特許 6816133 改変ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6816133

(24)【登録日】2020年12月25日

(45)【発行日】2021年1月20日

(54)【発明の名称】改変ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20210107BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20210107BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210107BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 ZZNA

   C12N15/12

   C12N5/10

【請求項の数】6

【全頁数】86

(21)【出願番号】特願2018-517380(P2018-517380)

(86)(22)【出願日】2016年10月5日

(65)【公表番号】特表2018-535663(P2018-535663A)

(43)【公表日】2018年12月6日

(86)【国際出願番号】US2016055492

(87)【国際公開番号】WO2017062451

(87)【国際公開日】20170413

【審査請求日】2019年10月2日

(31)【優先権主張番号】62/297,426

(32)【優先日】2016年2月19日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/237,394

(32)【優先日】2015年10月5日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】508117721

【氏名又は名称】プレシジョン バイオサイエンシズ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】特許業務法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジャンツ，デレック

(72)【発明者】

【氏名】スミス，ジェームス，ジェファーソン

(72)【発明者】

【氏名】ニコルソン，マイケル，ジー．

(72)【発明者】

【氏名】マクレオード，ダニエル，ティー．

(72)【発明者】

【氏名】アントニー，ジェヤラージ

(72)【発明者】

【氏名】バートセビッチ，ビクター

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１７６９１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 欧州特許出願公開第３００４３３７（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１５３４７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Can. Res., 2015, Vol. 75, No. 18, pp. 3853-3859

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ５／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常領域遺伝子をそのゲノム中に含む遺伝子改変ヒトＴ細胞であって、
前記改変ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子が５’から３’に：
（ａ）前記ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の５’領域；
（ｂ）キメラ抗原受容体をコードする外因性ポリヌクレオチド；及び
（ｃ）前記ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の３’領域；
を含み、
前記外因性ポリヌクレオチドが、前記ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の配列番号３の１３位と１４位との間に挿入され、前記キメラ抗原受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記遺伝子改変ヒトＴ細胞は、前記細胞表面で内因性ＴＣＲを発現しない、遺伝子改変ヒトＴ細胞。

【請求項2】

前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１１２と少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記細胞外リガンド結合ドメインがＣＤ１９に結合する、請求項１に記載の遺伝子改変ヒトＴ細胞。

【請求項3】

前記キメラ抗原受容体が、以下からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載の遺伝子改変ヒトＴ細胞：
（ａ）配列番号１１３と少なくとも９５％の配列同一性を有する細胞内細胞質シグナル伝達ドメイン；
（ｂ）配列番号１１４と少なくとも９５％の配列同一性を有する細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；
（ｃ）配列番号１１５と少なくとも９５％の配列同一性を有するシグナルペプチド；及び
（ｄ）配列番号１１６と少なくとも９５％の配列同一性を有するヒンジドメイン。
（ｅ）配列番号１１７と少なくとも９５％の配列同一性を有する膜貫通ドメイン。

【請求項4】

前記キメラ抗原受容体が、配列番号１１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子改変ヒトＴ細胞。

【請求項5】

前記外因性ポリヌクレオチドが、前記キメラ抗原受容体の発現を駆動するプロモータ配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子改変ヒトＴ細胞。

【請求項6】

前記プロモータ配列が、配列番号１１８と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項５に記載の遺伝子改変ヒトＴ細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月１９日に出願された「改変ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞」と題する米国特許仮出願第６２／２９７，４２６号明細書、及び２０１５年１０月５日に出願された「改変ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞」と題する米国特許仮出願第６２／２３７，３９４号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、腫瘍学、癌免疫療法、分子生物学、及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、改変ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子をそのゲノムに含む、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が低下している遺伝子改変細胞に関する。本発明は更に、このような遺伝子改変細胞を作製するための方法、及びこのような細胞を対象において癌を含む疾患を治療するために使用する方法に関する。

【0003】

ＥＦＳ−ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出される配列表の参照
本出願には、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表が含まれており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年１０月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は２０００７０６＿００１８０ＷＯ１．ｔｘｔであり、サイズは２６４，０４６バイトである。

【背景技術】

【0004】

Ｔ細胞養子免疫療法は、癌治療のための有望なアプローチである。この戦略は、特定の腫瘍関連抗原に対するそれらの特異性を高めるように遺伝子改変された、単離ヒトＴ細胞を利用する。遺伝子改変は、抗原特異性をＴ細胞に移植するためのキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体の発現を含み得る。外因性Ｔ細胞受容体とは対照的に、キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体の可変ドメインからその特異性に由来する。従って、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）は、主要組織適合性複合体において腫瘍の免疫反応性を非限定的に誘導する。今日まで、Ｔ細胞養子免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び慢性リンパ球性白血病）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、グリア芽腫、進行した神経膠腫、卵巣癌、中皮腫、メラノーマ、及び膵臓癌を含む多数の癌の臨床療法として利用されてきている。

【0005】

癌治療としての潜在的有用性にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞による養子免疫療法は、ある程度、細胞表面上の内因性Ｔ細胞受容体の発現によって制限されていた。内因性Ｔ細胞受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、同種異系患者への投与後に、主要及び副組織適合抗原を認識し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症をもたらし得る。結果として、臨床試験は、患者のＴ細胞を単離し、キメラ抗原受容体を取り込むように遺伝子改変して、次いで同じ患者に再注入する、自己ＣＡＲ Ｔ細胞の使用に大きく焦点を当てている。自己由来のアプローチは、投与されたＣＡＲＴ細胞に免疫寛容を提供するが、このアプローチは、患者の癌が診断された後に患者特異的ＣＡＲＴ細胞を作製するのに必要な時間と費用の両方によって制約される。

【0006】

従って、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低下させ、投与によりＧＶＨＤを発症しない、第三者ドナー由来のＴ細胞を用いて調製された「既製の」ＣＡＲＴ細胞を開発することが有利であると思われる。このような製品は、診断に先立って作製および検証され、必要に応じてすぐに患者に提供することができる。従って、ＧＶＨＤの発生を防止するために内因性Ｔ細胞受容体を欠く同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の開発が必要である。

【0007】

ゲノムＤＮＡの遺伝子改変は、目的の遺伝子座においてＤＮＡ配列を認識するように操作された、部位特異的で、レアカッティングなエンドヌクレアーゼを使用して行うことができる。操作された部位特異的ヌクレアーゼを生成するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ゲノム中の所定の部位を認識及び切断するように操作することができる。ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限酵素のヌクレアーゼドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。ジンクフィンガードメインは、長さが約１８塩基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を生成するための合理的又は実験的手段によって再設計することができる。この操作されたタンパク質ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼに融合することにより、ゲノムレベルの特異性でＤＮＡ切断を標的とすることが可能にする。ＺＦＮは、広範囲の真核生物における遺伝子の付加、除去、及び置換を標的とするために広範に使用されている（非特許文献１に概説されている）。同様に、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を生成して、ゲノムＤＮＡ中の特定の部位を切断することができる。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合された、操作された部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む（非特許文献２に概説されている）。しかし、この場合、ＤＮＡ結合ドメインは、それぞれが単一のＤＮＡ塩基対を特異的に認識するＴＡＬ−エフェクタードメインのタンデム配列を含む。本発明の実施にＺＦＮ及びＴＡＬＥＮが有する限界は、それらがヘテロ二量体であることであり、その結果、細胞内の単一機能性ヌクレアーゼの産生が２つのタンパク質単量体の同時発現を必要とすることである。

【0008】

コンパクトＴＡＬＥＮは、二量体化の必要性を回避する代わりのエンドヌクレアーゼ構造を有する（非特許文献３）。コンパクトＴＡＬＥＮは、Ｉ−ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインに融合された、操作された部位特異的ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。ＦｏｋＩとは異なり、Ｉ−ＴｅｖＩは二本鎖ＤＮＡ切断を行うために二量体化する必要がないため、コンパクトＴＡＬＥＮは単量体として機能する。

【0009】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に基づく操作されたエンドヌクレアーゼも当技術分野で知られている（非特許文献４；非特許文献５）。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、２つの成分：（１）カスパーゼエフェクターヌクレアーゼ、典型的には微生物Ｃａｓ９；及び（２）ヌクレアーゼをゲノムの目的の位置に誘導する、約２０ヌクレオチドの標的化配列を含む短い「ガイドＲＮＡ」、を含む。それぞれが異なる標的化配列を有する複数のガイドＲＮＡを同じ細胞において発現させることにより、ゲノム中の複数の部位に対するＤＮＡ切断を同時に標的化することが可能である。従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼは本発明に適している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の主要な欠点は、報告されている高頻度のオフターゲットＤＮＡ切断であり、このことがヒト患者を治療するための系の有用性を制限し得る（非特許文献６）。

【0010】

ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一般的に見出される、１５〜４０塩基対の切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼのグループである。それらは、寄生虫ＤＮＡ因子、例えばグループ１自己スプライシングイントロン及びインテイン等と頻繁に関連している。それらは、細胞のＤＮＡ修復機構を動員する、染色体における二本鎖切断を生じさせることによって、宿主ゲノムの特定の位置で相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進する（非特許文献１）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、通常、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７）ファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７）ファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７）モチーフの１又は２つのいずれかのコピーを有することを特徴とする（非特許文献８を参照されたい）。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７）モチーフの単一のコピーを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７）ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成するが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７）モチーフの２つのコピーを有するメンバーは単量体として見出される。

【0011】

Ｉ−ＣｒｅＩ（配列番号６）は、藻類クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の葉緑体染色体中の２２塩基対の認識配列を認識及び切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７）ファミリーのメンバーである。野生型Ｉ−ＣｒｅＩ切断部位の優先性を改変するために、遺伝子選択技術が用いられている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。より最近では、Ｉ−ＣｒｅＩ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを、哺乳動物、酵母植物、細菌、及びウイルスのゲノム中の部位を含む、多岐にわたるＤＮＡ部位を標的とするように包括的に再設計可能なモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載されている、（特許文献１）。

【0012】

特許文献２に最初に記載されているように、Ｉ−ＣｒｅＩ及びその操作された誘導体は通常二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のＮ末端に結合する短いペプチドリンカーを使用して、単一のポリペプチドに融合することができる（非特許文献１３； 非特許文献１４）。従って、機能的「単鎖」メガヌクレアーゼを、単一の転写産物から発現させることができる。

【0013】

ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域中のＤＮＡ標的を切断するための操作されたメガヌクレアーゼの使用は、特許文献３に以前に開示されている。特許文献３は、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のエクソン１内の認識配列（特許文献３の配列番号３）を標的とするように操作された、Ｉ−ＯｎｕＩメガヌクレアーゼの変異体を開示している。特許文献３は、キメラ抗原受容体がＴＣＲノックアウト細胞において発現され得ることを論じているが、著者らは、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子中のメガヌクレアーゼ切断部位への、キメラ抗原受容体コード配列の挿入を開示していない。

【0014】

内因性ＴＣＲの発現を破壊するための他のヌクレアーゼ及び機序の使用も開示されている。例えば、ヒトＴ細胞におけるＴＣＲ遺伝子を破壊するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用は、特許文献４及び５に記載されている。特許文献６は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、並びに単離されたＴ細胞中のＴＣＲ遺伝子を標的とするために操作された単鎖ガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を記載する。特許文献７は、Ｔ細胞における特異的ＴＣＲ及び／又はＣＤ３鎖をコードする核酸を標的とする、小型ヘアピンＲＮＡの使用を開示している。

【0015】

しかし、本発明は、先行技術の教示を改善する。本発明者らは、ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入された外因性ポリヌクレオチド配列（例えば、キメラ抗原受容体又は外因性ＴＣＲコード配列）を含み、同時に細胞表面における内因性Ｔ細胞受容体の発現を破壊する遺伝子改変細胞を最初に教示している。更に、先行技術は、本明細書に記載のメガヌクレアーゼ若しくは認識配列、又はこのような遺伝子改変細胞を作製するためのそれらの使用を教示していない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】国際公開第２００７／０４７８５９号公報

【特許文献2】国際公開第２００９／０５９１９５号公報

【特許文献3】国際公開第２０１４／１９１５２７号公報

【特許文献4】米国特許第８，９５，８２８号明細書

【特許文献5】米国特許出願公開第２０１４／０３４９０２号明細書

【特許文献6】米国特許出願公開第２０１４／０３０１９９０号明細書

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３（２００５）、５９７８

【非特許文献2】Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２３（２０１３）：９３〜９

【非特許文献3】Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．４（２０１３）：１７６２

【非特許文献4】Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８（２０１３）：２２８１〜２３０８

【非特許文献5】Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（２０１３）：９５７〜６３

【非特許文献6】Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２０１３）：８２２〜６

【非特許文献7】Ｑ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８（２００６）：４９〜９５

【非特許文献8】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）（２００１）：３７５７〜３７７４

【非特許文献9】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２（２００４）：３１〜４１

【非特許文献10】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）：ｅ１７８

【非特許文献11】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（２００２）：３８７０〜９

【非特許文献12】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５（２００６）：４４３〜５８

【非特許文献13】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（２００９年）：１６５０〜６２

【非特許文献14】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（２００９）：５４０５〜１９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

本発明は、そのゲノム中に改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞を提供する。このような細胞は、遺伝子改変ヒトＴ細胞、又はヒトＴ細胞に由来する遺伝子改変細胞である。更に、このような細胞は、非改変対照細胞と比較した場合、内因性ＴＣＲの細胞表面発現が低下している。本発明はまた、遺伝子改変細胞の作製方法を提供する。本発明は更に、遺伝子改変細胞を投与することによって癌を治療するための免疫療法の方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0019】

従って、一態様において、本発明は、そのゲノム中に改変ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞を提供し、該改変ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子は、５’から３’に：（ａ）ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の５’領域；（ｂ）外因性ポリヌクレオチド；及び（ｃ）ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の３’領域を含む。遺伝子改変細胞は、遺伝子改変ヒトＴ細胞であるか、又はヒトＴ細胞に由来する遺伝子改変細胞である。更に、遺伝子改変細胞は、非改変対照細胞と比較した場合、内因性ＴＣＲの細胞表面発現が低下している。

【0020】

一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含み、このキメラ抗原受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン及び１又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0021】

このような一実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号１１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含み、この細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ１９に結合する。

【0022】

別のこのような実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号１１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する細胞内細胞質シグナル伝達ドメインを含む。

【0023】

別のこのような実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号１１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

【0024】

別のこのような実施形態において、キメラ抗原受容体はシグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１１５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有し得る。

【0025】

別のこのような実施形態において、キメラ抗原受容体はヒンジドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、配列番号１１６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する。

【0026】

別のこのような実施形態において、キメラ抗原受容体は膜貫通ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１１７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する。

【0027】

別のこのような実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号１１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する。

【0028】

別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモータ配列を含む。このような一実施形態において、プロモータ配列は、配列番号１１８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する。

【0029】

別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドの核酸配列は、配列番号１１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する。

【0030】

別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号３を含む認識配列内の位置においてＴＣＲ遺伝子に挿入される。このような一実施形態において、改変ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子は、配列番号１２０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0031】

別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号４を含む認識配列内の位置においてＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入される。このような一実施形態において、改変ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子は、配列番号１２１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0032】

別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号５を含む認識配列内の位置においてＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入される。このような一実施形態において、改変ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子は、配列番号１２２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0033】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の遺伝子改変細胞及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0034】

別の態様において、本発明は、医薬品としての使用のための、本明細書に記載の遺伝子改変細胞を提供する。本発明は更に、それを必要とする対象において疾患を治療するための医薬品の製造における、本明細書に記載の遺伝子改変細胞の使用を提供する。このような一態様において、この医薬品は癌の治療に有用である。いくつかの実施形態において、癌の治療は免疫療法である。

【0035】

別の態様において、本発明は、改変ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞の作製方法であって、（ａ）細胞に、（ｉ）操作されたヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列；又は（ｉｉ）操作されたヌクレアーゼタンパク質を導入し、前記操作されたヌクレアーゼがヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内の認識配列に切断部位を生成する工程、及び（ｂ）外因性ポリヌクレオチドを含む第２の核酸配列を細胞に導入する工程、を含む方法を提供する。このような方法において、細胞はヒトＴ細胞であるか、又はヒトＴ細胞に由来する。更に、外因性ポリヌクレオチド配列は、切断部位においてヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入される。更に、遺伝子改変細胞は、非改変対照細胞と比較した場合、内因性ＴＣＲの細胞表面発現が低下している。

【0036】

本方法の様々な実施形態において、第１の核酸配列又は操作されたヌクレアーゼタンパク質は、第２の核酸を導入する前に、又は第２の核酸を導入した後に細胞に導入することができる。

【0037】

本方法の一実施形態において、第２の核酸配列は、５’から３’に：（ａ）切断部位に隣接する５’上流配列に相同な５’相同アーム；（ｂ）外因性ポリヌクレオチド；及び（ｃ）切断部位に隣接する３’下流配列に相同な３’相同アーム、を含む。このような実施形態において、外因性ポリヌクレオチドの配列は、相同組換えによって切断部位においてヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入される。

【0038】

本方法の別の実施形態において、第２の核酸は切断部位に対して実質的な相同性を欠き、外因性ポリヌクレオチドの配列は、非相同末端結合によってヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入される。

【0039】

本方法の別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む。

【0040】

本方法の別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドの発現を駆動する第１のプロモータ配列を含む。

【0041】

本方法の別の実施形態において、操作されたヌクレアーゼをコードする第１の核酸は、ｍＲＮＡを用いて細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、本明細書に記載の少なくとも１つの操作されたヌクレアーゼのコード配列及び少なくとも１つの更なるタンパク質（例えば、第２のヌクレアーゼ）のコード配列を含むポリシストロニックｍＲＮＡであり得る。特定の実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、同じ遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子）内の異なる認識配列を標的とする、本明細書に記載の２つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードすることができる。他の実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼ、及び同じ遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子）内の異なる認識配列を認識及び切断するか、あるいは、ゲノム中の目的の別の遺伝子内の異なる認識配列を認識及び切断する第２のヌクレアーゼをコードすることができる。このような実施形態において、このようなポリシストロニックｍＲＮＡを使用して作製された遺伝子改変細胞は、同時にノックアウトされた複数の遺伝子を有することができる。更なる実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記載の少なくとも１つの操作されたヌクレアーゼ及び細胞に有益な１つの更なるタンパク質をコードし、切断部位への目的の外因性配列の挿入効率を改善し、且つ／又は疾患の治療に有益である。

