特許 6811711 刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞の調節

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6811711

(24)【登録日】2020年12月17日

(45)【発行日】2021年1月13日

(54)【発明の名称】刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞の調節

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20201228BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201228BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20201228BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20201228BHJP

   C12N 15/00 20060101ALN20201228BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20201228BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALN20201228BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20201228BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20201228BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 TZNA

   A61K39/395 E

   A61P35/00

   A61P37/04

   C12Q1/04

   !C12N15/00

   !C07K14/705

   !C12N5/0784

   !C12N5/0786

   !C07K16/00

【請求項の数】26

【全頁数】128

(21)【出願番号】特願2017-516664(P2017-516664)

(86)(22)【出願日】2015年9月28日

(65)【公表番号】特表2017-538664(P2017-538664A)

(43)【公表日】2017年12月28日

(86)【国際出願番号】US2015052682

(87)【国際公開番号】WO2016049641

(87)【国際公開日】20160331

【審査請求日】2018年8月28日

(31)【優先権主張番号】62/056,569

(32)【優先日】2014年9月28日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/129,883

(32)【優先日】2015年3月8日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】クランメル マシュー

(72)【発明者】

【氏名】ブロズ ミランダ

(72)【発明者】

【氏名】ウォルフ デニス

(72)【発明者】

【氏名】ポラック ジョシュア

(72)【発明者】

【氏名】ビンウィーズ ミカイル

【審査官】 大島 彰公

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１６／０２３０１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５２７５０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０２６２３４８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Journal of Clinical Oncology，２０１３年，vol.31, No.15, Supp.，e22054

【文献】 Monoclonal Antibodies(Third Edition)，１９９６年，p.72-100

【文献】 Cancer Immunol.Immunother.,2009,58(10),p.1577-1586

【文献】 Am.J.Pathol.,2009,174(3),p.1048-1064

【文献】 Curr.Opin.Immunol.,2009,21(1),p.38-46

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ、Ｃ１２Ｑ、Ｃ０７Ｋ、Ｃ１２Ｎ、

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体またはその抗原結合断片を含む、それを必要とする対象の癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞の死滅、減少、または枯渇のための医薬組成物であって、
該抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞上に発現しているＴＲＥＭ２の細胞外ドメインに結合し、かつ
該抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｃ領域を有し、かつ
(a)抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、および抗体媒介性貪食（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性のうちの少なくとも1つを有する、ならびに/または
(b)抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する、
前記医薬組成物。

【請求項2】

前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１４^＋、及びＢＤＣＡ３⁻であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞と前記抗体またはその抗原結合断片との接触前の前記癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞のレベル未満であるレベルまで、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって前記非刺激性骨髄系細胞を死滅、減少、または枯渇させ、前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＢＤＣＡ１⁻、及びＢＤＣＡ３^＋である刺激性骨髄系細胞、ならびに前記非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、ならびに前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、減少、または枯渇により、前記癌組織に対する免疫応答が増進することによって、前記癌が治療される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記抗体またはその抗原結合断片が、前記免疫細胞集団において非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合を増加させる、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

抗体またはその抗原結合断片を含む、それを必要とする対象における癌を治療するための医薬組成物であって、
該抗体またはその抗原結合断片が、癌に存在する1つまたは複数の非刺激性骨髄系細胞上に発現しているＴＲＥＭ２の細胞外ドメインに結合し、
該抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｃ領域を有し、かつ
(a)抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、および抗体媒介性貪食（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性のうちの少なくとも1つを有し、ならびに/または
(b)抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を有し、かつ
前記抗体またはその抗原結合断片が、対象の癌組織に存在する前記非刺激性骨髄系細胞を死滅、減少、または枯渇させる、
前記医薬組成物。

【請求項5】

前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１４^＋、及びＢＤＣＡ３⁻であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞と前記抗体またはその抗原結合断片との接触前の前記癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞のレベル未満であるレベルまで、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって前記非刺激性骨髄系細胞を死滅、減少、または枯渇させ、前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＢＤＣＡ１⁻、及びＢＤＣＡ３^＋である刺激性骨髄系細胞、ならびに前記非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、減少、または枯渇によって前記癌が治療される、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記非刺激性骨髄系細胞が、腫瘍関連マクロファージ；腫瘍関連樹状細胞；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１４^＋、及びＢＤＣＡ３⁻；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＣＤ１４^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ１^＋のうちの少なくとも１つであるか、またはＢＤＣＡ３^＋ではないものであり、こうしたものが、フローサイトメトリーまたは同等のアッセイによって決定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記非刺激性骨髄系細胞が、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、ＴＬＲ７、及びＬＩＬＲＢ４のうち、ＴＲＥＭ２を少なくとも含む１つまたは複数に陽性であり、ならびに／またはＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１のうちの少なくとも１つに陰性であり、こうしたものが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子アレイ、フローサイトメトリー、ＲＮＡ配列解析、または同等のアッセイによって測定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体、アンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体、ポリクローナル抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、アフコシル化抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び全長抗体、ならびにそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞の死、前記非刺激性骨髄系細胞のアポトーシス、前記非刺激性骨髄系細胞の溶解、前記非刺激性骨髄系細胞の貪食、及び前記非刺激性骨髄系細胞の増殖抑止のうちの少なくとも１つを誘導する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記癌が、固形癌または液性癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記癌が、メラノーマ、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、前立腺癌、肺癌、及び乳癌からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記対象が、免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記免疫療法が、チェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、Ｔ細胞のチェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、養子Ｔ細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、樹状細胞ワクチン、単球ワクチン、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質、ＢｉＴＥ抗原結合タンパク質、トール様受容体リガンド、ならびにサイトカインのうちの少なくとも１つである、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

それを必要とする対象の癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞の死滅、減少、または枯渇のための医薬の製造における、抗体またはその抗原結合断片の使用であって、
該抗体またはその抗原結合断片が、非刺激性骨髄系細胞上に発現しているＴＲＥＭ２の細胞外ドメインに結合し、かつ
該抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｃ領域を有し、かつ
(a)抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、および抗体媒介性貪食（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性のうちの少なくとも1つを有する、ならびに/または
(b)抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する、
前記使用。

【請求項15】

前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１４^＋、及びＢＤＣＡ３⁻であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞と前記抗体またはその抗原結合断片との接触前の前記癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞のレベル未満であるレベルまで、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって前記非刺激性骨髄系細胞を死滅、減少、または枯渇させ、前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＢＤＣＡ１⁻、及びＢＤＣＡ３^＋である刺激性骨髄系細胞、ならびに前記非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、ならびに前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、減少、または枯渇により、前記癌組織に対する免疫応答が増進することによって、前記癌が治療される、請求項１４に記載の使用。

【請求項16】

前記抗体またはその抗原結合断片が、前記免疫細胞集団において非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合を増加させる、請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

それを必要とする対象における癌を治療するための医薬の製造における、抗体またはその抗原結合断片の使用であって、
該抗体またはその抗原結合断片が、癌に存在する1つまたは複数の非刺激性骨髄系細胞上に発現しているＴＲＥＭ２の細胞外ドメインに結合し、
該抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｃ領域を有し、かつ
(a)抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、および抗体媒介性貪食（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性のうちの少なくとも1つを有し、ならびに/または
(b)抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を有し、かつ
前記抗体またはその抗原結合断片が、対象の癌組織に存在する前記非刺激性骨髄系細胞を死滅、減少、または枯渇させる、
前記使用。

【請求項18】

前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１４^＋、及びＢＤＣＡ３⁻であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞と前記抗体またはその抗原結合断片との接触前の前記癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞のレベル未満であるレベルまで、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって前記非刺激性骨髄系細胞を死滅、減少、または枯渇させ、前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＢＤＣＡ１⁻、及びＢＤＣＡ３^＋である刺激性骨髄系細胞、ならびに前記非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、減少、または枯渇によって前記癌が治療される、請求項１７に記載の使用。

【請求項19】

前記非刺激性骨髄系細胞が、腫瘍関連マクロファージ；腫瘍関連樹状細胞；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１４^＋、及びＢＤＣＡ３⁻；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＣＤ１４^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ１^＋のうちの少なくとも１つであるか、またはＢＤＣＡ３^＋ではないものであり、こうしたものが、フローサイトメトリーまたは同等のアッセイによって決定される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の使用。

【請求項20】

前記非刺激性骨髄系細胞が、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、ＴＬＲ７、及びＬＩＬＲＢ４のうち、ＴＲＥＭ２を少なくとも含む１つまたは複数に陽性であり、ならびに／またはＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１のうちの少なくとも１つに陰性であり、こうしたものが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子アレイ、フローサイトメトリー、ＲＮＡ配列解析、または同等のアッセイによって測定される、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項21】

前記抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体、アンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体、ポリクローナル抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、アフコシル化抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び全長抗体、ならびにそれらの抗原結合断片のうちの少なくとも１つである、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の使用。

【請求項22】

前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞の死、前記非刺激性骨髄系細胞のアポトーシス、前記非刺激性骨髄系細胞の溶解、前記非刺激性骨髄系細胞の貪食、及び前記非刺激性骨髄系細胞の増殖抑止のうちの少なくとも１つを誘導する、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項23】

前記癌が、固形癌または液性癌である、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項24】

前記癌が、メラノーマ、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、前立腺癌、肺癌、及び乳癌からなる群から選択される、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項25】

前記対象が、免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項26】

前記免疫療法が、チェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、Ｔ細胞のチェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、養子Ｔ細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、樹状細胞ワクチン、単球ワクチン、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質、ＢｉＴＥ抗原結合タンパク質、トール様受容体リガンド、ならびにサイトカインのうちの少なくとも１つである、請求項２５に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月２８日に出願の米国仮出願第６２／０５６，５６９号、及び２０１５年３月８日に出願の米国仮出願第６２／１２９，８８３号の利益を主張し、これらはそれぞれ、その全体が参照によって、すべての目的を対象として本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による支援を受けた研究または開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって付与されたＵ０１ ＣＡ１４１４５１及びＵ５４ ＣＡ１６３１２３の下、政府の支援を受けて実施したものである。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

免疫は、腫瘍の増殖を防止する役割を担っている。病巣内においては、複雑な微小環境が生じ得、Ｔ細胞が動員されるにもかかわらず、腫瘤の発生に対して有効な制御が行われないことが多い。腫瘍の排除と腫瘍エスケープとのバランスに対する理解は、骨髄系細胞が腫瘍微小環境において担う役割の差異に対する理解に依存し得るものである。

【0004】

腫瘍微小環境の骨髄系集団は、単球及び好中球（場合によっては、骨髄系由来の免疫抑制細胞として大まかに群化される）、マクロファージ、ならびに樹状細胞を顕著に含む。腫瘍内の骨髄系集団は、全体として、非刺激性または抑制性であると長く考えられてきたものの、より最近になって、すべての腫瘍浸潤性である骨髄系細胞のすべてが等しく生じるわけではないことが理解されてきた。

【0005】

正常組織では、こうした骨髄系細胞の多くが、自然免疫及び適応免疫の両方を適切に機能させるために必須であり、特に、損傷修復を適切に機能させるために必須なものである。しかしながら、癌の状況においては、一般に、マクロファージが著しく過剰に存在すると共に、こうした細胞型、及び他の細胞型の集団は、機能障害性であるか、または歪曲化されていると説明される。ＣＤ６８またはＣＤ１６３などの単一マーカーによって定義される総集団として考えるとき、「マクロファージ」の浸潤は、複数の腫瘍型において対象の予後が不良であることと関連しており、このことは複数の腫瘍型にあてはまる（（ｄｅ Ｖｉｓｓｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００８；５７：１５３１−９（非特許文献１））、（Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｕｒｏｌ ２０００；７：２６３−９（非特許文献２））、（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２０，２００１；７：４０２１−６（非特許文献３））、（Ｒｕｆｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，５２３ ２０１２；１０９：２７９６−８０１（非特許文献４）））。しかしながら、腫瘍微小環境から、表現型的及び機能的にマクロファージを分画することは、マクロファージ及び樹状細胞が類似しているために複雑なことであり、腫瘍生物学において問題になっている。形態的判定基準は、これまで組織に対して適用されることが多く、１つの手法は、樹状細胞は、よりスパイク状または樹状の形態を有しており、マクロファージは、よりベールに包まれているか、または球状の形態を有していることに基づいて樹状細胞をマクロファージと区別しようとするものであった（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ５５５，１９９９；１９０：１４１７−２６（非特許文献５））。他のグループは、遺伝子マーカー及び細胞表面マーカーに基づく区別を試みているところである。

【0006】

腫瘍内の抗原提示コンパートメントには多様性が存在し、Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の特徴を区別することができる。Ｔ細胞は、腫瘍免疫の主要なけん引役であるため、その同種ＡＰＣの正確な特徴を理解することが重要となるであろう。骨髄系細胞は、腫瘍に由来する抗原をＴ細胞に対して提示し、それによってＴ細胞を活性化状態に維持する能力を有する細胞の中で突出したものである。抗原提示は、腫瘍自体の内部で起こるものであり、腫瘍の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の機能に影響を与える可能性がある。抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞の活性化は、抗原特異的な免疫応答及び腫瘍細胞の死滅における重要な構成要素である。こうした骨髄系集団は、腫瘍反応性である細胞傷害性Ｔリンパ球を流入させるための、主要なＴ細胞相互作用性のパートナーかつ抗原提示細胞に相当するので、その特徴を理解することは、治療の道への導きとなり得るものである。

【0007】

本明細書に引用される特許、特許出願、出版物、文書、及び論文はすべて、参照によって、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】ｄｅ Ｖｉｓｓｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００８；５７：１５３１−９

【非特許文献2】Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｕｒｏｌ ２０００；７：２６３−９

【非特許文献3】Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２０，２００１；７：４０２１−６

【非特許文献4】Ｒｕｆｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，５２３ ２０１２；１０９：２７９６−８０１

【非特許文献5】Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ５５５，１９９９；１９０：１４１７−２６

【発明の概要】

【0009】

対象の癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞の死滅方法、無能化方法、または枯渇方法が本明細書に記載され、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞に結合しかつ対象の癌組織における非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇に有効な量で存在する抗体またはその抗原結合断片と非刺激性骨髄系細胞との接触を含む。いくつかの態様では、非刺激性骨髄系細胞は、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在する。いくつかの態様では、非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇により、癌組織の量または体積が減少することによって、対象が治療される。いくつかの態様では、接触によって、免疫細胞集団において、非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合が増加する。いくつかの態様では、接触によって、免疫細胞集団において、刺激性骨髄系細胞に対する非刺激性骨髄系細胞の割合が減少する。いくつかの態様では、接触によって、対象において、免疫応答が増進する。いくつかの態様では、接触によって、癌組織以外に存在する骨髄系細胞、及び／または癌組織に存在する刺激性骨髄系細胞が実質的に死滅することも、無能化することも、枯渇することもない。

【0010】

対象における癌の治療方法についても本明細書に記載され、当該方法は、癌に存在する非刺激性骨髄系細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇に有効な量で存在する抗体またはその抗原結合断片の投与を含む。いくつかの態様では、非刺激性骨髄系細胞は、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在する。いくつかの態様では、非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇により、癌組織の量または体積が減少することによって、対象が治療される。いくつかの態様では、接触によって、免疫細胞集団において、非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合が増加する。いくつかの態様では、接触によって、免疫細胞集団において、刺激性骨髄系細胞に対する非刺激性骨髄系細胞の割合が減少する。いくつかの態様では、接触によって、癌以外に存在する骨髄系細胞、及び／または癌に存在する刺激性骨髄系細胞が実質的に死滅することも、無能化することも、枯渇することもない。いくつかの態様では、対象の癌は、癌に対する免疫応答の生成または増進によって治療される。

【0011】

いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、非刺激性骨髄系細胞に発現する標的タンパク質の細胞外ドメインに結合し、標的タンパク質は、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ１１９からなる群から選択され、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１４^＋、及びＢＤＣＡ３⁻であり、抗体またはその抗原結合断片は、非刺激性骨髄系細胞と抗体またはその抗原結合断片との接触前の癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞のレベル未満であるレベルまで、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって非刺激性骨髄系細胞を死滅、無能化、または枯渇させ、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＢＤＣＡ１⁻、及びＢＤＣＡ３^＋である刺激性骨髄系細胞、ならびに非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、接触または投与によって、癌組織以外に存在する骨髄系細胞、及び／または癌組織に存在する刺激性骨髄系細胞が実質的に死滅することも、無能化することも、枯渇することもなく、ならびに非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇により、癌細組織に対する免疫応答が増進することによって、癌が治療される。

【0012】

いくつかの態様では、非刺激性骨髄系細胞は、腫瘍関連マクロファージ；腫瘍関連樹状細胞；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１４^＋、及びＢＤＣＡ３⁻；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＣＤ１４^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ１^＋のうちの少なくとも１つであるか、またはＢＤＣＡ３^＋ではないものであり、こうしたものは、例えば、フローサイトメトリーまたは同等のアッセイによって決定してよい。いくつかの態様では、非刺激性骨髄系細胞は、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、ＴＬＲ７、及びＬＩＬＲＢ４のうちの少なくとも１つに陽性であり、ならびに／またはＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１のうちの少なくとも１つに陰性であり、こうしたものは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子アレイ、フローサイトメトリー、ＲＮＡ配列解析（ＲＮＡｓｅｑ）、または同等のアッセイによって測定してよい。

【0013】

いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、及び抗体媒介性貪食（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性のうちの少なくとも１つを有する。いくつかの態様では、抗体は、モノクローナル抗体、アンタゴニスト抗体、ポリクローナル抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ３抗体、アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、全長抗体、及び抗原結合断片のうちの少なくとも１つである。いくつかの態様では、抗体もしくはその抗原結合断片は、ＩｇＧ２抗体ではないか、または抗体もしくはその抗原結合断片は、ＩｇＧ４抗体ではない。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、コンジュゲートされている。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、放射性核種、細胞毒素、化学療法物質、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素、免疫調節物質、抗血管新生物質、アポトーシス促進物質、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、第２の抗体、及び第２の抗体断片からなる群から選択される少なくとも１つの治療物質に対してコンジュゲートされている。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ１１９のうちの少なくとも１つと選択的に結合する。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ４には選択的に結合しない。

【0014】

いくつかの態様では、接触または投与によって、非刺激性骨髄系細胞の死、非刺激性骨髄系細胞のアポトーシス、非刺激性骨髄系細胞の溶解、非刺激性骨髄系細胞の貪食、及び非刺激性骨髄系細胞の増殖停止のうちの少なくとも１つが誘導される。

【0015】

いくつかの態様では、刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＢＤＣＡ１⁻、及びＢＤＣＡ３^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、及びＢＤＣＡ３^＋；ならびにＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋、のうちの少なくとも１つである細胞を含み、こうしたものは、例えば、フローサイトメトリーまたは同等のアッセイによって決定してよい。いくつかの態様では、刺激性骨髄系細胞は、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、ＴＬＲ７、及びＬＩＬＲＢ４のうちの少なくとも１つに陰性であり、ならびに／またはＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１のうちの少なくとも１つに陽性であり、こうしたものは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子アレイ、フローサイトメトリー、ＲＮＡ配列解析、または同等のアッセイによって測定してよい。

【0016】

いくつかの態様では、非刺激性骨髄系細胞は、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在する。

【0017】

いくつかの態様では、癌組織は、固形癌または液性癌（ｌｉｑｕｉｄ ｃａｎｃｅｒ）である。いくつかの態様では、癌は、メラノーマ、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、前立腺癌、肺癌、及び乳癌からなる群から選択される。

【0018】

いくつかの態様では、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様では、対象は、免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる。いくつかの態様では、免疫療法は、チェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、Ｔ細胞のチェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、養子Ｔ細胞療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、樹状細胞ワクチン、単球ワクチン、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質、ＢｉＴＥ抗原結合タンパク質、トール様受容体（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｉｐｔ）リガンド、ならびにサイトカインのうちの少なくとも１つである。

【0019】

いくつかの態様では、方法は、対象において免疫応答を増進する。いくつかの態様では、免疫応答は、免疫療法に基づく免疫応答である。いくつかの態様では、免疫療法に基づく免疫応答は、癌組織を標的とする。

【0020】

いくつかの態様では、方法は、刺激性骨髄系細胞の活性を増進するか、または刺激性骨髄系細胞の数を増加させる物質の投与をさらに含む。いくつかの態様では、物質は、ＦＬＴ３Ｌである。

【0021】

いくつかの態様では、方法は、対象において癌を治療する。

【0022】

いくつかの態様では、接触または投与によって、免疫細胞集団において、非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合が増加する。いくつかの態様では、接触または投与によって、対象の腫瘍に存在する刺激性骨髄系細胞は、腫瘍に存在するＣＤ４５＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋である細胞全体の１〜４％超、１〜２％超、１％超、１．３７％超、１．６％超、２％超、３％超、または４％超を占めるようになる。

【0023】

いくつかの態様では、方法は、対象に由来する生体試料における、刺激性骨髄系細胞の数、及び／または非刺激性骨髄系細胞の数の決定をさらに含む。いくつかの実施形態では、決定段階は、対象が抗体またはその抗原結合断片の投与から恩恵を受けるかどうかの決定に使用される。いくつかの態様では、決定段階は、抗体またはその抗原結合断片の投与の有効性の監視に使用される。

【0024】

いくつかの態様では、方法は、対象に由来する生体試料における、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、ＴＬＲ７、及びＬＩＬＲＢ４のうちの少なくとも１つの発現レベルの決定をすることをさらに含む。いくつかの態様では、方法は、対象に由来する生体試料における、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１のうちの少なくとも１つの発現レベルの決定をさらに含む。

【0025】

いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体またはその抗原結合断片及び医薬的に許容可能な添加剤を含む医薬組成物に存在する。いくつかの態様では、組成物は、無菌である。

【0026】

いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、非刺激性骨髄系細胞に発現する標的タンパク質の細胞外ドメインに結合し、標的タンパク質は、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ１１９からなる群から選択され、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１４^＋、及びＢＤＣＡ３⁻であり、抗体またはその抗原結合断片は、非刺激性骨髄系細胞と抗体またはその抗原結合断片との接触前の癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞のレベル未満であるレベルまで、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって非刺激性骨髄系細胞を死滅、無能化、または枯渇させ、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、ＢＤＣＡ１⁻、及びＢＤＣＡ３^＋である刺激性骨髄系細胞、ならびに非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇によって、癌が治療される。

【0027】

腫瘍に対する、対象の免疫応答の増進方法も本明細書で開示され、当該方法は、腫瘍における刺激性骨髄系細胞の存在量を増進する有効量の治療、または腫瘍における非刺激性骨髄系細胞の存在量を減少させる有効量の治療の、対象に対する実施を含み、治療は腫瘍に対する免疫応答を増進し、任意で、免疫応答は腫瘍の体積を減少させる。

【0028】

腫瘍を有する対象における、癌免疫療法治療の効力改善方法も本明細書で開示され、当該方法は、腫瘍における刺激性骨髄系細胞の存在量を増進する有効量の治療、または腫瘍における非刺激性骨髄系細胞の存在量を減少させる有効量の治療の、対象に対する実施を含み、対象は、癌免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる。

【0029】

いくつかの態様では、方法は、ＦＬＴ３Ｌの全身投与または増進を含む。いくつかの態様では、方法は、刺激性骨髄系細胞を選択的に残しながら非刺激性骨髄系細胞の排除または減少をもたらす１つまたは複数の抗体の全身性投与を含む。いくつかの態様では、方法は、ＣＳＦ１の発現または作用を並行してブロックしながらの、ＦＬＴ３Ｌを使用した、対象の自己の骨髄細胞または血液細胞の治療を含む。いくつかの態様では、方法は、骨髄または血液の前駆細胞集団における、ＩＲＦ８、Ｍｙｃｌ１、またはＢＡＴＦ３もしくはＺＢＴＢ４６の発現増進を含む。

【0030】

対象に由来する試料における非刺激性骨髄系細胞の存在の有無の決定方法も本明細書で開示され、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞及び刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団と非刺激性骨髄系細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片との接触と、非刺激性骨髄系細胞に対して抗体が結合したことを示す複合体の存在決定と、任意で、集団における非刺激性骨髄系細胞の数の定量と、任意で、非刺激性骨髄系細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を使用した対象の治療と、を含む。

【0031】

対象に由来する試料における刺激性骨髄系細胞の存在の有無の決定方法も本明細書で開示され、当該方法は、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団と刺激性骨髄系細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片との接触と、刺激性骨髄系細胞に対して抗体が結合したことを示す複合体の存在決定と、任意で、集団における刺激性骨髄系細胞の数の定量と、任意で、対象の治療と、を含む。

【0032】

腫瘍試料における非刺激性骨髄系細胞の定量方法も本明細書で開示され、当該方法は、腫瘍関連マクロファージ；腫瘍関連樹状細胞；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＣＤ１４^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ１^＋のうちの少なくとも１つであるか、またはＢＤＣＡ３^＋ではないものである細胞の数の測定を含む。

【0033】

腫瘍試料に存在する刺激性骨髄系細胞の定量方法も本明細書で開示され、当該方法は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋；ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、及びＢＤＣＡ３^＋；ならびにＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋、のうちの少なくとも１つである細胞の数の測定を含む。

【0034】

いくつかの態様では、細胞は、細胞選別方法によって定量される。いくつかの態様では、細胞の選別方法は、蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別、マイクロラフト選別（ｍｉｃｒｏｒａｆｔ ｓｏｒｔｉｎｇ）、及び親和性に基づく細胞分離からなる群から選択される。

【0035】

腫瘍試料における非刺激性骨髄系細胞の定量方法も本明細書で開示され、当該方法は、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、ＴＬＲ７、及びＬＩＬＲＢ４である非刺激性骨髄系細胞マーカーのうちの少なくとも１つの発現量の測定を含む。

【0036】

腫瘍試料に存在する刺激性骨髄系細胞の定量方法も本明細書で開示され、当該方法は、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１である刺激性骨髄系細胞マーカーのうちの少なくとも１つの発現量の測定を含む。

【0037】

いくつかの態様では、マーカーの発現は、定量的ＰＣＲによって測定される。いくつかの態様では、マーカー遺伝子発現の定量は、マーカー遺伝子の配列を対象とする固定化プローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを使用して達成される。

【0038】

いくつかの態様では、腫瘍試料は、腫瘍の針生検、パンチ生検、または外科的切除によって腫瘍から得られる。

【0039】

患者における癌の状態の評価方法も本明細書で開示され、当該方法は、対象に由来する腫瘍試料の取得段階と、対象に由来する腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の測定段階と、を含む。

【0040】

いくつかの態様では、評価される癌の状態は、癌再発の可能性であり、腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、癌再発の可能性の減少を示す。いくつかの態様では、評価される癌の状態は、免疫療法治療に対する対象の適性（ａｍｅｎａｂｉｌｉｔｙ）であり、腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、免疫療法治療に対して対象が陽性応答する可能性の増加を示す。いくつかの態様では、評価される癌の状態は、免疫療法治療の有効性であり、腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、免疫療法治療が有効であることを示す。いくつかの態様では、評価される癌の状態は、予測癌生存期間であり、腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、予測癌生存期間の増加を示す。

【0041】

いくつかの態様では、刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇は、代表的な腫瘍試料のプールにおいて観測される刺激性骨髄系細胞の存在量の中央値または平均値を超える存在量である。いくつかの態様では、刺激性骨髄系細胞の存在量は、試料に存在する非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合として測定される。いくつかの態様では、刺激性骨髄系細胞の存在量は、試料に存在する全骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合として測定される。いくつかの態様では、刺激性骨髄系細胞の存在量は、試料に存在する全ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合として測定される。いくつかの態様では、刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇は、ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞１００個当たりの刺激性骨髄系細胞数が１．３７個を超えるものとして定義される。いくつかの態様では、免疫療法治療は、抗ＰＤ１治療である。いくつかの態様では、抗ＰＤ１治療は、ニボルマブまたはペンブロリズマブの投与である。いくつかの態様では、対象はメラノーマを有する。

【0042】

腫瘍における刺激性骨髄系細胞の存在量を増加させるための治療の有効性の評価方法も本明細書で開示され、当該方法は、癌を有する１個体または複数個体の対象に対する治療の実施段階と、１個体または複数個体の対象に由来する１つまたは複数の腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の測定段階と、を含み、１つまたは複数の腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の増加が、物質が有効であることを示す。

【0043】

いくつかの態様では、刺激性骨髄系細胞の存在量の増加は、１つまたは複数の腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量が、治療の実施前に１個体または複数個体の対象に由来する１つまたは複数の腫瘍試料において観測されたものと比較して多いこととして定義される。いくつかの態様では、刺激性骨髄系細胞の存在量の増加は、治療された対象に由来する１つまたは複数の腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量が、治療されない対象に由来する代表的な腫瘍試料のプールにおいて観測されるものと比較して多いこととして定義される。

【0044】

抗ＬＩＬＲＢ４抗体もしくはその抗原結合断片は、表ＢＢに示される配列の１つもしくは複数を含むか、またはそれらの変異体は、表ＢＢに示される配列に対して、少なくとも８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有し、任意で、抗体またはその抗原結合断片は、表ＢＢに示されるＣＤＲ配列を有するＣＤＲのそれぞれを含み、任意で、抗体またはその抗原結合断片は、表ＢＢに示される可変ドメインのそれぞれを含み、及び任意で、抗体またはその抗原結合断片は、表ＢＢに示される全長配列を含む。

【0045】

ＬＩＬＲＢ４タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合断片は、非刺激性骨髄系細胞を特異的に死滅、枯渇、または無能化する能力を有する。

【0046】

いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ４の細胞外ドメインに結合し、抗体またはその抗原結合断片は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって、非刺激性骨髄系細胞を死滅、無能化、または枯渇させる。

【0047】

いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、及び抗体媒介性貪食活性のうちの少なくとも１つを有する。いくつかの態様では、抗体は、モノクローナル抗体、アンタゴニスト抗体、ポリクローナル抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ３抗体、アフコシル化抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、全長抗体、及び抗原結合断片のうちの少なくとも１つである。いくつかの態様では、抗体もしくはその抗原結合断片は、ＩｇＧ２抗体ではないか、または抗体もしくはその抗原結合断片は、ＩｇＧ４抗体ではない。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、コンジュゲートされている。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、放射性核種、細胞毒素、化学療法物質、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素、免疫調節物質、抗血管新生物質、アポトーシス促進物質、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、第２の抗体、及び第２の抗体断片からなる群から選択される少なくとも１つの治療物質に対してコンジュゲートされている。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、表ＢＢに示される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。

