特許 6812436 抗ウイルス薬およびウイルス感染症の治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6812436

(24)【登録日】2020年12月18日

(45)【発行日】2021年1月13日

(54)【発明の名称】抗ウイルス薬およびウイルス感染症の治療方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/78 20060101AFI20201228BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20201228BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20201228BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20201228BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20201228BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20201228BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20201228BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20201228BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20201228BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20201228BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20201228BHJP

   C08F 16/34 20060101ALI20201228BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/78

   A61P31/12

   A61P31/18

   A61P31/16

   A61P31/22

   A61P31/14

   A61P31/20

   A61K9/08

   A61K9/20

   A61K9/10

   A61K9/14

   C08F16/34

【請求項の数】16

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2018-528557(P2018-528557)

(86)(22)【出願日】2017年2月17日

(65)【公表番号】特表2019-510731(P2019-510731A)

(43)【公表日】2019年4月18日

(86)【国際出願番号】AU2017050139

(87)【国際公開番号】WO2017139849

(87)【国際公開日】20170824

【審査請求日】2019年12月19日

(31)【優先権主張番号】2016900595

(32)【優先日】2016年2月19日

(33)【優先権主張国】AU

(31)【優先権主張番号】2016902715

(32)【優先日】2016年7月11日

(33)【優先権主張国】AU

(73)【特許権者】

【識別番号】517173123

【氏名又は名称】レッセ ファーマシューティカルズ リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｒｅｃｃｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100181847

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 かおり

(72)【発明者】

【氏名】グラハム ジョン ハミルトン メルローズ

(72)【発明者】

【氏名】ミシェル ケリン デリッツィア

【審査官】 松村 真里

(56)【参考文献】

【文献】 特許第６６０５６０２（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特表２０１１−５０３２６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０４７４２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０９−２３５３４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０２−５０１７５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５２３４２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２１６５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５８−０７４６７６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アクロレイン由来セグメントおよびポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントを含み、１０００ダルトン以下の分子量を有する共重合体を含む、対象における非経口ウイルス感染症の治療のための組成物。

【請求項2】

前記アクロレイン由来セグメントは、２以上のアクロレイン残基を含むポリアクロレインオリゴマーである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記共重合体は、３００〜１０００ダルトンの分子量を有する、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントは、２００〜６００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。

【請求項5】

前記ポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントは、２００〜４００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。

【請求項6】

前記ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコールである、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。

【請求項7】

局所投与用である、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。

【請求項8】

全身投与用である、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。

【請求項9】

経口投与用、吸入用、経皮送達用、または注射用である、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。

【請求項10】

経口投与用である、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。

【請求項11】

循環系または血流への注射用である、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。

【請求項12】

０．０１重量％〜２０重量％の範囲の水溶液としての投与で使用される、請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。

【請求項13】

錠剤、カプレット、シロップ、または液体の形態で経口投与用に使用される、請求項９に記載の組成物。

【請求項14】

前記共重合体は、１日あたりに体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の用量で、全身投与用に使用される、請求項１から１３のいずれかに記載の組成物。

【請求項15】

前記ウイルス感染症は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、肝炎、ロスリバー、およびヘルペスからなる群から選択される、請求項１から１４のいずれかに記載の組成物。

【請求項16】

前記ウイルス感染症は、インフルエンザである、請求項１から１５のいずれかに記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントとを含む共重合体であって、分子量が１５００ダルトン以下、好ましくは好ましくは１０００ダルトンまでである共重合体を使用した、ウイルス感染症、特に、非経口ウイルス感染症の治療方法、およびポリアルキレングリコールの水溶液中でのアクロレインの重合による共重合体の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

脂質エンベロープまたはコート（通常は疎水性）を有するウイルスは、重要なヒトおよび動物の病原体である。そのようなウイルスに関連する状態の例には、オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス）、ＨＩＶ、肝炎、ロスリバーおよびヘルペスが含まれる。ヘルペスウィルスは、軽度の粘膜潰瘍から免疫不全患者の生命を脅かす疾患まで、一次感染と二次感染の両方を引き起こす。ヘルペスグループには、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ヘルペスゾスター（鶏痘／帯状疱疹）、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペス６，７（Roseola、移植後感染）およびヘルペス８（カポジ肉腫に関連する）が含まれる。

【0003】

ヘルペス型ウイルスに感染した人は、典型的には、症状が経験される発生期と無症状潜伏期のサイクルに供される。潜伏期間中、ウイルスは神経節に存在し、非活動状態であり、患者は無症候性である。しかし、無症候性であっても、患者は依然として他人に感染させる可能性がある。これはウイルス流出と呼ばれる。ウイルスが再活性化されたときに症状が再発する可能性がある。再活性化は、多くの異なる事象によって誘発され得、免疫不全患者において特に問題である。

【0004】

当技術分野では、代替の抗ウイルス療法の必要性が存在する。本発明は、一組の実施形態において、これらの必要性に対処し、ウイルス感染を治療する方法を提供する。

【0005】

アクロレインは、その高い反応性のために身体組織に非常に損傷を与える。たばこ紙巻たばこの煙中のアクロレインガスと肺がんのリスクとの間にはつながりがある（Feng, Z; Hu W; Hu Y; Tang M（2006年10月）"Acrolein is a major cigarette-related lung cancer agent: Preferential binding at p53 mutational hotspots and inhibition of DNA repair". Proceedings of the National Academy of Sciences 103 (42): 15404-15409）。純粋なポリアクロレインは、単独でも有意な抗ウイルス活性を示さないことが知られている。しかしながら、米国特許第5290894号（Melroseら）を含むいくつかの特許は、消化管を介したウイルス感染の治療のための潜在的な抗ウイルス剤としての修飾ポリアクロレインの調製および使用を開示している。この種のポリアクロレインのさらなる例は、米国特許第6723336号、米国特許第7629002号、および米国特許第9119394号に記載されている。アクロレインは極度な反応性のモノマーであり、重合すると急速に高分子量の難治性のネットワークを形成する。通常、アニオン重合は、水を含まない溶媒中で実施され、高分子量ポリマーを形成するために迅速な重合を提供する。

【0006】

先行技術に記載されたポリマーの知覚される利点の１つは、それらの作用が胃腸管に限定されるように腸壁を貫通することができないことである。米国特許第9119394号（Melrose）には、アクロレインおよび／またはそのアセタールとアルカノールとの塩基触媒重合によって形成され得るポリアクロレインポリマーが記載されている。ポリマーは、膜、特に胃腸管の膜を通って移動する傾向が減少するという利点を有する。

