特許 6815120 エレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6815120

(24)【登録日】2020年12月24日

(45)【発行日】2021年1月20日

(54)【発明の名称】エレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20210107BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20210107BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 A

   C12M1/42

【請求項の数】12

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2016-147124(P2016-147124)

(22)【出願日】2016年7月27日

(65)【公開番号】特開2018-14916(P2018-14916A)

(43)【公開日】2018年2月1日

【審査請求日】2019年6月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】594164542

【氏名又は名称】キヤノンメディカルシステムズ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001737

【氏名又は名称】特許業務法人スズエ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】櫻井 康雄

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０２−３０３４７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Scientific Reports，２０１３年，p.1-7，doi:10.1038/srep03370

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｍ １／４２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多数の被検細胞及び導入物質で組成され、液組成の異なる細胞懸濁液を含む検査対象の細胞懸濁液が収納されている複数のウェルと、
前記ウェルに対応して設けられる複数の電極部であって、前記電極部の各々が前記細胞懸濁液に浸漬されるように支持されている複数電極を含む複数の電極部と、
測定用交流電圧を含む測定用電圧及び前記ウェル内の前記被検細胞にエレクトロポレーションを生じさせるインパルス電圧を発生する電源部であって、前記被検細胞に細胞死を誘発しないように、前記測定用交流電圧を前記インパルス電圧に比べて低い低電圧に設定する電源部と、
測定モードにおいて、前記電源部から前記電極部の前記電極に前記測定用交流電圧を印加して前記電極間の細胞懸濁液の抵抗を測定し、この測定結果に基づいて、前記複数のウェルにおける電荷量の密度を一定とする、前記ウェル毎の前記インパルス電圧のインパルス印加時間を算出する算出部と、
エレクトロポレーションモードにおいて、前記インパルス電圧を前記算出したインパルス印加時間の間、前記各電極部の前記電極に印加するインパルス電圧印加部と、
を具備するエレクトロポレーション装置。

【請求項2】

前記電源部は、前記測定用交流電圧を前記インパルス電圧の１０〜２０％の低い低電圧に設定する請求項１のエレクトロポレーション装置。

【請求項3】

前記電源部は、前記測定用電圧としてインパルス電圧に比べて低い低電圧に設定した測定用直流電圧を発生し、前記測定モード時に、この測定用直流電圧を前記直流インパルス印加時間に比べて長い測定時間の間印加し、
前記算出部は、前記測定用直流電圧の印加に基づいて前記電極間の時定数を測定し、この時定数及び前記抵抗の測定結果から前記前記電極間のキャパシタを算出し、この測定結果及び算出結果に基づいて供給すべき前記ウェル毎の前記インパルス電圧のインパルス印加時間を算出するする請求項１のエレクトロポレーション装置。

【請求項4】

前記ウェル毎の前記細胞懸濁液に関する前記測定結果及び前記算出結果を格納する記憶部を更に具備する請求項１又は請求項３のエレクトロポレーション装置。

【請求項5】

前記インパルス電圧印加部は、前記電源部及び電極間に接続され、前記電極部に対応するスイッチ及び前記前記供給すべき電荷量に応じて前記スイッチを開閉して前記インパルス印加電圧のインパルス印加時間を制御する制御部を含む請求項１のエレクトロポレーション装置。

【請求項6】

前記インパルス電圧印加部は、前記電源部及び電極間に接続され、前記電極部に対応するスイッチ及びこのスイッチを開閉制御するとともに前記供給すべき電荷量に応じて前記インパルス印加電圧の電圧値を設定する制御部を含む請求項１のエレクトロポレーション装置。

【請求項7】

複数のウェルの夫々に多数の被検細胞及び導入物質で組成され、液組成の異なる細胞懸濁液を含む細胞懸濁液を収納し、
前記ウェルに対応して設けられる複数の電極部であって、前記電極部の各々に支持される複数の電極を前記細胞懸濁液に浸漬し、
測定モードにおいて、前記被検細胞に細胞死を誘発しないように、前記測定用交流電圧を前記インパルス電圧に比べて低い低電圧に設定される測定用交流電圧を前記電極部の前記電極に印加して前記電極間の細胞懸濁液の抵抗を測定し、この測定結果に基づいて、前記複数のウェル内における電荷量の密度を複数のウェル間で一定とする、前記ウェル毎の前記インパルス電圧のインパルス印加時間を算出し、
エレクトロポレーションモードにおいて、前記ウェル内の前記被検細胞にエレクトロポレーションを生じさせる前記インパルス電圧を前記算出したインパルス印加時間の間、前記各電極部の前記電極に印加する、
ことを具備するエレクトロポレーション方法。

【請求項8】

前記測定用交流電圧は、前記インパルス電圧の１０〜２０％の低い低電圧に設定される請求項７のエレクトロポレーション方法。

【請求項9】

前記測定用電圧としてインパルス電圧に比べて低い低電圧に設定した測定用直流電圧を発生し、 前記測定モード時に、前記直流インパルス印加時間に比べて長い測定時間の間、この測定用直流電圧を印加し、
この測定用直流電圧の印加に基づいて前記電極間の時定数を測定し、この時定数及び前記抵抗の測定結果から前記前記電極間のキャパシタを算出し、この測定結果及び算出結果に基づいて供給すべき前記ウェル毎の前記インパルス電圧のインパルス印加時間を算出する請求項７のエレクトロポレーション方法。

