特許 6812346 ｍＲＮＡを効率よく生体内に送達できるポリイオンコンプレックス並びにこれを用いた関節症の治療薬および治療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6812346

(24)【登録日】2020年12月18日

(45)【発行日】2021年1月13日

(54)【発明の名称】ｍＲＮＡを効率よく生体内に送達できるポリイオンコンプレックス並びにこれを用いた関節症の治療薬および治療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20201228BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20201228BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20201228BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20201228BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20201228BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20201228BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20201228BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20201228BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7105

   A61K48/00

   A61P19/02

   A61K47/34

   A61K47/18

   A61K47/42

   C07K14/47ZNA

   C12N15/12

【請求項の数】8

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2017-532572(P2017-532572)

(86)(22)【出願日】2016年7月29日

(86)【国際出願番号】JP2016072322

(87)【国際公開番号】WO2017022665

(87)【国際公開日】20170209

【審査請求日】2019年6月6日

(31)【優先権主張番号】特願2015-151564(P2015-151564)

(32)【優先日】2015年7月31日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】597144679

【氏名又は名称】ナノキャリア株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】位▲高▼ 啓史

(72)【発明者】

【氏名】大庭 伸介

(72)【発明者】

【氏名】鄭 雄一

(72)【発明者】

【氏名】片岡 一則

【審査官】 星 功介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／１２１９２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 UCHIDA, Satoshi et al.，In Vivo Messenger RNA Introduction into the Central Nervous System Using Polyplex Nanomicelle，PLOS ONE，2013.02.13, Vol.8, e56220，p.1-9，ISSN 1932-6203

【文献】 BABA, Miyuki et al.，Treatment of neurological disorders by introducing mRNA in vivo using polyplex nanomicelles，Journal of Controlled Release，2015.01.17, Vol.201，p.41-48，ISSN 0168-3659

【文献】 UCHIDA, Hirokuni et al.，Modulated Protonation of Side Chain Aminoethylene Repeats in N-Substituted Polyaspartamides Promotes，Journal of the American Chemical Society，2014, Vol.136，p.12396-12405，ISSN 0002-7863

【文献】 American Journal of Translational Research，2014, Vol.6, No.6，pp.736-745

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

Ａ６１Ｋ ４８／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カチオン性ポリマーとｍＲＮＡとを含んでなる、ポリイオンコンプレックスであって、
カチオン性ポリマーが、カチオン性非天然アミノ酸をモノマー単位として含む重合体であり、カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として、−（ＮＨ−（ＣＨ₂）₂）_p−ＮＨ₂で表される基｛ここで、ｐは２、３または４である｝を有するアミノ酸である、ポリイオンコンプレックスを含む、変形性関節症またはリウマチ性関節炎を処置することに用いるための医薬組成物であって、
ｍＲＮＡが、Ｒｕｎｔ関連転写因子１（Ｒｕｎｘ１）、コア結合因子ベータ（Ｃｂｆｂｅｔａ）、性決定ボックス９（Ｓｏｘ９）、およびプロテオグリカン４からなる群から選択される関節形成を促進する因子をコードするものである、医薬組成物。

【請求項2】

カチオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールとのブロック共重合体である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

カチオン性ポリマーが、下記一般式（Ｉ）：

【化1】

｛式中、
Ｒ¹は、ポリエチレングリコールであり、ポリエチレングリコールと隣り合うアミノ酸とはリンカーを介して結合してもよく、
Ｒ²は、メチレンまたはエチレンであり、
Ｒ³は、−（ＮＨ−（ＣＨ₂）₂）_p−ＮＨ₂で表される基であり、ｐは、２、３または４であり、
Ｒ⁴は、水素、保護基、疎水基、または重合性基であり、
Ｘは、カチオン性天然アミノ酸であり、
ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ₁は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ₃は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ−ｎ₁−ｎ₃は、０以上の整数であり、式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい｝で表される、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