【0042】

本方法の別の実施形態において、少なくとも第２の核酸配列は、第２の核酸配列を含むウイルスベクターと細胞とを接触させることによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列及び第２の核酸配列の両方が、第１の核酸配列及び第２の核酸配列の両方を含む単一のウイルスベクターと細胞とを接触させることによって導入される。あるいは、細胞は、第１の核酸配列を含む第１のウイルスベクター及び第２の核酸配列を含む第２のウイルスベクターと接触させることができる。

【0043】

第２の核酸配列がウイルスベクターによって導入される方法のこのような実施形態において、第２の核酸は、５’相同アームの５’上流に位置する、又は３’相同アームの３’下流に位置する第２のプロモータ配列を更に含むことができる。第２のプロモータが３’相同アームの３’下流に位置する実施形態において、プロモータは逆位であってよい。

【0044】

本方法の別の特定の実施形態において、少なくとも第２の核酸配列は、第２の核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと細胞とを接触させることによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列及び第２の核酸配列の両方が、第１の核酸配列及び第２の核酸配列の両方を含む単一の組換えＡＡＶと細胞とを接触させることによって導入される。あるいは、細胞は、第１の核酸配列を含む第１の組換えＡＡＶ及び第２の核酸配列を含む第２の組換えＡＡＶと接触させることができる。

【0045】

第２の核酸配列が組換えＡＡＶベクターによって導入される方法のこのような実施形態において、第２の核酸は、５’相同アームの５’上流に位置する、又は３’相同アームの３’下流に位置する第２のプロモータ配列を更に含むことができる。第２のプロモータが３’相同アームの３’下流に位置する実施形態において、プロモータは逆位であってよい。

【0046】

本方法の別のこのような実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶベクターである。

【0047】

本方法の別のこのような実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、任意の血清型を有することができる。本方法の特定の実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２の血清型を有する。本方法の別の特定の実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６の血清型を有する。

【0048】

本方法の別の実施形態において、少なくとも第２の核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入される。

【0049】

本方法の特定の実施形態において、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列はｍＲＮＡにより細胞に導入され、外因性ポリヌクレオチドを含む第２の核酸配列はウイルスベクター、好ましくは組換えＡＡＶベクターを使用して細胞に導入され、細胞はヒトＴ細胞であり、目的の配列はキメラ抗原受容体をコードする。このような実施形態において、この方法は、キメラ抗原受容体を含み、対照細胞と比較したときに内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が低下している遺伝子改変Ｔ細胞を作製する。

【0050】

本方法の別の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、組換えメガヌクレアーゼ、組換えジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、組換え転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、又はメガＴＡＬヌクレアーゼである。本方法の特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは組換えメガヌクレアーゼである。

【0051】

本方法のこのような実施形態において、組換えメガヌクレアーゼは、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域（配列番号１）の残基９３〜２０８内の認識配列を認識及び切断する。このような組換えメガヌクレアーゼは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。

【0052】

本方法のこのような一実施形態において、認識配列は配列番号３（即ち、ＴＲＣ１−２認識配列）を含む。

【0053】

本方法の別のこのような実施形態において、第１のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号：８〜１８のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号１９〜２７のいずれか１つの残基７〜１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号８〜１８のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号１９〜２７のいずれか１つの残基１９８〜３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0054】

本方法の別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、（ａ）配列番号８〜１８のいずれか１つの２１５位；又は（ｂ）配列番号１９〜２７のいずれか１つの２４位に対応する位置にＹを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、（ａ）配列番号８〜１８のいずれか１つの２３３位；又は（ｂ）配列番号１９〜２７のいずれか１つの４２位に対応する位置にＧを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、（ａ）配列番号８〜１８のいずれか１つのそれぞれ２１５位及び２３３位；又は（ｂ）配列番号１９〜２７のいずれか１つのそれぞれ２４位及び４２位に対応する位置に、Ｙ及びＧの１又は複数を含む。

【0055】

本方法の別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号８〜１８のいずれか１つの２６位；又は（ｂ）配列番号１９〜２７のいずれか１つの２１７位に対応する位置にＴを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号８〜１８のいずれか１つの２８位；又は（ｂ）配列番号１９〜２７のいずれか１つの２１９位に対応する位置にＦ若しくはＹを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号８〜１８のいずれか１つの３８位；又は（ｂ）配列番号１９〜２７のいずれか１つの２２９位に対応する位置にＦを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号８〜１８のいずれか１つの４４位；又は（ｂ）配列番号１９〜２７のいずれか１つの２３５位に対応する位置にＳを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号８〜１８のいずれか１つの４６位；又は（ｂ）配列番号１９〜２７のいずれか１つの２３７位に対応する位置にＦ若しくはＹを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号８〜１８のいずれか１つのそれぞれ２６、２８、３８、４４、及び４６；又は（ｂ）配列番号１９〜２７のいずれか１つのそれぞれ２１７、２１９、２２９、２３５、及び２３７位に対応する位置に、Ｔ、Ｆ又はＹ、Ｆ、Ｓ及びＦ又はＹ及びＲの１又は複数を含む。

【0056】

本方法の別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号：８〜１８のいずれか１つの残基２１５〜２７０又は配列番号１９〜２７のいずれか１つの残基２４〜７９を含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号８〜１８のいずれか１つの残基２４〜７９又は配列番号１９〜２７のいずれか１つの残基２１５〜２７０を含む。

【0057】

本方法の別のこのような実施形態において、第１のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号８〜１８のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号１９〜２７のいずれか１つの残基７〜１５３を含む。別のこのような実施形態において、第２のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号８〜１８のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号１９〜２７のいずれか１つの残基１９８〜３４４を含む。

【0058】

本方法の別のこのような実施形態において、組換えメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。

【0059】

本方法の別のこのような実施形態において、組換えメガヌクレアーゼは、配列番号８〜２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0060】

本方法の更なる実施形態において、認識配列は配列番号４（即ち、ＴＲＣ３−４認識配列）を含む。

【0061】

本方法のこのような一実施形態において、第１のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号２８又は２９の残基７〜１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号２８又は２９の残基１９８〜３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0062】

本方法の別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２８又は２９の２４位に対応する位置にＹを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号３０又は３１の２６位に対応する位置にＴを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２８又は２９の４６位に対応する位置にＹを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２８又は２９のそれぞれ位置２４、２６、及び４６に対応する位置にＹ、Ｔ、及びＹの１又は複数を含む。

【0063】

本方法の別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２８又は２９の２１５位に対応する位置にＨを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２８又は２９の２６６位に対応する位置にＴを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２８又は２９の２６８位に対応する位置にＣを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２８又は２９の２１５、２６６、及び２６８位に対応する位置にＨ、Ｔ、及びＣの１又は複数を含む。

【0064】

本方法の別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２８又は２９の残基２４〜７９を含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２８又は２９の残基２１５〜２７０を含む。

【0065】

本方法の別のこのような実施形態において、第１のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号２８又は２９の残基７〜１５３を含む。別のこのような実施形態において、第２のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号２８又は２９の残基１９８〜３４４を含む。

【0066】

本方法の別のこのような実施形態において、組換えメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。

【0067】

本方法の別のこのような実施形態において、組換えメガヌクレアーゼは、配列番号２８又は２９のアミノ酸配列を含む。

【0068】

本方法の更なる実施形態において、認識配列は配列番号５（即ち、ＴＲＣ７−８認識配列）を含む。

【0069】

本方法のこのような一実施形態において、第１のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号３０の残基７〜１５３又は配列番号３１若しくは３２の残基１９８〜３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号３０の残基１９８〜３４４又は配列番号３１若しくは３２の残基７〜１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0070】

本方法の別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、（ａ）配列番号３０の２４位；又は（ｂ）配列番号３１若しくは３２の２１５位に対応する位置にＹを含む。

【0071】

本方法の別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号３０の２１５位；又は（ｂ）配列番号３１若しくは３２の２４位に対応する位置にＹ若しくはＷを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号３０の２３１位；又は（ｂ）配列番号３１若しくは３２の４０位に対応する位置にＭ、Ｌ、若しくはＷを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号３０の２３７位；又は（ｂ）配列番号３１若しくは３２の４６位に対応する位置にＹを含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号３０のそれぞれ２１５位、２３１位及び２３７位；又は（ｂ）配列番号３１若しくは３２のそれぞれ２４位、４０位、及び４６位に対応する位置に、Ｙ若しくはＷ、Ｍ、Ｌ若しくはＷ及びＹの１又は複数を含む。

【0072】

本方法の別のこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号３０の残基２４〜７９又は配列番号３１若しくは３２の残基２１５〜２７０を含む。別のこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号３０の残基２１５〜２７０又は配列番号３１若しくは３２の残基２４〜７９を含む。

【0073】

本方法の別のこのような実施形態において、第１のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号３０の残基７〜１５３又は配列番号３１若しくは３２の残基１９８〜３４４を含む。別のこのような実施形態において、第２のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号３０の残基１９８〜３４４又は配列番号３１若しくは３２の残基７〜１５３を含む。

【0074】

本方法の別のこのような実施形態において、組換えメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。

【0075】

本方法の別のこのような実施形態において、組換えメガヌクレアーゼは、配列番号３０〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0076】

別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において癌を治療するための免疫療法の方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載の遺伝子改変細胞及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載の方法に従って作製された遺伝子改変細胞及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。

【0077】

本方法の別の実施形態において、治療される癌は、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、メラノーマ、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。

【0078】

本方法の別の実施形態において、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。

【0079】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分は、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態であってよく、これらは、特定のエピトープ又は抗原（例えば、癌細胞又は他の疾患を引き起こす細胞又は粒子等の細胞の表面に優先的存在するにエピトープ又は抗原）に対する特異性を提供する。ｓｃＦｖはリンカー配列を介して結合することができる。細胞外リガンド結合ドメインは、任意の目的の抗原又はエピトープに特異的であり得る。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖはヒト化することができる。キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識され得る、従って、抗体媒介性自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的として、殺傷するようにＴ細胞を導く自己抗原を含む（Ｐａｙｎｅら、（２０１６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ３５３（６２９５）：１７９〜１８４を参照されたい）。このようなＣＡＲは、キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ばれ、その使用は本発明に包含される。

【0080】

本発明の上記及び他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参照することにより、より完全に理解することができる。明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよい。実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、まさに各組み合わせが個々に且つ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の適切な部分的組み合わせで提供されてもよい。実施形態に列挙された特徴の全ての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、まさにこのような各部分的組み合わせが個々に且つ明示的に本明細書に開示されているかのように本明細書に開示される。本明細書で開示される本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて本発明の互いの態様に適用される。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1】ヒトＴＲＣアルファ定常領域遺伝子中のＴＲＣ認識配列を示す。図１Ａは本発明の組換えメガヌクレアーゼによって標的とされる各認識配列は、２つの認識半部位を含む。各認識半部位は、４塩基対の中央配列によって分離された９塩基対を含む。ＴＲＣ１−２認識配列（配列番号３）は、ヒトＴ細胞アルファ定常領域（配列番号１）のヌクレオチド１８７〜２０８に及んでおり、ＴＲＣ１及びＴＲＣ２と呼ばれる２つの認識半部位を含む。ＴＲＣ３−４認識配列（配列番号４）は、ヒトＴ細胞アルファ定常領域（配列番号１）のヌクレオチド９３〜１１４に及んでおり、ＴＲＣ３及びＴＲＣ４と呼ばれる２つの認識半部位を含む。ＴＲＣ７−８認識配列（配列番号５）は、ヒトＴ細胞アルファ定常領域（配列番号１）のヌクレオチド１１８〜１３９に及んでおり、ＴＲＣ７及びＴＲＣ８と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｂ）本発明の組換えメガヌクレアーゼは、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットが第１の認識半部位（例えばＴＲＣ１、ＴＲＣ３、又はＴＲＣ７）に結合し、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットが第２の認識半部位（例えば、ＴＲＣ２、ＴＲＣ４、又はＴＲＣ８）二結合する、２つのサブユニットを含む。組換えメガヌクレアーゼが単鎖メガヌクレアーゼである実施形態において、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置することができる。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置することができる。

【図2A-2B】ＴＲＣ１結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。図２Ａ〜図２Ｂは本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号３の９塩基対のＴＲＣ１認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。アミノ酸配列アライメントは、配列番号８〜２７に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ１結合サブユニット（配列番号３３〜５２）について提供される。示されるように、配列番号８〜１８のＴＲＣ１結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含み、配列番号１９〜２７のＴＲＣ１結合サブユニットは残基７〜１５３を含む。各ＴＲＣ１結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされており、各位置で最も頻度の高いアミノ酸は、最も一般的な残基は太字で、２番目に多いものは太字かつイタリック体で更に強調されている。超可変領域外の残基は、８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号明細書を参照されたい）。図２に提供される全てのＴＲＣ１結合サブユニットは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ（配列番号３３）のＴＲＣ１結合サブユニット（残基１９８〜３４４）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示した残基番号は、配列番号８〜２７の残基番号である。

【図3A-3B】ＴＲＣ２結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。図３Ａ〜図３Ｂは本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号３の９塩基対のＴＲＣ２認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号８〜２７に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ２結合サブユニット（配列番号５８〜７７）についてのアミノ酸配列アライメントが提供される。示されるように、配列番号８〜１８のＴＲＣ２結合サブユニットは残基７〜１５３を含み、配列番号１９〜２７のＴＲＣ２結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含む。各ＴＲＣ２結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされており、各位置で最も頻度の高いアミノ酸は、最も一般的な残基は太字で、２番目に多いものは太字且つイタリック体でさらに強調されている。超可変領域外の残基は、８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）、並びにメガヌクレアーゼＴＲＣ１−２ｘ．８７ ＥＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７、及びＴＲＣ１−２ｘ．１６３の１３９位のＲ残基（灰色の網掛け及び下線）を除いて、各サブユニットにおいて同一である。図３に提供される全てのＴＲＣ２結合サブユニットは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ（配列番号５８）のＴＲＣ２結合サブユニット（残基７〜１５３）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示した残基番号は、配列番号８〜２７の残基番号である。

【図4】ＴＲＣ３結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号４の９塩基対のＴＲＣ３認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号２８及び２９に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ３結合サブユニット（配列番号５３及び５４）についてのアミノ酸配列アラインメントが提供される。示されるように、配列番号２８及び２９のＴＲＣ３結合サブユニットは、残基７〜１５３を含む。各ＴＲＣ３結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされている。超可変領域外の残基は、８０位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。ＴＲＣ３−４ｘ．３及びＴＲＣ ３−４ｘ．１９メガヌクレアーゼのＴＲＣ３結合サブユニットは、９７％の配列同一性を共有する。示した残基番号は、配列番号２８及び２９の残基番号である。

【図5】ＴＲＣ４結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号４の９塩基対のＴＲＣ４認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号２８及び２９に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ４結合サブユニット（配列番号７８及び７９）についてのアミノ酸配列アラインメントが提供される。示されるように、配列番号２８及び２９のＴＲＣ４結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含む。各ＴＲＣ４結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされている。超可変領域外の残基は、８０位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。ＴＲＣ３−４ｘ．３及びＴＲＣ３−４ｘ．１９メガヌクレアーゼのＴＲＣ４結合サブユニットは、９７％の配列同一性を共有する。示した残基番号は、配列番号２８及び２９の残基番号である。

【図6A-6B】ＴＲＣ７結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。図６Ａ〜図６Ｂは本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号５の９塩基対のＴＲＣ７認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号３０〜３２に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ７結合サブユニット（配列番号５５〜５７）についてのアミノ酸配列アライメントが提供される。示されるように、配列番号３０のＴＲＣ７結合サブユニットは残基７〜１５３を含み、配列番号３１及び３２のＴＲＣ７結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含む。各ＴＲＣ７結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされており、各位置で最も頻度の高いアミノ酸は、最も一般的な残基は太字で、２番目に多いものは太字且つイタリック体で更に強調されている。超可変領域外の残基は、８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。図６で提供される全てのＴＲＣ７結合サブユニットは、ＴＲＣ ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼ（配列番号５５）のＴＲＣ７結合サブユニット（残基７−１５３）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示される残基番号は、配列番号３０〜３２の残基番号である。

【図7A-7B】ＴＲＣ８結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。図７Ａ〜図７Ｂは本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号５の９塩基対のＴＲＣ８認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号３０〜３２に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ８結合サブユニット（配列番号８０〜８２）についてのアミノ酸配列アライメントが提供される。示されるように、配列番号３０のＴＲＣ８結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含み、配列番号３１及び３２のＴＲＣ８結合サブユニットは残基７〜１５３を含む。各ＴＲＣ８結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされており、各位置で最も頻度の高いアミノ酸は、最も一般的な残基は太字で、２番目に多いものは太字且つイタリック体でさらに強調されている。超可変領域外の残基は、８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。図７で提供される全てのＴＲＣ８結合サブユニットは、ＴＲＣ ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼ（配列番号８０）のＴＲＣ８結合サブユニット（残基１９８〜３４４）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示される残基番号は、配列番号３０〜３２の残基番号である。

【図8】Ｔ細胞受容体アルファ定常領域（配列番号１）に見出される認識配列を標的とする組換えメガヌクレアーゼを評価するためのＣＨＯ細胞におけるレポーターアッセイの模式図である。本明細書中に記載の組換えメガヌクレアーゼのために、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定に組み込まれたＣＨＯ細胞株が作製された。レポーターカセットは、５’から３’の順序で、：ＳＶ４０初期プロモータ；ＧＦＰ遺伝子の５’の２／３；本発明の操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、ＴＲＣ１−２認識配列、ＴＲＣ３−４認識配列、又はＴＲＣ７−８認識配列）；ＣＨＯ−２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（ＷＯ／２０１２／１６７１９２）；及びＧＦＰ遺伝子の３’の２／３、で構成されていた。このカセットを安定にトランスフェクトされた細胞は、ＤＮＡ破壊誘発剤の不在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、それぞれのメガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって導入された。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかでＤＮＡ破壊が誘導された場合、ＧＦＰ遺伝子の重複領域は互いに組換えられて機能的ＧＦＰ遺伝子を生成する。次いで、ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージは、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的測定として、フローサイトメトリによって決定することができる。