【0007】

米国特許第6,060,571号明細書（Werleら）には、水系において消毒剤としての活性を提供するのに十分なアクロレインを放出するアクロレイン放出ポリマーが記載されている。そのようなポリマーは、水性媒体中に放出される有意なレベルのアクロレインの毒性のために、インビボでの使用には適していない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の背景についての議論は、本発明の文脈を説明するために含まれる。これは、言及された資料のいずれかが、請求項の優先日に公表された、既知の、または一般的な知識の一部であることを認めたものとはみなされない。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントとを含む低分子量共重合体が、共重合体の分子量を１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下に制限するように調製できることを見出した。さらに、低分子量共重合体が強力な抗ウイルス活性を提供し、アクロレインモノマーの放出なしに非経口ウィルス感染症の治療に使用できることを見出した。事実、この活性は、より高分子量のアクロレインポリマーと比較して強化されている。

【0010】

１セットの実施形態によれば、対象におけるウイルス感染症の治療、制御または予防のための方法が提供され、この方法は、アクロレイン由来セグメントおよびポリアルキレングリコールオリゴマーセグメント（好ましくは、２００〜６００ダルトンの分子量）を含む共重合体を対象に投与することを含み、共重合体は１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下の分子量を有する。

【0011】

さらなる一組の実施形態によれば、インビボでの少なくとも１つの標的感染細胞を、アクロレイン由来セグメントおよびポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントを含む有効量の共重合体とを接触させる工程を含む、インビボでのウイルス感染症（好ましくは、非経口ウイルス感染症）の治療方法が提供され、共重合体は、１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下の分子量を有する。

【0012】

ウイルス感染症は、ヘルペス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルスおよびインフルエンザを含む被覆ウイルス（例えば、脂質被覆ウイルス）のような広範囲のウイルスによって引き起こされ得る。好ましくは、本発明の方法によって治療および／または制御されるウイルス感染症は、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、Vadcella Zosterウイルス（水痘または帯状疱疹の形態で）、ＨＣＭＶ、ＥＢＶ、ヘルペス６型、ヘルペス７型、およびヘルペス８型であり得る。

【0013】

別の実施形態において、ウイルスは、インフルエンザＡのようなインフルエンザウイルスである。

【0014】

さらに別の実施形態では、ウイルスはロスリバーウイルスである。

【0015】

本発明の方法は、免疫抑制個体におけるウイルス感染の治療に特に適している。本発明の方法は、他の抗ウイルス治療を伴う補助療法として使用することもできる。

【0016】

さらに別の態様では、少なくとも２０％ｗ／ｗの水および少なくとも４、好ましくは少なくとも１０のポリアルキレングリコール／アクロレインの重量比でポリアルキレングリコールオリゴマー（好ましくは分子量２００〜６００ダルトン）を含む水溶液中で、ｐＨ１２以下、すなわち、ｐＨが７〜１２のアルカリ触媒の条件下にて、アクロレインとポリアルキレングリコールオリゴマーを重合することを含む、アクロレイン由来セグメント（ポリアクロレインオリゴマーなど）とポリアルキレングリコールオリゴマーとを含む共重合体の製造方法が提供される。

【0017】

定義
「身体」という用語は、人間および／または動物の身体を意味する。「対象」という用語は対象であるそのような被験者を意味する。

【0018】

静脈内治療（略してＩＶ療法またはｉｖ療法）は、液体物質を静脈に直接注入することである。

【0019】

本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、そのままの消化管を通る以外の方法で体内に取り込まれることを意味する。すなわち、通常、胃または腸内ではない。

【0020】

「非経口ウイルス感染症」という用語は、胃腸管内ではなく体内で罹患したウイルス感染症を指す。

【0021】

用語「肺投与」は、吸入による本発明の製剤の肺への投与を指す。

【0022】

本明細書で使用する「吸入」という用語は、肺の肺胞への空気の摂取を指す。特定の例において、摂取は、吸入中に本発明の製剤を自己投与することによって、または呼吸器、例えば呼吸器の患者に呼吸器を介して投与することによって行うことができる。本発明の製剤に関して使用される「吸入」という用語は、「肺投与」と同義である。

【0023】

本明細書中で使用される「薬学的に許容可能な担体」という語句は、対象の共重合体の運搬または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒封入材料のような薬学的に許容される材料、組成物もしくはビヒクル、および／または１つの器官もしくは身体の部分から別の器官もしくは身体の部分への組成物を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者に過度に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末のトラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐薬ワックスのような賦形剤、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油ような油；グリコール、例えばプロピレングリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリオキシエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル等のエステル類；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；および医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質が挙げられる。

【0024】

この共重合体は、治療を提供するために治療上有効な量（または「薬学的に有効な量もしくは活性のある量」）で使用され得る。その量は、経口、筋肉内、静脈内、吸入または経皮投与などの投与様式に依存する。本明細書で使用する「治療上有効な量」という語句は、所望の抗ウイルス治療効果を生じるのに有効な共重合体組成物を含む共重合体および／または組成物、材料または組成物の量を意味する。

【0025】

アクロレイン由来セグメントという用語は、１つ以上のアクロレインモノマー残基を含む共重合体セグメントを指す。

【0026】

オリゴマー、ポリアルキレングリコールオリゴマーおよびポリアクロレインオリゴマーという用語は、少なくとも２つのモノマー単位、好ましくは少なくとも３つのモノマー単位からなるポリマーを意味する。オリゴマーは、典型的には、２〜２０個のモノマー単位を含み、一実施形態では、単位数は２〜１０である。

【0027】

用語「モノマー単位」および「モノマー残基」は、アクロレインおよびポリアルキレングリコールのような反応モノマーから誘導された共重合体中に存在する単位を指す。

【0028】

多分散指数は、ポリマーの重量平均分子量（Ｍ_ｗ）対ポリマーの数平均分子量（Ｍ_ｎ）の比である。ポリマーの重量平均分子量および数平均分子量は、高速液体クロマトグラフィーなどの分析方法によって決定することができる。重量平均分子量および数平均分子量が決定されると、多分散度指数は、重量平均分子量を数平均分子量で割ることによって（Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ）容易に計算される。仮説的に単分散のポリマーは、１.０００の多分散指数を有する。しかしながら、市販の樹脂などの典型的な市販ポリマーは、１０以上の多分散指数を有する。広い分子量分布を有するポリマーはより高い多分散指数を有し、狭い分子量分布を有するポリマーはより低い多分散指数を有する。

【0029】

本明細書を通じて、用語「含む（comprises）」または「含むこと（comprising）」またはその文法上の変形の使用は、記載された特徴、整数、ステップまたは構成要素の存在を特定するために用いられるが、特定されていない１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、構成要素またはそのグループの存在または追加を排除するものではない。
本発明の実施形態を図面を参照して説明する：

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】実施例３に記載される、濃度による阻害％の変化のＣＰＥアッセイ結果を示すグラフである。

【図2】実施例３に記載の実施例１の製剤の濃度（％）での％阻害の変動のＰＲＮＴアッセイ結果のグラフである。

【図3】本発明の共重合体で処置したグループ１と実施例４による第２グループの感染対照との２つのグループでウイルスに感染したマウスの生存率を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0031】