【0048】

１つの医薬組成物は、本明細書に開示の抗ＬＩＬＢＲ４抗体またはその抗原結合断片、及び医薬的に許容可能な添加剤を含む。

【0049】

いくつかの態様では、組成物は、無菌である。

【0050】

いくつかの態様では、本明細書に開示の抗ＬＩＬＢＲ４抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に開示の方法において使用される。
[本発明1001]
非刺激性骨髄系細胞に結合しかつ対象の癌組織における前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇に有効な量で存在する抗体またはその抗原結合断片と前記非刺激性骨髄系細胞との接触を含む、前記対象の前記癌組織に存在する前記非刺激性骨髄系細胞の死滅方法、無能化方法、または枯渇方法であって、任意で、前記非刺激性骨髄系細胞が、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、任意で、前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇により、癌組織の量または体積が減少することによって、前記対象が治療され、任意で、前記接触によって、前記免疫細胞集団において非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合が増加し、任意で、前記接触によって、前記免疫細胞集団において刺激性骨髄系細胞に対する前記非刺激性骨髄系細胞の割合が減少し、任意で、前記接触によって、前記対象において免疫応答が増進し、ならびに任意で、前記接触によって、前記癌組織以外に存在する骨髄系細胞、及び／または前記癌組織に存在する刺激性骨髄系細胞が実質的に死滅することも、無能化することも、枯渇することもない、前記方法。
[本発明1002]
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞に発現する標的タンパク質の細胞外ドメインに結合し、前記標的タンパク質が、ＴＲＥＭ2、ＭＳ4Ａ7、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＬＩＬＲＢ4、ＭＲＣ1／ＣＤ206、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ119からなる群から選択され、前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ11ｃ^＋、ＣＤ14^＋、及びＢＤＣＡ3⁻であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞と前記抗体またはその抗原結合断片との接触前の前記癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞のレベル未満であるレベルまで、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって前記非刺激性骨髄系細胞を死滅、無能化、または枯渇させ、前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、ＢＤＣＡ1⁻、及びＢＤＣＡ3^＋である刺激性骨髄系細胞、ならびに前記非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、前記接触によって、前記癌組織以外に存在する骨髄系細胞、及び／または前記癌組織に存在する刺激性骨髄系細胞が、実質的に死滅することも、無能化することも、枯渇することもなく、ならびに前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇により、前記癌細組織に対する免疫応答が増進することによって、前記癌が治療される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記非刺激性骨髄系細胞が、腫瘍関連マクロファージ；腫瘍関連樹状細胞；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ11ｃ^＋、ＣＤ14^＋、及びＢＤＣＡ3⁻；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＣＤ14^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14^＋、ＢＤＣＡ3⁻、ＣＤ11ｂ^＋、及びＣＤ11ｃ^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、及びＢＤＣＡ1^＋のうちの少なくとも1つであるか、またはＢＤＣＡ3^＋ではないものであり、こうしたものが、フローサイトメトリーまたは同等のアッセイによって決定される、本発明1001〜1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
前記非刺激性骨髄系細胞が、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＭＲＣ1、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、Ｃ1ＱＢ、Ｃ1ＱＡ、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、Ｃ1ＱＣ、ＴＭＥＭ119、ＭＳ4Ａ7、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ4Ｆ18、ＴＲＥＭ2、ＴＬＲ7、及びＬＩＬＲＢ4のうちの少なくとも1つに陽性であり、ならびに／またはＫＩＴ、ＣＣＲ7、ＢＡＴＦ3、ＦＬＴ3、ＺＢＴＢ46、ＩＲＦ8、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ1、ＣＬＥＣ9Ａ、ＢＤＣＡ3、及びＸＣＲ1のうちの少なくとも1つに陰性であり、こうしたものが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子アレイ、フローサイトメトリー、ＲＮＡ配列解析、または同等のアッセイによって測定される、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記抗体またはその抗原結合断片が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、及び抗体媒介性貪食（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性のうちの少なくとも1つを有する、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記抗体が、モノクローナル抗体、アンタゴニスト抗体、ポリクローナル抗体、ＩｇＧ1抗体、ＩｇＧ3抗体、アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、全長抗体、及び抗原結合断片のうちの少なくとも1つである、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記抗体もしくはその抗原結合断片が、ＩｇＧ2抗体ではないか、または前記抗体もしくはその抗原結合断片が、ＩｇＧ4抗体ではない、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記抗体またはその抗原結合断片が、コンジュゲートされている、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記抗体またはその抗原結合断片が、放射性核種、細胞毒素、化学療法物質、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素、免疫調節物質、抗血管新生物質、アポトーシス促進物質、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、第2の抗体、及び第2の抗体断片からなる群から選択される少なくとも1つの治療物質に対してコンジュゲートされている、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＲＥＭ2、ＭＳ4Ａ7、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＬＩＬＲＢ4、ＭＲＣ1／ＣＤ206、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ119のうちの少なくとも1つと選択的に結合し、任意で、前記抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＬＲＢ4には選択的に結合しない、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記接触が、前記非刺激性骨髄系細胞の死、前記非刺激性骨髄系細胞のアポトーシス、前記非刺激性骨髄系細胞の溶解、前記非刺激性骨髄系細胞の貪食、及び前記非刺激性骨髄系細胞の増殖抑止のうちの少なくとも1つを誘導する、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、ＢＤＣＡ1⁻、及びＢＤＣＡ3^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、及びＢＤＣＡ3^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＢＤＣＡ3^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、及びＢＤＣＡ3^＋；ならびにＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ11ｃ^＋、及びＢＤＣＡ3^＋、のうちの少なくとも1つである細胞を含み、こうしたものが、フローサイトメトリーまたは同等のアッセイによって決定される、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記刺激性骨髄系細胞が、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＭＲＣ1、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、Ｃ1ＱＢ、Ｃ1ＱＡ、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、Ｃ1ＱＣ、ＴＭＥＭ119、ＭＳ4Ａ7、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ4Ｆ18、ＴＲＥＭ2、ＴＬＲ7、及びＬＩＬＲＢ4のうちの少なくとも1つに陰性であり、ならびに／またはＫＩＴ、ＣＣＲ7、ＢＡＴＦ3、ＦＬＴ3、ＺＢＴＢ46、ＩＲＦ8、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ1、ＣＬＥＣ9Ａ、ＢＤＣＡ3、及びＸＣＲ1のうちの少なくとも1つに陽性であり、こうしたものが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子アレイ、フローサイトメトリー、ＲＮＡ配列解析、または同等のアッセイによって測定される、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記非刺激性骨髄系細胞が、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在する、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記癌組織が、固形癌または液性癌である、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記癌が、メラノーマ、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、前立腺癌、肺癌、及び乳癌からなる群から選択される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記対象が、ヒト対象である、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記対象が、免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記免疫療法が、チェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、Ｔ細胞のチェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、抗ＰＤ1、抗ＰＤＬ1、抗ＣＴＬＡ4、養子Ｔ細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、樹状細胞ワクチン、単球ワクチン、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質、ＢｉＴＥ抗原結合タンパク質、トール様受容体リガンド、ならびにサイトカインのうちの少なくとも1つである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記方法が、前記対象において免疫応答を増進し、任意で、前記免疫応答が、免疫療法に基づく免疫応答であり、任意で、前記免疫療法に基づく免疫応答が、前記癌を標的とする、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記方法が、刺激性骨髄系細胞の活性を増進するか、または刺激性骨髄系細胞の数を増加させる物質の投与をさらに含み、任意で、前記物質がＦＬＴ3Ｌである、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記対象の癌が治療される、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記接触によって、前記免疫細胞集団において非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合が増加する、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記接触によって、前記対象の腫瘍に存在する刺激性骨髄系細胞が、前記腫瘍に存在するＣＤ45＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋である細胞全体の1〜4％超、1〜2％超、1％超、1．37％超、1．6％超、2％超、3％超、または4％超を占めるようになる、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記対象に由来する生体試料における、刺激性骨髄系細胞の数、及び／または非刺激性骨髄系細胞の数の決定をさらに含み、任意で、前記決定段階が、前記対象が前記抗体またはその抗原結合断片の投与から恩恵を受けるかどうかの決定に使用され、及び任意で、前記決定段階が、前記抗体またはその抗原結合断片の投与の有効性の監視に使用される、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記対象に由来する生体試料における、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＭＲＣ1、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、Ｃ1ＱＢ、Ｃ1ＱＡ、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、Ｃ1ＱＣ、ＴＭＥＭ119、ＭＳ4Ａ7、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ4Ｆ18、ＴＲＥＭ2、ＴＬＲ7、ＬＩＬＲＢ4、ＫＩＴ、ＣＣＲ7、ＢＡＴＦ3、ＦＬＴ3、ＺＢＴＢ46、ＩＲＦ8、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ1、ＣＬＥＣ9Ａ、ＢＤＣＡ3、及びＸＣＲ1のうちの少なくとも1つの発現レベルの決定をさらに含む、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記抗体またはその抗原結合断片及び医薬的に許容可能な添加剤を含む医薬組成物に存在する、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記組成物が無菌である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
癌に存在する非刺激性骨髄系細胞に結合しかつ前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇に有効な量で存在する抗体またはその抗原結合断片の投与を含む、対象における前記癌の治療方法であって、任意で、前記非刺激性骨髄系細胞が、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、任意で、前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇により、癌組織の量または体積が減少することによって、前記対象が治療され、任意で、前記接触によって、前記免疫細胞集団において、非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合が増加し、任意で、前記接触によって、前記免疫細胞集団において、刺激性骨髄系細胞に対する前記非刺激性骨髄系細胞の割合が減少し、任意で、前記接触によって、前記癌以外に存在する骨髄系細胞、及び／または前記癌に存在する刺激性骨髄系細胞が実質的に死滅することも、無能化することも、枯渇することもなく、ならびに任意で、前記対象の癌が、前記癌に対する免疫応答の生成または増進によって治療される、前記治療方法。
[本発明1030]
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞に発現する標的タンパク質の細胞外ドメインに結合し、前記標的タンパク質が、ＴＲＥＭ2、ＭＳ4Ａ7、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＬＩＬＲＢ4、ＭＲＣ1／ＣＤ206、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ119からなる群から選択され、前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ11ｃ^＋、ＣＤ14^＋、及びＢＤＣＡ3⁻であり、前記抗体またはその抗原結合断片が、前記非刺激性骨髄系細胞と前記抗体またはその抗原結合断片との接触前の前記癌組織に存在する非刺激性骨髄系細胞のレベル未満であるレベルまで、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって前記非刺激性骨髄系細胞を死滅、無能化、または枯渇させ、前記非刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、ＢＤＣＡ1⁻、及びＢＤＣＡ3^＋である刺激性骨髄系細胞、ならびに前記非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在し、前記非刺激性骨髄系細胞の死滅、無能化、または枯渇によって前記癌が治療される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記非刺激性骨髄系細胞が、腫瘍関連マクロファージ；腫瘍関連樹状細胞；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ11ｃ^＋、ＣＤ14^＋、及びＢＤＣＡ3⁻；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＣＤ14^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14^＋、ＢＤＣＡ3⁻、ＣＤ11ｂ^＋、及びＣＤ11ｃ^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、及びＢＤＣＡ1^＋のうちの少なくとも1つであるか、またはＢＤＣＡ3^＋ではないものであり、こうしたものが、フローサイトメトリーまたは同等のアッセイによって決定される、本発明1029〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記非刺激性骨髄系細胞が、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＭＲＣ1、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、Ｃ1ＱＢ、Ｃ1ＱＡ、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、Ｃ1ＱＣ、ＴＭＥＭ119、ＭＳ4Ａ7、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ4Ｆ18、ＴＲＥＭ2、ＴＬＲ7、及びＬＩＬＲＢ4のうちの少なくとも1つに陽性であり、ならびに／またはＫＩＴ、ＣＣＲ7、ＢＡＴＦ3、ＦＬＴ3、ＺＢＴＢ46、ＩＲＦ8、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ1、ＣＬＥＣ9Ａ、ＢＤＣＡ3、及びＸＣＲ1のうちの少なくとも1つに陰性であり、こうしたものが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子アレイ、フローサイトメトリー、ＲＮＡ配列解析、または同等のアッセイによって測定される、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記抗体またはその抗原結合断片が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、及び抗体媒介性貪食活性のうちの少なくとも1つを有する、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記抗体が、モノクローナル抗体、アンタゴニスト抗体、ポリクローナル抗体、ＩｇＧ1抗体、ＩｇＧ3抗体、アフコシル化抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、全長抗体、及び抗原結合断片のうちの少なくとも1つである、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記抗体もしくはその抗原結合断片が、ＩｇＧ2抗体ではないか、または前記抗体もしくはその抗原結合断片が、ＩｇＧ4抗体ではない、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記抗体またはその抗原結合断片が、コンジュゲートされている、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記抗体またはその抗原結合断片が、放射性核種、細胞毒素、化学療法物質、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素、免疫調節物質、抗血管新生物質、アポトーシス促進物質、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、第2の抗体、及び第2の抗体断片からなる群から選択される少なくとも1つの治療物質に対してコンジュゲートされている、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＲＥＭ2、ＭＳ4Ａ7、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＬＩＬＲＢ4、ＭＲＣ1／ＣＤ206、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ119のうちの少なくとも1つと選択的に結合し、任意で、前記抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＬＲＢ4には選択的に結合しない、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記接触が、前記非刺激性骨髄系細胞の死、前記非刺激性骨髄系細胞のアポトーシス、前記非刺激性骨髄系細胞の溶解、前記非刺激性骨髄系細胞の貪食、及び前記非刺激性骨髄系細胞の増殖抑止のうちの少なくとも1つを誘導する、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記刺激性骨髄系細胞が、ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、ＢＤＣＡ1⁻、及びＢＤＣＡ3^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、及びＢＤＣＡ3^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＢＤＣＡ3^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、及びＢＤＣＡ3^＋；ならびにＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ11ｃ^＋、及びＢＤＣＡ3^＋、のうちの少なくとも1つである細胞を含み、こうしたものが、フローサイトメトリーまたは同等のアッセイによって決定される、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記刺激性骨髄系細胞が、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＭＲＣ1、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、Ｃ1ＱＢ、Ｃ1ＱＡ、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、Ｃ1ＱＣ、ＴＭＥＭ119、ＭＳ4Ａ7、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ4Ｆ18、ＴＲＥＭ2、ＴＬＲ7、及びＬＩＬＲＢ4のうちの少なくとも1つに陰性であり、ならびに／またはＫＩＴ、ＣＣＲ7、ＢＡＴＦ3、ＦＬＴ3、ＺＢＴＢ46、ＩＲＦ8、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ1、ＣＬＥＣ9Ａ、ＢＤＣＡ3、及びＸＣＲ1のうちの少なくとも1つに陽性であり、こうしたものが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子アレイ、フローサイトメトリー、ＲＮＡ配列解析、または同等のアッセイによって測定される、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記非刺激性骨髄系細胞が、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在する、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記癌が、固形癌または液性癌である、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記癌が、メラノーマ、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、前立腺癌、肺癌、及び乳癌からなる群から選択される、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記対象が、ヒト対象である、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記対象が、免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記免疫療法が、チェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、Ｔ細胞のチェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、抗ＰＤ1、抗ＰＤＬ1、抗ＣＴＬＡ4、養子Ｔ細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、樹状細胞ワクチン、単球ワクチン、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質、ＢｉＴＥ抗原結合タンパク質、トール様受容体リガンド、ならびにサイトカインのうちの少なくとも1つである、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記方法が、前記対象において免疫応答を増進し、任意で、前記免疫応答が、免疫療法に基づく免疫応答であり、任意で、前記免疫療法に基づく免疫応答が、前記癌を標的とする、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記方法が、刺激性骨髄系細胞の活性を増進するか、または刺激性骨髄系細胞の数を増加させる物質の投与をさらに含み、任意で、前記物質がＦＬＴ3Ｌである、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記接触によって、前記免疫細胞集団において非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合が増加する、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記投与によって、前記対象の腫瘍に存在する刺激性骨髄系細胞が、前記腫瘍に存在するＣＤ45＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋である細胞全体の1〜4％超、1〜2％超、1％超、1．37％超、1．6％超、2％超、3％超、または4％超を占めるようになる、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記対象に由来する生体試料における、刺激性骨髄系細胞の数、及び／または非刺激性骨髄系細胞の数の決定をさらに含み、任意で、前記決定段階が、前記対象が前記抗体またはその抗原結合断片の投与から恩恵を受けるかどうかの決定に使用され、及び任意で、前記決定段階が、前記抗体またはその抗原結合断片の投与の有効性の監視に使用される、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記対象に由来する生体試料における、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＭＲＣ1、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、Ｃ1ＱＢ、Ｃ1ＱＡ、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、Ｃ1ＱＣ、ＴＭＥＭ119、ＭＳ4Ａ7、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ4Ｆ18、ＴＲＥＭ2、ＴＬＲ7、ＬＩＬＲＢ4、ＫＩＴ、ＣＣＲ7、ＢＡＴＦ3、ＦＬＴ3、ＺＢＴＢ46、ＩＲＦ8、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ1、ＣＬＥＣ9Ａ、ＢＤＣＡ3、及びＸＣＲ1のうちの少なくとも1つの発現レベルの決定をさらに含む、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記抗体またはその抗原結合断片及び医薬的に許容可能な添加剤を含む医薬組成物に存在する、治療方法の上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記組成物が無菌である、本発明1054の方法。
[本発明1056]
腫瘍における刺激性骨髄系細胞の存在量を増進する有効量の治療、または腫瘍における非刺激性骨髄系細胞の存在量を減少させる有効量の治療の、対象に対する実施を含む、前記腫瘍に対する、前記対象の免疫応答の増進方法であって、前記治療が前記腫瘍に対する免疫応答を増進し、任意で、前記免疫応答が前記腫瘍の体積を減少させる、前記増進方法。
[本発明1057]
腫瘍における刺激性骨髄系細胞の存在量を増進する有効量の治療、または腫瘍における非刺激性骨髄系細胞の存在量を減少させる有効量の治療の、対象に対する実施を含む、前記腫瘍を有する前記対象における、癌免疫療法治療の効力改善方法であって、前記対象が、前記癌免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる、前記効力改善方法。
[本発明1058]
ＦＬＴ3Ｌの全身投与または増進を含む、本発明1056または本発明1057の方法。
[本発明1059]
刺激性骨髄系細胞を選択的に残しながら非刺激性骨髄系細胞の排除または減少をもたらす1つまたは複数の抗体の全身投与を含む、本発明1056または本発明1057の方法。
[本発明1060]
ＣＳＦ1の発現または作用を並行してブロックしながらの、ＦＬＴ3Ｌを使用した、対象の自己の骨髄細胞または血液細胞の治療を含む、本発明1056または本発明1057の方法。
[本発明1061]
骨髄または血液の前駆細胞集団における、ＩＲＦ8、Ｍｙｃｌ1、またはＢＡＴＦ3もしくはＺＢＴＢ46の発現増進を含む、本発明1056または本発明1057の方法。
[本発明1062]
対象に由来する試料における非刺激性骨髄系細胞の存在の有無の決定方法であって、
ａ．前記非刺激性骨髄系細胞及び刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団と前記非刺激性骨髄系細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片との接触と、
ｂ．非刺激性骨髄系細胞に対して前記抗体が結合したことを示す複合体の存在決定と、
ｃ．任意で、前記集団における非刺激性骨髄系細胞の数の定量と、
ｄ．任意で、前記非刺激性骨髄系細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を使用した、前記対象の治療と、
を含む、前記決定方法。
[本発明1063]
対象に由来する試料における刺激性骨髄系細胞の存在の有無の決定方法であって、
ａ．前記刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団と前記刺激性骨髄系細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片との接触と、
ｂ．刺激性骨髄系細胞に対して前記抗体が結合したことを示す複合体の存在決定と、
ｃ．任意で、前記集団における刺激性骨髄系細胞の数の定量と、
ｄ．任意で、前記対象の治療と、
を含む、前記決定方法。
[本発明1064]
腫瘍試料における非刺激性骨髄系細胞の定量方法であって、腫瘍関連マクロファージ；腫瘍関連樹状細胞；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＣＤ14^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14^＋、ＢＤＣＡ3⁻、ＣＤ11ｂ^＋、及びＣＤ11ｃ^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、及びＢＤＣＡ1^＋のうちの少なくとも1つであるか、またはＢＤＣＡ3^＋ではないものである細胞の数の測定を含む、前記定量方法。
[本発明1065]
腫瘍試料に存在する刺激性骨髄系細胞の定量方法であって、ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、ＣＤ11ｃ^＋、及びＢＤＣＡ3^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＢＤＣＡ3^＋；ＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ14⁻、及びＢＤＣＡ3^＋；ならびにＣＤ45^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ11ｃ^＋、及びＢＤＣＡ3^＋、のうちの少なくとも1つである細胞の数の測定を含む、前記定量方法。
[本発明1066]
前記細胞が、細胞選別方法によって定量される、本発明1064または本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記細胞選別方法が、蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別、マイクロラフト選別、及び親和性に基づく細胞分離からなる群から選択される、本発明1066の方法。
[本発明1068]
腫瘍試料における非刺激性骨髄系細胞の定量方法であって、Ｃ5ＡＲ1、ＬＹＶＥ1、ＡＢＣＣ3、ＭＲＣ1、ＳＩＧＬＥＣ1、ＳＴＡＢ1、Ｃ1ＱＢ、Ｃ1ＱＡ、ＴＭＥＭ37、ＭＥＲＴＫ、Ｃ1ＱＣ、ＴＭＥＭ119、ＭＳ4Ａ7、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ4Ｆ18、ＴＲＥＭ2、ＴＬＲ7、及びＬＩＬＲＢ4である非刺激性骨髄系細胞マーカーのうちの少なくとも1つの発現量の測定を含む、前記定量方法。
[本発明1069]
腫瘍試料に存在する刺激性骨髄系細胞の定量方法であって、ＫＩＴ、ＣＣＲ7、ＢＡＴＦ3、ＦＬＴ3、ＺＢＴＢ46、ＩＲＦ8、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ1、ＣＬＥＣ9Ａ、ＢＤＣＡ3、及びＸＣＲ1である刺激性骨髄系細胞マーカーのうちの少なくとも1つの発現量の測定を含む、前記定量方法。
[本発明1070]
前記マーカーの発現量が、定量的ＰＣＲによって測定される、本発明1068または本発明1069の方法。
[本発明1071]
マーカー遺伝子発現量の前記定量が、マーカー遺伝子の配列を対象とする固定化プローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを使用して達成される、本発明1068または本発明1069の方法。
[本発明1072]
前記腫瘍試料が、腫瘍の針生検、パンチ生検、または外科的切除によって前記腫瘍から得られる、本発明1064〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
患者における癌の状態の評価方法であって、前記対象に由来する腫瘍試料の取得段階と、前記対象に由来する前記腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の測定段階と、を含む、前記評価方法。
[本発明1074]
評価される前記癌の状態が、癌再発の可能性であり、前記腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、癌再発の可能性の減少を示す、本発明1073の方法。
[本発明1075]
評価される前記癌の状態が、免疫療法治療に対する前記対象の適性（ａｍｅｎａｂｉｌｉｔｙ）であり、前記腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、免疫療法治療に対して前記対象が陽性応答する可能性の増加を示す、本発明1073の方法。
[本発明1076]
評価される前記癌の状態が、免疫療法治療の有効性であり、前記腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、前記免疫療法治療が有効であることを示す、本発明1073の方法。
[本発明1077]
評価される前記癌の状態が、予測癌生存期間であり、前記腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、予測癌生存期間の増加を示す、本発明1073の方法。
[本発明1078]
刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、代表的な腫瘍試料のプールにおいて観測される刺激性骨髄系細胞の存在量の中央値または平均値を超える存在量である、本発明1074〜1077のいずれかの方法。
[本発明1079]
刺激性骨髄系細胞の前記存在量が、前記試料に存在する非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合として測定される、本発明1073の方法。
[本発明1080]
刺激性骨髄系細胞の前記存在量が、前記試料に存在する全骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合として測定される、本発明1073の方法。
[本発明1081]
刺激性骨髄系細胞の前記存在量が、前記試料に存在する全ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合として測定される、本発明1073の方法。
[本発明1082]
刺激性骨髄系細胞の存在量の上昇が、ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞100個当たりの刺激性骨髄系細胞数が1．37個を超えるものとして定義される、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記免疫療法治療が、抗ＰＤ1治療である、本発明1075または本発明1076の方法。
[本発明1084]
前記抗ＰＤ1治療が、ニボルマブまたはペンブロリズマブの投与である、本発明1083の方法。
[本発明1085]
前記対象が、メラノーマを有する、本発明1083の方法。
[本発明1086]
腫瘍における刺激性骨髄系細胞の存在量を増加させるための治療の有効性の評価方法であって、癌を有する1個体または複数個体の対象に対する前記治療の実施段階と、前記1個体または複数個体の対象に由来する1つまたは複数の腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の測定段階と、を含み、前記1つまたは複数の腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量の増加が、前記物質が有効であることを示す、前記評価方法。
[本発明1087]
刺激性骨髄系細胞の存在量の増加が、前記1つまたは複数の腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量が、前記治療の実施前に前記1個体または複数個体の対象から得られる1つまたは複数の腫瘍試料において観測されたものより多いこととして定義される、本発明1086の方法。
[本発明1088]
刺激性骨髄系細胞の存在量の増加が、治療された対象に由来する前記1つまたは複数の腫瘍試料における刺激性骨髄系細胞の存在量が、治療されない対象に由来する代表的な腫瘍試料のプールにおいて観測されるものより多いこととして定義される、本発明1086の方法。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】マウス及びヒトの腫瘍において希少なＤＣ及び大量に存在するマクロファージを示す。図１Ａは、ＰｙＭＴｃｈＯＶＡ腫瘍を消化し、ＣＤ４５で濃縮したものに由来する腫瘍ＡＰＣ集団のフローサイトメトリー及びゲーティングを示す。Ａ−Ｃは、５回以上の独立した実験の代表である。図１Ｂは、異所性Ｂ７８ＣｈＯＶＡ腫瘍におけるＡＰＣ集団のサイトメトリーを示す。図１Ｃは、Ｂ７８ｃｈＯＶＡにおける腫瘍浸潤性の免疫細胞による、腫瘍に由来するｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のヒストグラムを示す。それぞれの細胞型のヒストグラムは、手前から奥の順にそれぞれ、Ｔ細胞、好中球（Ｎφ）、ＤＣ２、ＤＣ１、単球、ＴＡＭ２、ＴＡＭ１、及び腫瘍を示す。図１Ｄは、ヒトの転移性メラノーマの生検を消化したものの代表的なサイトメトリーであり、ＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻（ＣＤ３ｅ、ＣＤ５６、ＣＤ１９）ＨＬＡ−ＤＲ^＋によって定義し、ＣＤ１４、ＢＤＣＡ１、及びＢＤＣＡ３によって分割したＤＣ集団及びＴＡＭ集団の同定を示す。二重陰性である細胞は、系譜ゲートを回避したＢ細胞、未成熟な単球、またはｐＤＣを反映している可能性がある。図１Ｅは、ＰｙＭＴｃｈＯＶＡモデル及びＢ７８ｃｈＯＶＡモデルを対象とした、腫瘍浸潤性の骨髄系細胞の相対割合であり、全ＣＤ４５^＋細胞に占める％として示される。データは、個々の腫瘍から収集し、マウス（ｎ＝５）に由来する平均値±標準誤差として示される。図１Ｆは、ヒト転移性メラノーマに浸潤しているＤＣ集団及びＴＡＭ集団の頻度であり、全ＣＤ４５^＋に占める％として示される。データは、複数の患者から収集し、生検（ｎ＝４）に由来する平均値±標準誤差として示される。

【図2】表面及び転写のプロファイリングにより、異なる系譜の腫瘍ＤＣ及び腫瘍マクロファージが強調されていることを示す。データ（図２Ａ〜図２Ｇ）はすべて、異所性Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍モデルに由来する。細胞系譜は、図１に定義される通りである。図２Ａは、ＤＣに特異的なマーカーパネルの発現であり、それぞれのアイソタイプ（灰色網掛け）と比較したものを示す。黒の外枠で囲まれた部分はＣＤ１０３^＋ＤＣ２集団であり、特有の発現を示している。図２Ｂは、マクロファージに特異的なマーカー（色付き）の発現差異を、対応するアイソタイプ（灰色網掛け）と共に示す。黒の外枠で囲まれた部分はＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１集団、ＴＡＭ１集団、及びＴＡＭ２集団であり、特有の発現を示している。図２Ｃは、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１集団による、ＤＣ−Ｔ_ｈ２マーカー（色付き）の特異的な発現であり、それぞれのアイソタイプ（灰色網掛け）と比較したものを示す。黒の外枠で囲まれた部分は、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１であり、特有の発現を示している。図２Ｄは、ＦＡＣＳによって精製した集団をＲＮＡ配列解析することよって明らかにした網羅的転写特性であり、生物学的に３連で実施したものを示す。データは、ＤＣ１、ＤＣ２、ＴＡＭ１、及びＴＡＭ２の間で最も変動した上位１０００遺伝子の、網羅的平均に対するＬｏｇ_２倍数変化のヒートマップとして示される。図２Ｅは、ＲＮＡ配列解析で得た網羅的転写特性に基づくＤＣ１集団、ＤＣ２集団、ＴＡＭ１集団、及びＴＡＭ２集団の主成分解析（ＰＣＡ）を示す。図２Ｆは、選別したＡＰＣ集団に由来するＩｒｆ４、Ｉｒｆ８、Ｍｙｂ、及びＺｂｔｂ４６（ｚＤＣ）の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。データは、平均ΔＣｔ±ＳＥＭとして示され、生物学的に３連（ｎ＝３）として計算したものである（Ｎ．Ｄ．は、未検出を示す）。図２Ｇは、腫瘍のＡＰＣ集団におけるＩｒｆ４及びＩｒｆ８を対象にした細胞内染色であり、それぞれのアイソタイプ（灰色）と比較したものを示す。図２Ｅにおいて、３つのドットで示されるそれぞれのクラスターは、左から右の順にそれぞれ、ＣＤ１０３＋ＤＣ２、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ１、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ１、及びＦ４／８０＋ＴＡＭ２を示す。

【図3】腫瘍浸潤性のＡＰＣ集団を対象とした、Ｉｒｆ４、Ｉｒｆ８、及びＢａｔｆ３の要件差異を示す。データはすべて、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１集団及びＣＤ１０３^＋ＤＣ２集団の代表的なフローサイトメトリー分析（ＣＤ４５^＋、Ｌｙ６Ｃ⁻、ＭＨＣＩＩ^＋、及びＣＤ２４^＋でゲート実施）である。データは、平均値±ＳＥＭとして示される。統計学的有意性は、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１によって示される。ｎｓ＝統計学的に有意差なし。図３Ａは、Ｉｒｆ８^−／−（ノックアウト（ＫＯ））に由来する異所性ＰｙＭＴ−ＶＯ腫瘍であり、対照（野生型（ＷＴ））と比較したものを示す。相対的な細胞割合は、全ＭＨＣＩＩ^＋細胞に占める％として示される。データは、個々のマウス（ｎ＝６）から収集し、２回の独立した実験によるものである。図３Ｂは、Ｉｒｆ４^ｆ／ｆｘＣＤ１１ｃ−ＣＲＥ^＋宿主における異所性Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍であり、Ｃｒｅが陰性である同腹仔の一匹（ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）と比較したものを示す。相対的な細胞割合は、全ＭＨＣＩＩ^＋細胞に占める％として示される。データは、個々のマウス（ｎ＝７）から収集し、２回の独立した実験によるものである。図３Ｃは、Ｂａｔｆ３ＫＯにおける異所性Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍であり、野生型（ＷＴ）と比較したものを示す。相対的な細胞割合は、全ＭＨＣＩＩ^＋細胞に占める％として示される。データは、個々のマウス（ｎ＝６）から収集した。図３Ｄは、Ｚｂｔｂ４６−ＤＴＲマウスにおける異所性Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍を示し、当該マウスには、ジフテリア毒素（ＤＴ）を使用した２４時間の急性の枯渇を実施するか、またはＰＢＳを与えた。相対的な細胞割合は、全ＭＨＣＩＩ^＋細胞に占める％として示される。データは、個々のマウス（ｎ＝６）から収集し、２回の独立した実験によるものである。

【図4】腫瘍浸潤性のＡＰＣ集団による、Ｍ−ＣＳＦサイトカイン及びＧＭ−ＣＳＦサイトカインに対する依存差異を示す。図４Ａは、選別したＡＰＣに由来するＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２Ｒｂ、及びＣＳＦ３Ｒの発現のｑＰＣＲを示す。データは、平均ΔＣｔ±ＳＥＭとして示され、個々のＢ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍を生物学的に３連（ｎ＝３）として計算したものである（Ｎ．Ｄ．は、未検出を示す）。図４Ｂは、抗ＣＳＦ−１により３日間ブロック（点付き）した後の腫瘍ＡＰＣのサイトメトリーであり、アイソタイプ（白塗り（ｆｉｌｌｅｄ））で処理した腫瘍動物と比較したものを示す。腫瘍の全ＣＤ４５^＋細胞に占める％として定量し、２回の独立した実験によって個々のマウス（ｎ＝６）から収集したものであり、平均値±ＳＥＭとして示される。統計学的有意性は、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１によって示される。ｎｓ＝統計学的に有意差なし。図４Ｃは、骨髄（ＢＭ）前駆細胞の養子移入ならびにＢＭ、脾臓、及び腫瘍に対する寄与を示す図である。図４Ｄは、腫瘍に到達している類遺伝子性細胞の代表的なサイトメトリーを示す。ＣＤ４５．２でゲートし、図１Ａのゲーティング方針に従って実施した。図４Ｅは、野生型（ＷＴ）のＧＭＰ前駆細胞と、ＧＭＣＳＦＲ ＫＯ ＧＭＰ前駆細胞とを比較使用して、Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍を有するレシピエントに対して競合ＢＭ養子移入を示す。再増殖の効率は、移行した全細胞に占める％としてプロットした。腫瘍に到達しているＧＭＰ細胞の代表的なゲーティングであり、野生型（ＷＴ）（ＢＭ、脾臓、及び腫瘍のそれぞれの左のバー）、ノックアウト（ＫＯ）（ＢＭ、脾臓、及び腫瘍のそれぞれの右のバー）を示す。腫瘍に到達しているＤＣをＣＤ２４^＋ＣＤ１１ｃ^＋によって定義して定量した。データは、２回の独立した実験から収集し、個々の腫瘍（ｎ＝６）に由来する平均値±ＳＥＭとしてプロットした。図４Ｆは、異所性であり、サイトカイン発現腫瘍であるＢ１６−Ｆ１０、Ｂ１６−ＧＭＣＳＦ、及びＢ１６−ＦＬＴ３Ｌの間で実施した、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１集団及びＣＤ１０３^＋ＤＣ２集団のサイトメトリー（ＣＤ４５^＋、Ｌｙ６Ｃ⁻ＭＨＣＩＩ^＋、ＣＤ２４^＋でゲート実施）を示す。集団は、それぞれの腫瘍を対象として、全ＭＨＣＩＩ^＋細胞に占める％として示される。データは、３回の独立した実験から収集し、個々の腫瘍（ｎ＝６）に由来する平均値±ＳＥＭとしてプロットした。図４Ｆのそれぞれの群（右パネル）において、バーは、左から右の順序で、それぞれＤＣ２、ＤＣ１、ＴＡＭ１、及びＴＡＭ２を示す。

【図5】ＣＤ１０３^＋ＤＣ２に特有の抗原処理能力及び抗原提示能力を示す。データ（図５Ａ〜図５Ｇ）はすべて、異所性Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍モデルに由来する。図５Ａは、交差提示、サイトカイン及びケモカインの産生、ならびに同時刺激に関与する選択された遺伝子を選択し、それらを対象として、集団を横断してＲＮＡ配列決定を実施することで得た発現量をＬｏｇ_２変換したヒートマップを示す。色の基準は、薄灰色＝下位２０パーセンタイル、濃灰色＝上位８０パーセンタイルであり、２０〜８０パーセンタイルにかけて、中央（５０パーセンタイル）を挟んで漸加的に色の勾配をつけた。データは、選別した細胞を生物学的に３連として得た。図５Ｂは、Ｔ細胞制御性分子（濃線）を対象として、リガンドの表面タンパク質レベルを分析したサイトメトリーであり、それぞれのアイソタイプ（灰色網掛け）と比較したものを示す。図５Ｃは、ＭＣＨＩ及びＭＨＣＩＩ（濃線であり、手前の４つの線）の発現を分析したサイトメトリーであり、それぞれのアイソタイプ（網掛け付きであり、奥の４つの線）と比較したものを示す。図５Ｃにおいて、それぞれの線は、色付きのものの手前から奥の順にそれぞれ、ＣＤ１０３＋ＤＣ２、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ１、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ１、及びＦ４／８０＋ＴＡＭ２である。図５Ｃにおいて、それぞれの線は、網掛けのものの手前から奥の順にそれぞれ、ＣＤ１０３＋ＤＣ２、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ１、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ１、及びＦ４／８０＋ＴＡＭ２である。図５Ｄは、デキストランをエクスビボで集団を横断して取り込ませ、当該集団を分析したサイトメトリーを示す。灰色＝デキストランなし、薄色のヒストグラム＝４Ｃで実施したデキストランの結合、及び３７Ｃで実施したデキストランの取り込み＝濃色のヒストグラムであり、３連で示される。それぞれの集団を対象として、デルタ幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を平均値±ＳＥＭとしてプロットした。データは、２回の独立した実験（ｎ＝６）の代表である。図５Ｅは、細胞内コンパートメントの相対的なｐＨを集団を横断して分析したサイトメトリーを示す。Ｂ７８腫瘍細胞に対して、比率計測ｐＨ構築物であるＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｐＨｌｏｕｒｉｎを遺伝子導入した。ｐＨｌｕｏｒｉｎは、酸性ｐＨで消光するｐＨ感受性のＧＦＰ誘導体である。代表的なヒストグラムは、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞におけるｐＨｌｕｏｒｉｎの蛍光を示しており、ここで、ｐＨ−ＧＦＰの強度が低いことは、環境が、より酸性であることを示す。灰色のヒストグラムは、ｐＨｌｕｏｒｉｎを発現していない対照腫瘍（Ｂ７８親）に由来するそれぞれの集団である。データは、ＧＦＰの蛍光とｍＣｈｅｒｒｙの蛍光とのｇＭＦＩ比として要約した。データは、平均比±ＳＥＭとして示されており、３回の独立した実験から収集したものである。図５Ｆは、集団におけるＩＬ１２の細胞内サイトカイン染色を示す。それぞれの集団にわたって定量したＩＬ１２^＋細胞の％であり、２回の独立した実験（ｎ＝３）から収集したデータを、平均値±ＳＥＭとしてプロットした。統計学的な有意性は、^＊ｐ＜０．０５によって示される。図５Ｆにおいて、それぞれの線は、手前から奥の順にそれぞれ、ＣＤ１０３＋ＤＣ２、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ１、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ１、及びＦ４／８０＋ＴＡＭ２である。図５Ｇは、サイトカインＩｌ１２ｂ及びサイトカインＩｌ１０の転写物をｑＰＣＲによって測定した転写レベルを示す。データは、平均ΔＣｔ±ＳＥＭとして示され、生物学的に３連（ｎ＝３）として個々の腫瘍から計算したものである（Ｎ．Ｄ．は、未検出を示す）。

【図6】ＣＤ１０３^＋ＤＣは、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞を対象とする優れたＴ細胞刺激因子であることを示す。データはすべて、異所性Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍モデルに由来する。Ｔ細胞＋ＢＭＤＣ（灰色網掛け、最背後）、Ｔ細胞＋ＢＭＤＣ＋ＳＬ８（網掛けなしの灰色、最背後から２番目）、Ｔ細胞＋腫瘍ＡＰＣ（各色付きヒストグラム）。２０，０００個のＴ細胞：４，０００個のＡＰＣの比で播種した。記載がない限り、４回の独立した実験に由来する代表的なフロープロットを示す。図６Ａは、腫瘍から直接得て選別したＡＰＣ集団と共に培養した、ナイーブであるか、または予め活性化したＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の早期活性化マーカーであるＮｕｒ７７及びＣＤ６９（１２時間）を分析したフローサイトメトリーを示す。図６Ａにおいて、それぞれの線は、手前から奥の順にそれぞれ、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ２、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ１、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ１、及びＣＤ１０３＋ＤＣ２である。図６Ｂは、ナイーブＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を分析した代表的なフローサイトメトリーであり、腫瘍のＡＰＣ集団と７２時間共培養した後、ｅＦｌｕｏｒ６７０の色素希釈によって測定し、Ｎｕｒ７７（ＴＣＲ誘発の尺度として）に対してプロットしたものを示す。グラフの上に総細胞収量数を記載した。図６Ｃは、腫瘍ＡＰＣ間でナイーブＴ細胞の増殖を重ね合わせたヒストグラムを示す。図６Ｃにおいて、それぞれの線は、手前から奥の順にそれぞれ、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ１、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ２、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ１、及びＣＤ１０３＋ＤＣ２である。図６Ｄは、Ｔ細胞の増殖を分析した代表的なサイトメトリーであり、予め活性化したＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ芽細胞（Ｔ ｃｅｌｌ ｂｌａｓｔ）を腫瘍ＡＰＣの集団と共に７２時間培養した時点で、ｅＦｌｕｏｒ６７０の色素希釈によって測定し、Ｎｕｒ７７に対してプロットしたものを示す。グラフの上に総細胞収量数を記載した。図６Ｅは、予め活性化したＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を、腫瘍ＡＰＣ間で重ね合わせたヒストグラムを示す。図６Ｅにおいて、それぞれの線は、手前から奥の順にそれぞれ、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ１、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ２、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ１、及びＣＤ１０３＋ＤＣ２である。図６Ｆは、Ｔ細胞の増殖を分析した代表的なサイトメトリーであり、腫瘍ＡＰＣの集団と共にナイーブＯＴ−ＩＩ ＣＤ４^＋Ｔ細胞を培養し、７２時間の時点でｅＦｌｕｏｒ６７０の色素希釈によって測定したものを示す。代表的なフロープロットは、２回の独立した実験に由来する。図６Ｇは、ナイーブＯＴ−ＩＩ ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を、腫瘍ＡＰＣ間で重ね合わせたヒストグラムを示す。それぞれの線は、手前から奥の順にそれぞれ、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ１、Ｆ４／８０＋ＴＡＭ２、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ１、及びＣＤ１０３＋ＤＣ２である。

【図7】生体内及び切片のイメージングによって、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１及びＣＤ１０３^＋ＤＣ２は腫瘍周縁部の近辺では存在が希薄であるものの、Ｔ細胞がその場に存在するときは、依然として相互作用できることを明らかにしている。図７Ａは、腫瘍内ＡＰＣの近位／遠位での定量を示す。データは、独立したイメージングを４回実施して収集し、平均値±ＳＥＭとして示される。図７Ａにおいて、それぞれの群のバーは、左から右の順にそれぞれ、ＴＡＭ２、ＴＡＭ１、及びＤＣ１／２である。図７Ｂは、インビボでのＡＰＣとＴ細胞との接触であり、観測された、Ｔ細胞との対（ｃｏｕｐｌｅ）全体に占める割合として示される。生体内２光子イメージングを独立して２回実施し、３０分間で蓄積した４つの異なる位置の撮像データである。接触は、Ｔ細胞と、赤、黄色、及び緑で示すＡＰＣと、の間で生じた物理的な接触を数えることによって、手作業でスコア化した。バーの配置は、接触したＡＰＣを示す（上部：ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１、下部：ＴＡＭ１、中央部：ＴＡＭ２）。図７Ｃは、ＣＤ４５^＋細胞に対して陽性に選択した消化腫瘍と、予め活性化したＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞と、を使用したエクスビボでのＴ細胞との対形成（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）アッセイを示す。データは、それぞれの集団内においてＴ細胞との対が占める％（左）、及びＴ細胞との対に占める総％（右）として計算した。データは、２回の独立した実験から取集し、平均値±ＳＥＭとしてプロットした。図７Ｃにおいて、それぞれの群のそれぞれのバーは、左から右の順にそれぞれ、ＤＣ２、ＤＣ１、ＴＡＭ１、及びＴＡＭ２である。

【図8】効率的な養子ＣＴＬ療法には、腫瘍において、希少なＣＤ１０３ ＤＣ２集団が必要であることを示す。図８Ａは、ｚＤＣ−ＤＴＲ宿主のＥＧ７．１を対象として、腫瘍の増殖曲線を腫瘍面積（ｍｍ^２）として継時的にプロットしたものを示す。矢印は、ジフテリア毒素（Ｄ．Ｔ．）／ＰＢＳの腹腔内投与の時間、及び５ｘ１０^６個の予め活性化したＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の静脈内移入の時間を示し、それぞれ４日目及び５日目である。その後、経過期間を通して、ジフテリア毒素（ＤＴ）／ＰＢＳは３日に１回投与し、引き続いてＦＴＹ−７２０／生理食塩水は２日に１回投与した。薄灰色の破線（上）は、Ｔ細胞の移入は実施しておらず、ｚＤＣ−ＤＴＲ宿主においてＥＧ７．１が増殖していることを示す。活性化したＣＤ８^＋Ｔ細胞の移入、及びＦＴＹ−７２０による処理（黒線、下）またはそれにＤＴ媒介性のＤＣの枯渇を追加したもの（濃灰色線、中央）では、ＥＧ７．１は退縮した。代表データは、２回の独立した実験に由来する平均腫瘍面積±ＳＥＭ（ｎ＝４）として示される。統計学的な有意性は、^＊ｐ＜０．０５によって示される。図８Ｂは、共変数として癌型を適合させた多変量ＣＯＸ比例ハザード生存率解析において、ＴＣＧＡのヒト試料を対象として、個々の遺伝子（緑で示されるＣＤ１０３^＋に特異的な遺伝子であるか、または赤で示されるＴＡＭ１／ＴＡＭ２／Ｃｄ１１ｂ ＤＣ１に特異的な遺伝子のいずれか）と比較した、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の遺伝子シグナル比の予後の値の比較を示す。データは、９５％信頼区間と共にハザード比（ＨＲ）として示されており、ＢＨｐ値が０．０５未満である遺伝子を対象として、１未満の値は、全生存率（ＯＳ）の増加を意味し、１を超える値は、ＯＳの減少を意味する。図８Ｃは、共変数として癌型を適合させた多変量ＣＯＸ比例ハザード生存率解析において、ＴＣＧＡのヒト試料を対象として、公開された予後の遺伝子特性のいくつかと比較した、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の遺伝子シグナル比の予後の値の比較を示す。データは、９５％信頼区間と共にハザード比（ＨＲ）として示されており、ＢＨｐ値が０．０５未満である遺伝子を対象として、１未満の値は、全生存率（ＯＳ）の増加を意味し、１を超える値は、ＯＳの減少を意味する。図８Ｄは、ヒトＴＣＧＡのデータセットにおける１２種の癌すべてにわたるＫ−Ｍプロットであり、癌型を適合させたものを示す。データは、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の遺伝子発現比が高いもの（黒、ｎ＝１８０１）と、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の発現比が低いもの（灰色、ｎ＝１８０１）と、で解析を実施し、ｐ値＝１．７６ｅ−０７であった。図８Ｅは、ＴＣＧＡのデータセットにおける、乳癌患者の全生存率を対象とするＫ−Ｍプロットを示す。データは、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の遺伝子発現比が高いもの（黒、ｎ＝４２２）と、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の発現比が低いもの（灰色、ｎ＝４２３）と、で解析を実施し、ｐ値＝０．０２５５であった。図８Ｆは、ＴＣＧＡのデータセットにおける、頭頸部扁平上皮癌患者の全生存率を対象とするＫ−Ｍプロットを示す。データは、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の遺伝子発現比が高いもの（黒、ｎ＝１５１）と、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の発現比が低いもの（灰色、ｎ＝１５２）と、で解析を実施し、ｐ値＝０．０００２０７であった。図８Ｇは、ＴＣＧＡのデータセットにおける、肺腺癌患者の全生存率を対象とするＫ−Ｍプロットを示す。データは、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の遺伝子発現比が高いもの（黒、ｎ＝１７７）と、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の発現比が低いもの（灰色、ｎ＝１７８）と、で解析を実施し、ｐ値＝０．０００８７４であった。