【図9】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおいて、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域（配列番号１）中の認識配列を認識し、切断する組換えメガヌクレアーゼの効率を示す。配列番号８〜３２に示される組換えメガヌクレアーゼのそれぞれを、ＴＲＣ１−２認識配列（配列番号３）、ＴＲＣ３−４認識配列（配列番号４）、又はＴＲＣ７−８認識配列（配列番号５）を標的とするように操作し、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。示した結果は、ＴＲＣ標的認識配列またはＣＨＯ−２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を示す、各アッセイで観察されたＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを提供する。陰性対照（ＲＨＯ１−２ｂｓ）を各アッセイに更に含めた。図９Ａ〜図９ＣはＴＲＣ１−２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼ。図９ＤはＴＲＣ３−４認識配列を標的とするメガヌクレアーゼ。図９Ｅ〜図９ＦはＴＲＣ７−８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼ。図９Ｇは２７１位のＱがＥで置換された（ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥ）、８０位のＱがＥで（ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱ）、又は８０位のＱ及び２７１位のＱの両方がＥで置換された（ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ）ＴＲＣ１−２ｘ．８７メガヌクレアーゼの変異体。

【図10】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける組換えメガヌクレアーゼ有効性の時間経過を示す。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱ、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼを、メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをＣＨＯレポーター細胞に導入した１、４、６、８、及び１２日後に決定されたＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを用いてＣＨＯレポーターアッセイで評価した。

【図11】ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼのトランスフェクション後のＪｕｒｋａｔ細胞ゲノムＤＮＡの分析を示す。ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後に、ゲノムＤＮＡを回収し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを実施して、内因性ＴＲＣ１−２認識配列における遺伝子改変を推定した。

【図12】内因性ＴＲＣ１−２認識配列における遺伝子改変についての、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼ発現の用量応答を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞に、３μｇ又は１μｇいずれかの所与のＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼｍＲＮＡをトランスフェクトした。９６時間で、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを用いてゲノムＤＮＡを分析した。

【図13】ヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識配列の切断を示す。図１３ＡはＣＤ３^＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いでＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを電気穿孔した。トランスフェクション後３日目及び７日目にゲノムＤＮＡを回収し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを使用して分析した。図１３Ｂは内因性ＴＲＣ１−２認識配列の突然変異がＴ細胞受容体の表面発現を排除するのに十分であるかどうかを決定するために、抗ＣＤ３抗体を使用したフローサイトメトリによって細胞を分析した。トランスフェクション後３日目及び７日目に対照細胞（水をトランスフェクトした）及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥトランスフェクト細胞を分析し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞及びＣＤ３陰性Ｔ細胞のパーセンテージを決定した。

【図14】ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼの発現後のヒトＴ細胞中のＴＲＣ１−２認識配列で観察された代表的な核酸配列の欠失を示す。

【図15】組換えＡＡＶベクターの配列要素及び外因性核酸配列を内因性ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入するための操作されたヌクレアーゼと組み合わせたその使用を示す図である。

【図16】ＡＡＶ４０５ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。

【図17】ＡＡＶ４０６ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。

【図18】ＡＡＶ形質導入効率を向上させるための、メガヌクレアーゼｍＲＮＡトランスフェクションおよび組換えＡＡＶ形質導入のタイミングの決定を示す。ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、トランスフェクション後２、４、又は８時間に、細胞にＧＦＰをコードする組換えＡＡＶベクター（ＧＦＰ−ＡＡＶ）を形質導入した。Ｔ細胞を、形質導入の７２時間後に、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリによって分析し、形質導入効率を決定した。

【図19】組換えＡＡＶベクターを使用した外因性核酸配列の挿入についてのヒトＴ細胞の分析を示す。ＣＤ３^＋Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡをトランスフェクトし、続いて（トランスフェクション２時間後）ＡＡＶ４０５又はＡＡＶ４０６を形質導入した。形質導入のみの対照には（水を）擬似トランスフェクトし、ＡＡＶ４０５又はＡＡＶ４０６のいずれかを形質導入した。メガヌクレアーゼのみの対照にはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをトランスフェクトし、次いでトランスフェクションの２時間後に（水を）擬似形質導入した。ゲノムＤＮＡをＴ細胞から回収し、ＡＡＶベクター中の相同領域を超える配列を認識するプライマーを使用して、ＰＣＲによりＴＲＣ１−２遺伝子座を増幅させた。相同性領域の外側のＰＣＲプライマーは、ＡＡＶベクターからではなく、Ｔ細胞ゲノムの増幅のみを可能にした。ＰＣＲ産物を精製し、ＥａｇＩで消化した。次いで、ＰＣＲ産物を切断について分析した。

【図20】ＡＡＶ４０５を使用したヒトＴ細胞のＴＲＣ１−２認識配列へのＥａｇＩ挿入の特徴付けを示す。図２０Ａでは先の実験で生成した未消化ＰＣＲ産物をｐＣＲ−平滑ベクター（ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングした。コロニーＰＣＲを、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを使用して行い、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥおよびＡＡＶ４０５をトランスフェクトした細胞由来のＰＣＲ産物の一部をゲル電気泳動によって分析した。分析により、完全長ＰＣＲ産物（約１６００ｂｐ）、より小さいインサート、及び空のプラスミド（約３００ｂｐ）の混合物が示されている。図２０Ｂでは並行して、ＰＣＲ産物の別の部分をＥａｇＩで消化して、ＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたＥａｇＩ認識部位を含むクローンのパーセントを決定した。ＥａｇＩで切断されたＰＣＲ産物は、約７００および８００ｂｐの予想された断片を生成した。

【図21】ＡＡＶ４０６を使用したヒトＴ細胞のＴＲＣ１−２認識配列へのＥａｇＩ挿入の特徴付けを示す。図２１Ａでは先の実験で生成した未消化ＰＣＲ産物をｐＣＲ−平滑ベクター（ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングした。コロニーＰＣＲを、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを使用して行い、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ及びＡＡＶ４０６をトランスフェクトした細胞由来のＰＣＲ産物の一部をゲル電気泳動によって分析した。分析により、完全長ＰＣＲ産物（約１６００ｂｐ）、より小さいインサート、及び空のプラスミド（約３００ｂｐ）の混合物が示されている。図２１Ｂでは並行して、ＰＣＲ産物の別の部分をＥａｇＩで消化して、ＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたＥａｇＩ認識部位を含むクローンのパーセントを決定した。ＥａｇＩで切断されたＰＣＲ産物は、約７００及び８００ｂｐの予想された断片を生成した。

【図22】図２２Ａは、ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼの発現後のヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識配列で観察された代表的な核酸配列の欠失及び挿入（即ち、インデル）を示す。図２２Ｂは、ＥａｇＩ制限部位を含む外因性核酸配列の挿入を確認するＴＲＣ１−２認識配列の核酸配列を示す。

【図23】組換えＡＡＶ形質導入効率の向上を示す図である。形質導入効率を、メガヌクレアーゼｍＲＮＡトランスフェクションのタイミング及びその後のＡＡＶ形質導入のタイミングを最適化することによってさらに分析した。トランスフェクション直後又はトランスフェクションの２時間後に、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、続いてＧＦＰ−ＡＡＶを形質導入した。更に、刺激されていない休止Ｔ細胞にＧＦＰ−ＡＡＶを形質導入した。擬似形質導入細胞も分析した。形質導入の７２時間後、細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリによって分析し、ＡＡＶ形質導入効率を決定した。

【図24】ＡＡＶ−ＣＡＲ１００（ＡＡＶ４０８）ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップである。

【図25】ＡＡＶ−ＣＡＲ７６３（ＡＡＶ４１２）ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップである。

【図26】ヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識部位でのキメラ抗原受容体コード配列の挿入を示す図である。ＡＡＶ４１２ ＨＤＲ鋳型がＴＲＣ１−２認識配列における二本鎖切断の修復に利用されたかどうかを決定するための、ＰＣＲに基づくアッセイを開発した。

【図27】ヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識部位でのキメラ抗原受容体コード配列の挿入を示す図である。ＡＡＶ４０８ＨＤＲ鋳型がＴＲＣ１−２認識配列における二本鎖切断の修復に利用されたかどうかを決定するための、ＰＣＲに基づくアッセイを開発した。図２７ＡはＣＡＲ遺伝子がその遺伝子座に挿入されている場合、ＴＲＣ１−２認識配列座の５’末端にのみ産物を増幅するプライマー対を使用して生成されたＰＣＲ産物を示す。図２７ＢはＣＡＲ遺伝子がその遺伝子座に挿入されている場合、ＴＲＣ１−２認識配列座の３’末端にのみ産物を増幅するプライマー対を用いて生成されたＰＣＲ産物を示す。

【図28】デジタルＰＣＲの図である。図２８ＡはヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識部位へのキメラ抗原受容体コード配列の挿入効率を定量的に決定するために開発されたデジタルＰＣＲアッセイの略図を示す。図２８ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼｍＲＮＡ及び／又は漸増量のＡＡＶ４０８を電気穿孔したヒトＴ細胞由来のゲノムＤＮＡについてのデジタルＰＣＲの結果を示す。

【図29】ヒトＴ細胞上のＣＤ１９キメラ抗原受容体の細胞表面発現の図である。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを、ＡＡＶ４０８をＨＤＲ鋳型として使用して、ＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入した細胞において決定した。細胞表面発現をフローサイトメトリによって分析した。図２９Ａ擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及び擬似電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入した細胞を示す。図２９ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入した細胞を示す。

【図30】ＡＡＶ４２１ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。

【図31】ＡＡＶ４２２ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。

【図32】キメラ抗原受容体コード配列の挿入を示す。ＰＣＲ法を使用して、ＡＡＶ４２１又はＡＡＶ４２２によって導入されたキメラ抗原受容体コード配列が、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼによって切断されたＴＲＣ１−２認識部位に挿入されたかどうかを決定した。図３２ＡはＡＡＶ４２１による形質導入後の挿入の分析を示す。図３２ＢはＡＡＶ４２２による形質導入後の挿入の分析を示す。

【図33】ヒトＴ細胞上のＣＤ１９キメラ抗原受容体の細胞表面発現を示す図である。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを、ＡＡＶ４２１をＨＤＲ鋳型として使用して、ＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入した細胞において決定した。細胞表面発現をフローサイトメトリによって分析した。図３３Ａは擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及び擬似電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２１を形質導入した細胞を示す。図３３ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２１を形質導入した細胞を示す。

【図34】細胞表面キメラ抗原受容体を発現するヒトＴ細胞の増殖を示す図である。いくつかの方法により、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのためのｍＲＮＡの電気穿孔及びＡＡＶ４２１の形質導入後に、ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋Ｔ細胞集団の優先的な拡大及び濃縮を決定した。図３４ＡはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添を示す。図３４ＢはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添、並びにマイトマイシンＣにより不活性化されたＩＭ−９細胞とのインキュベーションを示す。図３４ＣはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添、並びにマイトマイシンＣにより不活性化されたＩＭ−９細胞との２回のインキュベーションを示す。

【図35】ヒトＴ細胞上のＣＤ１９キメラ抗原受容体の細胞表面発現を示す図である。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを、ＡＡＶ４２２をＨＤＲ鋳型として使用して、ＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入した細胞において決定した。細胞表面発現をフローサイトメトリによって分析した。図３５Ａは擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及び擬似電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入した細胞を示す。図３５ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入した細胞を示す。

【図36】細胞表面キメラ抗原受容体を発現するヒトＴ細胞の増殖を示す図である。いくつかの方法により、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのためのｍＲＮＡの電気穿孔及びＡＡＶ４２２の形質導入後に、ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋Ｔ細胞集団の優先的な拡大及び濃縮を決定した。図３６ＡはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添を示す。図３６ＢはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添、並びにマイトマイシンＣにより不活性化されたＩＭ−９細胞とのインキュベーションを示す。図３６ＣはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添、並びにマイトマイシンＣにより不活性化されたＩＭ−９細胞との２回のインキュベーションを示す。

【図37】一本鎖ＡＡＶを使用したメガヌクレアーゼノックアウト効率を示す図である。実験は、一本鎖ＡＡＶベクターを同時に形質導入した場合のヒトＴ細胞における２つのメガヌクレアーゼのノックアウト効率を調べるために行った。図３７ＡはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのためのｍＲＮＡを電気穿孔し、漸増量の一本鎖ＡＡＶ４１２を形質導入した細胞を示す。図３７Ｂはベータ−２ミクログロブリン遺伝子を標的とするメガヌクレアーゼのためのｍＲＮＡを電気穿孔し、漸増量の一本鎖ＡＡＶ４１２を形質導入した細胞を示す。図３７ＣはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのためのｍＲＮＡを電気穿孔し、漸増量の一本鎖ＡＡＶ４２２を形質導入した細胞を示す。

【図38】抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の機能活性を示す図である。図３８ＡはＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞又はＣＤ１９−Ｕ９３７細胞のいずれかを標的集団とするＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。図３８Ｂはルシフェラーゼ標識ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞を標的とする細胞死滅アッセイを示す。

【図39】線形化ＤＮＡドナー鋳型の形質導入後の、キメラ抗原受容体の発現を示す図である。これらの実験は、ＴＲＣ１−２認識配列座に相同な相同アーム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ）に隣接する抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子を含むプラスミドを生成した。いくつかのプラスミドにおいて異なるプロモータが使用され、相同アームは「短い」（５’相同アームで２００ｂｐ及び３’相同アームで１８０ｂｐ）か、又は「長い」（５’相同アームで９８５ｂｐ及び３’相同アーム上で７６３ｂｐ）化のいずれかであった。ＣＡＲドナープラスミドをベクター骨格中の制限部位で線形化し、ゲル精製した。図３９ＡはバックグラウンドＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋染色を示す。図３９ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡ単独を電気穿孔した細胞を示す。図３９ＣはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡと、ＥＦ１αコアプロモータ及びＨＴＬＶエンハンサーを有する長い相同アームベクターとを共電気穿孔した細胞を示す。図３９ＤはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡと、ＥＦ１αコアプロモータ（エンハンサーなし）とを有する短い相同アームベクターを共電気穿孔した細胞を示す。図３９ＥはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡの不在下でＥＦ１αコアプロモータ及びＨＴＬＶエンハンサーを有する長い相同アームベクターを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＦはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡの不在下でＥＦ１αコアプロモータを有する（エンハンサーなし）短い相同アームベクターを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＧはＣＡＲ遺伝子の５’末端にＣＡＲの発現を駆動するＭＮＤプロモータ及びイントロンを含む長い相同アーム構築物と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＨはＣＡＲの発現を駆動するＭＮＤプロモータ含み、イントロンを含まない長い相同アーム構築物と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＩはＭＮＤプロモータを含み、イントロンを含まない短い相同アームプラスミドと、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＪはＣＡＲ遺伝子の５’末端にＣＡＲの発現を駆動するＭＮＤプロモータ及びイントロンを含む長い相同アーム構築物を電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは電子穿孔されなかった細胞を示す。図３９ＫはＣＡＲの発現を駆動するＭＮＤプロモータ含み、イントロンを含まない長い相同アーム構築物を電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは電気穿孔しなかった細胞を示す。図３９ＬはＭＮＤプロモータを含み、イントロンを含まない短い相同アームプラスミドを電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは電気穿孔しなかった細胞を示す。図３９ＭはＪｅＴプロモータを含んだ短い相同アーム構築物と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＮはＣＭＶプロモータを含んだ長い相同アーム構築物と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＯはＪｅＴプロモータを含んだ短い相同アーム構築物を電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは電気穿孔しなかった細胞を示す。図３９ＰはＣＭＶプロモータを含んだ長い相同アーム構築物を電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは電気穿孔しなかった細胞を示す。

【図40】線形化されたＤＮＡ構築物によって送達されたキメラ抗原受容体コード領域が、ヒトＴ細胞においてＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたかどうかを決定するためのＰＣＲ分析の図である。

【図41】ＡＡＶ４２３ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。

【図42】ヒトＴ細胞上のＣＤ１９キメラ抗原受容体の細胞表面発現を示す図である。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを、ＡＡＶ４２３をＨＤＲ鋳型として使用して、ＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入した細胞において決定した。細胞表面発現をフローサイトメトリによって分析した。図４２Ａ擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及び擬似電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した細胞を示す。図４２ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した細胞を示す。

【図43】キメラ抗原受容体コード配列の挿入を示す図である。ＰＣＲ法を使用して、ＡＡＶ４２３によって導入されたキメラ抗原受容体コード配列が、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼによって切断されたＴＲＣ１−２認識部位に挿入されたかどうかを決定した。

【図44】抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の表現型分析を示す。図４４Ａでは活性化Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡで電気穿孔し、次にＪｅＴプロモータにより駆動され、相同アームに隣接する抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現カセットを含むＡＡＶ６ベクターを形質導入した。ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）と共に５日間培養した後、フローサイトメトリによって細胞表面ＣＤ３及び抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現について細胞を分析した。図４４Ｂでは抗ＣＤ３磁気ビーズを用いてＣＤ３^＋細胞を枯渇させることによりＣＤ３⁻細胞を濃縮した。次いで、枯渇させた細胞をＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ）中で３日間培養し、ＣＤ３及び抗ＣＤ１９ＣＡＲの細胞表面発現について再分析した。Ｃ）ＣＤ３⁻ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の精製された集団をフローサイトメトリによって分析し、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋である細胞のパーセンテージを決定した。図４４ＤではＣＤ３⁻ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の精製された集団を、フローサイトメトリによってさらに分析し、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯを染色することによってそれらがセントラルメモリーＴ細胞、移行性メモリーＴ細胞、又はエフェクターメモリーＴ細胞であるかどうかを決定した。

【図45】Ｒａｊｉ播種性リンパ腫モデルを示す。ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）^４４を安定に発現するＲａｊｉ細胞を、２．０×１０^５細胞／マウスの用量で、１日目に５〜６週齢の雌ＮＳＧマウスに静脈注射した。４日目に、ＰＢＳ、又は同じ健康なドナーＰＢＭＣから調製された遺伝子編集された対照ＴＣＲ ＫＯ Ｔ細胞を含有するＰＢＳ、又は同じドナーから調製されたＣＡＲ Ｔ細胞の表示の用量を含有するＰＢＳを、マウスにｉ．ｖ．注射した。表示の日に、生存マウスにルシフェリン基質（１５０ｍｇ／ｋｇ生理食塩水）を腹腔内注射し、麻酔し、７分後に「ＩＶＩＳ ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ」（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア４．５．１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してデータを分析し、エクスポートした。発光信号強度は、ｐ／秒／ｃｍ^２／ｓｒの輝度で表される。