【請求項10】

前記ウェル毎の前記細胞懸濁液に関する前記測定結果及び前記算出結果を記憶する請求項７又は請求項９のエレクトロポレーション方法。

【請求項11】

前記供給すべき電荷量に応じて、前記電極部に対応して前記電極に接続されるスイッチを開閉制御してインパルス印加電圧の印加時間を制御する請求項６のエレクトロポレーション方法。

【請求項12】

前記電極部に対応して前記電極に接続されるスイッチを開閉制御するとともに前記供給すべき電荷量に応じて設定されたインパルス印加電圧を印加する請求項６のエレクトロポレーション方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の実施形態は、エレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞に人工遺伝子等を電気的に導入するエレクトロポレーション方法は、電気穿孔法とも称せられ、遺伝子導入方法として特許文献１で知られている。このエレクトロポレーション方法は、細胞懸濁液内に短時間に高電圧を印加して電気的刺激（電気パルス）を細胞に与え、一時的に細胞膜を破壊して微細孔を細胞に生じさせている。そして、エレクトロポレーション方法では、この微細孔を介して細胞外液中の分子（遺伝子或いは薬剤化合物）を細胞内に導入させている。このようにエレクトロポレーション方法では、細胞懸濁液内で細胞に電気パルスを印加して細胞膜を一時的に透過性としている。

【0003】

エレクトロポレーション方法は、電気的刺激を与える処理であることから、細胞がダメージを受けて細胞死を招くことがある。しかも、エレクトロポレーション方法は、細胞を個別的に処理するのではなく、多数の細胞を集団として扱ってＤＮＡ等の物質を注入する方法であることから、細胞の無駄遣いが多く、また、エレクトロポレーションの効率が非常に悪い問題がある。

【0004】

従来の実験室レベルで実施されるエレクトロポレーション方法では、反応ウェル内に平板電極が対向配置される対向平板２極方式が主流とされている。この平板２極方式は、反応ウェル内の位置に依存して、電場が変化していることから、細胞への人工遺伝子等の分子の導入効率にムラが出る問題がある。実験室レベルでは、細胞死或いは細胞破壊されたものを除外して良好にＤＮＡ等の物質が注入された細胞のみを選択すればその後の処理に問題がないとされている。しかし、臨床検査では、このエレクトロポレーション方法を適用するには、細胞の無駄遣いを減少させ、また、エレクトロポレーションの効率を良好にすることが要請されている。

【0005】

このような背景から、非特許文献１において、電極として嶮山型電極の採用されているエレクトロポレーション装置が提案されている。このエレクトロポレーション装置では、反応ウェル内に、嶮山型電極としての多数の針状電極が配置され、細胞懸濁液内の電場が比較的均一に維持されている。このように反応ウェル内に、多数の針状電極が配置されるエレクトロポレーション装置では、対向平板２極方式に比べて、細胞が複数電極間に分布されることから、夫々の細胞にエレクトロポレーションのための固有の臨界電界強度（Ｅ＝ｋＶ／ｃｍ）を与えることができるとしている。ここで、Ｖは、電極間電圧であり、ｃｍは、電極間距離を意味している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００４−１４５１７号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】"High-density distributed electrodenetwork, a multi-functional electroporation method for delivery ofmolecules of different sizes" SCIENTIFIC REPORTS | 3 : 3370 | DOI: 10.1038/srep03370

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上述したように嶮山型電極の採用によって、多数の細胞に良好にＤＮＡ等の物質を注入できることが予想される。しかしながら、多数の患者から採取された細胞が検査対象とされ、同時並行処理される臨床検査では、エレクトロポレーション前の前処理の段階において液組成が異なる細胞懸濁液が調整され、予想するようなエレクトロポレーション効果を実現することができない問題がある。体細胞が複数の反応ウェルで同時にエレクトロポレーションされる例では、患者から採取できる細胞の数、修理、前工程から持ち込まれる処理液の量に差があり、各反応ウェルで検査対象の細胞懸濁液の電気抵抗が異なっている蓋然性が高くなる。従って、複数の反応ウェル毎に、同一の電圧を印加すると、反応ウェル毎に流れる電荷量が異なり、結果として、反応ウェルごとの人工遺伝子等の注入物質の導入効率にムラがでる問題がある。

【0009】

この発明の目的は、複数のウェルに格納された細胞懸濁液に電圧インパルスを印加してウェル毎に定まる電荷量を注入し、細胞外液中の分子をその細胞懸濁液内の細胞に効率的に導入させることができるエレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法を提供するにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