ｍＲＮＡが、Ｒｕｎｘ１をコードするものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

ｐが、３または４である、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

ｐが、４である、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

２日に１回または３日に１回投与することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

７日に１回投与することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の参照】

【0001】

本願は、特願２０１５−１５１５６４号（出願日：２０１５年７月３１日）の優先権の利益を享受する出願であり、その内容の全体が引用されることにより本願に組込まれる。

【技術分野】

【0002】

本発明は、ｍＲＮＡを効率よく生体内に送達できるポリイオンコンプレックス並びにこれを用いた関節症の治療薬および治療法に関する。

【背景技術】

【0003】

体内の好適な箇所に薬剤を送り届けるドラッグデリバリーシステムは、副作用の少ない新しい医薬を提供するものとして研究開発が行われている。その中で、ポリイオンコンプレックス（以下、「ＰＩＣ」ともいう）を用いたドラックデリバリーシステムは、ナノミセルに薬物を包接させて疾患部位特異的に薬物を送達することが可能な技術として注目を集めている。

【0004】

ＰＩＣを応用した技術として、特に核酸を副作用少なく体内に送達できるシステムが開発されてきた（特許文献１および２）。特許文献１および２では、ＤＮＡと新しいカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスが発明者らにより開発されている。また、ＲＮＡとカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスも発明者らにより発表されている（非特許文献１）。

【0005】

変形性関節症（ＯＡ）は、慢性の分解性関節疾患であり、軟骨組織の合成と分解のバランスが崩れることによって引き起こされる（非特許文献２）。変形性関節症は、高齢者における主要な健康問題である（非特許文献３）。しかしながら、変形性関節症の病態修正薬（ＤＭＯＡＤ）は未だ臨床用途では開発されていない（非特許文献４および５）。

【0006】

Ｒｕｎｘ１は、胚および成体において軟骨形成を制御することで知られている（非特許文献６および７）。２つの異なるＤＭＯＡＤ候補化合物が、Ｒｕｎｘ１を介した治療効果を有することが明らかとなってきている（非特許文献８および９）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特許第４５３５２２９号公報

【特許文献2】特許第５０６１３４９号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】H. Uchida et al., Journal of the American Chemical Society 136, 12396-12405 (2014)

【非特許文献2】G. Nuki, Z Rheumatol, 58, 142-147 (1999)

【非特許文献3】D. T. Felson et al., Annals of Internal Medicine 133, 635-646 (2000)

【非特許文献4】Z. Jotanovic et al., Current drug targets 15, 635-661 (2014)

【非特許文献5】D. J. Hunter, Nat Rev Rheumatol 7, 13-22 (2011)

【非特許文献6】A. Kimura et al., Development. (England, 2010), vol. 137, pp. 1159-1167

【非特許文献7】K. T. LeBlanc et al., J. Cell. Physiol., 230 (2), pp. 440-448 (2015)

【非特許文献8】F. Yano et al., Ann Rheum Dis 72, 748-753 (2013)

【非特許文献9】K. Johnson et al., Science 336, 717-721 (2012)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、ｍＲＮＡを効率よく生体内に送達できるポリイオンコンプレックス並びにこれを用いた関節症の治療薬および治療法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、カチオン性ポリマーとして、非天然アミノ酸をモノマー単位として含む重合体であり、非天然アミノ酸は、側鎖として、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは２、３または４である｝を有するカチオン性ポリマーと、ｍＲＮＡとを含むポリイオンコンプレックスが、ｍＲＮＡを長時間持続的に高発現させることを明らかにした。本発明者らは、変形性関節症を、上記カチオン性ポリマーとＲｕｎｘ１のｍＲＮＡとを含むポリイオンコンプレックスを投与することにより処置できることを明らかにした。本発明は、これらの知見に基づくものである。

【0011】

本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）カチオン性ポリマーとｍＲＮＡとを含んでなる、ポリイオンコンプレックスであって、
カチオン性ポリマーが、カチオン性非天然アミノ酸をモノマー単位として含む重合体であり、カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは２、３または４である｝を有するアミノ酸である、ポリイオンコンプレックス。
（２）カチオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールとのブロック共重合体である、上記（１）に記載のポリイオンコンプレックス。
（３）カチオン性ポリマーが、下記一般式（Ｉ）：