【0082】

配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ番号２８７５５）のヌクレオチド配列を示す。

【0083】

配列番号２は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域によってコードされるアミノ酸配列を示す。

【0084】

配列番号３は、ＴＲＣ１−２認識配列のアミノ酸配列を示す。

【0085】

配列番号４は、ＴＲＣ３−４認識配列のヌクレオチド配列を示す。

【0086】

配列番号５は、ＴＲＣ７−８認識配列のヌクレオチド配列を示す。

【0087】

配列番号６は、Ｉ−ＣｒｅＩのアミノ酸配列を示す。

【0088】

配列番号７は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのアミノ酸配列を示す。

【0089】

配列番号８は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0090】

配列番号９は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0091】

配列番号１０は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0092】

配列番号１１は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0093】

配列番号１２は、ＴＲＣ１−２ｘ．６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0094】

配列番号１３は、ＴＲＣ１−２ｘ．２０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0095】

配列番号１４は、ＴＲＣ１−２ｘ．５５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0096】

配列番号１５は、ＴＲＣ１−２ｘ．６０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0097】

配列番号１６は、ＴＲＣ１−２ｘ．１０５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0098】

配列番号１７はＴＲＣ１−２ｘ．１６３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0099】

配列番号１８は、ＴＲＣ１−２ｘ．１１３＿３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0100】

配列番号１９は、ＴＲＣ１−２ｘ．５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0101】

配列番号２０は、ＴＲＣ１−２ｘ．８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0102】

配列番号２１は、ＴＲＣ１−２ｘ．２５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0103】

配列番号２２は、ＴＲＣ１−２ｘ．７２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0104】

配列番号２３は、ＴＲＣ１−２ｘ．８０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0105】

配列番号２４は、ＴＲＣ１−２ｘ．８４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0106】

配列番号２５は、ＴＲＣ１−２ｘ．１２０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0107】

配列番号２６は、ＴＲＣ１−２ｘ．１１３＿１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0108】

配列番号２７は、ＴＲＣ１−２ｘ．１１３＿２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0109】

配列番号２８はＴＲＣ３−４ｘ．３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0110】

配列番号２９は、ＴＲＣ３−４ｘ．１９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0111】

配列番号３０は、ＴＲＣ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0112】

配列番号３１は、ＴＲＣ７−８ｘ．９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0113】

配列番号３２は、ＴＲＣ７−８ｘ．１４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0114】

配列番号３３は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0115】

配列番号３４は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥメガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0116】

配列番号３５は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱメガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0117】

配列番号３６は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0118】

配列番号３７は、ＴＲＣ１−２ｘ．６メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0119】

配列番号３８は、ＴＲＣ１−２ｘ．２０メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0120】

配列番号３９は、ＴＲＣ１−２ｘ．５５メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0121】

配列番号４０は、ＴＲＣ１−２ｘ．６０メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0122】

配列番号４１は、ＴＲＣ１−２ｘ．１０５メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0123】

配列番号４２は、ＴＲＣ１−２ｘ．１６３メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0124】

配列番号４３は、ＴＲＣ１−２ｘ．１１３＿３メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0125】

配列番号４４は、ＴＲＣ１−２ｘ．５メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0126】

配列番号４５は、ＴＲＣ１−２ｘ．８メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0127】

配列番号４６は、ＴＲＣ１−２ｘ．２５メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0128】

配列番号４７は、ＴＲＣ１−２ｘ．７２メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0129】

配列番号４８は、ＴＲＣ１−２ｘ．８０メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0130】

配列番号４９は、ＴＲＣ１−２ｘ．８４メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0131】

配列番号５０は、ＴＲＣ１−２ｘ．１２０メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0132】

配列番号５１は、ＴＲＣ１−２ｘ．１１３＿１メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0133】

配列番号５２は、ＴＲＣ１−２ｘ．１１３＿２メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0134】

配列番号５３は、ＴＲＣ３−４ｘ．３メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0135】

配列番号５４はＴＲＣ３−４ｘ．１９メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0136】

配列番号５５は、ＴＲＣ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0137】

配列番号５６はＴＲＣ７−８ｘ．９メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0138】

配列番号５７はＴＲＣ７−８ｘ．１４メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0139】

配列番号５８は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0140】

配列番号５９は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥメガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0141】

配列番号６０は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱメガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0142】

配列番号６１は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0143】

配列番号６２は、ＴＲＣ１−２ｘ．６メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0144】

配列番号６３は、ＴＲＣ１−２ｘ．２０メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0145】

配列番号６４は、ＴＲＣ１−２ｘ．５５メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0146】

配列番号６５は、ＴＲＣ１−２ｘ．６０メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0147】

配列番号６６は、ＴＲＣ１−２ｘ．１０５メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0148】

配列番号６７は、ＴＲＣ１−２ｘ．１６３メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0149】

配列番号６８は、ＴＲＣ１−２ｘ．１１３＿３メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0150】

配列番号６９は、ＴＲＣ１−２ｘ．５メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0151】

配列番号７０は、ＴＲＣ１−２ｘ．８メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0152】

配列番号７１はＴＲＣ１−２ｘ．２５メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0153】

配列番号７２は、ＴＲＣ１−２ｘ．７２メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0154】

配列番号７３は、ＴＲＣ１−２ｘ．８０メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0155】

配列番号７４は、ＴＲＣ１−２ｘ．８４メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0156】

配列番号７５は、ＴＲＣ１−２ｘ．１２０メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0157】

配列番号７６は、ＴＲＣ１−２ｘ．１１３＿１メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0158】

配列番号７７は、ＴＲＣ１−２ｘ．１１３＿２メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0159】

配列番号７８は、ＴＲＣ３−４ｘ．３メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0160】

配列番号７９は、ＴＲＣ３−４ｘ．１９メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0161】

配列番号８０は、ＴＲＣ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼの残基１９８〜３４４を示す。

【0162】

配列番号８１は、ＴＲＣ７−８ｘ．９メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0163】

配列番号８２は、ＴＲＣ７−８ｘ．１４メガヌクレアーゼの残基７〜１５３を示す。

【0164】

配列番号８３は、ＴＲＣ１−２認識配列のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を示す。

【0165】

配列番号８４は、ＴＲＣ３−４認識配列のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を示す。

【0166】

配列番号８５は、ＴＲＣ７−８認識配列のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を示す。

【0167】

配列番号８６は、配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0168】

配列番号８７は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0169】

配列番号８８は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0170】

配列番号８９は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0171】

配列番号９０は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0172】

配列番号９１は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0173】

配列番号９２は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0174】

配列番号９３は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0175】

配列番号９４は、切断に起因する挿入及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0176】

配列番号９５は、切断に起因する挿入及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0177】

配列番号９６は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0178】

配列番号９７は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0179】

配列番号９８は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0180】

配列番号９９は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0181】

配列番号１００は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0182】

配列番号１０１は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0183】

配列番号１０２は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0184】

配列番号１０３は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0185】

配列番号１０４は、切断に起因する欠失及びＮＨＥＪを含む配列番号１のヌクレオチド１６２〜２３３を示す。

【0186】

配列番号１０５は、配列番号１のヌクレオチド１８１〜２１４を示す。

【0187】

配列番号１０６は、相同組換えによって挿入された外因性核酸配列を含む配列番号１のヌクレオチド１８１〜２１４を示す。

【0188】

配列番号１０７は、ＡＡＶ４０５ベクターを作製するために使用されるプラスミドのヌクレオチド配列を示す。

【0189】

配列番号１０８は、ＡＡＶ４０６ベクターを作製するために使用されるプラスミドのヌクレオチド配列を示す。

【0190】

配列番号１０９は、ＡＡＶ−ＣＡＲ１００（ＡＡＶ４０８）ベクターを作製するために使用されるプラスミドのヌクレオチド配列を示す。

【0191】

配列番号１１０は、ＡＡＶ−ＣＡＲ７６３（ＡＡＶ４１２）ベクターを作製するために使用されるプラスミドのヌクレオチド配列を示す。

【0192】

配列番号１１１は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体のアミノ酸配列を示す。

【0193】

配列番号１１２は、抗ＣＤ１９細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列を示す。

【0194】

配列番号１１３は、キメラ抗原受容体細胞内細胞質シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を示す。

【0195】

配列番号１１４は、キメラ抗原受容体細胞内共刺激ドメインのアミノ酸配列を示す。

【0196】

配列番号１１５は、キメラ抗原受容体シグナルペプチドドメインのアミノ酸配列を示す。

【0197】

配列番号１１６は、キメラ抗原受容体ヒンジ領域のアミノ酸配列を示す。

【0198】

配列番号１１７は、キメラ抗原受容体膜貫通ドメインのアミノ酸配列を示す。

【0199】

配列番号１１８は、ＥＦ−１アルファコアプロモータのヌクレオチド配列を示す。

【0200】

配列番号１１９は、外因性ポリヌクレオチドインサートのヌクレオチド配列を示す。

【0201】

配列番号１２０は、ＴＲＣ１−２認識配列内に挿入された外因性核酸配列を含むヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

【0202】

配列番号１２１は、ＴＲＣ３−４認識配列内に挿入された外因性核酸配列を含むヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

【0203】

配列番号１２２は、ＴＲＣ７−８認識配列内に挿入された外因性核酸配列を含むヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

【0204】

配列番号１２３は、ＡＡＶ４２１ベクターを作製するために使用されるプラスミドの核酸配列を示す。

【0205】

配列番号１２４は、ＡＡＶ４２２ベクターを作製するために使用されるプラスミドの核酸配列を示す。

【0206】

配列番号１２５は、ＡＡＶ４２３ベクターを作製するために使用されるプラスミドの核酸配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0207】

１．１ 参照と定義
本明細書で言及する特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書に引用されるＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む、発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及び参考文献は、それぞれが具体的かつ個々に参照により組み込まれると示されると同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

【0208】

本発明は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されるものと解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧且つ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して図示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して図示された特徴は、その実施形態から削除することができる。更に、本明細書に示唆された実施形態に対する多くの変形および追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、これらは本発明から逸脱するものではない。

【0209】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明に使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定する意図のものではない。

【0210】

本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0211】

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、又は「この（ｔｈｅ）」は、１つ又は複数を意味することができる。例えば、「１つの（ａ）」細胞は単一の細胞又は多数の細胞を意味することができる。

【0212】

本明細書で使用されるように、特に他のことが示されない限り、「又は」という語は、「及び／又は」の包括的な意味で使用され、「どちらか／又は」の排他的な意味で使用されるものではない。

【0213】

本明細書で使用される用語「メガヌクレアーゼ」は、１２塩基対を超える認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。好ましくは、本発明のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩに由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えばＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、又は二量体化特性に関して天然Ｉ−ＣｒｅＩと比較して改変されたＩ−ＣｒｅＩの操作された変異体を指すことができる。Ｉ−ＣｒｅＩのこのような改変された変異体を作製するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として、又は一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを用いて単一のポリペプチドに連結された「単鎖メガヌクレアーゼ」として二本鎖ＤＮＡに結合する。用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、用語「メガヌクレアーゼ」と同義である。本発明のメガヌクレアーゼは、細胞、特にヒトＴ細胞において発現した場合実質的に非毒性であり、従って、本明細書に記載の方法を用いて測定した場合に、細胞生存率に対する有害効果またはメガヌクレアーゼ切断活性の有意な低下を観察することなく、細胞にトランスフェクトし、３７℃において維持することができる。

【0214】

本明細書で使用される場合、用語「単鎖メガヌクレアーゼ」は、リンカーによって連結された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニット−リンカー−Ｃ−末端サブユニットという構成を有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列が同一ではなく、同一ではないＤＮＡ配列を認識する。従って、単鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、偽パリンドローム又は非パリンドローム認識配列を切断する。単鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「単鎖ヘテロ二量体」又は「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、他に特定しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体又は単鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。

【0215】

本明細書で使用される、用語「リンカー」は、２つのメガヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然タンパク質に見出される配列を有してもよく、又は天然タンパク質には見出されない人工配列であってもよい。リンカーは可撓性で二次構造が欠如していてもよく、又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していてもよい。リンカーとしては、限定するものではないが、米国特許第８，４４５，２５１号に包含されるものを挙げることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号８〜３２のいずれか１つの残基１５４〜１９５を含むアミノ酸配列を有することができる。

【0216】

本明細書で使用される場合、用語「ＴＡＬＥＮ」は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの任意の部分に融合された１６〜２２個のＴＡＬドメイン反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。

【0217】

本明細書で使用される場合、「コンパクトＴＡＬＥＮ」という用語は、Ｉ−ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインの任意の触媒活性部分に任意の向きで融合された１６〜２２個のＴＡＬドメイン反復配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。

【0218】

本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、Ｃａｓ９等のカスパーゼと、ゲノムＤＮＡ中の認識部位にハイブリダイズすることによって、カスパーゼのＤＮＡ切断を誘導するガイドＲＮＡとを含む、カスパーゼに基づくエンドヌクレアーゼを指す。

【0219】

本明細書で使用される場合、用語「メガＴＡＬ」は、操作された配列特異的ホーミングエンドヌクレアーゼを有する活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む単鎖ヌクレアーゼを指す。

【0220】

タンパク質に関して本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、タンパク質をコードする核酸及び該タンパク質を発現する細胞又は生物に遺伝子操作技術を適用した結果として改変されたアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、用語「組換え」は、遺伝子操作技術を適用した結果として改変された核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作技術としては、限定するものではないが、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技術；トランスフェクション、形質転換、及び他の遺伝子移入技術；相同組換え；部位特異的突然変異誘発；並びに遺伝子融合が挙げられる。この定義に従って、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニング及び発現によって産生されるタンパク質は、組換え体とはみなされない。

【0221】

本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、同種の遺伝子の対立遺伝子集団における最も一般的な天然に存在する対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド配列）を指し、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドがその元の機能を有する。用語「野生型」は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドも指す。野生型対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド）及びポリペプチドは、野生型配列に対して１又は複数の突然変異及び／又は置換を含む突然変異体又は変異体の対立遺伝子及びポリペプチドとは区別される。野生型の対立遺伝子又はポリペプチドは、生物において正常な表現型を付与することができるが、突然変異体又は変異体の対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては、変化した表現型を付与し得る。野生型ヌクレアーゼは、組換え体又は非天然のヌクレアーゼとは区別される。

【0222】

組換えタンパク質に関して本明細書で使用される場合、用語「改変」は、参照配列（例えば、野生型又は天然の配列）と比較した組換え配列におけるアミノ酸残基の任意の挿入、欠失、又は置換を意味する。

【0223】

本明細書で使用される場合、用語「認識配列」は、エンドヌクレアーゼによって結合及び切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４つの塩基対によって分離された１対の逆位９塩基対「半部位」を含む。単鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１の半部位に接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２の半部位に接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３’「オーバーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「粘着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって生成され得る短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ−ＣｒｅＩに由来するメガヌクレアーゼ及び単鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対認識配列の塩基１０〜１３を含む。コンパクトＴＡＬＥＮの場合、認識配列は、Ｉ−ＴｅｖＩドメインによって認識される第１のＣＮＮＮＧＮ配列、続いて長さが４〜１６塩基対である非特異的スペーサ、続いてＴＡＬ−エフェクタードメインによって認識される長さ１６〜２２ｂｐの第２の配列である（この配列は、典型的には５’Ｔ塩基を有する）。コンパクトＴＡＬＥＮによる切断は、２塩基対の３’オーバーハングを生じる。ＣＲＩＳＰＲの場合、認識配列は、典型的には１６〜２４塩基対の配列であり、これにガイドＲＮＡが結合してＣａｓ９切断を誘導する。ＣＲＩＳＰＲによる切断は平滑末端を生成した。

【0224】

本明細書で使用される場合、用語「標的部位」又は「標的配列」は、ヌクレアーゼの認識配列を含む、細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。

【0225】

本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」は、メガヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列又は任意の配列）と非共有結合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋ_ｄによって測定される。本明細書中で使用される場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫ_ｄが、基準ヌクレアーゼと比較して統計的に有意なパーセント変化で増加または減少される場合、ヌクレアーゼは結合親和性を「変化」させている。

【0226】

本明細書で使用する場合、用語「相同組換え」又は「ＨＲ」は、修復鋳型として同種ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡ切断を修復する天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら、（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８〜１９７６）。相同なＤＮＡ配列は、細胞に送達された内因性染色体配列又は外因性核酸であり得る。

【0227】

本明細書中で使用される場合、用語「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」は、２本鎖ＤＮＡ切断が、２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接接合によって修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら、（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８〜１９７６を参照されたい）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復は誤りを起こしやすく、修復部位でのＤＮＡ配列の非鋳型付加又は欠失が頻繁に起こる。いくつかの例では、標的認識配列における切断は、標的認識部位においてＮＨＥＪを生じる。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断、続いてＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、フレームシフト突然変異等の遺伝子機能を破壊する突然変異をコード配列に導入する可能性がある。従って、細胞集団において遺伝子を効果的にノックアウトするために、操作されたヌクレアーゼを使用することができる。

【0228】

本明細書で使用する場合、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞（例えば、ヒトＴ細胞）上に抗原に対する特異性を付与又は移植する操作された受容体を指す。キメラ抗原受容体は、典型的には、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分、及びＴ細胞活性化に必要なシグナルを伝達する１又は複数の刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分は、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態であってよく、これらは、特定のエピトープ又は抗原（例えば、癌細胞又は他の疾患を引き起こす細胞又は粒子の表面に優先的存在するにエピトープ又は抗原）に対する特異性を提供する。細胞外リガンド結合ドメインは、任意の目的の抗原又はエピトープに特異的であり得る。特定の実施形態において、リガンド結合ドメインはＣＤ１９に特異的である。

【0229】

キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識され得る、従って、抗体媒介性自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的として、殺傷するようにＴ細胞を導く自己抗原を含む（Ｐａｙｎｅら、（２０１６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（６２９５）：１７９〜１８４を参照されたい）。このようなＣＡＲは、キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ばれ、その使用は本発明に包含される。

【0230】

ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して結合することができる。細胞内刺激ドメインは、抗原結合後に免疫エフェクター細胞に活性化シグナルを伝達する１又は複数の細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。このような細胞質シグナル伝達ドメインは、限定するものではないが、ＣＤ３−ゼータを含む。細胞内刺激ドメインはまた、リガンド結合後に増殖性及び／又は細胞生存シグナルを伝達する１又は複数の細胞内共刺激ドメインを含み得る。このような細胞内共刺激ドメインとしては、限定するものではないが、ＣＤ２８ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＯＸ４０ドメイン、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。キメラ抗原受容体は、ヒンジ又はスペーサ配列を介して細胞外リガンド結合ドメインに結合した膜貫通ドメインを含む、追加の構造要素を更に含むことができる。