実施例によれば、
多数の被検細胞及び導入物質で組成され、液組成の異なる細胞懸濁液を含む検査対象の細胞懸濁液が収納されている複数のウェルと、
前記ウェルに対応して設けられる複数の電極部であって、前記電極部の各々が前記細胞懸濁液に浸漬されるように支持されている複数電極を含む複数の電極部と、
測定用交流電圧を含む測定用電圧及び前記ウェル内の前記被検細胞にエレクトロポレーションを生じさせるインパルス電圧を発生する電源部であって、前記被検細胞に細胞死を誘発しないように、前記測定用交流電圧を前記インパルス電圧に比べて低い低電圧に設定する電源部と、
測定モードにおいて、前記電源部から前記電極部の前記電極に前記測定用交流電圧を印加して前記電極間の細胞懸濁液の抵抗を測定し、この測定結果に基づいて、前記複数のウェル内における電荷量の密度を一定とする、前記ウェル毎の前記インパルス電圧のインパルス印加時間を算出する算出部と、
エレクトロポレーションモードにおいて、前記インパルス電圧を前記算出したインパルス印加時間の間、前記各電極部の前記電極に印加するインパルス電圧印加部と、
を具備するエレクトロポレーション装置が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施形態のエレクトロポレーション装置が組み込まれた細胞特性評価装置の１例を概略的に示す模式図である。

【図2】図１に示すエレクトロポレーション装置におけるウェル内に浸漬される電極配置を示す平面図である。

【図3】図１に示すエレクトロポレーション装置におけるエレクトロポレーション回路部の概略を示すブロック図である。

【図4】図１に示す細胞特性評価装置における処理を示すフローチャートである。

【図5】図１に示すエレクトロポレーション（遺伝子導入）装置における動作手順を示すフローチャートである。

【図6】図１に示すエレクトロポレーション装置における他の実施の形態に係るエレクトロポレーション回路部の概略を示すブロック図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、エレクトロポレーション装置の実施の形態について、図面を参照して説明する。

【0013】

始めに、図１を参照して実施の形態に係るエレクトロポレーション装置３０が組み込まれた細胞特性評価システム１０の１例を説明する。このシステム１０においては、エレクトロポレーション装置は、レポーターベクターとして遺伝子（ＤＮＡ）を導入する装置として実現され、被検細胞の異常活性を検出し、それに基づいて被検細胞の細胞特性を評価している。

【0014】

システム１０は、細胞分離装置２０と、エレクトロポレーション装置３０と、測定装置４０と、これらの装置の下方に連続して延出され、容器部６０を搬送するステージ５０とから構成されている。このようにステージ５０上には、細胞分離装置２０、エレクトロポレーション装置、測定装置４０がステージ５０の移動に沿って配置され、容器部６０のウェル６２に被検細胞を含む試料１８が導かれた順次処理される。

【0015】

細胞分離装置２０は、対象（例えば、患者）から得た検体（例えば、血液或いは尿）から、試験されるべき細胞、即ち、被検細胞を分離するための複数の分離器２２を具備している。複数の分離器２２は、容器部６０上のウェル６２の配列に対応してステージ５０の移動方向に対して略直交する方向（交差方向）に沿って配列されている。各分離器２２は、対象から得た検体を受け入れる受容器２４と、受容器２４で受け取った検体について消化等の処理を行う処理器２６と、処理器２６で処理された処理済み検体から被検細胞を分離するための分離部２８とを具備している。この分離器２２では、受容器２４、処理器２６及び分離部２８は、互いに内径の異なる３つの中空の筒状体が上方から下方に向けてこの順序で積層され、互いに液密に一体化されている。受容器２４、処理器２６及び分離部２８と各境界部は、弁（図示せず）により開閉可能に液絡されている。

【0016】

受容器２４は、上部が開口した筒状で、下方に向けて漏斗状に形成されている筒状体に構成され、開閉可能な蓋を備えている。受容器２４と処理器２６との境界は、弁（図示せず）によって液密に閉じられて逆流が防止される。従って、この弁が閉じたときには、この弁は、受容器２４の底部を構成している。処理器２６は、受容器２４の下端と連続する筒状体に形成されている。受容器２４との境界部の弁が液密に閉じたときには、処理器２６は、有蓋となっている。同様に処理器２６は、分離部２８との境界部の弁が閉じたときには、有底となっている。分離部２８は、その内壁が処理器２６の内壁から液密に連続している筒状体であり、その下端には、弁（図示せず）が設けられている。この弁が液密に閉じられて、分離部２８は、有底に維持される。

【0017】

分離部２８の内部には、分離材が固定されている。システム１０の使用時には、分離部２８底の下方のステージ５０上に、分離された被検細胞を含む試料１８を分離部２８から受け取り、試料を収容するウェル６２を具備している容器部６０が載置される。ステージ５０は、矢印５１で示されるようにステージ移動機構５４によって移動され、容器部６０上に配置された複数のウェル６２は、夫々分離部２８に対応して設けられ、矢印５１で示されるステージ５０の進行方向に対して略直交するように配列されている。ここで、処理器２６は、その内部に含む検体に対して消化および生化学反応などの所望の処理を行う加熱および／または恒温機構を備えても良い。また、分離材は、処理器２６からの下りてきた検体から、被検細胞を含む試料１８を分離、採取する部材であってもよく、或いは、処理器２６からの下りてきた検体から、夾雑物を取り除く部材であっても良い。分離材は、分離部２８の中心軸に交差する面に沿って広がり分離部２８の内壁の円周に亘って固定されていて良い。分離材は、例えば、フィルター、メンブランおよび／または磁石などであっても良い。受容器２４の蓋及び受容器２４と処理器２６と分離部２８との各境界部に設けられる弁（いずれも図示せず）は、開閉制御部１２によって開閉制御され、処理された試料が順次滴下されて下方に流下される。