この治療方法は、セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメント（好ましくは分子量２００〜６００ダルトン）を含む共重合体を投与する工程を含み、共重合体は１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下の分子量を有する。

【0032】

アクロレイン由来セグメントは、１つ以上のアクロレインモノマー残基を含むこととしてもよい。一実施形態では、アクロレイン由来セグメントはポリアクロレインオリゴマーを含む。

【0033】

ポリアルキレングリコールは、ポリ（Ｃ１〜Ｃ４アルキレングリコール）またはその混合物または共重合体であってもよいが、一般に、ポリアルキレングリコールは、好ましくは２００〜６００ダルトンの範囲の分子量のポリエチレングリコールである。

【0034】

ポリエチレングリコールという用語は、好ましくは、ジエチレングリコールを含まないことは、当業者には理解されるであろう。平均分子量２００〜６００ダルトンのポリエチレングリコールには、名目上の平均分子量２００〜６００ダルトンのポリエチレングリコールを含み、平均分子量は、指定された値の１１０％以下で９０％以上（好ましくは１０５％以下９５％以上）である。ポリエチレングリコールは、式 H--[OCH₂CH₂]n--OHのものである。ｎの平均値は少なくとも３であり、一般に３〜１３である（平均は整数である必要はない）。ポリエチレングリコールは医薬グレードの商業的供給者から広く入手可能であり、平均分子量が指定された値の１０５％以下および９５％以上でないことを一般的に示す特定の名目上の分子量で販売されている。粘度および分子量測定の方法は、USP NF Official Standard of Volume 11180-1182 [2007 Edition]に開示されている。一組の実施形態において、ポリエチレングリコールの分子量は２００〜４００である。いくつかの実施形態では、エチレングリコールの特定の純粋オリゴマー、例えば、化合物の式：H--[OCH₂CH₂]n--OHを使用することが好ましく、ここで、ｎは３または４である。

【0035】

一組の実施形態において、共重合体の分子量（ここでは常に数平均分子量を意味する）は少なくとも３００ダルトン、好ましくは少なくとも４００ダルトン、例えば４００〜１５００ダルトンの範囲であり、より好ましくは分子量は４００〜１０００ダルトンの範囲である。

【0036】

治療は、予防的または治癒的であり得る。

【0037】

別の実施形態では、共重合体は、例えば、経口投与、吸入、経皮送達によって、または血流または筋肉内注射などの注射によって、または注射または注入などの静脈内治療によって全身投与される。約１０００ダルトン以下、特に約８００ダルトン以下の分子量の分子が、腹膜を横切って合理的に自由に通過することが一般に認められている。経口投与は、共重合体が腸壁を介して全身循環に吸収されることを必要とする。この実施形態では、経口投与される共重合体は、分子量が１０００ダルトン以下であり、例えば４００〜８００ダルトンの範囲の分子量であることが特に好ましい。本発明者らは、この分子量の共重合体が、経口投与された場合に全身循環中に輸送され、非経口ウイルス感染の治療を提供することを見出した。腸壁を介して吸収された共重合体の割合は、一般に、この範囲のより低い分子量の共重合体の方が大きい。

【0038】

共重合体は、経皮または経粘膜送達のために、エアロゾル、ゲル、局所フォームまたは軟膏として適用されるか、または皮膚または粘膜への適用のための包帯に含浸され得る。共重合体は、エアロゾル等を介した吸入として適用され得る。

【0039】

さらなる実施形態において、共重合体は、ポリマーのための浸透増強剤を含み得る組成物からの経皮送達によって投与される。パッチ、マイクロニードルまたは類似の装置を使用して経皮送達を増強することができる。

【0040】

本発明の組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のようなアジュバントを含有してもよい。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含むことによって保証され得る。また、砂糖、塩化ナトリウムなどの等張性を調整する薬剤を含むことが望ましい場合もある。注射用医薬形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤の包含によってもたらされ得る。

【0041】

別の好ましい実施形態では、医薬組成物は、皮下（ｓ．ｃ．）投与に適した形態である。

【0042】

経口投与に適した医薬剤形には、錠剤（被覆または非被覆）、カプセル（硬質または軟質シェル）、カプレット、丸薬、トローチ剤、シロップ剤、液剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤および懸濁剤、舌下錠剤、ウエハース、または頬パッチなどのパッチが挙げられる。

【0043】

共重合体は、可溶性であり、完全な１〜１４のｐＨ範囲にわたって可溶性のままであるので、水性組成物中に配合することができる。共重合体は、既知の薬学的に許容可能な担体および賦形剤を含む組成物で投与することができる。しかしながら、水性製剤は重要な利点を提供する。組成物は、治療される特定のウイルスおよび投与様式に応じて、広範囲の濃度の共重合体を含むことができる。一組の実施形態において、水性医薬組成物中の共重合体の濃度は、組成物の０．０１重量％〜２０重量％の範囲である。したがって、好ましい一組の実施形態において、共重合体は水溶液として投与される。

【0044】

組成物は、錠剤、カプレット、シロップまたは液体の形態で経口投与することができ、経口投与される用量は、ウイルスの重篤度および種類に依存するが、例えば、体重１ｋｇあたり一日１０ｍｇ〜５００ｍｇのような、体重１ｋｇあたり一日１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲であり得る。

【0045】

アクロレイン−共重合体が非経口疾患に対して活性であるという本明細書の知見は、それらの活性に関連すると考えられる作用機序のために予想されなかった。米国特許第6723336号は、アクロレインポリマーの抗菌活性を完全に消滅させるために追加のタンパク質を使用する。先行技術の焦点は、それらの経腸移行を防止するために、十分に高い分子量を有するアクロレイン−ポリマーの経口投与による胃腸管における感染症を治療することであった。実際、アクロレインモノマーの反応性は、アクロレインを重合させて約１，０００ダルトン以下の分子量を有する生成物を生成することが現在可能であると考えられていないようなものである。非経口疾患に対する投与も、それらの潜在的な毒性（血清タンパク質との反応を含む）の理由から意図的に避けられている。

【0046】

先行技術のポリアクロレインの製造では、重合のメカニズムはアニオン性であり、アニオンのクエンチングまたは生成物の解離を避けるために水分含量を最小限に抑える必要があると考えられていた。本発明者らは、単量体の比率、アクロレインおよびポリエチレングリコールの水による希釈を制御し、従来技術と比較して、ｐＨをより低い範囲に保持−ｐＨを１２．０以下、好ましくは１２．０〜７．０のｐＨ範囲に維持することによって、分子量を１０００ダルトン以下に制限し得ることを見出した。すなわち、重合の新しいメカニズムを達成するために、ｐＨ範囲は従来技術の重合でこれまで使用されていたものよりも２倍のｐＨ単位、すなわち１００倍低いヒドロキシルイオン濃度まで低下する。

