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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】6813923
(24)【登録日】2020年12月22日
(45)【発行日】2021年1月13日
(54)【発明の名称】体性幹細胞集積組織構造体及びその製造器具
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20201228BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20201228BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20201228BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20201228BHJP
A61L 27/24 20060101ALI20201228BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N5/074
C12M1/00 A
A61L27/38 100
A61L27/24
【請求項の数】18
【全頁数】40
(21)【出願番号】特願2020-103747(P2020-103747)
(22)【出願日】2020年6月16日
【審査請求日】2020年7月2日
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】518383828
【氏名又は名称】バイオチューブ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】中山 泰秀
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 康史
(72)【発明者】
【氏名】岩井 良輔
(72)【発明者】
【氏名】福島 雅典
(72)【発明者】
【氏名】竹中 洋
【審査官】
藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１６／０７６４１６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２００７−３１２８２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００８−２３７８９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１０−０９４４７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００６−２５５２８８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ ５／００
Ａ６１Ｌ ２７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
凹部を有し線維性結合組織で構成されたコア部と、前記凹部に形成されたＩＩＩ型コラーゲン及び体性幹細胞を含む疎線維性の体性幹細胞集積組織とを有する、組織構造体であって、
前記凹部が少なくとも２．５ｍｍの開口幅を有し、
前記体性幹細胞が、間葉系幹細胞、並びに多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ３の少なくとも一方を発現する多能性幹細胞を含む、
組織構造体。
前記凹部が少なくとも２．５ｍｍの開口幅を有し、
前記体性幹細胞が、間葉系幹細胞、並びに多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ３の少なくとも一方を発現する多能性幹細胞を含む、
組織構造体。
【請求項2】
前記コア部が１つ又は２つ以上の前記凹部を有する、請求項１に記載の組織構造体。
【請求項3】
前記コア部が少なくとも３つの前記凹部を有する、請求項１又は２に記載の組織構造体。
【請求項4】
前記コア部が少なくとも２．５ｍｍの径を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項5】
組織構造体の形状が棒状であり、複数の前記凹部が周方向に沿って位置する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項6】
組織構造体の形状が棒状であり、複数の前記凹部が軸方向に沿って位置する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項7】
組織構造体の形状が略多面体形状であり、複数の前記凹部が異なる面に位置する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項8】
組織構造体の形状が非管状かつ非シート状である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項9】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組織構造体であって、生体組織材料が存在する環境下に、中空部を有する組織構造体製造器具を留置することによって形成され、
前記組織構造体製造器具が、前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定し、
前記開口部が少なくとも２．５ｍｍの開口幅を有し、
前記開口部からの前記中空部の深さが少なくとも２ｍｍである、
組織構造体。
前記組織構造体製造器具が、前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定し、
前記開口部が少なくとも２．５ｍｍの開口幅を有し、
前記開口部からの前記中空部の深さが少なくとも２ｍｍである、
組織構造体。
【請求項10】
前記組織構造体が前記組織構造体製造器具内の前記中空部を埋めた状態であり、前記コア部が前記枠体の表面に密着している、請求項９に記載の組織構造体。
【請求項11】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組織構造体から、体性幹細胞集積組織又は体性幹細胞を分離することを含む、体性幹細胞の収集方法。
【請求項12】
生体組織材料が存在する環境下に留置することにより、凹部を有し線維性結合組織で構成されたコア部と前記凹部に形成されたＩＩＩ型コラーゲン及び体性幹細胞を含む疎線維性の体性幹細胞集積組織とを有する組織構造体を形成するための、中空部を有する組織構造体製造器具であって、
前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定し、
前記開口部が少なくとも２．５ｍｍの開口幅を有し、
前記開口部からの前記中空部の深さが少なくとも２ｍｍであり、
前記体性幹細胞が、間葉系幹細胞、並びに多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ３の少なくとも一方を発現する多能性幹細胞を含む、
生体組織材料が存在する環境下に留置したときに、前記枠体の表面から前記中空部の内方に広がるように線維性結合組織が形成されることによって、前記開口部から前記中空部に向かって窪む凹部を有するコア部が生成するとともに、前記凹部に前記体性幹細胞が集積した疎線維性組織が形成される、組織構造体製造器具。
前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定し、
前記開口部が少なくとも２．５ｍｍの開口幅を有し、
前記開口部からの前記中空部の深さが少なくとも２ｍｍであり、
前記体性幹細胞が、間葉系幹細胞、並びに多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ３の少なくとも一方を発現する多能性幹細胞を含む、
生体組織材料が存在する環境下に留置したときに、前記枠体の表面から前記中空部の内方に広がるように線維性結合組織が形成されることによって、前記開口部から前記中空部に向かって窪む凹部を有するコア部が生成するとともに、前記凹部に前記体性幹細胞が集積した疎線維性組織が形成される、組織構造体製造器具。
【請求項13】
前記開口部は２．５ｍｍ又はそれを超える直径の円が内接可能な開口形状を有する、請求項１２に記載の組織構造体製造器具。
【請求項14】
前記枠体が、柱状部材と支持部から構成され、前記支持部が、前記枠体の形状を保持するように柱状部材を固定している、請求項１２又は１３に記載の組織構造体製造器具。
【請求項15】
複数の柱状部材が、その両端部で支持部に固定され、かつ、支持部と支持部に挟まれた仮想的な筒面上に周方向に配置されている、請求項１４に記載の組織構造体製造器具。
【請求項16】
前記開口部が、柱状部材と支持部によって形成されているか、又は複数の柱状部材によって形成されている、請求項１４又は１５に記載の組織構造体製造器具。
【請求項17】
前記開口部が、多角形状、矩形状、台形状、丸形状、円形状、又は楕円形状の開口縁を有する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組織構造体製造器具。
【請求項18】
支持部が、前記中空部と前記器具の外部空間とを連通する開口部をさらに有する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の組織構造体製造器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、体性幹細胞集積組織構造体及びその製造器具に関する。
【背景技術】
【0002】
異物を排除する自己防衛反応は、生体に侵入した異物の周辺にマクロファージなどを集積させる。マクロファージは、異物の表面に吸着して異物を分解すると共に、単球によるＴＧＦ−βの産生を通じて線維芽細胞によるコラーゲンの産生を促す。その結果、生体に侵入した異物は、線維芽細胞とコラーゲンとを含む結合組織に覆われて生体内で隔離される（カプセル化）。このような現象を利用して生体由来組織を形成する技術として、生体内に異物である基材を埋入して結合組織を形成する技術が報告されている（特許文献１〜６など）。例えば、特許文献５は、棒状構造部材の外周に沿って螺旋状に形成された外郭部材を生体に埋入することにより、棒状構造部材の表面に形成され外郭部材を包埋する結合組織体を製造することを開示している。特許文献６は、棒状体の外周にステントを嵌合させたアッセンブリを生体に埋入することにより、アッセンブリの外周に結合組織体を形成させ、それを生体から取り出し、棒状体を抜くことで、結合組織体によって被覆されたステントが得られることを開示している。しかしカプセル化によって基材表面で形成される組織は通常、数十μｍ〜数百μｍ程度の厚みしかなく、そこに含まれる細胞のほとんどは線維芽細胞である。
【0003】
近年、疾病や外傷によって損なわれた組織や臓器の機能を再生させる技術として、生体外で培養された細胞やそこから構築された組織を生体に移植する再生医療が注目されている。幹細胞は、再生医療において目的の細胞を生成したり組織を構築したりする上で重要な材料である。一方、倫理的な検討が必要とされる胚性幹細胞や、安全性の確立が必要とされる人工多能性幹細胞は、再生医療に用いる根幹が確立されていない。そこで、より安全性が高く倫理的問題の少ない体性幹細胞を効率的に収集する技術が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２００７−３１２８２１号公報
【特許文献2】特開２００８−２３７８９６号公報
【特許文献3】特開２０１０−０９４４７６号公報
【特許文献4】特開２０１２−１０５８６０号公報
【特許文献5】国際公開ＷＯ２０１６／０７６４１６号
【特許文献6】特開２００６−２５５２８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、体性幹細胞を効率よく収集する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、体性幹細胞が集積した組織構造体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は以下を包含する。［１］凹部を有し線維性結合組織で構成されたコア部と、前記凹部に形成されたＩＩＩ型コラーゲン及び体性幹細胞を含む疎線維性の体性幹細胞集積組織とを有する、組織構造体。
［２］前記コア部が１つ又は２つ以上の前記凹部を有する、上記［１］に記載の組織構造体。
［３］前記コア部が少なくとも３つの前記凹部を有する、上記［１］又は［２］に記載の組織構造体。
［４］前記凹部が少なくとも２．５ｍｍの開口幅を有する、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の組織構造体。
［５］前記コア部が少なくとも２．５ｍｍの径を有する、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の組織構造体。
［６］体性幹細胞が間葉系幹細胞及び多能性幹細胞の少なくとも一方を含む、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の組織構造体。
［７］組織構造体の形状が棒状であり、複数の前記凹部が周方向に沿って位置する、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の組織構造体。
［８］組織構造体の形状が棒状であり、複数の前記凹部が軸方向に沿って位置する、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の組織構造体。
［９］組織構造体の形状が略多面体形状であり、複数の前記凹部が異なる面に位置する、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の組織構造体。
［１０］組織構造体の形状が非管状かつ非シート状である、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の組織構造体。
［１１］上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の組織構造体であって、生体組織材料が存在する環境下に、中空部を有する組織構造体製造器具を留置することによって形成され、
前記組織構造体製造器具が、前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定する、
組織構造体。
［１２］前記組織構造体が前記組織構造体製造器具内の前記中空部を埋めた状態であり、前記コア部が前記枠体の表面に密着している、上記［１１］に記載の組織構造体。
［１３］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の組織構造体から、体性幹細胞集積組織又は体性幹細胞を分離することを含む、体性幹細胞の収集方法。
【0008】
［１４］生体組織材料が存在する環境下に留置することにより、凹部を有し線維性結合組織で構成されたコア部と前記凹部に形成されたＩＩＩ型コラーゲン及び体性幹細胞を含む疎線維性の体性幹細胞集積組織とを有する組織構造体を形成するための、中空部を有する組織構造体製造器具であって、前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定し、
生体組織材料が存在する環境下に留置したときに、前記枠体の表面から前記中空部の内方に広がるように線維性結合組織が形成されることによって、前記開口部から前記中空部に向かって窪む凹部を有するコア部が生成するとともに、前記凹部に体性幹細胞が集積した疎線維性組織が形成される、組織構造体製造器具。
［１５］前記開口部が少なくとも２．５ｍｍの開口幅を有する、上記［１４］に記載の組織構造体製造器具。
［１６］前記開口部は２．５ｍｍ又はそれを超える直径の円が内接可能な開口形状を有する、上記［１４］又は［１５］に記載の組織構造体製造器具。