【0018】

分離器２２で分離された被検細胞を含む試料１８は、ステージ５０上に載置された容器部６０上のウェル６２に収容される。被検細胞を収容する容器部６０は、エレクトロポレーション装置に送られる。

【0019】

エレクトロポレーション装置は、容器部６０のウェル６２に対応して複数のプローブヘッド３４を備えている。各プローブヘッド３４は、容器部６０の各ウェル６２に収容された被検細胞に対してレポーターベクターを導入するエレクトロポレーションのための剣山電極３２を支持している。このプローブヘッド３４は、昇降機構３６によって個別に或いは同時に降下されて剣山電極３２、３３がウェル６２内の試薬１８に浸漬される。剣山電極３２、３３には、エレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０が接続され、エレクトロポレーション回路部７０からの微小時間（数十マイクロ秒）に亘るインパルス電圧が剣山電極３２、３３に印加されてレポーターベクターが被検細胞に導入される。レポーターベクターの被検細胞への導入処理後には、昇降機構３６が動作されてプローブヘッド３４が上昇され、図示するような定位置に復帰される。

【0020】

導入プローブヘッド３４は、図２に示すように剣山電極を構成する複数の電極３２、３３を支持し、複数の電極３２、３３によってエレクトロポレーターを構成している。複数の電極３２、３３は、例えば、５０〜６０本の電極で構成され、互いに近接する電極対の一方が陽極に、また、他方がアースに定められるように電源部直流電源に接続される。このように剣山電極を構成する複数の電極３２、３３は、導入プローブヘッド３４から所定長だけ延出されて等長の露出長を与えられ、その先端（自由端）が同一の仮想面上に２次元的分布される。図２においては、剣山電極の構成を簡略化して示すために９本の電極のみが示され、プラス側の電極３２が白抜きの円で示され、アース側の電極３３がハッチされた円で示され、交互にプラス側の電極３２及びアース側の電極３３が配置されている様子が示されている。

【0021】

エレクトロポレーション回路部７０は、図３に示すように選択スイッチ７３によって切り替えられて選択可能な直流電源７２及び交流電源７１を含む電源部９０を備え、電源部９０のプラス側は、個別に開閉時間ｔが制御される個別スイッチ７４及び電流検出部７５を介して剣山電極のプラス側電極３２に接続され、電源部９０のマイナス側は、剣山電極のマイナス側電極３２に接続されている。容器部６０のウェル６２には、それぞれ検査対象の細胞懸濁液が収納され、図３では、これらプラス側の電極３２及びアース側の電極３３が細胞懸濁液に浸漬されている。容器部６０のウェル６２内には、ほぼ同一容量の細胞懸濁液が導入されるように、制御されるが、後に述べるようにウェル６２毎にインパルス時間及び／またはインパルス電圧が制御されることから、厳密に一定容量の細胞懸濁液が導入されなくとも良い。ここで、直流電源７２は、主にエレクトロポレーションを実行するポレーションモードの際に利用され、交流電源７１は、エレクトロポレーション前における細胞懸濁液の電気特性を測定して印加条件を算出する測定モードの際に利用される。

【0022】

エレクトロポレーション回路部７０は、測定部９２及び印加条件算出部９４を備えている。測定モード時における各ウェル６２内に流れる電流は、電流検出部７５で検知され、電流検出部７５から測定部９２に出力されて各ウェル６２内の細胞懸濁液の回路定数（抵抗Ｒ、キャパシタＣ及び時定数τ）が測定用電圧値及び測定電流値から演算される。これらの演算された回路定数のパラメータは、各ウェル６２を特定するウェル番号とともに印加条件記憶部９６に記憶される。また、印加条件算出部９４では、これらの演算された回路定数のパラメータを利用してスイッチ閉成時間（インパルス時間）及び設定電荷量を含む印加条件を算出し、同様に、ウェル番号に関連付けられて印加条件記憶部９６に格納される。エレクトロポレーション回路部７０は、個別スイッチ７４の開閉を制御するスイッチ開閉制御部９７及び回路全体を制御する回路制御部９８を備えている。スイッチ開閉制御部９７は、ポレーションモード時にスイッチ７４の閉成時間を制御し、マイナス側電極３３からプラス側電極３４に供給する電荷量を制御している。また、回路制御部９８は、電源部９０、測定部９２、印加条件算出部９４、印加条件記憶部９６及びスイッチ開閉制御部９７を制御し、エレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０における測定モード及びポレーションモードを実行させている。測定モード及びポレーションモードについては、後により詳細に説明する。