【0231】

本明細書で使用する場合、「外因性Ｔ細胞受容体」又は「外因性ＴＣＲ」とは、ＴＣＲを内因性に発現してもしなくてもよい免疫エフェクター細胞（例えば、ヒトＴ細胞）のゲノムにその配列が導入されるＴＣＲを指す。免疫エフェクター細胞上の外因性ＴＣＲの発現は、特定のエピトープ又は抗原（例えば、癌細胞又は他の疾患を引き起こす細胞又は粒子の表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原）に対する特異性を付与することができる。このような外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ及びベータ鎖を含むことができ、又はガンマ及びデルタ鎖を含むことができる。本発明において有用な外因性ＴＣＲは、任意の抗原又は目的のエピトープに対して特異性を有し得る。

【0232】

本明細書で使用される場合、用語「発現低下」は、対照細胞と比較した場合、遺伝子改変細胞の細胞表面における内因性Ｔ細胞受容体の発現の任意の低下を指す。低下という用語はまた、対照細胞の集団と比較した場合、細胞表面で内因性ポリペプチド（即ち、内因性Ｔ細胞受容体）を発現する、細胞集団中の細胞のパーセンテージの低下を指すことができる。このような低下は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％まで、又は最大１００％であり得る。従って、用語「低下」は、内因性Ｔ細胞受容体の部分ノックダウン及び完全ノックダウンの両方を包含する。

【0233】

アミノ酸配列及び核酸配列の両方に関して本明細書で使用される場合、用語「同一性パーセント」、「配列同一性」、「類似性パーセンテージ」、「配列類似性」等は、アライメントしたアミノ酸残基又はヌクレオチドの間の類似性を最大にする、同一又は類似の残基又はヌクレオチドの数、総残基又はヌクレオチドの数及び配列アライメント中のギャップの存在及び長さの関数である、配列のアライメントに基づく２つの配列の類似性の程度の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するための様々なアルゴリズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書中で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴｐプログラム及び核酸配列についてはＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これらは両方ともＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して利用可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｇｉｓｈ及びＳｔａｔｅｓ（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６〜２７２；Ｍａｄｄｅｎら、（１９９６）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１〜１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２）；Ｚｈａｎｇら、（２０００）、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１−２）：２０３〜１４に記載されている。本明細書中で使用される場合、２つのアミノ酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝３；ギャップ開始ペナルティ＝−１１；ギャップ伸長ペナルティ＝−１；及びスコア行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２。本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝１１；ギャップ開始ペナルティ＝−５；ギャップ伸長ペナルティ＝−２；マッチ報酬＝１；ミスマッチペナルティ＝−３。

【0234】

２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関して本明細書で使用される場合、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における改変と同じアミノ酸残基の置換であり、２つのタンパク質が標準配列アラインメント（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて）に供される場合に、第１のタンパク質における改変のアミノ酸位が、第２のタンパク質における改変のアミノ酸位に対応するか、又は整列することを示すために「対応する」という用語が使用される。従って、残基Ｘ及びＹが配列アライメントにおいて互いに対応する場合、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への改変に対応し、Ｘ及びＹが実際には異なる数であってもよい。

【0235】

本明細書で使用される場合、用語「認識半部位」、「認識配列半部位」、又は単に「半部位」は、ホモ二量体又はヘテロ二量体メガヌクレアーゼの単量体によって、あるいは単鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識される、二本鎖ＤＮＡ分子中の核酸配列を意味する。

【0236】

本明細書中で使用される場合、用語「超可変領域」は、比較的高い可変性を有するアミノ酸を含むメガヌクレアーゼ単量体又はサブユニット内の局在化配列を指す。超可変領域は、約５０〜６０個の連続残基、約５３〜５７個の連続残基、又は好ましくは約５６個の残基を含むことができる。いくつかの実施形態において、超可変領域の残基は、配列番号８〜３２のいずれか１つの２４〜７９位又は２１５〜２７０位に対応し得る。超可変領域は、認識配列中のＤＮＡ塩基と接触する１又は複数の残基を含むことができ、単量体又はサブユニットの塩基選択を変更するように改変することができる。超可変領域はまた、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と結合する場合、ＤＮＡ骨格に結合する１又は複数の残基を含むことができる。このような残基は、ＤＮＡ骨格及び標的認識配列に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変化させるように改変することができる。本発明の異なる実施形態において、超可変領域は、可変性を示す１〜２０の間の残基を含むことができ、塩基選択及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる。特定の実施形態において、超可変領域は、可変性を示す約１５〜１８の間の残基を含み、塩基選択及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように修飾することができる。いくつかの実施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号８〜３２のいずれか１つの２４、２６、２８、２９、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６６、６８、７０、７２、７３、７５、及び７７位の１又は複数に対応する。他の実施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号８〜３２のいずれか１つの２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２４８、２５７、２５９、２６１、２６３、２６４、２６６、及び２６８位の１又は複数に対応する。

【0237】

本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子」及び「ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子」は互換的に使用され、ＮＣＢＩ ＧｅｎＩＤ ＮＯ．２８７５５（配列番号１）によって同定されるヒト遺伝子を指す。

【0238】

用語「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えＤＮＡ断片」は、本明細書において互換的に使用され、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドである。組換え構築物は、限定するものではないが、天然に一緒には見出されない調節及びコード配列を含む、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドの人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し、天然に見出されるものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列を含み得る。このような構築物は、単独で使用してもよく、又はベクターと組み合わせて使用してもよい。

【0239】

本明細書中で使用される場合、「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、所定の宿主細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳が可能な複製系及び配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知の宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターとしては、限定するものではないが、プラスミドベクター及び組換えＡＡＶベクター、又は本発明のメガヌクレアーゼをコードする遺伝子を標的細胞に送達するために適切な当技術分野で公知の任意の他のベクターを挙げることができる。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択、及び増殖させるために、ベクター上に存在しなければならない遺伝的要素を十分に認識している。

【0240】

本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、ウイルスベクターを指すこともできる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を挙げることができる。

【0241】

本明細書で使用する場合、「ポリシストロニック」ｍＲＮＡは、２つ以上のコード配列（即ち、シストロン）を含み、２つ以上のタンパク質をコードする単一のメッセンジャーＲＮＡを指す。ポリシストロニックｍＲＮＡは、限定するものではないが、ＩＲＥＳ要素、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、及びＦ２Ａ要素を含む、同じｍＲＮＡ分子由来の２つ以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要素を含むことができる。

【0242】

本明細書中で使用される場合、「ヒトＴ細胞」又は「Ｔ細胞」は、ヒトドナーから単離されたＴ細胞を指す。ヒトＴ細胞及びそれに由来する細胞には、継代培養されていない単離されたＴ細胞、不死化のない細胞培養条件下で継代及び維持されたＴ細胞、並びに不死化され、細胞培養下で無期限に維持され得るＴ細胞が含まれる。

【0243】

本明細書で使用する場合、「対照」又は「対照細胞」は、遺伝子改変細胞の遺伝子型又は表現型における変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば：（ａ）野生型細胞、即ち、遺伝子改変細胞を生じた遺伝子改変のための出発物質と同じ遺伝子型の細胞；（ｂ）遺伝子改変された細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌル構築物で形質転換された（即ち、目的の形質に対して公知の効果を有さない構築物を有する）細胞；（ｃ）遺伝子改変された細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型又は表現型の発現を誘導する条件又は刺激、あるいは更なる遺伝子改変に曝されない細胞を含むことができる。

【0244】

本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、本発明が、その範囲内の値のいずれかに等しい変数で実施され得ることを伝える意図のものである。従って、本質的に離散的な変数の場合、この変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続する変数の場合、この変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実数値と等しくなり得る。一例として、限定するものではないが、０から２の間の値を有すると記載された変数は、変数が本質的に離散的である場合、０、１、又は２の値を取ることができ、変数が本質的に連続的である場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１、又はであれば、≧０且つ≦２の任意の他の実数値を取ることができる。

【0245】

２．１ 本発明の原理
本発明は、切断部位におけるＮＨＥＪが、ＴＣＲアルファ鎖サブユニットの発現及び最終的に細胞表面でのＴ細胞受容体の発現を破壊するように、操作されたヌクレアーゼを、ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子（配列番号１）に見出される認識配列の認識及び切断に利用できるという発見に部分的に基づいている。更に、本発明によれば、外因性ポリヌクレオチド配列は、例えば相同組換えによって、目的の配列が細胞内で同時に発現されるようにヌクレアーゼ切断部位においてＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入される。このような外因性配列は、例えば、キメラ抗原受容体、外因性ＴＣＲ受容体、又は任意の他の目的のポリペプチドをコードすることができる。

【0246】

従って、本発明は、単一の操作されたヌクレアーゼで単一の認識部位を標的化することにより、内因性Ｔ細胞受容体のノックアウトと外因性核酸配列（例えば、キメラ抗原受容体又は外因性ＴＣＲ）の発現との両方を可能にする。キメラ抗原受容体をコードする配列がＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入される特定の実施形態において、本発明は、抗原特異的ＣＡＲを発現し、内因性ＴＣＲの発現を低下又は完全にノックアウトさせる同種異系Ｔ細胞を作製する単純化された方法を提供する。このような細胞は、同種異系の対象に投与された場合、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の誘導の減少を示し得るか、又は誘導し得ない。

【0247】

２．２ Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子内の認識配列を認識及び切断するためのヌクレアーゼ
生存細胞のゲノム中でＤＮＡ切断を行うために部位特異的ヌクレアーゼを使用することが可能であり、このようなＤＮＡ切断は突然変異誘発性ＮＨＥＪ修復を介して、又はトランスジェニックＤＮＡ配列との相同組換えを介してゲノムの永続的改変をもたらし得ることが、当技術分野では公知である。ＮＨＥＪは切断部位で突然変異誘発を生じ、対立遺伝子の不活性化を引き起こす。ＮＨＥＪ関連突然変異誘発は、初期停止コドンの生成、異常な非機能性タンパク質を生成するフレームシフト突然変異、を介して対立遺伝子を不活性化する可能性があり、あるいはナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解等の機序を引き起こす可能性がある。ＮＨＥＪを介した突然変異誘発を誘導するヌクレアーゼの使用は、特定の突然変異又は野生型対立遺伝子中に存在する配列を標的化するために使用することができる。標的遺伝子座における二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的と相同である配列に隣接するトランスジェニックＤＮＡ配列の相同組換えを刺激することが公知である。このようにして、外因性核酸配列を標的座に挿入することができる。このような外因性核酸は、例えば、キメラ抗原受容体、外因性ＴＣＲ、又は目的の任意の配列若しくはポリペプチドをコードすることができる。

【0248】

異なる実施形態において、様々な異なるタイプのヌクレアーゼが本発明の実施に有用である。一実施形態において、本発明は組換えメガヌクレアーゼを使用して実施することができる。別の実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ Ｎｉｃｋａｓｅを用いて実施することができる。所定のＤＮＡ部位を認識するＣＲＩＳＰＲ及びＣＲＩＳＰＲ Ｎｉｃｋａｓｅを生成するための方法予は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｒａｎ、ら、（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１〜３０８を参照されたい。別の実施形態において、本発明は、ＴＡＬＥＮ又はコンパクトＴＡＬＥＮを使用して実施することができる。所定のＤＮＡ部位に結合するＴＡＬＥドメインを作製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｙｏｎら、（２０１２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：４６０〜５を参照されたい。更なる実施形態において、本発明はメガＴＡＬを使用して実施することができる。

【0249】

好ましい実施形態において、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼである。単鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニット及びリンカーペプチドによって連結されたＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインのそれぞれは、認識配列の半分（即ち、認識半部位）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニットの接合点付近の認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が４塩基対の３’一本鎖オーバーハングの対を生成するように、４塩基対によって相殺される。

【0250】

いくつかの実施例において、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１−２認識配列（配列番号３）を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼは、本明細書では総称して「ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼは、配列番号８〜２７で提供される。

【0251】

更なる実施例において、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、ＴＲＣ３−４認識配列（配列番号４）を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼは、本明細書では総称して「ＴＲＣ３−４メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＴＲＣ３−４メガヌクレアーゼは、配列番号２８及び２９で提供される。

【0252】

更なる実施例において、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、ＴＲＣ７−８認識配列（配列番号５）を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼは、本明細書では総称して「ＴＲＣ７−８メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＴＲＣ７−８メガヌクレアーゼは、配列番号３０〜３２で提供される。

【0253】

本発明の組換えメガヌクレアーゼは、第１の超可変領域（ＨＶＲ１）領域を含む第１のサブユニットと、第２の超可変領域（ＨＶＲ２）を含む第２のサブユニットとを含む。更に、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識半部位（例えばＴＲＣ１、ＴＲＣ３、又はＴＲＣ７半部位）に結合し、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識半部位（例えば、ＴＲＣ２、ＴＲＣ４、又はＴＲＣ８半部位）に結合する。組換えメガヌクレアーゼが単鎖メガヌクレアーゼである実施形態において、ＨＶＲ１領域を含み、第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２領域を含み、第２の半分部位に結合する第２のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置されるように第１及び第２のサブユニットを配向させることができる。別の実施形態において、ＨＶＲ１領域を含み、第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２領域を含み、第２の半分部位に結合する第２のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置されるように第１及び第２のサブユニットを配向させることができる。本発明の例示的なＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼを表１に示す。本発明の例示的なＴＲＣ３−４メガヌクレアーゼを表２に示す。本発明の例示的なＴＲＣ７−８メガヌクレアーゼを表３に示す。

【0254】

表１．ＴＲＣ１−２認識配列（配列番号３）を認識及び切断するように操作された例示的組換えメガヌクレアーゼ

【表1】

【0255】

^＊「ＴＲＣ１サブユニット％」及び「ＴＲＣ２サブユニット％」は、それぞれ、各メガヌクレアーゼのＴＲＣ１結合及びＴＲＣ２結合サブユニット領域と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのＴＲＣ１結合及びＴＲＣ２結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。

【0256】

表２．ＴＲＣ３−４認識配列（配列番号４）を認識及び切断するように操作された例示的組換えメガヌクレアーゼ

【表2】

【0257】

*「ＴＲＣ３サブユニット％」及び「ＴＲＣ４サブユニット％」は、それぞれ、各メガヌクレアーゼのＴＲＣ３結合及びＴＲＣ４結合サブユニット領域と、ＴＲＣ３−４ｘ．３メガヌクレアーゼのＴＲＣ３結合及びＴＲＣ４結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。

【0258】

表３．ＴＲＣ７−８認識配列（配列番号５）を認識及び切断するように操作された例示的組換えメガヌクレアーゼ

【表3】

【0259】

＊「ＴＲＣ７サブユニット％」及び「ＴＲＣ８サブユニット％」は、それぞれ、各メガヌクレアーゼのＴＲＣ７結合及びＴＲＣ８結合サブユニット領域と、ＴＲＣ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼのＴＲＣ７結合及びＴＲＣ８結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。

【0260】

２．３ 遺伝子改変細胞の作製方法
本発明は、ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常領域遺伝子（配列番号１）内に見出される認識配列を認識及び切断する操作されたヌクレアーゼを使用して、遺伝子改変細胞を作製する方法を提供する。このような認識配列における切断は、切断部位におけるＮＨＥＪを可能にし、ヒトＴ細胞受容体アルファ鎖サブユニットの発現を破壊し、細胞表面でのＴ細胞受容体の発現及び／又はまたは機能の低下をもたらす。更に、このような認識配列における切断は、外因性核酸配列のＴＣＲアルファ定常領域遺伝子への直接相同組換えを更に可能にすることができる。

【0261】

本発明の操作されたヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又は好ましくは、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に送達され得る。このような核酸は、ＤＮＡ（例えば、環状または線形化プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）又はＲＮＡであり得る。操作されたヌクレアーゼコード配列がＤＮＡ形態で送達される実施形態に関しては、メガヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに動作可能に連結されなければならない。本発明に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎら、（１９８４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（３）：６５９〜６３）又はＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４〜１０）等の構成的プロモータ、並びにテトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎら、（１９９２）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８〜４５）等の誘導性プロモータが挙げられる。

【0262】

いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる可能性を低減するため、細胞に送達される。操作されたヌクレアーゼをコードするこのようなｍＲＮＡは、インビトロ転写のような当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、７−メチル−グアノシンを用いてキャップされる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはポリアデニル化されていてもよい。

【0263】

特定の実施形態において、本発明の操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、細胞内で同時に発現される２つ以上のヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡであり得る。ポリシストロニックｍＲＮＡは、同じ標的遺伝子中の異なる認識配列を標的とする、本発明の２つ以上のヌクレアーゼをコードすることができる。あるいは、ポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記載の少なくとも１つのヌクレアーゼと、同じ遺伝子に位置する別個の認識配列を標的とするか、又は切断部位が両方の遺伝子において生成されるように第２の遺伝子に位置する第２の認識配列を標的とする少なくとも１つの更なるヌクレアーゼとをコードすることができる。ポリシストロニックｍＲＮＡは、限定するものではないが、ＩＲＥＳ要素、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、及びＦ２Ａ要素を含む、同じｍＲＮＡ分子由来の２つ以上の遺伝子（即ち、シストロン）の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要素を含むことができる。

【0264】

精製されたヌクレアーゼタンパク質を細胞に送達してゲノムＤＮＡを切断することができ、このことにより、当技術分野で公知の様々な異なる機序によって、目的の配列を有する切断部位での相同組換え又は非相同末端結合が可能になる。

【0265】

いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞透過性ペプチド又は標的リガンドに結合され、細胞取り込みを促進する。当技術分野で公知の細胞透過性ペプチドの例としては、ポリ−アルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎら、（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４〜９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚら、（２００５）、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９〜７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉら、（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７〜２７２４）、Ｐｅｐ−１（Ｄｅｓｈａｙｅｓら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：７６９８〜７７０６）、及びＨＳＶ−１ ＶＰ−２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓら、（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９〜４９）が挙げられる。別の実施形態において、操作されたヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、該ヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、それによって内在化されるように、標的細胞上に発現される特異的細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合又は非共有結合される。あるいは、操作されたヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、このような細胞表面受容体に対する天然リガンド（又は天然リガンドの一部）に共有結合又は非共有結合され得る。（ＭｃＣａｌｌら、（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａら、（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４〜７４；Ｋａｎｇら、（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０〜３０；Ｑｉａｎら、（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１〜５０８）。