［１７］前記枠体が、柱状部材と支持部から構成され、前記支持部が、前記枠体の形状を保持するように柱状部材を固定している、上記［１４］〜［１６］のいずれかに記載の組織構造体製造器具。
［１８］複数の柱状部材が、その両端部で支持部に固定され、かつ、支持部と支持部に挟まれた仮想的な筒面上に周方向に配置されている、上記［１７］に記載の組織構造体製造器具。
［１９］前記開口部が、柱状部材と支持部によって形成されているか、又は複数の柱状部材によって形成されている、上記［１７］又は［１８］に記載の組織構造体製造器具。
［２０］前記開口部が、多角形状、矩形状、台形状、丸形状、円形状、又は楕円形状の開口縁を有する、上記［１４］〜［１９］のいずれかに記載の組織構造体製造器具。
［２１］支持部が、前記中空部と前記器具の外部空間とを連通する開口部をさらに有する、上記［１７］〜［１９］のいずれかに記載の組織構造体製造器具。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、体性幹細胞を効率よく収集することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図10】図１０は組織構造体製造器具を使用した、体性幹細胞が集積した組織構造体の作製試験の結果を示す写真である。Ａ：使用した器具、Ｂ：生体内埋設後に取り出された、内部に組織構造体が形成されている器具、Ｃ：得られた組織構造体の断面。
【図13】図１３は組織構造体の、間葉系幹細胞マーカーＣＤ９０及びＣＤ１０５に対する免疫組織化学染色の結果を示す写真である。左列：ＣＤ９０／ＤＡＰＩ、右列：ＣＤ１０５／ＤＡＰＩ。Ａ、Ｂ：ポケット部、Ｃ、Ｄ：柱状部材周囲、Ｅ、Ｆ：中心部。
【図14】図１４は組織構造体の、多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ３に対する免疫組織化学染色の結果を示す写真である。左列：ＳＳＥＡ４／ＤＡＰＩ、右列：ＳＳＥＡ３／ＤＡＰＩ。Ａ、Ｂ：ポケット部、Ｃ、Ｄ：柱状部材周囲、Ｅ、Ｆ：中心部。
【図15】図１５は組織構造体の、増殖因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対する免疫組織化学染色の結果を示す写真である。左列：ＶＥＧＦ／ＤＡＰＩ、右列：ＨＧＦ／ＤＡＰＩ。Ａ、Ｂ：ポケット部、Ｃ、Ｄ：柱状部材周囲、Ｅ、Ｆ：中心部。
【図16】図１６は組織構造体の、幹細胞マーカーＳＳＥＡ３と他のマーカーとの二重染色の結果を示す写真である。Ａ：ＣＤ９０／ＳＳＥＡ３／ＤＡＰＩ、Ｂ：ＣＤ１０５／ＳＳＥＡ３／ＤＡＰＩ、Ｃ：ＳＳＥＡ３／ＳＳＥＡ４／ＤＡＰＩ、Ｄ：ＶＥＧＦ／ＳＳＥＡ３／ＤＡＰＩ。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、生体組織から体性幹細胞を効率よく集積可能な組織構造体製造器具と、その器具を用いて作製することができる体性幹細胞に富む組織構造体に関する。
【0012】
本発明によれば、そのような組織構造体製造器具を、生体組織材料が存在する環境下（例えば生体内）に留置することにより、組織構造体製造器具内に細胞を集積させ、組織構造体製造器具内において体性幹細胞が集積した組織構造体の形成を誘導することができる。
【0013】
生体組織材料が存在する環境下に留置した本発明の組織構造体製造器具の開口部からは、生体組織材料由来の細胞等が当該器具内の中空部（当該器具の外部空間へと開口している）に入り込み、当該中空部に線維性結合組織が形成される。組織構造体製造器具の開口部の直下に、当該開口部から器具内中空部に向かって窪む、線維性結合組織の凹部が生じるとともに、当該凹部を有し線維性結合組織で構成されるコア部が、器具中空部に面した器具表面から器具内中空部に向かって形成され、さらに、当該凹部内に体性幹細胞が多数集積し、体性幹細胞集積組織が形成される。組織構造体製造器具内の中空部に当該中空部を埋めるように組織（線維性結合組織とその凹部内の体性幹細胞集積組織とを含む）が形成されるのに十分な期間にわたり、生体組織材料が存在する環境下に組織構造体製造器具を留置することにより、当該器具内に組織構造体が形成される。得られた組織構造体中の体性幹細胞集積組織からは、体性幹細胞を容易に効率良く回収することができる。本発明は、本発明者らが見出したこのような知見に基づくものである。
【0014】
本発明に係る組織構造体製造器具は、より具体的には、器具内の中空部を形成する枠体を有し（例えば、その枠体により構成され）、その枠体は、上記中空部から組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有する。組織構造体製造器具は、好ましくは、生体組織材料が存在する環境下（例えば生体内）に留置したときに、上記枠体の表面から上記中空部の内方に広がるように線維性結合組織が形成されることによって、上記開口部から上記中空部に向かって窪む凹部を有するコア部が生成するとともに、上記凹部に体性幹細胞が集積した疎線維性組織が形成されるように構成されている。組織構造体製造器具内に、枠体が形成する中空部を埋めるように組織構造体が形成されるとき、その枠体は上記中空部内に形成される組織構造体の形状（全体形状、コア部の形状、体性幹細胞集積組織／凹部の位置及び深さなど）を規定する。
【0015】
一実施形態では、上記枠体は、柱状部材と支持部を含むものであってよく、例えば柱状部材と支持部から構成されるものであってよい。この支持部は、枠体の形状を保持しそれにより中空部の形状を維持するように柱状部材を固定する。例えば、複数の柱状部材が、その両端部で支持部に固定されていてもよい。複数の柱状部材は、その中間部でさらに支持部に固定されていてもよい。上記枠体は、複数の柱状部材を含むことが好ましく、以下に限定するものではないが、例えば、３〜５０本、４〜４０本、４〜３０本、５〜３０本、３〜２０本、３〜１５本、３〜１０本、４〜１５本、又は５〜１５本の柱状部材を含むものであってよい。柱状部材は、円柱状、楕円柱状、角柱状、錐台状、ツイスト状、ねじ状等の任意の形状を有するものであってよい。支持部は、円環状、円盤状、楕円環状、楕円盤状、矩形枠状、又は板状（例えば多角形、台形又は不定形の板状）等の任意の形状を有するものであってよい。上記枠体は、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の支持部を有していてもよい。上記枠体は、複数の柱状部材がその両端部及び場合によりその中間部（例えば中間部の１ヶ所又は２ヶ所以上）で支持部に固定された構造が、柱状部材の延在方向に２つ以上連なるものであってもよい。その場合、１つの支持部上に、以下に限定するものではないが、例えば、３〜２０本、３〜１５本、３〜１０本、４〜１５本、又は５〜１５本の柱状部材が固定され得る。
【0016】
一実施形態では、上記枠体において、複数の柱状部材は、その両端部及び場合によりその中間部で支持部に固定され、かつ、支持部と支持部に挟まれた仮想的な筒面上（例えば、円筒面上、楕円筒面上、又は角筒面上）に周方向に配置されているものであってよい。この場合、支持部は円環状、円盤状、楕円環状、楕円盤状、矩形枠状、又は板状（例えば多角形、台形又は不定形の板状）等であり得るが、それらに限定されない。複数の柱状部材は、支持部と支持部に挟まれた仮想的な筒面上に、等間隔で配置されてもよいし、異なる間隔で配置されてもよい。上記枠体は、複数の柱状部材がその両端部及び場合によりその中間部で支持部に固定され、かつ、支持部と支持部に挟まれた仮想的な筒面上に周方向に配置された構造が、柱状部材の延在方向に２つ以上連なるものであってもよい。その場合、１つの支持部上に、以下に限定するものではないが、例えば、３〜２０本、３〜１５本、３〜１０本、４〜１５本、又は５〜１５本の柱状部材が固定され得る。
【0017】
別の実施形態では、上記枠体は、複数の柱状部材を含むものであってよく、例えば複数の柱状部材によって構成され、枠体の形状を保持するようにそれらの柱状部材が相互に固定されたものであってもよい。
【0018】
上記枠体を構成する柱状部材は、少なくとも０．５ｍｍ、０．５ｍｍ〜５ｍｍ、例えば０．７ｍｍ〜３ｍｍ又は０．７ｍｍ〜１．５ｍｍの径を有するものであってよいが、それに限定されない。
【0019】
上記枠体を構成する支持部は、５ｍｍ〜３０ｍｍ、例えば５ｍｍ〜２５ｍｍ又は６ｍｍ〜２０ｍｍの径を有するものであってよいが、それに限定されない。
【0020】
別の実施形態では、上記枠体は、網目状又はコイル状等の線状部材を含むものであってよく、例えば線状部材によって構成されていてもよい。線状部材は、０．５ｍｍ〜５ｍｍ、例えば０．７ｍｍ〜３ｍｍ又は０．７ｍｍ〜１．５ｍｍの径を有するものであってよいが、それに限定されない。上記枠体は、線状部材と支持部を含むものであってよく、例えば線状部材と支持部によって構成されていてもよい。この支持部は、枠体の形状を保持するように線状部材を固定する。
【0021】
本発明において「径」（差し渡し）とは、別途記載しない限り、目的の部材又は領域の断面（通常は短手方向の断面）においてその両側から接する二本の平行線の間の最長距離として定義される。なお、その断面は円形又は楕円形に限定されず、多角形、台形又は不定形等であってもよい。
【0022】
組織構造体製造器具、枠体、及びそれらの構成部材である柱状部材の長手方向の長さは、以下に限定されないが、それぞれ、５ｍｍ〜１００ｍｍ、例えば、１５ｍｍ〜９０ｍｍ、２０ｍｍ〜８０ｍｍ、１５ｍｍ〜７０ｍｍ、又は２０ｍｍ〜６０ｍｍであってよい。
【0023】
組織構造体製造器具、枠体、並びにそれらの構成部材である柱状部材、支持部、及び線状部材等は、生体適合性材料を含むかそれにより構成されるものであることが好ましい。生体適合性材料としては、以下に限定するものではないが、アクリル樹脂、シリコーン樹脂等の樹脂、セラミックス、ステンレス、コバルトクロム合金、チタン、ニッケルチタン等のチタン合金、プラチナ、金等の金属材料などが挙げられる。本発明においてここで使用される生体適合性材料は、生体内において、少なくとも組織構造体の製造期間内には変形しない程度の剛性を備えることが好ましい。
【0024】
上記枠体は、器具中空部から組織構造体製造器具の外部空間に連通しておりその直下に線維性結合組織の凹部が形成される開口部を、１、２、３、又は４つ以上（例えば、４、５、６、７、８、９、又は１０以上）有することができ、例えば１〜５０、３〜５０、４〜４０、４〜３０、５〜３０、３〜２０、３〜１５、３〜１０、４〜１５、又は５〜１５個有することができる。そのような開口部は、好ましくは、柱状部材と支持部によって形成されているか、又は複数の柱状部材によって形成されている。あるいは、そのような開口部は、線状部材によって、又は線状部材と支持部によって形成されていてもよい。
【0025】
上記枠体の支持部は、それ自体が、器具内中空部と上記器具の外部空間とを連通する開口部を有してもよい。例えば、支持部が円環状、楕円環状、矩形枠状等である場合、支持部は当該開口部を有していてもよい。
【0026】
枠体の上記開口部は、線維性結合組織／コア部、並びに線維性結合組織／コア部の凹部及びその凹部内の体性幹細胞集積組織を形成するのに十分な開口幅を有していればよい。本発明において枠体の上記開口部の「開口幅」は、当該開口部の短手方向の開口幅として定義される。枠体の上記開口部は、少なくとも２．５ｍｍの開口幅を有することが好ましく、例えば、３．０ｍｍ以上の開口幅を有していてもよい。一実施形態では、上記開口部は、２．５ｍｍ以上２８ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２５ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２０ｍｍ以下；又は３．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下の開口幅を有していてもよい。枠体の上記開口部の開口幅を、本明細書では開口幅Ｗとも表記する。
【0027】
なお本発明に関して「長手方向」及び「短手方向」の用語は、任意の形状、又は任意の形状を有する物体に対して用いられ、例えば、長方形又は直方体に加えて、他の多角形、円、楕円、円柱、角柱、円錘、角錐、錘台等、並びにそれらの形状を有する枠体等を含む様々な形状又は物体に対して用いられる。円、正方形又は立方体等の一部の形状又は物体においては「長手方向」及び「短手方向」の長さが同一であり得る。
【0028】
枠体の開口部の開口幅は、開口部を形成する部材（柱状部材、支持部、線状部材等）上の、開口面積が最も狭くなる同一面上の位置に定義される開口縁において決定することができる（例えば、図２の１０Ｆを参照のこと）。枠体が複数の柱状部材と支持部から構成されるか、又は複数の柱状部材若しくは線状部材から構成される場合には、上記開口部の開口幅は、枠体の当該開口部を含む短手方向の断面における、隣り合う柱状部材又は線状部材間の最短距離として算出することもできる。その場合、枠体の短手方向の断面は、支持部に平行な断面であってもよい。隣り合う柱状部材又は線状部材が平行に配置されている場合には、上記開口部の開口幅は、その柱状部材又は線状部材間の単一の最短距離として算出することもできる。
【0029】
あるいは、又は上記に加えて、枠体の開口部は、２．５ｍｍ又はそれを超える直径（例えば、３．０ｍｍ又はそれを超える直径）の円が内接可能な開口形状（形及び大きさ）を有することが好ましい。枠体の上記開口部は、例えば、２．５ｍｍ以上２８ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２５ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２０ｍｍ以下；又は３．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下の直径の円が内接可能な開口形状を有するものであり得る。そのような開口形状を有する、枠体の開口部は、線維性結合組織の凹部及びその凹部内の体性幹細胞集積組織の形成に特に適している。ここで、枠体の開口部について「円が内接可能な開口形状」とは、当該開口部の開口形状（例えば、矩形、又は多角形等）の内側に、所定の直径を有する円が１点以上で接して収まることができることを意味する。例えば、長辺２０ｍｍ、短辺２．５ｍｍの長方形の開口形状を有する開口部には、最大２．５ｍｍの直径の円が内接可能である。本発明において、枠体の開口部の開口形状は、当該開口部において開口面積が最も狭くなる位置で定めることができ、例えば、上記開口縁を含む面（例えば、平面）上で定めることができる。
【0030】
一実施形態では、枠体の上記開口部は、多角形状、矩形状、台形状、丸形状、円形状、又は楕円形状等の任意の形状の開口端を有するものであってよい。
【0031】
本発明に係る組織構造体製造器具の枠体の上記開口部の少なくとも１つにおいて、各開口縁の相互に対向する辺は、当該辺の延在方向において異なる大きさの開口幅を有してもよい。組織構造体製造器具のこの構成によれば、１つの開口部に異なる大きさの開口幅を含むことができる。
【0032】
枠体が形成する中空部は、コア部を形成するのに十分な深さを有することが好ましい。枠体において、上記開口部からの中空部の深さは、少なくとも２ｍｍであってよい。上記開口部からの中空部の深さは、例えば、２ｍｍ以上３０ｍｍ以下；２ｍｍ以上２６ｍｍ以下；又は２ｍｍ以上１２ｍｍ以下であってよい。枠体における上記開口部からの中空部の深さ（本明細書において深さＤと表す）は、枠体の短手方向の断面における、単一の開口部の開口縁上にある点を結ぶ直線の中点から中空部の最深点までの距離として決定することができる（図２）。枠体において、複数の柱状部材が、その両端部及び場合によりその中間部で支持部に固定され、かつ、支持部と支持部に挟まれた仮想的な筒面上に（例えば、仮想的な筒面上に内接又は外接して）周方向に（好ましくは、仮想的な筒面上の周囲を取り巻くように）配置されている場合、その筒面の短手方向の断面の中心点を中空部の最深点とすることができる。短手方向の断面の中心点は、仮想的な筒面上に周方向に配置された各柱状部材から等距離にある点であってよい。短手方向の断面の中心点は、仮想的な筒面の円形断面の中心であってよい。本発明に係る組織構造体製造器具は、深さＤが２ｍｍ以上（好ましくは、当該開口部の深さＤが一定の場合）であるか又は深さＤの最大値が２ｍｍ以上（当該開口部の深さＤが一定でない場合）である開口部を少なくとも１つ有するものであってよい。