【0023】

エレクトロポレーション装置は、レポーターベクターを含む試薬を容器部６０に供給するためのノズル（図示せず）を備え、エレクトロポレーション装置は、ノズルに試薬を送るための送液システム、送液システムに試薬を供給するための試薬収納容器（いずれも図示せず）を備えている。

【0024】

尚、エレクトロポレーション装置は、所定時間に亘り、所定の培養条件下で容器部６０のウェル６２内の被検細胞を培養する培養器として機能しても良い。エレクトロポレーション装置の培養は、図１に示されるシステムの全体を制御する制御部８０により制御されれば良い。

【0025】

エレクトロポレーション装置において、レポーターベクターが被検細胞に導入された後、この被検細胞が収納されているウェル６２を有する容器部６０は、次に測定装置４０に移送される。測定装置４０は、ステージ５０の一部分を上部と下部とから覆い、容器部６０を暗室内に収納した状態に維持する暗箱機構（図示せず）及び暗箱機構内部に配置され、ウェル６２内の試料１８を照明する光源（図示せず）を備えている。また、測定装置４０は、光源で照明されるウェル６２内の被写体（細胞）に焦点合わせされる対物レンズ４２及び対物レンズ４で伝播される被写体画像（細胞）を撮影する撮像部８２を具備している。光源および撮像部８２は、システム制御部８０によって制御され、システム制御部８０は、撮像部８２で撮影されたウェル６２内の被写体画像をメモリ８４にフレーム画像として格納し、撮影画像をそのまま、或いは、コントラスト処理または強調処理等を施して表示部８６に表示させている。測定装置４０が顕微鏡装置を備える場合には、測定装置４０の光源、対物レンズ４２および撮像部８２は、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラなどを搭載した顕微鏡装置に含まれている撮像部等が代用されても良い。システム制御部８０は、撮像部８２のみならず、開閉制御部１２、昇降機構３６、ステージ移動機構５２及びエレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０を制御して、図４に示す被検細胞の細胞特性を評価する方法を実施させている。

【0026】

システム制御部８０によって制御されている細胞特性評価システム１０では、評価方法を実施するに際して、はじめに細胞分離装置２０の分離部２８下方のステージ５０上に容器部６０が載置されて評価処理が開始される（Ｓ１８）。次に、上部開口から受容器２４内に、所望により予めミンスやホモジナイズなどの前処理がなされた検体が持ち込まれる。これと共に、処理器２６での処理に必要な試薬が添加される。試薬の添加は、処理器２６に開閉可能に設けられた試薬添加口から行われてもよい（Ｓ２０）。開閉処理部１２によって受容器２４の蓋が閉められ、処理器２６との境界の弁が開成される。予め設定された条件に従って処理器２６内で消化処理が行われる。処理器２６は予め設定された条件を満たす環境を作り出すための温度調節器を備えてよい（Ｓ２１）。次に、処理器２６と分離部２８との境界の弁か解放され、処理器２６内で処理された検体が分離部２８内部に送られる。分離部２８の分離材を通過することにより、検体に含まれる夾雑物が除去される（Ｓ２２）。分離された被検細胞を含む試料１８は、容器部６０のウェル６２に送られて収容される。ここで、分離材を通過するのに先駆けて処理器２６内で進められた反応を止めるための反応停止試薬が検体に対して添加されても良い。この添加は、予め分離部２８内に反応停止試薬を収容されていても良く、そのような試薬を添加するための開閉可能な試薬添加口が分離器２２の何れかの位置の壁面に設けられていても良い（Ｓ２３）。

【0027】

被検細胞を含む試料１８をウェル６２に収容したままで、容器部６０は、エレクトロポレーション装置に送られる（Ｓ２４）。エレクトロポレーション装置のノズルからレポーターベクターを含む試薬が容器部６０のウェル６２に添加される。導入プローブヘッド３４の電極３２，３３が容器部６０のウェル６２内の試料１８に接触され、エレクトロポレーション回路部７０においてポレーションモードに先だって測定モードが実行され、電荷印加条件が設定される（Ｓ２５）。その後、電荷印加条件の設定後、ポレーションモードに切り替えられて、設定された電荷印加条件でエレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０が動作制御され、レポーターベクターが被検細胞に導入される（Ｓ２６）。エレクトロポレーション回路部７０の制御下で被検細胞は、所定の時間に亘り、所定の培養条件下で培養される（Ｓ２８）。

【0028】

ここでは、レポーターベクターが被検細胞に導入される例を示したが、レポーターベクターに代えて、または、レポーターベクターとともに、レポーターベクター以外の核酸、タンパク質、薬剤及び/またはイオンなどが被検細胞に導入されても良い。被検細胞に導入されるこれら物質は、単に導入物質と称するものとする。

【0029】

その後、容器部６０は、測定装置４０に送られる。測定装置４０では、容器部６０のウェル６２に収容された被検細胞におけるレポーター蛋白質量を測定する。測定装置４０における全ての手続きは、予めメモリ８４に格納されたプログラムおよび複数の情報が纏められたテーブルに従ってシステム制御部８０が実行制御する。例えば、光源からの光照射、照射時間および照射間隔などの照射条件の制御、撮像部８２による撮像および撮像条件の制御、撮像された画像についての画像処理および画像処理などが測定装置４０において制御される。また、細胞特性の判定についても、予めメモリ８４に格納されたプログラムに沿って、画像と細胞特性とを対応付けした情報を含むテーブルを参照して、システム制御部８０が実施する。