【図9】ＣＤ１０３^＋遺伝子及びＢＤＣＡ３^＋遺伝子の転写量が、転移性メラノーマにおける再発後生存率の増加と関連することを示す。図９Ａは、ＣＯＸ比例ハザード生存率解析において、転移性メラノーマのデータセットを使用して実施した、ＣＤ１０３^＋遺伝子、ＣＤ１０３^＋／−比、及び個々の遺伝子の予後の値の比較を示す。データは、９５％信頼区間と共にハザード比（ＨＲ）として示されており、１未満の値は、転移後の全生存率（ＯＳ）（再発後生存率）の増加を意味し、１を超える値は、転移後のＯＳの減少を意味し、ＢＨ適合ｐ値は０．０５未満である。図９Ｂは、ＣＤ１０３^＋の遺伝子リストの発現を対象とした、転移性メラノーマ患者の再発後生存率のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。データは、ＣＤ１０３^＋遺伝子の発現レベルを対象として、３３％、５０％、及び６６％の厳密性閾値（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）において、「高」（薄灰色、各プロットの上に位置する線）ビン、及び「低」（黒、各プロットの下に位置する線）ビンへと解析分類した。図９Ｃは、ＣＤ１０３^＋／−の遺伝子発現比を対象とした、転移性メラノーマ患者の再発後生存率のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。データは、ＣＤ１０３^＋／−の遺伝子発現レベル比を対象として、３３％、５０％、及び６６％の厳密性閾値において、「高」（薄灰色、各プロットの上に位置する線）ビン、及び「低」（黒、各プロットの下に位置する線）ビンへと解析分類した。図９Ｄ〜図９Ｅは、クラスに基づくＴＩＬカテゴリーの尺度であり、図９Ｆ〜図９Ｇは、｛Ｂｏｇｕｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ，２００９｝による腫瘍周囲のＣＤ３＋Ｔ細胞数の組織学的尺度であり、ＳＤＣ遺伝子特性（図９Ｄ、図９Ｆ）及びＳＤＣ／ＮＳＭ比（図９Ｅ、図９Ｇ）に対してプロットしたものを示す。

【図10】ヒト転移性メラノーマにおける、腫瘍浸潤性であるＡＰＣ集団のフローサイトメトリーによる定量を示す。図１０Ａは、ヒト転移性メラノーマの生検を実施した患者の表を示す。それぞれの患者を対象とした、年齢、性別、及び腫瘍の生検位置、ならびに（知見があれば）治療歴を収載した患者の識別表である。リストにある患者はすべて、ＵＣＳＦにおいて抗ＰＤ−１免疫療法を受けた患者である。前歴は、治療歴なし（ｎａｉｖｅ）を０、治療歴ありを１としてコード化した。^＊＊は、進行が急速であり、追加検査が不可能であったことを示す。図１０Ｂは、腫瘍浸潤性の骨髄系サブセットを定義するための、ヒト転移性メラノーマを対象とした、フローサイトメトリーの代表的なゲーティング方針を示す。データは、顕著なＢＤＣＡ３＋ＤＣ集団及びＢＤＣＡ１＋ＤＣ集団を有する患者の代表であり、単一細胞及び生存細胞でゲートしたものである。（ｐＤＣ、ＣＤ１４^＋ＴＡＭ、ＢＤＣＡ１^＋ＤＣ、ＢＤＣＡ３^＋、ＣＤ１４−ＴＡＭ）。図１０Ｃは、腫瘍浸潤性の骨髄系サブセットを定義するための、ヒト転移性メラノーマを対象とした、フローサイトメトリーの代表的なゲーティング方針を示す。データは、顕著なＢＤＣＡ３^＋ＤＣ集団を有さない患者の代表であり、単一細胞及び生存細胞でゲートしたものである。（ｐＤＣ、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ１^＋ＤＣ、ＢＤＣＡ３^＋ＤＣ、ＣＤ１４−ＴＡＭ）。図１０Ｄは、ＣＤ４５＋（黒、各群の左バー）細胞、及びＨＬＡ−ＤＲ＋（灰色、各群の右バー）細胞の頻度であり、患者の生検を横断して、全生存細胞に占める割合として示される。図１０Ｅは、患者の生検を横断して腫瘍浸潤性の免疫集団の頻度であり、ゲーティング方針によって定義されるものを示す。データは、患者を横断して、全ＣＤ４５^＋に占める頻度であり、平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として示される。ｐＤＣ、ＣＤ１４^＋、ＴＡＭ、ＢＤＣＡ１＋^＋ＤＣ、ＢＤＣＡ３^＋ＤＣ、ＣＤ１４−ＴＡＭ、系譜マーカー（ＣＤ３ｅ、ＣＤ５６、ＣＤ１９）。

【図11】ヒトメラノーマにおけるＢＤＣＡ３^＋ＤＣの細胞存在量が、抗ＰＤ１応答性を予測することを示す。患者は、レスポンダー（灰色、部分奏功もしくは完全奏功を含む）、または非レスポンダー（黒、安定疾患（ｓｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、及び進行疾患（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）を含む）のいずれかとして分類した。図１１Ａは、個々の患者の全生存細胞に占めるＣＤ４５^＋細胞の割合を示すウォーターフォールプロットであり、レスポンダー及び非レスポンダーを分けたものを示す図１１Ｂは、腫瘍の全生存細胞に占めるＣＤ４５^＋細胞の割合を対象として、レスポンダー（灰色）及び非レスポンダー（黒）の頻度を定量したものを示す。データは、患者全体で収集したものであり、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示される。ｎ．ｓ．＝有意差なし。図１１Ｃは、個々の患者の腫瘍における全ＣＤ４５＋細胞に占めるＢＤＣＡ３^＋ＤＣの割合を示すウォーターフォールプロットであり、レスポンダー及び非レスポンダーを分けたものを示す。図１１Ｄは、腫瘍の全ＣＤ４５^＋細胞に占めるＢＤＣＡ３^＋ＤＣの割合を対象として、レスポンダー（灰色）及び非レスポンダー（黒）の頻度を定量したものを示す。データは、患者を横断して収集したものであり、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示される。^＊＊ｐ＝０．００５６。図１１Ｅは、腫瘍の全ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞に占める割合として、ＢＤＣＡ３^＋ＤＣ及びＣＤ１４^＋ＴＡＭの頻度を示す散布図であり、レスポンダーは、白丸として、非レスポンダーは、黒丸として示される。図１１Ｆは、腫瘍の全ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞に占める割合として、ＢＤＣＡ３^＋ＤＣ及びＢＤＣＡ１^＋ＤＣの頻度を示す散布図であり、レスポンダーは、白丸として、非レスポンダーは、黒丸として示される。図１１Ｇは、腫瘍の全ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞に占める割合として、ＢＤＣＡ３^＋ＤＣ及びＣＤ１４−ＴＡＭの頻度を示す散布図であり、レスポンダーは、白丸として、非レスポンダーは、黒丸として示される。

【図12】メラノーマのマウスモデルにおいて、抗ＰＤ１の効力には、ＣＤ１０３^＋ＤＣが必要であることを示す。図１２Ａは、免疫療法治療レジメンを組み合わせたマウス及び腫瘍モデルの図である。図１２Ｂは、Ｂ６対照マウスにおける個々のＢ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍の腫瘍面積（ｍｍ^２）を示し（最も左のグラフ）、当該マウスには、１００ｕｇの対照アルメニアンハムスターＩｇＧ、及び１００ｕｇの対照ラットＩｇＧ２ａを、腫瘍増殖から５日目、８日目、及び１１日目に腹腔内投与した。データは、２回の独立した実験をｎ＝８で実施して収集した。図１２Ｃは、Ｚｂｔｂ４６−ＤＴＲ ＢＭキメラマウスにおける個々のＢ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍の腫瘍面積（ｍｍ^２）を示し（中央のグラフ）、当該マウスには、１００ｕｇの抗ＣＴＬＡ−４、及び１００ｕｇの抗ＰＤ−１を、腫瘍増殖から５日目、８日目、及び１１日目に投与し、４日目、７日目、及び１０日目には、ＰＢＳを注射した。データは、２回の独立した実験をｎ＝８で実施して収集した。図１２Ｄは、Ｚｂｔｂ４６−ＤＴＲ ＢＭキメラマウスにおける個々のＢ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍の腫瘍面積（ｍｍ^２）を示し（最も右のグラフ）、当該マウスには、１００ｕｇの抗ＣＴＬＡ−４、及び１００ｕｇの抗ＰＤ−１を、腫瘍増殖から５日目、８日目、及び１１日目に投与し、４日目、７日目、及び１０日目には、ＤＴを注射した。データは、２回の独立した実験をｎ＝８で実施して収集した。

【図13】徐々にゲーティングすることによって、記載のヒト腫瘍型のすべてにおいて、ＮＳＭ集団及びＳＤＣ集団の両方が同定されたことを示し、これは、フローサイトメトリーによって分析したものである（転移性メラノーマ、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、及び結腸癌）。

【図14】Ｂ１６−Ｆ１０異所性マウス腫瘍モデル及びＭＣ３８異所性マウス腫瘍モデルにわたって、ＴＲＥＭ２を含むさまざまなＮＳＭマーカーを使用して実施した、腫瘍微小環境における記載の細胞サブセットの標識化、ならびにＭＳ４６７、ＬＩＬＲＢ４、及びＣＤ８８の染色であり、フローサイトメトリーによって分析したものを示す。すべてのＮＳＭマーカーの染色パターンは、ＮＳＭ集団（ＴＡＭ、Ｌｙ６Ｃ＋単球、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ）に対して非常に特異的であり、ＳＤＣ（ＣＤ１０３＋ＤＣ）は染色されないことを明らかにしている。集団は、図１Ａ及び図１Ｂのゲーティング方針と同様に予めゲートした。それぞれの集団の二次対照は灰色網掛けにされており、それと共に、それぞれの集団のＮＳＭマーカー染色が黒実線のヒストグラムとして重ねられている。

【図15】ヒトＳＤＣでのＣＣＲ７の発現を示す。集団は、図１３のゲーティング方針と同様に予めゲートした。

【図16】マウス異所性Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍の腫瘍微小環境において、ＳＤＣ遺伝子産物である、ＣＣＲ７及びＸＣＲ１がＳＤＣ（ＣＤ１０３＋ＤＣ）で特異的に発現しており、ＮＳＭ（ＴＡＭ、Ｌｙ６Ｃ＋単球、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ）では、ＳＤＣタンパク質は発現してないことを示す。集団は、図１Ａ及び図１Ｂのゲーティング方針と同様に予めゲートした。それぞれの二次対照は灰色網掛けにされており、それと共に、それぞれの集団のＳＤＣマーカー染色が黒実線のヒストグラムとして重ねられている。

【図17】野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスに由来する健康なＢＭ組織及び脾臓組織では、ＮＳＭマーカーであるＭＳ４Ａ７及びＴＲＥＭ２は染色されず、フローサイトメトリーによる分析で検出されないことを示す。集団は、図１Ａ及び図１Ｂのゲーティング方針と同様に予めゲートした。それぞれの集団の二次対照は灰色網掛けにされており、それと共に、それぞれの集団のＭＳ４Ａ７及びＴＲＥＭ２の染色が黒実線のヒストグラムとして重ねられている（上図）。下半分の図は、ＴＲＥＭ２抗体のクローン２、クローン５、及びクローン７を使用して、力価調整した濃度（０ｎＭ、２ｎＭ、２０ｎＭ、及び２００ｎＭ）で免疫集団を横断してマウスの健康なＢＭ組織及び脾臓組織を染色した際に、染色されず、この非染色性には特異性があることを示す。

【図18】抗ＴＲＥＭ２抗体、及びＬＩＬＲＢ４抗体が、それぞれＴＲＥＭ２及びＬＩＬＲＢ４を有する細胞を、インビボで特異的に枯渇させることを示す。対照、及びＴＲＥＭ２またはＬＩＬＲＢ４を発現するＥＬ４形質移入体細胞を１：１の比で混合し、ＷＴのＢ６雄性マウスへと腹腔内注射した。３時間後に、動物に対して（抗ＴＲＥＭ２または抗ＬＩＬＲＢ４）抗体、または対照のヒトＩｇＧ１もしくはＰＢＳを注射した。３６時間後、マウスを屠殺し、腹膜洗浄によって収集し、腹膜から回収した細胞をフローサイトメトリーによって数えた。

【図19】抗ＮＳＭ抗体が、対照と比較して、抗ＰＤ−１治療と同程度に腫瘍の増殖を減少させることを示す。ＭＣ３８結腸癌を、６週齢の雄性Ｂ６マウスへと注射した。処理群へと無作為化したマウスを、５日目、７日目、１１日目、１５日目に、記載の抗体で腹腔内注射によって処置した。７５％順位（上位の異常値を除外し、下位４分の３をプロット）で示される。投薬：ＰＤ−１及びＦｃ対照については、２００ｕｇ／日、抗Ｐｉ１．２（抗ＴＲＥＭ２）抗体については、４０ｕｇ、２０ｕｇ、２０ｕｇ、及び４０ｕｇを５日目、７日目、１１日目、及び１５日目に注射。腫瘍はノギスで測定し、腫瘍体積が示される。

【図20】ヒトメラノーマにおけるＢＤＣＡ３＋の受信者操作特性（ＲＯＣ）解析を示す。図２０Ａは、％ＢＤＣＡ３の染色データ及び抗ＰＤ１の予後データを使用して実施した、ＣＤ４５^＋に対するＢＤＣＡ３^＋の割合と、予後とを対比させたＲＯＣ解析を示す。図２０Ｂは、％ＢＤＣＡ３の染色データ及び抗ＰＤ１の予後データを使用して実施した、ＨＬＡ−ＤＲ^＋に対するＢＤＣＡ３^＋の割合と、予後とを対比させたＲＯＣ解析を示す。

【図21】原発性ヒトＨＮＳＣ腫瘍組織において、ＴＲＥＭ２タンパク質は、ＮＳＭ集団（ＣＤ１４＋ＴＡＭ）に限定して発現しており、ＳＤＣ（ＢＤＣＡ３＋ＤＣ）を含むＣＤ１４陰性ＣＤ１１ｃ陽性細胞ではほとんど発現していないか、または全く発現していないことを示す。ＴＲＥＭ２に特異的な市販抗体（ＲｎＤ、クローン２３７９２０）による染色を、消化したヒトＨＮＳＣ腫瘍組織に対して実施し、二次対照染色（抗ラットＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と比較し、フローサイトメトリーによって分析した。この図は、ヒト腫瘍組織において、ＮＳＭ細胞でＮＳＭ遺伝子産物が特異的に発現しており、ＳＤＣ細胞では発現していないことを示す。集団は、生存、ＣＤ４５＋、系譜陰性（ｌｉｎｅａｇｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ＋でゲートし、ＣＤ１４の発現によって分割した。

【発明を実施するための形態】

【0052】

本発明のこうした態様及び他の態様ならびに利点は、以下に続く詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。本明細書に記載のさまざまな実施形態の性質の１つ、それらのいくつか、またはそれらのすべてを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成させてよいと理解されることになる。

【0053】

詳細な説明
本明細書の解釈を目的として、下記の定義が適用されることになると共に、適切であれば常に、単数形で使用される用語は複数形も含むことになり、逆もまた同様である。以下に示す任意の定義が、参照によって本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する際は、示す定義が優先するものとする。

【0054】

本明細書に記載の発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むと理解される。

【0055】

本明細書に記載のすべての組成物、及び本明細書に記載の組成物を使用するすべての方法について、組成物は、記載の成分もしくは段階を含むか、または記載の成分もしくは段階「から本質的になる」かのいずれかであり得る。組成物が、記載の成分「から本質的になる」と記載されるとき、組成物は、記載の成分を含むと共に、治療中の症状に実質的に影響を与えない他の成分を含んでよいが、こうした明示的に記載される成分以外には治療中の症状に実質的に影響を与える任意の他の成分は含まないか、または組成物が、こうした記載のもの以外に治療中の症状に実質的に影響を与える余分な成分を含むのであれば、組成物は、その余分な成分を、治療中の症状に実質的に影響を与えるために十分な濃度もしくは量では含まない。方法が、記載の段階「から本質的になる」と記載されるとき、方法は、記載の段階を含むと共に、治療中の症状に実質的に影響を与えない他の段階を含んでよいが、方法は、明示的に記載される段階以外には、治療中の症状に実質的に影響を与える任意の他の段階を含まない。非限定の特定例として、組成物が、成分「から実質的になる」と記載されるとき、組成物は、任意の量の医薬的に許容可能な担体、媒体、または希釈剤、及び治療中の症状に実質的に影響を与えないような成分を追加で含んでよい。

【0056】

「任意で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という用語は、逐次的に使用されるとき、記載の組み合わせの１つ〜すべてを含むことを意図すると共に、部分的な組み合わせ（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）のすべてを企図する。

【0057】

本明細書では、「有効量」または「治療的に有効な量」は、抗ＮＳＭ抗原結合物質または抗ＮＳＭ抗体などの治療化合物の量であって、単独または他の治療様式との組み合わせのいずれかで、単一用量または一連用量の一部のいずれかとして個体に投与され、所望の治療効果の生成または所望の治療効果に対する寄与に有効である量を指す。所望の治療効果の例は、免疫応答の増進、腫瘍発生の鈍化または遅延、疾患の安定化、１つまたは複数の症状の寛解である。有効量は、１つまたは複数の投与量で与えられてよい。

【0058】

本明細書では、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、癌などの症状の進行の遅延または好転を指す。本明細書では、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、癌などの症状の治療行為を指す。

【0059】

本明細書では、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」または「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、哺乳類として分類される任意の動物を指し、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）及び農場の動物（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、ならびに動物園の動物、競技用の動物（ｓｐｏｒｔ ａｎｉｍｌａｌ）、またはペット動物が含まれ、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、ケナガイタチ、ラット、ネコ、及び同様のものなどである。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、マウスである。

【0060】

本明細書では、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、本技術分野の当業者に容易に理解される、それぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書に記載の「約」のつく値またはパラメーターに対する参照は、その値またはパラメーター自体を対象とする実施形態を含む（及び説明する）ものである。

【0061】

本明細書及び添付の特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈で明確に示されない限り、複数の参照対象を含むことに留意されなくてはならない。

【0062】

本明細書に記載の構造特性及び機能特性のいずれについても、こうした特性の決定方法は、当該技術分野において知られている。

【0063】

非刺激性骨髄系細胞（Ｎｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｃｅｌｌ）（ＮＳＭ）
抗ＮＳＭ抗体の使用を含む、非刺激性骨髄系細胞（ＮＳＭ）の無能化及び／または検出を目的とする方法及び組成物が本明細書で提供される。ＮＳＭタンパク質を発現する非刺激性骨髄系細胞の標的化及び／または検出を目的とする方法及び組成物も本明細書で提供される。

【0064】

ヒトＮＳＭタンパク質の非ヒトホモログを標的とする抗体の、その非ヒト個体における使用を含む、非刺激性骨髄系細胞の無能化及び／または検出を目的とする方法及び組成物も本明細書で提供される。

【0065】

本明細書では、非刺激性骨髄系細胞は、免疫応答の刺激に十分に有効ではない骨髄系細胞である（例えば、刺激性骨髄系細胞と比較して、腫瘍微小環境における抗腫瘍応答の刺激に有効ではない）。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、刺激性骨髄系細胞と比較して、Ｔ細胞に対する抗原（例えば、腫瘍抗原）提示に有効ではないか、または腫瘍特異的なＴ細胞応答の刺激に有効ではない。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、刺激性骨髄系細胞と比較して、Ｔ細胞に対する腫瘍関連抗原の取り込み、処理、及び／または提示の能力が低いことを示し得る。非刺激性骨髄系細胞は、低い細胞傷害性Ｔリンパ球の再刺激能力を含有し得るか、もしくは当該能力を含有し得ないか、または場合によっては、有効な腫瘍細胞死滅の刺激を行うことができない。非刺激性骨髄系細胞は、刺激性骨髄系細胞と比較して、抗原処理、抗原提示、及び／または抗原同時刺激に関与する遺伝子及び細胞表面マーカーの発現量が低いことを示し得、当該遺伝子及び細胞表面マーカーには、限定はされないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩ、及びＭＨＣＩＩが含まれる。

【0066】

非刺激性骨髄系細胞は、刺激性骨髄系細胞と比較すると、交差提示、同時刺激、及び／または刺激性サイトカインと関連する遺伝子の発現量を低く示し得ると共に、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の発現量を高く示し得り、当該関連遺伝子には、限定はされないが、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＴＡＰＢＰ、ＰＳＭＥ２、ＣＤ２４ａ、ＣＤ２７４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２４４、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＡＭ１、ＴＩＭ３、ＰＤＬ２、ＲＡＮＫ、ＦＬＴ３、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ２ＲＢ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＩＬ１２ｂ、ＸＣＲ１、ＣＣＲ７、ＣＣＲ２、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、及びＣＣＬ５のうちの任意の１つまたは複数が含まれる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、分化及び生存のために、転写因子であるＩＲＦ４、及びサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１に依存する。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を分泌することによって、腫瘍性の血管新生に寄与し得ると共に、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を分泌することによって腫瘍の増殖を支持し得る。

【0067】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）または樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、樹状細胞（ＤＣ）ではない。

【0068】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である。ＴＡＭは、癌性腫瘍の付近、またはその内部に存在するマクロファージであり、循環している単球または組織常在性のマクロファージに由来する。

【0069】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞及び刺激性骨髄系細胞は、それらが発現するマーカー、またはそれらが選択的に発現するマーカーに基づいて区別される。細胞表面マーカーの発現量は、「＋」または「陽性」として記載され得る。細胞表面マーカーの欠如は、「−」または「陰性」として記載され得る。細胞表面マーカーの発現量は、「高（ｈｉｇｈ）」（高レベルのマーカーを発現する細胞）または「低（ｌｏｗ）」（低レベルのマーカーを発現する細胞）としてさらに記載され、これらは、細胞表面のそれぞれのマーカーの相対的な発現量を示す。マーカーのレベルは、当該技術分野において知られるさまざまな方法によって決定してよく、例えば、免疫染色及びＦＡＣＳ分析、またはゲル電気泳動及びウエスタンブロット法である。

【0070】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、スパイク状または樹状の形態によって区別することができる。１つの実施形態では、非刺激性樹状細胞は、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１４−、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ１＋（ＤＣ１細胞とも称される）である。１つの実施形態では、非刺激性樹状細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１４−、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ３＋（ＤＣ２細胞とも称される）ではない。１つの実施形態では、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１４−、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ３＋である樹状細胞は、刺激性骨髄系細胞である。

【0071】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、腫瘍関連マクロファージである。いくつかの実施形態では、例えば、ヒトでは、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１４＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｃ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻である。いくつかの実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｃ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である。

【0072】

いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、例えばマウスといった他の動物のＴＡＭ及びＤＣの標的化に有用である。そのような実施形態では、マウスのＴＡＭ及びＤＣと、ＮＳＭ抗体との接触が実施される。１つの実施形態では、例えば、マウスでは、腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ^高、及びＣＤ１１ｃ^低（ＴＡＭ１とも称される）である。１つの実施形態では、例えば、マウスでは、腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ^低、及びＣＤ１１ｃ^高（ＴＡＭ２としても称される）である。本明細書では、「ＣＤ１１ｂ^高マクロファージ」という用語は、高レベルのＣＤ１１ｂを発現するマクロファージに関する。本明細書では、「ＣＤ１１ｂ^低マクロファージ」という用語は、ＣＤ１１ｂ^高マクロファージのものより実質的に低いレベルのＣＤ１１ｂをその表面に発現するマクロファージに関する。本明細書では、「ＣＤ１１ｃ^高」という用語は、高レベルのＣＤ１１ｃを発現するマクロファージに関する。本明細書では、「ＣＤ１１ｃ^低マクロファージ」という用語は、Ｃｄ１１ｃ^高マクロファージのものより実質的に低いレベルのＣＤ１１ｃをその表面に発現するマクロファージに関する。

【0073】

いくつかの実施形態では、本発明の非刺激性骨髄系細胞は、１つまたは複数のＴＡＭ細胞及びＤＣ１細胞を含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、例えば、マウスでは、本発明の非刺激性骨髄系細胞は、１つまたは複数のＴＡＭ１細胞、ＴＡＭ２細胞、及びＤＣ１細胞を含む。そのような実施形態では、本発明の非刺激性骨髄系細胞と、ＮＳＭ抗体との接触が実施される。

【0075】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、腫瘍性病巣の周縁部内、または癌化腫瘍管に局在しており、そこで、同種Ｔ細胞と接触するようになる。１つの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の局在は修正され、その結果、当該細胞は、もはや腫瘍周縁部に局在しないか、またはもはやＴ細胞と接触しない。

【0076】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在する。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、非刺激性骨髄系細胞のみを含む免疫細胞集団に存在する。本発明の免疫細胞集団は、純粋であり、同種性であり、異種性であり、さまざまな供給源に由来し（例えば、疾患組織、腫瘍組織、健康な組織、細胞バンク）、初代細胞培養で維持され、不死化培養で維持され、及び／またはエクスビボ培養で維持されてよい。

【0077】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、腫瘍関連マクロファージである。

【0078】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、樹状細胞である。

【0079】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ１^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ１^＋である細胞を含む。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ１^＋である細胞からなる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ１^＋である細胞から本質的になる。

【0080】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻である細胞を含む。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻である細胞からなる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻である細胞から本質的になる。

【0081】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋である細胞を含む。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋．である細胞からなる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋である細胞から本質的になる。

【0082】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｃ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｃ^＋である細胞を含む。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｃ^＋である細胞からなる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｃ^＋である細胞から本質的になる。

【0083】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、及びＣＤ１１ｃ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、及びＣＤ１１ｃ^＋である細胞を含む。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、及びＣＤ１１ｃ^＋である細胞からなる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、及びＣＤ１１ｃ^＋である細胞から本質的になる。

【0084】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋である細胞を含む。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋である細胞からなる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋である細胞から本質的になる。

【0085】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である細胞を含む。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である細胞からなる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である細胞から本質的になる。

【0086】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である細胞を含む。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である細胞からなる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＢＤＣＡ３⁻、ＣＤ１１ｂ^＋、及びＣＤ１１ｃ^＋である細胞から本質的になる。

【0087】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋ではない。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋ではない細胞を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、例えば、マウスでは、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^高、及びＣＤ１１ｃ^低である。いくつかの実施形態では、例えば、マウスでは、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^高、及びＣＤ１１ｃ^低である細胞を含む。いくつかの実施形態では、例えば、マウスでは、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^高、及びＣＤ１１ｃ^低である細胞からなる。いくつかの実施形態では、例えば、マウスでは、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^高、及びＣＤ１１ｃ^低である細胞から本質的になる。そのような実施形態では、非刺激性マウス骨髄系細胞と、ＮＳＭ抗体との接触が実施される。

【0089】

いくつかの実施形態では、例えば、マウスでは、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^低、及びＣＤ１１ｃ^高である。いくつかの実施形態では、例えば、マウスでは、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^低、及びＣＤ１１ｃ^高である細胞を含む。いくつかの実施形態では、例えば、マウスでは、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^低、及びＣＤ１１ｃ^高である細胞からなる。いくつかの実施形態では、例えば、マウスでは、非刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｂ^低、及びＣＤ１１ｃ^高である細胞から本質的になる。そのような実施形態では、非刺激性マウス骨髄系細胞と、ＮＳＭ抗体との接触が実施される。

【0090】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、癌組織に存在する。

【0091】

いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、癌組織に存在する。

【0092】

いくつかの実施形態では、非刺激性細胞及び刺激性骨髄系細胞は、癌組織に存在する。

【0093】

いくつかの実施形態では、生体試料は、非刺激性骨髄系細胞及び刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団を含む。

【0094】

ＮＳＭ細胞は、腫瘍組織に存在するＤＣ１細胞、ＴＡＭ１細胞、及びＴＡＭ２細胞を集合的に指し得、それらがＮＳＭ細胞マーカーを発現することによって、他の細胞型と区別され得る。例えば、ＳＤＣのものと比較して、ＮＳＭ細胞において、発現量または転写量が多い遺伝子及び関連タンパク質は、ＮＳＭマーカーとして機能し得る。例示のＮＳＭマーカーは、ＣＤ１１ｂである。ＮＳＭマーカーの追加の例は、表Ａに記載される。ＮＳＭ細胞は、その細胞表面に、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ１１９を発現し得る。いくつかの態様では、ＮＳＭ細胞は、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１のうちの少なくとも１つを発現しない。

【0095】

１つの実施形態では、ＮＳＭ細胞は、表Ａに記載のＮＳＭマーカー遺伝子の１つまたは複数を発現する腫瘍浸潤性の骨髄系細胞である。別の実施形態では、ＮＳＭ細胞は、表Ａに記載のＮＳＭマーカーの３つ以上を発現する腫瘍骨髄系細胞である。別の実施形態では、ＮＳＭ細胞は、表Ａに記載のＮＳＭマーカーのほとんどまたはすべてを発現する腫瘍骨髄系細胞である。別の実施形態では、ＮＳＭ細胞は、ＭＲＣ１、ＭＳ４Ａ７、Ｃ１ＱＣ、ＡＰＯＥ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、及びＣ５ＡＲ１を発現する腫瘍骨髄系細胞として同定される。
（表Ａ）

【0096】

刺激性骨髄系細胞（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｃｅｌｌ）
本明細書では、刺激性骨髄系細胞（ある特定の態様では、ＳＤＣとも呼ばれる）は、免疫応答の刺激に有効な骨髄系細胞である（例えば、非刺激性骨髄系細胞と比較して、腫瘍微小環境における抗腫瘍応答の刺激に、より有効である）。いくつかの実施形態では、刺激性骨髄系細胞は、非刺激性骨髄系細胞と比較して、Ｔ細胞に対する抗原（例えば、腫瘍抗原）提示に有効であるか、または腫瘍特異的なＴ細胞応答の刺激に有用である。いくつかの実施形態では、刺激性骨髄系細胞は、非刺激性骨髄系細胞と比較して、Ｔ細胞に対する腫瘍関連抗原の取り込み、処理、及び／または提示の高い能力を示し得る。刺激性骨髄系細胞は、非刺激性骨髄系細胞と比較して、細胞傷害性Ｔリンパ球の高い再刺激能力を有し得るか、または場合によっては、有効な腫瘍細胞死滅刺激を行うことができる。刺激性骨髄系細胞は、非刺激性骨髄系細胞と比較して、抗原処理、抗原提示、及び／または抗原同時刺激に関与する遺伝子及び細胞表面マーカーの高い発現量を示し得り、当該遺伝子及び細胞表面マーカーには、限定はされないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩ、及びＭＨＣＩＩが含まれる。

【0097】

例示の刺激性骨髄系細胞マーカーは、表Ａに記載される。例えば、ヒトＳＤＣでは、Ｘｃｒ１、Ｃｌｅｃ９ａ、及びＢＤＣＡ３（ＣＤ１４１）の発現は、ＳＤＣ独自性のマーカーである。ＣＤ１０３は、ヒトＳＤＣでは発現しないものの、マウスでは、ＣＤ１０３もＳＤＣ独自性の強力なマーカーとして使用され得ると留意されるであろう。

【0098】

１つの実施形態では、ＳＤＣは、樹状細胞独自性を有する腫瘍浸潤性の骨髄系細胞であり、表Ａに記載のＳＤＣマーカーも１つまたは複数発現する。別の実施形態では、ＳＤＣは、樹状細胞独自性を有する腫瘍浸潤性の骨髄系細胞であり、表Ａに記載のＳＤＣマーカーも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはすべて発現する。別の実施形態では、ＳＤＣは、ＢＤＣＡ３、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＸＣＲ１、及びＣＬＥＣ９Ａを発現する腫瘍浸潤性の骨髄系樹状細胞として同定される。ＳＤＣ細胞は、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１のうちの少なくとも１つを発現し得る。いくつかの実施形態では、ＳＤＣは、その細胞表面に、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及び／またはＴＭＥＭ１１９を実質的に発現しない。いくつかの実施形態では、ＳＤＣは、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、ＴＬＲ７、及び／またはＬＩＬＲＢ４を実質的に発現しない。本明細書に開示のマーカーの発現量を評価するために、技術分野で認識される、数あるアッセイのなかでも特に、フローサイトメトリー及びＰＣＲを使用することができる。

【0099】

刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋であり得る。刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋であり得る。刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１４⁻、及びＢＤＣＡ３^＋であり得る。刺激性骨髄系細胞は、ＣＤ４５^＋、ＨＬＡ−ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、及びＢＤＣＡ３^＋であり得る。

【0100】

抗体
本出願は、抗体及び組成物を提供し、当該組成物は、非刺激性骨髄系細胞を無能化する抗体を含む、ＮＳＭタンパク質に結合する抗体を含む。

【0101】

本出願は、抗体及び組成物を提供し、当該組成物は、非刺激性骨髄系細胞を無能化する抗体を含む、ＮＳＭタンパク質に結合する抗体を含む。

【0102】

本明細書では、「抗体」または「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子もしくは免疫グロブリン遺伝子のセットによって実質的にコードされるポリペプチド、または分析物結合性であるその断片であって、分析物（例えば、抗原）に特異的に結合及びそれを特異的に認識するものを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパー定常領域遺伝子、ラムダ定常領域遺伝子、アルファ定常領域遺伝子、ガンマ定常領域遺伝子、デルタ定常領域遺伝子、イプシロン定常領域遺伝子、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパーまたはラムダのいずれかとして分類される。抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体には主要な５つのクラスが存在し、当該クラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭである。こうしたもののいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）へとさらに分かれ得るものであり、当該サブクラスは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ_２である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0103】

例示の免疫グロブリン（抗体）構造単位は、２つのポリペプチド鎖対からなり、それぞれの対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）、及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。それぞれの鎖のＮ末端ドメインは、約１００〜１１０残基またはそれより多くのアミノ酸を有した、抗原認識を主に担う可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、こうした軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインを指す。ＩｇＧ１重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端の順で、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインからなる。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端の順で、ＶＬドメイン及びＣＬドメインからなる。ＩｇＧ１重鎖は、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインの間にヒンジを含む。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン構築物は、治療ポリペプチドに連結された、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥに由来する免疫グロブリンドメインを少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体に見られる免疫グロブリンドメインは、ダイアボディ、またはナノボディなどの、免疫グロブリンに基づく構築物に由来するか、またはそこから得られる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の免疫グロブリン構築物は、ラクダ抗体（ｃａｍｅｌｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）などの重鎖抗体に由来する免疫グロブリンドメインを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される免疫グロブリン構築物は、ウシ抗体（ｂｏｖｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト抗体、ラクダ抗体、マウス抗体、または任意のキメラ抗体などの哺乳類抗体に由来する免疫グロブリンドメインを少なくとも１つ含む。

【0104】

本明細書では、「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変性であり、及び／または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、４つの鎖を有する天然抗体は、６つのＨＶＲを含み、その内訳は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。ＨＶＲは、一般に、超可変ループに由来するアミノ酸残基、及び／または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来するアミノ酸残基を含み、相補性決定領域は、最も高い配列可変性を有しており、及び／または抗原認識に関与する。ＶＨにおけるＣＤＲ１は例外であるが、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも称され、こうした用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関連して、本明細書で互換的に使用される。この特定領域については、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）、及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１−９１７（１９８７）によって説明されており、これらの中で、お互いを比較すると、定義は、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含んでいる。それでもなお、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すために、いずれかの定義を適用することは、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内であることを意図する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変化することになる。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮することで、どの残基が特定ＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。

【0105】

本明細書では、「単鎖」という用語は、ペプチド結合によって直線的に連結されたアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定のそのような実施形態では、単鎖Ｆａｂ分子において、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端に連結される。本明細書に、より詳細に記載されるように、ｓｃＦｖでは、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）のＣ末端が、ポリペプチド鎖によって、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）のＮ末端に連結されている。あるいは、ｓｃＦｖは、ＶＨのＣ末端が、ポリペプチド鎖によって、ＶＬのＮ末端に連結されたポリペプチド鎖を含む。

【0106】

「Ｆａｂ断片」（抗原結合断片とも称される）は、軽鎖及び重鎖にそれぞれ存在する可変ドメインであるＶＬ及びＶＨに加えて、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも称される）を含む。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも称される）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域に由来するシステインを１つまたは複数含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基が付加していることによって、Ｆａｂ断片とは異なるものである。

【0107】

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、こうしたドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。１つの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの間に、抗原結合のためにｓｃＦｖが所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖ断片については、ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び米国特許第５，５８７，４５８号において説明されている。

【0108】

「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」の形式は、個々の免疫グロブリンドメインである。Ｓｄａｂは、極めて安定であり、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとしての発現が容易である（Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＭ，Ｄｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（２００７）．“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３−２２）。

【0109】

本明細書に記載の「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。用語は、天然配列のＦｃ領域及び変異体のＦｃ領域を含む。別段の特定記載がない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵの番号付けシステムに従う。ＥＵの番号付けシステムは、ＥＵインデックスとも呼ばれ、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１において説明される通りである。本明細書では、２量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、２量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つを指し、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合を実現する能力を有するポリペプチドを指す。例えば、２量体ＩｇＧＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧのＣＨ２定常ドメイン配列、及びＩｇＧのＣＨ３定常ドメイン配列を含む。Ｆｃのクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり得、こうしたクラスのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）へとさらに分かれ得る。サブクラスは、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２である。

【0110】

「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。例えば、ＦｃＲは、天然配列を有するヒトＦｃＲであり得る。一般に、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であると共に、ＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩサブクラス、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含むものであり、対立遺伝子変異体、あるいは、こうした受容体のスプライシングされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（抑制性受容体）を含み、これらは、それらの細胞質ドメインが主に異なる類似したアミノ酸配列を有する。他のアイソタイプの免疫グロブリンは、ある特定のＦｃＲとも結合し得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ ｅｄ．，１９９９）を参照のこと）。活性化受容体であるＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制性受容体であるＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）において概説されている）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）、及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において概説されている。他のＦｃＲは、未来に同定されることになるものを含めて、本明細書に記載の「ＦｃＲ」という用語によって包含される。用語は、新生児型受容体であるＦｃＲｎも含み、ＦｃＲｎは、母系性ＩｇＧの胎児への移行を担うものである（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。

【0111】

ＣＨ２ドメインの改変は、Ｆｃに対するＦｃＲの結合に影響を与え得る。Ｆｃ領域におけるアミノ酸改変は、当該技術分野において多く知られており、それらは、異なるＦｃガンマ受容体を対象としてＦｃの親和性を選択的に変えるためのものである。いくつかの態様では、Ｆｃは、Ｆｃ−ガンマ受容体の選択的結合を促進する１つまたは複数の改変を含む。

【0112】

Ｆｃに対するＦｃＲの結合を変える変異の例は、以下に記載のものである。

【0113】

Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（Ｌｕ Ｙ，Ｖｅｒｎｅｓ ＪＭ，Ｃｈｉａｎｇ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１ Ｆｅｂ ２８；３６５（１−２）：１３２−４１）、

【0114】

Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ＪＢ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ，Ｔｕａｉｌｌｏｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｓｅｐ １５；６７（１８）：８８８２−９０、Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ＪＬ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｎｏｖ ３０；１３（６）：Ｒ１２３）、

【0115】

Ｆ２４３Ｌ（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｒ，Ｔｈｏｍ Ｇ，Ｌｅｖｅｎｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１１ Ｓｅｐ；２４（９）：６７１−８．）、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ，Ｈｏｎｇ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１−６０４）、