【0033】
なお本発明の組織構造体製造器具の枠体が有する開口部の少なくとも１つが上記のような開口部であればよいが、枠体が有する開口部のすべてが上記のような開口部であることがさらに好ましい。
【0034】
本発明に係る組織構造体製造器具の枠体において、複数の上記開口部が、柱状部材を挟んで相互に隣り合って存在してもよい。複数の上記開口部が、枠体の周方向に沿って配置されていてもよい。あるいは、複数の上記開口部が、枠体の軸方向に沿って配置されていてもよい。あるいは、複数の上記開口部が、枠体の周方向及び軸方向にそれぞれ沿って配置されていてもよい。このような開口部の構成によれば、組織構造体の外面に形成される、体性幹細胞を集積させるための凹部の密度を高めることが可能であり、好ましい実施形態では、体性幹細胞の集積効率を高めること、ひいては、１つの集積器具から採取される体性幹細胞の細胞数を多くすることが可能ともなる。そのような組織構造体製造器具を用いた場合、製造される組織構造体のコア部は、凹部周縁部によって区画された複数の凹部を有していてもよく、その場合、各凹部は少なくとも１つの凹部周縁部を挟んで別の凹部に隣接していることとなる。
【0035】
本発明の組織構造体製造器具は、枠体が形成する中空部内に棒状体などの別の部材を備えていないことが好ましく、また、当該中空部内に棒状体などの別の部材が格納された状態で生体組織材料が存在する環境下に留置されないように構成されていることが好ましい。
【0036】
一実施形態では、本発明に係る組織構造体製造器具は、図１に示すものである。図１に示すように、組織構造体製造器具１０（以下、本発明に係る組織構造体製造器具を、器具１０とも呼ぶ）は、円環状の３つの支持部１１を備える。各支持部１１は、以下に限定するものではないが、アクリル樹脂やシリコーン樹脂などの生体適合性を有した樹脂を含むか又はそれによって構成されていてもよい。３つの支持部１１は、２つの第１支持部１１Ａと、２つの第１支持部１１Ａに挟まれた１つの第２支持部１１Ｂとを備え、１つの軸方向Ａｘに沿って並ぶ。１つの第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂとは、１つの仮想的な円筒面Ｓの両端部に位置する。２つの第１支持部１１Ａは、器具外と器具内とを軸方向Ａｘに連通する貫通孔１１Ｈを備える。第２支持部１１Ｂは、一方の円筒面Ｓの内部と他方の円筒面Ｓの内部とを軸方向Ａｘに連通する貫通孔１１Ｈを備える。器具１０が生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織に埋設・留置されるとき、これら貫通孔１１Ｈから、器具内の中空部に向けて線維芽細胞を始めとする細胞等が流入することができる。
【0037】
１つの第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂは、円柱状の３本の柱状部材１３を固定している。３本の柱状部材１３は、各円筒面Ｓ上においてその周方向Ｃｉに等間隔に配置（等配）され、第１支持部１１Ａ及び第２支持部１１Ｂとともに、３つの開口部１０Ｈを区画・形成する。柱状部材１３、２つの第１支持部１１Ａ、及び第２支持部１１Ｂは、器具１０の枠体を構成している。器具１０が、生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織に埋設される前において、柱状部材１３と第１支持部１１Ａ及び第２支持部１１Ｂに囲まれる空間は、中空部１０Ｓであり、各開口部１０Ｈは、器具内の中空部１０Ｓから器具の外部空間に連通する。器具１０が生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織に埋設されるとき、各開口部１０Ｈから、生体組織から器具内の中空部１０Ｓに向けて、器具内の中空部に向けて線維芽細胞を始めとする細胞等が流入することができる。
【0038】
図２には図１に示す器具の上記開口部を含む短手方向の断面の模式図を示す。図２に示すように、円筒面Ｓの周方向で隣り合う柱状部材１３の最短距離であり得る、この断面において開口縁１０Ｆ上にある点を結ぶ直線の長さが開口幅Ｗに当たる。隣り合う柱状部材１３が平行である場合、軸方向Ａｘにおいて開口幅Ｗは一定である。隣り合う柱状部材１３が平行でない場合、軸方向Ａｘの各部位において、開口幅Ｗは相互に異なる。器具１０の上記開口部は、開口幅Ｗが、２．５ｍｍ以上、例えば、２．５ｍｍ以上２８ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２５ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２０．０ｍｍ以下；又は３．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下である開口形状を有するものであってよい。体性幹細胞の集積される効率をより高める観点において、器具１０の軸方向Ａｘの全体にわたり、開口幅Ｗは少なくとも２．５ｍｍであることが好ましい。あるいは、又は上記に加えて、器具１０の上記開口部は、２．５ｍｍ以上２８ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２５ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２０ｍｍ以下；又は３．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下の直径の円が内接可能な開口形状を有するものであることも好ましい。
【0039】
図２に示す断面上の円筒面Ｓの中心（中心点）Ｃｔと、開口縁１０Ｆ上にある点を結ぶ直線の中点との間の距離が、開口部１０Ｈからの中空部１０Ｓの深さＤに当たる。器具１０は、深さＤ又は深さの最大値が少なくとも２ｍｍ、例えば２ｍｍ以上３０ｍｍ以下；２ｍｍ以上２６ｍｍ以下；又は２ｍｍ以上１２ｍｍ以下である開口部１０Ｈを有するものであってよい。
【0040】
生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織に埋設された組織構造体製造器具１０において、組織形成は、図３に概説するように起こると考えられるが、本発明はこの理論に限定されるものではない。図３Ａに示すように、器具１０が生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織に埋設されたとき、中空部１０Ｓの外側には、生体組織２１が位置する。次いで、図３Ｂに示すように、生体組織由来の液性成分が、開口部１０Ｈ及び貫通孔１１Ｈを通じて、中空部１０Ｓに侵入する。器具１０が生体組織に埋設されてから、適切な時間、例えば、３時間以上６時間以下を経過すると、器具１０の中空部１０Ｓは、生体組織由来の液性成分によって満たされる。図３Ｃに示すように、器具１０の中空部１０Ｓが液性成分によって満たされると、生体組織内の線維芽細胞２２Ｃが、開口部１０Ｈ及び貫通孔１１Ｈを通じて、中空部１０Ｓに侵入する。中空部１０Ｓに侵入した線維芽細胞２２Ｃは、柱状部材１３の表面から、中空部１０Ｓの内方に向けて、線維性結合組織２２を形成し始める。
【0041】
図３Ｄに示すように、柱状部材１３の中空部１０Ｓに面した表面上で形成され始めた線維性結合組織は、中空部１０Ｓの内方に向けて広がるように成長する。そして、各柱状部材１３の表面から広がった線維性結合組織２２が、中空部１０Ｓの内方において相互につながり、それによって、開口部１０Ｈから中空部１０Ｓに向かって窪む凹部２２Ｈが、線維性結合組織２２の表面に形成される。なお組織構造体製造器具１０の構成要素である支持部１１、例えば、図２に示す器具の第１支持部１１Ａ及び第２支持部１１Ｂの表面から中空部１０Ｓの内方に向けても、線維性結合組織２２が形成され、成長し、柱状部材１３の表面から広がった線維性結合組織２２とつながる。各柱状部材１３及び支持部１１（例えば、図２に示す器具の第１支持部１１Ａ及び第２支持部１１Ｂ）の表面から広がるように形成された線維性結合組織２２が相互に連結することにより、コア部２５が形成される。すなわち、線維性結合組織２２で構成されたコア部２５はその外面に凹部を有する。凹部を有する線維性結合組織２２及びコア部２５の形成が進むにつれ、生体組織に含まれる体性幹細胞２３Ｃが、開口部１０Ｈを通じて凹部２２Ｈに移動する。生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織に埋設された組織構造体製造器具１０を適切な期間にわたり留置することにより、凹部において、体性幹細胞２３Ｃを含む体性幹細胞集積組織（ポケット部とも称する）が形成されることになる。
【0042】
組織構造体製造器具１０の別の実施形態では、図４Ａに示すように、器具１０は、柱状部材１３と、外径（外側の円の直径）が６ｍｍである円環状の２つの第１支持部１１Ａと、その２つの第１支持部１１Ａに挟まれて配置された外径が６ｍｍである円環状の１つの第２支持部１１Ｂとを備えるものであってよい。上段の１つの第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂとの間には、開口幅Ｗが３．０ｍｍ、深さＤが２ｍｍとなるように、直径１ｍｍの３本の柱状部材１３（長さ２５ｍｍ）が固定されており、下段の第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂとの間には、開口幅Ｗが２．５ｍｍ、深さＤが２．２ｍｍとなるように、直径１ｍｍの４本の柱状部材１３（長さ２５ｍｍ）が固定されている。図４Ａに示すこのような器具１０において、上段の第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂと柱状部材１３によって形成された各開口部は、最大で直径３．０ｍｍ（開口幅Ｗと等しい）の円が内接可能な開口形状を有し、下段の第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂと柱状部材１３によって形成された各開口部は、最大で直径２．５ｍｍ（開口幅Ｗと等しい）の円が内接可能な開口形状を有する。
【0043】
組織構造体製造器具のさらに別の実施形態では、図４Ｂに示すように、器具１０は、柱状部材１３と、外径が１１ｍｍである円環状の２つの第１支持部１１Ａと、その２つの第１支持部１１Ａに挟まれて配置された外径が１１ｍｍである円環状の２つの第２支持部１１Ｂとを備えるものであってよい。上段の１つの第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂとの間には、開口幅Ｗが４．０ｍｍ、深さＤが４．６ｍｍとなるように、直径１ｍｍの６本の柱状部材１３（長さ２０ｍｍ）が固定されており、下段の第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂとの間には、開口幅Ｗが３．０ｍｍであり、深さＤが４．８ｍｍとなるように、直径１ｍｍの８本の柱状部材１３（長さ２０ｍｍ）が支持されている。中段の２つの第２支持部１１Ｂの間には、開口幅Ｗが６．０ｍｍであり、深さＤが４．０ｍｍとなるように、直径１ｍｍの４本の柱状部材１３（長さ２０ｍｍ）が固定されている。図４Ｂに示すこのような器具１０において、上段の第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂと柱状部材１３によって形成された各開口部は、最大で直径４．０ｍｍ（開口幅Ｗと等しい）の円が内接可能な開口形状を有し、下段の第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂと柱状部材１３によって形成された各開口部は、最大で直径３．０ｍｍ（開口幅Ｗと等しい）の円が内接可能な開口形状を有し、中段の２つの第２支持部１１Ｂと柱状部材１３によって形成された各開口部は、最大で直径６．０ｍｍ（開口幅Ｗと等しい）の円が内接可能な開口形状を有する。
【0044】
組織構造体製造器具のさらに別の実施形態では、図４Ｃに示すように、器具１０は、柱状部材１３と、外径が１６ｍｍである円環状の２つの第１支持部１１Ａと、その２つの第１支持部１１Ａに挟まれて配置された外径が１６ｍｍである円環状の２つの第２支持部１１Ｂとを備えるものであってよい。上段の１つの第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂとの間には、開口幅Ｗが５．０ｍｍ、深さＤが７．１ｍｍとなるように、直径１ｍｍの８本の柱状部材１３（長さ２０ｍｍ）が固定されており、下段の第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂとの間には、開口幅Ｗが３．５ｍｍ、深さＤが７．３ｍｍとなるように、直径１ｍｍの１０本の柱状部材１３（長さ２０ｍｍ）が固定されている。中段の２つの第２支持部１１Ｂの間には、開口幅Ｗが６．５ｍｍ、深さＤが６．８ｍｍとなるように、直径１ｍｍの６本の柱状部材１３（長さ２０ｍｍ）が固定されている。図４Ｃに示すこのような器具１０において、上段の第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂと柱状部材１３によって形成された各開口部は、最大で直径５．０ｍｍ（開口幅Ｗと等しい）の円が内接可能な開口形状を有し、下段の第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂと柱状部材１３によって形成された各開口部は、最大で直径３．５ｍｍ（開口幅Ｗと等しい）の円が内接可能な開口形状を有し、中段の２つの第２支持部１１Ｂと柱状部材１３によって形成された各開口部は、最大で直径６．５ｍｍ（開口幅Ｗと等しい）の円が内接可能な開口形状を有する。
【0045】
組織構造体製造器具１０のさらに別の実施形態では、図４Ｄに示すように、器具１０は、柱状部材１３と、外径が１１ｍｍである円環状の２つの第１支持部１１Ａと、その２つの第１支持部１１Ａに挟まれて配置された外径が１０ｍｍである円環状の１つの第２支持部１１Ｂとを備えるものであってよい。２つの第１支持部１１Ａの間には、開口幅Ｗが４．０ｍｍ、深さＤが４．６ｍｍとなるように、直径１ｍｍの６本の柱状部材１３（長さ６０ｍｍ）が固定されており、それらの柱状部材１３はその長手方向の略中央でさらに第２支持部１１Ｂにより固定されている。図４Ｄに示すこのような器具１０において、第１支持部１１Ａと第２支持部１１Ｂと柱状部材１３によって形成された各開口部は、最大で直径４．０ｍｍの円が内接可能な開口形状を有する。
【0046】
組織構造体製造器具のさらに別の実施形態では、図５Ａに示すように、器具１０は、柱状部材１３と、外径が１１ｍｍである円環状の２つの第１支持部１１Ａを備えるものであってよい。２つの第１支持部１１Ａの間には、一方の第１支持部１１Ａから他方の第１支持部１１Ａに向けて、開口幅Ｗが１．０ｍｍから５．０ｍｍまで連続的に変化し、また深さＤが５．０ｍｍから４．３ｍｍまで連続的に変化するように直径１ｍｍの８本の柱状部材１３が固定されている。開口幅Ｗは、器具１０の、支持部１１Ａと平行な短手方向の断面において測定している。図５Ａに示す器具１０の長さ（長手方向の大きさ）は４０ｍｍである。
【0047】
組織構造体製造器具のさらに別の実施形態では、図５Ｂに示すように、器具１０は、柱状部材１３と、外径が１６ｍｍである円環状の２つの第１支持部１１Ａを備えるものであってよい。２つの第１支持部１１Ａの間には、一方の第１支持部１１Ａから他方の第１支持部１１Ａに向けて、開口幅Ｗが１．０ｍｍから８．０ｍｍまで連続的に変化し、また深さＤが７．５ｍｍから６．３ｍｍまで連続的に変化するように、直径１ｍｍの８本の柱状部材１３が固定されている。開口幅Ｗは、器具１０の、支持部１１Ａと平行な短手方向の断面において測定している。図５Ｂに示す器具１０の長さ（長手方向の大きさ）は６０ｍｍである。