【0266】

いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して、ナノ粒子に共有結合、若しくは好ましくは非共有結合されるか、又はこのようなナノ粒子内に封入される（Ｓｈａｒｍａら（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４）。ナノ粒子は、その長さスケールが＜１μｍ、好ましくは＜１００ｎｍであるナノスケール送達システムである。このようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生体高分子からなるコアを使用して設計することができ、組換えメガヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ又はＤＮＡの複数のコピーをナノ粒子コアに付着又は封入することができる。これは、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数を増加させ、従って、個々の操作されたヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、標的認識配列が切断される可能性を最大にする。このようなナノ粒子の表面を、ポリマー又は脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂質）で更に改変して、その表面が追加の官能性を付与するコア−シェルナノ粒子を形成し、細胞送達及びペイロードの取り込みを増強することができる（Ｊｉａｎら、（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１〜３０）。ナノ粒子は、ナノ粒子を適切な細胞型に導き、及び／又は細胞取り込みの可能性を高めるために、標的化分子に更に結合されることが有利であり得る。このような標的化分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体に対する天然リガンド（又は天然リガンドの一部）が挙げられる。

【0267】

いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、カチオン性脂質を使用してリポソーム内に封入又は複合体化される（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｚｕｒｉｓら、（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３３：７３〜８０；Ｍｉｓｈｒａら、（２０１１）Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照されたい）。リポソーム及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、細胞の細胞膜との融合及び／又は破壊によって細胞の取り込みおよび送達効率を促進することができる。

【0268】

いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えばＰＬＧＡ）内に封入されるか、又はカチオン性ポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉら、（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３〜５３６）。

【0269】

いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わされる（Ｔｏｎｇら、（２００７）．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ。９（１１）：９５６〜６６）。ポリマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、細胞外の非特異的相互作用を減少させることができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェルを含み得る。

【0270】

いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞への送達のために、エマルジョン又はナノエマルジョン（即ち、平均粒径＜１ｎｍを有する）内に製剤化される。用語「エマルジョン」は、限定するものではないが、任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴を指し、水不混和相が水相と混合されると、無極性残基（例えば、長い炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向ける疎水力の結果として形成され得る脂質構造を含む。これらの他の脂質構造としては、限定するものではないが、単層、少重層、及び多重層の脂質小胞、ミセル並びにラメラ相が挙げられる。エマルジョンは、水相及び親油性相（典型的には油及び有機溶媒を含む）からなる。エマルジョンはまた、しばしば、１又は複数の界面活性剤を含有する。ナノエマルジョン製剤は周知であり、例えば、米国特許出願第２００２／００４５６６７号及び第２００４／００４３０４１号、並びに米国特許第６，０１５，８３２号、第６，５０６，８０３号、第６，６３５，６７６号、及び第６，５５９，１８９号の明細書に記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0271】

いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多官能性ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、及びポリマーデンドリマーに共有結合又は非共有結合される（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓら、（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５〜５６；Ｃｈｅｎｇら、（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３〜４３）。デンドリマーの発生は、ペイロードの容量及びサイズを制御することができ、高いペイロード容量を提供することができる。更に、複数の表面基の表示を活用して、安定性を改善し、非特異的な相互作用を低減することができる。

【0272】

いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ウイルスベクターを使用して細胞に導入される。このようなベクターは当技術分野で公知であり、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる（Ｖａｎｎｕｃｃｉら、（２０１３ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１〜２２）に概説されている）。本発明に有用な組換えＡＡＶベクターは、細胞へのウイルスの形質導入及びヌクレアーゼ遺伝子の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。特定の実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ６の血清型を有する。組換えＡＡＶベクターはまた、それらが宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙら、（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８〜５４）。

【0273】

操作されたヌクレアーゼ遺伝子がＤＮＡ形態（例えばプラスミド）で、及び／又はウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能に連結されなければならない。いくつかの実施形態において、これは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターのＬＴＲ）由来の内因性プロモータ又は周知のサイトメガロウイルス若しくはＳＶ４０ウイルスの初期プロモータ等のウイルスプロモータであり得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞（例えば、ヒトＴ細胞）において遺伝子発現を優先的に駆動するプロモータに動作可能に連結される。

【0274】

本発明は更に、外因性核酸配列がヌクレアーゼ切断部位でＴＲＣアルファ定常領域遺伝子に挿入されるように、外因性核酸の細胞への導入を提供する。いくつかの実施形態において、外因性核酸は、５’相同アーム及び３’相同アームを含み、ヌクレアーゼ切断部位における核酸配列の細胞ゲノムへの組換えを促進する。

【0275】

本発明の外因性核酸は、先に考察した手段のいずれかによって細胞に導入することができる。特定の実施形態において、外因性核酸は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス等のウイルスベクター、又は好ましくは組換えＡＡＶベクターを用いて導入される。外因性核酸を導入するために有用な組換えＡＡＶベクターは、細胞へのウイルスの形質導入及び外因性核酸配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。特定の実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ６の血清型を有する。組換えＡＡＶベクターはまた、それらが宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る。

【0276】

別の特定の実施形態において、外因性核酸は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞内に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、外因性核酸を含むことができ、好ましい実施形態において、相同組換えによってヌクレアーゼ切断部位への核酸配列の挿入を促進するために５’及び３’相同アームを含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、５’相同アームの５’上流に５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を、３’相同アームの３’下流に３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列を更に含むことができる。

【0277】

別の特定の実施形態において、本発明のエンドヌクレアーゼ及び／又は本発明の外因性核酸配列をコードする遺伝子は、線形化ＤＮＡ鋳型のトランスフェクションによって細胞に導入することができる。いくつかの実施例において、エンドヌクレアーゼ及び／又は外因性核酸配列をコードするプラスミドＤＮＡは、環状プラスミドＤＮＡが細胞へのトランスフェクションの前に線形化されるように、１又は複数種の制限酵素によって消化することができる。

【0278】

細胞に送達される場合、本発明の外因性核酸は、細胞におけるコードされたポリペプチドの発現に適した、先に述べた哺乳動物プロモータ及び誘導性プロモータを含む任意のプロモータに動作可能に連結することができる。本発明の外因性核酸は、合成プロモータに動作可能に連結されていてもよい。合成プロモータとしては、限定するものではないが、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２００２／０１２５１４号パンフレット）を挙げることができる。

【0279】

本発明の遺伝子改変細胞がヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である実施例において、このような細胞は、メガヌクレアーゼ及び／又は外因性核酸配列の導入前に活性化を必要とし得る。例えば、Ｔ細胞は、可溶性の、又は支持体（即ち、ビーズ）とコンジュゲートした抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体と、細胞を活性化するのに十分な時間接触させることができる。

【0280】

本発明の遺伝子改変細胞は、１又は複数の誘導可能な自殺遺伝子を発現するように更に改変することができ、その誘導により細胞死を引き起こし、インビトロ又はインビボの細胞の選択的破壊を可能にする。いくつかの例では、自殺遺伝子は、細胞傷害性ポリペプチド、非毒性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換する能力を有するポリペプチド、及び／又は細胞内の細胞傷害性遺伝子経路を活性化するポリペプチドをコードすることができる。即ち、自殺遺伝子は、単独又は他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす生成物をコードする核酸である。このような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。更なる例は、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子及び５−フルオロシトシンを毒性の高い化合物５−フルオロウラシルに変換することができるシトシンデアミナーゼの細菌遺伝子である。自殺遺伝子としては更に、非限定的な例として、カスパーゼ−９、カスパーゼ−８、又はシトシンデアミナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。いくつかの例において、カスパーゼ−９は、二量化（ＣＩＤ）の特定の化学誘導剤を用いて活性化することができる。自殺遺伝子はまた、細胞を治療用及び／又は細胞傷害性のモノクローナル抗体に感受性にする、細胞の表面で発現されるポリペプチドをコードすることもできる。更なる例において、自殺遺伝子は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂであるリツキシマブによって認識される抗原性モチーフ及び自殺遺伝子を発現する細胞の選択を可能にするエピトープを含む組換え抗原性ポリペプチドをコードすることができる。例えば、２つのリツキシマブ結合エピトープ及びＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含む、国際公開第２０１３１５３３９１号パンフレットに記載のＲＱＲ８ポリペプチドを参照されたい。このような遺伝子について、リツキシマブを必要に応じて対象に投与して、細胞枯渇を誘導することができる。

【0281】

２．４ 医薬組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の遺伝子改変細胞、又は本発明の遺伝子改変細胞の集団及び医薬担体を含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版、２００５年）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、細胞は、典型的には、医薬として許容される担体と混合され、得られた組成物が対象に投与される。当然のことながら、担体は製剤中の他の成分と適合するという意味において許容可能でなければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、対象の疾患の治療に有用な１又は複数の更なる薬剤を更に含むことができる。遺伝子改変細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞（又はそれに由来する細胞）である更なる実施形態において、本発明の医薬組成物は、インビボでの細胞増殖及び生着を促進する、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１）等の生体分子を更に含むことができる。本発明の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、追加の薬剤又は生物学的分子と同じ組成物で投与することができ、あるいは、別々の組成物で同時投与することができる。

【0282】

本発明の医薬組成物は、Ｔ細胞養子免疫療法によって標的とされ得る任意の疾患状態を治療するために有用であり得る。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は癌の治療に有用である。このような癌としては、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、白血病、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、メラノーマ、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫が挙げられる。特定の実施形態において、Ｂ細胞起源の癌としては、限定するものではないが、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられる。

【0283】

２．５ 組換えＡＡＶベクターの作製方法
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法において使用するための組換えＡＡＶベクターを提供する。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、ＨＥＫ−２９３のような哺乳動物細胞株において産生される。ウイルスのｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、その自己複製を防止して、治療遺伝子（例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子）を送達する余地を作り出すためにベクターから除去されるので、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供することが必要である。更に、複製を支持するために必要な「ヘルパー」（例えば、アデノウイルス）成分を提供することが必要である（Ｃｏｔｓ Ｄ、Ｂｏｓｃｈ Ａ、Ｃｈｉｌｌｏｎ Ｍ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０〜８１）。しばしば、組換えＡＡＶベクターは、細胞株に、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在ＤＮＡ配列含むウイルス性ＩＴＲを含む第３のプラスミドをトランスフェクトする三重トランスフェクションを使用して作製される。カプシドに包まれたゲノム（目的のＩＴＲ及び１又は複数の介在遺伝子）を含むウイルス粒子は、その後、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離される。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、続いて、目的の（１又は複数の）遺伝子に、細胞、組織、又はヒト患者等の生物に送達する。

【0284】

組換えＡＡＶ粒子は、典型的には細胞中で産生される（製造される）ので、部位特異的エンドヌクレアーゼがパッケージング細胞中で確実に発現されないようにするために、本発明の実施において予防措置を講じる必要がある。本発明のウイルスゲノムは、エンドヌクレアーゼに対する認識配列を含むので、パッケージング細胞株において発現される任意のエンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノムがウイルス粒子にパッケージングされる前にこれを切断することができる。これは、パッケージング効率の低下及び／又は断片化したゲノムのパッケージングを生じる。以下を含むいくつかのアプローチを使用して、パッケージング細胞におけるエンドヌクレアーゼ発現を防止することができる：

【0285】

１．エンドヌクレアーゼは、パッケージング細胞において活性ではない組織特異的プロモータの制御下に置くことができる。例えば、筋肉組織への（１又は複数の）エンドヌクレアーゼ遺伝子の送達のためにウイルスベクターが開発された場合、筋肉特異的プロモータを使用することができる。筋特異的プロモータの例としては、Ｃ５−１２（Ｌｉｕら、（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３〜９２）、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｙｕａｓａら、（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１５７６〜８８）、又は平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅら、（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９〜５４）が挙げられる。ＣＮＳ（ニューロン）特異的プロモータの例としては、ＮＳＥ、シナプシン、及びＭｅＣＰ２プロモータ（Ｌｅｎｔｚら、（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．４８：１７９〜８８）が挙げられる。肝特異的プロモータの例としては、アルブミンプロモータ（Ｐａｌｂ等）、ヒトα１−抗トリプシン（Ｐａ１ＡＴ等）、及びヘモペキシン（Ｐｈｐｘ等）（Ｋｒａｍｅｒ、ＭＧら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ７：３７５〜８５）が挙げられる。眼特異的プロモータの例としては、オプシン、及び角膜上皮特異的Ｋ１２プロモータ（Ｍａｒｔｉｎ ＫＲＧ、Ｋｌｅｉｎ ＲＬ及びＱｕｉｇｌｅｙ ＨＡ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７〜７５）（Ｔｏｎｇ Ｙら、（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，９：：９５６〜６６）が挙げられる。これらのプロモータ又は当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、ＨＥＫ−２９３細胞において高度に活性ではなく、従って、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッケージング細胞において有意なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じることは期待されない。同様に、本発明のウイルスベクターは、他の細胞株の使用及び不適合性組織特異的プロモータの使用（即ち、周知のＨｅＬａ細胞株（ヒト上皮細胞）及び肝臓特異的ヘモペキシンプロモータの使用）を企図している。組織特異的プロモータの他の例としては、滑膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、ＡＤＰＲＨＬ１（心臓）、及び一遺伝子性奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）が挙げられる。（Ｊａｃｏｘ Ｅら、（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．５（８）：ｅ１２２７４）。

【0286】

２．あるいは、ベクターは、エンドヌクレアーゼが発現されにくい異なる種由来の細胞にパッケージングすることができる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳類パッケージング細胞において活性ではない、周知のサイトメガロウイルス又はＳＶ４０ウイルスの初期プロモータ等の哺乳動物プロモータを用いて、微生物、昆虫、又は植物細胞中で産生され得る。好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、Ｇａｏらが記載したバキュロウイルス系を使用して昆虫細胞中で産生される（Ｇａｏ，Ｈ．ら、（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３８〜４３）。哺乳動物プロモータの制御下にあるエンドヌクレアーゼは、これらの細胞で発現する可能性は低い（Ａｉｒｅｎｎｅ，ＫＪら、（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（４）：７３９〜４９）。更に、昆虫細胞は、哺乳動物細胞とは異なるｍＲＮＡスプライシングモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）イントロン又はＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン等の哺乳動物イントロンを、エンドヌクレアーゼのコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞のプレｍＲＮＡ転写産物から効率的にスプライシングされないので、昆虫細胞は機能的エンドヌクレアーゼを発現せず、完全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子が送達される哺乳動物細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライシングし、機能的エンドヌクレアーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、昆虫パッケージング細胞中における毒性タンパク質バルナーゼ及びジフテリア毒素断片Ａの発現を減弱させ、これらの毒素遺伝子を有する組換えＡＡＶベクターの産生を可能にするためのＨＧＨ及びＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンの使用を報告している（Ｃｈｅｎ，Ｈ（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。

【0287】

３．エンドヌクレアーゼ遺伝子は、エンドヌクレアーゼ発現のために小分子誘導物質が必要とされるように、誘導プロモータに動作可能に連結することができる。誘導性プロモータの例としては、Ｔｅｔ−Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ Ｈ．ら、（２０１５）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４））及びＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ Ｇ．ら、（２０１１）Ｓｐｉｎｅ、３６（１０）：Ｅ６２３〜８）が挙げられる。両方のシステム並びに当技術分野で公知の類似のシステムは、小分子活性化因子（それぞれドキシサイクリン又はエクジソン）に応答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれＴｅｔリプレッサー及びエクジソン受容体の変種）に依存する。このようなリガンド誘導性転写活性化因子を使用する本発明の実施は、１）転写因子に対する（１又は複数の）結合部位を有するエンドヌクレアーゼ遺伝子を、対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に置くこと、並びに２）パッケージングされたウイルスゲノム中の転写因子をコードする遺伝子を含むこと、を含む。後者の工程は、転写活性化因子が同じ細胞に供給されない場合、組換えＡＡＶ送達後に標的の細胞又は組織においてエンドヌクレアーゼが発現されないので、必要である。次いで、転写活性因子は、同族小分子活性化因子で処理された細胞又は組織においてのみ、エンドヌクレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチは、小分子誘導物質がいつ、及びどの組織に送達されるかを選択することによって、エンドヌクレアーゼ遺伝子発現を空間−時間的様式で調節することができるので、有利である。しかし、担持能力が著しく制限されたウイルスゲノムに誘導物質を含める必要性は、このアプローチに欠点を生じさせる。

【0288】

４．別の好ましい実施形態において、組換えＡＡＶ粒子は、エンドヌクレアーゼの発現を妨げる転写リプレッサーを発現する哺乳動物細胞株において産生される。転写リプレッサーは当技術分野において公知であり、Ｔｅｔ−リプレッサー、Ｌａｃ−リプレッサー、Ｃｒｏリプレッサー、及びＬａｍｂｄａリプレッサーが挙げられる。エクジソン受容体等の多くの核内ホルモン受容体は、それらの同族ホルモンリガンドの不在下で転写リプレッサーとしても作用する。本発明を実施するために、パッケージング細胞は、転写リプレッサーをコードするベクターをトランスフェクト／形質導入され、ウイルスゲノム中のエンドヌクレアーゼ遺伝子（パッケージングベクター）は、リプレッサーがプロモータをサイレンシングするように、リプレッサーに対する結合部位を含むように改変されたプロモータに動作可能に連結される。転写リプレッサーをコードする遺伝子は、種々の位置に置くことができる。前記遺伝子は、別のベクターにコード化することができ、ＩＴＲ配列の外側のパッケージングベクターに組み込むことができ、ｃａｐ／ｒｅｐベクター又はアデノウイルスヘルパーベクターに組み込むことができ、又は最も好ましくは、それが構成的に発現されるようにパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込むことができる。転写リプレッサー部位を取り込むために一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分野で公知である。例えばＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎは強力な構成的ＣＭＶ及びＲＳＶプロモータを、Ｌａｃリプレッサーのオペレーターを含むように改変し、改変プロモータからの遺伝子発現がリプレッサーを発現する細胞において大きく減弱したことを示した（Ｃｈａｎｇ ＢＤ及びＲｏｎｉｎｓｏｎ ＩＢ（１９９６）Ｇｅｎｅ １８３：１３７〜４２）。非ヒト転写リプレッサーの使用は、エンドヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッサーを発現するパッケージング細胞でのみ抑制され、得られる組換えＡＡＶベクターを形質導入された標的の細胞又は組織では抑制されないことを確実にする。

【0289】

２．６ 操作されたヌクレアーゼ変異体
本発明の実施形態は、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼ、特に組換えメガヌクレアーゼ、及びその変異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載の組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド及びこのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。

