配列番号７の安定同位体標識ペプチドのＭＳクロマトグラムのピーク面積の比から、酸化されたＭｅｔ−１４７を含むトリプシン消化血清アルブミン由来ペプチドの血清中の濃度が、約１．３μＭであることが明らかとなった。

【0123】

この結果から、酸化されたＭｅｔ−１１１及びＭｅｔ−１４７を含むそれぞれのトリプシン消化血清アルブミン由来ペプチドの濃度が明らかとなった。この結果は、酸化されたメチオニン残基の絶対量を求めるものであり、実験例１〜実験例５で示した、酸化されていないメチオニン残基と酸化されたメチオニン残基との量比を求める実験とは異なり、生体の酸化ストレスレベルをより直接的に測定することが可能であることを示すものである。

【産業上の利用可能性】

【0124】

本発明により、生体の酸化ストレスレベルを正確に測定する技術を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]