【0048】
組織構造体製造器具のさらに別の実施形態では、図６Ａに示すように、器具１０は、支持部の一例である大矩形枠１１Ｃと、支持部の一例である小矩形枠１１Ｄと、柱状部材１３（直径１ｍｍ）とから構成される、略多面体形状を有するものであってよい。大矩形枠１１Ｃは、（縦）２０ｍｍ×（横）１５ｍｍの大きさ（いずれも内寸；矩形枠の厚みは１ｍｍであり、外寸は（縦）２２ｍｍ×（横）１７ｍｍ）を有し、小矩形枠１１Ｄは、（縦）３ｍｍ×（横）１５ｍｍの大きさ（いずれも内寸；矩形枠の厚みは１ｍｍであり、外寸は（縦）５ｍｍ×（横）１７ｍｍ）を有する。図６Ａに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける４つの頂点部と、小矩形枠１１Ｄにおける４つの頂点部とに固定された４本の柱状部材１３を備える。また、図６Ａに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの長辺の中点と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの短辺の中点とを結ぶ１本の柱状部材１３をさらに備える。
【0049】
図６Ａに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの長辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの短辺と、これらと接続する３本の柱状部材１３（大矩形枠１１Ｃ及び小矩形枠１１Ｄと直角に接続する最短の柱状部材１３の長さ５５ｍｍ）とによって区画・形成された、台形状の２つの開口部１０Ｈを有する。図６Ａに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの長辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの短辺と、これらと接続する２本の柱状部材１３とによって区画・形成された、台形状の１つの開口部１０Ｈを有する。また、図６Ａに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの短辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの長辺と、これらと接続する２本の柱状部材１３とによって区画・形成された、長方形状の開口部１０Ｈを有する。図６Ａに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃの２つの長辺及び２つの短辺、並びに小矩形枠１１Ｄの２つの長辺及び２つの短辺によってそれぞれ区画・形成された、２つの貫通開口部１２Ｈをさらに有する。図６Ａに示す器具１０において、開口幅は１．０ｍｍから２０．０ｍｍまでであり、また深さＤは２．０ｍｍから１０．５ｍｍまでである。開口幅Ｗは、器具１０の、大矩形枠１１Ｃの長辺と平行な短手方向の断面において測定している。
【0050】
図６Ｂに示すように、器具１０は、図６Ａに示す器具１０と同じく、支持部の一例である大矩形枠１１Ｃと、支持部の一例である小矩形枠１１Ｄと、柱状部材１３（直径１ｍｍ）とから構成される、略多面体形状を有するものであってよい。大矩形枠１１Ｃは、（縦）２０ｍｍ×（横）１５ｍｍの大きさ（いずれも内寸；矩形枠の厚みは１ｍｍであり、外寸は（縦）２２ｍｍ×（横）１７ｍｍ）を有し、小矩形枠１１Ｄは、（縦）３ｍｍ×（横）１５ｍｍの大きさ（いずれも内寸；矩形枠の厚みは１ｍｍであり、外寸は（縦）５ｍｍ×（横）１７ｍｍ）を有する。図６Ｂに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける２つの頂点部と小矩形枠１１Ｄにおける２つの頂点部に固定された２本の柱状部材１３を備える。また、図６Ｂに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの短辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの長辺とを、スリット２６Ｓ（幅１ｍｍ）を有する１つの板状体２６で接続している。
【0051】
図６Ｂに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの長辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの短辺と、これらに接続する２本の柱状部材１３とによって区画・形成された、台形状の開口部１０Ｈを有する。図６Ｂに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの短辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの長辺と、これらに接続する２本の柱状部材１３とによって区画・形成された、長方形状の開口部１０Ｈを有する。また、図６Ｂに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの長辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの短辺と、これらを接続する板状体２６の縁と、柱状部材１３とによって区画・形成された、台形状の２つの開口部１０Ｈを有する。図６Ｂに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃの２つの長辺及び２つの短辺、並びに小矩形枠１１Ｄの２つの長辺及び２つの短辺によってそれぞれ区画・形成された、２つの貫通開口部１２Ｈをさらに有する。図６Ｂに示す器具１０において、開口幅は１．０ｍｍから２０．０ｍｍまでであり、また深さＤは２．０ｍｍから２０．５ｍｍまでである。開口幅Ｗは、器具１０の、大矩形枠１１Ｃの長辺と平行な短手方向の断面において測定している。
【0052】
図６Ｃに示すように、器具１０は、支持部の一例である大矩形枠１１Ｃと、支持部の一例である小矩形枠１１Ｄと、支持部の一例である中矩形枠１１Ｅと、柱状部材１３（直径１ｍｍ）とから構成される、略多面体形状を有するものであってよい。大矩形枠１１Ｃは、（縦）２０ｍｍ×（横）１５ｍｍの大きさ（いずれも内寸；矩形枠の厚みは１ｍｍであり、外寸は（縦）２２ｍｍ×（横）１７ｍｍ）を有し、中矩形枠１１Ｅは、（縦）１５ｍｍ×（横）１５ｍｍの大きさ（いずれも内寸；矩形枠の厚みは１ｍｍであり、外寸は（縦）１７ｍｍ×（横）１７ｍｍ）を有し、小矩形枠１１Ｄは、（縦）３ｍｍ×（横）１５ｍｍの大きさ（いずれも内寸；矩形枠の厚みは１ｍｍであり、外寸は（縦）５ｍｍ×（横）１７ｍｍ）を有する。図６Ｃに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける４つの頂点部と小矩形枠１１Ｄにおける４つの頂点部に固定された４本の柱状部材１３を備え、４本の柱状部材１３は中矩形枠１１Ｅでさらに固定されている。図６Ｃに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの長辺の中点と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの短辺の中点とを結び、中間部で中矩形枠１１Ｅでさらに固定されている、１本の柱状部材１３をさらに備える。
【0053】
図６Ｃに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの短辺と、中矩形枠１１Ｅにおける１つの辺と、これらに接続する２本の柱状部材１３とによって区画・形成された、長方形状の開口部１０Ｈを有する。図６Ｃに示す器具１０は、中矩形枠１１Ｅにおける１つの辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの長辺と、これらに接続する２本の柱状部材１３とによって区画・形成された、長方形状の開口部１０Ｈを有する。また、図６Ｃに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの長辺と、中矩形枠１１Ｅにおける１つの辺と、これらに接続する３本の柱状部材１３とによって区画・形成された、台形状の２つの開口部１０Ｈを有する。図６Ｃに示す器具１０は、中矩形枠１１Ｅにおける１つの辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの短辺と、これらに接続する３本の柱状部材１３とによって区画・形成された、台形状の２つの開口部１０Ｈを有する。図６Ｃに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃにおける１つの長辺と、中矩形枠１１Ｅにおける１つの辺と、これらに接続する２本の柱状部材１３とによって区画・形成された、長方形状の開口部１０Ｈを有する。図６Ｃに示す器具１０は、中矩形枠１１Ｅにおける１つの辺と、小矩形枠１１Ｄにおける１つの短辺と、これらに接続する２本の柱状部材１３とによって区画・形成された、長方形状の開口部１０Ｈを有する。図６Ｃに示す器具１０は、大矩形枠１１Ｃの２つの長辺及び２つの短辺、並びに小矩形枠１１Ｄの２つの長辺及び２つの短辺によってそれぞれ区画・形成された、２つの貫通開口部１２Ｈをさらに有する。図６Ｃに示す器具１０において、開口幅は１．０ｍｍから２０．０ｍｍまでであり、また深さＤは２．０ｍｍから１０．５ｍｍまでである。開口幅Ｗは、器具１０の、大矩形枠１１Ｃの長辺と平行な短手方向の断面において測定している。
【0054】
開口部１０Ｈの位置は、器具１０の周方向及び／又は軸方向Ａｘに並ぶ位置に限らず、器具１０の長手方向に延びる螺旋上に周期的に定められる位置とすることも可能である。また、開口部１０Ｈの位置は、１つずつの開口部１０Ｈが所定の方向に繰り返される構成に限らず、例えば、複数の開口部１０Ｈが１つの開口群を構成し、複数の開口群が所定の方向に繰り返される構成であってもよい。
【0055】
組織構造体製造器具のさらに別の実施形態では、器具１０又は枠体の形状は、特に限定されず、棒状であってもよいし、略多面体形状（例えば、立方体状、直方体状等）であってもよいし、略球状又は略半球状であってもよい。器具１０又は枠体の形状は、直線的な棒状に限らず、例えば、曲線状とすることも可能である。
【0056】
組織構造体製造器具のさらに別の実施形態では、図７に示すように、器具１０を構成する枠体がコイル状であり、開口縁１０Ｆがコイルの周方向に連なる１つ以上の螺旋形状であってもよい。コイル状に巻き回された線状部材１６の隣り合う円周部分間の最短距離として開口幅Ｗを測定することができる。開口幅Ｗが少なくとも２．５ｍｍ、例えば、２．５ｍｍ以上２８ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２５ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２０ｍｍ以下；又は３．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下となる開口形状を有する開口部を、器具１０が備えることが好ましい。また、コイル状の器具１０の中心軸と、コイル状に巻き回された線状部材１６との最短距離を、深さＤとして算出することもでき、深さＤが少なくとも２ｍｍ、例えば、２ｍｍ以上３０ｍｍ以下；２ｍｍ以上２６ｍｍ以下；又は２ｍｍ以上１２ｍｍ以下となる領域を、器具１０が有してもよい。
【0057】
組織構造体製造器具のさらに別の実施形態では、器具１０は、例えば、図８に示すように、中空部を有する立方体状や直方体状の枠体から構成されていてもよい。立方体状や直方体状の側面１７は開口部１０Ｈを備え、側面１７を構成する隣り合う柱状部材間の最短距離として開口幅Ｗを測定することができる。その開口幅Ｗが少なくとも２．５ｍｍ、例えば、２．５ｍｍ以上２８ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２５ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２０ｍｍ以下；又は３．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下となる少なくとも１つの開口部を、器具１０又は枠体が備えることが好ましい。また、立方体状や直方体状の器具１０又は枠体の中心点と、器具１０の側面との最短距離として、深さＤを算出することもできる。深さＤが少なくとも２ｍｍ、例えば、２ｍｍ以上３０ｍｍ以下；２ｍｍ以上２６ｍｍ以下；又は２ｍｍ以上１２ｍｍ以下となる領域を、器具１０が有してもよい。
【0058】
器具１０の枠体が有する形状は、例えば、図８に示す立方体形状や直方体形状の構造が１つの面上に連なる形状であってもよい。
【0059】
組織構造体製造器具のさらに別の実施形態では、器具１０はステント形状であってもよい。図９に示すステント形状の器具１０は、拡張及び収縮可能な網目状の筒形態を有し、その網目が開口部１０Ｈを形成し、両端にはバルーン挿入用の端部開口部１４Ｈを有するものであってよい。本発明は、例えば、図９に示すステント形状の器具を、組織構造体製造器具として用いることができる。典型的な実施形態では、生体組織材料が存在する環境下、例えば、生体内の生体組織に、閉じたステントをマウントしたバルーンカテーテルを挿入し、皮下で水圧を付加してバルーンを拡張させ、ステントを拡径させ、次いで水圧を解除し、バルーンを収縮させて抜去することにより、ステントを容易に埋設することができる。
【0060】
上記組織構造体製造器具を用いた、体性幹細胞が集積した組織構造体の製造方法は、生体組織材料が存在する環境下、例えば、生体内又は生体組織中に当該組織構造体製造器具を配置し、一定期間にわたり留置することを含む。生体組織材料が存在する環境、例えば、生体内の生体組織は、線維芽細胞を含むものであってよい。生体組織は、外胚葉系組織、中胚葉系組織、又は内胚葉系組織であってよい。組織構造体製造器具を留置する生体組織は、健常状態で体性幹細胞が存在する組織であってもよいし、傷害部又は欠損部のように組織修復に必要とされる体性幹細胞が存在する組織であってもよい。線維芽細胞が存在する生体組織の１つの好ましい例は、皮下組織である。
【0061】
組織構造体製造器具は、生体内の生体組織内に埋設し留置することができる。あるいは、組織構造体製造器具は、生体内の生体組織を模倣した人工環境、すなわち、生体内から取り出された生体組織を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系や、生体内の生体組織を模倣して生体外に構築された環境下に留置してもよい。生体内の生体組織を模倣した人工環境としては、単離された細胞又は組織の三次元培養によって作製された人工組織又は人工臓器などが挙げられる。
【0062】
生体内の生体組織に組織構造体製造器具を埋設し留置する際には、必要に応じて麻酔下で、生体又は生体組織を切開し、挿入口を形成する。次いで、挿入口に組織構造体製造器具を挿入する。組織構造体製造器具が埋設された後、切開の傷口が縫合される。
【0063】
埋設する生体組織は、体性幹細胞の入手起源となりうる任意の動物のものであってよく、例えば、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類、並びにイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウスなどを含む哺乳動物、また鳥類、魚類、両生類等の動物が挙げられるが、これらに限定されない。組織構造体製造器具を埋設する部位は、特に限定されないが、腹部、胸部、肩部、背部、四肢、又は腹腔内等であってよい。
【0064】