【0030】

エレクトロポレーション装置における被検細胞の培養の後、容器部６０は、測定装置４０に送られる。その後、光源からの光が容器部６０のウェル６２内に照射される。容器部６０のウェル６２を通過した光は、対物レンズ８７で集められ、その光から撮像部８２は任意に明視野画像を得る。その後、暗箱機構内において、被検細胞に導入されたレポーター蛋白質からの光学的な信号（ここでは、１例としての発光）を、対物レンズ８７を通して、撮像部８２によって撮像する。光源の光照射を止め、被検細胞からの発光が対物レンズ８７で集められ、その光から撮像部８２が発光画像を得る（Ｓ２８）。撮像部８２により得られた任意の明視野画像および発光画像は、システム制御部８０により画像処理されて任意に重ね合わされて（マージされて）表示部８４に表示される。システム制御部８０では、画像の表示部８４への表示と同時または表示と前後して、明視野画像および発光画像と、メモリ８４に格納されたテーブルとに基づいて、被検細胞の細胞特性を判定する。この判定の結果は、マージされた画像と共に表示部８４に示される（Ｓ２９）。表示部８４への各ウェル６２に評価判定結果が表示画像とともにメモリ８４に格納されて一連の処理が終了される（Ｓ３０）。

【0031】

ここでは、レポーター蛋白質からの光学的な信号として発光が生じる例を示したが、発光とは異なるレポーター蛋白質が生じる検出な可能な信号についても、撮像部８２を構成する検出装置を交換することにより同様に測定することが可能である。

【0032】

図４に示されたステップＳ２５及びＳ２６に示される測定モード及びポレーションモードについて図２、図３及び図５を参照して詳細に説明する。

【0033】

複数のウェル６２内の、複数の被検体細胞に均一にエレクトロポレーションするには、全てのウェル６２に同一の電荷量が供給されることが要請される。より厳密には、電荷量の密度を全ウェルで一定にし、個々の細胞が受ける電気的影響の大きさを揃えることが要請されている。ところが、被検体細胞を含む細胞懸濁液（試料１８）は、含まれる細胞の数や種類、前工程で使われた処理液がウェル６２に持込まれ量の違いにより細胞懸濁液の電気抵抗がウェルごとに異なっている。従って、全てのウェルに同じ電圧を印加して臨界電界強度（Ｅ＝ｋＶ／ｃｍ）を一定にすると、個々のウェル６２内に流れる電荷量に違いが生じる。（Ｖは、電極間電圧であり、ｃｍは、電極間距離を意味している。）そのため、ウェル毎に個々の細胞が受ける電気的影響の大きさが異なり、エレクトロポレーションの効果に差が生じる。結果として、ウェル６２間で検査結果の比較ができない問題に至っている。

【0034】

発明者は、複数ウェル６２に同一条件でエレクトロポレーションする為には、測定モードにおいて、各ウェル内の細胞懸濁液の電気的パラメータを測定し、この測定モードで測定された条件に基づいてエレクトロポレーションを実行することによってこのような問題を解消できると着想している。この測定モードにおける測定を前提とすれば、ウェル６２毎に個々の細胞が受ける電気的影響の大きさが異なっても、ウェル６２毎に個々の細胞に均一なエレクトロポレーションの効果を与えることができ、結果として、ウェル６２間で検査結果の比較ができるとしている。

【0035】

エレクトロポレーションでは、長い時間電圧が印加されると、細胞は、細胞死に誘導されることから、微小時間（数十マイクロ秒）で電圧が印加されることが要請される。このときに電極３２、３３間に生ずる電荷量Ｑは、
Ｑ=ＣＶ（１−ｅ^-ｔ／τ）
τ=Ｒ・Ｃ
で表される。ここで、Ｒ及びＣは、それぞれウェル６２内の電極３２、３３間の抵抗及びキャパシタ、τは、時定数、Ｖは、測定モードで電極３２、３３間に印加する電圧、また、ｔは、電圧印加の経過時間である。ここで、抵抗Ｒは、主に電極３２、３３間の細胞懸濁液の抵抗に相当し、キャパシタＣは、電極３２、３３の表面の細胞懸濁液との間の界面に生じる電気２重層の静電容量に相当している。

【0036】

前処理で、ウェル６２内の細胞懸濁液の抵抗Ｒ及びキャパシタＣが異なり、ウェル毎に入れられる細胞懸濁液内の細胞の数で、これらのパラメータが変化される。また、被検体が異なれば、被検体の個体差が変化される。同一被検体であっても、サンプルされる個体差（細胞の数）が生じ、また、同一容積のウェル６２であっても細胞懸濁液を入れる量でこれらのパラメータが変化される。