【0116】

Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒ ＧＡ，Ｄａｎｇ Ｗ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６ Ｍａｒ １４；１０３（１１）：４００５−１０）、

【0117】

Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Ｃｈｕ ＳＹ，Ｖｏｓｔｉａｒ Ｉ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｓｅｐ；４５（１５）：３９２６−３３）、

【0118】

Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２７０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ、Ｇ２３７Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄ、ならびにＷＯ２０１１／１２０１３４、及びＷＯ２０１１／１２０１３５において記載される他の変異。こうした文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ ａｎｄ Ｌｉｌａ Ｍ．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｎｏ １１，ＩＳＢＮ １ ９０７５６８ ３７ ９，Ｏｃｔ ２０１２によるもの）の２８３ページに記載される変異。

【0119】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、それがエフェクター機能を媒介する能力を改善するための改変を含む。そのような改変は、当該技術分野において知られており、アフコシル化、または活性化受容体へのＦｃの親和性操作、及びＣＤＣを対象とするＣ１ｑへのＦｃの親和性操作を含み、活性化受容体へのＦｃの親和性操作は、主に、ＡＤＣＣを対象とするＦＣＧＲ３ａへのＦｃの親和性操作である。以下の表Ｂは、文献で報告されたさまざまな設計を、エフェクター機能の操作を対象として要約したものである。

【0120】

Ｆｃの糖鎖付加部位（ＥＵの番号付けでＡｓｎ２９７）にフコースがほとんど付加しないか、または全く付加しない抗体を、アミノ酸配列を変えることなく生産させる方法は、当該技術分野においてよく知られている。ＧｌｙｍａＸ（登録商標）技術（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ）は、フコース生合成の細胞経路を変える酵素の遺伝子を、抗体産生に使用する細胞へと導入することに基づくものである。これによって、Ｎ結合型の抗体糖質部分に対して、抗体産生細胞が、糖である「フコース」を付加することを防ぐ。（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｄｅｃ；２０（１２）：１６０７−１８。フコシル化レベルが低下した抗体を得る別の手法は、米国特許第８，４０９，５７２号において見つけることができ、当該特許は、フコシル化レベルが低い抗体を細胞が産生する能力を対象として、抗体産生で細胞株を選択することを教示している。抗体は、完全にアフコシル化（抗体が検出可能なフコースを有さないことを意味する）するか、また部分的にアフコシル化することができ、部分的アフコシル化は、単離した抗体のフコース量が、哺乳類の発現系によって産生される類似抗体で通常検出されるフコース量の９５％未満、８５％未満、７５％未満、６５％未満、５５％未満、４５％未満、３５％未満、２５％未満、１５％未満、または５％未満であることを意味する。

【0121】

したがって、１つの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、表Ｂに示すような、エフェクター機能を改善するアミノ酸改変の１つまたは複数を含む２量体Ｆｃを含み得る。別の実施形態では、抗体は、エフェクター機能を改善するためにアフコシル化することができる。
（表Ｂ）ＣＨ２ドメイン及びエフェクター機能の操作

【0122】

ＦｃγＲ及び／もしくは補体の結合、ならびに／またはエフェクター機能を低下させるＦｃ改変は、当該技術分野において知られている。抗体のエフェクター機能を低下させるか、または静める操作に使用されてきた方針については、最近の出版物によって説明されている（Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ（２００９），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：６８５−６９１、及びＳｔｒｏｈｌ，ＷＲ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ ＬＭ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ”Ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ２２５−２４９を参照のこと）。こうした方針には、糖鎖付加の改変を介したエフェクター機能の低減、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４骨格の使用、またはＦｃのヒンジ領域もしくはＣＨ２領域への変異導入が含まれる。例えば、米国特許公開第２０１１／０２１２０８７号（Ｓｔｒｏｈｌ）、国際特許公開第ＷＯ２００６／１０５３３８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２２５０５８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２５１５３１号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＳｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ（（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９）において、Ｆｃに対するＦｃγＲまたは補体の結合を特異的に減少させる改変について説明されている。

【0123】

Ｆｃに対するＦｃγＲまたは補体の結合を減少させる既知のアミノ酸改変の特定の非限定例には、以下の表に記載のものが含まれる。
（表Ｃ）Ｆｃに対するＦｃγＲまたは補体の結合を減少させる改変

【0124】

いくつかの実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）活性を有する。ＡＤＣＣは、病原性または腫瘍形成性である標的細胞の表面抗原に対して抗体が結合すると生じ得るものである。その細胞表面にＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲまたはＦＣＧＲ）を有するエフェクター細胞が、標的細胞に結合した抗体のＦｃ領域を認識して結合する。当該エフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、または単球が含まれる。そのような結合は、細胞死につながる細胞内シグナル伝達経路の活性化を引き起こすことができる。特定の実施形態では、抗体の免疫グロブリンＦｃ領域サブタイプ（アイソタイプ）は、ヒトのＩｇＧ１及びＩｇＧ３を含む。本明細書では、ＡＤＣＣは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性の細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞に結合した抗体を認識し、それに続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性の反応を指す。ＡＤＣＣの媒介を目的とする初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号において説明されているものなどの、インビトロでのＡＤＣＣアッセイを実施してよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）において開示されているものなどの動物モデルにおいて、インビボでの評価を実施してよい。

【0125】

いくつかの実施形態では、抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。抗体が誘導するＣＤＣは、古典的補体カスケードのタンパク質を介して媒介され、補体タンパク質であるＣ１ｑが抗体に結合することによって引き起こされる。Ｃ１ｑに対して抗体Ｆｃ領域が結合すると、補体カスケードの活性化が誘導される。特定の実施形態では、抗体の免疫グロブリンＦｃ領域サブタイプ（アイソタイプ）は、ヒトのＩｇＧ１及びＩｇＧ３を含む。本明細書では、ＣＤＣは、補体の存在下において、分子が標的を溶解する能力を指す。補体活性化経路は、同種抗原と複合体化した分子（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体））に対して、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）において説明されているようなＣＤＣアッセイを実施してよい。

【0126】

抗ＮＳＭ抗体は、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ１１９のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を標的とすることができる。抗ＮＳＭ抗体は、ＴＲＥＭ２を標的とすることができる。抗ＮＳＭ抗体は、ＭＳ４Ａ７を標的とすることができる。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及び／またはＴＭＥＭ１１９のうちの１つまたは複数を標的としない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＬＩＬＲＢ４を標的としない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＴＲＥＭ２には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＭＳ４Ａ７には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、Ｃ５ＡＲ１には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＬＹＶＥ１には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＡＢＣＣ３には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＬＩＬＲＢ４には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＳＩＧＬＥＣ１には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＳＴＡＢ１には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＴＭＥＭ３７には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＭＥＲＴＫには結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＴＭＥＭ１１９には結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、ＴＬＲ７には結合しない。

【0127】

いくつかの実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞貪食（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）（ＡＤＣＰ）活性を有する。ＡＤＣＰは、病原性または腫瘍形成性である標的細胞の表面抗原に対して抗体が結合すると生じ得るものである。単球及びマクロファージを含む、その細胞表面にＦｃ受容体を有する貪食細胞は、標的細胞に結合した抗体のＦｃ領域を認識して結合する。標的細胞に結合した抗体にＦｃ受容体が結合すると、標的細胞の貪食が開始され得る。ＡＤＣＰは、ＡＤＣＣの一形態であると考えることができる。

【0128】

いくつかの実施形態では、抗体は、免疫複合体を形成する能力を有する。例えば、免疫複合体は、抗体によって覆われた腫瘍細胞であり得る。

【0129】

いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、癌組織以外に存在する骨髄系細胞には実質的に結合しない。いくつかの態様では、抗ＮＳＭ抗体は、癌組織に存在する刺激性骨髄系細胞には実質的に結合しない。

【0130】

いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

【0131】

いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。

【0132】

いくつかの実施形態では、抗体は、ハイブリドーマによって産生される。他の実施形態では、抗体は、所望の可変ドメイン及び定常ドメインを発現するように操作された組換え細胞によって産生される。

【0133】

いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖抗体、または抗原特異性及び下流ヒンジ領域（ｌｏｗｅｒ ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を保持する他の抗体誘導体もしくはその変異体であってよい。

【0134】

いくつかの実施形態では、抗体は、多機能性抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、その断片、またはその変異体であってよい。特定の実施形態では、抗体断片またはその誘導体は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２断片、ＣＤＲ、及びＳｃＦｖから選択される。

【0135】

ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体のすべてが含まれる。１つの実施形態では、可変ドメイン及び定常ドメインのすべてが、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全なヒト抗体）。こうした抗体は、ヒトの重鎖及び／または軽鎖をコードする遺伝子に由来して抗体を発現するように遺伝子学的に改変されたマウスを対象の抗原で免疫化するものを含む、さまざまな方法で調製してよい。

【0136】

ヒト化抗体は、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／または追加が存在することによって、非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有しており、その結果、ヒト化抗体は、ヒト対象に投与されるとき、非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘導する可能性が低く、及び／または誘導する免疫応答の程度は低い。１つの実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖及び／または軽鎖のフレームワークドメイン及び定常ドメインにおける、ある特定のアミノ酸が、ヒト化抗体を産生するように改変される。別の実施形態では、ヒト抗体に由来する定常ドメイン（複数可）は、非ヒト種の可変ドメイン（複数可）に融合される。別の実施形態では、非ヒト抗体の１つまたは複数のＣＤＲ配列における１つまたは複数のアミノ酸残基が変更されることで、非ヒト抗体がヒト対象に投与されるときにその免疫原性が生じる可能性が減少し、変更されたアミノ酸残基はいずれも、抗体がその抗原に対して免疫特異的に結合することに決定的に重要なものではないか、またはアミノ酸配列に対して実施される変更は保存的な変更であり、その結果、ヒト化された抗体の抗原に対する結合は、非ヒト抗体の抗原に対する結合と比較して、顕著に悪化しない。ヒト化抗体の調製方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号、及び第５，８７７，２９３号において見つけることができる。

【0137】

キメラ抗体は、１つの抗体に由来する１つまたは複数の領域と、１つまたは複数の他の異なる抗体に由来する１つまたは複数の領域と、を含む抗体を指す。

【0138】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＮＳＭタンパク質などの表面抗原に特異的である。いくつかの実施形態では、治療抗体は、腫瘍抗原（例えば、腫瘍細胞が特異的に発現する分子）に特異的である。特定の実施形態では、治療抗体は、ヒトまたは非ヒト霊長類のＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分を有してよい。

【0139】

いくつかの実施形態では、抗体は、エフェクター分子に対して結合またはコンジュゲートされている。特定の実施形態では、抗体は、放射性核種、細胞毒素、化学療法物質、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素、免疫調節物質、抗血管新生物質、アポトーシス促進物質、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、第２の抗体、及び第２の抗体断片からなる群から選択される少なくとも１つの治療物質に対してコンジュゲートされている。

【0140】

いくつかの実施形態では、抗体は、アゴニスト抗体である。アゴニスト抗体は、細胞に発現するＮＳＭタンパク質に当該抗体が結合した後、ＮＳＭの１つまたは複数の活性または機能を誘導（例えば、向上）することができる。アゴニスト抗体は、ＮＳＭに結合して活性化し得ることで、細胞の増殖変化を引き起こすか、または抗原提示能力を改変する。アゴニスト抗体は、ＮＳＭに結合して活性化し得ることで、細胞の増殖またはアポトーシスの改変につながる細胞内シグナル伝達経路を誘発する。

【0141】

いくつかの実施形態では、抗体は、アンタゴニスト抗体である。アンタゴニスト抗体は、細胞に発現するＮＳＭタンパク質に当該抗体が結合した後、ＮＳＭの１つまたは複数の活性または機能をブロック（例えば、低下）することができる。例えば、アンタゴニスト抗体は、１つまたは複数のＮＳＭタンパク質に結合して、当該ＮＳＭタンパク質に対するリガンドの結合をブロックし得ることで、細胞の分化及び増殖を防ぐか、または抗原提示能力を改変する。アンタゴニスト抗体は、ＮＳＭタンパク質に結合して、そのリガンドによる当該ＮＳＭタンパク質の活性化を防ぎ得ることで、細胞の増殖及び生存に寄与する細胞内シグナル伝達経路を改変する。

【0142】

いくつかの実施形態では、抗体は、枯渇性抗体（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。枯渇性抗体は、抗体と他の免疫細胞との相互作用を介して分子が接触した際に、非刺激性骨髄系細胞を死滅させるであろうものである。例えば、ＮＳＭタンパク質を有する細胞に抗体が結合するとき、抗体は、補体タンパク質と結合して、補体依存性の細胞溶解を誘導することが可能である。ＮＳＭタンパク質を有する細胞に抗体が結合するとき、抗体は、Ｆｃ受容体を有する付近の細胞を誘発することで、ＮＳＭタンパク質を有する細胞を、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって死滅させることも可能である。

【0143】

いくつかの実施形態では、抗体は、中和抗体であり、抗体は、ＮＳＭの１つまたは複数の生物学的活性を中和する。いくつかの実施形態では、ＮＳＭタンパク質は、非刺激性骨髄系細胞の表面に発現し、抗体は、ＮＳＭタンパク質の細胞外ドメインを認識する。

【0144】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＮＳＭに選択的である（ＮＳＭに対して優先的に結合する）。ある特定の実施形態では、ＮＳＭに対して選択的に結合する抗体が有する解離定数（Ｋｄ）の範囲は、０．０００１ｎＭ〜１μＭである。ある特定の実施形態では、抗体は、異なる種に由来するタンパク質間で保存されているＮＳＭタンパク質のエピトープに対して特異的に結合する。別の実施形態では、選択的な結合は、必ずしも必要なわけではないが、排他的結合を含む。

【0145】

１つの実施形態では、その標的に結合した抗ＮＳＭ抗体は、それが結合した非刺激性骨髄系細胞のインビボでの枯渇の誘発を担う。いくつかの実施形態では、クラスター化した抗体によって誘導されるエフェクタータンパク質は、炎症性サイトカインの放出、抗原産生の制御、エンドサイトーシス、または細胞死滅を含む、さまざまな応答を誘発することができる。１つの実施形態では、抗体は、補体を動員及び活性化する能力を有するか、またはインビボで抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を有するか、またはＦｃ受容体との結合によってインビボで貪食を媒介する能力を有する。抗体は、結合に際して、非刺激性骨髄系細胞のアポトーシスまたは壊死を誘導することによって、非刺激性骨髄系細胞を枯渇させ得る。

【0146】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。

【0147】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ３抗体である。

【0148】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体ではない。

【0149】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体ではない。

【0150】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、インビトロで実施され、ａ）非刺激性骨髄系細胞の死滅、ｂ）磁気ビーズによる非刺激性骨髄系細胞の枯渇、またはｃ）非刺激性骨髄系細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による選別、によって達成される。

【0151】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体が有する解離定数（Ｋｄ）の範囲は、０．０００１ｎＭ〜１μＭである。例えば、抗体のＫｄは、約１μＭ、約１００ ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭから約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかの範囲であってよい。

【0152】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＮＳＭ抗体のインビボでの投与については、通常の投与量は、投与経路に応じて、１日当たり、個体の体重で約１０ｎｇ／ｋｇ〜最大で約１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれを超える量、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の間で変化してよい。数日またはそれより長い期間にわたる反復投与については、治療されることになる疾患または障害の重症度に応じて、所望の症状抑制が達成されるまで治療が維持される。例示の投薬レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇである初回用量の抗ＮＳＭ抗体の投与を含み、その後、約１ｍｇ／ｋｇである維持用量が２週間ごとに週１回投与される。医師が達成を望む薬物動態学的な減衰パターンに応じて、他の投与量レジメンを使用してよい。例えば、本明細書では、個体に対する、１週間に１〜２１回の投薬を企図する。ある特定の実施形態では、約３μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（約３μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約３０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、及び約２／ｍｇ／ｋｇなど）の投薬範囲を使用してよい。ある特定の実施形態では、投薬頻度は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、１日おき、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、または１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、もしくはこれらより長い期間に１回である。治療の進捗は、従来の手法及びアッセイによって容易に監視される。抗ＮＳＭ抗体の投与を含む投薬レジメンは、使用される用量とは無関係に、期間にわたって変えることができる。

【0153】

ある特定の実施形態では、抗体は、薬剤に対してコンジュゲートされ、薬剤は、例えば、毒素、化学療法物質、免疫調節物質、または放射性同位体である。ＡＤＣ（抗体薬剤複合体）の調製方法は、当該技術分野においていくつか知られており、例えば、米国特許第８，６２４，００３号（ポット法）、第８，１６３，８８８号（１段階）、及び第５，２０８，０２０号（２段階法）において説明されている。抗体またはその抗原結合断片は、放射性核種、細胞毒素、化学療法物質、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素、免疫調節物質、抗血管新生物質、アポトーシス促進物質、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、第２の抗体、及び抗原に結合する第２の抗体断片を含む少なくとも１つの薬剤に対してコンジュゲートすることができる。

【0154】

タンパク質、ヌクレオチド、及びホモログ
ＮＳＭタンパク質を発現する非刺激性ヒト骨髄系細胞の無能化及び／または検出を目的とする方法及び組成物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＮＳＭタンパク質のホモログを発現する非ヒト哺乳類細胞に由来する非刺激性骨髄系細胞の無能化及び／または検出に関する。例えば、マウスにおけるＮＳＭタンパク質の発現パターンは、そのヒトホモログと同等に限定されたパターンを示し得る。したがって、１つの実施形態では、ＮＳＭタンパク質を発現する非刺激性マウス骨髄系細胞の無能化及び／または検出を目的とする方法及び組成物が、本明細書で提供される。ＮＳＭタンパク質のホモログを類似の発現パターンで発現する任意の個体に由来する非刺激性細胞であって、その細胞が、ＮＳＭタンパク質のものと同等の発現パターンを示す非刺激性細胞の無能化及び／または検出を目的とする類似の方法及び組成物も、本明細書で提供される。

【0155】

ＮＳＭのタンパク質またはヌクレオチドには、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、ＴＬＲ７、及びＬＩＬＲＢ４、ならびにそれらのホモログのうちの少なくとも１つまたは複数が含まれ得る。ＳＤＣのタンパク質またはヌクレオチドには、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１、ならびにそれらのホモログのうちの少なくとも１つまたは複数が含まれ得る。細胞表面のＮＳＭタンパク質には、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ１１９のうちの少なくとも１つまたは複数が含まれ得る。細胞表面のＮＳＭタンパク質は、１つまたは複数の抗ＮＳＭ抗体によって、単独または組み合わせで標的となり得る。ＮＳＭは、一般に、ＮＳＭのタンパク質またはヌクレオチドに対して陽性であると共に、ＳＤＣのタンパク質またはヌクレオチドに対して陰性であり、それとは逆に、ＳＤＣは、一般に、ＳＤＣのタンパク質またはヌクレオチドに対して陽性であると共に、ＮＳＭのタンパク質またはヌクレオチドに対して陰性である。

【0156】

本明細書に記載の抗原結合構築物は、少なくとも１つのポリペプチドを含む。本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについても記載される。抗原結合構築物は、典型的には、単離される。

【0157】

本明細書では、「単離された」は、その天然の細胞培養環境の成分から同定され、分離及び／または回収された物質（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を意味する。その天然環境に混入している成分は、抗原結合構築物の診断的または治療的な使用を妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。単離されたは、例えば、ヒトが介在することによって、合成的に産生した物質も指す。

【0158】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。すなわち、ポリペプチドを対象とする記載は、ペプチドの記載、及びタンパク質の記載に対して同等に適用され、逆もまた同様である。用語は、天然起源のアミノ酸ポリマー、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基が、天然にコードされるアミノ酸ではないアミノ酸ポリマーに対して適用される。本明細書では、用語は、全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基は、共有ペプチド結合によって連結される。

【0159】

「アミノ酸」という用語は、天然起源及び非天然起源のアミノ酸、ならびに天然起源のアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされるアミノ酸は、２０の一般アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）、ならびにピロールリジン及びセレノシステインである。アミノ酸アナログは、天然起源のアミノ酸と同一の基本化学構造を有している化合物を指し、当該基本化学構造は、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合した炭素であり、当該化合物は、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、及びメチオニンメチルスルホニウム（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｎｉｕｍ）などである。そのようなアナログは、改変されたＲ基（ノルロイシンなど）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然起源のアミノ酸と同一の基本化学構造を保持している。アミノ酸に対する参照には、例えば、天然起源のタンパク新生Ｌ−アミノ酸、アミノ酸の変異体及び誘導体などの化学的に改変されたアミノ酸であるＤ−アミノ酸、β−アラニン、オルニチン等などの天然起源の非タンパク新生アミノ酸、ならびに当該技術分野においてアミノ酸の特性として知られる性質を有する、化学的に合成された化合物が含まれる。非天然起源のアミノ酸の例には、限定はされないが、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖に追加のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されたアミノ酸（例えば、システイン酸）が含まれる。合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸、または１つもしくは複数のＤ−アミノ酸を含む非天然アミノ酸を、本発明のタンパク質へと組み込むことは、多くのさまざまな面で有利であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド等は、Ｌ−アミノ酸含有対応物と比較して、インビトロまたはインビボでの安定性が増加している。したがって、Ｄ−アミノ酸を組み込んでペプチド等を構築することは、細胞内における安定性の増加が望ましいか、または必要であるときに、特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ−ペプチド等は、内在性のペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して抵抗性であり、それによって、そのような性質が望ましいときに、分子の生物学的利用率を改善すると共に、インビボでの存続期間を延長する。さらに、Ｄ−ペプチド等は、Ｔヘルパー細胞に対して主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ拘束性の提示を実施するために効率的に処理することが不可能であり、それ故に、生物体全体において液性免疫応答が誘導される可能性は低い。

【0160】

本明細書では、アミノ酸は、それが一般に知られる３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字の記号のいずれかによって、本明細書で称され得る。同様に、ヌクレオチドは、それが一般的に許容された１文字のコードによって称され得る。

【0161】

抗原結合構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、２つ以上のヌクレオチド分子が連続する区間を示すことを意図する。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ＲＮＡ起源、半合成起源もしくは合成起源、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

【0162】

「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、及び１本鎖形態または２本鎖形態のいずれかで存在するそれらのポリマーを指す。別段の限定がないかぎり、用語は、参照核酸と類似した結合性質を有し、天然起源のヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。別段の限定がない限り、用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術において使用されるＤＮＡアナログ（ホスホロチオエート、ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）及び同様のもの）を含むオリゴヌクレオチドアナログも指す。別段の記載がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示される配列に加えて、保存的に改変されたその変異体（限定はされないが、縮重コドンによる置換を含む）及び相補配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドンによる置換は、１つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成してよい（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。

【0163】

「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に対して適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変された変異体」は、同一もしくは本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、またはアミノ酸配列をコードしない核酸であって、本質的に同一である配列へと改変された核酸を指す。遺伝コードは縮重しているため、多数の機能的に同一である核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべて、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変えることなく、記載の対応コドンのいずれかへと変更することができる。そのような核酸変異は、「サイレント変異（ｓｉｌｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」であり、これは、一種の保存的に改変された変異である。ポリペプチドをコードする、本明細書に記載のあらゆる核酸は、その核酸の可能なあらゆるサイレント変異も説明する。当業者であれば、核酸におけるそれぞれのコドン（ＡＵＧ及びＴＧＧは例外であり、ＡＵＧは、通常、メチオニンを対象とする唯一のコドンであり、ＴＧＧは、通常、トリプトファンを対象とする唯一のコドンである）は、機能的に同一な分子を得るために改変できることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異はそれぞれ、記載配列のそれぞれにおいて潜在するものである。

【0164】

アミノ酸配列に関しては、当業者であれば、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する、コード配列の単一アミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変更、追加、または欠失させる個々の置換、欠失、または追加は、変更が、１つのアミノ酸の欠失、１つのアミノ酸の追加、１つの化学的に類似したアミノ酸での１つのアミノ酸の置換をもたらす「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を与える保存的な置換を示す表が当業者には知られている。そのような保存的に改変された変異体は、本明細書に記載の多型変異体、種間ホモログ、及び対立遺伝子に追加されるものであり、それらを除外するものではない。

【0165】

機能的に類似したアミノ酸を与える保存的な置換を示す表が当業者には知られている。下記の８つの群はそれぞれ、お互いに保存的な置換となるアミノ酸を含む。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び［０１３９］８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照のこと）

【0166】

２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関連する「同一の」または「同一性」割合という用語は、同一である２つ以上の配列または部分配列を指す。下記の配列比較アルゴリズム（もしくは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して測定されるか、または手作業のアライメント及び視覚的検査によって、比較窓（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）または指定領域にわたって、最大一致となるように比較及びアライメントされるとき、配列が、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを一定割合（すなわち、特定領域にわたる同一性割合が、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％）で有しているのであれば、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補配列も指すものである。同一性は、長さが少なくとも約５０残基のアミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在し得るか、または長さが７５〜１００残基のアミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在し得るか、または特定されない場合は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全配列にわたって存在し得る。ヒト以外の種に由来するホモログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識したプローブを使用して、厳密なハイブリダイゼーション条件下で実施されるライブラリーの選別段階と、当該ポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡ及びゲノムのクローンの単離段階と、を含む処理によって得られるものであり得る。そのようなハイブリダイゼーション手法は、当業者によく知られている。

【0167】

配列比較については、典型的には、１つの配列が参照配列となり、その配列と試験配列とが比較される。配列比較アルゴリズムを使用するときは、試験配列及び参照配列をコンピューターへと入力すると共に、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。初期設定のプログラムパラメーターを使用するか、または代替パラメーターを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列の配列同一性割合を計算する。

【0168】

本明細書では、「比較窓」は、２０〜６００、通常、約５０〜約２００、より通常は、約１００〜約１５０からなる群から選択される近接位置数のいずれか１つを有するセグメントであって、その中で、配列と、同一の近接位置数を有する参照配列と、がこれら２つの配列が最適にアライメントされた後に比較され得るセグメントに対する参照を含む。比較を目的とする配列アライメントの方法は、当業者に知られている。比較を目的とする最適な配列アライメントは、含まれるものに限定はされないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索方法によって、こうしたアルゴリズムをコンピューターに実装することによって（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、または手作業のアライメント及び視覚的検査によって（例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５付録）を参照のこと）実施することができる。

【0169】

配列同一性割合及び配列類似性の決定に適したアルゴリズムの例の１つは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０のアルゴリズムであり、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０において説明されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて、ワールドワイドウェブで利用可能なＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及びスピードを決定するものである。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列が対象）は、初期設定として、１１の文字列長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３の文字列長、及び１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）、５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両鎖比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的には、「低複雑度（ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）」のフィルターはオフにして実施される。

【0170】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性尺度の１つは、最小確率和（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然生じるであろう確率の指標を提供するものである。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較において、最小確率和が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満である場合、参照配列と類似していると考えられる。

【0171】

「に対して選択的に（または特異的に）ハイブリッド形成する」という語句は、その配列が複合混合物（限定はされないが、全細胞またはライブラリーのＤＮＡもしくはＲＮＡを含む）に存在するとき、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列のみに対して生じる、分子の結合、二重化（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、またはハイブリッド形成を指す。

【0172】

「厳密なハイブリダイゼーション条件」という語句は、当該技術分野において知られるような低イオン強度及び高温の条件下での、ＤＮＡの配列、ＲＮＡの配列、もしくは他の核酸の配列、またはそれらの組み合わせの配列のハイブリダイゼーションを指す。典型的には、厳密な条件下で、プローブは、核酸の複合混合物（限定はされないが、全細胞またはライブラリーのＤＮＡもしくはＲＮＡを含む）において、その標的配列に対してハイブリッド形成することになるが、複合混合物における他の配列に対してはハイブリッド形成しない。厳密な条件は、配列依存性であり、状況が異なれば異なることになる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリッド形成する。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細な指針については、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）において見つけることができる。

【0173】

本明細書では、「操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」という用語は、天然起源または組換えのポリペプチドまたはその断片のペプチド骨格または翻訳後修飾の任意の操作を含むと考えられる。操作は、アミノ酸配列の改変、糖鎖付加パターンの改変、または個々のアミノ酸の側鎖基の改変、ならびにこうした手法の組み合わせを含む。操作されたタンパク質は、標準的な分子生物学手法によって発現及び産生される。

【0174】

「単離された核酸分子またはポリヌクレオチド」は、核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを意図し、これらは、その天然環境から取り出されたものである。例えば、ベクターに含まれ、ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、単離されたと考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液に存在する（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド分子を通常含むが、当該ポリヌクレオチド分子が染色体外に存在するか、またはそれが天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する細胞に含まれるポリヌクレオチド分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、インビボまたはインビトロのＲＮＡ転写物、ならびにプラス鎖及びマイナス鎖の形態、ならびに２本鎖の形態が含まれる。本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、例えば、ＰＣＲまたは化学合成を介して、合成的に産生したような分子がさらに含まれる。さらに、ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸には、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの制御性要素が含まれる。

【0175】

「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号において説明されるような、インビトロでの、所望のヌクレオチド配列の増幅方法を一般に指す。一般に、ＰＣＲ法は、鋳型の核酸に対して優先的にハイブリッド形成する能力を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プリマー伸長合成サイクルを反復して実施することを伴う。

【0176】

核酸またはポリヌクレオチドが、本発明の参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有することによって、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００残基のヌクレオチド当たり最大で５個の点変異を含み得ることを除き、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して同一であることを意図する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの最大で５％は、欠失、もしくは別のヌクレオチドによる置換を有し得るか、または参照配列の全ヌクレオチドの最大で５％に相当する多数のヌクレオチドが参照配列へと挿入され得る。参照配列のこうした変更は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位置または３’末端位置に生じ得るか、あるいはそうした末端位置の間に存在する任意の位置であって、参照配列の残基間に個々に散在する任意の位置であるか、または参照配列内の１つもしくは複数の近接基における任意の位置のいずれかに生じ得る。実践的な事項として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有しているかどうかは、ポリペプチドを対象に議論したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）などの、既知のコンピュータープログラムを使用して、従来通りに決定することができる。

【0177】

ポリペプチドの誘導体または変異体は、誘導体または変異体のアミノ酸配列が、元のペプチドに由来する１００残基のアミノ酸配列と、少なくとも５０％の同一性を有するのであれば、ペプチドと「相同性」を共有しているか、または「相同性」であると言われる。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、誘導体と同一数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチド断片のいずれかのものと、少なくとも７５％同一である。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、誘導体と同一数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチド断片のいずれかのものと、少なくとも８５％同一である。ある特定の実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、誘導体と同一数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチド断片と、少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、誘導体と同一数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチド断片と、少なくとも９５％同一である。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、誘導体と同一数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチド断片のいずれかのものと、少なくとも９９％同一である。

【0178】

本明細書では、「改変された」という用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造、同時翻訳修飾、またはポリペプチドの翻訳後修飾に対する変更などの、所与のポリペプチドに対して実施される任意の変更を指す。「（改変された）」という用語形態は、議論中のポリペプチドに対する、任意の改変を意味し、すなわち、議論下にあるポリペプチドが、改変されたものであり得るか、または未改変のものであり得ることを意味する。

【0179】

いくつかの態様では、本明細書に開示の抗体またはタンパク質は、本明細書に開示の表（複数可）または受入番号（複数可）において示される関連アミノ酸配列またはその断片に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示の単離された抗体またはタンパク質は、本明細書に開示の表（複数可）または受入番号（複数可）において示される関連ヌクレオチド酸配列またはその断片に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む。

【0180】

医薬組成物
本出願は、抗体を含む組成物を提供し、当該組成物には、本明細書に記載の抗体のいずれか１つまたは複数を、１つまたは複数の医薬的に許容可能な添加剤と共に含む医薬組成物が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、無菌である。医薬組成物は、一般に、有効量の抗体を含む。

【0181】

こうした組成物は、本明細書に開示の抗体の１つまたは複数に加えて、医薬的に許容可能な添加剤、担体、緩衝剤、安定化剤、または当業者によく知られる他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨害すべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し得るものであり、投与経路は、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内の経路である。

【0182】

経口投与向けの医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたは補助剤などの固体担体を含み得る。液体の医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱物油、または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖類の溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含み得る。

【0183】

静脈内注射、皮膚注射、もしくは皮下注射、または苦痛部位への注射については、活性成分は、発熱物質を含まず、適したｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態をとることになる。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性媒体を使用して、適した溶液を調製することが十分可能である。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／または他の添加剤を必要に応じて含めることができる。

【0184】

個体に投与されることになるポリペプチド、抗体、核酸、小分子、または他の医薬的に有用な化合物が何であれ、投与は、好ましくは、個体に対して恩恵を与えるために十分である「治療的に有効な量」、または「予防的に有効な量」（場合によっては、予防は治療であると考えることができるが）で実施される。実際の投与量ならびに投与速度及び投与過程は、治療中のタンパク質凝集疾患の性質及び重症度に依存することになる。例えば、投与量等の決定といった、治療の処方は、一般医及び他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、治療されることになる疾患、個々の対象の症状、送達部位、投与方法、及び医師に知られる他の因子を考慮するものである。上で言及した手法及びプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０において見つけることができる。

【0185】

組成物は、単独、または他の治療との組み合わせで、治療されることになる症状に応じて、同時または逐次的のいずれかで投与することができる。

【0186】

方法
使用方法
１つの態様では、本出願は、非刺激性骨髄系細胞と、ヒト抗体などの抗ＮＳＭ抗体と、の接触方法を提供し、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞の無能化をもたらす。

【0187】

別の態様では、本出願は、非刺激性骨髄系細胞と、抗ＮＳＭマウス抗体と、の接触方法を提供し、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞の無能化をもたらす。

【0188】

いくつかの実施形態では、非刺激性細胞は、ＤＣ１細胞、及びＴＡＭ細胞のうちの１つまたは複数である。

【0189】

いくつかの実施形態では、本出願は、非刺激性骨髄系細胞の無能化方法を提供し、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞とＮＳＭ抗体との接触を含み、それによって、非刺激性骨髄系細胞を死滅させる。無能化は、細胞の機能を部分的または完全に消失させることを指す。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、細胞の増殖抑止誘導につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、細胞のアポトーシスにつながる。いくつかの実施形態では、非刺激性細胞の無能化は、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による細胞の溶解につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、細胞の壊死につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、細胞の増殖抑止誘導につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、細胞の不活性化につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、細胞におけるＮＳＭタンパク質の活性の中和につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、細胞増殖の減少につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、細胞の分化につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、細胞が抑制性の抗原提示細胞として働く能力の低下につながるか、または細胞が抗原提示細胞を活性化する能力の低下につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、腫瘍組織内または腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内における細胞の誤った局在化につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、腫瘍組織内または腫瘍微小環境内における細胞の空間的組織化の変化につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の無能化は、腫瘍組織内またはＴＭＥ内における細胞の時間的な発現変化につながる。いくつかの実施形態では、方法は、非刺激性骨髄系細胞の除去をさらに含む。

【0190】

本明細書に記載の非刺激性骨髄系細胞を無能化する態様のいずれか、またはすべてにおいて、特性（複数可）または機能（複数可）の態様の任意の向上または低下または変化が、抗ＮＳＭ抗体と接触しない細胞と比較される。

【0191】

別の態様では、本出願は、非刺激性骨髄系細胞と、抗ＮＳＭ抗体との接触方法を提供し、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞の機能調節をもたらす。調節は、下記のうちのいずれか１つまたは複数であり得る。いくつかの実施形態では、非刺激性細胞は、ＤＣ１細胞、ＴＡＭ１細胞、及びＴＡＭ２細胞のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、機能調節は、非刺激性骨髄系細胞の無能化につながる。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の機能調節は、例えば、非刺激性細胞がＭＨＣＩ分子上の腫瘍抗原をナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に対して交差提示する能力を向上させることによって、細胞がナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を刺激する能力の向上につながる。いくつかの実施形態では、調節は、非刺激性骨髄系細胞のＴ細胞刺激機能を向上させ、当該Ｔ細胞刺激機能には、例えば、細胞がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達、Ｔ細胞の増殖、またはＴ細胞のサイトカイン産生を誘発する能力が含まれる。１つの実施形態では、非刺激性細胞の生存率が減少するか、または非刺激性細胞の増殖が減少する。１つの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合が増加する。

【0192】

本明細書に記載の非刺激性骨髄系細胞の機能を低下させる態様のいずれか、またはすべてにおいて、特性（複数可）または機能（複数可）の態様の任意の向上または低下または変化が、抗ＮＳＭ抗体と接触しない細胞と比較される。

【0193】

いくつかの実施形態では、本出願は、非刺激性骨髄系細胞の死滅（細胞死の誘導とも称される）方法を提供し、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞と抗ＮＳＭ抗体との接触を含み、それによって、非刺激性骨髄系細胞を死滅させる。いくつかの実施形態では、死滅は、抗ＮＳＭ抗体と接触していない非刺激性骨髄系細胞と比較して増加する。いくつかの実施形態では、接触は、非刺激性骨髄系細胞のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施形態では、接触は、非刺激性骨髄系細胞のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、非刺激性骨髄系細胞及び刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団に存在する。いくつかの実施形態では、方法は、非刺激性骨髄系細胞の除去をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞の１０％〜８０％が死滅する。いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％が死滅する。

【0194】

いくつかの実施形態では、本出願は、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団における、非刺激性骨髄系細胞に対する刺激性骨髄系細胞の割合の増加方法を提供し、当該方法は、免疫細胞集団と抗ＮＳＭ抗体との接触を含む。いくつかの実施形態では、割合は、抗ＮＳＭ抗体と接触していない細胞集団と比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＤＣ１細胞に対するＤＣ２細胞の割合が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ１細胞に対するＤＣ２細胞の割合が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ２細胞に対するＤＣ２細胞の割合が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ１細胞＋ＴＡＭ２細胞に対するＤＣ２細胞の割合が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ１細胞＋ＤＣ１細胞に対するＤＣ２細胞の割合が増加する。いくつかの実施形態では、ＤＣ１細胞＋ＴＡＭ２細胞に対するＤＣ２細胞の割合が増加する。いくつかの実施形態では、ＤＣ１細胞＋ＴＡＭ１細胞＋ＴＡＭ２細胞に対するＤＣ２細胞の割合が増加する。いくつかの実施形態では、割合は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加する。

【0195】

いくつかの実施形態では、刺激性骨髄系細胞：非刺激性骨髄系細胞の接触前の比は、０．００１：１〜０．１：１の範囲にある。いくつかの実施形態では、刺激性骨髄系細胞：非刺激性骨髄系細胞の接触後の比は、０．１：１〜１００：１である。

【0196】

いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の数が減少する。いくつかの実施形態では、刺激性骨髄系細胞は、ＤＣ２細胞である。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、例えば、壊死またはアポトーシスによって死滅する。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、増殖抑止下へと誘導される。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞は、もはや増殖しない。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の空間的局在化が変化し、割合は、ＴＭＥの特定領域において増加する。いくつかの実施形態では、非刺激性骨髄系細胞の時間的な発現が変化し、割合は、腫瘍発生の間の特定期間の間で増加する。

【0197】

いくつかの実施形態では、接触は、インビトロで実施される。いくつかの実施形態では、接触は、インビボで実施される。いくつかの特定の実施形態では、接触は、ヒトにおいて、インビボで実施される。いくつかの実施形態では、接触は、抗ＮＳＭ抗体の投与によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、抗体を投与される個体（ヒトなど）は、癌を有する。