生体組織材料が存在する環境下に配置された組織構造体製造器具は、器具内中空部に、凹部を有し線維性結合組織により構成されたコア部とその凹部内に体性幹細胞が集積した組織とが形成されるまで、そこに留置する。
【0065】
生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織に組織構造体製造器具を留置する時間は、生体組織において過度な炎症を引き起こすことなく体性幹細胞の十分な集積を可能にする期間であることが好ましく、埋設部位、生体生物種、器具のサイズなどに応じて適宜設定することができる。そのような留置時間は、一般的には５日〜４ヶ月間であり得るが、好ましくは１週間（７日間）以上３ヶ月以下であり、例えば１週間以上２ヶ月以下、１週間以上５週間以下、９日間以上５週間以下、９日間以上４週間以下、２週間以上５週間以下、２週間以上４週間以下、２週間以上３週間以下、又は３週間以上５週間以下であってよい。
【0066】
留置期間後、組織構造体製造器具を生体組織材料が存在する環境下から取り出す。取り出した組織構造体製造器具内には、体性幹細胞が集積した組織を含む凹部を有する、線維性結合組織を含むコア部を有する組織構造体が形成されている。
【0067】
器具１０の生体からの取り出しの際には、必要に応じて麻酔下で、組織構造体製造器具の埋設部位を切開する。切開部から組織構造体製造器具を取り出した後、傷口の縫合を施すことが好ましい。
【0068】
このようにして生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織から、組織構造体製造器具を取り出すことにより、組織構造体を単離することができる。取り出した組織構造体製造器具から、組織構造体を分離することにより、組織構造体を回収してもよい。このようにして、組織構造体製造器具を用いて、組織構造体を製造することができる。
【0069】
本発明は、上記の組織構造体製造器具を用いて製造可能な、本発明に係る組織構造体も提供する。より具体的には、本発明は、凹部を有し線維性結合組織で構成されたコア部と、その凹部に形成されたＩＩＩ型コラーゲン及び体性幹細胞を含む疎線維性の組織（体性幹細胞集積組織）とを有する、組織構造体に関する。
【0070】
本発明において組織構造体のコア部２５を構成する線維性結合組織２２は、コラーゲン線維と線維芽細胞を主成分とする、線維密度が高く強靭な組織である。本発明におけるコア部を構成する線維性結合組織は、密性結合組織と称することもでき、脂肪組織や疎性結合組織とは異なる。本発明におけるコア部を構成する線維性結合組織は、コラーゲンとして、主にＩ型コラーゲンを含むことが好ましい。一方、通常、本発明のコア部におけるＩＩＩ型コラーゲン含量は少なく、特にその中心部にはＩＩＩ型コラーゲンはごくわずかに存在するだけである。好ましい実施形態では、本発明のコア部における総コラーゲン中のＩ型コラーゲンの比率は６５〜９０重量％程度、例えば７０〜８５重量％程度、ＩＩＩ型コラーゲンの比率は５〜３０重量％程度、例えば１０〜２５重量％程度である（例えば、図１２Ａ及びＢ）。好ましい実施形態では、本発明において線維性結合組織で構成されるコア部において、凹部の近傍には体性幹細胞が存在し得るが、凹部から離れた領域（特に、コア部の中心部）には体性幹細胞は全く存在しないか又はほぼ存在しない。
【0071】
一方、凹部に形成される体性幹細胞集積組織２３（ポケット部）は、体性幹細胞を含み、特に体性幹細胞２３Ｃが富化された、疎線維性組織である。本発明における凹部に形成される体性幹細胞集積組織はＩＩＩ型コラーゲンを含み、そのＩＩＩ型コラーゲン含量はコア部のＩＩＩ型コラーゲン含量と比較して多い。凹部に形成される体性幹細胞集積組織は、線維芽細胞、血管内皮細胞等の他の細胞を含んでもよいし、他の種類のコラーゲンや他の物質をさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明の体性幹細胞集積組織における総コラーゲン中のＩ型コラーゲンの比率は３０〜７５重量％程度、例えば３５〜６５重量％程度、総コラーゲン中のＩＩＩ型コラーゲンの比率は２０〜６５重量％程度、例えば３０〜６０重量％である（例えば、図１２Ｃ）。凹部に形成される体性幹細胞集積組織中の線維は少量でありランダムに配向している。凹部に形成される体性幹細胞集積組織２３は、コラーゲン線維を疎らにしか含んでいないことから、疎線維性であり軟組織である。なお体性幹細胞集積組織２３が形成される凹部は、通常、コア部の外面に存在する。
【0072】
好ましい実施形態では、本発明の組織構造体の凹部に形成される体性幹細胞集積組織（ポケット部）における総コラーゲン中のＩＩＩ型コラーゲンの比率は、その組織構造体のコア部における総コラーゲン中のＩＩＩ型コラーゲンの比率よりも高い。一実施形態では、前者（ポケット部におけるＩＩＩ型コラーゲンの比率）が３０〜６０重量％、後者（コア部におけるＩＩＩ型コラーゲンの比率）が１０〜２５重量％であり得る。
【0073】
好ましい実施形態では、本発明の組織構造体の凹部に形成される体性幹細胞集積組織（ポケット部）における総コラーゲン中のＩ型コラーゲンの比率は、その組織構造体のコア部における総コラーゲン中のＩ型コラーゲンの比率よりも低い。一実施形態では、前者（ポケット部におけるＩ型コラーゲンの比率）が３５〜６５重量％、後者（コア部におけるＩ型コラーゲンの比率）が７０〜８５重量％であり得る。
【0074】
本発明に係る組織構造体、特にコア部及び体性幹細胞集積組織は、弾性線維を実質的に含まない。本発明において「弾性線維を実質的に含まない」とは、エラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ）染色で全く検出されないか又は実質的に検出されないことを意味する。
【0075】
本発明に係る組織構造体は、組織構造体製造器具の中空部において形成される際、器具内中空部を埋めるようにして形成されるため、器具内中空部の形状に沿った形状となる。例えば、図４Ｄに示す組織構造体製造器具を用いて組織構造体の製造を行った場合、図１１の組織構造体断面写真に示されるように、線維性結合組織により構成されるコア部は、柱状部材１３の配置に従って、組織構造体の中心部から６本の柱状部材１３の表面へと放射状に延び、かつ柱状部材１３と柱状部材１３の間の各開口部の直下に凹部を１つずつ（合計６つの凹部）形成しており、その６つの凹部にそれぞれ体性幹細胞集積組織が形成されている。したがって、本発明に係る組織構造体は、中空部を形成する枠体によりその形状が規定される。すなわち、本発明に係る組織構造体は、組織構造体製造器具により成形される。
【0076】
本発明における線維性結合組織から構成される「コア部」は、組織構造体の中核部を指し、その凹部に形成された体性幹細胞集積組織を支持するものである。好ましい実施形態では、本発明のコア部は、組織構造体の中心部から、組織構造体の最外面に向かって連続的に広がっている。本発明において組織構造体の「中心部」は、例えば、組織構造体が棒状の場合には、組織構造体の中心軸（長手方向中心軸）の全長若しくは一部及び／又はその周方向近傍の領域を指し、その中心軸は、組織構造体の短手方向の各断面（長手方向に直交する断面）の中心点（幾何中心）を結んだ線を指す。あるいは、本発明における組織構造体の「中心部」は、例えば、組織構造体が略多面体状の場合には、組織構造体の中心軸（長手方向中心軸）の全長若しくは一部及び／又はその周方向近傍の領域を指し、その中心軸は、組織構造体の短手方向の各断面の中心点（幾何中心）を結んだ線を指す。
【0077】
本発明に係る組織構造体のコア部は、少なくとも２．５ｍｍの径を有することが好ましい。コア部の「径」は上述の定義のとおりであり、コア部の短手方向の断面に対して両側から接する二本の平行線の間の最長距離として決定される。コア部の径は、典型的には、コア部の短手方向の断面上の、コア部の中心部を挟んで反対側に存在する２つの凹部周縁部２４の端部２４Ｅ（図２２）間の最長距離であり得る。
【0078】
一実施形態では、本発明に係る組織構造体又はそのコア部は、中実であってもよいし、中実でなくてもよい。組織構造体又はそのコア部について「中実」とは、組織構造体又はそのコア部の中心部まで組織が詰まっていることを意味する。なお生体組織材料が存在する環境下に留置後の組織構造体製造器具内から取り出した組織構造体においては、柱状部材の外側にも薄い組織の膜が形成されていることがあるが、そのような薄い組織の膜の存在は、本発明に係る組織構造体及又はそのコア部が中実でないことを意味しない。
【0079】
本発明の組織構造体は、コア部において、体性幹細胞集積組織がその内部に形成された少なくとも１つの凹部を有し、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上の当該凹部を有してもよい。本発明の組織構造体は、コア部において、例えば４、５、６、７、８、９、又は１０以上の、体性幹細胞集積組織が形成された凹部を有してもよい。本発明の組織構造体のコア部が有する、体性幹細胞集積組織が形成された凹部は、組織構造体１個当たり、例えば１〜５０、３〜５０、４〜４０、４〜３０、５〜３０、３〜２０、３〜１５、３〜１０、４〜１５、又は５〜１５個であり得る。凹部は線維性結合組織により形成されている。コア部における各凹部の内面は典型的には略曲面状（例えば、すり鉢状）に構成されている。
【0080】
本発明の組織構造体において、体性幹細胞集積組織が形成された凹部は、以下に限定するものではないが、少なくとも２．５ｍｍの開口幅ＷＷを有することが好ましい。凹部の開口幅ＷＷは、その組織構造体の製造に使用された組織構造体製造器具の枠体の開口部の開口幅Ｗと同一とみなして算出することができる。あるいは、本発明の組織構造体における凹部の開口幅ＷＷは、組織構造体製造器具を取り外した後の組織構造体の短手方向の断面において、組織構造体製造器具の枠体（例えば、柱状部材、支持部、線状部材等）の周囲に形成された凹部周縁部２４の、枠体（例えば、柱状部材、支持部、線状部材等）表面上の端部（枠体の開口部の開口縁に対応）間の最短距離として決定することができる。本発明の組織構造体において、コア部の上記凹部は、開口幅ＷＷが２．５ｍｍ以上、例えば、２．５ｍｍ以上２８ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２５ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２０．０ｍｍ以下；又は３．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下である開口形状を有することが好ましい。
【0081】
あるいは、又は上記に加えて、本発明の組織構造体のコア部の、体性幹細胞集積組織が形成された凹部は、２．５ｍｍ又はそれを超える直径（例えば、３．０ｍｍ又はそれを超える直径）の円が内接可能な開口形状（形及び大きさ）を有することが好ましい。上記凹部の開口は、例えば、２．５ｍｍ以上２８ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２５ｍｍ以下；２．５ｍｍ以上２０ｍｍ以下；又は３．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下の直径の円が内接可能な形状及び大きさを有するものであり得る。そのような形状及び大きさを有する、上記凹部の開口は、線維性結合組織の凹部及びその凹部内の体性幹細胞集積組織の形成に特に適している枠体の開口部の開口形状に対応したものである。ここで、本発明の組織構造体のコア部の凹部の開口について「円が内接可能」とは、当該開口の開口形状（例えば、矩形、又は多角形）の内側に、所定の直径を有する円が当該開口に１点以上で接して収まることができることを意味する。例えば、長辺２０ｍｍ、短辺２．５ｍｍの長方形の開口形状には、最大２．５ｍｍの直径の円が内接可能である。
【0082】
一実施形態では、本発明の組織構造体において、線維性結合組織又はコア部は、凹部周縁部によって区画された複数の凹部を有していてもよい。
【0083】
一実施形態では、本発明の組織構造体の線維性結合組織又はコア部の外面は、複数の凹部と複数の凹部周縁部によって構成され得る。
【0084】
本発明に係る組織構造体は、棒状（例えば、略円柱状又は略多角柱状など）、略多角体状、略錐台状、略球状等の任意の形状を有していてよい。一実施形態では、本発明の組織構造体の形状が棒状であり、複数の上記凹部がその周方向に沿って位置するものであってよい。別の実施形態では、本発明の組織構造体の形状は棒状であり、複数の上記凹部がその軸方向に沿って位置するものであってもよい。別の実施形態では、本発明の組織構造体の形状が棒状であり、複数の上記凹部がその軸方向及び周方向に沿って位置するものであってもよい。
【0085】
さらに別の実施形態では、本発明の組織構造体の形状が略多面体状であり、複数の上記凹部が、略多面体の異なる面に位置するものであってよい。
【0086】
本発明の組織構造体の形状は、非管状であることが好ましく、さらに、非シート状であることが好ましい。
【0087】
本発明の組織構造体は、コア部の凹部に形成された疎線維性組織を有する。本発明の組織構造体の凹部に形成されたその組織には体性幹細胞が集積している（体性幹細胞集積組織）。体性幹細胞集積組織に含まれる体性幹細胞は、間葉系幹細胞及び多能性幹細胞の少なくとも一方を含むことが好ましく、間葉系幹細胞及び多能性幹細胞の両方を含むことがさらに好ましい。体性幹細胞集積組織は、幹細胞マーカーを発現している幹細胞、例えば、少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーを発現している多能性幹細胞及び／又は少なくとも１つの間葉系幹細胞マーカーを発現している間葉系幹細胞を含み得る。体性幹細胞集積組織は、好ましくは、多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ３の両方を発現している多能性幹細胞を含む。体性幹細胞集積組織はまた、ＳＳＥＡ３及びＳＳＥＡ４のいずれか一方を発現している幹細胞、例えば多能性幹細胞も含み得る。体性幹細胞集積組織はまた、間葉系幹細胞マーカーＣＤ９０及びＣＤ１０５の両方又は一方を発現している間葉系幹細胞を含み得る。体性幹細胞集積組織はまた、間葉系幹細胞マーカーＣＤ９０、又はＣＤ９０とＳＳＥＡ３の両方を発現している幹細胞を含み得る。体性幹細胞集積組織はまた、間葉系幹細胞マーカーＣＤ１０５、又はＣＤ１０５とＳＳＥＡ３の両方を発現している幹細胞を含み得る。体性幹細胞集積組織はまた、増殖因子マーカーＶＥＧＦ、又はＶＥＧＦとＳＳＥＡ３の両方を発現している幹細胞を含み得る。そのような幹細胞は、高い血管新生能を有する幹細胞である。体性幹細胞集積組織はまた、増殖因子マーカーＨＧＦを発現している幹細胞を含み得る。本発明の組織構造体の体性幹細胞集積組織は、上記マーカーに加えて、又は上記マーカーの代わりに、異なるマーカーを発現する体性幹細胞、例えば多能性幹細胞、間葉系幹細胞を含んでもよい。
【0088】
好ましい実施形態では、本発明の組織構造体は、それに含まれる全細胞数に対し、体性幹細胞（間葉系幹細胞及び多能性幹細胞を含む）を、１％以上、５％以上、１０％以上、又は３０％以上、及び、６０％以下、５０％以下、４０％以下、又は３０％以下の比率、例えば１〜６０％、５〜４０％、５〜３０％、又は５〜２０％の比率（細胞数ベースの幹細胞比率）で含み得る。
【0089】
好ましい実施形態では、本発明の体性幹細胞集積組織は、それに含まれる全細胞数に対し、体性幹細胞（間葉系幹細胞及び多能性幹細胞を含む）を、２０％以上、３０％以上、又は５０％以上、及び、９０％以下、８０％以下、又は７０％以下の比率、例えば、２０〜９０％、３０〜９０％、３０〜８０％、又は５０〜９０％（細胞数ベースの幹細胞比率）の比率で含み得る。
【0090】
好ましい実施形態では、本発明の組織構造体及び／又は体性幹細胞集積組織を、実施例４に記載されたように、０．２５％コラゲナーゼタイプＩ溶液中で３７℃で１．５時間処理したとき、それにより分解された組織（体性幹細胞集積組織とその周囲）から回収された細胞は、その全細胞数に対し、体性幹細胞（間葉系幹細胞及び多能性幹細胞を含む）を、２０％以上、３０％以上、又は５０％以上、及び、９０％以下、８０％以下、又は７０％以下の比率、例えば、２０〜９０％、３０〜９０％、３０〜８０％、又は５０〜９０％（細胞数ベースの幹細胞比率）の比率で含み得る。