【0047】

一組の実施形態において、本発明は、ポリエチレングリコール（好ましくは分子量２００〜６００ダルトン）を含む水溶液中のアクロレインの塩基触媒重合を含む、非経口ウイルス性疾患の治療のための共重合体の調製方法であって、ポリアルキレングリコール／アクロレインの比は少なくとも４、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０であり、水は組成物の少なくとも２０重量％の量で存在する方法を提供する。

【0048】

好ましい一組の実施形態において、本方法は、アクロレインの水溶液、好ましくはアクロレイン濃度が５０％ｗ／ｗ以下のアクロレインの水溶液を、少なくとも１０％ｗ／ｗの水を含み、ｐＨが１２．０以下、好ましくはｐＨ１１以下である、ポリエチレングリコールの水溶液に添加することを含む。

【0049】

さらにより好ましい実施形態では、アクロレインは、ｐＨ９〜１１のポリアルキレングリコールの水溶液に水溶液として添加される。

【0050】

概して、本発明者らは、本方法で使用される水性系において、１１．５以下（好ましくは１１以下）などの１２．０以下のような比較的低いｐＨが、アクロレインを重合させるために使用されるｐＨ１４までの従来技術のｐＨ範囲よりも有意な利点を提供することを見出した。相対的に高いｐＨは、先行技術において長期間にわたって使用されるように、酸化をもたらし、溶解性を改善するカルボキシル基を導入する。対照的に、本発明者らは、比較的高いｐＨでの長時間の加熱を必要とせずに、本発明の方法において溶解性が得られ、結果として、カルボニルおよび／またはカルボキシル含有量が非常に低く、典型的には、共重合体の０〜１０％であることを見出した。カルボニルまたはカルボキシル含有量の最小値は、雑多な起源のタンパク質との望ましくない反応または細菌の酸性および陰イオン性コーティングに対する反発の両方を最小限に抑えることによって、両方の場合において抗生物質の作用を増強すると考えられる。

【0051】

理論に拘泥するものではないが、本発明の方法では、アルカリの存在下でのアクロレインの重合は、このような有意な量の水の存在下で完全にアニオン性のメカニズムによって進行するのではなく、むしろ、重要な重合のフリーラジカルメカニズムを有すると考えられる。

【0052】

この結論は、以下の事実によって裏付けられている：（ａ）二重フリーラジカル、酸素の存在によって重合が促進されたこと（ｂ）溶媒の主成分である水がアニオンクエンチングであること（ｃ）重合は、周囲温度およびそれ以上の温度では顕著であり、速い、発熱性の、典型的なフリーラジカル阻害剤であるハイドロキノンによって阻害される−すべての観察は、イオン重合よりもフリーラジカル重合の典型である（Florey; Odian）。再び理論に縛られることなく、反応メカニズムは、酸素とヒドロキシルイオンとの間に開始剤−ラジカルが形成され、続いて、ポリエチレングリコール溶媒にラジカル転移して重合を開始し；その後、共重合体内のカルボニルに隣接する活性ラジカル部位で重合されたアクロレイン残基の数を制限するために溶媒−ヒドロキシルを含む溶媒−移送終了する、と考えられている。

【0053】

ポリアルキレングリコールオリゴマーは、連鎖移動および／または連鎖停止を提供し、それによって（水希釈と共に）全体のヒドロキシル含有量に直接比例する分子量を制限すると考えられている。

【0054】

概要として、合成のコア戦略は、先行技術の米国特許第9119394号のものとは異なり、結果として生じる共重合体生成物の２つのセグメントを、求核性マイケル付加よりもむしろフリーラジカル機構によって進めるために、理論により結合されることを望むことなく、考えられる機構によって結合させることである。これは、（ラジカル、酸素の存在を最大にすることによって）増殖するフリーラジカル活性中心の形成を最大にすることによって、および、求核性マイケル付加のための水素イオン欠乏活性中心の形成を最小限に抑え、ｐＨを最小限に抑えることによって行われる。

【0055】

活性共重合体は、アミノ酸モデルのシステイン（スルフヒドリル）またはスレオニン（ヒドロキシル）のいずれかとわずかな反応を示すことがＨＰＬＣによって示され、共重合体の抗病活性は、非共有結合、物理的疎水性の効果のみに対して、共重合体中の特定された近接炭素において、標的細胞膜の安定性に影響を及ぼす。修飾ポリアクロレイン中のカルボニル基のタンパク質との化学反応に依存する先行技術における作用機序は、したがって、本発明の共重合体の抗ウイルス活性に関与しているとは考えられていない。

【0056】

アクロレインポリマーとタンパク質との破壊的な反応性を教示する先行技術とは対照的に、本発明者らは、共重合体の抗ウイルス活性がタンパク質の存在によって有意に低下しないことを見出した。本発明者らは、共重合体の抗ウイルス活性が、毒性をもたらすタンパク質とのあらゆる血管内化学反応またはインビボ除去プロセスと競合する以上に十分に速いことを見出した。先行技術の見解では、一貫して、これらの観察および結論は、本明細書のように非経口的に共重合体（実施例１の共重合体など）を合成して使用することを進行するのに直観的に反している。

【0057】

本明細書に開示される共重合体は、従来技術のアクロレインポリマーよりもはるかに毒性の少ない血管内チャレンジを表す。本発明者らは、共重合体が低い多分散度で製造され得、低い多分散度は、好ましくは５未満、より好ましくは２未満、最も好ましくは１．５未満、さらにより好ましくは１．２未満の低い多分散性が、特に分子量が１０００未満、例えば４００〜１０００ダルトン、より好ましくは４００〜８００ダルトン、例えば４００〜６００ダルトンである場合に、共重合体の性能を高めることを見出した。本発明のポリマーは、約１の多分散指数を有する狭い対称かつ単一のポリマーとして調製することができる。以前に記載されたアクロレインポリマーは、概して、より高い多分散性を含有するか、またはWO 09/059350の実施例６のポリマーの場合、非常に高感度のＵＶ検出において、約１％および約８倍以上の広い範囲の低分子量ポリマー／残留物を含み、これらは屈折率検出から容易に検出できない。本明細書の共重合体は、単一に近い多分散性の狭い分子量分布で定量的に形成され得る。この共重合体は、従来技術の重度に加熱され自己酸化されたアクロレイン−ポリマーよりもはるかに少ない潜在的に有毒な汚染物質（残留涙石化アクロレインを含む、出発材料および副生成物）を含む。本発明の好ましい実施形態では、カルボニル含有量および塩基触媒による調製に使用されるｐＨの両方が、これまでにない最小限度であり、両方の因子を、特に、アクロレイン−ポリマーにおいて異常に急速であることを先行技術が見出している、カルボニルとのカニッツァーロ反応からの副生成物およびそれらの潜在的な毒性を最小限に抑えるために使用することができ、先行技術はアクロレイン−ポリマーにおいて異常に急速であることを見出した。