【0198】

別の態様では、本発明は、個体における免疫関連の症状（例えば、癌）の治療方法を提供し、当該方法は、抗ＮＳＭ抗体を含む有効量の組成物の、個体に対する投与を含む。別の態様では、本発明は、個体における免疫応答の増進方法を提供し、当該方法は、抗ＮＳＭ抗体を含む有効量の組成物の、個体に対する投与を含む。いくつかの実施形態では、こうした方法は、ＰＤＬ封鎖療法、ＣＴＬＡ４封鎖療法、Ｔ細胞の抑制分子をブロックする全身性のチェックポイント封鎖療法、養子Ｔ細胞療法、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、樹状細胞療法、または他の細胞療法、ならびに従来の化学療法などの他の同時治療と組み合わせてさらに提供される。

【0199】

いくつかの実施形態では、方法は、個体に由来する生体試料におけるＮＳＭタンパク質の発現レベルの決定をさらに含む。いくつかの実施形態では、生体試料には、限定はされないが、体液、組織試料、臓器試料、尿、糞便、血液、唾液、ＣＳＦ、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、生体試料は、腫瘍組織に由来する。いくつかの実施形態では、発現レベルは、ＮＳＭタンパク質をコードするｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを含む。いくつかの実施形態では、ＮＳＭタンパク質の発現レベルは、ＮＳＭのタンパク質発現レベルを含む。いくつかの実施形態では、試料におけるＮＳＭタンパク質の発現レベルは、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、放射免疫アッセイ、ドットブロット、免疫検出法、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴、光学分光、質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｙ）、ＨＰＬＣ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲ、ＲＮＡ配列解析、マイクロアレイ解析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ手法、及びＦＩＳＨ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される方法を使用して検出される。

【0200】

別の態様では、本出願は、一般的な非刺激性骨髄系細胞の存在の有無の決定方法、または特定の非刺激性骨髄系細胞（例えば、ＤＣ１細胞、ＴＡＭ１細胞、及び／またはＴＡＭ２細胞）の存在の有無の決定方法を提供し、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞を含む細胞集団と抗ＮＳＭ抗体との接触と、非刺激性骨髄系細数の定量と、を含む。別の態様では、本出願は、非刺激性骨髄系細胞の存在の有無の決定方法を提供し、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞及び刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団と抗ＮＳＭ抗体との接触と、細胞に対して抗体が結合したことを示す複合体または部分の検出と、任意で、集団における非刺激性骨髄系細胞数の定量と、を含む。別の態様では、刺激性骨髄系細胞に対する非刺激性骨髄系細胞の相対的な割合の決定方法が提供され、当該方法は、非刺激性骨髄系細胞及び刺激性骨髄系細胞を含む免疫細胞集団と抗ＮＳＭ抗体との接触と、刺激性骨髄系細胞及び非刺激性骨髄系細胞の数の定量と、刺激性骨髄系細胞に対する非刺激性骨髄系細胞の相対的な割合の決定と、を含む。

【0201】

検出及び／または定量を対象として本明細書に記載される実施形態では、抗ＮＳＭ抗体は、ＮＳＭタンパク質に結合するが、生物学的応答に対する影響は有し得るものの、ＡＤＣＣなどの生物学的応答に必ずしも影響を与える必要はない。

【0202】

別の態様では、本発明は、免疫関連の症状（例えば、癌）の治療を目的とする免疫療法（例えば、抗ＮＳＭ抗体を使用するもの）に応答し得る個体の同定方法を提供し、当該方法は、個体に由来する生体試料におけるＮＳＭタンパク質の発現レベルの検出と、個体が免疫療法に応答し得るかどうかの、ＮＳＭタンパク質の発現レベルに基づく決定と、を含み、健康な個体におけるＮＳＭタンパク質レベルと比較して、個体においてＮＳＭタンパク質レベルが上昇していることが、個体が免疫療法に応答し得ることを示す。いくつかの実施形態では、こうした方法は、個体における免疫関連の症状（例えば、癌）の診断を目的として使用してもよく、こうした方法は、ＮＳＭタンパク質の発現レベルに基づくものであり、健康な個体におけるＮＳＭタンパク質レベルと比較して、個体においてＮＳＭタンパク質レベルが上昇していることが、個体が癌を患うことを示す。いくつかの実施形態では、発現レベルは、ＮＳＭタンパク質をコードするｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを含む。他の実施形態では、ＮＳＭタンパク質の発現レベルは、ＮＳＭタンパク質のタンパク質発現レベルを含む。いくつかの実施形態では、ＮＳＭタンパク質の発現レベルは、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、放射免疫アッセイ、ドットブロット、免疫検出法、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴、光学分光、質量分析、ＨＰＬＣ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲ、ＲＮＡ配列解析、マイクロアレイ解析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ手法、及びＦＩＳＨ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される方法を使用して、試料において検出される。こうした実施形態では、抗ＮＳＭ抗体は、ＮＳＭタンパク質に結合するが、ＡＤＣＣなどの生物学的応答に必ずしも引き起こす必要はない。いくつかの実施形態では、生体試料は、腫瘍組織に由来する。いくつかの実施形態では、生体試料には、限定はされないが、体液、組織試料、臓器試料、尿、糞便、血液、唾液、ＣＳＦ、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0203】

腫瘍に対する、対象の免疫応答の増進方法、または免疫療法治療の効力の増進方法も本明細書で開示される。一般に、ＳＤＣの存在量を増加させる治療は、再発を伴わない生存期間などの、対象の予後を改善することになると共に、癌免疫療法治療の効力を増進することになる。治療は、対象の腫瘍において、ＳＤＣ細胞の相対的または絶対的な存在量を増加させることができる。治療は、対象の腫瘍において、ＮＳＭ細胞の相対的または絶対的な存在量を減少させることができる。

【0204】

一般的な治療方針の例示の方法には、Ｆｌｔ３Ｌの全身導入による、ＳＤＣ数の増加が含まれる。別の方法は、ＣＳＦ１を並行してブロックしながらの、ＦＬＴ３Ｌを使用した、対象の自己の骨髄細胞または血液細胞の治療である。骨髄または血液の前駆細胞集団における、例えば、レトロウイルスによる、ＩＲＦ８、Ｍｙｃｌ１、またはＢＡＴＦ３もしくはＺＢＴＢ４６などのＳＤＣ転写因子の発現を、ＳＤＣ発生の推進に使用してもよい。治療の別の方針には、ＳＤＣを選択的に残しながら実施する、ＮＳＭ細胞の全身排除が含まれる。これによって、こうした集団の割合に好ましい全体変化が生じ得る。ＮＳＭ細胞の排除は、ＮＳＭ表面タンパク質に対する抗体の投与（全身性または腫瘍に限局するもの）を含む、任意の手段によって達成してよい。

【0205】

いくつかの実施形態では、ＳＤＣ増進治療は、対象本来の免疫系による、癌の制御または根絶をよりよい形で可能にする療法治療として適用される。別の実施形態では、本発明のＳＤＣ増進治療は、免疫療法治療などの療法治療と組み合わせて適用され（そのような適用は、免疫療法治療の前、それと同時、またはその後に実施される）、ＳＤＣ増進治療は、療法治療の効力を増加させるための付属治療または補助治療として働く。

【0206】

投与方法
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、個体における免疫関連の症状の治療に有用である。１つの実施形態では、個体はヒトであり、抗体はＮＳＭ抗体である。別の実施形態では、個体はマウスであり、抗体は、ＮＳＭ抗体である。

【0207】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法（免疫応答の増進方法、または非刺激性骨髄系細胞の無能化誘発方法など）は、癌の治療に有用であり、したがって、抗ＮＳＭ抗体または抗ＮＳＭ抗体を投与される個体は癌を有する。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌である。いくつかの実施形態では、癌は、液性癌である。いくつかの実施形態では、癌は、免疫回避的である。いくつかの実施形態では、癌は、免疫応答性である。特定の実施形態では、癌は、メラノーマ、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌、神経膠芽腫、及び乳癌からなる群から選択される。

【0208】

いくつかの実施形態では、免疫関連の症状は、（ヒトにおける）非刺激性骨髄系細胞でのＮＳＭタンパク質の発現と関連する免疫関連の症状であるか、または非ヒト種におけるＮＳＭタンパク質のホモログの発現と関連する免疫関連の症状である。いくつかの実施形態では、免疫関連の症状は、刺激性骨髄系細胞と比較して、非刺激性骨髄系細胞でＮＳＭタンパク質が過剰に発現することと関連する免疫関連の症状である。いくつかの実施形態では、ＮＳＭのｍＲＮＡまたはＮＳＭのタンパク質の過剰発現量は、刺激性骨髄系細胞と比較して、少なくとも約２倍、約５倍、約１０倍、約２５倍、約５０倍、または約１００倍高い。

【0209】

いくつかの実施形態では、抗体は、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所的に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、注入によって、吸入によって、くも膜下腔内に、脳室内に、鼻腔内に投与される。有効量の抗ＮＳＭ抗体は、癌の治療を目的として投与してよい。抗ＮＳＭ抗体の適切な投与量は、治療されることになる癌型、抗ＮＳＭ抗体の型、癌の重症度及び経過、個体の臨床症状、個体の病歴及び治療に対する応答、ならびに担当医の裁量に基づいて決定してよい。

【0210】

ＳＤＣ及びＮＳＭ細胞の検出及び定量
本発明は、ＳＤＣ及び／またはＮＳＭ細胞の定量を目的とする任意の方法論を包含する。さまざまな実施形態は、例えば、腫瘍試料における、ＳＤＣ及び／またはＮＳＭ細胞の同定及び定量に関する。腫瘍試料は、当該技術分野において知られるように患者から得た腫瘍細胞を含む任意の組織であってよく、例えば、生検（例えば、針生検または例えば、４ｍｍのパンチ生検といったパンチ生検）で取り出された腫瘍の一部であるか、または原発性もしくは転移性の細胞を含む、外科的に切除された実質的な全腫瘍である。ＳＤＣの存在量は、周縁領域と比較して、腫瘍の遠位領域で多いことに留意されることになる。典型的な試料では、この差異は、平均化されて取り除かれることになり、結果に影響を与ないことになる。しかしながら、過剰量の周縁材料が試料に含まれるのであれば、これによって結果に影響が及び、ＳＤＣの存在量が実際より低く数えられる可能性がある。

【0211】

１つの実施形態では、試料におけるＳＤＣ及びＮＳＭ細胞の数は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、類似のフローサイトメトリーによる方法論、磁気活性化細胞選別、マイクロラフト選別、親和性に基づく細胞分離方法、及び細胞の混合集団から特定の細胞型を単離する他の手段によって直接的に定量される。例えば、当該技術分野において知られるように、腫瘍試料を酵素で消化して単一細胞浮遊液を調製してよい。その後、細胞は、それぞれの細胞型に特有のタンパク質マーカーまたは糖質マーカーに対して特異的な抗体で標識することができる。次に、当該技術分野において知られるように、さまざまな標識に基づくさまざまなゲーティングプロトコールを利用することで、ＦＡＣＳまたは類似の方法論によって細胞画分を分離することができる。例えば、実施例に記載のように、消化した腫瘍に由来する単一細胞浮遊液を、蛍光タグを有する抗体で標識することで、試料内の他の細胞型から樹状細胞画分をＦＡＣＳにより単離し、ＳＤＣ及びＮＳＭ細胞のプールを分離することが可能であった。当該技術分野で知られるように、細胞外マーカータンパク質または細胞内マーカータンパク質のいずれかの標識化を、そのような方法論で使用してよい。

【0212】

例えば、１つのＦＡＣＳプロトコールでは、腫瘍骨髄系コンパートメントのさまざまな細胞型を下記のように選別してよい。ＣＤ１１ｂ及びＬｙ６Ｃを発現する細胞は、単球及び好中球に相当し、そのようものが発現していることによって除去することができる。腫瘍マクロファージ細胞（ＴＡＭ１及びＴＡＭ２）と、樹状細胞（ＳＤＣ及びＤＣ１細胞）と、を区別するために、ＣＤ２４の高発現及びＦ４／８０の低発現を使用してよい。ＴＡＭ１細胞は、「ＣＤ１１ｂ高」、「ＭＨＣクラスＩＩ低」、及び「ＣＤ１１ｃ低」である一方で、ＴＡＭ２細胞は、「ＣＤ１１ｂ低」、「ＭＨＣクラスＩＩ高」、及び「ＣＤ１１ｃ高」であることから、２つの腫瘍マクロファージ集団は、それらがＣＤ１１ｂとＣＤ１１ｃとで発現差異を有していることによってお互いを分離することができる。ヒトの腫瘍マクロファージは、ＣＤ１４を特徴的に発現する一方で、ＤＣは、典型的には、ＣＤ１４を発現しない。２つの樹状集団のお互いの区別、及びマクロファージとの区別に役立つ区別表面マーカーの例には、マウスにおけるＣＤ１０３、ＸＣＲ１、Ｃｌｅｃ９ａ、及びＣＤ１１ｂ、またはヒトにおけるＣＤ１４、ＢＤＣＡ３、ＸＣＲ１、及びＣｌｅｃ９ａが含まれる。例えば、２つの樹状細胞集団は、それらが、ＣＤ１１ｂ（ＳＤＣには存在せず、ＮＳＭ細胞には存在する）、及びＣＤ１０３（ＮＳＭ細胞には存在せず、ＳＤＣには存在する）の発現差異を有していることによって、マウス腫瘍において分離してよい。同様に、ヒトにおいてＳＤＣは、ＢＤＣＡ３、ＸＣＲ１、及びＣｌｅｃ９を発現する一方で、非刺激性ＤＣは、ＢＤＣＡ１を発現し、マクロファージは、ＣＤ１４を発現する。

【0213】

別の実施形態では、他の細胞型と比較したＳＤＣの存在、頻度、及び相対的な存在量を決定するために、組織試料の直接的な組織学的分析が使用される。例えば、ＳＤＣマーカーを標的とする標識した抗体で組織切片を染色して抗原を比較してよく、ＮＳＭマーカーを標的とする標識した抗体で組織切片を染色して抗原を比較してよい。その後、標識した組織切片を定量的蛍光顕微鏡によって分析し、試料におけるＳＤＣ及びＮＳＭ細胞の定量、ならびに試料におけるそのような細胞の相対的な物理的分布及び物理的局在化の可視化に適用してよい。

【0214】

別の実施形態では、試料におけるＳＤＣの存在量及び／またはＮＳＭ細胞の存在量は、バルクの腫瘍試料における遺伝子発現パターンを観測することによって間接的に決定され、細胞画分への試料の分離は不必要となる。バルクの腫瘍試料におけるＳＤＣ及びＮＳＭの遺伝子マーカーの定量的解析は、腫瘍に存在するＮＳＭ細胞に対するＳＤＣの割合の代替尺度として利用される。例えば、１つの実施形態では、腫瘍試料内の細胞の全トランスクリプトームをアッセイすることで、ＮＳＭマーカー遺伝子の発現量に対するＳＤＣマーカー遺伝子の発現量の割合が決定される。マーカー遺伝子発現のそのような定量は、遺伝子発現の解析を対象とする技術分野において知られる任意の数のツールを利用して達成できると理解されることになる。

【0215】

１つの実施形態では、腫瘍試料におけるマーカー遺伝子の発現評価は、当該技術分野において知られるように、定量的ＰＣＲによる方法論を使用して実施される。そのような方法論は、当該技術分野において知られるように、全腫瘍トランスクリプトームのプロトコール、及びマーカー遺伝子の配列を特異的に増幅する能力を有するプライマー対を使用して実施することができる。マーカー遺伝子の配列が既知であることを考慮すれば、それに対するプライマーの生成は、当業者には容易なことである。発現量の定量との関連における、特定遺伝子の「遺伝子配列」に対する参照は、当該技術分野において知られるように、発現するときにその遺伝子によって産生するｍＲＮＡ（またはそこから生成するｃＤＮＡ）に対応するか、またはそれに対して相補性である全核酸配列または部分核酸配列を指すことになると理解される。

【0216】

別の実施形態では、マーカー遺伝子の発現量は、当該技術分野において知られるように、ＤＮＡアレイの手法を使用して測定することができる。マーカー遺伝子の転写物に結合するプローブは、マーカー遺伝子の既知配列を利用して、当業者が容易に生成し得ると共に、任意の数の遺伝子発現チップ及び解析プラットフォームにおいて利用してよい。

【0217】

別の実施形態では、ＳＤＣ及びＮＳＭ細胞の定量は、マーカー遺伝子またはその翻訳産物によって制御される遺伝子及びタンパク質として定義されると共に、その活性がマーカー遺伝子の発現に応答して予測通りに変化する下流の遺伝子及びタンパク質の存在または活性を監視することによって達成される。別の実施形態では、例えば、免疫学的な活性の差異によってＳＤＣ及びＮＳＭ細胞を同定または定量するために、機能アッセイが使用される。例えば、ＳＤＣは、腫瘍抗原の交差提示能を有しており、ＣＤ８Ｔ細胞の強力な活性化因子である一方で、ＮＳＭ細胞はそうではない。同様に、ＮＳＭ細胞は、高度に貪食的な挙動をとる一方で、ＳＤＣは、頑強さが比較的少ない貪食細胞である。

【0218】

存在量及び探索
本発明のさまざまな実施形態は、腫瘍におけるＳＤＣの存在量の決定に関する。そのような細胞の存在量は、さまざまな尺度によって評価してよい。そのような測定は、相対的な測定または絶対的な測定を含み得、直接的または間接的な測定を含み得る。例えば、相対的な存在量は、試料におけるＮＳＭ細胞に対するＳＤＣの割合、試料におけるＤＣ１細胞の数に対するＳＤＣの割合、または試料内のすべての細胞型に対するＳＤＣの割合、試料における全骨髄系細胞に対するＳＤＣの割合、もしくは試料におけるＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞に対するＳＤＣの割合、を測定することによって決定してよい。いくつかの実施形態では、ＳＤＣの絶対的な存在量は、例えば、腫瘍組織のｍｌ当たりの全ＳＤＣ数の尺度、または腫瘍組織のマイクログラム当たりの全ＳＤＣ数の尺度として決定される。間接的な尺度には、ＳＤＣマーカー遺伝子の遺伝子発現レベルの単独評価、またはＮＳＭ細胞などの他の細胞型との、マーカー発現レベルの比較評価が含まれる。

【0219】

さまざまな実施形態では、対象の腫瘍におけるＳＤＣの存在量は、予後指標、診断指標、または治療選択指標を含む。

【0220】

さまざまな実施形態は、ＳＤＣの存在量の「上昇」または「増加」などの比較尺度に関する。そのような比較尺度は、代表試料と対象由来の試料との比較によって実施してよい。代表試料には、例えば、早期時点の同一対象に由来する試料、同様の対象（例えば、年齢、性別、健康指標、癌の進行度、癌型等が適合する）に由来する試料、または同様の腫瘍（例えば、腫瘍の型、腫瘍の段階、及び腫瘍の進行度の他の尺度）に由来する試料が含まれ得る。いくつかの実施形態では、例えば、治療の効力が測定され、存在量の上昇は、存在量が、治療を受けていない対象に由来する代表試料において観測されるものと比較して増加していることであると定義される。いくつかの実施形態では、存在量の上昇または増加を構成するものを決定するために、典型的または平均的なＳＤＣ存在量の尺度がベースラインとして使用され、例えば、代表試料におけるＳＤＣの平均値、中央値、または類似の統計学的尺度を使用してよい。有意に上昇または増加した量を定義するために、当該技術分野において知られるさまざまな統計学的な方法論を使用してよい。

【0221】

１つの実施形態では、対象の腫瘍におけるＳＤＣの存在量は、予後指標を含み、対象の予後は、対象の腫瘍におけるＳＤＣの存在量に基づいて予測され、存在量の上昇が、予後が好ましい確率が高いことを示す。予後の例示尺度には、再発を伴わない生存の可能性、再発を伴わない生存の予測期間、全生存の予測期間、再発の危険、生命指標の質等が含まれる。例えば、１つの実施形態では、腫瘍試料におけるＮＳＭ細胞に対するＳＤＣの割合は、直接的または間接的のいずれかで測定され、ＳＤＣの存在量の尺度として利用され、再発を伴わない生存の予測期間は、対象の予後の尺度である。例えば、同様の腫瘍試料のプールにおいて観測されるＮＳＭマーカー遺伝子の発現量に対するＳＤＣマーカー遺伝子の発現量の割合の平均値または中央値は、閾値として役立ち得るものであり、個々の対象で測定された割合が、当該閾値を超えるのであれば、その対象は再発を伴わずに生存する可能性が高いと考えられる。

【0222】

別の実施形態では、対象の腫瘍におけるＳＤＣの存在量は、対象が免疫療法治療に対して陽性応答する可能性の指標であり、対象に由来する腫瘍試料におけるＳＤＣの存在量の上昇は、免疫療法に対して陽性応答する可能性が高いことの指標である。例えば、１つの実施形態では、腫瘍試料におけるＮＳＭ細胞に対するＳＤＣの割合は、直接的または間接的に測定され、ＳＤＣの存在量の尺度として利用される。例えば、同様の腫瘍試料のプールにおいて観測されるＮＳＭマーカー遺伝子の発現量に対するＳＤＣマーカー遺伝子の発現量の割合の平均値または中央値は、閾値として役立ち得るものであり、個々の対象で測定される割合が、当該閾値を下回るのであれば、その対象は免疫療法に対して陽性応答する可能性が低いと考えられる。

【0223】

どの対象が、免疫療法による治療に適性を有している可能性が高いかを予測する方法が存在すれば、適切な治療介入の選択が有利に可能となる。免疫療法治療に対して応答する可能性が低いと考えられる対象には、他の治療様式を適用してよい一方で、免疫療法に対して応答する可能性が高い対象は、それに応じて治療することができる。本発明の治療選択指標は、当該技術分野において知られる任意の癌免疫療法に対する応答性または非応答性の予測に適用可能である。例えば、１つのクラスの癌免疫療法は、「チェックポイント封鎖（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ）」治療として知られる。哺乳類の免疫系は、さまざまな「チェックポイント」を含んでおり、それらは、通常は免疫応答を減弱する共に自己免疫反応を防ぐために働く自己制限性の抑制経路である。腫瘍は、こうした経路を乗っ取り、その結果、抗腫瘍免疫応答が抑制されることが明らかとなっている。さまざまな治療方針がチェックポイント封鎖として知られており、それらは、抗体などのリガンドを使用することで、こうした制御点をブロックし、腫瘍による免疫応答抑制を抑制して抗腫瘍免疫を奪回することを含むものである。別のクラスの免疫療法は、細胞に基づく方針を含み、例えば、樹状細胞などの細胞を対象から取り出し、そのような細胞を、腫瘍抗原を標的としてエクスビボで増殖させて活性化するものである。その後、活性化した細胞を体に再導入することで、対象において腫瘍に対する免疫応答を増進する。

【0224】

本明細書に含まれる開示は、ＳＤＣの存在量と、免疫療法治療に対する対象の予後及び／または対象の適性と、の新規の関連性を含む技術分野を提供する。本発明は、こうした概念の任意の適用を広範に包含する。癌の任意の特定の型または亜型を対象として、ＳＤＣの存在量の特定尺度と、特定免疫療法に対する対象の予後または適性の特性尺度と、の予測的な関連性を構築することによって、本発明の概念を実施することは、当業者の技術範囲内である。そのような予測的な関連性は、ＳＤＣの存在量の増加が、免疫療法治療に対する対象の予後の改善または適性の向上を示す現象を具体化する任意の統計学的なレジメンを包含し得る。

【0225】

１つの実施形態では、本発明は、予測的な関連性を含み、ＮＳＭマーカー遺伝子の発現量に対する、ＳＤＣマーカー遺伝子の発現量の割合が、ＮＳＭ免疫細胞の存在量に対するＳＤＣの存在量の尺度として使用され、ＳＤＣ集団の上昇が、対象が生存する可能性の増加を予測する。例えば、実施例に記載のように、１２の異なる癌型に相当する３６０２個の腫瘍試料に由来する遺伝子発現データの大きなプール（ＴＣＧＡ包括的癌（ｐａｎ−ｃａｎｃｅｒ）プロジェクトに由来するデータ）を解析し、それぞれの腫瘍試料を対象として、関連する対象生存率データが利用可能であった。それぞれの試料を対象として、表ＡのＳＤＣマーカー遺伝子のすべての観測平均発現レベル（正規化されたデータセットにおける相対強度単位で測定）を計算し、ＳＤＣ樹状免疫細胞の存在量の尺度とした。同様に、それぞれの試料を対象として、表ＡのＮＳＭマーカー遺伝子のすべての観測平均発現レベルを計算し、ＮＳＭ免疫細胞の存在量の尺度とした。その後、それぞれの試料を対象として、ＮＳＭ細胞の存在量シグナルに対するＳＤＣの割合を計算し、対数変換してから、Ｚスコアをデータセット全体にわたって、中央値が０、標準偏差が１となるように正規化した。それぞれの癌型を対象として、ＮＳＭ遺伝子マーカーに対するＳＤＣの遺伝子発現割合の中央値を計算した。それぞれの癌型を対象として、試料のプールを、ＮＳＭに対する「高」ＳＤＣ割合、またはＮＳＭに対する「低」ＳＤＣ割合へと分割し、高プールは、同様試料（癌型に基づいて適合したもの）の全集団を対象とした中央値を超える標準化割合を有する試料をすべて含み、低プールは、中央値を下回る標準化割合を有する試料をすべて含むものとした。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して、全生存率とＳＤＣ／ＮＳＭの特性比とを二値変数としてそれらの関連性を評価した（癌当たりで、中央値を隔てて分割）。図に示すように、データは、低プールと比較して高プールにおいて、全生存率が実質的に増加していることを明確に示している。

【0226】

したがって、試料におけるＮＳＭ遺伝子発現量に対するＳＤＣマーカー遺伝子発現量の割合は、試料を得た対象の全生存期間を予測するものであり、割合の上昇が、全生存率の増加を示す。この場合、割合の「上昇」は、割合がその癌型を対象とする割合の中央値を超えることとして定義される。したがって、１つの実施形態では、本発明は、対象の全生存期間の増加（ＳＤＣ／ＮＳＭの低特性比を有する対象との比較）の予測方法を含み、当該方法は、（１）対象に由来する腫瘍試料におけるＮＳＭ遺伝子の平均発現量に対するＳＤＣマーカー遺伝子の平均発現量の割合を対数変換し、ｚスコアとする計算と、その後に実施する比較であって、腫瘍試料の癌型を対象とする、ＮＳＭ遺伝子の発現量に対するＳＤＣマーカー遺伝子の発現量の割合の中央値に相当する閾値と、対象で観測された割合との比較と、によるものであり、試料の割合値が、閾値を超える場合、全生存期間の平均と比較して全生存期間が長いことを示す。

【0227】

本明細書に示されるＳＤＣ存在量の計算方法の例は、例示であり、さまざまな方法で改変してよいと理解されることになる。例えば、表Ａの遺伝子サブセットを使用してよい。例えば、１つの実施形態では、ＳＤＣマーカーであるＢＤＣＡ３、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、及びＣＬＥＣ９Ａ、ならびにＮＳＭマーカーであるＭＲＣ１、ＭＳ４Ａ７、Ｃ１ＱＣ、ＡＰＯＥ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、及びＣ５ＡＲ１が使用される。同様に、遺伝子発現割合の計算に利用する特定の数学的な演算を変更してよく、例えば、平均値を対数変換するよりもむしろ、対数変換された値を合計してから平均化するといったこと等を実施してよい。特定の方法論が、試料におけるＮＳＭマーカー遺伝子の発現レベルに対するＳＤＣマーカー遺伝子の発現レベルの割合の代表である限り、割合の計算に利用する数学的な演算の正確な性質及び順序は、本質的な要素ではない。

【0228】

代替の実施形態では、ＮＳＭの存在量は、全生存腫瘍細胞当たりのＮＳＭ細胞数、全腫瘍免疫細胞当たりのＮＳＭ細胞数、腫瘍試料の単位体積当たりのＮＳＭ細胞数、または腫瘍試料の単位質量（例えば、ｍｇ）当たりのＮＳＭ細胞数として測定してよい。同様に、ＳＤＣの存在量は、全生存腫瘍細胞当たりのＳＤＣ細胞数、全腫瘍免疫細胞当たりのＳＤＣ細胞数、腫瘍試料の単位体積当たりのＳＤＣ細胞数、または腫瘍試料の単位質量（例えば、ｍｇ）当たりのＳＤＣ細胞数として測定してよい。

【0229】

試料における全骨髄系細胞は、試料における全ＣＤ１１ｂ＋細胞として評価してよい。試料における全骨髄系細胞は、ＣＤ１４を発現する全細胞に、ＣＤ１６を発現する全細胞と、ＨＬＡを発現する全細胞とを加えたものとして定義してよい。

【0230】

１つの実施形態では、ＳＤＣ細胞の存在量は、試料におけるＳＤＣマーカーを発現するＨＬＡ−ＤＲ陽性骨髄系細胞の割合として、フローサイトメトリー法によって評価される。ＳＤＣマーカーは、例えば、ＢＤＣＡ３またはＸＣＲ１またはＣｌｅｃ９ａであってよい。

【0231】

本開示の発明者らは、ＣＤ１４を発現する（ＣＤ１４＋）マクロファージ及び単球の存在量は、非刺激性細胞の存在量の尺度として使用し得るか、または癌予後のより正確な予測もしくは治療効力のより正確な評価を目的として対象プールの分類に使用し得ることを有利に発見した。ＣＤ１４＋マクロファージは、刺激性樹状細胞と競合し得、したがって、骨髄系プールにおけるＳＤＣ細胞に対するＣＤ１４＋細胞のバランスは、癌予後の決定に重要であり得る。ＣＤ１４＋細胞の割合は、ＳＤＣの存在量の効果を調節し得る。１つの実施態様では、ＮＳＭの存在量の代替尺度は、試料におけるＣＤ１４＋骨髄系細胞の存在量として定義される。１つの実施形態では、ＣＤ１４＋骨髄系細胞の存在量は、全ＣＤ１１ｂ＋骨髄系細胞に占めるＣＤ１４の発現割合として測定される。別の実施形態では、ＣＤ１４を発現するＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の割合が、ＣＤ１４＋細胞の存在量の尺度として使用される。別の実施形態では、ＣＤ１４＋骨髄系細胞の存在量は、ＣＤ４５を発現する全免疫細胞に占める割合として測定される。別の実施形態では、ＣＤ１４＋骨髄系細胞の存在量は、試料組織のグラム当たりのＣＤ１４＋細胞数または同様の尺度として測定される。

【0232】

本発明の１つの実施態様では、ＳＤＣの存在量は、ＨＬＡ−ＤＲ＋を発現すると共に、例えば、ＢＤＣＡ３またはＸＣＲ１といったＳＤＣマーカーも発現する骨髄系細胞の割合として測定される。１つの実施形態では、予後指標、治療効力の指標、特定治療に対する対象の適性の指標として測定されるＳＤＣの存在量が利用され、ＳＤＣ存在量の上昇が、好ましい予後、治療に対する好ましい応答、または特定治療に対して適性を有している可能性の増加を示し、ＳＤＣ存在量の低下が、予後不良、治療の無効性、または特定治療に対して適性を有している可能性の低下を示す。例えば、ＳＤＣ（例えば、ＢＤＣＡ３＋細胞）の存在量が、ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の１〜４％、１〜２％、１％、２％、３％、４％、５％、もしくは１．３７％、またはそれより大きいことは、ＳＤＣの存在量の上昇であると考えてよい。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞のＳＤＣ細胞含量が１〜５％、１〜４％、１〜２％、１％、２％、３％、４％、５％、もしくは１．３７％であるか、またはそれより大きい腫瘍を有する対象は、抗ＰＤ１などの免疫療法治療に対して陽性応答する可能性が５０％を超え、例えば、陽性応答する可能性が、８５％を超える。

【0233】

１つの実施形態では、評価される治療は、免疫賦活治療または免疫療法治療である。例えば、治療は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を標的とする治療を含んでよい。例えば、抗ＰＤ１治療には、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（商標））、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標））が含まれる。別の類似の治療は、例えば、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））を使用したＣＴＬＡ−４の標的化である。１つの実施形態では、対象が抗ＰＤ１治療に対して応答することになる可能性は、対象の腫瘍におけるＳＤＣ細胞の存在量を測定することによって評価され、例えば、腫瘍において、ＳＤＣ細胞の存在量は、ＳＤＣマーカー（例えば、ＢＤＣＡ３）を発現するＨＬＡ−ＤＲ＋骨髄系細胞の割合として評価され、ＳＤＣ細胞の存在量の上昇は、対象の抗ＰＤ１治療に対する応答が良好となることを示し、ＳＤＣ細胞の存在量の低下は、対象の抗ＰＤ１治療に対する応答が不良となることを示す。１つの実施例では、腫瘍試料において、ＳＤＣ細胞の存在量の上昇は、ＨＬＡ−ＤＲ＋骨髄系細胞が４％以上であることとして定義され、ＳＤＣ細胞の存在量の低下は、ＨＬＡ−ＤＲ＋骨髄系細胞が４％未満であることとして定義される。１つの実施形態では、対象は、メラノーマを有した対象である。上記の方法論は、抗ＰＤ１治療の効力評価に同様に利用してよく、治療後にＳＤＣ細胞の存在量の増加が観測されれば、治療が有効であることを示す。同様に、ＰＤ１の推定阻害物質は、ＳＤＣ細胞の存在量を増加させる物質として同定してよく、ＳＤＣ細胞の存在量は、例えば、ＢＤＣＡ３＋細胞であるＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の割合として測定される。

【0234】

１つの実施形態では、本発明は、ＳＤＣの存在量を増進する組成物（または他の型の治療様式）の同定を目的とする選別方法を含む。例えば、腫瘍を有する動物を、ＳＤＣの存在量を増進する推定増進剤に曝露してよく、その後、本発明のツール及び方法を使用して、ＳＤＣの存在量を評価してよく、例えば、非治療対照または治療前の同一対象に由来する試料と比較して、ＳＤＣの存在量が増進することが、治療がＳＤＣの存在量を有効に増進するものであることを示す。そのようなＳＤＣ存在量は、ＳＤＣ存在量の任意の尺度を含んでよく、当該尺度には、例えば、ＮＳＭ細胞に対するＳＤＣの割合、またはその間接的な測定といった、ＳＤＣの相対的及び絶対的な尺度が含まれる。

【0235】

キット及び製造物品
本出願は、本明細書に記載の抗体組成物のいずれか１つまたは複数を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、二次抗体、免疫組織化学分析用の試薬、医薬的に許容可能な添加剤、及び説明書、ならびにそれらの任意の組み合わせのいずれかから選択される構成要素をさらに含む。１つの特定の実施形態では、キットは、１つまたは複数の医薬的に許容可能な添加剤と共に、本明細書に記載の抗体組成物のいずれか１つまたは複数を含む医薬組成物を含む。

【0236】

１つの態様では、キットは、試薬、生体材料、ならびにＳＤＣ及びＮＳＭ細胞の測定を容易化するための他の構成要素から構成することができる。例えば、１つの実施形態では、キットは、抗体を含むことができ、当該抗体には、試料中のＳＤＣ及び／またはＮＳＭ細胞の定量を目的とするＦＡＣＳまたは他の細胞選別もしくはフローサイトメトリーの方法論を容易化するための、骨髄系細胞、一般的な樹状細胞マーカー、ＳＤＣ細胞マーカー、及びＮＳＭ細胞マーカーを標的とする、蛍光標識された抗体が含まれる。例えば、ＳＤＣ及びＮＳＭの画分のＦＡＣＳでの単離を容易化するために、マウスのＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、Ｌｙ６Ｃ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ２４、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ１０３を標的とする、異なる標識を有する抗体を含むキットを使用してよく、一方では、ヒトのＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＢＤＣＡ１、及びＢＤＣＡ３を標的とする、異なる標識を有する抗体を含むキットを使用してよい。

【0237】

別の実施形態では、１つもしくは複数のＳＤＣ遺伝子マーカー、または１つもしくは複数のＮＳＭ遺伝子マーカーの増幅を目的として、ＰＣＲプライマーのセットをキットに含めることができる。１つの実施形態では、ＰＣＲプライマーのキットは、表Ａに記載のＳＤＣマーカーのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはすべて、及び表Ａに記載のＮＳＭマーカーのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以上を特異的に増幅する能力を有するプライマーのセットを含む。別の実施形態では、ＰＣＲプライマーのキットは、ＢＤＣＡ３、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＭＲＣ１、ＭＳ４Ａ７、Ｃ１ＱＣ、ＡＰＯＥ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、及びＣ５ＡＲ１を特異的に増幅する能力を有するプライマーのセットを含む。

【0238】

キットは、ＳＤＣもしくはＮＳＭの転写物またはｃＤＮＡへの結合及び／またはその標識化を目的とするＳＤＣまたはＮＳＭの遺伝子マーカーの部分配列を含む２つ以上のプローブを含むことができる。別の実施形態では、キットは、固定化プローブをその上に有するマイクロアレイまたは他の固体基板を含み、当該固定化プローブは、腫瘍浸潤性のＳＤＣもしくはＮＳＭの転写産物またはそこから得られるｃＤＮＡへの結合及びその定量を目的とする１つまたは複数のＳＤＣまたはＮＳＭのマーカー遺伝子配列を含む。１つの実施形態では、アレイは、表Ａに記載のＳＤＣマーカーのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくはすべて、及び／または表Ａに記載のＮＳＭマーカーのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０以上に対応するプローブのセットを含む。別の実施形態では、アレイは、ＢＤＣＡ３、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＭＲＣ１、ＭＳ４Ａ７、Ｃ１ＱＣ、ＡＰＯＥ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、及びＣ５ＡＲ１に対応するプローブのセットを含む。

【0239】

キットは、試料におけるＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、及びＣＬＥＣ９Ａの遺伝子配列を特異的に増幅する能力を有するＰＣＲプライマーのセットを含むことができる。キットは、試料におけるＣ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、及びＴＬＲ７の遺伝子配列を特異的に増幅する能力を有するＰＣＲプライマーのセットを含むことができる。キットは、試料におけるＭＲＣ１、ＭＳ４Ａ７、Ｃ１ＱＣ、ＡＰＯＥ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、及びＣ５ＡＲ１の遺伝子配列を特異的に増幅する能力を有するＰＣＲプライマーのセットを含むことができる。オリゴヌクレオチドアレイは、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＢＤＣ３Ａ、ＸＲＣ１、及びＣＬＥＣ９Ａの遺伝子配列に結合する能力を有する固定化プローブを含むことができる。オリゴヌクレオチドアレイは、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ２、及びＴＬＲ７の遺伝子配列に結合する能力を有する固定化プローブを含むことができる。オリゴヌクレオチドアレイは、ＭＲＣ１、ＭＳ４Ａ７、Ｃ１ＱＣ、ＡＰＯＥ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、及びＣ５ＡＲ１の遺伝子配列に結合する能力を有する固定化プローブを含むことができる。

【0240】

本出願は、本明細書に記載の抗体組成物またはキットのいずれか１つを含む製造物品も提供する。製造物品の例には、バイアル（密封バイアルを含む）が含まれる。

【実施例】

【0241】

下記は、本発明の実施を目的とする特定の実施形態の例である。実施例は、例示のみを目的として提供され、いかなる様式においても本発明の範囲を限定する意図はない。使用する数（例えば、量、温度等）に関する正確性確保のための努力はなされているが、当然のことながら、幾許かの実験的な誤差及び逸脱は許容されるべきである。