【化1】

｛式中、
Ｒ^１は、ポリエチレングリコールであり、ポリエチレングリコールと隣り合うアミノ酸とはリンカーを介して結合してもよく、
Ｒ^２は、メチレンまたはエチレンであり、
Ｒ^３は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基であり、ｐは、２、３または４であり、
Ｒ^４は、水素、保護基、疎水基、または重合性基であり、
Ｘは、カチオン性天然アミノ酸であり、
ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ_１は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ_３は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ−ｎ_１−ｎ_３は、０以上の整数であり、式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい｝で表される、上記（１）または（２）に記載のポリイオンコンプレックス。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを含んでなる、関節症を処置するための医薬組成物であって、
ｍＲＮＡが、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡである、医薬組成物。
（５）ｐが、３または４である、上記（４）に記載の医薬組成物。
（６）ｐが、４である、上記（５）に記載の医薬組成物。
（７）２日に１回または３日に１回投与することを特徴とする、上記（４）〜（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（８）７日に１回投与することを特徴とする、上記（５）または（６）に記載の医薬組成物。
（９）関節症が、変形性関節症またはリウマチ性関節炎である、上記（４）〜（８）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１０）上記（３）に記載のポリイオンコンプレックスであって、ｐが３または４であるポリイオンコンプレックスを含む、ｍＲＮＡの細胞内への送達剤。
（１１）ｐが４である、上記（１０）に記載の送達剤。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、関節内投与したルシフェラーゼｍＲＮＡの発現を示す。

【0013】

【図2】図２は、関節内投与したルシフェラーゼｍＲＮＡの発現量の経時的推移を示す。

【0014】

【図3】図３は、変形性関節症に対するＲｕｎｘ１のｍＲＮＡの投与の影響を示す。図３では、カチオン性ポリマーとしてｐが２であるポリマーを用いている。

【0015】

【図4】図４は、変形性関節症に対するＲｕｎｘ１のｍＲＮＡの投与の影響を示す。図４では、カチオン性ポリマーとしてｐが３であるポリマーを用いている。

【0016】

【図5】図５は、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群における様々なマーカー遺伝子の発現とＴＵＮＥＬ法による細胞死への影響を示す。

【発明の具体的な説明】

【0017】

本発明のポリイオンコンプレックスは、（ｉ）カチオン性ポリマーを含んでなるブロック共重合体と、（ｉｉ）ｍＲＮＡとがポリイオンコンプレックスとを少なくとも含んでなるものである。本発明のポリイオンコンプレックスにおいて、カチオン性ポリマーは、非天然アミノ酸をモノマー単位として含む重合体であり、非天然アミノ酸は、側鎖として、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは２、３または４である｝を有する点に特徴がある。ｐは、好ましくは３または４であり、最も好ましくは３である。カチオン性ポリマーは、ポリエチレングリコールブロックとブロック共重合体を形成したものであってもよい。（ｉ）の共重合体と（ｉｉ）のｍＲＮＡは溶液中でポリイオンコンプレックスを形成している。本発明のポリイオンコンプレックスは、溶液中、好ましくは水溶液中に提供され得る。

【0018】

本発明のポリイオンコンプレックスは、カチオン性ポリマーとｍＲＮＡとを含み、ナノミセル形態を取ると考えられる。従って、本発明のポリイオンコンプレックスは、本明細書では、ポリイオンコンプレックス型ミセルと言うことがある。

【0019】

本明細書では、ｍＲＮＡとは、メッセンジャーＲＮＡを意味する。

【0020】

本発明のポリイオンコンプレックスでは、ｍＲＮＡ中のシチジンおよびウリジンは修飾されていてもよい。修飾されたシチジンとしては、例えば、５−メチル−シチジンが挙げられ、修飾したウリジンとしては、シュードウリジンおよび２−チオ−シチジンが挙げられる。修飾シチジンおよびウリジンは、全シチジンおよびウリジンの１０モル％以上、２０モル％以上、または３０モル％以上含まれていればよい。