【0058】

共重合体が活動的な抗ウイルス活性を有することが見出された。これは、対象におけるウイルス感染症の新規で汎用的かつ成功した治療方法を表す。

【0059】

アクロレインモノマーの他に、アクリル酸、アクリルアミド、アクリロニトリル、塩化ビニル、スチレン、メタクリル酸、メチルメタクリレート、酢酸ビニル、ビニルピリジンおよびビニルピロリドンなどの他のモノマーは、本明細書に記載されるように、ポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントおよびアクロレイン由来セグメントを含む共重合体の調製においてさらなるモノマーとして使用され得る。追加のモノマーは、共重合体の抗ウイルス活性に有害ではない量で存在してもよい。モノマーの比は、共重合体の水溶性を維持するように選択することができ、他のモノマーの取り込みは、モノマー反応性を考慮した反応条件および相対モノマー濃度によって制御することができる。概して、他のモノマーは、共重合体のモノマー残基の１５モル％以下、好ましくは１０モル％以下、最も好ましくはポリアルキレングリコールおよびアクロレインモノマー残基のみからなることが好ましい。

【0060】

本発明の共重合体の特徴である疎水性機構は、以下を制御するプロセス工程によって達成される：分子量；ビリオンおよびウイルスに感染した細胞との抗ウイルス反応に対する親和性；タンパク質の存在下での抗ウイルス活性の増強；共重合体内のカルボニルおよびカルボキシル含有量の両方の最小化が含まれる。

【0061】

本明細書で提供される共重合体抗ウイルスは、一般に、他の化学療法に対して耐性であるか非耐性であるかに関わらず、幅広い種類のウイルスに対する有効性を提供する。

【0062】

好ましい一組の実施形態では、本発明の共重合体の製造方法は、以下の工程を含む：
ポリアルキレングリコール（好ましくは２００〜６００ダルトンの範囲での分子量のポリエチレングリコール）の弱塩基性（好ましくはｐＨが１２．０以下、より好ましくはｐＨが９〜１１）水溶液を提供し、
前記弱塩基性の溶液を激しく撹拌して空気を含ませ、
アクロレイン水溶液５０％ｗ／ｗ以下の濃度の水溶液（通常は防腐剤を含む）としてアクロレインを添加し（好ましくはある期間、例えば２分間、より好ましくは少なくとも５分間にわたってゆっくりと）、
反応温度を１０℃〜４０℃の範囲に維持し、
前記アクロレインのモノマーが消費されたら、酸を添加して９以下、好ましくは８以下のｐＨを提供する。

【0063】

得られる共重合体の分子量は、ポリアルキレングリコールの分子量によって制御され、そのヒドロキシル濃度に直接比例する。（重合は周囲温度で始まり、発熱性の重合が進行するにつれて（保存剤からの黄色の出現、次いで消失から明らかである）わずかに上昇する。）

【0064】

反応の間、好ましくは撹拌を継続し、必要な場合にのみ、ｐＨを弱塩基性（好ましくはｐＨ１２．０以下、より好ましくはｐＨ９〜１１）に維持する。分解／副反応を低下させ、生成物中のカルボニルまたはカルボキシル形成を減少させるために、より多くの塩基の添加およびその濃度を最小にする。

【0065】

最後に、溶液のｐＨを低下させることができる。好ましい一組の実施形態では、酸の添加によりｐＨをほぼ中性に調整する。アクロレインの極めて強い刺激臭は、概して、少なくとも９９％の収率で形成される共重合体生成物においてはもはや顕在しない。

【0066】

得られるアクロレイン−共重合体は、典型的には、２５０〜１０００ダルトン（３００〜１０００ダルトン、４００〜１０００ダルトンまたは４００〜８００ダルトンなど）の範囲の分子量を有する。共重合体は、ポリアクロレインの任意の含量から予想される濁りのないものである。アクロレイン由来セグメントとポリエチレングリコールオリゴマーセグメントとの間の結合および内容は、先に提案された態様で、すべての共重合体のサイズ分離−ＨＰＬＣにより実証され、残留アクロレインモノマーまたは実質的なポリアクロレインを示さず各々が１つの狭く、対称的で支配的な解明できない質量ピークを有し、さらに、セグメント間の会合が単に物理的吸着であった場合の分解可能な変化および予測とは対照的に、実施例２からの共重合体ＭＷ１，０００は、すべての共重合体の元の調製で使用されたものに匹敵する塩基性条件下で、ポリエチレングリコールにＭＷ２００よる平衡化後のサイズ分離ＨＰＬＣおよび抗ウイルス活性の変化はなかった（例えば、実施例２）。

【0067】

共重合体の製造に使用されるアクロレイン：ポリエチレングリコールの重量比は、好ましくは１：４〜１：４０、より好ましくは１：８〜１：２０である。

【0068】

好ましい塩基はアルカリ水酸化物の水溶液であり、より好ましくは、水酸化アルカリは水酸化ナトリウムである。

【0069】

酢酸はｐＨ緩衝目的には有用であるが、好ましい酸は希塩酸である。

【0070】

アクロレインのポリアルキレングリコール水溶液への添加は約１０分を要し、反応の完了までは、通常、約４０分、好ましくは９０分以下が好ましい。

【0071】

典型的には、本発明者らは、共重合体生成物への実質的に完全な変換を得るのに５０分の反応時間が適切であることを見出した。

【0072】

アクロレインは、好ましくは、水溶液としての水溶性ポリアルキレングリコールに添加され、より好ましくは、水溶性ポリアルキレングリコール溶液に対して添加される水溶性アクロレイン溶液の重量に基づいて、アクロレインモノマーの１０重量％〜３０重量％の範囲の濃度で、水溶液として添加される。

【0073】

得られる共重合体は、１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは０％の反応性カルボニル基含有率（加えて、任意のカルボキシル含有率を含む）を有する。

【0074】

アクロレイン溶液は、通常、０．５％以下、典型的には０．０１〜０．５％、より好ましくは０．１％ｗ／ｗのようなインヒビター、ハイドロキノンを含有する。

【0075】

本明細書の共重合体は、様々な組成物および物理的形態に含まれ得ることは、当業者には明らかであろう。特に、インビボでの組成物および薬学的な使用方法は、共重合体のより遅いクリアランスを利用して、明らかとなるであろう。また、膜、組織および器官を通る浸透速度を調整するための分子量の変動、および結果として生じる、ヒトまたは動物の体内での吸収または分布の薬理学的利点が得られることは明らかであり、この文脈において、例えば３００〜８００ダルトンのような低分子量共重合体は、分子量１０００ダルトンを超える共重合体よりも迅速に吸収され、分布される。

【0076】

本明細書の結果を考慮すると、タンパク質、特にブロスを添加して共重合体の使用中の抗ウイルス活性を高めることも考えられる。

【0077】

本明細書の対象製品は、水溶性であり、ヒト／動物への投与は、薬物、特に口または注射による公知の通常の方法によるものであり、単独または組成物中の任意の実際の薬学的方法で、器官および組織内で、または、ヒトもしくは動物の生体内血管系と接触するかまたはインビボで使用され得る。共重合体をヒトおよび動物に投与する場合、それら自体または例えば０．１％〜９９．５％（より好ましくは０．５％〜９０％）の活性成分を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物として付与され得る。