【0091】
以上の幹細胞比率は、少なくとも１つの幹細胞マーカー（以下に限定するものではないが、例えば、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４からなる群から選択される少なくとも１つ、又はＣＤ９０、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４からなる群から選択される少なくとも１つ）を発現している細胞の数を幹細胞数（体性幹細胞数）として用いて、算出することができる。
【0092】
一実施形態では、本発明の組織構造体及び体性幹細胞集積組織は、間葉系幹細胞と多能性幹細胞を、以下に限定されないが、間葉系幹細胞：多能性幹細胞＝６０〜９５：５〜４０、６０〜８０：１０〜３０、又は６５〜７５：１５〜２５の比率で含むことができる。この間葉系幹細胞 対 多能性幹細胞比は、少なくとも１つの間葉系幹細胞マーカー（以下に限定するものではないが、例えば、ＣＤ９０又はＣＤ１０５）を発現している細胞の数を間葉系幹細胞数とし、少なくとも１つの多能性幹細胞マーカー（以下に限定するものではないが、例えば、ＳＳＥＡ３又はＳＳＥＡ４）を発現している細胞の数を多能性幹細胞数として用いて、算出することができる。
【0093】
本発明の組織構造体において凹部に形成される体性幹細胞集積組織は、そのような体性幹細胞に加え、ＩＩＩ型コラーゲンを含んでおり、さらに、線維芽細胞、血管内皮細胞等の他の細胞を含んでもよいし、他の種類のコラーゲンや他の物質をさらに含んでもよい。血管内皮細胞の存在は、例えば、血管内皮細胞マーカーｖＷＦの発現を検出することにより調べることができる。線維芽細胞の存在は、例えば、線維芽細胞マーカーｖｉｍｅｎｔｉｎの発現を検出することにより調べることができる。
【0094】
本発明の組織構造体では特にその比較的外側の領域でＶＥＧＦの高発現が見られ得る。一方、本発明の組織構造体の中心部に多く含まれる線維芽細胞では典型的にはＶＥＧＦの発現が弱い。
【0095】
本発明の組織構造体は、生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織に、上記の組織構造体製造器具を留置することによって形成されるものであってよい。
【0096】
本発明の組織構造体は、生体組織材料が存在する環境下で、上記の組織構造体製造器具を用いて製造された後、当該器具内に入ったままの状態であってもよい。その場合、組織構造体が組織構造体製造器具内の中空部を埋めた（満たした）状態であり、そのコア部は当該器具の枠体（例えば、柱状部材、支持部、線状部材等）の表面に密着していることが好ましい。あるいは本発明の組織構造体は、その形成後、組織構造体製造器具から分離されたものであってもよい。
【0097】
本発明の組織構造体の線維性結合組織（コア部）の凹部に形成された体性幹細胞集積組織は、線維性結合組織から、容易に採取することができる。例えば、本発明の組織構造体の線維性結合組織２２（コア部２５）の凹部２２Ｈから、体性幹細胞集積組織２３を容易に掻き取ることができる。あるいは、生体組織材料が存在する環境下、例えば生体内の生体組織から取り出された器具１０から、集積された体性幹細胞２３Ｃを含む体性幹細胞集積組織２３を、凹部２２Ｈから掻き取ったり、酵素分解したりすることによって、体性幹細胞集積組織２３又は体性幹細胞２３Ｃを回収することができる。生体組織材料が存在する環境下から取り出した器具１０を、直接、コラゲナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｒ）；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ディスパーゼなどの分解酵素により酵素処理することによって、体性幹細胞２３Ｃを器具内中空部において凹部に形成された体性幹細胞集積組織２３から分離してもよい。あるいは、凹部２２Ｈから掻き取った体性幹細胞集積組織２３を、コラゲナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｒ）；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ディスパーゼなどの分解酵素により酵素処理することによって、体性幹細胞２３Ｃを体性幹細胞集積組織２３から分離してもよい。酵素処理時間は、処理物の量にも依存するが、典型的には、０．５〜２時間程度であってよい。酵素処理によって生き残った細胞を、線維性結合組織２２から分離し、そこから体性幹細胞２３Ｃを回収してもよい。
【0098】
さらなる単離精製工程により、体性幹細胞２３Ｃの精製度を増加させることもできる。例えば、膜フィルターやメッシュフィルターなどを用いる濾過処理によって、体性幹細胞２３Ｃを含む細胞を分離してもよい。体性幹細胞２３Ｃの単離精製は、幹細胞マーカー（多能性幹細胞マーカー及び又は間葉系幹細胞マーカー）等の、体性幹細胞の細胞表面に特異的に発現しているマーカーを用いて行うことができる。例えば、多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ３の一方又は両方、間葉系幹細胞マーカーＣＤ１０５及びＣＤ１０５の一方又は両方を、幹細胞マーカーとして用いることができる。体性幹細胞集積組織から、例えば、磁気細胞分離（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）、蛍光活性化細胞分離（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）等のセルソーティング法を始めとする常法により、体性幹細胞を容易に分離及び／又は濃縮することができる。
【0099】
本発明は、本発明の組織構造体から、体性幹細胞集積組織又は体性幹細胞を分離することを含む、体性幹細胞２３Ｃの収集方法にも関する。
【0100】
本発明の組織構造体の体性幹細胞集積組織から単離された体性幹細胞は、必要に応じて適宜培養及び増殖してもよいし、しなくてもよい。あるいは、体性幹細胞集積組織又はそこから部分精製された体性幹細胞を含む細胞集団を、必要に応じて適宜培養及び増殖してもよいし、しなくてもよい。体性幹細胞集積組織、体性幹細胞を含む細胞集団、又は体性幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの組織構築又は細胞分化用に用いることができる。体性幹細胞集積組織、体性幹細胞を含む細胞集団、又は体性幹細胞は、患者に投与して、再生医療用、例えば、組織修復（組織再生）、組織若しくは臓器の障害若しくは機能低下を修復又は改善するために、用いることができる。すなわち、本発明で得られる体性幹細胞集積組織、体性幹細胞を含む細胞集団、又は体性幹細胞を含む細胞製剤は、再生医療用、例えば、組織修復（組織再生）、組織若しくは臓器の障害若しくは機能低下の修復又は改善用のものであり得る。
【0101】
本発明で得られる体性幹細胞集積組織、体性幹細胞を含む細胞集団、又は体性幹細胞は、生体組織外で目的とする細胞に分化を誘導されてから、患者に投与してもよいし、適切な生体組織（組織若しくは臓器の障害若しくは機能低下が生じている部位など）に分化誘導なしで投与してもよい。本発明で得られる体性幹細胞集積組織、体性幹細胞を含む細胞集団、又は体性幹細胞は、常法に従って凍結保存することができ、必要な時期に投与することができる。
【0102】
本発明によれば、体性幹細胞が集積された組織構造体を製造することができ、それにより体性幹細胞を効率よく収集し、体性幹細胞の取得及び利用を容易にすることができる。
【実施例】
【0103】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0104】
［材料及び器具］本願明細書の実施例では、以下の被験動物、試薬及び機器を使用した。
− 被験動物：ビーグル犬、雌、３歳齢、体重１０ｋｇ
− 図４〜６に示す組織構造体製造器具
− 図９に示す形状のステント、及びバルーンカテーテル
− 組織保存液ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（Ｒ）ＦＲＳ（ＢｉｏＬＩｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，１０１１０２）
− コラゲナーゼタイプＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＬＳ００４２１４）
− ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭ−ＬＧ（低グルコース）；Ｗａｋｏ，０４１−２９７７５）
− 細胞凍結保存液バンバンカー（Ｒ）（日本ジェネティクス，ＣＳ−０２−００１）
− ４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Ｗａｋｏ，１６３−２０１４６）
− 溶血試薬ＶｅｒｓａＬｙｓｅ Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ａ０９７７７）
− ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｓｅｒａ，ＦＢ−１３６５）
− リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
− キシレン（武藤化学，４３１３）
− １００％エタノール（武藤化学，４０２６）
− 媒染剤（武藤化学，４００６−１）
− 第二媒染剤（武藤化学，８１４１−１）
− ワイゲルト鉄ヘマトキシリン液１（武藤化学，４０３４−１）
− ワイゲルト鉄ヘマトキシリン液２（武藤化学，４０３５−１）
− ０．７５％オレンジＧ（武藤化学，４０２３−１）
− １％酢酸（武藤化学，４０１７−１）
− マッソン染色液Ｂ（武藤化学，４０２５−１）
− ２．５％リンタングステン酸液（武藤化学，４０１８−１）
− アニリン青液（武藤化学，４０２０−１）
− 前田変法レゾルシル・フクシン液（武藤化学，４０３２−１）
− ワンギーソン液Ａ（武藤化学，４０３６−１）
− ワンギーソン液Ｂ（武藤化学，４０３７−１）
− １％シリウスレッド液（武藤化学，３３０６−１）
− クエン酸バッファー（Ｓｉｇｍａ，Ｃ９９９９−１０００ＭＬ）
− ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｗａｋｏ，０１３−２５７７３）
【0105】
＜一次抗体＞− 抗ＣＤ９０抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ１２３５１１）
− 抗ＣＤ１０５抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ１５６７５６）
− 抗ＳＳＥＡ４抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ１６２８７）
− 抗ＶＥＧＦＡ抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ１３１６）
− 抗ＨＧＦ抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ８３７６０）
− 抗ＳＳＥＡ３抗体（Ｂｉｏｓｓ，ｂｓ−３５７５Ｒ）
− 抗Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ６９９４）
− 抗ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ８０６９）
【0106】
＜二次抗体（蛍光標識）＞− ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）４８８）（ａｂｃａｍ，ａｂ１５０１１３）
− ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５９４）（ａｂｃａｍ，ａｂ１５００８０）
− ＰｒｏＬｏｎｇＴＭ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐ３６９３１）
− 細胞染色バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４２０２０１）
− ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ９０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３２８１０７）
− 抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０４８−７００）
− ヤギ抗ウサギＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０４８−６００）
− ＭＡＣＳバッファー（ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｒ）Ｒｉｎｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０９１−２２２）
− ＭＡＣＳ分離カラム（ＭＳカラム；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０４２−２０１）
− 蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ−Ｕ）
− 偏光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，ＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ１０００）
【0107】
［実施例１］生体内組織形成術（ｉＢＴＡ）による組織構造体の作製ビーグル犬を麻酔し、右側腹部から背部にかけて５ヶ所の皮膚を電気メスで切開した後、皮下に、図４Ｄ及び図１０Ａに示す形状の組織構造体製造器具を各箇所に１つずつ挿入して埋設し、傷口を縫合した。３週間留置した後、ビーグル犬を麻酔し、皮膚を切開し、皮下の組織構造体製造器具を取り出した。使用した組織構造体製造器具は、直径１ｍｍ、長さ６０ｍｍの円柱状の６本の柱状部材１３をその両端部と中間部で直径１１ｍｍの円環状の支持部により固定したものであり、その開口幅Ｗは４．０ｍｍ、深さＤは４．６ｍｍである。
【0108】
皮下から取り出した器具のほぼ全体が軟組織に覆われていた。断面を観察したところ、器具内の中空部（中空空間）には中心まで組織が詰まっていた。生体内に埋設し留置した組織構造体製造器具内の中空部に細胞が集積し、組織形成されたものと考えられた。埋設部位の違いは組織形成にほとんど影響しなかった。
【0109】
図１０に、使用した器具（Ａ）、生体内埋設の３週間後に取り出された器具（Ｂ）、及び得られた組織構造体の断面（Ｃ）の写真の例を示す。
【0110】
生体内に本発明に係る組織構造体製造器具を埋設し留置することにより、組織構造体を作製できることが示された。
【0111】
皮下から取り出した組織構造体製造器具は、組織保存液ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（Ｒ）ＦＲＳの入った１５ｍＬ遠心管に入れて氷上に置き、４℃で保存して２４時間以内に次の処理を行った。
【0112】
クリーンベンチ内で、組織保存液から、形成された組織構造体を内部に有する組織構造体製造器具を取り出し、ＰＢＳの入った遠心管で軽く洗浄後、器具周囲の余分な組織をトリミングした。トリミング後、写真を撮影し、当該器具をＤＭＥＭ中で保存した。
【0113】