【0021】

本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。

【0022】

本発明では、カチオン性ポリマーは、例えば、カチオン性天然アミノ酸および／またはカチオン性非天然アミノ酸をモノマー単位として含んでいてもよい。ここで、カチオン性天然アミノ酸としては、好ましくはヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンが挙げられ、より好ましくはアルギニン、オルニチンおよびリジンが挙げられ、さらに好ましくはオルニチンおよびリジンが挙げられ、さらにより好ましくはリジンが挙げられる。

【0023】

本発明では、カチオン性ポリマーにおいて、非天然アミノ酸をモノマー単位とする重合体部分は、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸をモノマー単位として含む重合体に、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは２、３または４である｝を導入することにより得ることができる。当業者であれば、アスパラギン酸またはグルタミン酸をモノマー単位として含む重合体とジエチルトリアミン、トリエチルテトラアミンまたはテトラエチルペンタアミンを反応させることにより、この非天然アミノ酸をモノマー単位とする重合体部分を得ることができる。

【0024】

本発明の好ましい態様では、カチオン性ポリマーは、下記一般式（Ｉ）：

【化1】

｛式中、
Ｒ^１は、ポリエチレングリコールであり、ポリエチレングリコールと隣り合うアミノ酸とはリンカーを介して結合してもよく、
Ｒ^２は、メチレンまたはエチレンであり、
Ｒ^３は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基であり、ｐは、２、３または４であり、
Ｒ^４は、水素、保護基、疎水基、または重合性基であり、
Ｘは、カチオン性アミノ酸であり、
ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ_１は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ_３は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ−ｎ_１−ｎ_３は、０以上の整数であり、式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい｝で表されるものとすることができる。

【0025】

上記式（Ｉ）において、ｐは、好ましくは３または４であり、最も好ましくは３である。

【0026】

上記式（Ｉ）において、保護基としては、Ｃ_１−６アルキルカルボニル基が挙げられ、好ましくはアセチル基であり、疎水性基としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレンおよびこれらの誘導体またはＣ_１−６アルキル基が挙げられ、重合性基としては、メタクリロイル基およびアクリロイル基が挙げられる。これらの保護基、疎水性基および重合性基をブロックコポリマーに導入する方法は当業者に周知である。

【0027】

上記式（Ｉ）において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、平均重合度５〜２００００、好ましくは１０〜５０００、より好ましくは４０〜５００であるが、ブロックコポリマーとｍＲＮＡとのポリイオンコンプレックス形成が阻害されない限り特に限定されない。カチオン性ポリマーのＰＥＧの末端は、水酸基、メトキシ基または保護基で保護されていてもよい。

【0028】

上記式（Ｉ）において、リンカーは、例えば、−（ＣＨ_２）ｒ−ＮＨ−｛ここでｒは、１〜５のいずれかの整数である。｝または−（ＣＨ_２）ｓ−ＣＯ−｛ここでｓは、１〜５のいずれかの整数である。｝とすることができ、好ましくはペプチド結合により式（Ｉ）の隣り合うアミノ酸と結合することができる。また、リンカーは、好ましくは、ＰＥＧのメチレン側でＰＥＧとＰＥＧのＯ原子を介して結合していてもよい。

【0029】

上記式（Ｉ）において、ｎは、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、ｍは、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、ｍ＋ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、２〜５００のいずれかの整数である。

【0030】

本発明のある態様では、カチオン性ポリマーは、ＰＥＧ−リンカー−ポリカチオンブロックのブロック共重合体をカチオン性ポリマー｛ここで、ＰＥＧ、リンカーおよびポリカチオンブロックは、上記で定義される通りである。｝とすることができる。

【0031】

本発明者らは、ポリイオンコンプレックスの形成に用いるカチオン性ポリマーが、側鎖として、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは２、３または４である｝を有するモノマー単位を含む重合体である場合に、ｍＲＮＡが長期に体内で存在しうること、特にｐが３または４である場合に、体内でｍＲＮＡが顕著に長期間持続的に高発現することを見いだした。従って、本発明において、カチオン性ポリマーは、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは２、３または４である｝を側鎖に有するモノマー単位を含むものであり、ｐは、より好ましくは３または４であり、さらに好ましくは３である、カチオン性ポリマーとすることができる。