【0078】

組成物は、薬理学的に有効な量の共重合体を含む固体、溶液、ゲル、エマルジョンまたは懸濁液であってもよい。本発明の化合物は、１種以上の他の化学療法剤と組み合わせて使用することができる。本発明の化合物の投薬量は、任意の薬物−薬物反応のために調整することができる。一実施形態では、化学療法剤は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞周期阻害剤、酵素、CAMPTOSAR（イリノテカン）などのトポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節剤、抗ホルモン、抗血管新生剤、例えば、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＣＯＸ−２阻害剤、抗アンドロゲン、白金配位錯体（シスプラチンなど）、置換尿素、例えばヒドロキシ尿素；メチルヒドラジン誘導体、例えばプロカルバジン；副腎皮質抑制剤、例えば、ミトタン、アミノグルテチミド、ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、例えば、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、（プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベステロール）、タモキシフェンなどの抗エストロゲン、アンドロゲン（例えば、テストステロンプロピオネート）、アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール、およびアロマシン（エキセメスタン）からなる群から選択される。

【0079】

共重合体およびそれらの組成物は、ウイルスに対して実質的な活性を有する。

【0080】

理論に拘泥するものではないが、作用のメカニズムは、
・本発明により記載される共重合体は、共重合体と疾患細胞の外膜のタンパク質との間の非特異的な疎水性反応に依存することが判明しており、反応がより大きくなると、細胞の外膜の疎水性および代謝性活性が細胞を弱め、内部浸透圧が周囲の細胞よりも大きく上昇し、
・反応が膜を弱める、
という利点をもたらす。

【0081】

したがって、より大きな内部代謝活性を有する細胞は、より大きな内部浸透圧、および外側膜に対するより大きな外向き圧力を有し、共重合体の効果から破裂に対して比較的大きな感受性を与える。

【0082】

この仮説はテストにかけられ成功している。さらに、それは普遍的であり、すなわち特異的ではなく、すべてのタイプのウイルスを含有する細胞に適用可能である。

【0083】

ウイルスを含有する細胞の代謝活性、浸透圧および膜張力が周囲の細胞よりも大きくなり、外膜が本発明によって記載されたポリマーにより敏感であることは、当業者には明らかであろう。

【0084】

慢性炎症の原因となる感染または癌誘発代謝物（癌につながるヘリコバクターピロリが例えばよく知られる）の感染のいずれかにより、細菌感染が癌につながる可能性があることも当業者には知られている。従って、本発明に記載された共重合体は、細菌に対する抗生物質薬剤として既に実用的であることが判明しているので、ここに記載されたそのウイルスおよび癌活性は、有利であり、おそらく相乗的であるはずである。また、ウイルス感染、特にインフルエンザウイルスがしばしば細菌感染に関連しているので、１つの薬剤における同時の抗ウイルス性および抗生物性が有利に相乗的である。

【0085】

実施例１のように、細菌に対するスーパーバグ／耐性型を形成するために突然変異が起こったかどうかにかかわらず、細菌に対して抗菌活性の同じ程度または類似の結果が得られていることも明らかであろう−本明細書では形成のための同じ非感受性が生じている、すなわち、ウイルスがスーパー（抵抗性）形態であるかどうかにかかわらず、同じ性質が、通常、突然変異によって進化して発生する。

【0086】

また、追加の薬学的効果を達成するために、本明細書に記載された抗生物質（抗菌剤）、抗ウイルス薬以外のものが共重合体の製剤への添加のために考慮され得ることも明らかである。

【0087】

本発明を、以下の実施例を参照してさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。

【0088】

実施例
実施例１および比較例１からの共重合体は抗ウイルス特性を有する。インビボで実施例１からのより低いＭＷ５００は、アクロレインおよびＰＥＧのより高分子量のポリマーよりも常に有効であることが見出されている。

【0089】

カルボニル含有量の推定
本明細書で報告されるカルボニル含有量の推定値は、確立された方法（Peters 1962; Melrose 2009）に基づいている。二重に、共重合体（１ｇ）の試料水溶液を０．０１ｇの精度で秤量し、水（９ｇ）を添加し、次に０．０１Ｍ塩酸または０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液のいずれかを適切に添加してｐＨを６．００にした。

【0090】

ヒドロキシルアミン塩酸塩（５０ｍＬ）の１％溶液を０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．００にした。

【0091】

上記共重合体と試薬の溶液を混合し、室温で３０分間放置した。その後、反応物を、０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（ＶｍＬ）でｐＨ６．００まで逆滴定した。

【0092】

従って、元の試料溶液のｗ／ｗ％カルボニル含有量（Ｗｇ）は、アクロレインとして推定され、Ｖ×０．１０×５．６／Ｗに等しい。

【0093】

ＨＰＬＣによる共重合体の定量分析
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、屈折率およびＵＶ（２６８ｎｍ）検出器の両方を同時に使用してShimadzu Profinence装置で実施した。カラムは、サイズ排除による分離のために、（直列の）Waters Hydrogel 120またはWaters Hydrogel 250のいずれかまたは両方であった。

【0094】

ＭＷ較正は、平均ＭＷ範囲２００〜１０，０００ダルトンのSigma-Aldrichポリエチレングリコールの排除時間対対数ＭＷの直線プロットによって行った。したがって、これに基づいて常に決定されて本明細書に報告されたアクロレイン−共重合体の分子量は常に（最も近い５００ダルトンに補正された）数平均分子量を指す、という決定の方法に従う。

【0095】

水溶媒（０．６ｍＬ〜１．０ｍＬ／分）を用いて溶質（０．０２０ｍＬ；０．４％ｗ／ｗ）の水溶液で分離を行った。

【0096】

質量分析法による共重合体の定量分析
２つの別々の技術（島津科学機器（オセアニア）Pty Ltdの提供による）が実施された：
・事前クロマトグラフィーなしで、質量分析計への直接注入；
・クロマトグラフィー後の質量分析

【0097】

装置；実験の条件は、Nexera UHPLCバイナリー高圧勾配およびLCMS-8060（単一四重極質量分析をシミュレートするためにＱ３スキャン下で実行；移動相等価部分は水中０．０２％ギ酸およびアセトニトリル中０．０２％ギ酸、並びにカラムPhemonenex Aeris XB C18 300A 150×2.1mm、である。

【0098】

ポリマー溶液の定量的ＵＶ／可視分析
分析のための溶液は、水（２０ｇ）に共重合体（２５０ｍｇ）を希釈し、場合によっては化学量論的モル当量の反応物を希釈することによって調製し、その後、Shimadzu UVmini-1240装置でＵＶスペクトルを取る前に、水で１：９に希釈した。