［実施例２］組織構造体の組織学的分析実施例１で生体内から取り出した組織構造体製造器具を、４％ＰＦＡで４℃で２４時間処理することにより組織を固定し、次いで器具を取り外して組織構造体のパラフィン包埋ブロックを作製した。
【0114】
パラフィン包埋ブロックを、短手方向にミクロトームで厚さ３〜５μｍの切片を作製した。切片についてヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色、マッソン・トリクローム（ＭＴ）染色、エラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ）染色、及びシリウスレッド（ＳＲ）染色を行い、顕微鏡で観察を行った。
【0115】
染色の結果、組織構造体は全体的にＨＥ染色で桃色に（図１１Ａ）、ＭＴ染色で青色に（図１１Ｂ）、染色されたことから、得られた組織構造体にはコラーゲン線維が豊富に含まれていることが示された。さらに組織構造体は全体的にＳＲ染色で赤色に染まったことから、コラーゲンが豊富に含まれていることが示された（図１１Ｄ）。組織構造体における、特に組織構造体製造器具の柱状部材の周囲から中心部にかけての領域は、濃染されたことから示されるとおり、コラーゲンが密に存在していた。したがって組織構造体の上記柱状部材周囲及び中心部では線維性の結合組織が形成されたことが示された。これに対し、組織構造体の、上記柱状部材間に当たる位置には、ＨＥ、ＭＴ及びＳＲ染色の全てで淡染された領域が存在し、この領域にはコラーゲン線維が極めて疎らに存在するのみであった。得られた組織構造体において上記柱状部材周囲及び中心部に形成された結合組織は上記柱状部材間に略曲面状の凹部を有しており、その凹部に淡染領域（ポケット部）に相当する軟組織（疎線維性組織）が形成されていることが示された。
【0116】
なお、ＥＶＧ染色で黒色に染色される領域がなかったことから、組織構造体には弾性線維はほとんど含まれていないことが示された（図１１Ｃ）。
【0117】
組織構造体中に存在するコラーゲンの型を調べるため、シリウスレッド（ＳＲ）染色した切片を偏光顕微鏡で観察した。偏光顕微鏡ではＩ型コラーゲンは黄〜橙色、ＩＩＩ型コラーゲンは緑色に観察される。
【0118】
観察の結果、シリウスレッドで濃染された領域（器具柱状部材周囲及び中心部）では密に配列したコラーゲン線維が黄色や橙色に観察されたことから、Ｉ型コラーゲンが主に存在していることが示された（図１２Ａ及びＢ）。一方、柱状部材間の淡染領域は緑色で観察され、器具柱状部材周囲及び中心部と比較して、ＩＩＩ型コラーゲンがより多く存在していることが示された（図１２Ｃ）。柱状部材間の淡染領域（ポケット部）に含まれる線維は少量でありランダムに配向していた（図１２Ｃ）。
【0119】
［実施例３］免疫組織化学染色組織構造体中に存在する細胞種及びその分布を調べるため、組織構造体の免疫組織化学染色を行った。組織構造体の厚さ３〜５μｍの切片について、間葉系幹細胞マーカーとしてＣＤ９０及びＣＤ１０５、多能性幹細胞マーカーとしてＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ３、増殖因子として血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を、対応する一次抗体及び二次抗体を用いた免疫組織化学染色により検出した。さらに、細胞核染色のためにＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いた染色処理を行った。その結果を図１３〜１５に示す。
【0120】
間葉系幹細胞マーカーＣＤ９０及びＣＤ１０５の検出では、ポケット部において多数の細胞が染色された。上記柱状部材周囲においてもポケット部に近い領域では陽性細胞が確認できた。図１３において代表的な染色箇所を矢じり記号で示した。一方、組織構造体の中心部には陽性細胞は全く存在していなかった。
【0121】
多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ３の検出では、間葉系幹細胞マーカーと同様に、ポケット部において多数の細胞が染色された。図１４Ａ及びＢに代表的な染色箇所を矢じり記号で示した。一方、組織構造体の中心部には陽性細胞が存在していなかった。
【0122】
組織構造体内部の増殖因子の発現に関しては、ＶＥＧＦは組織構造体全体の比較的外側の領域で高発現しており、特にポケット部内に存在する円形細胞がより強くＶＥＧＦを発現していた（図１５）。ＨＧＦ発現細胞はポケット部に多くみられ、ＶＥＧＦと同様に円形細胞がＨＧＦを高発現していた（図１５）。なお円形細胞は一般に未分化性が高い細胞と考えられる。一方、線維芽細胞におけるＶＥＧＦの発現は弱かった。
【0123】
幹細胞の性質を調べるため、幹細胞マーカーＳＳＥＡ３と他のマーカーとの二重染色を行った（ＣＤ９０＆ＳＳＥＡ３、ＣＤ１０５＆ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４＆ＳＳＥＡ３、ＶＥＧＦ＆ＳＳＥＡ３）。
【0124】
二重染色の結果、二重陽性細胞（白矢印）の他に、各マーカーの単独陽性の細胞（横縞矢印、ドット矢印）が見られた（図１６）。横縞矢印は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＳＥＡ４、又はＶＥＧＦ陽性の緑色の染色を示している。ドット矢印は、ＳＳＥＡ４陽性の赤色の染色を示している。ポケット部の組織を構成している細胞が、未分化度の異なる、階層性を持った細胞集団であることが示された。また、一部の細胞は多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４とＳＳＥＡ３を同時に発現しており（図１６Ｃ）、これはＥＳ細胞などのより未分化な多能性幹細胞の特徴（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｓ，２００２；２０：３２９−３３７）と一致する。また、ＶＥＧＦがＳＳＥＡ３陽性細胞で特に高く発現したことから（図１６Ｄ）、ポケット部の組織に存在する未分化性の高い幹細胞は高い血管新生能を有していると考えられた。実際、抗ｖＷＦ抗体を用いた免疫組織化学染色により、血管内皮細胞マーカーｖＷＦの発現が、ポケット部とコア部の境界を中心とした領域において強く検出され、当該境界付近及びポケット部における血管内皮細胞の存在が示された。なお、抗ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体を用いた免疫組織化学染色により、ポケット部には線維芽細胞マーカーｖｉｍｅｎｔｉｎの発現も検出された。
【0125】
以上の結果は、組織形成を促進するためにポケット部に幹細胞が集積し活性化されていることを示す。すなわち凹部に形成された組織（ポケット部）は体性幹細胞が集積した組織（体性幹細胞集積組織）であるといえる。このようなポケット部を有する組織構造体を作製することで、活性化状態の幹細胞を高効率で取得・利用可能になる。
【0126】
［実施例４］細胞分離及び分析バイアル中のコラゲナーゼタイプＩ（５０ｍｇ）にＤＭＥＭ（無血清）を２０ｍＬ加え、０．２５％コラゲナーゼ溶液を調製した。調製したコラゲナーゼ溶液を６ｍＬ入れた１５ｍＬ遠心管に、実施例１で生体内から取り出された、組織構造体を内部に有する組織構造体製造器具を入れ、恒温槽で３７℃で振盪した。１．５時間振盪した後、当該器具とコラゲナーゼで未分解の組織とを取り除き、遠心管を４℃で１０００ｒｐｍ、５分遠心し、上清を除去した。ＤＭＥＭを６ｍＬ添加し、ピペッティングし、５０ｍＬ遠心管に細胞を回収した（４本分、２４ｍＬ）。回収画分を４℃で１０００ｒｐｍ、５分遠心し、上清を除去した。
【0127】
赤血球を溶血させるため、回収した細胞にＶｅｒｓａＬｙｓｅ Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１ｍＬ加え、ピペッティングし、室温で１０分インキュベートした。１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを１０ｍＬ加え、４℃で１０００ｒｐｍ、５分遠心し、上清を除去した。細胞凍結保存液バンバンカー（Ｒ）を５ｍＬを加えて懸濁し、その細胞懸濁液１０μＬを分取し、等量のトリパンブルー染色液を加えて染色し、細胞数を計数した。クライオチューブに１ｍＬずつ分注し、液体窒素タンクで保存した。
【0128】
バンバンカー（Ｒ）５ｍＬ懸濁液の細胞濃度は６．２５×１０６細胞／ｍＬ、細胞生存率は９８．４％であった。したがって、組織構造体１つあたり約４ｘ１０６細胞を回収できた。なお独立して行った他の実験でもほぼ同等の細胞数を回収できた。本実施例の処理条件下では、体性幹細胞集積組織のほぼ全体とその周囲の結合組織（組織構造体の周辺部）が分解されたが、組織構造体（コア部）の中心部までは分解されなかった。
【0129】
回収された細胞集団中の細胞の存在比率を調べるため、フローサイトメーターを用いてＣＤ９０陽性細胞、ＳＳＥＡ３陽性細胞、ＳＳＥＡ４陽性細胞をそれぞれ計数した。
【0130】
その結果、回収された細胞集団中、ＣＤ９０陽性細胞が７３％、ＳＳＥＡ３陽性細胞が２３％、及びＳＳＥＡ４陽性細胞が１８％であり（図１７）、回収された細胞集団中の幹細胞マーカーを発現する細胞は８０％前後であった。マーカー発現に基づくと、約７０％が間葉系幹細胞（２．８×１０６細胞）、約２０％が多能性幹細胞（８．０×１０５細胞）であった。
【0131】
コラゲナーゼ処理では、組織構造体が外側から分解されて細胞が分離されるため、コラゲナーゼ処理初期に分離される細胞のほとんどは体性幹細胞集積組織由来の体性幹細胞であった。コラゲナーゼ処理時間に応じて線維芽細胞の割合が増えることが示された。
【0132】
一般的な間葉系幹細胞のソースである骨髄は１０〜１００細胞／ｍＬ、脂肪組織は５×１０３細胞／ｇの間葉系幹細胞を含むにすぎない。本発明に係る細胞構造体は幹細胞を高い比率で含んでいることから、本発明では、幹細胞を回収する従来の方法と比較してより高効率に幹細胞を回収することができる。
【0133】
［実施例５］ＣＤ９０又はＳＳＥＡ３陽性細胞の濃縮実施例４と同様の方法で組織構造体をコラゲナーゼ処理し回収した細胞集団から、ＣＤ９０又はＳＳＥＡ３陽性の幹細胞を単離及び濃縮した。回収した細胞集団について抗ＣＤ９０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３２８１０７）又は抗ＳＳＥＡ３抗体（Ｂｉｏｓｓ，ｂｓ−３５７５Ｒ）で標識し、磁気ビーズ抗体（抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０４８−７００）及びヤギ抗ウサギＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０４８−６００））を反応させ、磁気細胞分離（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）法により細胞分離を行った。
【0134】
その結果、ＣＤ９０陽性細胞の比率を分離前の６２％から分離後に９０％まで濃縮することができた（図１８）。またＳＳＥＡ３陽性細胞の比率を、分離前の２９％から分離後に８４％まで濃縮することができた（図１９）。
【0135】
ＭＡＣＳ法による細胞分離前の細胞集団（対照）及び細胞分離後の細胞集団を６ウェルプレートに３０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培養し、細胞形態を観察した。その結果、線維芽細胞様の細胞がプレート底面に接着し、また増殖したことが示された（図２０）。幹細胞マーカーで分離した細胞も線維芽細胞様の形態であったが、分離前の細胞集団よりも小型の細胞が多くみられた（図２０）。
【0136】
このように本発明に係る細胞構造体をソースとすることにより、目的の幹細胞を効率よく濃縮することができた。
【0137】
［実施例６］ビーグル犬の皮膚を穿刺し、皮下に、閉じたステント（拡径時の長さ２９ｍｍ ｘ 直径２０ｍｍ）をマウントしたバルーンカテーテルを挿入した（図２１Ａ、Ｄ）。皮下で水圧を付加してバルーンを拡張させ（図２１Ｂ）、ステントを拡径させた（図２１Ｃ）。
【0138】
水圧を解除し、バルーンを収縮させて抜去し、ステントを拡径状態で皮下に留置した。３週間後、ビーグル犬を麻酔し、皮膚を切開して、皮下に留置したステントを摘出した。
【0139】
ステント内部には中心部まで組織が詰まっていた（図２１Ｅ）。ステント内部に形成された組織構造体を取り出した（図２１Ｆ）。ステントの金属フレーム周囲及び中心部では線維性結合組織が形成され、隣接する金属フレームと金属フレームの間で結合組織は曲面状の凹部を形成した。その凹部には幹細胞が集積したポケット部（体性幹細胞集積組織）が形成されていた（図２１Ｇ、矢印）。またステントの両端の貫通開口部１２Ｈにおいても、金属フレーム間と同様に、体性幹細胞集積組織が形成された凹部が認められた。このように、図９に示す形状のステントを用いても本発明に係る組織構造体を製造できることが示された。
【0140】
［実施例７］様々な形状を有する本発明に係る組織構造体製造器具を用い、組織構造体の製造を行った。図４Ａ〜Ｃ、及び図５Ａ及びＢに示す５種類の形状の組織構造体製造器具１０を準備した。使用した５種類の組織構造体製造器具の柱状部材１３は、いずれも直径１ｍｍの円柱状であった。十分な麻酔下のビーグル犬に切開術を施して、腹部の皮下に組織構造体製造器具を埋設して傷口を縫合した。器具埋設の３日、１０日、２週間（１４日）、１７日、又は３週間（２１日）後、ビーグル犬に切開術を施して、腹部の皮下から組織構造体製造器具を取り出した。
【0141】
皮下から取り出した組織構造体製造器具は、ほぼ全体が軟組織で覆われ、その器具内の中空部（中空空間）には組織が詰まっており、上記実施例と同様に組織構造体が形成されたことが観察された。
【0142】
上記器具から得た組織構造体について、実施例２と同様の方法でコラーゲン線維を染色するための線維染色処理を行った。一例として、図４Ｂの組織構造体製造器具（開口部の開口幅Ｗ＝６．０ｍｍ）を用いて形成された組織構造体の長手方向中央付近に位置する切片のＨＥ染色像を、図２２に示す。実施例２とよく似た結果が示された。各柱状部材の周囲から組織構造体の中心部にかけては結合組織が存在し、柱状部材間では結合組織が凹部２２Ｈを形成し、その凹部には疎線維性の体性幹細胞集積組織（ポケット部）２３が存在していた。なお結合組織の主成分は、緻密なコラーゲン線維であった。
【0143】
組織構造体の組織解析の結果から、組織構造体製造器具の各柱状部材の表面から当該器具の中空部の内方に広がるように線維性結合組織が形成されていき、隣り合う柱状部材の周囲で形成された結合組織が相互につながることにより、上記器具の開口部から器具中空部に向かって窪む凹部を外面に有するコア部が形成されるとともに、その凹部に生体由来の体性幹細胞が集積し、体性幹細胞集積組織が形成されると考えられた。
【0144】
さらに、実施例３と同様にして、免疫組織化学染色を行った。コア部の結合組織では、ＤＡＰＩ染色された多数の細胞核の存在が認められた一方、間葉系幹細胞マーカーＣＤ９０の発現は陰性であり、また、多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現も陰性であった。他方、体性幹細胞集積組織（ポケット部）には、ＣＤ９０陽性である多数の体性幹細胞、及びＳＳＥＡ−４陽性である多数の体性幹細胞の存在が認められた。
【0145】
組織構造体製造器具の生体内埋設後の留置期間が３日の場合、凹部を外面に有するコア部の形成は認められたが、体性幹細胞集積組織とコア部において、ＣＤ９０陽性細胞及びＳＳＥＡ−４陽性細胞のいずれの存在も検出されなかった。留置期間が１０日、２週間、１７日、及び３週間の場合、コア部において、ＣＤ９０陽性細胞及びＳＳＥＡ−４陽性細胞の存在が示された。
【0146】