【0242】

本発明の実施の際は、別段の記載がない限り、当該技術分野の技術に属するタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ手法、及び薬理学の従来方法を用いることになる。そのような手法は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３^ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。

【0243】

実施例１：実施例１〜９の材料及び方法
マウスの腫瘍

【0244】

ＰｙＭＴ−ＣｈＯＶＡ遺伝子導入Ｃ５７ＢＬ／６ファウンダーマウスについては、説明した通りであり（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、子孫を、ＰｙＭＴ−ＣｈＯＶＡ導入遺伝子を対象としてＰＣＲによって選別してから癌を監視し、２０〜３０週齢の時点で使用した。Ｂ７８ＣｈＯＶＡは、Ｂ７８の変異体であり（Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、これを発生させて、補足の方法に記載のように使用した。追加の系統に関する情報はすべて、補足の方法において見つけることができる。マウスはすべて、ＳＰＦ条件下で維持し、ＮＩＨ及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの基準に準拠して処理し、ＵＣＳＦの管理規制に従った。

【0245】

フローサイトメトリー

【0246】

抗体はすべて、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＣＳＦ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｏｒｅから購入するか、またはＫｒｕｍｍｅｌ Ｌａｂにおいて産生させた。表面染色については、細胞を抗Ｆｃ受容体抗体（クローン２．４Ｇ２）と共にインキュベートし、２％のＦＣＳを添加したＰＢＳ中で、抗体を使用して氷上で細胞を３０分間染色した。生存率は、固定化可能なＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｚｏｍｂｉｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＤＡＰＩで染色することによって評価した。細胞内染色については、マウスに対して１０ｕｇ／体重ｇとなるようにＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（Ｃａｙｍａｎ）を注射してから６時間後に細胞を収集し、表面マーカーに対する抗体で染色してから、２５℃で１０分間、２％のＰＦＡで固定化し、０．２％のサポニンで透過処理を実施した後、標的抗体で染色した。フローサイトメトリーはすべて、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで実施した。フローサイトメトリーのデータ解析は、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して実施した。細胞選別は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを使用して実施した。

【0247】

ＴＣＧＡバイオインフォマティクス解析

【0248】

臨床的な発現解析は、１２の癌型に相当する３６０２人の患者の腫瘍試料（乳癌が８４５個、卵巣癌が２６５個、頭頸部扁平上皮癌が３０３個、膀胱癌が１２２個、神経膠芽腫が１６８個、結腸癌が１９０個、ＡＭＬが１７３個、直腸癌が７２、肺腺癌が３５５個、肺扁平上皮が２５９個、腎癌が４８０個、及び子宮癌が３７０個）に由来する全ゲノムにわたるｍＲＮＡレベル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｍＲＮＡ配列解析）を使用するものであり、当該ｍＲＮＡレベルは、ＴＣＧＡ ＰａｎＣａｎｃｅｒの作業部会によって単一のデータセットへと正規化及び統合されたものであり、公開されている通りである（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｈｏａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４）（データは、ＴＣＧＡ Ｄａｔａ Ｐｏｒｔａｌのhttps://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/に存在し、ｓｙｎ１７１５７５５として、https://www.synapse.org/で利用可能である）。ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の特性比は、ＣＤ１０３^＋ＤＣ遺伝子の平均発現量を、ＣＤ１０３⁻ＤＣ遺伝子の平均発現量で割ったものの対数として計算し、その後、標準化（平均値＝０、標準偏差＝１、図８Ｃの遺伝子一覧）してｚスコアとする。出願人は、ＣＤ８／ＣＤ６８の発現比（ＤｅＮａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）と併せて、Ｔ細胞（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）、増殖（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ＣＳＲ／損傷（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）、及びガンマインターフェロン（Ｖｉｉｇｉｍａａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）の公開されている特性についても、公開されているように評価した。全生存率のデータは、ＴＣＧＡのポータルから取得し（２０１３年６月にダウンロード）（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、生存率解析は、Ｃｏｘ比例ハザードモデリングを使用し、癌型を適合させて多変量モデルで実施した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（Ｂｅｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，１９９５）を使用して多重比較を適合した後、対数順位のｐ値を使用して有意性を評価した。Ｒの生存率パッケージ（Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｃｋａｇｅ）を使用して、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを作成した。ＫＭプロットの全データにおいて（図８Ｅ）、出願人は、その腫瘍型が有するＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻の特性比の中央値を使用して、それぞれの試料を「高」または「低」として分類することによって、癌型を「適合」させた。

【0249】

マウスの系統情報

【0250】

ＯＴ−Ｉマウスは、Ｈ−２Ｋｂと関連する卵白アルブミンペプチドであるＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＬ８）に対して特異的であり（Ｈｏｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、当該マウスをＣＤ４５．１，Ｎｕｒ７７−ｅＧＦＰマウス（Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、及びＣｄ２−ＲＦＰマウス（Ｖｅｉｇａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）、またはアクチン−ＣＦＰマウス（Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）と交配させることで、養子移入、イメージング、及び活性化の実験を目的として、ゲノム的にコードされており、蛍光的または類遺伝子的に標識されたＴ細胞を産生させた。

【0251】

腫瘍における骨髄系細胞集団の調節については、下記のマウス系統を使用した。Ｃ５７ＢＬ／６は、Ｓｉｍｏｎｓｅｎから購入した。Ｉｒｆ４^ｆ／ｆｘＣＤ１１ｃ−Ｃｒｅ（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６），（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣｈｉｃａｇｏのＡｎｎｅ Ｓｐｅｒｌｉｎｇの好意により出願人に供与された。Ｉｒｆ８^−／−ＦＶＢＮ（Ｏｕｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）は、ＵＣＳＦのＳｃｏｔｔ Ｋｏｇａｎの好意により出願人に供与された。Ｚｂｔｂ４６−ＤＴＲ（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、Ｃｓｆ２ｒｂ^−／−（Ｒｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、及びＣｓｆ３ｒ^−／−（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

【0252】

腫瘍内のＡＰＣの可視化については、ＰｙＭＴ−ＣｈＯＶＡ遺伝子導入マウスをＣｘ_３ｃｒ１−ｅＧＦＰ（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００）、及びＣｄ１１ｃ−ｍＣｈｅｒｒｙマウス（Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）と交配させることで得られた、両導入遺伝子を有するＦ１子孫をイメージング実験に使用した。

【0253】

細胞株、細胞培養、プラスミド、遺伝子導入

【0254】

下記の腫瘍細胞株を標準的な条件下で培養してからマウスへと注射した。Ｂ１６−Ｆ１０（Ｆｉｄｌｅｒ，１９７５）、Ｂ１６−ＧＭＣＳＦ（Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、Ｂ１６−ＦＬＴ３Ｌ（Ｃｕｒｒａｎ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，２００９）は、Ｌａｒｒｙ Ｆｏｎｇの好意により供与された。Ｂ７８−親（Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。Ｂ７８ｃｈＯＶＡは、親であるＢ７８に対して、標準的な方法を使用して、ＰｙＭＴＣｈＯＶＡ（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ）において使用したものと同一のＣｈ−ＯＶＡ融合構築物を遺伝子導入した。ＥＬ４（Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７２）、ＥＧ７（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ＥＧ７−ｃｈＯＶＡ、Ｖｏ−ＰｙＭＴ−ルシフェラーゼ−ＦＶＢは、ＵＣＳＦのＺｅｎａ Ｗｅｒｂの好意により出願人に供与され（Ｈａｌｐｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＬＬＣは、ＵＣＳＦのＬｅｗｉｓ Ｌａｎｉｅｒの好意により出願人に供与された（Ｂｅｒｔｒａｍ ａｎｄ Ｊａｎｉｋ，１９８０）。Ｂ７８ｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｐＨｌｏｕｒｉｎは、製造者の説明書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、Ｂ７８−親の細胞に対してＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｐＨｌｏｕｒｉｎ構築物を遺伝子導入することによって生成させた（Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0255】

簡潔に記載すると、接着細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン含み、１０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で、３７℃／５％ＣＯ２の条件を使用して組織培養処理済プラスチックプレートで培養し、２日に１回分割継代した。浮遊細胞は、１０％のＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを添加したＲＰＭＩ−１６４０中で、フラスコで培養し、２日に１回分割継代した。

【0256】

異所性腫瘍の注射

【0257】

腫瘍細胞株を収集し、ＰＢＳで３回洗浄した後、成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：１の比で混合し、最終注射体積を５０ｕｌとした。１００，０００個の腫瘍細胞（別段の記載がない限り）を剪毛したマウス右側腹部に皮下注射し、そのまま１４〜２１日増殖させてから使用した。

【0258】

腫瘍の消化

【0259】

ＰｙＭＴ−ｃｈＯＶＡ腫瘍及び異所性Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍をマウスから切除し、取り出した腫瘍組織の総重量を決定した。その後、メスを使用して腫瘍を細断してから、撹拌棒を入れた２５ｍｌの三角フラスコに入れ、腫瘍重量０．３グラム当たり５００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、及び２００ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、５％のＣＯ２雰囲気下にある３７℃のインキュベーター内の撹拌プレート上に当該三角フラスコを置いて間隔を３０分として３回消化した。各３０分の間隔の後、腫瘍を７０ｕｍの細胞ストレーナーに通して未消化の腫瘍の大きな断片を除去してから、残っている塊を再度消化に供し、その間、単離した単一細胞は氷上で保持した。その後、ＣＤ４５−ビオチン磁気陽性選択（ＳｔｅｍＳｅｐ）を４℃で実施することで全腫瘍免疫浸潤物を濃縮した。

【0260】

ヒト試料

【0261】

組織を外科用のハサミでしっかりと細断してから、磁気撹拌棒を入れた２５ｍＬの三角フラスコへと移し、０．３ｇの組織当たり３ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ）、及び５０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、３７℃／５％ＣＯ２の条件で、一定に撹拌しながら１時間処理した。その後、試料を７０ｕｍのフィルターに通して濾過してから遠心沈降し、染色に向けて再懸濁した（Ｒｕｆｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ヒト試料のすべてについて、対象のすべてからインフォームドコンセントを得ており、ＩＲＢの認可（ＩＲＢ番号１３−１２２４６、１２／０６／２０１３〜１２／０５／２０１４）に従って研究を実施した。

【0262】

細胞の単離

【0263】

ＯＴ−ＩナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を６〜１２週齢のマウスのリンパ節及び脾臓から単離した。製造者の説明書に従って、陰性ＣＤ８単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して選択を実施した。ＢＭＤＣは、骨髄細胞を１〜２ｘ１０＾６個細胞／ｍｌとしてプレートに播種し、１０％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ中でＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）と共に８〜１１日間培養することによって生成させた。培養の最後の２日間はＩＬ−４を添加し、使用の１２時間前にＬＰＳを添加することで、ＢＭＤＣを完全に成熟させた。

【0264】

ｅＦｌｏｕｒ６７０によるＴ細胞の標識化

【0265】

ＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞をＦＣＳ非含有ＲＰＭＩ中で２ｕＭのｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。その後、２ｍｌのＦＣＳを使用してｅＦｌｕｏｒ６７０による標識処理を停止し、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩで、使用前に３回洗浄した。

【0266】

Ｔ細胞のバルク活性化（ＣＴＬの生成）

【0267】

１００ｎｇ／ｍｌのＳＬ８ペプチドでパルス処理したＢ６脾細胞で、ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ遺伝子導入リンパ節細胞を３０分間刺激した後、３回洗浄した。刺激後の２日間、及び刺激の４日後に再び、細胞を２Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２の存在下で増殖させ、２〜３日後に実験に使用した。

【0268】

Ｔ細胞増殖アッセイ

【0269】

ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ遺伝子導入マウスからリンパ節細胞を単離し、ＳｔｅｍＳｅｐ ＣＤ８濃縮（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を濃縮し、または及び／またはＣＴＬのバルク活性化培養物を使用した。ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ遺伝子導入マウスからリンパ節細胞を単離し、ＳｔｅｍＳｅｐ ＣＤ４濃色（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を濃縮した。２ｕＭのｅＦｌｕｏｒ６７０で標識済である濃縮した２０，０００個のナイーブＣＤ８細胞または５日前に予め活性化したＯＴ−Ｉ Ｔ細胞またはナイーブＣＤ４細胞と、２５ｎｇ／ｍｌのＳＬ８ペプチド（ＯＴ−Ｉ）もしくは１ｕｇ／ｍｌのｐＯＶＡ３２３〜３３９ペプチド（ＯＴ−ＩＩ）の存在下もしくは非存在下でパルス処理した４，０００個のＢＭＤＣ、またはパルス処理なしの４，０００個の腫瘍ＡＰＣ（別段の記載がないかぎり）のいずれかと、を９６ウェルのＶ底プレートにおいて混合し、１２時間、４８時間、または７２時間のいずれかの時間、３７℃／５％ＣＯ２の条件でインキュベートし、それらの時点での活性化を、フローサイトメトリーを介して、ＣＤ６９／Ｎｕｒ７７の増加及びｅｆｌｕｏｒ６７０の希釈によって測定した。

【0270】

対形成アッセイ

【0271】

対形成アッセイは、説明の通り実施した（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。簡潔に記載すると、標識したＴ細胞と、３０分〜１時間消化した腫瘍消化物に由来する染色した単一細胞浮遊液と、を混合した後、フローサイトメトリーに向けて２％のＰＦＡで固定化した。対形成の割合は、Ｔ細胞の総数に対するＴ細胞との対の数として計算した。

【0272】

インビボでの多光子顕微鏡イメージング及び手術

【0273】

動物は、イソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）を使用して、温めた顕微鏡ステージ上で麻酔下に保ち、施設のガイドラインに従って、定期間隔で麻酔の深度を監視した。手術前に、１００ｕｇのＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅを含むＰＢＳを動物に静脈内注射すると共に、１ｍｌの乳酸リンゲル液を腹腔内注射した。乳腺を外科的に露出させ、出願人が以前に説明した吸引窓（ｓｕｃｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）の改変型を介しての腫瘍を撮像した。生体内イメージングは、２つの赤外レーザーを備えた特注の２光子装置（ＭａｉＴａｉ：Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ：Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を使用して実施した。ＭａｉＴａｉレーザーは、ＣＦＰ及びＧＦＰの同時励起、またはＧＦＰの単独励起を目的として、それぞれ８７０ｎｍまたは９１０ｎｍに調整した。Ｃｈａｍｅｌｅｏｎレーザーは、ｍＣｈｅｒｒｙの励起を目的として、１０３０ｎｍに調整した。発光は、６色検出器アレイ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｈ９４３３ＭＯＤ検出器を利用した特注）に連結された２５ｘ１．２ＮＡの水レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して検出し、交互レーザー励起を使用することで、１２の検出チャネルを得た。励起フィルターは、青紫色４１７／５０、青色４７５／２３、緑色５１０／４２、黄色５４２／２７、赤色６０７／７０、遠赤色６７５／６７を使用した。顕微鏡は、ＭｉｃｒｏＭａｎａｇｅｒソフトウェアスイートによって制御し、ｚ−スタック（ｚ−ｓｔａｃｋ）画像は、４倍平均化及び３ｕＭのｚ−深度（ｚ−ｄｅｐｔｈ）で取得した。データ解析は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアスイート（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使用して実施した。

【0274】

エクスビボでの腫瘍切片の染色及び多光子イメージング

【0275】

動物を安楽死させ、腫瘍を収集した。妨げとなる脂肪を除去し、腫瘍を２％の低融点アガロースを含むＰＢＳに包埋した（ＳｅａＰｌａｑｕｅ，Ｌｏｎｚａ）。Ｃｏｍｐｒｅｓｓｔｏｍｅ ＶＦ−２００，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎａｒｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．の組織スライサーを使用して、厚さ３００μＭの切片を調製した。Ｖｅｔｂｏｎｄ（３Ｍ）を使用して、切片をプラスチックのカバーガラスに付着させ、３７℃／５％ＣＯ２の条件で、５％のラット血清を添加したＲＰＭＩにおいて、Ａｌｅｘａ６４７で標識されたラット抗ＣＤ１１ｂ抗体で２時間染色した。切片は、ＲＰＭＩ中で洗浄し、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡を使用して撮像した。

【0276】

ＲＮＡ抽出、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、及びＲＮＡ配列解析

【0277】

４，０００〜２０，０００個の細胞を選別し、３００ｕｌのＴｒｉｚｏｌ ＬＳへと直接添加して急速冷凍し、迅速に−８０℃として抽出まで保管した。ＲＮＡは、フェノール−クロロホルム法によって抽出し、エタノール沈殿を実施した。その後、試料をＤＮａｓｅＩで処理し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ナノリットルのｑＰＣＲ Ｆｌｕｉｄｉｇｍ解析については、２倍濃度のＴａｑｍａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した標的特異的な増幅を介して、ｃＤＮＡを予め増幅（１２サイクル）した後、エキソヌクレアーゼＩで処理することで、組み込まれていないプライマーを除去した。その後、試料及びプライマー（標的プライマーは、Ｈａｒｖａｒｄプライマーバンク：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/を使用して設計した）を、２倍濃度のＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共に４８．４８ Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙへと負荷し、ＢｉｏＭａｒｋ ＨＤにかけた。ＲＮＡ配列解析については、Ａｒｃｔｕｒｕｓ Ｐｉｃｏｐｕｒｅ ＲＮＡ単離キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して試料を抽出し、生物学的に分析し、ＵＣＳＦ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅに提出した。ライブラリーは、Ｎｕｇｅｎ Ｏｖａｔｉｏｎキットを使用して調製し、その後にＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００機器で配列決定した。シングルエンドである、５０塩基対のリードを生成させることで、約４億５００万のリードを得、平均深度（ｄｅｐｔｈ）は、３３７０万リード／試料であった。リードをマウスゲノム（ＵＳＣＳ ｍｍ１０）に対してアライメントし、既知のｍＲＮＡに特異的に位置づけされたものを発現差異の評価に使用した。発現差異の解析及び評価については、Ｔｏｐｈａｔ（Ｔｒａｐｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００９）を使用してアライメントを実施すると共に、ＤＥＳｅｑ（Ａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｕｂｅｒ，２０１０）を使用して発現差異の解析を行った。

【0278】

腫瘍の増殖

【0279】

腫瘍の増殖曲線については、記載の期間にわたって、腫瘍の幅（ｗｉｄｔｈ）ｘ腫瘍の高さ（ｈｅｉｇｈｔ）としてノギスで腫瘍面積（ｍｍ^２）を測定した。

【0280】

ジフテリア毒素、ＦＴＹ−７２０、及び抗ＣＳＦ−１での処理

【0281】

ジフテリア毒素（Ｄ．Ｔ．）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。一過性のＤ．Ｔ．による除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）については、体重グラム当たり２０ｎｇのＤ．Ｔ．をＤＴＲマウスの腹腔内に注射し、Ｄ．Ｔ．注射の２４時間後に、分析に向けてマウスを安楽死させた。長期間の除去については、マウスに対して最初に２０ｎｇ／グラムのＤＴを腹腔内注射した後、その後は４ｎｇ／グラムで実施する３日に１回の投与を維持した。

【0282】

ＦＴＹ７２０は、Ｃａｙｍａｎから購入し、生理食塩水において再構成して１ｍｇ／ｍｌの一定分量として−２０Ｃで保管した。生理食塩水中の最終濃度が１００ｕｇ／ｍｌである２００ｕｌのＦＴＹを、記載の期間にわたって２日に１回腹腔内注射した。

【0283】

中和抗ＣＳＦ−１抗体、クローン５Ａ１、及びアイソタイプラットＩｇＧ２ａは、ＵＣＳＦ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｅから購入し、精製した。動物は、腹腔内注射によって１ｍｇの抗体で最初に処理し、３日後に解析した。期間にわたって枯渇を維持するため、その後は５日に１回、０．５ｍｇ用量をマウスに続けて腹腔内注射した。

【0284】

ＧＭＰ前駆細胞の調製及び養子移入

【0285】

すべての骨（大腿骨、脛骨、上腕骨、尺骨、橈骨、及び骨盤を含む）を収集し、選別緩衝液（２％のＦＣＳを添加したＰＢＳ）に移し、乳鉢及び乳房で粉砕し、ＨＢＳＳで繰り返し洗浄した後、７０ｕｍのフィルターに通した。その後、１７５ｍＭの塩化アンモニウムを使用して３７℃で５分間、ＲＢＣの溶解処理を実施した細胞を洗浄し、３ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１０（Ｓｉｇｍａ）の分離層（ｕｎｄｅｒｌａｙ）を使用して、密度勾配遠心分離を実施することで、生存細胞を選択すると共に、残存する骨の残骸を除去した。骨髄細胞は、ＣＤ１１７ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１１７陽性細胞を濃縮し、ＡｕｔｏＭＡＣＳで陽性のものを選択した。その後、非コンジュゲートラット抗体の系譜混合物（ＣＤ４、ＣＤ８、Ｍａｃ１、Ｇｒ−１、ＣＤ５、Ｔｅｒ１１９、及びＣＤ３）を使用して、細胞を氷上で３０分間染色した後に洗浄し、蛍光的にコンジュゲートした抗ラット二次抗体を使用して、氷上で３０分間染色した。その後、細胞を洗浄し、前駆細胞の主要混合物（ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）（Ｃｋｉｔ−ＡＰＣ−ｃｙ７、Ｓｃａ１−ＰＢ、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、及びＦＣｇＲ−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５）を使用して氷上で３０分間染色した後、洗浄してから、ＧＭＰを対象として、ＢＤ ＦＡＣｓ ＡｒｉａＩＩを使用し、生存細胞、ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１−、ＣＤ３４＋ＦｃｇＲ＋であるものを選別した。

【0286】

デキストラン取り込みアッセイ

【0287】

上記のように腫瘍を消化し、ＣＤ４５陽性で選択した後、細胞を、ウェル当たり１ｘ１０^６個で９６ウェル丸底プレートに播種し、１ｍｇ／ｍｌのＤｅｘｔｒａｎ−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（１０，０００ＭＷ）の存在下または非存在下、４℃または３７℃のいずれかで３０分間、３連でインキュベートした。プレートを５分に１回軽くたたいた。その後、プレートを３回洗浄した後、表面抗体で染色してすぐにフローサイトメトリーによって分析した。３７℃でのデキストランの取り込みの幾何平均蛍光強度から、４℃でのデキストランの結合の幾何平均蛍光強度を差し引いたものをデキストランの取り込みとして測定した。

【0288】

細胞の追跡及びイメージング解析

【0289】

データは、Ｉｍａｒｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使用して可視化及び解析した。個々のＴ細胞は、Ｉｍａｒｉｓによって同定及び追跡した。ＣＤ１１ｃ ｍｃｈｅｒｒｙ ＤＣは、ＭＡＴＬＡＢでセグメント化したものからマスク化ＤＣのイソサーフェス（ｉｓｏ−ｓｕｒｆａｃｅ）を使用して計算した。接触持続時間は、Ｉｍａｒｉｓを使用して追跡したマスク化Ｔ細胞−ＤＣ対の計算追跡持続時間によって決定した。

【0290】

抗体クローン

【0291】

マウスＡｂクローン：ＣＤ４５クローン３０−Ｆ１１、ＣＤ４５．１クローンＡ２０、ＣＤ４５．２クローン１０４、ＣＤ１１ｂクローンＭ１／７０、ＣＤ１１ｃクローンＮ４１８、ＣＤ１０３クローン２Ｅ７、ＣＤ２４クローンＭ１／６９、ＣＤ９０．２クローン３０−Ｈ１２、Ｌｙ６ＣクローンＨＫ１．４、ＭＨＣＩＩクローンＮ２２、Ｆ４／８０クローンＢＭ８、ＣＤ６９クローンＨ１．２Ｆ３、ＣＤ１３５クローンＡ２Ｆ１０、ＣＤ１１７クローン２Ｂ８、ＣＤ２６クローンＨ１９４−１１２、ＣＤ２０６クローンＣ０６８Ｃ２、ＣＤ６４クローンＸ５４−５／７．１、ＭｅｒＴＫクローンＹ３２３、ＣＤ３０１ｂクローン１１Ａ１０−Ｂ７−２は、Ａｋｉｋｏ Ｉｗａｓａｋｉの好意によるＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの出願人への供与物、ＰＤＬ２クローンＴＹ２５、ＩＲＦ４クローンＭ１７及びＩＲＦ８クローンＴ１４は、Ｒｏｇｅｒ Ｓｃｉａｍｍａｓの好意によるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏからの出願人への供与物、ＩＬ１２クローンＣ１７．８、ＣＤ８０クローン１６−１０Ａ１、ＣＤ８６クローンＧＬ１、２Ｂ４クローンｍ２Ｂ４、ならびにＰＤＬ１クローン１０Ｆ．９Ｇ２。

【0292】

ヒトＡｂクローン：ＣＤ４５クローンＨｌ３０、ＣＤ３ｅクローンＯＫＴ３、ＨＬＡＤＲクローンＬ２４３、ＣＤ５６クローンＣＭＳＳＢ、ＣＤ１９クローンＨ１Ｂ１９、ＣＤ１４クローン６１Ｄ３、ＣＤ１６クローンＣＢ１６、ＣＤ１１ｃクローン３．９、ＢＤＣＡ１クローンＬ１６１、及びＢＤＣＡ３クローンＡＤ５−１４Ｈ１２。

【0293】

統計解析

【0294】

統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。別段の特定記載がない限り、データはすべて、４回以上の別々の実験の代表である。誤差バーは、Ｐｒｉｓｍを使用して計算したＳＥＭを示し、３連の実験条件に由来するものである。特定の統計検定では、対応Ｔ検定及び独立Ｔ検定を使用し、０．０５未満であるｐ値はすべて、統計学的に有意であると見なした。

【0295】

実施例２：表面マーカーは、大量に存在するマクロファージから、希少な腫瘍性ＤＣサブセットを描出する。
腫瘍浸潤性骨髄系集団を精査するために、１１色のフローサイトメトリーパネルを考案し、蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質及び卵白アルブミンを独立して共発現する癌遺伝子が開始するように操作された自発生乳腺腫瘍モデルであるＰｙＭＴＣｈＯＶＡ（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）使用して、段階的なゲート方針を用いた。出願人は、腫瘍性ＣＤ４５^＋コンパートメントの特性を明らかにし、その多くが、貪食された腫瘍抗原を有しており、したがって、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を示している（図１Ａ）。骨髄系特異的マーカーであるＣＤ１１ｂ及び単球マーカーであるＬｙ６Ｃによってすべての造血細胞を部分ゲートすることで、好中球及び単球を排除することが可能であった（データ未掲載）。ＭＨＣＩＩ^＋細胞内で、ＤＣは、ＣＤ２４^高及びＦ４／８０^低である発現に基づいてマクロファージと区別され、そのいずれもあてはまらないか、単独であてはまれば、典型的には、この区別をする上で十分である。その後、健康な末梢組織で観測されたように、ＤＣは、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１０３の発現差異に基づいて２つの集団へと解析分類されることが明らかとなった（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。出願人は、２つのメラノーママウスモデル（Ｂ７８ＣｈＯＶＡ（ｍＣｈｅｒｒｙ及びＯＶＡを発現するＢ１６の変異体）、図１Ｂ及びＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、データ未掲載）においてこうした集団を発見し、これは、マウス種（例えば、ＦＶＢ ＰｙＭＴ、データ未掲載）、及び異所性腫瘍（ルイス肺癌、データ未掲載）にまたがるものであった。出願人は、識別及び議論を容易なものとするために、これ以後は、こうしたＤＣ集団を「ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１」及び「ＣＤ１０３^＋ＤＣ２」と称する。

【0296】

Ｆ４／８０^高ＣＤ２４^低コンパートメントを解析することで、２つの型のマクロファージが存在することも明らかとなり、これらは、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１ｂの発現差異によって同定した。ＣＤ１１ｃ^低ＣＤ１１ｂ^高細胞（ここまでは「ＴＡＭ１」）及びＣＤ１１ｃ^高ＣＤ１１ｂ^低細胞（「ＴＡＭ２」）は、同様に描出されたＭＨＣＩＩ^高集団及びＭＨＣＩＩ^低集団（Ｍｏｖａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に広くは一致するように思われる（図５ｃも参照のこと）。ＣＤ１１ｃ、さもなければ「非常に典型的な（ｐｒｏｔｏｙｐｉｃａｌ）」ＤＣマーカーは、ＤＣに最も多く存在する一方で、ＴＡＭ２では高度に発現しており、ＴＡＭ１ではそれほどでないにせよ発現していた（データ未掲載）。こうした集団は、それぞれの有病率、及びそれらが有している能力は、区別が曖昧であり、異なる程度は僅かであったものの、調べたすべてのモデルにわたって存在していた（図１Ａ〜図１Ｂ、及びデータ未掲載）。それ故に、出願人は、出願人の系譜及び機能の試験を、１つの例である自発生腫瘍モデル（ＰｙＭＴＣｈＯＶＡ）及び異所性腫瘍モデル（Ｂ７８ＣｈＯＶＡ）に適用した。これらの具体的なモデルは、別段の記載がある箇所にはあてはまらない。

【0297】

腫瘍に由来するｍＣｈｅｒｒｙの負荷量及び保持を、こうした集団のそれぞれを対象として評価した。これによって、取り込み^高細胞の存在が明らかとなり、当該細胞は、腫瘍周縁部に局在化することを出願人が以前に報告しており、その後、ＣＤ１１ｃのみによって同定したものであり（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、ＴＡＭ１及びＴＡＭ２のゲートにおいて最も多く補足された（図１ｃ及びデータ未掲載）。比較してみると、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１及びＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、ｍＣｈｅｒｒｙの取り込みまたは保持が少ない一方で、単球のいくつかでは、中程度の抗原負荷量を有しているという証拠が明らかとなったが、好中球ではこのことはほとんど見られなかった。

【0298】

ＣＤ１１ｂ^＋及びＣＤ１０３^＋のＤＣサブセットは、末梢性のマウス組織の多くにおいて見出されていると共に、それらの対応物は、末梢性のヒト組織において同定されており、それぞれＢＤＣＡ１及びＢＤＣＡ３を発現することによって定義された（Ｄｚｉｏｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｈａｎｉｆｆａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。出願人は、こうしたマーカーを使用して、ヒト転移性メラノーマ試料において、ＴＡＭ／ＤＣを同等に区別することも可能であることを発見した（図１Ｄ）。すべてのＴＡＭに相当するＣＤ１６⁻ＨＬＡＤＲ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ１４^＋細胞は、ＣＤ１６⁻ＨＬＡＤＲ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ１４⁻ＤＣ集団とは異なっており、次いで、当該ＤＣ集団をＢＤＣＡ１（「ＤＣ１」）及びＢＤＣＡ３（「ＤＣ２」）の発現差異によって解析分類した。マウスモデル（図１Ｅ）及びヒトメラノーマ生検（図１Ｆ）全般にわたって共通していることは、ＣＤ１１ｂ^＋／ＢＤＣＡ１ ＤＣ１集団、及びＣＤ１０３^＋／ＢＤＣＡ３ ＤＣ２集団が存在していると共に、それらが希薄であり、ＤＣ２に関しては特に希薄であるということである。

【0299】

実施例３：腫瘍のＤＣ及びマクロファージのタンパク質及び転写の描出。
出願人のゲーティング方針を検証するために、出願人は、ＩｍｍＧｅｎコンソーシアム（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）によって定義される抗体パネルを適用した。出願人の「ＤＣ」の割り当てと一致して、Ｂ７８ｃｈＯＶＡモデル及びＰｙＭＴｃｈＯＶＡモデルにおいて、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）、ＣＤ１１７（ｃＫｉｔ）、及びＣＤ２６を発現していた一方で、ＴＡＭの両集団はそれらを発現していなかった（図２Ａ及びデータ未掲載）。驚くべきことに、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１は、検出可能なレベルのＤＣマーカーを発現しておらず、実際は、ＣＤ２０６、ＣＤ６４、及びＭｅｒＴＫを含む「マクロファージ」マーカーのいくつかを発現しているという理由によって、ＴＡＭ１及びＴＡＭ２とはさらに分離されるものであった（図２Ｂ及びデータ未掲載）。しかしながら、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１は、ＣＤ３０１ｂ及びＰＤＬ２を僅かに発現しており、それらは両方共、皮膚において見出されるＩＲＦ４依存性の「ＤＣ_Ｔｈ２」集団を定義するために使用されてきたものである（図２Ｃ及びデータ未掲載）（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｋｕｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0300】

こうしたＡＰＣをさらに描出するために、出願人は、Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍から選別した細胞の遺伝子発現特性を、ＲＮＡ配列解析を使用して解析した。図２Ｄに示すように、遺伝子ブロックは、４つの異なる集団を明瞭に分離しており、ＰＣＡ解析（図２Ｅ）では、ＴＡＭ１、ＴＡＭ２、及びＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１が最も類似しており、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２が、最も異なっていた。最も発現が異なっていた遺伝子の中で、ＤＣ系譜を定義する転写因子であるＩｒｆ８（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００５）及びＺｂｔｂ４６（ｚＤＣ）（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２）は、それぞれＣＤ１０３^＋ＤＣ２のみに特異的であるか、または両方のＤＣに特異的であった一方で、Ｉｒｆ４は、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１において中程度に濃縮されており、これらはすべて、ＲＴ−ｑＰＣＲによって検証したものである（図２Ｆ）。このことは、ＩＲＦ４／８を対象とする細胞内フローサイトメトリーによってタンパク質レベルでも確認した（図２Ｇ及びデータ未掲載）。すべての集団がＭｙｂを発現しており、このことは、卵黄嚢から発生した組織前駆細胞に由来するものとは対照的に、造血幹細胞を起源とすることを示している（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。表面表現型及び重要転写因子の発現が特有なものであることは、ＰｙＭＴｃｈＯＶＡモデルにおいて再確認した（データ未掲載）。

【0301】

こうした腫瘍内集団は、異なる腫瘍特異的な機構を介するものであって、当該集団が通常組織のいくつかにおいて依存するような転写因子には依存しない可能性があるため、出願人は、ノックアウトマウス、または転写因子が推進するジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）マウスを使用して、Ｉｒｆ８、Ｉｒｆ４、Ｂａｔｆ３、及びｚＤＣに対する依存性を調べた。出願人は、さまざまな異所性腫瘍を利用した。この理由は、こうした対立遺伝子を組み込み、繁殖させて自発性モデルをつくる際に予測不能な変動が生じると共に、期間を要するためである。出願人は異所性ＰｙＭＴ乳腺腫瘍モデルを使用して、Ｉｒｆ８が欠失するとＣＤ１０３^＋ＤＣ２が特異的に除去されるが、ＴＡＭ１またはＴＡＭ２には影響を与えず、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１の割合は少し濃縮されることを発見し、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１の濃縮は、おそらく補償が生じた結果であると考えられる（図３Ａ）。対照的に、Ｂ７８ｃｈＯＶＡモデルにおいて、ＣＤ１１ｃ−Ｃｒｅによって推進することでＩｒｆ４を条件的に欠失させると（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１が特異的に減少し、その他は、ほとんど変化しなかった（図３Ｂ）。ＲＮＡ配列解析のデータと一致して、Ｂａｔｆ３欠損動物でもまた、Ｂ７８ｃｈＯＶＡモデルにおいて、腫瘍性ＣＤ１０３^＋ＤＣ２集団が欠乏しており、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１集団、ＴＡＭ１集団、またはＴＡＭ２集団に対する影響はなかった（図３Ｃ）。最終的に、ｚＤＣ推進型ＤＴＲ対立遺伝子を使用したとき、Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍において、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２が特異的かつ有意に減少し、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１集団またはＴＡＭ１／ＴＡＭ２集団はほとんど変化しないか、または全く変化しないことを出願人は発見し（図３Ｄ）、このことは幾分か予想外であった。このことは、ＤＴＲ対立遺伝子の予測不能な変動を示し得るか、またはｚＤＣ発現の僅かではあるが有意な変動を示し得るものである。まとめると、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１及び腫瘍において非常に多く存在するＴＡＭ１／ＴＡＭ２と比較して、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、異なる系譜のＡＰＣに相当するものであると出願人は結論づける。

【0302】

実施例４：ＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、異なるサイトカインによってプログラムされる。
ＡＰＣは、骨髄（ＢＭ）前駆細胞に由来すると共に、それがＤＣ／マクロファージのサブセットへと分化することは、特定のサイトカインに依存している。こうした集団への分化を推進するサイトカインを決定するために、出願人は、ｑＰＣＲによって、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）受容体の発現を、モデルを横断して調べた。ＴＡＭ１、ＴＡＭ２、及びＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１においては、Ｃｓｆ１ｒ（Ｍ−ＣＳＦＲ）が排他的に見出された一方で、ＤＣ１サブセット及びＤＣ２サブセットにおいては、Ｃｓｆ２ｒｂ（ＧＭ−ＣＳＦＲ）が特異的に発現しており、Ｃｓｆ３ｒ（Ｇ−ＣＳＦ）は、すべてにおいて存在しなかった（図４Ａ）。中和抗体での処理または異所性腫瘍を有するサイトカイン受容体欠損マウスのいずれかを使用して、出願人は、腫瘍におけるＡＰＣのＣＳＦサイトカインに対する依存性を機能的に試験した。

【0303】

ＴＡＭ１細胞及びＴＡＭ２細胞は、以前に示されたように（Ｗｙｃｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００４）、それらを維持するためにＣＳＦ−１に決定的に依存している一方で、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１集団及びＣＤ１０３^＋ＤＣ２集団は、ＣＳＦ１には依存しておらず、これは特有なことであった（図４Ｂ）。サイトカイン受容体欠損マウスを使用するために、出願人は、顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）を、異所性腫瘍を有する宿主へと移入する類遺伝子性養子移入モデルを開発し、ＢＭ、脾臓、及び腫瘍における再増殖を追跡した（図４Ｃ）。腫瘍において、ＧＭＰに由来する細胞がすべての骨髄系コンパートメントに集合しており、このことは、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２、ＴＡＭ１、及びＴＡＭ２がＧＭＰ起源であることを確認するものであった（図４Ｄ）。ＧＭＰ養子系を競合移入と共に使用することによって、出願人は、腫瘍においてＣｓｆ２ｒｂ^−／−細胞が、ＤＣを再構成する能力を選択的に有していないことを発見し、ここで、当該ＤＣは、ＣＤ２４^＋ＣＤ１１ｃ^＋のゲーティングを使用してＤＣ１／ＤＣ２の合計として定義されるものである。出願人は、ＴＡＭ１及びＴＡＭ２の再増殖に対する影響はないことを発見し、このことは、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）が腫瘍性ＤＣの発生に特有の要件であることを示唆している（図４Ｅ）一方で、４つのＡＰＣのいずれも、ＣＳＦ−３を必要としないことが明らかとなった（データ未掲載）。

【0304】

ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦまたはＦＬＴ３−リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）によって原型的に推進されるため、出願人は、ＧＭＣＳＦまたはＦＬＴ３Ｌを発現するように操作されたＢ１６メラノーマ腫瘍モデルを使用して、サイトカインが腫瘍においてＤＣ集団を十分に推進するかを評価した。腫瘍がＧＭＣＳＦを発現することで、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１の割合は大幅に歪んだ一方で、ＦＬＴ３Ｌを発現する腫瘍は、腫瘍において希少なＣＤ１０３^＋ＤＣ２の増殖を特異的に推進した（図４Ｆ）。