【0099】

実施例１および比較例１
実施例１は、ポリアクロレインオリゴマーセグメントおよび分子量２００ダルトンのポリエチレングリコールオリゴマーセグメントを含む約５００ダルトンの分子量の本発明の共重合体の製造を記載する。この共重合体は、本明細書に記載されるような望ましくない副反応のレベルを導入することなく、信頼できる成功のために推奨される最高ｐＨであるので、ｐＨ１２．０の調製物から意図的に説明される。共重合体の抗ウイルス活性は、通常、約２５００ダルトンの分子量の対応する共重合体のものと比較して高い。

【0100】

実施例１−ＭＷ約５００ダルトンの共重合体の製造
水（２０ｇ）とポリエチレングリコール（６０ｇ；ＭＷ２００）の溶液に、新たに蒸留したアクロレイン（５ｇ；ハイドロキノン０．１％ｗ／ｗで阻害）の水（２０ｇ）溶液を１０分かけてゆっくりと添加し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の添加によりｐＨ１２にすると、１０分の間に、酸化ハイドロキノンの黄色が速やかに現れ、その後消失した。このプロセスの間、組成物を連続的かつ激しく撹拌して空気との多量の接触を提供した。発熱および急速な重合が行われ、反応物の温度は約２５℃〜３５℃に維持された。

【0101】

さらに５０分後、１Ｍの塩酸水溶液を加えて透明な溶液をｐＨ７．５に調整した。生成物は透明でほぼ無色の（淡黄色の）溶液であった。本明細書のサンプルについて行われたすべての試験および結果は、精製せずに７℃で４年間または６年間保存したサンプルで行った。これは、製品の高純度および高安定性を示すものとみなされる。

【0102】

ＵＶ可視、２００〜６００ｎＭのスペクトルの生成物は、２００〜３００ｎＭ領域の遠端にのみ実質的な吸収を有した。これは、カルボニルと共役した不飽和の無視できる含量と一致しており、マイケル反応の傾向に関連する可能性がある。

【0103】

ＨＰＬＣは、重合収率が９９〜１００％ｗ／ｗであり、あらゆる残留アクロレインモノマーが１ｐｐｍ ｗ／ｗ未満であり、ＭＷは約５００ダルトンを示した。質量分析は塩基が３１２の塩基ピークを示し、共重合体が２つの２−プロパノール（例えば、アクロレイン）残基に線状に共有結合した５つのオキシエチレン（例えば、ＰＥＧ）残基を含むことを示した。

【0104】

ｐＨ１まで（及びｐＨ１４まで）試験したところ、共重合体は可溶性のままであった。共重合体は約０〜１０％ｗ／ｗのカルボニル含有量またはカルボキシル含有量を有する。

【0105】

Waters Hydrogel 120、Waters Hydrogel 250上で単独で行うか、または一連のいずれかを交互に配列する方法で、１ｍｌ／分で水中でＨＰＬＣを行ったかどうかに関わらず、ＨＰＬＣ中の生成物の単一ピークは狭く未解明のまま残っていた。

【0106】

重合がｐＨ８またはｐＨ１０のいずれかで行われたときに同じ調製結果が生じ、大腸菌に対して常に正確に同一のインビトロ微生物学的速度−結果および同じＨＰＬＣ結果が得られた。（ｐＨ８を除いて、１％ｗ／ｗ未満の総量のアクロレインの二量体またはオリゴマーを示す量の物質を有する生成物が得られ、インビボでの微生物学的速度試験はすべての生成物について同じであった。

【0107】

実施例１の調製は、独立して、本出願人の実験室の別のメンバーにより別々にｐＨ８、ｐＨ１０およびｐＨ１２を含む、８〜１２の種々のｐＨで何回も繰り返され、同一の重合結果、ＨＰＬＣおよびインビトロで得られた大腸菌に対する速度試験の結果を示した。

【0108】

比較例１−分子量約２５００ダルトンの共重合体
この実施例は、分子量２０００のポリエチレングリコールセグメントを含む、より高分子量の２５００ダルトンの、本発明ではない共重合体の製造を記載する。

【0109】

水（３０ｇ）およびポリエチレングリコール（２０ｇ；ＭＷ２，０００）の溶液に、新たに蒸留したアクロレイン（５ｇ；ハイドロキノン０．１％ｗ／ｗで阻害）の水（２０ｇ）溶液を１０分かけてゆっくりと添加し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ１１にすると、この間、酸化ハイドロキノンの黄色が速やかに現れ、その後、消失した。組成物は、添加前および添加中に激しく機械的に撹拌して、空気との多量の接触を提供した。発熱および急速な重合が起こり、温度は２５℃〜３５℃に維持された。

【0110】

さらに５０分間撹拌した後、１Ｍの塩酸水溶液を加えて透明な溶液をｐＨ７．５に調整した。生成物は透明でほぼ無色の（非常に淡い黄色の）溶液であった。

【0111】

先行技術におけるすべてのポリアクロレイン生成物と共通して、寒天を介した拡散に対する比較的高分子量の生成物による耐性のために、微生物学的分析の寒天拡散技術は本明細書では使用されないことは注目に値する。

【0112】

本明細書で記録された試料およびそれらの結果について行われたすべての試験は、精製せずに７℃で４〜６年間保存された試料に対して行われた。これは、製品の高純度および高安定性を示すものとみなされる。

【0113】

ＵＶ可視、２００〜６００ｎＭのスペクトルの生成物は、２００〜３００ｎＭ領域の遠端にのみ実質的な吸収を有した。

【0114】

ＨＰＬＣは、重合収率が９９〜１００％ｗ／ｗであり、あらゆる残留アクロレインモノマーが１ｐｐｍ ｗ／ｗ未満であることを示した。ＭＷは約２，５００ダルトンであった。ｐＨ１まで（およびｐＨ１４まで）試験したところ、ポリマーは可溶性のままであった。このポリマーは約０〜１０％ｗ／ｗのカルボニル含有量を有する。

【0115】

Waters Hydrogel 120、Waters Hydrogel 250上で単独で行うか、または一連のいずれかを交互に配列する方法で、１ｍｌ／分で水中でＨＰＬＣを行ったかどうかに関わらず、ＨＰＬＣ中の生成物の単一ピークは狭く未解明のまま残っていた。

【0116】

本明細書に記載の重合メカニズムに基づいて、（ポリエチレングリコールの当量に関して）重合において添加されたアクロレインモノマーの当量は、実施例１よりも比較例１の方が大きいと計算できるので、不溶性ポリアクロレインを形成する傾向は、前者においてより高いが、７℃／６年で放置しても観察されなかった。アクロレイン−ポリマーの希釈溶液を希塩酸でｐＨ２．５に段階的に酸性化し、希水酸化ナトリウム溶液で逆滴定するとカルボキシル基が存在しないことが示された（ｐＫ_ａ＝４．５）。