【0032】

本発明者らは、本発明のポリイオンコンプレックスにおいて、ｍＲＮＡをＲｕｎｘ１のｍＲＮＡとしてこれを関節症モデル動物に投与したところ、Ｒｕｎｘ１により関節症の症状の進展が遅くなること、または改善することを見いだした。

【0033】

従って、本発明では、本発明のポリイオンコンプレックスを含む、関節症を治療するための医薬組成物が提供される。本発明のある態様では、ｍＲＮＡが、関節形成を促進する因子のｍＲＮＡである。関節形成を促進する因子の非限定的な例としては、Ｒｕｎｔ関連転写因子１（Ｒｕｎｘ１）、コア結合因子ベータ（Ｃｂｆｂｅｔａ）、性決定ボックス９（Ｓｏｘ９）、およびプロテオグリカン４などの関節形成を促進する転写因子が挙げられる。

【0034】

本発明のある態様では、関節症は、変形性関節炎またはリウマチ性関節炎である。

【0035】

本発明のある態様では、式（Ｉ）において、Ｒ１が保護されたポリエチレングリコールであり、ｐが３または４であり、Ｒ４は水素または保護基であるカチオン性ポリマーとＲｕｎｘ１のｍＲＮＡとのポリイオンコンプレックス型ミセルを含む、関節症（例えば、変形性関節炎またはリウマチ性関節炎）の処置のための医薬組成物である。

【0036】

ある態様では、本発明の医薬組成物は、賦形剤をさらに含んでいてもよい。

【0037】

ある態様では、本発明の医薬組成物は、関節投与用に製剤化されたものとしてもよい。

【0038】

本発明の別の側面では、関節症を、その必要のある対象において処置する方法であって、本発明の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでなる、方法が提供される。

【0039】

本発明では、本発明の医薬組成物を対象に投与すると、ｍＲＮＡからのタンパク質の発現が対象内で少なくとも２日間、好ましくは３日間持続させることができる。従って、本発明の医薬組成物は、２日おき、または３日おきに投与することができる。

【0040】

また、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基において、ｐが３または４である場合には、対象内で少なくとも４日間、好ましくは８日間ｍＲＮＡを発現させることができる。従って、本発明の医薬組成物は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基において、ｐが３または４である場合には、例えば、３日に１回、好ましくは４日に１回、より好ましくは５日に１回、さらに好ましくは６日に１回、さらにより好ましくは１週間に１回投与することができる。これにより、投与回数が削減され、患者における治療負担が大幅に軽減される。

【実施例】

【0041】

実施例１：ポリイオンコンプレックスの作製
まず、ｍＲＮＡを含有するポリイオンコンプレックスを作製した。

【0042】

１−１．ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）、ｐＡｓｐ（ＴＥＴ）またはｐＡｓｐ（ＴＥＰ）をモノマー単位として含む重合体の合成
本実施例では、ポリアスパラギン酸の側鎖に−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは２、３または４である｝を導入することにより、表題の重合体を得た。具体的には、一方の末端がメトキシ基であり、他方の末端がアミノプロピル基である、数平均分子量２３，０００のポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ₂）（日本油脂から購入した）を塩化メチレンに溶解した。β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）（中央化製品社から購入した）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と上記塩化メチレン溶液の混合液に添加して溶解させ、反応溶液を得た。次いで、反応溶液を４０℃で２日間反応させて、ポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲによる解析から、ＰＢＬＡ部分の数平均分子量は約１４，０００であり、重合度は約６６であった。

【0043】

次に、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡにジエチレントリアミン、トリエチルテトラアミンおよびテトラエチルペンタアミンをそれぞれ反応させて、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＴＥＴ）ブロック共重合体、およびＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＴＥＰ）ブロック共重合体を得た。具体的には、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡをベンゼンに溶解し凍結乾燥させた。凍結乾燥したＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。その後、得られた溶液にジエチレントリアミン、トリエチルテトラアミンおよびテトラエチルペンタアミン（それぞれ和光純薬から購入した）をそれぞれ滴下し、４０℃のマイルドな無水条件で反応させて、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＴＥＴ）ブロック共重合体、およびＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＴＥＰ）ブロック共重合体を得た。得られたブロック共重合体は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により、鋭い単一の分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４）を示した。