図２３に示すように、ＨＥ染色の結果から、留置期間が１０日の場合、体性幹細胞集積組織に多数の線維素（フィブリン）が含まれることが認められた。一方、留置期間が３週間の場合は、留置期間が１０日の場合と比較して体性幹細胞集積組織に含まれる線維素が少ないことが認められた。対照的に、体性幹細胞集積組織において検出されたＣＤ９０陽性の細胞数及びＳＳＥＡ−４陽性の細胞数は、留置期間が３週間の場合には、留置期間が１０日の場合と比較して非常に多いことが認められた。
【0147】
留置期間が２週間の場合の体性幹細胞集積組織中のＣＤ９０陽性の細胞数は、留置期間が１０日の場合と、留置期間が３週間の場合との中間値程度であった。それに対し、留置期間が２週間の場合の体性幹細胞集積組織中のＳＳＥＡ−４陽性の細胞数は、留置期間が１０日の場合よりも若干多い程度であった。すなわち、生体内埋設の２週間後から３週間後までの間の時点で、体性幹細胞集積組織中のＳＳＥＡ−４陽性細胞が大幅に増加したことが示された。
【0148】
以上の結果から、体性幹細胞集積組織中の体性幹細胞の細胞数は、組織構造体製造器具の生体内留置期間に応じて増加することが示された。
【0149】
［実施例８］図４〜６に示す組織構造体製造器具の構造と、結合組織の凹部及び体性幹細胞集積組織の形成との関係について、実施例７と同様の方法で３週間の留置期間にわたり製造された組織構造体を線維染色（ＨＥ染色）処理した切片を調べた。
【0150】
組織構造体の製造に図４Ａに示す形状の組織構造体製造器具を使用した場合、（ｉ）３本の柱状部材１３間の開口幅Ｗが３．０ｍｍであり、深さＤが２．０ｍｍである器具の中空部１０Ｓ（器具上段）、及び（ｉｉ）４本の柱状部材１３間の開口幅Ｗが２．５ｍｍであり、深さＤが２．２ｍｍである器具の中空部１０Ｓ（器具下段）の両方において、各柱状部材１３、支持部１１Ａ及び１１Ｂの周囲及び中心部に線維性結合組織を有し、かつ２本の隣り合う柱状部材１３と支持部１１Ａと支持部１１Ｂで囲まれた（形成された）各開口部から器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈを有するコア部２５と、その凹部に形成された体性幹細胞集積組織２３とを有する組織構造体が製造された（図２４）。コア部２５を構成する線維性結合組織２２は組織構造体製造器具の２つの支持部１１Ａの各貫通孔１１Ｈ内まで広がっていた。組織構造体は、貫通孔（支持部開口部）１１Ｈから器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈをさらに有しており、その凹部にも体性幹細胞集積組織２３の形成が認められた。上記（ｉ）及び（ｉｉ）の器具中空部にそれぞれ形成された線維性結合組織は、支持部１１Ｂの貫通孔内に形成された線維性結合組織を介して連結されていた。
【0151】
組織構造体の製造に図４Ｂに示す形状の組織構造体製造器具を使用した場合、（ｉ）６本の柱状部材１３間の開口幅Ｗが４．０ｍｍであり、深さＤが４．６ｍｍである器具の中空部１０Ｓ（器具上段）、（ｉｉ）４本の柱状部材１３間の開口幅Ｗが６．０ｍｍであり、深さＤが４．０ｍｍである器具の中空部１０Ｓ（器具中段）、及び（ｉｉｉ）８本の柱状部材１３間の開口幅Ｗが３．０ｍｍであり、深さＤが４．８ｍｍである器具の中空部１０Ｓ（器具下段）のいずれにおいても、各柱状部材１３、支持部１１Ａ及び１１Ｂの周囲及び中心部に線維性結合組織を有し、かつ２本の隣り合う柱状部材１３と２つの対向する支持部（支持部１１Ａと支持部１１Ｂ、又は２つの支持部１１Ｂ）で囲まれた（形成された）各開口部から器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈを有するコア部２５と、その凹部に形成された体性幹細胞集積組織２３とを有する組織構造体が製造された（図２５）。コア部２５を構成する線維性結合組織２２は組織構造体製造器具の２つの支持部１１Ａの各貫通孔１１Ｈ内まで広がっていた。組織構造体は、貫通孔（支持部開口部）１１Ｈから器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈをさらに有しており、その凹部にも体性幹細胞集積組織２３の形成が認められた。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の器具中空部にそれぞれ形成された線維性結合組織は、２つの支持部１１Ｂの貫通孔１１Ｈ内に形成された線維性結合組織を介して連結されていた。
【0152】
組織構造体の製造に図４Ｃに示す形状の組織構造体製造器具を使用した場合、（ｉ）８本の柱状部材１３間の開口幅Ｗが５．０ｍｍであり、深さＤが７．１ｍｍである器具の中空部１０Ｓ（器具上段）、（ｉｉ）６本の柱状部材１３間の開口幅Ｗが６．５ｍｍであり、深さＤが６．８ｍｍである器具の中空部１０Ｓ（器具中段）、及び（ｉｉｉ）１０本の柱状部材１３間の開口幅Ｗが３．５ｍｍであり、深さＤが７．３ｍｍである器具の中空部１０Ｓ（器具下段）のいずれにおいても、各柱状部材１３、支持部１１Ａ及び１１Ｂの周囲及び中心部に線維性結合組織を有し、かつ２本の隣り合う柱状部材１３と２つの対向する支持部（支持部１１Ａと支持部１１Ｂ、又は２つの支持部１１Ｂ）で囲まれた（形成された）各開口部から器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈを有するコア部２５と、その凹部に形成された体性幹細胞集積組織２３とを有する組織構造体が製造された（図２６）。コア部２５の線維性結合組織２２は組織構造体製造器具の２つの支持部１１Ａの各貫通孔１１Ｈ内まで広がっていた。組織構造体は、貫通孔（支持部開口部）１１Ｈから器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈをさらに有しており、その凹部にも体性幹細胞集積組織２３の形成が認められた。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の器具中空部にそれぞれ形成された線維性結合組織は、２つの支持部１１Ｂの貫通孔１１Ｈ内に形成された線維性結合組織を介して連結されていた。
【0153】
組織構造体の製造に図５Ａに示す形状の組織構造体製造器具を使用した場合、各柱状部材１３及び支持部１１Ａの周囲及び中心部に線維性結合組織を有し、かつ２本の隣り合う柱状部材１３と２つの対向する支持部１１Ａで囲まれた（形成された）各開口部から器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈを有するコア部２５と、その凹部に形成された体性幹細胞集積組織２３とを有する組織構造体が製造された。各開口部について、柱状部材１３間の開口幅Ｗが２．５ｍｍ以上５．０ｍｍ以下の範囲において凹部２２Ｈの形成が認められ、その凹部２２Ｈに体性幹細胞集積組織２３の存在が認められた。開口幅Ｗが２．５ｍｍよりも狭い範囲においては、凹部２２Ｈの形成は認められなかった。例えば、図２７Ａは、組織構造体の長手方向のほぼ中央に位置する切片のＨＥ染色写真である。開口幅Ｗが３．０ｍｍであり、深さＤが４．８ｍｍである部位では凹部２２Ｈが認められ、その凹部２２Ｈにおいて体性幹細胞集積組織２３の存在も認められた。図２７Ｂは、組織構造体の長手方向の端部近くに位置する切片のＨＥ染色写真である。開口幅Ｗが４．０ｍｍであり、深さＤが４．６ｍｍである部位では凹部２２Ｈが認められ、その凹部２２Ｈにおいて体性幹細胞集積組織２３の存在も認められたが、開口幅Ｗが２．０ｍｍであり、深さＤが４．９ｍｍである部位では凹部２２Ｈの形成は認められなかった（図２７Ｂ）。コア部２５の線維性結合組織２２は組織構造体製造器具の２つの支持部１１Ａの各貫通孔１１Ｈ内まで広がっていた。組織構造体は、貫通孔（支持部開口部）１１Ｈから器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈをさらに有しており、その凹部にも体性幹細胞集積組織２３の形成が認められた。
【0154】
組織構造体の製造に図５Ｂに示す形状の組織構造体製造器具を使用した場合、各柱状部材１３及び支持部１１Ａの周囲及び中心部に線維性結合組織を有し、かつ２本の隣り合う柱状部材１３と２つの対向する支持部１１Ａで囲まれた（形成された）各開口部から器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈを有するコア部２５と、その凹部に形成された体性幹細胞集積組織２３とを有する組織構造体が製造された。各開口部について、柱状部材１３間の開口幅Ｗが２．５ｍｍ以上８．０ｍｍ以下の範囲において凹部２２Ｈの形成が認められ、その凹部２２Ｈに体性幹細胞集積組織２３の存在が認められた。開口幅Ｗが２．５ｍｍよりも狭い範囲においては、凹部２２Ｈの形成は認められなかった。例えば、図２８Ａは、組織構造体の長手方向のほぼ中央に位置する切片のＨＥ染色写真である。開口幅Ｗが４．０ｍｍであり、深さＤが７．２ｍｍである部位では凹部２２Ｈが認められ、その凹部２２Ｈに体性幹細胞集積組織２３の存在も認められた。図２８Ｂは、組織構造体の端部近くに位置する切片のＨＥ染色写真である。開口幅Ｗが７．０ｍｍであり、深さＤが６．６ｍｍである部位では凹部２２Ｈが認められ、その凹部２２Ｈにおいて体性幹細胞集積組織２３の存在も認められたが、開口幅Ｗが２．０ｍｍであり、深さＤが７．４ｍｍである部位では凹部２２Ｈの形成は認められなかった（図２８Ｂ）。コア部２５の線維性結合組織２２は組織構造体製造器具の２つの支持部１１Ａの各貫通孔１１Ｈ内まで広がっていた。組織構造体は、貫通孔（支持部開口部）１１Ｈから器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈをさらに有しており、その凹部にも体性幹細胞集積組織２３の形成が認められた。
【0155】
図２９は、図５Ｂに示す形状の組織構造体製造器具を用いて製造された組織構造体の、軸方向Ａｘに沿った断面を有する切片の線維染色処理後の写真の拡大画像である。この画像は、開口幅Ｗが２．０ｍｍから５．０ｍｍまで連続的に変化する範囲の開口部直下に形成された組織の構造を示す。図２９に示されるように、開口幅Ｗが２．０ｍｍ以上５．０ｍｍ以下の範囲において、開口幅Ｗが大きいほどその直下に形成される凹部２２Ｈの深さも大きく、開口幅Ｗの増加に伴ってその直下の凹部２２Ｈに形成される体性幹細胞集積組織２３のサイズ（体積）も大きくなることが示された。特に、凹部２２Ｈの深さは、開口幅Ｗ＝３．０ｍｍを境界として急激に増えることから、体性幹細胞集積組織２３のサイズも開口幅Ｗ＝３．０ｍｍ以上で急激に増えると考えられた。
【0156】
組織構造体の製造に図６Ａに示す形状の組織構造体製造器具を使用した場合、各柱状部材１３、大矩形枠１１Ｃ及び小矩形枠１１Ｄの周囲及び中心部に線維性結合組織を有し、かつ２本の隣り合う柱状部材１３と大矩形枠１１Ｃと小矩形枠１１Ｄで囲まれた（形成された）各開口部から器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈを有するコア部２５と、その凹部に形成された体性幹細胞集積組織２３とを有する組織構造体が製造された。また組織構造体の製造に図６Ｂに示す形状の組織構造体製造器具を使用した場合、各柱状部材１３、大矩形枠１１Ｃ、小矩形枠１１Ｄ及び板状体２６の周囲及び中心部に線維性結合組織を有し、かつ（ｉ）２本の隣り合う柱状部材１３と大矩形枠１１Ｃと小矩形枠１１Ｄで囲まれた（形成された）開口部、及び（ｉｉ）１本の柱状部材１３と大矩形枠１１Ｃと小矩形枠１１Ｄと板状体２６で囲まれた（形成された）開口部のそれぞれから、器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈを有するコア部２５と、その凹部に形成された体性幹細胞集積組織２３とを有する組織構造体が製造された。板状体２６のスリット２６Ｓ（開口幅１ｍｍ）の開口部においては凹部は形成されなかった。各開口部について、柱状部材１３間の開口幅Ｗが３．０ｍｍ以上２０．０ｍｍ以下の範囲において凹部２２Ｈの形成が認められ、その凹部２２Ｈに体性幹細胞集積組織２３の存在が認められた。なお図６Ａに示す形状の組織構造体製造器具の深さＤは、２．０ｍｍから１０．５ｍｍまでの範囲である。また図６Ｂに示す形状の組織構造体製造器具の深さＤは、当該器具の底部が塞がっており中空部の最深点が底部上にあるため、２．０ｍｍから２０．５ｍｍまでの範囲である。コア部２５の線維性結合組織２２は組織構造体製造器具の大矩形枠１１Ｃ及び小矩形枠１１Ｄの枠内まで広がっていた。組織構造体は、大矩形枠１１Ｃ及び小矩形枠１１Ｄ（いずれも支持部）の開口部から器具中空部に向かってそれぞれ窪む凹部２２Ｈをさらに有しており、その凹部にも体性幹細胞集積組織２３の形成が認められた。
【0157】
組織構造体の製造に図６Ｃに示す形状の組織構造体製造器具を使用した場合、各柱状部材１３、大矩形枠１１Ｃ、中矩形枠１１Ｅ、及び小矩形枠１１Ｄの周囲及び中心部に線維性結合組織を有し、かつ（ｉ）２本の隣り合う柱状部材１３と大矩形枠１１Ｃと中矩形枠１１Ｅで囲まれた（形成された）開口部、（ｉｉ）２本の柱状部材１３と中矩形枠１１Ｅと小矩形枠１１Ｄで囲まれた（形成された）開口部のそれぞれから、器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈを有するコア部２５と、その凹部に形成された体性幹細胞集積組織２３とを有する組織構造体が製造された（図３０）。各開口部について、柱状部材１３間の開口幅Ｗが３．０ｍｍ以上２０．０ｍｍ以下の範囲において凹部２２Ｈの形成が認められ、その凹部２２Ｈに体性幹細胞集積組織２３の存在が認められた。なお図６Ｃに示す形状の組織構造体製造器具の深さＤは、２．０ｍｍから１０．５ｍｍまでの範囲である。コア部２５の線維性結合組織２２は組織構造体製造器具の大矩形枠１１Ｃ、中矩形枠１１Ｅ及び小矩形枠１１Ｄの枠内まで広がっていた。組織構造体は、大矩形枠１１Ｃ及び小矩形枠１１Ｄ（いずれも支持部）の開口部から器具中空部に向かってそれぞれ窪む凹部２２Ｈをさらに有しており、その凹部にも体性幹細胞集積組織２３の形成が認められた。
【0158】
図６Ｃに示す形状の組織構造体製造器具を使用して得られた組織構造体（図３０）の切片のＨＥ染色の結果を図３１に示す。図３０に示す位置で、組織構造体を切断した。図３１Ａは、大矩形枠１１Ｃの開口部直下に形成された体性幹細胞集積組織２３の縦断面（ａ−ａ’）の染色像である。図３１Ｂは、小矩形枠１１Ｄの開口部直下に形成された体性幹細胞集積組織２３の縦断面（短手方向；ｂ−ｂ’）の染色像である。いずれの開口部においても、器具中空部に向かって窪む凹部２２Ｈと凹部における体性幹細胞集積組織２３の形成が観察された。大矩形枠１１Ｃ又は小矩形枠１１Ｄの周囲の線維性結合組織では、コラーゲン線維が密に存在していた。
【0159】
以上の実施例では、組織構造体製造器具の開口幅Ｗが２．５ｍｍ以上の範囲において、組織構造体における凹部２２Ｈの形成が認められた。一方、開口幅Ｗが２．５ｍｍ未満の開口部の直下には凹部２２Ｈの形成が認められなかった。深さＤ、又は深さＤの最大値は、少なくとも、２ｍｍ以上の場合、凹部２２Ｈの形成への影響は認められなかった。
【0160】
本発明に係る組織構造体製造器具１０を用いることにより、短い留置期間、例えば、１ヶ月以内、さらには２〜３週間程度でも、凹部２２Ｈに体性幹細胞２３Ｃを集積させて富化させた組織構造体を製造できることが示された。
【符号の説明】
【0161】
Ａｘ…軸方向、Ｃｉ…周方向、Ｃｔ…中心点、Ｄ…深さ、Ｓ…円筒面、Ｗ…開口幅、１０…組織構造体製造器具、１０Ｆ…開口縁、１０Ｈ…開口部、１０Ｓ…中空部、１１…支持部、１１Ａ…第１支持部、１１Ｂ…第２支持部、１１Ｈ…貫通孔、１２Ｈ…貫通開口部、１３…柱状部材、１６…線状部材、２１…生体組織、２２…線維性結合組織、２２Ｃ…線維芽細胞、２２Ｈ…凹部、２３…体性幹細胞集積組織、２３Ｃ…体性幹細胞、２４…凹部周縁部、２５…コア部。
【要約】
【課題】体性幹細胞を効率よく収集する方法の提供。【解決手段】凹部を有し線維性結合組織で構成されたコア部と、前記凹部に形成されたＩＩＩ型コラーゲン及び体性幹細胞を含む疎線維性の体性幹細胞集積組織とを有する、組織構造体、その製造器具、及び組織構造体からの体性幹細胞の収集方法。
【選択図】図２２