【0290】

本明細書で使用される場合、「変異体」は、実質的に類似の配列を意味する意図のものである。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１又は複数の内部部位における１又は複数個のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び／又は天然ポリペプチドの１又は複数の部位における１又は複数個のアミノ酸の置換により、「天然の」ポリペプチドから導かれたポリペプチドを意味する意図のものである。本明細書で使用される場合、「天然の」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形態によって包含される変異体ポリペプチドは生物学的に活性である。即ち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性；即ち、例えばＴＲＣ１−２認識配列（配列番号３）、ＴＲＣ３−４認識（配列番号４）、及びＴＲＣ７−８認識配列（配列番号５）を含むヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域（配列番号１）に見出される認識配列を認識及び切断する能力を保有し続けている。このような変異体は、例えばヒトの操作から生じ得る。実施形態の天然ポリペプチド（例えば、配列番号８〜３２）の生物学的に活性な変異体、又は本明細書に記載の認識半部位結合サブユニット（例えば、配列番号３３〜８２）の生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによる決定で、天然ポリペプチドまたは天然サブユニットと約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又はサブユニットの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと、わずか約１〜４０個のアミノ酸残基、わずか約１〜２０個、わずか約１〜１０個、わずか約５個、わずか４、３、２個、又は更には１個のアミノ酸残基が異なり得る。

【0291】

実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む様々な方法で改変することができる。このような操作のための方法は、当技術分野において一般的に知られている。例えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異誘発及びポリヌクレオチド改変のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８〜４９２；Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ及びＧａａｓｔｒａ編、（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら、（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換する等の保存的置換が最適であり得る。

【0292】

野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対するアミノ酸改変の実質的な数が以前に同定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号明細書）、これを、単独で又は組み合わせることにより、得られた合理的に設計されたメガヌクレアーゼが、野生型酵素とは異なる半部位特異性を有するように、ＤＮＡ認識配列半部位内の個別の塩基において特異性が改変された組換えメガヌクレアーゼがもたらされる。表４は、認識半部位の各半部位位置（−１から−９）に存在する塩基に基づいて特異性を高めるために組換えメガヌクレアーゼ単量体又はサブユニットにおいてなされ得る有望な置換を提供する。

【0293】

【表4】

【0294】

ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然のポリヌクレオチド内の１又は複数の部位に１又は複数のヌクレオチドの欠失及び／又は付加を含む。当業者は、実施形態の核酸の変異体が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識するであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体には、遺伝コードの縮重のために、実施形態のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。変異体ポリヌクレオチドは、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されるが、実施形態の組換えメガヌクレアーゼを依然としてコードするような、合成的に誘導されたポリヌクレオチドを含む。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによる決定で、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上の配列同一性を有すると思われる。実施形態の特定のポリヌクレオチド（即ち、参照ポリヌクレオチド）の変異体は、変異ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列同一性のパーセントを比較することによって評価することもできる。

【0295】

本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特徴において根本的な変化を生じることは期待されない。しかし、その実施に先立って、置換、欠失、又は挿入の正確な効果を予測することが困難である場合、当業者は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子（配列番号１）内に見出される認識配列を選択的に認識及び切断するその能力についてポリペプチドをスクリーニングすることによって、その効果が評価されることを理解するであろう。

【実施例】

【0296】

本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらの実施例を、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。当業者であれば、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記載の特定の物質及び手順に対する多数の等価物を認識し、又は確認することができるであろう。このような等価物は、以下の実施例に従った特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0297】

実施例１；ＴＲＣ認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼの特徴付け

【0298】

１．ＴＲＣ１−２認識配列を認識および切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ（配列番号８〜２７）は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域中に存在するＴＲＣ１−２認識配列（配列番号３）を認識及び切断するように操作されていた。各ＴＲＣ１−２組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来Ｎ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号３のＴＲＣ１認識半部位に結合し、第２のサブユニットはＴＲＣ２認識半部位に結合する（図１Ａを参照されたい）。

【0299】

図２及び図３に示すように、ＴＲＣ１結合サブユニット及びＴＲＣ２結合サブユニットは各々、それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＴＲＣ１結合サブユニットは、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ１領域の外側で同一であり、ＨＶＲ１領域内では高度に保存されている。同様に、ＴＲＣ２結合サブユニットもまた、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）、並びにメガヌクレアーゼＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７、及びＴＲＣ１−２ｘ．１６３の１３９位（Ｒ残基を含む）（網掛けの灰色及び下線）を除いて、ＨＶＲ２領域の外側で同一である。ＨＶＲ１領域と同様に、ＨＶＲ２領域も高度に保存されている。

【0300】

配列番号８〜２７のＴＲＣ１結合領域を図２に示し、それぞれ配列番号３３〜５２として提供する。配列番号３３〜５２はそれぞれ、メガヌクレアーゼＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ（配列番号８）のＴＲＣ１結合領域である配列番号３３と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号８〜２７のＴＲＣ２結合領域を図３に示し、それぞれ配列番号５８〜７７として提供する。配列番号５８〜７７はそれぞれ、メガヌクレアーゼＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ（配列番号８）のＴＲＣ２結合領域である配列番号５８と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。

【0301】

２．ＴＲＣ３−４認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「ＴＲＣ３−４メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ（配列番号２８及び２９）は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域中に存在するＴＲＣ３−４認識配列（配列番号４）を認識及び切断するように操作されていた。各ＴＲＣ３−４組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来Ｎ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＴＲＣ３−４メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号４のＴＲＣ３認識半部位に結合し、第２のサブユニットはＴＲＣ４認識半部位に結合する（図１Ａを参照されたい）。

【0302】

図４及び図５に示すように、ＴＲＣ３結合サブユニット及びＴＲＣ４結合サブユニットは各々、それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＴＲＣ３結合サブユニットは、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ１領域の外側で同一であり、ＨＶＲ１領域内では高度に保存されている。同様に、ＴＲＣ４結合サブユニットもまた、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ２領域の外側で同一であり、ＨＶＲ２領域内では高度に保存されている。

【0303】

配列番号２８及び２９のＴＲＣ３結合領域を図４に示し、それぞれ配列番号５３及び５４として提供する。配列番号５３及び５４は、９６．６％の配列同一性を共有する。配列番号２８及び２９のＴＲＣ４結合領域を図５に示し、それぞれ配列番号７８及び７９として示す。配列番号７８及び７９もまた、９６．６％の配列同一性を共有する。

【0304】

３．ＴＲＣ７−８認識配列を認識および切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「ＴＲＣ７−８メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ（配列番号３０〜３２）は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域中に存在するＴＲＣ７−８認識配列（配列番号５）を認識及び切断するように操作されていた。各ＴＲＣ７−８組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来Ｎ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＴＲＣ７−８メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号５のＴＲＣ７認識半部位に結合し、第２のサブユニットはＴＲＣ８認識半部位に結合する（図１Ａを参照されたい）。

【0305】

図６及び図７に示すように、ＴＲＣ７結合サブユニット及びＴＲＣ８結合サブユニットは各々、それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＴＲＣ７結合サブユニットは、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ１領域の外側で同一であり、ＨＶＲ１領域内では高度に保存されている。同様に、ＴＲＣ８結合サブユニットもまた、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ２領域の外側で同一であり、ＨＶＲ２領域内では高度に保存されている。

【0306】

配列番号３０〜３２のＴＲＣ７結合領域を図６に示し、それぞれ配列番号５５〜５７として提供する。配列番号５５〜５７はそれぞれ、メガヌクレアーゼＴＲＣ７−８ｘ．７（配列番号３０）のＴＲＣ７結合領域である配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号３０〜３２のＴＲＣ８結合領域を図７に示し、それぞれ配列番号８０〜８２として提供する。配列番号８０−８２はそれぞれ、メガヌクレアーゼＴＲＣ７−８ｘ．７（配列番号３０）のＴＲＣ８結合領域である配列番号８０と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。

【0307】

４．ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域認識配列の切断
ＴＲＣ１−２、ＴＲＣ３−４、及びＴＲＣ７−８メガヌクレアーゼがそれぞれの認識配列（それぞれ配列番号３、４、及び５）を認識及び切断することができるかどうかを決定するために、各組換えメガヌクレアーゼを、先に記載のＣＨＯ細胞レポーターアッセイ（国際公開第／２０１２／１６７１９２号パンフレット及び図８を参照されたい）を使用して評価した。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセットを保有するＣＨＯ細胞レポーター株を作製した。各細胞株のＧＦＰ遺伝子は、メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が機能性ＧＦＰ遺伝子をもたらす相同組換え事象を刺激するように、一対の認識配列によって分断された。

【0308】

この研究のために開発されたＣＨＯレポーター細胞株において、ＧＦＰ遺伝子に挿入された１つの認識配列は、ＴＲＣ１−２認識配列（配列番号３）、ＴＲＣ３−４認識配列（配列番号４）、又はＴＲＣ７−８認識配列（配列番号５）であった。ＧＦＰ遺伝子に挿入された第２の認識配列は、「ＣＨＯ−２３／２４」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによって認識及び切断されるＣＨＯ−２３／２４認識配列であった。ＴＲＣ１−２認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、本明細書では「ＴＲＣ１−２細胞」と呼ばれる。ＴＲＣ３−４認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、本明細書では「ＴＲＣ３−４細胞」と呼ばれる。ＴＲＣ７−８認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、本明細書では「ＴＲＣ７−８細胞」と呼ばれる。

【0309】

ＣＨＯレポーター細胞を、それらの対応する組換えメガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトし（例えば、ＴＲＣ１−２細胞にはＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした）、又はＣＨＯ−２３／３４メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。各アッセイにおいて、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、９６ウェルプレートにおいて、４ｅ^５のＣＨＯレポーター細胞に５０ｎｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリにより評価して、トランスフェクトされていない陰性対照（ＴＲＣ１−２ｂｓ）と比較したＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定した。図９に示すように、ＴＲＣ１−２、ＴＲＣ３−４、及びＴＲＣ７−８メガヌクレアーゼは全て、対応する認識配列を含む細胞株において、陰性対照を有意に超える頻度でＧＦＰ陽性細胞を産生することが見出された。

【0310】

ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱ、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼの効力も、時間依存的様式で決定した。この研究では、ＴＲＣ１−２細胞（１ｅ^６）に１細胞あたり１ｅ^６のメガヌクレアーゼｍＲＮＡコピーを、製造元の指示に従ってＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを使用して電気穿孔した。トランスフェクションの１、４、６、８、及び１２日後、細胞をフローサイトメトリによって評価して、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定した。図１０に示すように、各ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼはトランスフェクションの２日後に高効率を示し、５０％を超えるＧＦＰ陽性細胞が観察された。この効果は１２日間にわたって持続し、細胞毒性の証拠は観察されなかった。

【0311】

５．結論
これらの研究は、本発明に包含されるＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼ、ＴＲＣ３−４メガヌクレアーゼ、及びＴＲＣ７−８メガヌクレアーゼが、それらのそれぞれの認識配列を細胞内で効率的に標的とし、切断できることを実証した。

【0312】

実施例２；Ｔ細胞におけるＴＲＣ認識配列の切断及び細胞表面Ｔ細胞受容体発現の抑制

【0313】

１．Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＲＣ１−２認識配列の切断
この研究は、本発明に包含されるＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼが、Ｊｕｒｋａｔ細胞（不死化ヒトＴリンパ球細胞株）においてＴＲＣ１−２認識配列を切断できることを実証した。１ｅ^６のＪｕｒｋａｔ細胞に１細胞あたり８ｅ^６の所与のＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼｍＲＮＡコピーを、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを製造元の指示に従って使用して電気穿孔した。トランスフェクションの７２時間後に、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を細胞から採取し、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイを実施して内因性ＴＲＣ１−２認識配列（図１１）における遺伝子改変を推定した。Ｔ７Ｅアッセイでは、ＴＲＣ１−２認識部位に隣接するプライマーを使用してＴＲＣ１−２遺伝子座をＰＣＲにより増幅する。ＴＲＣ１−２遺伝子座内にインデル（ランダムな挿入又は欠失）がある場合、得られたＰＣＲ産物は、野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子の混合物からなると思われる。ＰＣＲ産物を変性させ、ゆっくりと再アニーリングする。ゆっくりとした再アニーリングは、野生型及び突然変異対立遺伝子からなるヘテロ二重鎖の形成を可能にし、ミスマッチ塩基及び／又はバルジを生じる。Ｔ７Ｅ１酵素は、ミスマッチ部位で切断し、ゲル電気泳動によって可視化され得る切断産物を生じる。図１１は、ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼの１３の異なるバージョンがＴ７Ｅ１アッセイにおいて陽性結果を生じ、内因性ＴＲＣ１−２認識配列におけるインデルの効果的な生成を示していることを明確に実証した。

【0314】

ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼの切断特性を更に調べるために、用量反応実験をＪｕｒｋａｔ細胞で行った。１ｅ^６のＪｕｒｋａｔ細胞に１細胞あたり３μｇ又は１μｇの所与のＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼｍＲＮＡコピーを、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを製造元の指示に従って使用して電気穿孔した。トランスフェクションの９６時間後、ｇＤＮＡを回収し、Ｔ７Ｅ１アッセイを上記のように行った。図１２に見られるように、ＴＲＣ１−２ｘ．８７メガヌクレアーゼの３つの異なるバージョンを含む１５種類の異なるＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼは、内因性ＴＲＣ１−２認識部位での切断を示した。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥは特にうまく機能し、Ｔ７Ｅ１アッセイにおいて強いシグナルを生成し、Ｊｕｒｋａｔ細胞で毒性がほとんど又は全くなかった。

【0315】

２．ヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識配列の切断
この研究は、本発明に包含されるＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼが、ドナーから得られたヒトＴ細胞においてＴＲＣ１−２認識配列を切断できることを実証した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いでＡｍａｘａ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を製造元の指示に従って使用して、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを電気穿孔した。トランスフェクションの３日後及び７日後、ｇＤＮＡを回収し、Ｔ７Ｅ１アッセイを上記のように行った。図１３Ａは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥがヒトＴ細胞において内因性ＴＲＣ１−２認識配列に突然変異を効果的に導入し、メガヌクレアーゼがＴＲＣ１−２認識配列を認識及び切断したことを示すことを実証している。切断産物の強度は、トランスフェクションの３日目後と７日目後との間で変化がないと思われ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼによる毒性はほとんど又は全くないことを示唆している。内因性ＴＲＣ１−２認識配列における突然変異がＴ細胞受容体の表面発現を排除するのに十分であるかどうかを決定するために、抗ＣＤ３抗体を使用したフローサイトメトリによって細胞を分析した。図１３Ｂは、トランスフェクトされたＴ細胞の約５０％がＣＤ３に対して陰性に染色されことを示し、Ｔ細胞受容体のノックアウトを示している。ＣＤ３陰性集団は、トランスフェクション後３日目と７日目との間で有意に変化せず、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼに関連する毒性はほとんど若しくはまったくないか、又はＴ細胞受容体発現の喪失を更に示した。

【0316】

ＣＤ３発現の消失がＴＲＣ１−２認識部位の突然変異によるものであることを検証するために、トランスフェクトされたＴ細胞からｇＤＮＡを回収し、ＴＲＣ１−２認識部位遺伝子座をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を製造者の指示に従って使用して、ｐＣＲ−平滑末端ベクターにクローニングした。個々のコロニーを拾い、ミニプレッププラスミドを配列決定した。図１４は、ＴＲＣ１−２認識配列で観察された、いくつかの代表的な欠失の配列を示す。観察された配列は、エンドヌクレアーゼによって生成されたＤＮＡ二本鎖切断の非相同末端結合修復から生じる欠失の典型的なものである。

【0317】

ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥに加えて、ＴＲＣ１−２ｘ．５５、及びＴＲＣ１−２ｘ．７２を含む他のＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼは、ヒトＴ細胞においてＴ細胞受容体をノックアウトすることができたが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥについて以前に観察されたノックアウトよりも程度は低かった（表５及び６）。ＴＲＣ１−２ｘ．７２Ｑ４７Ｅは、メガヌクレアーゼの活性部位（アミノ酸４７）に突然変異を有し、陰性対照として機能する。

【0318】

【表5】

【0319】

【表6】

【0320】

３．結論
これらの研究は、本発明に包含されるＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼが、Ｊｕｒｋａｔ細胞（不死化Ｔリンパ球細胞株）及びヒトドナーから得られたＴ細胞の両方において、ＴＲＣ１−２認識配列を認識及び切断することができることを実証した。更に、これらの研究は、インデルの出現によって証明されるように、ＮＨＥＪがメガヌクレアーゼ切断部位に生じることを実証した。更に、ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼは、ドナーから得られたヒトＴ細胞上のＴ細胞受容体の細胞表面発現を低下させることが示された。

【0321】

実施例３；外因性核酸をヒトＴ細胞に導入するための組換えＡＡＶベクター

【0322】

１．組換えＡＡＶベクター
本研究において、２つの組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶ４０５及びＡＡＶ４０６と呼ばれる）を、ＥａｇＩ制限部位を含む外因性核酸配列を相同組換えによりＴＲＣ１−２認識配列においてヒトＴ細胞のゲノムに導入するように設計した。各組換えＡＡＶベクターは、細胞株に、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」成分（例えばアデノウイルス）をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在ＤＮＡ配列（例えば外因性核酸配列）を含むウイルス性逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む第３のプラスミドをトランスフェクトする三重トランスフェクションプロトコルを使用して調製される（Ｃｏｔｓ Ｄ、Ｂｏｓｃｈ Ａ、Ｃｈｉｌｌｏｎ Ｍ（２０１３年）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０〜８１頁を参照されたい）。図１５は、外因性核酸配列をヌクレアーゼ切断部位で細胞ゲノムに導入するために組換えＡＡＶベクターを使用するための一般的なアプローチを示す。

【0323】

図１６に示すプラスミドを使用して、ＡＡＶ４０５（配列番号１０７）を調製した。示されるように、ＡＡＶ４０５プラスミドは、一般に、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー及びプロモータ配列、５’相同アーム、ＥａｇＩ制限部位を含む核酸配列、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、３’相同アーム、及び３’ＩＴＲを含む。図１７に示すプラスミドを使用して、ＡＡＶ４０６（配列番号１０８）を調製した。示されるように、ＡＡＶ４０６プラスミドは、ＡＡＶ４０５と同様の配列を含むが、５’相同アームの上流のＣＭＶエンハンサー及びプロモータ配列を欠く。本ＡＡＶ研究は、ＡＡＶ形質導入効率の陽性対照として組み込まれた、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクター（ＧＦＰ−ＡＡＶ）の使用をさらに含んでいた。