【0044】

１−２．ｍＲＮＡの調製
まず、ヒトＲＵＮＸ１発現ベクターを調製した。ｐＵＣ５７ベクター内に、ＸｈｏＩおよびＢａｌＩ／ＳｍａＩ制限酵素切断部位で挟んだ３×ＦＬＡＧタグ付きヒトＲＵＮＸ１（GenBank登録番号：NM_001754.4；配列番号１）のオープンリーディングフレーム（以下、ＲＵＮＸ１−ＦＬという）をクローン化した。得られたＲＵＮＸ１−ＦＬをｐＳＰ１７ベクターに導入した。mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion, Carlsbad, CA, USA)を用いて直鎖状化したｐＳＰ１７ベクターからＴ７プロモーター駆動性にヒトＲＵＮＸ１−ＦＬの転写を行い、その後、poly(A) tail kit (Ambion)を用いて転写物にポリＡを付加した。転写されたｍＲＮＡをRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した。同様の方法で、ＥＧＦＰのｍＲＮＡを調製した。Ｌｕｃ２は、pGL4.13 (Promega, Madison, WI, USA)のタンパク質転写領域を用い、同様の方法でｍＲＮＡを調製した。

【0045】

１−３．ポリイオンコンプレックス型ミセルの調製
１−１で得られたそれぞれの共重合体溶液と各種ｍＲＮＡ溶液とを別々に１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．３）中で混合して、ポリイオンコンプレックスを得た。ｍＲＮＡの濃度は、２２５μｇ／ｍＬとし、共重合体中のアミノ酸残基のアミノ基（Ｎ）と核酸中のリン酸基（Ｐ）との混合比（Ｎ／Ｐ）は、８となるようにした。共重合体溶液とｍＲＮＡ溶液とは１：２の量比で混合されたので、ｍＲＮＡの濃度は１５０μｇ／ｍＬとなった。

【0046】

対照として、ｍＲＮＡのリポプレックスをLipofectamine（商標）2000 (Life technologies, Carlsbad, CA)を用い、製造者マニュアルに従って調製した。

【0047】

実施例２：ｍＲＮＡを含むポリイオンコンプレックス型ミセルの関節内投与試験
ＩＣＲマウス（８週齢）の正常なひざ関節に麻酔下で３μｇのＬｕｃ２を含むように調製された２０μＬのポリイオンコンプレックス型ミセルを投与した。１．５ｍｇのＤ−ルシフェリンを含む１００μＬの溶液を前記マウスに静脈内投与し、IVIS（商標）Imaging System (Xenogen, Alameda, CA, US)を用いて、様々な時点（ミセル投与後２４時間、４８時間、または９６時間）でルシフェラーゼの関節内での発現を確認した。

【0048】

関節におけるルシフェラーゼの発現は、関節投与から１日後には観察できた（図１および２）。

【0049】

ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）をカチオン性ポリマーとして用いた場合には、発現量は低下したものの、２日後にもルシフェラーゼの発現が確認できた（図１Ａ）。

【0050】

ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＴ）をカチオン性ポリマーとして用いた場合には、発現が少なくとも４日間持続し、発現量も維持された（図１Ｂ）。発現量は低下したものの、投与から８日後にもルシフェラーゼの発現が確認できた（図１Ｂ）。ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＰ）については写真は掲載しないが、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＴ）と同様に少なくとも４日間は発現が持続し、投与から８日後でもルシフェラーゼの発現が確認できた（データ非掲載）。

【0051】

得られた結果から、ルシフェラーゼの発現量を定量するために、一秒あたりのフォトンカウントを算出した（図２）。図２ＡおよびＢによれば、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）は、少なくとも２日間はｍＲＮＡの発現を持続させた。また、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＴ）は、投与後１日目からルシフェラーゼが高発現させたが、驚くべきことに、２日目、４日目で発現量を増加させ、少なくとも８日目まで発現が持続させた（図２ＡおよびＢ）。さらに、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＰ）は、投与から１〜２日後にルシフェラーゼを高発現させ、その後は、発現量は低下させたものの、発現を投与から８日後まで持続させた（図２Ａ）。