【0037】

測定モードが開始される（Ｓ３２）と、始めに抵抗Ｒが測定される（Ｓ３３）。測定モードでは、細胞懸濁液内の細胞が細胞死を招かない様な（有意なダメージを与えないような）所定の交流電圧が第１の測定電圧として設定される。一例として、電極３２，３３間の距離が０.３mmに設定されている場合には、２０Ｖ／０．３ｍｍ≒６５Ｖ／ｍｍ以下の範囲に設定される。この範囲は、エレクトロポレーションを生じさせる際の直流インパルス電圧、例えば、２００−３００Ｖの１０〜２０％[１／５〜１／６]に相当し、低電圧２０〜６０Ｖのピークを有する交流電圧が第１の測定電圧として設定される。この抵抗Ｒの測定に際しては、回路制御部９８がスイッチ７３を制御して電源部９０の電源として交流電源７１を選択し、所定の時間（数秒）の間スイッチ７４を閉じて上述した所定電圧をピークとする所定の周波数（例えば、１０の４乗オーダーの周波数に相当する２０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚの周波数）の交流電圧Ｖ１を電極間３２，３３に印加する。この印加時の電極間３２，３３に流れる電流Ｉが電流検出部７５で検出され、測定部９２で抵抗値Ｒ（Ｒ=Ｖ１／Ｉ）が求められる（Ｓ３３）。印加電圧が交流であることから、抵抗値が電流Ｉ及び電圧Ｖ１から算出される。

【0038】

次に、時定数τが測定される（Ｓ３４）。この時定数τの測定に際しては、回路制御部９８がスイッチ７３を制御して電源部９０の電源として直流電源７２を選択する。そして、所定の時間（数秒）の間スイッチ７４を閉じて第２の測定電圧として所定の直流電圧を電極間３２，３３に印加する。この直流電圧は、同様に細胞懸濁液内の細胞が細胞死を招かない様な（有意なダメージを与えないような）直流電圧（第２測定電圧）に設定される。一例として、電極３２，３３間の距離が０.３mmに設定されている場合には、２０Ｖ／０．３ｍｍ≒６５Ｖ／ｍｍ以下の範囲に第２の電圧が設定される。この第２の電圧は、数百マイクロ秒、１秒の間スイッチ７４が閉じられ、第２の電圧が電極３２，３３間に印加されて電流の変化が測定部９２で測定される。測定部９２では、時間経過に伴う電流変化から時間経過に伴う電圧変化を算出して定常状態に至る時定数τを求めることができる。

【0039】

Ｑ=ＣＶ（１−ｅ^-ｔ／τ）
τ=Ｒ・Ｃ
このように、時定数τが判明することから、測定部９２において、ステップＳ３３で測定された抵抗Ｒを利用してキャパシタＣも計算により求めることができる（Ｓ３５）。ウェル６２毎に、求められた抵抗Ｒ、キャパシタＣ、時定数τ、測定時の第１電圧及び第２電圧は、印加条件設定部９６に表形式で格納される。印加条件算出部９４は、抵抗Ｒ、キャパシタＣ、時定数τ等のパラメータから直流インパルス電圧の印加時間ｔ、換言すれば、スイッチ７４の閉成時間ｔをウェル６２毎に算出する。上述した電荷量Ｑの式から明らかなように、直流インパルス電圧の印加時間ｔが算出されることによって電極３２，３３間に与えられる電荷量Ｑがすべてのウェル６２について一定化される。印加条件算出部９４で印加時間ｔ及び電荷量Ｑも、印加条件設定部９６に表形式で格納される。より具体的には、印加条件設定部９６に格納される表には、ウェル番号Ｗ１〜Ｗｎ毎に測定抵抗Ｒ１〜Ｒｎ、測定キャパシタＣ１〜Ｃｎ、測定時定数τ１〜τｎ、直流インパルス電圧の印加時間ｔ１〜ｔｎ、演算された電荷量Ｑ１〜Ｑｎ及び測定時の第１、第２電圧Ｖ１、Ｖ２が記載される。

【0040】

印加時間ｔ１〜ｔｎが演算されて印加条件設定部９６に格納されると、エレクトロポレーションが実行される（Ｓ３６）。システム制御部９７は、スイッチ７４が開成された状態で、直流電源７２にインパルス直流電圧Ｖを設定し、各スイッチ７４の閉成時間（インパルス印加時間）ｔ１〜ｔｎをスイッチ開閉制御部９７に設定してエレクトロポレーションを開始する。各スイッチ７４が印加時間ｔ１〜ｔｎで閉成されることから、インパルス電圧が各ウェル６２内の電極３２，３３に印加され、所望の電荷量Ｑ１〜Ｑｎがウェル６２毎に供給され、均一なエレクトロポレーションが実行される。このエレクトロポレーションの実行後に、処理が終了される（Ｓ３７）。

【0041】

インパルス直流電圧Ｖは、一例として（１５０Ｖ〜２００Ｖ）／０．３ｍｍ≒（５００Ｖ〜６５０Ｖ）／ｍｍ以下の範囲内でサンプル細胞に応じて設定される。印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎは、５０マイクロ秒以下に設定される。この印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎは、好ましくは、より小さい範囲に設定され、印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎが小さければ、小さい程、細胞死を阻止することができる。