【0305】

実施例５：ＣＤ１０３^＋ＤＣ２に特有の抗原処理能力及び抗原提示能力。
異なるＡＰＣの系譜要件が確立されたため、次に出願人は、それらがＴ細胞応答を開始、関与、及び維持する能力について評価した。抗原の処理、提示、及び同時刺激に関して細胞を解析するために、出願人は、図２のＲＮＡ配列解析データを使用して、こうした経路に関与する遺伝子の転写物レベル及びタンパク質レベルを解析した。差異は、かなりのものであり、潜在的なＡＰＣ機能の広範囲にまたがるものであった（図５Ａ）。注目すべきことに、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及び２Ｂ４を含む、Ｔ細胞応答の制御に関与する分子の表面レベルは、集団間で同等であった一方で、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、異なる転写特性を示し、当該特性は、Ｔ細胞相互作用を増進するであろうと予測される交差提示の増大、同時刺激の増進、及びケモカイン発現の増加と一致するものであった（図５Ａ、図５Ｂ、及びデータ未掲載）。ＡＰＣ間においてＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩの発現に大きな違いはなく、例外として、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２でＭＨＣＩが僅かに減少していた（図５Ｃ）。しかしながら、異所性腫瘍に由来し、エクスビボでのデキストランの取り込みによって外因的に測定された貪食能力では、ＴＡＭ１／ＴＡＭ２と比較して、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２において有意な差が観測された（図５Ｄ）。

【0306】

ＤＣの成熟及び貪食能力は、逆相関の関係にあることが多いため、出願人は、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２の貪食能力の減少が、抗原の交差提示が増加し、ＤＣがより成熟する（Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２）ことと対応するのではないかという仮説を立てた。ＤＣにおける抗原の効率的な交差提示は、食胞のｐＨを制御するＮｏｘ２に依存しており、それによって、Ｔ細胞ペプチドの破壊を防いでいる。本研究の前に、このことは、比率計測アッセイを使用し、ｐＨ感受性及びｐＨ非感受性のフルオロフォアの細胞内蛍光強度を貪食後に比較することで以前に決定された（Ｓａｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００６）。それ故に、出願人は、ｐＨ感受性ＧＦＰ（ｐＨｌｕｏｒｉｎ、ｐＨ６．５未満で消光）と、ｐＨ非感受性フルオロフォア（ｍＣｈｅｒｒｙ）と、の融合体を発現するＢ７８（メラノーマ）腫瘍株を生成させた。それぞれの集団のｍＣｈｅｒｒｙ^＋コンパートメント内のｐＨｌｕｏｒｉｎの強度を単独で解析することによって、出願人は、「ＤＣ」集団のみが、アルカリ性（蛍光）環境にｐＨｌｕｏｒｉｎを維持していることを発見し、ｐＨｌｕｏｒｉｎ及びｍＣｈｅｒｒｙのシグナル比を比較することで、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２が細胞内コンパートメントを最も塩基性に維持している一方で、ＴＡＭ１集団及びＴＡＭ２集団では、高度に酸性を示し、それ故に、分解性の貪食経路であることが示された（図５Ｅ）。ＣＤ１０３^＋ＤＣ２の食胞内腔のアルカリ性が増加していたことに加えて、この細胞では、炎症性誘発性サイトカインであるＩＬ−１２の発現が異なっており、抗炎症性であるＩＬ−１０は存在しないことが示された（図５Ｆ、図５Ｇ，及びデータ未掲載）。まとめると、こうした特徴はすべて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞への効率的な抗原交差提示に向けて、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２が高度に準備されていることを示唆している。

【0307】

実施例６：ＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞の優れた刺激因子である。
以前に出願人は、腫瘍から直接的に取得したとき、抗原を取り込んでいる骨髄系コンパートメントの総体がナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激することは可能であるが、予め活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激することは不可能であることを発見した（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。しかしながら、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２に特有の交差提示表現型に基づき、出願人は、腫瘍から新たに単離したそれぞれの集団のＴ細胞刺激能力を試験することを試みた。卵白アルブミンに特異的なＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞と１２時間共培養した後に、ＴＣＲシグナル伝達を強固に誘導する能力を有していたのはＣＤ１０３^＋ＤＣ２集団のみであり、このことは、ナイーブＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞及び予め活性化されたＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方において、早期Ｔ細胞活性化マーカーであるＮｕｒ７７及びＣＤ６９が増加したことによって証明された。重要なことに、このことは、異所性マウスモデル及び自発性マウスモデルの両方において一貫性を有していた（図６Ａ及びデータ未掲載）。色素標識したＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞との共培養を延長することで、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１集団及びＣＤ１０３^＋ＤＣ２集団が、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させる最も強固な刺激因子であることが明らかとなり、貪食性腫瘍骨髄系細胞において以前に同定された刺激能力のほとんど全体が、こうしたＤＣ内に特異的に存在することが示された（図６Ｂ〜６Ｃ、及びデータ未掲載）。興味深いことに、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、確立されたＣＴＬの強力な増殖を特異的に誘導する能力を有しており、当該ＣＴＬは、他の集団によって刺激されなかったことから、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、腫瘍におけるＣＴＬの優れた交差提示刺激因子であることが示唆された（それぞれ図６Ｄ〜６Ｅ、及びデータ未掲載）。

【0308】

最終的に、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、通常、全腫瘍単離物において低頻度で存在しており、この頻度では、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２がＣＴＬの増殖を推進することは依然として不可能である（データ未掲載（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２））。さらに、ＡＰＣサブセットのいずれも、腫瘍から直接的に得たＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を誘導しなかった（図６Ｆ〜６Ｇ、データ未掲載）。しかしながら、外来性のペプチドが、事実としてＤＣ１及びＤＣ２の増殖刺激能力を回復させており、このことは、こうしたＤＣがＣＤ４ Ｔ細胞を刺激することが本質的に不可能ではあり得ないことを示唆している（データ未掲載）。決定的に、このことは、腫瘍内のＣＤ１０３^＋ＤＣ２が、ＣＴＬを強固に刺激するための、腫瘍抗原の取り込み能力、処理能力、及び抗原提示能力を特異的に有していることを明らかにするものである。これは、腫瘍が含むものは、弱い骨髄系集団、または抑制性である骨髄系集団のみであるという単純な概念に対する挑戦である。

【0309】

実施例７：生体内イメージングによるＣＤ１０３^＋ＤＣ２の局在化及びＴ細胞相互作用の解明。
希少ＣＤ１０３^＋ＤＣ２のＴ細胞刺激能力が特有であることを考慮し、出願人は、こうした細胞の腫瘍内での空間的な組織化、及びそのＴ細胞との相互作用動力学に対する理解をインビボ及びインビトロの両方で試みた。生存している自発性腫瘍において、インビボでこうした集団を区別するために、ＰｙＭＴｃｈＯＶＡ対立遺伝子をＣｘ_３ｃｒ１−ｅＧＦＰ対立遺伝子及びＣｄ１１ｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ対立遺伝子へと交差させ、骨髄系コンパートメントにおいて３つの特異的な蛍光集団を生成させた（データ未掲載）。両ＤＣサブセット（ＤＣ１／ＤＣ２）は、赤色で特異的に標識された（ＣＤ１１ｃ−ｍＣｈｅｒｒｙのみ）一方で、ＴＡＭ１集団及びＴＡＭ２集団は、それぞれ緑色（Ｃｘ_３ｃｒ１−ｅＧＦＰ）ならびに黄色（ＣＤ１１ｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ及びＣｘ_３ｃｒ１−ｅＧＦＰ）に標識された。この蛍光手法を、２光子生体内イメージングと共に使用して、出願人は、ＴＡＭ１集団及びＴＡＭ２集団が腫瘍性病巣に密接して優先的に縁へと移動していることを観測した。この帯域は、出願人が以前に、Ｔ細胞が優先的に補足されることを発見した帯域である（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。対照的に、赤色のＤＣサブセットは、典型的には、腫瘍病巣から遠位にあるコラーゲンに富む別の帯域において見出され、遠位に局在化しているすべてのＡＰＣの７０％近くを構成するものであった（図７Ａ及びデータ未掲載）。

【0310】

この手法では、腫瘍病床の周縁部に存在するものの中で、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１細胞とＣＤ１０３^＋ＤＣ２細胞とが完全に区別されなかったため、出願人は、ほとんど存在しない赤色のＤＣが、排他的に一方またはもう一方のサブセットに優先的に相当し得るかどうかの決定を試みた。インサイチュでサブセットを描出するために、出願人は、抗ＣＤ１１ｂ抗体による染色を使用した生存腫瘍切片のイメージングを利用した。これを使用することで、出願人は、赤色／緑色蛍光レポーターの存在下で、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１サブセットとＣＤ１０３^＋ＤＣ２サブセットとをインサイチュで区別することが可能であったと共に、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ及びＣＤ１１ｂ⁻ＤＣの両方が、こうした位置に存在していることを発見した（データ未掲載）。出願人は、ＴＡＭが、一般に、腫瘍周縁部において優勢な細胞型となる一方で、それでもなお、数は非常に少ないものの、ＣＴＬ刺激促進性ＡＰＣをそこに見出すことができると結論づける。

【0311】

出願人の以前のデータは、流入するＣＴＬが腫瘍周縁部において捕捉される挙動をとることを示しており、出願人は、こうしたことがＤＣもしくはＴＡＭまたはそれらの両方で生じ得るかどうかの決定を試みた。生体内イメージングまたは生存切片イメージングのいずれかを目的として、アクチン−ＣＦＰ標識したＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、自発性乳腺腫瘍を有するマウスへと養子移入することによって、赤色／緑色レポーター系において、インビボでＴ細胞動力学を解析した。出願人は、以前に説明したように（Ｂｏｉｓｓｏｎｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、安定的なＴ細胞相互作用は、大部分が腫瘍周縁部に限局していることを観測した（図７Ｂ及びデータ未掲載）。スコア化した相互作用のすべてでＴＡＭ１相互作用が優勢であったものの、ＤＣ及びＴＡＭ２もまた、はっきりとＴ細胞の捕捉に関与していた。このことは、腫瘍近位領域において、ＤＣ１／２が不能でもなければ、腫瘍内で活動するＴ細胞から物理的に排除されている訳でもないことを示しているが、どれがＴ細胞を関与させる本質的な能力が高いのかという基本的な疑問を生じさせるものである。

【0312】

これに答えるために、出願人は、ＡＰＣの選択を組織の物理的制約から切り離し、腫瘍を消化することで、単一細胞浮遊液を調製し、インビトロで活性化したＯＴ−Ｉ ＣＴＬに導入し、そのままＯＴ−Ｉ ＣＴＬと抗原特異的な対を形成させた。その後、出願人は、Ｔ細胞と対を形成したそれぞれのＡＰＣ集団の割合をフローサイトメトリーによって定量した。これによって、ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞は、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２サブセット及びＴＡＭ１／２サブセットと優先的に対を形成することが明らかとなった（図７Ｃの左パネル）。しかしながら、ＴＡＭ１／２が高頻度で存在するため、ほとんどのＴ細胞−ＡＰＣ対は、ＴＡＭ１／２細胞と形成されたものである（図７Ｃの右パネル）。出願人は、腫瘍において、ＤＣ２が周縁部付近に存在するとき、Ｔ細胞相互作用に寄与しており、Ｔ細胞を占有するために競合する能力を有していると結論づける。

【0313】

実施例８：希少な腫瘍ＣＤ１０３^＋ＤＣ２は、効率的な養子Ｔ細胞療法を可能にする。
出願人は、完全に侵襲性かつ増殖性の株であるＥＧ７．１と比較して、自発的に退縮するＥＧ７腫瘍細胞株では、ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１とＣＤ１０３^＋ＤＣ２との割合がほとんど反転していることを発見し、このことは驚きであった。自発的に退縮するＥＧ７腫瘍細胞株は、これ以後はＥＧ７．２と称す。この侵襲性の増殖株は、出願人が他のすべての侵襲性の腫瘍において観測したＤＣの相対的な割合を維持していた（データ未掲載）一方で、この自発的に退縮するモデルは、異常に多い数のＣＤ１０３^＋ＤＣ２を含んでいた（データ未掲載）。出願人は、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２を欠いているＩｒｆ８ＫＯ腫瘍モデルにおいては、腫瘍増殖が増加するが、Ｉｒｆ４条件的ＫＯモデルでは増加しないことも観測した（データ未掲載）。まとめると、ＤＣ２の腫瘍性の存在量は、腫瘍制御において重要な役割を担い得ることが示唆されるが、増殖の差異は、その骨髄系細胞集団及びそのＣＴＬ刺激能力を超えて、こうした株における変動の大きさに相当し得るものである。それ故に、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２が、効率的なＣＴＬ媒介性の腫瘍退縮に必要であるかどうかを正式に試験するために、出願人は、増殖性ＥＧ７．１腫瘍モデルを対象とし、活性化した腫瘍特異的Ｔ細胞による養子Ｔ細胞療法を実施して退縮を解析した（Ｈｅｌｍｉｃｈ ａｎｄ Ｄｕｔｔｏｎ，２００１）。出願人は、こうした実験をｚＤＣ−ＤＴＲマウスにおいて実施した。当該マウスでは、腫瘍においてＣＤ１０３^＋ＤＣ２を特異的に除去することが可能である（図３Ｄ）。腫瘍部位に対するＣＤ１０３^＋ＤＣ２の影響を分離すると共に、ＬＮでのプライミングのどのような影響も排除するために、（１）ＬＮでのプライミングを必要とせず、典型的には、ＬＮを通過しない活性化したＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋ＣＴＬ芽細胞の使用と、（２）ＬＮへと流入する移入した希少ＣＴＬ Ｔ細胞がＬＮから流出することを防ぐＳＩＰ_１ＲアンタゴニストであるＦＴＹ−７２０での動物の処理と、である２つの方針を含めた実験を出願人は特別に設計した。ＦＴＹ−７２０単独の影響が、移入したＣＴＬが腫瘍の退縮を媒介することに対して与えた影響は最小限であった（データ未掲載）。しかしながら、出願人は、ＦＴＹ−７２０と関連させてＣＤ１０３^＋ＤＣ２を除去すると、ＣＴＬが効率的に腫瘍退縮を媒介する能力に対して重大な影響を与え、これによって、Ｔ細胞が媒介する腫瘍退縮が大幅に遅延することを発見した（図８Ａ）。

【0314】

実施例９：腫瘍内ＣＤ１０３^＋ＤＣ２の存在量の特性は、ヒトの癌全般わたって予後を予測する。
ヒト腫瘍に対して、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２の存在量が重要な役割を果たすかどうかを決定するために、出願人は、適合した予後データと共に、多数のヒト癌型に由来する相対的な遺伝子発現量を定量するＴＣＧＡアレイデータ（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｈｏａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を利用した。出願人は、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２を特徴付ける高レベル転写物を選択するために、出願人のＲＮＡ配列解析データを使用すると共に、ＴＡＭ１／ＴＡＭ２／ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ１細胞を特徴付けるが、ＣＤ１０３^＋ＤＣ２では低下している遺伝子のサブセットも選択した（それぞれ図８Ｂの上部及び下部の遺伝子）。出願人は、こうしたマウス遺伝子のヒトホモログを同定し、すべての癌型に由来する患者のＴＣＧＡデータにおけるこうした「特性」の発現をアッセイし、予後との関連性を評価した。比例ハザード生存率解析において、共変数として癌型をモデルに適合させることで、出願人は、こうした集団に由来する個々の遺伝子が予後に対してもたらす恩恵（ハザード比（ＨＲ）として示される）は僅かなものにすぎないことを観測した。しかしながら、出願人がＣＤ１０３^＋とＣＤ１０３⁻との遺伝子発現データの比を定義し、これをＣｏｘ解析内の連続変数として使用すると、生存率の増加との高度に有意な関連性（ＢＨ ｐ＝０．０００１９）が存在することが観測された（図８Ｂ）。

【0315】

この解析は、出願人が同定した細胞型と、その機能的に正反対なものとの比をとると、ヒトの癌全般にわたる予後を対象とする、非常に強力な予後値が生成することを示すものである。この「特性」と、他の以前に説明された「免疫スコア」と、の比較することで、全Ｔ細胞存在量に基づくもの（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）、及びマクロファージに対するＣＤ８Ｔ細胞のバルク比によって実施されるもの（ＣＤ８／ＣＤ６８ ＤｅＮａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を含む、他の現在のＴＣＧＡデータ解析と比較して、ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻遺伝子の比が最も強力な免疫促進性の生存シグナルを提供することが示された（図８Ｃ）。正反対の予後ではあるものの、出願人のスコアは、予後不良と関連する免疫スコアも有利に比較するものである。こうした患者の腫瘍におけるＣＳＦ−１の発現もまた、ＣＤ１０３／ＢＤＣＡ３遺伝子比の尺度と反相関するが、同様に、全腫瘍Ｆｌｔ３Ｌレベルと反相関することにも注目するべきである（データ未掲載）。

【0316】

最後に、出願人は、個々の癌型内でＴＣＧＡデータの解析を試みた。癌型を適合させて、このデータセットにおける１２のすべての癌を対象としたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ（Ｋ−Ｍ）は、高ＣＤ１０３^＋／ＣＤ１０３⁻遺伝子発現特性を有する腫瘍における全体的な恩恵を示すものである（図８Ｄ及びデータ未掲載）。この関連性の程度は、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、及び肺腺癌において特に顕著である（図８Ｅ〜８Ｇ）。全体として、これによって示される強力な免疫特性は予想外のものであり、それがマウスの腫瘍モデルでの実験による免疫プロファイリングに完全に由来するものであったため、なおさら予想外であった。

【0317】

実施例１０：実施例１１の材料及び方法
メラノーマバイオインフォマティクス解析

【0318】

メラノーマのデータセットであるＧＳＥ１９２３４（ｎ＝４４）は、特性の評価、及び生存率（Ｃｏｘ比例ハザード）との関連性評価の前に、Ｒの環境において分位数正規化よる処理を予め実施した。Ｂｏｇｕｎｏｖｉｃ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｔｉｃ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｌｅｓｉｏｎｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｉｎｇ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０６，２０４２９−２０４３４（２００９）。ＳＤＣ／ＮＳＭ特性比は、ＳＤＣ遺伝子の平均発現量を、ＮＳＭ遺伝子の平均発現量で割ったものの対数として計算し、その後、標準化（平均値＝０、標準偏差＝１、図１Ａの遺伝子一覧）してｚスコアとする。生存率解析は、Ｃｏｘ比例ハザードモデリングを使用して実施した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して多重比較を適合した後、対数順位のｐ値を使用して有意性を評価した。Ｒの生存率パッケージを使用して、^２０Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを作成し、出願人は、ＳＤＣまたはＳＤＣ／ＮＳＭの特性比の３３％値、５０％値（中央値）、または６６％値を使用して、それぞれの試料を「高」または「低」として分類した。

【0319】

患者及び試料

【0320】

組織学的にステージＩＶまたはステージＩＩＩの切除不能な転移性メラノーマを有していると確認された患者である場合、この試験に登録した。患者は、ＵＣＳＦ ＩＲＢが承認したプロトコール（ＵＣＳＦ ＣＨＲ番号１３−１２２４６）の下、組織収集に同意した。試験の登録期間は、２０１２年１２月から始まり、２０１５年２月までとした。患者は、下記のＰＤ−１／ＰＤＬ−１系（ａｘｉｓ）をブロックするモノクローナル抗体で治療した：ペンブロリズマブ（キーノート（Ｋｅｙｎｏｔｅ）００１、キーノート００２、キーノート００６もしくは拡大アクセスプログラムもしくは商用供給）またはニボルマブ（商用供給）。皮膚／皮下腫瘍は、パンチ（４ｍｍまたは６ｍｍ）、外科的切除（試料Ｋ１０）のいずれかで生検し、他の腫瘍生検はすべて、コア生検（１６ｇまたは１８ｇ）によって排他的に実施した。追加試料は、病理評価にまわした。生検（ｎ＝２１）は、抗ＰＤ１の注入前に収集した。新鮮な生検試料は、生理食塩水に浸したガーゼ上の無菌容器に迅速に入れると共に、湿った氷の入った容器に入れ、評価に向けて実験室に運んだ。すべての効果判定は、固形癌の治療効果判定のためのガイドラインバージョン１．１（ＲＥＣＩＳＴ）を使用して、放射線学的イメージングで実施した。完全奏功は、すべての標的病巣及び非標的病巣の完全な退縮として定義し、部分奏功は、新しい病巣の出現を伴わない、３０％を超える標的病巣の退縮として定義した。安定疾患は、標的病巣のサイズの３０％以下の減少、または２０％以下の増加として定義した。進行疾患は、標的病巣の２０％以上の増加、または１ｃｍのサイズを超える新たな病巣の出現として定義した。完全奏功または部分奏功である患者は、「レスポンダー」として分類し、安定疾患または進行疾患である患者は、「非レスポンダー」として分類した。フォローアップ検査が恩恵を与えることなく、進行が臨床的に定義される場合（例えば、新たな病巣）、患者はレスポンダーとして分類し、ＲＥＣＩＳＴは「ｘ」として示した。

【0321】

ヒト組織の消化

【0322】

組織を外科用のハサミでしっかりと細断してから、磁気撹拌棒を入れた２５ｍＬの三角フラスコへと移し、０．３ｇの組織当たり３ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ）、及び５０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、５％のＣＯ_２雰囲気下、３７℃で、一定に撹拌しながら１時間処理した。その後、試料を７０ｕｍのフィルターに通して濾過してから遠心沈降し、染色に向けて再懸濁した。Ｒｕｆｆｅｌｌ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｓｅｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９，２７９６−２８０１（２０１２）。

【0323】

フローサイトメトリー及びＡｂクローン

【0324】

抗体はすべて、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＣＳＦ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｏｒｅから購入するか、またはＫｒｕｍｍｅｌ Ｌａｂにおいて産生させた。表面染色については、細胞をヒト抗Ｆｃ受容体抗体の混合物（クローン３Ｇ８、クローンＦＵＮ−２、及びクローン１０．１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共にインキュベートし、２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳ中で抗体を使用して氷上で３０分間染色した。生存率は、固定化可能なＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲまたはＡｑｕａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色することによって評価した。フローサイトメトリーはすべて、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで実施した。フローサイトメトリーのデータ解析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）ソフトウェアを使用して実施した。細胞選別は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを使用して実施した。

【0325】

ヒト抗原に対するマウス抗体：ＣＤ４５クローンＨｌ３０、ＣＤ３ｅクローンＯＫＴ３、ＨＬＡ−ＤＲクローンＬ２４３、ＣＤ５６クローンＣＭＳＳＢ、ＣＤ１９クローンＨ１Ｂ１９、ＣＤ１４クローン６１Ｄ３、ＣＤ１６クローンＣＢ１６、ＣＤ１１ｃクローン３．９、ＢＤＣＡ１クローンＬ１６１、及びＢＤＣＡ３クローンＡＤ５−１４Ｈ１２。

【0326】

細胞株及び細胞培養

【0327】

Ｂ７８ＣｈＯＶＡは、Ｂ７８の変異株であり、ＰｙＭＴｃｈＯＶＡ細胞株の生成に使用したものと同一のＣｈ−ＯＶＡ融合構築物を使用して標準的な遺伝子導入手順によって生成させた。Ｇｒａｆ，Ｌ．Ｈ．，Ｊｒ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｐ．＆ Ｓｉｌａｇｉ，Ｓ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｌｏｎｅｓ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０，１３９−１５１（１９８４）、及びＥｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍａｒｇｉｎａｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｓｔａｂｌｙ ｅｎｇａｇｅ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２１，４０２−４１７（２０１２）。簡潔に記載すると、接着細胞は、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミンを含み、１０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中、５％のＣＯ_２雰囲気下、３７℃で組織培養処理済プラスチックプレートにおいて培養し、２日に１回分割した。浮遊細胞は、組織培養用のＴ２５フラスコ及びＴ７５フラスコにおいて、１０％のＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを添加したＲＰＭＩ−１６４０中で培養し、２日に１回分割した。

【0328】

マウス腫瘍

【0329】

マウスはすべて、ＳＰＦ条件下で維持し、ＮＩＨ及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの基準に準拠し、ＩＡＣＵＣ ＵＣＳＦのプロコールに従って処理した。

【0330】

腫瘍細胞株を収集し、ＰＢＳで３回洗浄した後、成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：１の比で混合し、最終注射体積を５０ｕｌとした。１５０，０００個の腫瘍細胞を、剪毛した右側腹部の皮下に注射し、そのまま１４〜２１日増殖させた。

【0331】

マウス種

【0332】

腫瘍における骨髄系細胞集団の調節については、野生型Ｃ５７ＢＬ／６をＳｉｍｏｎｓｅｎから購入し、Ｚｂｔｂ４６−ＤＴＲ Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＳＩｍｏｎｓｅｎから入手した。Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｚＤＣ（Ｚｂｔｂ４６，Ｂｔｂｄ４）ｄｅｆｉｎｅｓ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０９，１１５３−１１６５（２０１２）。Ｚｂｔｂ４６−ＤＴＲ ＢＭキメラは、致死線量照射（５．５Ｇｙ用量を２回）を実施した８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性レシピエント、及び２〜５Ｘ１０^６個のＺｂｔｂ４６−ＤＴＲ ＢＭ細胞を使用し、標準的な手順に従って生成させた。マウスを抗菌水で４週間保持し、再構成の８週間後に実験に使用した。

【0333】

腫瘍増殖

【0334】

腫瘍の増殖曲線については、記載の期間にわたって、電子ノギスで腫瘍の幅ｘ腫瘍の高さとして腫瘍面積（ｍｍ^２）を測定した。

【0335】

ジフテリア毒素、抗ＰＤ−１、及び抗ＣＴＬＡ−４での処理

【0336】

ＤＴは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＤＴＲマウスにおける、ＤＴによる一過性の除去については、ＤＴＲマウスに対して体重グラム当たり２０ｎｇのＤＴを腹腔内注射し、ＤＴ注射の２４時間後に、分析に向けてマウスを安楽死させた。長期の除去については、マウスに対して最初に２０ｎｇ／グラムのＤＴを腹腔内注射した後、その後は４ｎｇ／グラムで実施する３日に１回の投与を最大１５日間維持した。

【0337】

精製された抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰＩ−１４）及び抗ＣＴＬＡ−４（クローン９Ｈ１０）は、ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入し、３つ処理と組み合わせた治療として、腫瘍増殖の５日目、８日目、及び１１日目に、各抗体１００ｕｇを腹腔内注射した。

【0338】

統計解析

【0339】

統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。別段の特定記載がない限り、データはすべて、４回以上の独立した実験の代表である。誤差バーは、Ｐｒｉｓｍを使用して計算したＳ．Ｅ．Ｍ．を示し、３連の実験条件に由来するものである。特定の統計検定では、対応Ｔ検定及び独立Ｔ検定を使用し、０．０５未満であるｐ値はすべて、統計学的に有意であると見なした。

【0340】

実施例１１：腫瘍内ＢＤＣＡ３＋ＤＣは、ヒトメラノーマにおける、抗ＰＤ１チェックポイント療法に対する予後を予測する。
腫瘍内ＡＰＣの表現型は極めて多様であり、骨髄系は、マクロファージ及び樹状細胞の両方に類似した集団を複数形成することに寄与している。しかしながら、「マクロファージ」は、腫瘍の進行に対して抑制性である（ＤｅＮａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，及びＨａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．）一方で、おそらく、腫瘍内樹状細胞は刺激性である（Ｓａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．）のではないかと、長期にわたって考えられてきた。このことを明確かつ詳細に理解するための努力がなされてきたが、こうした細胞型同士を明瞭に区別するすべが存在しないことで大いに阻まれてきた。最近、出願人は、腫瘍内骨髄系細胞を区別するために、ＲＮＡ配列解析と共に高次元のフローサイトメトリーを試みた。出願人は、実際に、交差提示を行う樹状細胞の小集団は、ＣＴＬに対して高度に刺激性であるが、他の真の「樹状細胞」サブセット、ならびに非常に多く存在するマクロファージ集団は、腫瘍抗原反応性のＣＤ８Ｔ細胞の刺激に失敗することを発見した。希少な刺激性樹状細胞（ＳＤＣ）は、マウスでは、インテグリンＣＤ１０３の発現によって定義され、ヒトでは、ＣＤ１４１／ＢＤＣＡ３の発現によって定義される（Ｂｒｏｚ ｅｔ ａｌ．）。

【0341】

ヒトメラノーマにおける、こうした希少な免疫刺激性ＤＣ集団の役割を具体的に突き止めるために、出願人は、残るすべての非刺激性骨髄系（ＮＳＭであり、マクロファージ及び非刺激性ＤＣを含む）抗原提示細胞サブセットと比較して、それらのＲＮＡがマウスＳＤＣにおいて非常に濃縮されている２つの「特性」遺伝子セット、または逆に、ＮＳＭにおいて優先的に発現する１つの遺伝子セットのいずれかを最初に利用した（図９Ａ）。そこで出願人は、４４人の転移性メラノーマ患者に由来する、両方のＲＮＡ発現解析、腫瘍の分裂指数、疾患の臨床的なステージ分類、及び転移性メラノーマ患者の生存率を包含する、よく注解されたデータセットを検索した（Ｂｏｇｕｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ）。出願人は、個々のＳＤＣ遺伝子、ＳＤＣ遺伝子すべての平均、またはＳＤＣ／ＮＳＭ遺伝子の比のいずれかを解析することで、ＲＮＡ存在量の解析を試みた。これら後者の２つは、それぞれ全体的なＳＤＣ存在量、及び相対的なＳＤＣ／ＮＳＭ細胞存在量の尺度であると考えることが可能である（Ｂｒｏｚ ｅｔ ａｌ．）。

【0342】

９つのＳＤＣ特性遺伝子のうちの７つは、有意に予後の恩恵をもたらすものであり、ハザード比（ＨＲ）（以下の表１）として表現され、ＳＤＣ特性及びＳＤＣ／ＮＳＭ特性比の両方が、高度に有意な予測値を有する。

【0343】

こうした予後関連性をよりよく可視化するために、ＳＤＣ遺伝子またはＳＤＣ／ＮＳＭ比のいずれかを対象として、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ（Ｋ−Ｍ）プロットを作成し、プロットでは、患者を「高」特性発現または「低」特性発現へとビン分割し、その際、発現のビン分割の閾値を３３％、５０％、または６６％のいずれかとして厳密性カットポイントを増加させた（図９Ｂ、図９Ｃ）。こうした解析によって、最高レベルの発現量を選択すると、生存見込みが上昇し、ＳＤＣまたはＳＤＣ／ＮＳＭが上位３３％である腫瘍では、転移時点からの生存率が統計学的に最も有意に増加することが示された。このことは、腫瘍において刺激性ＢＤＣＡ３^＋ＤＣの存在量が増加することでよりよく生存が支援されるという仮説を裏付けるものであり、これは、治療を実施しないときでさえあてはまる。

【0344】

この関連性とＴ細胞免疫との関連性を考慮し、出願人は、特性が明らかにされた腫瘍におけるＴＩＬの存在量に関する精選情報をさらに利用することで、ＳＤＣ特性及びＳＤＣ／ＮＳＭ特性と、ＴＩＬの浸潤に関する解析分類データと、を関連付けた。この解析によって、ＴＩＬカテゴリーの、クラスに基づく尺度、及び腫瘍周囲のＣＤ３＋Ｔ細胞数の尺度が共に、ＳＤＣ遺伝子特性と高度に関連しており、程度は低いものの、依然として非常に有意な程度で、ＳＤＣ／ＮＳＭ比と関連することが明らかになった（図９Ｄ〜９Ｇ）。

【0345】

こうした関連性は、ＳＤＣの存在量、Ｔ細胞機能、及び全生存率の間の相互関連性を示唆するものであった。我々は、この関連性を、それがチェックポイント封鎖に関連する可能性があるものとして検索を試みた。しかしながら、ＳＤＣ特性及びＳＤＣ／ＮＳＭ特性は、集団自体に代わるものにすぎないため、出願人は、チェックポイント療法の臨床試験と関連させて、メラノーマ生検に由来するこうした集団の直接的な測定を試みることで、それらがどのように関連するのかを調べた。

【0346】

この目標を試験するために、出願人は、転移性メラノーマを有する患者から得た２１個の生検試料に由来する腫瘍生検を、フローサイトメトリーを使用して解析し、抗ＰＤ−１治療に応じたそれらの進行度を追跡した。２１人の患者の内、５人は女性、１６人は男性、平均年齢は６１．６歳であり、生検は、さまざまな位置及び組織から採取されたものである（図１０Ａ）。こうした患者のそれぞれについて、生検を酵素的に消化し、フローサイトメトリーで分析することで、腫瘍における免疫細胞浸潤割合を定量した。出願人は、包括的フローパネルを設計し、マーカーであるＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８５ｇ、ＣＤ１４、ＢＤＣＡ１、及びＢＤＣＡ３を使用してヒト骨髄系浸潤物を精査した。こうしたマーカーを使用することで、出願人は、こうした腫瘍の免疫コンパートメントを連続的にゲートして、ＢＤＣＡ３^＋ＤＣサブセット、ＢＤＣＡ１^＋ＤＣサブセット、ＣＤ１４^＋ＴＡＭサブセット、及びＣＤ１４⁻ＴＡＭサブセットを同定することが可能であった（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。そして、出願人は、ＢＤＣＡ３＋ＳＤＣ集団を顕著に有している患者（図１０Ｂ）と、それが顕著に少ない患者（図１０Ｃ）と、が存在することを発見した。ＣＤ４５^＋細胞の全体的な浸潤量、及びＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞の割合は、腫瘍によっても顕著に異なっていた（図１０Ｄ）。ほとんどのメラノーマで、リンパ球（「系譜」）の全体的な存在量は高度に濃縮されていた（図１０Ｅ）。そして、ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞を、図１０Ｃ／Ｄに示すように、骨髄系部分集団へと分類すると、患者の生検全般にわたって、非常に顕著な不均一性も示した（図１０Ｅ）。

【0347】

こうした免疫骨髄系浸潤物と、患者の応答と、の関連性を調べるために、出願人は、患者を、抗ＰＤ−１治療に対して、安定疾患もしくは進行疾患のいずれかとして定義される「非レスポンダー」、または部分奏功もしくは完全奏功として定義される「レスポンダー」のいずれかの群へと解析分類した（図１０Ａ及び方法を参照のこと）。この手法によって、レスポンダーである患者と、非レスポンダーである患者と、の間で、全ＣＤ４５＋免疫細胞浸潤物の割合には有意な差は存在せず、実際は、両群共に、ＣＤ４５＋細胞の平均割合は類似しており、平均値まわりのばらつきは類似していた（図１１Ａ、図１１Ｂ、及びデータ未掲載）。同様に、リンパ球細胞の全体的な頻度と、予後との間に明らかな関連性は存在しなかった（データ未掲載）。対照的に、全腫瘍細胞に占める割合（ＣＤ４５^＋細胞でゲーティング、図１１Ｃ〜１１Ｄ）、または全ＡＰＣに占め得る割合（ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞でゲーティング、データ未掲載）のいずれかとしてＢＤＣＡ３^＋ＤＣを、奏功群を横断して定量すると、抗ＰＤ−１に対してレスポンダーである患者は、その腫瘍におけるＢＤＣＡ３^＋ＤＣの頻度が統計学的に有意に高かった。まとめると、こうした発見は、腫瘍の全免疫細胞浸潤物は免疫療法に対する応答性を予測するものではなく、これはおそらく、全ＣＤ４５^＋集団がＴＭＥにおいて、腫瘍促進を担うのものと、抗腫瘍を担うものとの両方を相反して含んでいるためであり、その一方で、刺激性ＢＤＣＡ３^＋ＤＣの割合は、実際に、抗ＰＤ−１の免疫療法効力を予測できるものであることを示唆している。レスポンダーが相対的に低い数のＢＤＣＡ３を有するという明瞭な例は存在したが、この試料サイズを使用して、ＨＬＡ−ＤＲ＋の上位２％を絶対的に除外することで、レスポンダー状態の９５％信頼区間が得られた。

【0348】

出願人は、残る骨髄系集団の正確な同定、具体的には、ＣＤ１４＋ＴＡＭ、またはＢＤＣＡ１もしくはＣＤ１４−ＴＡＭによって特徴づけられる代替ＤＣ集団のいずれかの存在量、を考慮することによって、この肯定的な関係性をさらに改善することが可能かどうかを確認するために、このデータのさらなる調査を試みた。出願人は、患者が有する、ＢＤＣＡ３＋細胞の割合と、そうしたもののそれぞれの割合と、を対比させることによって個々の患者をプロットする共に、それぞれをレスポンダー状態に応じてコード化した。レスポンダーは、依然としてこのプロットでＢＤＣＡ３＋が高い領域へと解析分類された一方で、出願人は、他の集団には明らかな傾向は存在しないことを発見した（図１１Ｅ〜１１Ｇ）。この場合も同様に、こうした発見は、ＢＤＣＡ３が存在するということは、強固な抗腫瘍性応答の誘起が可能であることの強力な指標であるが、少数の患者では、低めのレベルを有しているにも関わらず、他の因子が応答を可能にする役割を担い得ることを示している。未来の研究では、可能な説明として、ＢＤＣＡ３＋細胞の腫瘍内局在化に焦点を当てるべきである。現在のところ、出願人が有している、こうしたものに対する抗体の能力は不十分であり、したがって、未来の試験に向けた開発が必要となるであろう。

【0349】

ＢＤＣＡ３^＋ＤＣの存在量と、免疫療法に対する応答性との間に強力な関連性が確立されたため、出願人は、この関連性が、チェックポイント封鎖療法に対する、この刺激性ＤＣ集団の機能的要件に相当するのかどうか、または単に、応答性の「特性」に相当するのかどうかを調べた。これを試験するために、出願人は、扱いが容易なマウスメラノーマモデルであるＢ７８ｃｈＯＶＡ細胞株^７を対象とした。Ｂ７８ｃｈＯＶＡ細胞株は、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質及び卵白アルブミンを発現するＢ１６メラノーマの改変変異体である。この腫瘍モデルと併せて、出願人は、Ｚｂｔｂ４６−ＤＴＲ ＢＭキメラマウスを使用した。当該キメラマウスでは、（ＣＤ１０３^＋）ＳＤＣが優先的に除去されることを出願人は以前に示した（Ｂｒｏｚ ｅｔ ａｌ．）。出願人が有するマウスモデルでは、抗ＰＤ１のみで実施する単独治療は、メラノーマに対する効果を有さなかった。したがって、出願人は、ＣＤ１０３＋ＳＤＣを欠失させると、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４とを組み合わせた免疫療法レジメンの効力が妨害されるかどうかを、除去モデルを使用して調べた（図１２Ａ）。５日目、８日目、及び１１日目に３回の投与を実施する処理レジメンと、日目に開始するＤＴまたはＰＢＳのいずれかの注射と、を使用して、抗ＰＤ−１及び抗ＣＬＴＡ−４、またはアイソタイプ適合対照抗体のいずれかでＺｂｔｂ４６−ＤＴＲ ＢＭキメラマウスを処理し、出願人は、ＤＴ処理単独ではこのモデルにおける腫瘍の増殖に対して影響を与えないことを確認した（データ未掲載）。出願人は、未処理のメラノーマ腫瘍が進行性に増殖する一方で、組み合わせ免疫療法で処理したメラノーマ腫瘍は、７〜８日後に急速に退縮し、１５日目までにはほとんど完全に根絶されることを発見した（図１２Ｂ、１２Ｃ）。対照的に、この強力な免疫療法と関連して、マウスのＣＤ１０３^＋ＤＣを枯渇させると、急速な腫瘍退縮は失われ、二重治療の効力に抑止がかかった。このことは、ＣＤ１０３^＋ＤＣが、免疫療法の効果に対する機能的要件であることを示唆している（図１２Ｄ）。