【0052】

このように、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＴ）およびＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＰ）はいずれも、生体内でｍＲＮＡを少なくとも２日間は高発現させることができた。また、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＴ）およびＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＰ）は、生体内でｍＲＮＡを少なくとも８日間は高発現させることができた。

【0053】

次に、本実施例で用いたカチオン性ポリマーによるｍＲＮＡの軟骨への送達と、それによる毒性の有無を確認した。

【0054】

ＥＧＦＰのｍＲＮＡ（３μｇ）とＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を含む２０μＬのポリイオンコンプレックス型ミセルをマウスの正常なひざに関節内投与した。対照として、２０μＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を同様にマウスの正常なひざに関節内投与した。投与から２４時間後、ひざを組織学的解析に供した。

【0055】

ひざの組織学的切片を作製し、抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫組織学によりＥＧＦＰ ｍＲＮＡのひざ関節内での発現を確認した。すると、ＥＧＦＰタンパク質は、関節軟骨の表層と中央部で発現した。また、ＴＵＮＥＬ法を用いて常法により、関節軟骨での細胞死の程度を観察したところ、ポリイオンコンプレックス型ミセルを投与した群と、ＰＢＳを投与した群とで差は見られなかった。このことから、本実施例で用いたポリイオンコンプレックス型ミセルは、生体内（例えば、ひざ関節内）でｍＲＮＡを発現させることが可能であること、ｍＲＮＡを発現させる用量で投与しても毒性を示さないことが明らかとなった。ｍＲＮＡは、高い免疫原性を有することで知られているが、ｍＲＮＡが有する抗原性に起因する問題は観察した限り見られなかった。

【0056】

実施例３：変形性関節症モデル動物における変形性関節症の治療
現在までのところ、ｍＲＮＡの生体内への送達とその持続的発現が困難であることから、生体における疾患の治療には高い障壁が存在した。実施例２により、本発明のポリイオンコンプレックスを用いると、生体内でｍＲＮＡを長期間持続的に高発現させることができた。そこで、本実施例では、本発明のポリイオンコンプレックスを用いて疾患の治療を試みた。

【0057】

変形性関節症モデル動物としては、変形性関節症モデルマウスを用いた。このモデルマウスは、ひざの内側側副靭帯と内側半月を手術で除去することにより作製した（S. Kamekura et al., Osteoarthritis Cartilage 13, 632-641 (2005)を参照）。変形性関節症は、術後１ヶ月で誘導された。組織学的ＯＡＲＳＩスコアリングシステムにより変形性関節症の重篤度を評価した（S. S. Glasson et al., 2010 Osteoarthritis Research Society International. Published by Elsevier Ltd, England, vol. 18 Suppl 3, pp. S17-23 (2010)を参照）。

【0058】

関節形成を促進する因子として、Ｒｕｎｘ１を選択し、実施例１に記載された通りに、そのｍＲＮＡとＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）と混合してポリイオンコンプレックス型ミセルを形成させた。得られたミセル溶液２０μＬ（すなわち、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡとして３μｇ）を術後１ヶ月の変形性関節症マウスのひざに３日に１回の頻度で１ヶ月間投与した。陰性対照としては、ｍＲＮＡとしてＥＧＦＰを用いたポリイオンコンプレックス型ミセルを術後１ヶ月の変形性関節症マウスのひざに３日に１回の頻度で１ヶ月間投与した。

【0059】

投与１ヶ月後で、陰性対照では、サフラニン−Ｏを用いて染色した組織切片において典型的な変形性関節症の症状が見られた。観察された症状としては、骨棘（こつきょく）および軟骨分解が挙げられ、これらは関節軟骨の厚みの減少および染色強度とその構造の破壊により証明された（図３Ａ）。これに対して、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡを導入した群では、変形性関節症の表現型が抑制される傾向を示し、特に骨棘形成において顕著であった（図３Ａ）。