【0117】

両方の共重合体は８℃で４年後でも依然として安定であり、ヒトの胃の滞留時間の間、シミュレートされたｐＨ条件に対して安定であった。

【0118】

全ての観察はｐＨ６．５と７．０との間で行われ、これは全く自然に達成され、異なる緩衝液からの様々な添加塩との可能な相互作用の合併症は回避された。

【0119】

実施例２
この実施例は、分子量６００ダルトンのポリエチレングリコールオリゴマーセグメントを含む約１０００ダルトンの分子量の本発明の共重合体の調製を実証した。

【0120】

新たに蒸留したアクロレイン（５ｇ；ハイドロキノン０．１％ｗ／ｗで阻害）の水（２０ｇ）溶液を水（２０ｇ）とポリエチレングリコール（６０ｇ；ＭＷ６００）の溶液に１０分かけてゆっくりと添加し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の添加によりｐＨ１０にした。組成物をアクロレインの添加前および添加中に激しく撹拌して空気を取り込み、大量の空気と接触させ、発熱および急速な重合を生じさせ、温度を約２５℃〜３５℃に維持した。添加の開始後、酸化ハイドロキノンの黄色が速やかに現れ、次いで消失して透明な溶液が得られた。

【0121】

さらに５０分後、１Ｍの塩酸水溶液を加えて透明な溶液をｐＨ７〜８に調整した。生成物は透明でほぼ無色の（淡黄色の）溶液であった。（ＵＶ−可視、２００〜６００ｎＭのスペクトルの産物は、２００〜３００ｎＭ領域の遠端にのみ実質的な吸収を有した。）

【0122】

ＨＰＬＣは、重合収率が９９〜１００％ｗ／ｗであり、あらゆる残留モノマーが１ｐｐｍ ｗ／ｗ未満であることを示し、ＭＷは約１，０００ダルトンであった。ｐＨ１まで（およびｐＨ１４まで）まで試験したところ、共重合体は可溶性のままであった。このポリマーは約０〜１０％ｗ／ｗのカルボニル含有量を有する。

【0123】

ポリエチレングリコールＭＷ２００（１２０ｍｇ）を共重合体（３８３ｍｇ）に添加し、１Ｍ水酸化ナトリウムの滴を加えてｐＨを１１にした。周囲温度で２時間放置した後、１Ｍ塩酸の滴でｐＨを７．５に調整し、３日間静置した。この処理の結果、共重合体のＨＰＬＣも抗ウイルス活性も変化しなかった。

【0124】

実施例３
第１部 第１にＣＰＥアッセイ（および抗生物質の細胞傷害性）、第２にＰＲＮＴ試験における、インフルエンザＡ ＴＸ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）に対する実施例１のインビトロ抗ウイルス評価。
実施例１の以下の２つのインビトロ活性の例は、作用が、それぞれ、予防的／細胞内部である場合、および作用が治癒的／細胞外である場合の代表例である。

【0125】

ＣＰＥ−細胞変性効果アッセイ−図１
・ＭＤＣＫ細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした
・翌日、細胞をＩＦＶ Ａ／ＴＸ／３６／９１に０．０１のＭＯＩで３５℃で２４時間感染させた
・翌日、実施例１の連続希釈（２倍希釈で０．１％（１０００ｐｐｍ）で開始）を培地中で調製した
・接種材料を細胞から除去し、連続希釈物を細胞に３５℃で１時間添加した
・化合物希釈物を除去し、細胞をＥＬＩＳＡによってウイルス抗原について評価した。

【0126】

細胞毒性アッセイ
・ＭＤＣＫ細胞を黒色壁９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした
・翌日、増殖培地を細胞から除去し、インキュベーション培地を添加した
・翌日、実施例１の連続希釈物を、ＣＰＥアッセイについて記載したように調製した
・培地を細胞から吸引し、化合物希釈物を３５℃で１時間添加した。培地のみでインキュベートした細胞を０％細胞傷害性データのために使用した
・培地を吸引し、PromegaのCelltiterGloキットを用いて５日目にＡＴＰ含量の評価のために細胞を溶解した
・得られたルシフェラーゼルミネセンスを定量し、４−ＰＬ曲線適合を用いてＣＣ５０を計算するのに使用した

【0127】

ＰＲＮＡ−プラーク減少中和アッセイ（および抗生物質の細胞傷害性）−図２
・ベロ細胞を２４ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした
・翌日、実施例１の連続希釈（２倍希釈で０．１％（１０００ｐｐｍ）で開始）および対照抗体を培地中で調製した
・段階希釈液を２００ＰＦＵのＩＦＶ Ａ／ＴＸ／３６／９１とともに３５℃で２時間インキュベートした
・その後、接種材料を３５℃で１時間細胞に添加した
・接種物を除去し、プレートを５日間インキュベートした
・ウイルス力価はイムノプラーク（immunoplaque）アッセイにより決定した

【0128】

細胞毒性アッセイ
・ベロ細胞を黒色壁96ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした
・翌日、実施例１の連続希釈液をＰＲＮＴアッセイについて記載したように調製した
・増殖培地を細胞から吸引し、化合物の希釈物を添加した。培地のみでインキュベートした細胞を０％細胞傷害性データのために使用した
・化合物を１時間後に除去し、新鮮な培地を添加してから、プレートを３５℃で５日間置いた
・培地を吸引し、PromegaのCelltiterGloキットを用いて５日目にＡＴＰ含量の評価のために細胞を溶解した
・得られたルシフェラーゼルミネセンスを定量し、４−ＰＬ曲線適合を用いてＣＣ５０を計算した。結果を表１に示す。

【0129】

【表1】

【0130】

処方１として記載された共重合体とＭＤＣＫ（イヌ）細胞またはＶｅｒｏ（サル）細胞のいずれかとの間に細胞毒性は観察されなかった。

【0131】

実施例４−インビボ抗ウイルス評価
この実施例は、ウィルス、特にインフルエンザＡ ＴＸ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１の感染の制御における、実施例１の共重合体のインビボでの活性を調べる。

【0132】

１０匹のマウス「グループ１」の処置群を、１０匹のマウスの未処置群と比較して、ウイルス感染症に対する応答を調べた。

【0133】

グループ１（鼻腔内投与により静脈内に感染；その後、実施例１の７０ｍｇ／ｋｇを用いて最初の５日間のそれぞれの間に１４０ｍｇ／ｋｇのマウス用量率で処置）。グループ２（鼻腔内投与により静脈内に感染;治療されていない）。４日後、マウスは病気の症状を呈し始めた。マウス１匹が生存できずに死亡した。残りは、（ａ）体重が２０％減少し、または（ｂ）失われた移動度のいずれかを有する結果として安楽死させた。

【0134】

生存率を表２に示す。

【0135】

【表2】

【0136】

結果は図３に示されるグラフに表される。

【図1】

【図2】

【図3】