【0042】

図３に示される回路においては、印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎが制御されるエレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０の構成を説明しているが、印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎに代えて印加電圧（インパルス電圧）Ｖ１〜Ｖｎが可変されるように構成されても良い。図６を参照して印加電圧（インパルス電圧）Ｖ１〜Ｖｎが可変される他の実施の形態に係るエレクトロポレーション回路部７０の回路構成を説明する。図６において、図４に示したと同一符号は、同一部分或いは同一箇所を示すものとしてその説明を省略する。

【0043】

印加電圧（インパルス電圧）Ｖ１〜Ｖｎを可変する可変印加電圧源（可変インパルス電圧源）は、個別スイッチ７４で抵抗ｒ０〜ｒｎを選択する電圧可変部７８が電源部９０に接続されて構成される。抵抗ｒ０〜ｒｎは、夫々抵抗値が異なり、共通接続されて電流検出部７５に接続されている。個別スイッチ７４で抵抗ｒ０〜ｒｎが選択されると、抵抗ｒｎの選択に基づいて直流インパルス電圧Ｖの電圧値が選択される。測定モード時においては、最も抵抗値の小さな抵抗ｒ０が選択されて測定系における抵抗損失が最小限に留められる。そして、図５に示すステップＳ３２〜Ｓ３５が実施されてウェル番号Ｗ１〜Ｗｎ毎の測定抵抗Ｒ１〜Ｒｎ、測定キャパシタＣ１〜Ｃｎ、測定時定数τ１〜τｎ等のパラメータで印加条件が求められる。ポレーションモード時においては、全てのウェル６２に同一の電荷量を供給すべく、求められた印加条件設定部９６に格納された表が参照されて一定の印加時間Ｔ０を基準とした各ウェル６２の電極３２，３３間に与えられるべき印加電圧ｖ０〜ｖｎが算出される。スイッチ開閉制御部９６は、各ウェル６２内に印加すべき印加電圧ｖ０〜ｖｎに応じて抵抗ｒ０〜ｒｎのいずれかを選定し、選定した抵抗ｒ０〜ｒｎにスイッチ７４が接続されるように制御してスイッチ７４を一定時間Ｔ０の間、閉成する。その結果、直流インパルス電圧Ｖｎの選択によってウェル６２毎の電荷量Ｑの均等化を図ることができる。

【0044】

尚、ウェル毎に直流インパルス電圧Ｖｎを選択することに加えて図４を参照する実施例で説明した印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎを選択するようにしても良い。即ち、印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎ及び抵抗ｒ０〜ｒｎの組み合わせによってウェル６２毎の電荷量Ｑの均等化を図るようにしても良い。

【0045】

上記実施形態では、被検細胞の培養をエレクトロポレーション装置が行う例を示したが、被検細胞の培養は、測定装置４０において行っても良い。その場合、システム１０が更に細胞培養を可能にする部材を備えれば良く、或いは、エレクトロポレーション装置と測定装置４０と両方において、被検細胞が培養されても良い。

【0046】

また、容器部６０のウェル６２へのレポーターベクターの添加は、容器部６０のウェル６２がエレクトロポレーション装置の所定の位置に送られる以前の何れかの時期に行われても良い。その場合、システム１０は、レポーターベクター添加機構をエレクトロポレーション装置よりも上流の所望の位置に更に備えれば良い。

【0047】

上述したエレクトロポレーション（遺伝子導入）装置及びエレクトロポレーション（遺伝子導入）方法によれば、複数のウェルに格納された細胞懸濁液に電圧インパルスを印加してウェル毎に定まる電荷量を注入し、細胞外液中の分子をその細胞懸濁液内の細胞に効率的に導入させることができる。結果として、複数のウェルに対して、同じように電場をかけることができ、それにより、複数のウェルの被検体細胞のエレクトロポレーション条件が均一化でき、正確な診断ができる。また、このような構成のエレクトロポレーション装置を具備する被検細胞の細胞特性を評価するシステムにあっては、より高い精度で効率的に被検細胞の細胞特性を評価することができる。また、検査をスループットで行うことが可能であるので、簡便に検査を行うことが可能であり、試料の取り違えやコンタミネーションを防ぐことが可能である。

【符号の説明】

【0048】

１０…細胞特性評価システム、１２…開閉制御部、１８…試料、２０…細胞分離装置、２２…分離器、２４…受容器、２６…処理器、２８は分離部、３０…エレクトロポレーション（遺伝子導入）装置、３２，３３…電極、３４…プローブヘッド、４０…測定装置、５０…ステージ、５１…矢印、５４…ステージ移動機構、６０…容器部、６２…ウェル、７０…エレクトロポレーション回路部、７１…交流電源、７２…直流電源、７４…スイッチ、７５…電流検出部、７８…電圧可変部７８、
８０…システム制御部、８２…撮像部、８６…表示部、９０…電源部、９２…測定部、９４…印加条件算出部、９６…印加条件記憶部、９７…スイッチ開閉制御部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】