【0060】

免疫組織学により、手術から２ヶ月後（すなわち投与完了から１ヶ月後）のひざにおけるＲｕｎｘ１タンパク質の発現を確認した。マウスを安楽死させ、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで環流して固定した。ひざ関節を回収し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳでさらに一晩固定し、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳを用いて脱カルシウム処理した。次いでひざ関節をパラフィン包埋し、７μｍ厚の正面切片を作製した。

【0061】

切片を抗Flag抗体 (1:100; F1804, M2, Sigma-Aldrich), 抗GFP抗体 (1:500; ab290, Abcam, Cambridge, MA), 抗Runx1抗体 (1:100; ab23980, Abcam), 抗Sox9抗体 (1:200; sc20095, Santa Cruz Biotechnology), 抗PCNA抗体 (1:1000; 2586s, Cell Signaling Technology)と、CSAII Biotin-free Tyramide Signal Amplication System (Dako, Glostrup, Denmark)とを組み合わせて染色した。また、切片は、抗タイプＸコラーゲン抗体(1:500; LB-0092, LSL-Cosmo Bio co., ltd., Tokyo, Japan)、抗タイプＩＩコラーゲン抗体(1:500; LB-1297, LSL-Cosmo Bio co., ltd.)、抗ＩＬ−１β抗体(1:100; sc7884, Santa Cruz Biotechnology)、および抗ＭＭＰ−１３抗体(1:500; mab13426, Millipore)でも染色した。いずれの切片もメチルグリーンで対比染色した。

【0062】

その結果、Ｒｕｎｘ１タンパク質は関節軟骨において強く発現し、骨棘様領域において発現は特に顕著であった（図３Ｂ）。関節症の重篤度を評価したところ、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群では、陰性対照群と比較して重篤度が低下した（図３Ｃ）。

【0063】

次に、カチオン性ポリマーとして、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の代わりに、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＴＥＴ）を用いる以外は上記と同様に変形性関節症の治療を試みた。

【0064】

サフラニン−Ｏを用いて染色した切片から、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群では、ＥＧＦＰ投与対照群と比較して、変形性関節症が抑制された（図４Ａ）。また、Ｒｕｎｘ１タンパク質の発現は、関節軟骨において強く観察された（データ非掲載）。さらに、免疫組織学的観察結果から、ＥＧＦＰおよびＲｕｎｘ１タンパク質が、関節軟骨で強く発現した（図４Ｂ）。そして、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群では、変形性関節症と骨棘の形成とが、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群において、陰性対照群と対比して統計学的に有意（ｐ＜０．０５）に抑制できた（図４Ｃ）。

【0065】

さらに、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群と陰性対照群とで各種因子の発現量を確認した。

【0066】

Ｓｏｘ９は、胚および成体において軟骨への分化と維持のマスター転写因子であるが、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群では陰性対照群よりも関節軟骨細胞において強く発現した（図５Ａ上段左パネル）。タイプＩＩコラーゲンは、主要な軟骨組織マトリックスタンパク質であるが、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群では陰性対照群よりも強く発現した（図５Ａ上段中央パネル）。さらに、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）も、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群において陰性対照群よりも強く発現した（図５上段右パネル）。このことは、Ｒｕｎｘ１が軟骨細胞の初期分化を促進する働きを有していることを示唆する。

【0067】

これに対して、タイプＸコラーゲンやＭＭＰ１３は、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群と陰性対照群とで大きな違いは認められなかった（図５下段左パネルおよび下段中央パネル）。ＩＬ−１βは、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群において陰性対照群よりも発現量が低かった（図５下段右パネル）。

【0068】

Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与のアポトーシスへの影響をＴＵＮＥＬ法により分析した。しかしながら、Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡ投与群と陰性対照群とで変形性関節症の関節における細胞死において大きな差は認められなかった（図５ＣおよびＤ）。

【0069】

リウマチ性関節炎とＲｕｎｘ１との関係が知られ、リウマチ性関節炎においては病態がＩＬ−１βを介することも知られている。本実施例で、Ｒｕｎｘ１が関節においてＩＬ−１βの発現を大きく抑制できたことから、リウマチ性関節炎も本実施例の手法により処置ができることが明らかである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]