【0350】

したがって、出願人は、マウス腫瘍組織及びヒト腫瘍組織の両方において、特異的ＳＤＣ（ＣＤ１０３^＋またはＢＤＣＡ３^＋）集団が有する強力な予測的及び予後的な恩恵を確立した。一般に、こうした発見は、以前の研究（ＤｅＮａｒｄｏ ｅｔ ａｌ、及びＦｒｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ）において明らかにされているように、腫瘍組織の免疫概観を完全に理解することの重要性をさらに強調するものである。「免疫スコアリング（Ｉｍｍｕｎｏ−ｓｃｏｒｉｎｇ）」（Ａｓｃｉｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ）は、いくつかの癌の新たな診断マーカーとして受け入れられつつあるが、この範囲を超えて、出願人の研究は、微小環境においてＴ細胞を調節し得る免疫細胞の希少集団を同定するために、ヒト腫瘍の詳細な免疫プロファイリングを実施する必要性が増していることを示すものである。層別化には、初期研究で明らかにされる特性を継続的に洗練した後、生検に適した試験の開発が必要となるであろうし、出願人の研究は、例えば、質量イオンビーム技術による高次元イメージングが、未来においてそのような方法の１つになり得ることを強調するものである（Ａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ）。

【0351】

実施例１２：後述の実施例の材料及び方法
腫瘍の消化

【0352】

腫瘍は、マウスから切除し、取り出した腫瘍組織の総重量を決定した。その後、メスを使用して腫瘍を細断し、腫瘍重量０．３グラム当たり、５ｍｇ／ｍｌの原液に由来する２０ｕｌ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ ＴＬ（Ｒｏｃｈｅ）、及び２００ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、３７℃の振とう機において、５０ｍｌのコニカルビーカー中、５％のＣＯ_２雰囲気下で３０分消化した。３０分後、腫瘍を７０ｕｍの細胞ストレーナーに通し、生存細胞をＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ）の密度勾配によって濃縮した。生存細胞を界面から回収し、洗浄して染色緩衝液に入れた（２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳ）。

【0353】

マウスの骨髄及び脾臓の単離

【0354】

大腿骨及び脛骨を取り出し、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ／２ｍＭＥＤＴＡ、及び２５Ｇ針／シリンジを使用して、骨髄を押し出した。脾臓は、マウスから切除し、メスを使用して細断した。組織断片は、３７℃の振とう機において、５００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、１００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、及び２００ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、５０ｍｌのコニカルビーカー中で消化した。その後、消化した組織を７０ｕｍの細胞ストレーナーに通して濾過した。骨髄及び脾臓の両方において、０．８％のＮＨＣｌ_４を使用して赤血球を５分間溶解した後、洗浄して染色緩衝液に入れた（２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳ）。

【0355】

ヒト腫瘍試料

【0356】

組織を外科用のハサミでしっかりと細断してから、５０ｍｌのコニカルビーカーに移し、腫瘍重量０．３グラム当たり、５ｍｇ／ｍｌの原液に由来する２０ｕｌ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ ＴＬ（Ｒｏｃｈｅ）、及び２００ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、３７℃／５％ＣＯ_２の条件で、一定に撹拌しながら３０分間処理した。その後、試料を７０ｕｍのフィルターに通して濾過してから遠心沈降し、染色に向けて再懸濁した（Ｒｕｆｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。すべてのヒト試料について、すべての対象からインフォームドコンセントを得ており、研究は、ＩＲＢの認可（ＩＲＢ番号１３−１２２４６、１２／０６／２０１３−１２／０５／２０１４）に従って実施した。

【0357】

フローサイトメトリー及びＡｂクローン

【0358】

抗体はすべて、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓから購入するか、またはＫｒｕｍｍｅｌ ＬａｂもしくはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃにおいて産生させた。表面染色については、抗Ｆｃ受容体抗体（クローン２．４Ｇ２）ならびに５００ｎｍのヒトＩｇＧ１Ｆｃと共に細胞をインキュベートし、２％のＦＣＳ及び２ｎＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳにおいて一次抗体を使用して氷上で３０分間染色した。その後、２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳで２回洗浄し、適した二次抗体を使用して氷上で３０分間染色した。生存率は、固定化可能なＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲまたはＤＡＰＩで染色することによって評価した。フローサイトメトリーはすべて、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで実施した。フローサイトメトリーのデータ解析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）ソフトウェアを使用して実施した。

【0359】

抗マウスＡｂクローン：ＣＤ４５クローン３０−Ｆ１１、ＣＤ１１ｂクローンＭ１／７０、ＣＤ１１ｃクローンＮ４１８、ＣＤ１０３クローン２Ｅ７、ＣＤ２４クローンＭ１／６９、ＣＤ９０．２クローン３０−Ｈ１２、Ｌｙ６ＣクローンＨＫ１．４、ＭＨＣＩＩクローンＭ５／１１４．１５．２、Ｆ４／８０クローンＢＭ８、ＣＤ６４クローンＸ５４−５／７．１。

【0360】

ＮＳＭマーカー：ＭＳ４Ａ７（ポリクローナル、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓより入手、製品番号：ＨＰＡ０１７４１８）、ＭＳ４Ａ６Ａ（ポリクローナル、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓより入手、製品番号ＨＰＡ０１１３９１）。ラット抗マウスＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）クローン２０／７０、抗ＬＩＬＲＢ４クローン（Ｐｉ１．５クローン１）、抗Ｔｒｅｍ２（Ｐｉ１．２クローン２、クローン５、またはクローン７）、ＣＤ２０６クローンＣ０６８Ｃ２、ＭｅｒＴＫクローンＹ３２３。

【0361】

ＳＤＣ：抗ＣＣＲ７クローン４Ｂ１２（マウス）、抗ＣＣＲ７クローン３Ｄ１２（ヒト）、抗ＸＣＲ１クローンＺＥＴ（マウス）、ＣＤ１３５クローンＡ２Ｆ１０（マウス）、ＣＤ１１７クローン２Ｂ８（マウス）。

【0362】

抗ヒトＡｂクローン：ＣＤ４５クローンＨｌ３０、ＣＤ３ｅクローンＯＫＴ３、ＨＬＡＤＲクローンＬ２４３、ＣＤ５６クローンＣＭＳＳＢ、ＣＤ１９クローンＨ１Ｂ１９、ＣＤ１４クローン６１Ｄ３、ＣＤ１６クローンＣＢ１６、ＣＤ１１ｃクローン３．９、ＢＤＣＡ１クローンＬ１６１、及びＢＤＣＡ３クローンＡＤ５−１４Ｈ１２。ＴＲＥＭ２（クローン２３７９２０）。

【0363】

二次抗体：抗ヒトＦａｂ−Ａ４８８、抗ラット−Ａ４８８、及び抗ヤギ−Ａ４８８を使用し、これらはすべて、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。

【0364】

抗ＴＲＥＭ２抗体を産生させるために、ヒト及びマウスのＴＲＥＭ２の細胞外ドメインに対応する精製タンパク質抗原をＦｃ融合体として産生させると共に、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。こうした抗原は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、吸着によって９６ウェルイムノプレートに４Ｃで一晩固定化した。その後、イムノプレートをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、ナイーブ合成Ｆａｂファージミドライブラリーと共に少なくとも２時間室温でインキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を添加したＰＢＳを大量に使用して洗浄することによって、未結合のファージを除去した。結合したファージは、０．１ＮのＨＣｌで溶出した。溶出したファージをｐＨ８．０の１ＭのＴｒｉｓ−Ｃｌで中和し、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７による一過性の補完を実施して細菌宿主を介した継代によって増幅した。１／５体積のＰＥＧ−８０００、２．５ＭのＮａＣｌを添加し、氷上で２０分インキュベートした後、１７，６００ｘｇ超で２０分間遠心して沈降させることによって、増幅したファージを細菌の上清と分離して濃縮した。沈降したファージを０．５％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳに再懸濁し、マウス、ヒト、またはそれら両方の抗原への吸着によって実施する、その後の一連の選択に使用した。一連の選択を３〜５回実施した後、９６ウェル形式で増殖した個々のクローンからファージを産生させ、培養上清をファージＥＬＩＳＡに使用することで、特異的に結合するクローンを検出した。抗原には結合するが、ウシ血清アルブミンまたはヒトＦｃ対照には結合しないクローンをＤＮＡ配列解析に供した。Ｐｉ１．２クローン２、クローン５、及びクローン７を選択し、試験した。こうしたクローンは、マウス及びヒトの細胞外ＴＲＥＭ２には結合するが、マウス及びヒトの細胞外ＴＲＥＭ１には結合しないことが明らかとなった（データ未掲載）。ＴＲＥＭ１（骨髄系細胞に発現する誘発性受容体１（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ １））の受入番号は、ＮＭ＿０１８６４３．３であり、２０１５年９月２５日時点でＮＣＢＩのウェブサイトを通して利用可能である。

【0365】

抗体ライブラリーは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏから入手した。Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＣＤＲ−Ｈ３ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｓ Ｎｏｔ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２２；４２５（４）：８０３−８１１を参照こと。当該文献は、参照によって、この発現目的及びすべての目的を対象として本明細書に組み込まれる。さまざまな合成抗体ライブラリーが、ＵＳＰＮ７９８５８４０Ｂ２においても説明されており、参照によって本明細書に組み込まれる。さまざまな合成抗体ライブラリーは、さまざまな本の章（Ｆｅｌｌｏｕｓｅ ａｎｄ Ｓｉｄｈｕ，“Ｍａｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ，”ｉｎ：Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｋａｓｅｒ，ｅｄｓ．Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，２００７においても説明されており、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0366】

ＬＩＬＲＢ４抗体は、上記のものまたはＷＯ２０１３０８００５５において説明されているものに類似した方法を使用して産生させた。当該文献は参照によって本明細書に組み込まれる。クローン１の配列は、表ＢＢに示される。

【0367】

細胞株及び細胞培養

【0368】

ＭＣ３８細胞は、標準的な細胞培養を実施することによって培養した。簡潔に記載すると、接着細胞は、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミンを含み、１０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中、５％のＣＯ_２雰囲気下、３７℃で、組織培養処理済プラスチックプレートにおいて培養し、２日に１回分割した。ＥＬ４浮遊細胞は、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミンを含み、１０％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０中、５％のＣＯ_２雰囲気下、３７℃で、組織培養フラスコにおいて培養し、２日に１回分割した。

【0369】

マウス腫瘍

【0370】

マウスはすべて、ＳＰＦ条件下で維持し、ＮＩＨ及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの基準に準拠し、ＩＡＣＵＣ ＵＣＳＦのプロコールに従って処理した。

【0371】

腫瘍細胞株を収集し、ＰＢＳで３回洗浄した後、最終注射体積を５０ｕｌとして注射した。１５０，０００個の腫瘍細胞を剪毛した右側腹部の皮下に注射し、そのまま６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウスにおいて１４〜２１日増殖させた。

【0372】

腫瘍の増殖

【0373】

腫瘍の増殖曲線については、記載の期間にわたって、電子ノギスで腫瘍の幅（ｗｉｄｔｈ）ｘ腫瘍の高さ（ｈｅｉｇｈｔ）として腫瘍を測定し、腫瘍体積（ｍｍ^３）をＶ＝（ＬｘＷｘＷ）／２として計算した。

【0374】

抗体処理

【0375】

ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した精製抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰＩ−１４）、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入）、または社内で産生させた抗体クローンを、腫瘍増殖から５日目、８日目、及び１１日目、ならびに１４日目に、４回にわたって２００ｕｇを腹腔内注射して処理した。例外として、抗ＴＲＥＭ２（Ｐｉ１．２）（クローン２）は、それぞれの日に、４０ｕｇ、２０ｕｇ、２０ｕｇ、及び４０ｕｇを注射した。

【0376】

形質導入体の生成

【0377】

細胞株は、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａレンチウイルスベクター及びＬｅｎｔｉＰａｃｋ ＨＩＶ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、レンチウイルスの形質導入によって生成させた。製造者の説明書に従って、感染細胞株を選択可能な抗生物質（ピューロマイシン）中で培養すると共に、ＦＡＣＳによって標的タンパク質の発現を対象とした選別を実施した。

【0378】

細胞の色素標識化

【0379】

０．５ｕＭのｅＦｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、または０．５ｕＭのＣＭＴＭＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）を含むＦＣＳ非含有ＲＰＭＩ中、３７℃で１５分間細胞をインキュベートした。その後、その後、２ｍｌのＦＣＳを使用して色素標識処理を停止し、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩで、使用前に３回洗浄した。

【0380】

腹腔内枯渇アッセイ

【0381】

親細胞株、及び標的を発現する形質導入細胞株のそれぞれを色素標識した２ｘ１０＾６個の細胞を野生型（ＷＴ）Ｂ６雄性マウスへと腹腔内注射した。４時間後、動物に５００ｕｇの枯渇用抗体または対照抗体を注射した。２４〜３６時間後に、腹膜洗浄によって移行した細胞を回収し、フローサイトメトリーによって数えた。

【0382】

統計解析

【0383】

統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。別段の特定記載がない限り、データはすべて、４回以上の独立した実験の代表である。誤差バーは、Ｐｒｉｓｍを使用して計算したＳ．Ｅ．Ｍ．を示し、３連の実験条件に由来するものである。特定の統計検定では、対応Ｔ検定及び独立Ｔ検定を使用し、０．０５未満であるｐ値はすべて、統計学的に有意であると見なした。

【0384】

実施例１３：複数のヒト腫瘍におけるＮＳＭ及びＳＤＣの存在。
次に、ＮＳＭ及びＳＤＣが、複数の異なるヒト腫瘍型にわたって存在するかどうかを決定した。転移性メラノーマ、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、及び結腸癌に由来するヒト腫瘍組織の生検を、ＳＤＣ集団及びＮＳＭ集団の存在を対象として、フローサイトメトリーによって分析した。代表的なフローサイトメトリーは、段階的なゲーティングによって、記載のヒト腫瘍型（転移性メラノーマ、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、及び結腸癌）のすべてにおいてＮＳＭ集団及びＳＤＣ集団の両方が同定されたことを示している。図１３を参照のこと。

【0385】

実施例１４：マウス腫瘍におけるＮＳＭタンパク質の発現及び結合。
次に、ある特定のＮＳＭタンパク質が、ＮＳＭの細胞表面に発現しているかどうか、及びそうしたＮＳＭタンパク質に抗ＮＳＭ抗体が結合し得るかどうかを決定した。ある特定のＮＳＭタンパク質が、ＳＤＣに発現しているかどうかも決定した。

【0386】

マウス腫瘍をＮＳＭマーカーで染色することで、こうしたマーカーがＮＳＭに特異的なものであり、ＳＤＣまたは他の細胞型もしくはサブセットではそうでないことが示された。図１４は、さまざまなＮＳＭマーカーで、記載の細胞サブセットの標識化し、記載の細胞サブセット内で実施したゲーティングを示す。記載のマーカーの染色は、黒のヒストグラムで示され、染色対照のアイソタイプは、灰色網掛けのヒストグラムによって示される。上の列：抗ＴＲＥＭ２（Ｐｉ１．２クローン２）で染色したＢ１６メラノーマ、第２列：抗ＴＲＥＭ２（Ｐｉ１．２クローン２）で染色したＭＣ３８、第３列：抗ＭＳ４Ａ７（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓから購入した市販のポリクローナル抗体、製品コード：ＨＰＡ０１７４１８）で染色したＭＣ３８、第４列：抗ＬＩＬＲＢ４（Ｐｉ１．５クローン１）で染色したＢ１６、第５列：抗Ｃ５ＡＲ１で染色したＭＣ３８。データは、炎症性ＤＣ、Ｌｙ６ｃ＋単球、及びＴＡＭに対する強力な結合、及びＣＤ１１ｂ＋ＤＣに対する顕著な結合を示す。ＣＤ１０３＋ＤＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び腫瘍細胞では、染色はほとんど観測されないか、または全く観測されなかった。

【0387】

所与のＮＳＭタンパク質を標的とする抗ＮＳＭ抗体が、所与のＮＳＭタンパク質に結合するということは、例えば、ＡＤＣＣを可能にする適切なＦｃドメインを選択することによって、抗体に基づく既知の枯渇メカニズムを介してＮＳＭが枯渇または死滅するであろうことを示している。

【0388】

実施例１５：ヒトのＳＤＣ及びＮＳＭ細胞におけるＣＣＲ７の発現。
消化した腫瘍組織におけるＳＤＣ集団及びＮＳＭ集団それぞれでのＣＣＲ７の特異的な発現をフローサイトメトリーによって分析した。データはすべてヒトの転移性メラノーマ細胞に由来する。図１５は、ＮＳＭ及び他の免疫細胞と比較して、ＣＣＲ７がヒトＳＤＣに特異的に発現していることを示す。

【0389】

実施例１６：腫瘍におけるＳＤＣタンパク質の発現及び結合。
次に、ある特定のＳＤＣタンパク質が、ＳＤＣの細胞表面に発現しているかどうか、及びそうしたＳＤＣタンパク質に抗ＳＤＣ抗体が結合し得るかどうかを決定した。ある特定のＳＤＣタンパク質が、ＮＳＭに発現しているかどうかも決定した。

【0390】

消化した腫瘍組織におけるＳＤＣ集団及びＮＳＭ集団のそれぞれでのＳＤＣ遺伝子産物及びＮＳＭ遺伝子産物の特異的な発現をフローサイトメトリーによって分析した。データはすべて、異所性Ｂ７８ｃｈＯＶＡ腫瘍モデルに由来する。腫瘍における細胞集団にわたって、ＳＤＣマーカー（ＣＣＲ７及びＸＣＲ１、黒線）の発現を、それぞれのアイソタイプ（灰色網掛け）と比較した。図１６は、ＳＤＣ遺伝産物がＳＤＣに特異的に発現しており、ＮＳＭにはＳＤＣタンパク質は発現していないことを示す。

【0391】

実施例１７：腫瘍以外には、ＮＳＭに対する結合は生じない。
ＴＲＥＭ２（クローン２３７９２０、ＲｎＤ）、及びＭＳ４Ａ７（市販ポリクローナル、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ）の発現を対象として、健康な野生型Ｂ６マウスの骨髄（ＢＭ）及び脾臓をフローサイトメトリーによって分析した。

【0392】

代表的なヒストグラムは、いくつかの健康な組織集団にわたる、ＴＲＥＭ２及びＭＳ４Ａ７の染色レベルを示す。それぞれの集団の二次対照（それぞれ抗ラット−Ａ４８８及び抗ウサギ−Ａ４８８であり、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから入手した）は灰色網掛けにされており、それぞれの集団の標的タンパク質の染色は黒実線のヒストグラムとして重ねられている

【0393】

一連の範囲の染色濃度（２、２０、２００ｎＭ）にわたる抗体染色によるＴＲＥＭ２（Ｐｉ１．２クローン２、クローン５、及びクローン７）の発現を対象として、健康な野生型Ｂ６マウスの骨髄（ＢＭ）及び脾臓をフローサイトメトリーによって分析し、免疫集団にわたって対照（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ、０ｎＭとしての標識）と比較した。

【0394】

図１７は、健康なＢＭ及び脾臓の組織では、複数のＮＳＭマーカーが実質的に染色されないことを示す。このことは、例えば、腫瘍治療の間に抗ＮＳＭ抗体を使用しても、顕著な非特異的作用は起こりそうもないことを示す。

【0395】

実施例１８：抗ＴＲＥＭ２抗体または抗ＬＩＬＲＢ４抗体を使用した腫瘍におけるＮＳＭの枯渇。
次に、抗ＮＳＭ抗体が、ＮＳＭを有する細胞をインビボで特異的に枯渇させることができるかどうかを決定した。

【0396】

ＴＲＥＭ２：対照及びＴＲＥＭ２（ＴＲＥＭ２はＰｉ１．２とも称され得る）を発現するＥＬ４形質移入細胞を、それぞれＣＭＴＭＲ及びＥｌｆｏｕｒ６７０で色素標識し、１：１の比で混合した。４ｘ１０＾６個の全細胞混合物を野生型（ＷＴ）Ｂ６雄性マウスの腹腔内へ注射した。４時間後に動物に対して、５００ｕｇの抗Ｐｉ１．２（抗ＴＲＥＭ２）抗体または対照ヒトＩｇＧ１を注射した。３６時間後にマウスを屠殺し、腹膜洗浄によって収集し、腹膜から回収した細胞をフローサイトメトリーによって数えた。図１８は、抗ＴＲＥＭ２抗体が、ＴＲＥＭ２を有する細胞をインビボで特異的に枯渇させる一方で、対照抗体は枯渇を生じさせないことを示す。

【0397】

ＬＩＬＲＢ４（ＩＬＴ３）：それぞれＴｄＴｏｍａｔｏ及びＧＦＰを発現する対照、及びＬＩＬＲＢ４を発現するＥＬ４形質移入細胞を、それぞれの細胞型を５ｘ１０＾５個として１：１の比で混合し、野生型（ＷＴ）Ｂ６雄性マウスの腹腔へと注射した。２時間後、動物に対して１００ｕｇの抗ＬＩＬＲＢ４クローン１またはＰＢＳ対照を注射した。２４時間後にマウスを屠殺し、腹膜洗浄によって収集し、腹膜から回収した細胞をフローサイトメトリーによって数えた。図１８は、抗ＬＩＬＲＢ４抗体が、ＬＩＬＲＢ４を有する細胞をインビボで特異的に枯渇させることを示す。

【0398】

所与のＮＳＭタンパク質を標的とする抗ＮＳＭ抗体が、ＮＳＭを枯渇させるということは、抗ＮＳＭ抗体が、腫瘍を有する対象に投与された際に、腫瘍の増殖を減少させるであろうことを示す。

【0399】

実施例１９：抗ＴＲＥＭ２抗体投与後の腫瘍増殖の減少。
次に、抗ＮＳＭ抗体がインビボで腫瘍の増殖を減少させることができるかどうかを決定した。

【0400】

６週齢の雄性Ｂ６マウスに対してＭＣ３８結腸癌をＴ０で注射した。処理群へと無作為化したマウスに対して、腫瘍移植後の５日目、７日目、１１日目、１５日目に、記載の抗体を腹腔内注射して処理した。投薬：抗ＰＤ−１及びＦｃ対照は、２００ｕｇ／日で実施し、抗ＴＲＥＭ２（Ｐｉ１．２クローン２）抗体は、５日目、７日目、１１日目、及び１５日目に、４０ｕｇ、２０ｕｇ、２０ｕｇ、及び４０ｕｇの注射を実施。ノギスで腫瘍を測定し、腫瘍体積を示す。ＴＲＥＭ２群及びＰＤ−１群ではそれぞれ、最大異常値は除外してデータ解析を実施した。図１９は、抗ＮＳＭ抗体が対照と比較して、抗ＰＤ−１治療と同程度に、腫瘍の増殖を減少させることを示す。

【0401】

実施例２０：抗ＮＳＭ抗体を使用した腫瘍におけるＮＳＭの枯渇。
それぞれＴｄＴｏｍａｔｏ及びＧＦＰを発現する対照、及びＮＳＭタンパク質を発現するＥＬ４形質移入細胞を、例えば、それぞれの細胞型を５ｘ１０＾５個として、１：１の比で混合し、野生型（ＷＴ）Ｂ６雄性マウスの腹腔へと注射する。２時間後、動物に対して、抗ＮＳＭ抗体（例えば、１００ｕｇ）、Ｆｃ対照、またはＰＢＳ対照を注射する。２４時間後にマウスを屠殺し、腹膜洗浄によって収集し、腹膜から回収した細胞をフローサイトメトリーによって数える。抗ＮＳＭ抗体は、ＮＳＭタンパク質を有する細胞をインビボで特異的に枯渇させる。抗ＮＳＭ抗体は、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及び／またはＴＭＥＭ１１９に結合する。ＮＳＭタンパク質は、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ１１９から選択される。

【0402】

実施例２１：抗ＮＳＭ抗体投与後の腫瘍増殖の減少。
６週齢の雄性Ｂ６マウスに対して癌細胞（例えば、ＭＣ３８結腸癌）をＴ０で注射する。処理群へと無作為化したマウスに対して、腫瘍移植後の複数日（例えば、５日目、７日目、１１日目、１５日目）に、Ｆｃ対照または抗ＮＳＭ抗体を腹腔内注射して処理する。投薬を決定する。例えば、Ｆｃ対照は、２００ｕｇ／日で投与し、抗ＮＳＭ抗体は、それぞれの日（例えば、５日目、７日目、１１日目、及び１５日目）に、４０ｕｇ、２０ｕｇ、２０ｕｇ、及び４０ｕｇ投与する。ノギスで腫瘍を測定し、腫瘍体積を決定する。抗ＮＳＭ抗体は、対照と比較して、腫瘍増殖を減少させる。抗ＮＳＭ抗体は、対照と比較して、実験マウスにおいて腫瘍に対する免疫応答を増進する。抗ＮＳＭ抗体は、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及び／またはＴＭＥＭ１１９に結合する。

【0403】

実施例２２：抗ＮＳＭ抗体の同時投与を介した免疫療法の増進。
６週齢の雄性Ｂ６マウスに対して癌細胞（例えば、ＭＣ３８結腸癌）をＴ０で注射する。処理群へと無作為化したマウスに対して、腫瘍移植後の複数日（例えば、５日目、７日目、１１日目、１５日目）に、Ｆｃ対照または抗ＮＳＭ抗体を腹腔内注射して処理する。マウスは、免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる。免疫療法には、チェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、Ｔ細胞のチェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、養子Ｔ細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、樹状細胞ワクチン、単球ワクチン、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質、ＢｉＴＥ抗原結合タンパク質、トール様受容体リガンド、ならびに／またはサイトカインが含まれ得る。当該技術分野において利用可能な情報及び通常技術を使用して投薬を決定し、例えば、Ｆｃ対照は、２００ｕｇ／日で投与し、抗ＮＳＭ抗体は、それぞれの日（例えば、５日目、７日目、１１日目、及び１５日目）に、４０ｕｇ、２０ｕｇ、２０ｕｇ、及び４０ｕｇ投与する。ノギスで腫瘍を測定し、腫瘍体積を決定する。免疫療法と併せて抗ＮＳＭ抗体を同時投与することで、非同時投与対照（例えば、単独療法）と比較して、腫瘍増殖の減少が増進する。免疫療法と併せて抗ＮＳＭ抗体を同時投与することで、非同時投与対照（例えば、単独療法）と比較して、腫瘍に対する免疫応答が増進する。抗ＮＳＭ抗体は、ＴＲＥＭ２、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及び／またはＴＭＥＭ１１９に結合する。

【0404】

実施例２３：免疫療法のレスポンダーと非レスポンダーとを対比させたＳＤＣの閾値解析。
次に、どのようなＳＤＣ割合の閾値が、癌を有する対象における、免疫療法開始前のレスポンダーの状態と、非レスポンダーの状態とを統計学的に対比させて示すのかということを、ＲＯＣ曲線によって決定した。

【0405】

ＲＯＣ曲線では、ＣＤ４５＋の関数として％ＢＤＣＡ３のデータを使用するか、またはＨＬＡ−ＤＲ＋の関数として％ＢＤＣＡ３＋のデータを使用した。当該データは、抗ＰＤ−１による治療前にヒトメラノーマを有する患者から取得したものである。％ＢＤＣＡ３値を変化させて、レスポンダー／非レスポンダーの二元系を用いてプロットした。曲線は、最適な閾値設定で、偽の陽性率（ＦＰＲ）に対して真の陽性率（ＴＰＲ）をプロットすることによって作成される。真の陽性率は、シグナル検出の感度としても知られる。偽の陽性率は、脱落（ｆａｌｌ−ｏｕｔ）としても知られ、（１−特異度）として計算することができる。曲線下の面積が広いことは、閾値が、特異度に対して高感度を有しており、したがって、予測性の高い値であることを示す。

【0406】

予測変数としてのＢＤＣＡ３のさらなる確証は、ＲのｐＲＯＣソフトウェアパッケージによって実行されるＤｅＬｏｎｇ法を使用して得た。ＤＣ／ＨＬＡ＋の割合については、曲線下面積（ＡＵＣ）の９５％信頼区間（ＣＩ）は、［０．７６−１］（ＡＵＣ＝０．９０５［０．７６−１］）と推定された。ブートストラップ法を使用して、層別化したブートストラップを２０００回繰り返し、ＣＩ＝［０．７３−１］（ＡＵＣ＝０．９０５［０．７３−１］）であった。ｐｃｔ／ＣＤ４５＋については、ＤｅＬｏｎｇによる推定は、９５％ＣＩ：［０．５９−０．９８］（ＡＵＣ＝０．７８６［０．５９−０．９８］）であり、ブートストラップでは、［０．５７−０．９５］（ＡＵＣ＝０．７８６［０．５７−０．９５］）であった。図２０Ａは、ＣＤ４５^＋に対するＢＤＣＡ３^＋の割合と、予後とを対比させたＲＯＣ解析を示し、図２０Ｂは、ＨＬＡ−ＤＲ^＋に対するＢＤＣＡ３^＋の割合と、予後とを対比させたＲＯＣ解析を示す。

【0407】

これは、ＢＤＣＡ３＋／ＨＬＡＤＲ＋の閾値割合として１．３４７％を使用するということは、下記の内容であることを示している。すなわち、患者がレスポンダーであるとすれば、結果としてＢＤＣＡ３＋が高い確率は、８９％であり（いわゆる感度）、患者が非レスポンダーであるとすれば、結果としてＢＤＣＡ３＋が低い確率は、８６％である（いわゆる特異度）ということである。このことは、腫瘍におけるＳＤＣの割合が、腫瘍におけるＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の中で約１．３４７％以上に増加することは、癌免疫療法が以前に実施されたか、進行中であるか、またはこれから実施するかを問わず、癌免疫療法に対する応答が増加する可能性を有しているということを示す。そのような増加は、例えば、ＳＤＣ数の増加（例えば、ＦＬＴ３Ｌの使用による）、及び／またはＮＳＭ数の減少（例えば、抗ＮＳＭ抗体の使用による）によって達成することができる。

【0408】

実施例２４：ＦＬＴ３−Ｌによる治療での腫瘍におけるＳＤＣ集団の増進。
６週齢の雄性Ｂ６マウスに対して癌細胞（例えば、ＭＣ３８結腸癌）をＴ０で注射する。処理群へと無作為化したマウスに対して、腫瘍移植後の複数日（例えば、５日目、７日目、１１日目、１５日目）に、ＦＬＴ３−ＬまたはＰＢＳ対照を腹腔内、静脈内、及び／または皮下に注射して注射処理する。当該技術分野において利用可能な情報及び通常技術を使用して投薬を決定する（例えば、１００ｕｌのＰＢＳに１０ｕｇ）。腫瘍増殖を通して複数時点で、動物を屠殺し、ＳＤＣ及びＮＳＭの存在量をフローサイトメトリーによって分析する。ＦＬＴ３−Ｌによる治療は、腫瘍発生を通して、腫瘍におけるＳＤＣ存在量を増進する。

【0409】

実施例２５：ＳＤＣ集団の増加に起因する、ＦＬＴ３−Ｌによる治療後の腫瘍増殖の減少。
６週齢の雄性Ｂ６マウスに対して癌細胞（例えば、ＭＣ３８結腸癌）をＴ０で注射する。処理群へと無作為化したマウスに対して、腫瘍移植後の複数日（例えば、５日目、７日目、１１日目、１５日目）に、ＦＬＴ３−ＬまたはＰＢＳ対照を腹腔内、静脈内、及び／または皮下に注射して注射処理する。当該技術分野において利用可能な情報及び通常技術を使用して投薬を決定する（例えば、１００ｕｌのＰＢＳに１０ｕｇ）。ノギスで腫瘍を測定し、腫瘍体積を決定する。ＦＬＴ３−Ｌによる治療は、対照と比較して腫瘍増殖を減少させる。ＦＬＴ３−Ｌによる治療は、腫瘍におけるＳＤＣ存在量、ならびにｄＬＮ、脾臓、及び骨髄（ＢＭ）におけるＳＤＣ集団を増進する。ＦＬＴ３−Ｌは、対照と比較して、実験マウスにおいて腫瘍に対する免疫応答を増進する。

【0410】

実施例２６：ＦＬＴ３−Ｌの同時投与を介した免疫療法の増進。
６週齢の雄性Ｂ６マウスに対して癌細胞（例えば、ＭＣ３８結腸癌）をＴ０で注射する。処理群へと無作為化したマウスに対して、腫瘍移植後の複数日（例えば、５日目、７日目、１１日目、１５日目）に、ＦＬＴ３−ＬまたはＰＢＳ対照を腹腔内、静脈内、及びまたは皮下に注射して注射処理する。マウスは、免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる。免疫療法には、チェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、Ｔ細胞のチェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、養子Ｔ細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、樹状細胞ワクチン、単球ワクチン、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質、ＢｉＴＥ抗原結合タンパク質、トール様受容体リガンド、ならびに／またはサイトカインが含まれ得る。当該技術分野において利用可能な情報及び通常技術を使用して投薬を決定する（例えば、１００ｕｌのＰＢＳに１０ｕｇ）。ノギスで腫瘍を測定し、腫瘍体積を決定する。免疫療法と併せてＦＬＴ３−Ｌを同時投与することで、非同時投与対照（例えば、単独療法）と比較して、腫瘍増殖の減少が増進する。免疫療法と併せてＦＬＴ３−Ｌを同時投与することで、非同時投与対照（例えば、単独療法）と比較して、腫瘍に対する免疫応答が増進する。Ｃｕｒｒａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、及びＳｈｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．も併せて参照のこと。

【0411】

実施例２７：アゴニストである抗ＦＬＴ３抗体を介したＳＤＣを標的とした刺激。
６週齢の雄性Ｂ６マウスに対して癌細胞（例えば、ＭＣ３８結腸癌）をＴ０で注射する。処理群へと無作為化したマウスに対して、腫瘍移植後の複数日（例えば、５日目、７日目、１１日目、１５日目）に、抗ＦＬＴ３抗体またはＦｃ対照抗体を腹腔内注射して注射処理する。当該技術分野において利用可能な情報及び通常技術を使用して投薬を決定する（例えば、Ｆｃ対照では２００ｕｇ／日、抗ＦＬＴ３抗体では４０ｕｇ、２０ｕｇ、２０ｕｇ、及び４０ｕｇ）。腫瘍増殖を通して複数時点で、動物を屠殺し、ＳＤＣ及びＮＳＭの存在量をフローサイトメトリーによって分析する。腫瘍発生を通した、抗ＦＬＴ３アゴニスト抗体による治療は、腫瘍におけるＳＤＣ存在量、ならびにｄＬＮ、脾臓、及びＢＭにおけるＳＤＣ集団を増進する。

【0412】

実施例２８：ＳＤＣ集団の増加に起因する、アゴニストである抗ＦＬＴ３抗体による治療後の腫瘍増殖の減少。
６週齢の雄性Ｂ６マウスに対して癌細胞（例えば、ＭＣ３８結腸癌）をＴ０で注射する。処理群へと無作為化したマウスに対して、腫瘍移植後の複数日（例えば、５日目、７日目、１１日目、１５日目）に、アゴニストである抗ＦＬＴ３抗体またはＦｃ対照を腹腔内注射して注射処理する。当該技術分野において利用可能な情報及び通常技術を使用して投薬を決定する（例えば、Ｆｃ対照では２００ｕｇ／日、抗ＦＬＴ３抗体では４０ｕｇ、２０ｕｇ、２０ｕｇ、及び４０ｕｇ）。ノギスで腫瘍を測定し、腫瘍体積を決定する。抗ＦＬＴ３抗体による治療は、対照と比較して、腫瘍増殖を減少させる。抗ＦＬＴ３抗体による治療は、腫瘍におけるＳＤＣ存在量、ならびにｄＬＮ、脾臓、及びＢＭにおけるＳＤＣ集団を増進する。抗ＦＬＴ３Ｌアゴニスト抗体は、対照と比較して、実験マウスにおいて腫瘍に対する免疫応答を増進する。

【0413】

実施例２９：アゴニストである抗ＦＬＴ３抗体の同時投与を介した免疫療法の増進。
６週齢の雄性Ｂ６マウスに対して癌細胞（例えば、ＭＣ３８結腸癌）をＴ０で注射する。処理群へと無作為化したマウスに対して、腫瘍移植後の複数日（例えば、５日目、７日目、１１日目、１５日目）に、抗ＦＬＴ３抗体またはＰＢＳ対照を腹腔内、静脈内、及びまたは皮下に注射して注射処理する。マウスは、免疫療法を以前に受けたことがあるか、現在受けているか、またはこれから受けることになる。免疫療法には、チェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、Ｔ細胞のチェックポイント阻害物質を抑制する免疫療法、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、養子Ｔ細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、樹状細胞ワクチン、単球ワクチン、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質、ＢｉＴＥ抗原結合タンパク質、トール様受容体リガンド、ならびに／またはサイトカインが含まれ得る。当該技術分野において利用可能な情報及び通常技術を使用して投薬を決定する（例えば、１００ｕｌのＰＢＳに１０ｕｇ）。ノギスで腫瘍を測定し、腫瘍体積を決定する。免疫療法と併せて抗ＦＬＴ３抗体を同時投与することで、非同時投与対照（例えば、単独療法）と比較して、腫瘍増殖の減少が増進する。免疫療法と併せて抗ＦＬＴ３抗体を同時投与することで、非同時投与対照（例えば、単独療法）と比較して、腫瘍に対する免疫応答が増進する。

【0414】

実施例３０：ヒト細胞でのＮＳＭタンパク質の発現。
図２１は、原発性ヒトＨＮＳＣ腫瘍組織において、ＴＲＥＭ２タンパク質の発現がＮＳＭ集団（ＣＤ１４＋ＴＡＭ）に限定されており、ＳＤＣ（ＢＤＣＡ３＋ＤＣ）を含むＣＤ１４陰性ＣＤ１１ｃ陽性細胞ではほとんど発現していないか、または全く発現していないことを示す。ＴＲＥＭ２に特異的な市販抗体（ＲｎＤ、クローン２３７９２０）による染色を、消化したヒトＨＮＳＣ腫瘍組織に対して実施し、二次対照染色（抗ラットＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と比較して、フローサイトメトリーによって分析した。この図は、ヒト腫瘍組織において、ＮＳＭ細胞でＮＳＭ遺伝子産物が特異的に発現しており、ＳＤＣ細胞では発現していないことを示す。集団は、生存、ＣＤ４５＋、系譜陰性、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ＋でゲートし、ＣＤ１４の発現によって分割した。

【0415】

本発明について、具体的に示すと共に、好ましい実施形態及びさまざまな代替の実施形態を参照しながら記載したが、関連技術分野の当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細におけるさまざまな変更が、それらの中で実施可能であることを理解するであろう。

【0416】

本明細書の本文内で引用した参考文献、公開特許、及び特許出願はすべて、それらの全体が、参照によって、すべての目的を対象として本明細書に組み込まれる。
配列
（表ＡＡ）

・本明細書に開示のＮＣＢＩ受入番号及び関連配列はすべて、２０１５年９月２５日時点で公的に利用可能なＮＣＢＩのウェブサイトを通して利用可能である。

（表ＢＢ）それぞれの抗ＬＩＬＲＢ４クローン１のＣＤＲ、可変、及び全長の配列

【0417】

参考文献

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]