【0324】

２．ＴＲＣ１−２認識配列への外因性核酸配列の導入
ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼによる二本鎖切断の発生後にＡＡＶ鋳型が相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）に適しているかどうかを試験するために、ヒトＴ細胞を使用して一連の実験を行った。第１の実験では、ＴＲＣ１−２ＲＮＡの電気穿孔のタイミング及び組換えＡＡＶベクターの形質導入を決定した。ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を製造者の指示に従って使用して、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を電気穿孔した。トランスフェクションの２、４、又は８時間後に、細胞にＧＦＰ−ＡＡＶ（１ｅ^５のウイルスゲノム／細胞）を形質導入した。細胞を、形質導入の７２時間後にＧＦＰ発現についてフローサイトメトリによって分析した。図１８に示すように、トランスフェクションの２時間後に細胞を形質導入した場合、最も高い形質導入効率が観察された（ＧＦＰ陽性細胞８８％）。形質導入効率は、トランスフェクションと形質導入との間の時間が増加するにつれて有意に減少し、４時間でＧＦＰ陽性細胞７８％及び８時間でＧＦＰ陽性細胞６５％であった。

【0325】

トランスフェクションの２時間後に細胞を形質導入した場合、効率的なウイルス形質導入が起こったと判断したので、ＡＡＶ４０５及びＡＡＶ４０６ベクターをヒトＴ細胞においてＨＤＲ鋳型として使用した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞を刺激し、上記のように１μｇのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２時間後に、細胞にＡＡＶ４０５又はＡＡＶ４０６（１ｅ^５のウイルスゲノム／細胞）のいずれかを形質導入した。形質導入のみの対照として、細胞に（水を）擬似トランスフェクションし、ＡＡＶ４０５又はＡＡＶ４０６（１ｅ^５のウイルスゲノム／細胞）のいずれかを形質導入した。メガヌクレアーゼのみの対照のために、細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをトランスフェクションし、次いでトランスフェクションの２時間後に（水を）擬似形質導入した。

【0326】

ＡＡＶベクターがＨＤＲ鋳型として機能するかどうかを決定するために、ｇＤＮＡを細胞から回収し、ＡＡＶベクター中の相同領域を超える配列を認識するプライマーを使用して、ＰＣＲによりＴＲＣ１−２遺伝子座を増幅させた。相同領域の外側のＰＣＲプライマーは、ＡＡＶベクターからではなく、Ｔ細胞ゲノムの増幅のみを可能にした。ＰＣＲ産物を精製し、ＥａｇＩで消化した。図１９は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをトランスフェクトされ、いずれかのＡＡＶベクターを形質導入された細胞から増幅されたＰＣＲ産物の切断を示し（矢印を参照されたい）、ＴＲＣ１−２認識配列へのＥａｇＩ部位の挿入を示している。全ての対照細胞集団由来のＰＣＲ産物はＥａｇＩによって切断されず、ＥａｇＩ部位の挿入がＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼによるＤＮＡ二本鎖切断の生成を必要とすることを実証している。

【0327】

ヒトＴ細胞へのＥａｇＩ部位の挿入を更に明確にするために、バルクＰＣＲ産物からの個々の産物を調べた。上記実験から生成された未消化ＰＣＲ産物を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を製造者の指示に従って使用してｐＣＲ−平滑ベクターにクローニングした。コロニーＰＣＲを、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを使用して実施し（ｐＣＲ平滑末端はインサートに隣接するＭ１３フォワード及びリバースプライミング部位を含む）、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ及びＡＡＶ４０５又はＡＡＶ４０６をトランスフェクトされた細胞由来のＰＣＲ産物の一部をゲル電気泳動により分析した（それぞれ図２０Ａ及び２１Ａ）。どちらの場合も、完全長ＰＣＲ産物（約１６００ｂｐ）、より小さいインサート、及びいくつかの空のプラスミド（約３００ｂｐ）が混在している。このアッセイでは、完全長よりも小さいが空のプラスミドよりも大きいバンドは、しばしば、ＴＲＣ１−２認識配列内に大きな欠失を含む配列である。平行して、ＰＣＲ産物の別の部分をＥａｇＩで消化して、ＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたＥａｇＩ認識部位を含むクローンのパーセントを決定した。図２０Ｂ及び２１Ｂは、いくつかのＰＣＲ産物がＥａｇＩで切断され（例えば、図２０Ｂ、第２列、左から６レーン）、約７００及び８００ｂｐの予想される断片を生成することを示す。これらのゲルから、ＥａｇＩ挿入が、ＡＡＶ４０５及びＡＡＶ４０６についてそれぞれ約２５％及び６％（空のベクターに対して調整）であると推定することができる。

【0328】

未切断及びＥａｇＩにより消化されたＰＣＲ産物のゲル電気泳動からの観察を確認するために、各ＰＣＲ産物の残りの部分を配列決定した。図２２Ａは、ＴＲＣ１−２認識配列で観察されたいくつかの代表的な欠失及び挿入の配列を示す。これらの配列は、エンドヌクレアーゼによって生成されたＤＮＡ二本鎖切断の非相同末端結合修復から生じる配列に典型的なものである。ＥａｇＩで切断されたＰＣＲ産物は全て、ＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたＥａｇＩ部位を含んでいた（図２２Ｂ）。

【0329】

３．ＡＡＶ形質導入効率の向上
ＡＡＶ形質導入をトランスフェクションの２時間後に実施した場合が、それより後に実施した場合よりも効率的であるという観察の観点から、トランスフェクションおよび形質導入のタイミングを最適化するための実験を行った。ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いでＡｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を製造者の指示に従って使用して、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ（１μｇ）を電気穿孔した。トランスフェクションの直後又はトランスフェクションの２時間後に、細胞にＧＦＰ−ＡＡＶ（１ｅ^５のウイルスゲノム／細胞）を形質導入した。更に、未刺激細胞に、ＧＦＰ−ＡＡＶ（１ｅ^５のウイルスゲノム／細胞）を形質導入した。形質導入の７２時間後に、細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリによって分析した。図２３は、トランスフェクションの２時間後に行ったＧＦＰ−ＡＡＶ形質導入が９０％のＧＦＰ陽性細胞をもたらしたが、トランスフェクション直後の形質導入は９８％のＧＦＰ陽性細胞を生じたことを示す。休止Ｔ細胞はＡＡＶ形質導入を受け入れないと思われ、ＧＦＰ陽性細胞は約０％であった。非形質導入細胞はまた、約０％のＧＦＰ陽性細胞を示した。

【0330】

４．概要
これらの研究は、ＡＡＶベクターを組換えメガヌクレアーゼと併せて使用して、相同組換えを介して、外因性核酸配列をＴＣＲアルファ定常領域の切断部位に組み込むことができることを実証する。

【0331】

実施例４；ヒトＴ細胞においてキメラ抗原受容体をコードする外因性核酸を導入するための組換えＡＡＶベクター

【0332】

１．組換えＡＡＶベクター
本研究において、２つの組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶ−ＣＡＲ１００及びＡＡＶ−ＣＡＲ７６３と呼ばれる）を、キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸配列を相同組換えによりＴＲＣ１−２認識配列においてヒトＴ細胞のゲノムに導入するように設計した。各組換えＡＡＶベクターは、先に記載した三重トランスフェクションプロトコルを使用して調製した。

【0333】

ＡＡＶ−ＣＡＲ１００（本明細書ではＡＡＶ４０８とも呼ぶ）は、図２４に示すプラスミド（配列番号１０９）を使用して調製した。示されるように、ＡＡＶ−ＣＡＲ１００（ＡＡＶ４０８）は、自己相補的なＡＡＶベクターを作製するために設計され、一般に、５’ＩＴＲ、５’相同アーム、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードする核酸配列、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、３’相同アーム、及び３’ＩＴＲを含む。図２５（配列番号１１０）に示すプラスミドを使用してＡＡＶ−ＣＡＲ７６３（本明細書ではＡＡＶ４１２とも呼ぶ）を調製した。示されるように、ＡＡＶ−ＣＡＲ７６３（ＡＡＶ４１２）プラスミドは、一般に、ＡＡＶ−ＣＡＲ１００（ＡＡＶ４０８）と同じ配列を含むが、一本鎖ＡＡＶベクターを作製するために設計される。一本鎖ＡＡＶベクターはより大きなペイロードを収容することができるので、５’相同アーム及び３’相同アームは、ＡＡＶ−ＣＡＲ７６３（ＡＡＶ４１２）においてＡＡＶ−ＣＡＲ１００（ＡＡＶ４０８）よりも長い。本ＡＡＶ研究は、ＡＡＶ形質導入効率の陽性対照として組み込まれた、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクター（ＧＦＰ−ＡＡＶ）の使用を更に含む。

【0334】

２．ＴＲＣ１−２認識配列へのキメラ抗原受容体配列の導入
キメラ抗原受容体配列をＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入し、同時に内因性ＴＣＲ受容体の細胞表面発現をノックアウトするための組換えＡＡＶベクターの使用効率を決定するための研究を行う。

【0335】

形質導入効率を確認するために、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞を得て、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を製造者の指示に従って使用して、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を電気穿孔した。細胞に、上記のようにトランスフェクションの直後にＧＦＰ−ＡＡＶ（１ｅ^５のウイルスゲノム／細胞）を形質導入する。細胞を、形質導入の７２時間後に、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリによって分析し、形質導入効率を決定する。

【0336】

ＡＡＶ−ＣＡＲ１００（ＡＡＶ４０８）及びＡＡＶ−ＣＡＲ７６３（ＡＡＶ４１２）ベクターは、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体配列の挿入のためにヒトＴ細胞においてＨＤＲ鋳型として使用される。ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞を刺激し、上記のように１μｇのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡをトランスフェクトする。次いで、トランスフェクションの直後又はトランスフェクションの０〜８時間以内のいずれかに、細胞にＡＡＶ−ＣＡＲ１００（ＡＡＶ４０８）又はＡＡＶ−ＣＡＲ７６３（ＡＡＶ４１２）（１ｅ^５のウイルスゲノム／細胞）を形質導入する。形質導入のみの対照として、細胞に（水を）擬似トランスフェクションし、ＡＡＶ−ＣＡＲ１００（ＡＡＶ４０８）又はＡＡＶ−ＣＡＲ７６３（ＡＡＶ４１２）（１ｅ^５のウイルスゲノム／細胞）のいずれかを形質導入した。メガヌクレアーゼのみの対照のために、細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡをトランスフェクションし、次いでトランスフェクションの直後に（水を）擬似形質導入する。

【0337】

キメラ抗原受容体配列の挿入は、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子中の切断部位の配列決定によって確認する。キメラ抗原受容体の細胞表面発現は、抗Ｆａｂ又は抗ＣＤ１９抗体を使用して、フローサイトメトリによって確認する。内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面でのノックアウトは、前述のフローサイトメトリによって決定される。

【0338】

実施例５；キメラ抗原受容体の挿入及び発現

【0339】

１．キメラ抗原受容体配列のＴＲＣ１−２認識配列への挿入
本研究では、ＡＡＶが、キメラ抗原受容体配列をＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入し、同時に内因性ＴＣＲ受容体の細胞表面発現をノックアウトするために使用できるＨＤＲ鋳型を提供できるかどうかを試験する。第１の実験では、上記のようにヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞（１ｅ^６細胞）を刺激し、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（２μｇ）を電気穿孔し、次いでＡＡＶ４１２（１ｅ^５ウイルスゲノム／細胞）を直ちに形質導入した。対照として、細胞に擬似電気穿孔し、次いでＡＡＶ４１２を形質導入するか、又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで擬似形質導入した。擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞の更なる対照も含んでいた。

【0340】

ＡＡＶ ＨＤＲ鋳型がＴＲＣ１−２認識配列における二本鎖切断の修復に利用されたかどうかを決定するための、ＰＣＲに基づくアッセイを開発した。３組のプライマー対をＰＣＲ分析に使用した。第１のセットは、ＡＡＶ４１２の相同アームを有する領域を増幅するように設計された。この第１プライマーセット（表７において「内部ホモログアーム／ＣＡＲ領域」と称される）は相同領域内にあるので、ゲノムの非改変ＴＲＣ１−２認識配列座（３４９ｂｐ）、ＡＡＶ４１２ベクターインプット（２６０３ｂｐ）、又はＣＡＲ遺伝子が挿入されたＴＲＣ１−２認識配列（２６０３ｂｐ）のいずれかを増幅する。第２のプライマーセット（表７において「外側５’相同アーム」と称される）は、ＡＡＶ４１２ ＨＤＲ鋳型のＣＡＲ領域内にアニーリングする１つのプライマー、ＡＡＶ４１２ ＨＤＲ鋳型の５’相同アームの外側のヒトゲノムにアニーリングする１つのプライマーを含み、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列内にうまく挿入された場合にのみ、１８７２ｂｐの断片を増幅する。第３のプライマーセット（表７において「外側３’相同アーム」と称される）は、ＡＡＶ４１２ ＨＤＲ鋳型のＣＡＲ領域内にアニーリングする１つのプライマー、及びＡＡＶ４１２ ＨＤＲ鋳型の３’相同アームの外側のヒトゲノムにアニーリングする１つのプライマーを含む。第２のプライマーセットと同様に、第３のプライマーセットは、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列にうまく挿入された場合にのみ１１０７ｂｐの断片を増幅する。まとめると、３つ全てのプライマーセットによるＰＣＲ産物は、ＣＡＲ配列が細胞内に存在するかどうか（プライマーセット１）、及びそれがＴＲＣ１−２認識配列に挿入されているかどうか（プライマーセット２及び３）を示す。

【0341】

形質導入後４日目に、上記のＰＣＲプライマー対を使用して細胞を分析した。簡潔には、約３０００個の細胞を回収し、ペレット化し、溶解し、ＰＣＲを行って、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたかどうかを決定した。ＰＣＲ産物を、図２６に示すアガロースゲルにおいて分離した（レーンの説明は表７に示す）。レーン１〜３は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、擬似形質導入したサンプル由来のＰＣＲ産物である。

【0342】

予想通り、最初のプライマー対（「内部ホモログアーム／ＣＡＲ領域」）は、非改変ＴＲＣ１−２認識配列座を増幅し、レーン１に示される３４９ｂｐのバンドを生成した。レーン２及び３は、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列に挿入されている場合にのみ産物を生成するプライマー対に対応し、産物は示されていない。レーン７〜９は、擬似電気穿孔、及び擬似形質導入されたサンプルを表し、上述のＴＲＣ１〜２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡのみの対照と同じバンドを示す。レーン４〜６は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、ＡＡＶ４１２を形質導入されたサンプル由来のＰＣＲ産物を示す。レーン４は、第１のプライマー対（「内部ホモログ／ＣＡＲ領域」）により生成された２つのバンドを示し、ゲノムの非改変ＴＲＣ１−２認識配列座（３４９ｂｐ）及びＡＡＶ４１２ベクターインプット（２６０３ｂｐ）、又はＣＡＲ遺伝子が挿入されたＴＲＣ１−２認識配列（２６０３ｂｐ）の増幅を示す。レーン５及び６は、ＣＡＲ核酸配列がＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ認識部位に挿入されている場合にのみ、産物を増幅するプライマー対によって生成される産物を示す。両方のバンドは予測されるサイズ（それぞれ１８７２及び１１０７ｂｐ）である。レーン１０〜１２は、擬似電気穿孔し、ＡＡＶ４１２を形質導入したサンプルを表す。レーン１０は、第１プライマー対（「内部ホモログ／ＣＡＲ領域」）によって生成された２つのバンドを示し、ゲノムの非改変ＴＲＣ１−２認識配列座（３４９ｂｐ）及びＡＡＶ４１２ベクターインプット（２６０３ｂｐ）の増幅を示す。レーン１１及び１２は、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列に挿入されている場合にのみ産物を生成するプライマー対に対応し、産物は示されていない。レーン１１及び１２（相同アームの外側のプライマーを含む）にバンドが存在しないことは、レーン１０の２６０３ｂｐバンドがＡＡＶ４１２インプットの増幅から生成されたことを示す。

【0343】

まとめると、ＰＣＲ分析は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡ及びＡＡＶ４１２の両方が細胞中に存在する場合、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ認識部位に導入されることを明らかに実証している。従って、本発明者らは、ＡＡＶ４１２がＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入するのに使用できる適切なＨＤＲ鋳型を産生するのに役立つと結論する。

【0344】

第２の実験では、上記のようにヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞を刺激し、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを電気穿孔した後、直ちに漸増量のＡＡＶ４０８（０μＬ、３．１２５μＬ、６．２５μＬ、１２．５μＬ、又は約２５μＬ、これは約０、３．１２５ｅ^３、６．２５０ｅ^３、１．２５ｅ^４、及び２．５ｅ^４ウイルスゲノム／細胞に対応する）を形質導入した。対照として、細胞に擬似電気穿孔し、次に漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入した。更なる対照には、擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞、並びにＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次に擬似形質導入した細胞が含まれた。形質導入後４日目に、細胞を回収し、上記のように分析したが、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列に挿入されている場合にのみ産物を増幅するプライマー対のみを使用した。図２７に示すように、ＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて分離した。図２７Ａは、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列座に挿入されている場合にのみ、その遺伝子座の５’末端に産物を増幅する上記のプライマー対（「外側５’相同アーム」）を使用して生成されたＰＣＲ産物を示す。図２７Ｂは、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列座に挿入されている場合にのみ、その遺伝子座の３’末端に産物を増幅する上記のプライマー対（「外側３’相同アーム」）を使用して生成されたＰＣＲ産物を示す。レーンの説明は表８に示す。図２７Ａ及び２７Ｂの両方のレーン１〜５は、擬似電気穿孔又は擬似電気穿孔し、次いで擬似形質導入したサンプルを表す。擬似電気穿孔した細胞においてＰＣＲ産物を見ることはできず、ＡＡＶ４０８によって生成されたＨＤＲ鋳型が、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡの不在下でＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入できないことを示している。レーン６は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、擬似形質導入したサンプルを表す。ＰＣＲ産物を見ることはできず、ＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子が挿入されていないことを示している。レーン７〜１０は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入したサンプルを表す。各ＰＣＲの適切なサイズのバンドが明らかであり、これは、ＡＡＶ４０８がＴＲＣ１−２認識配列の修復のためのＨＤＲドナーを産生でき、ＣＡＲ遺伝子の挿入をもたらし得ることを示している。

【0345】

【表7】

【0346】

【表8】

【0347】

上記のＰＣＲベースのアッセイは、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたかどうかを決定するのに有用であるが、効率に関する情報を与えない。ＣＡＲ挿入の効率を決定するために、本発明者らは、デジタルＰＣＲベースのアッセイを開発した（図２８Ａに概略を示す）。このアッセイでは、２つのプライマーセットを使用する。第１のセットは、無関係の遺伝子配列を増幅し、鋳型数を制御する参照配列を供給する。第２のセットは、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２認識配列に挿入されている場合にのみ産物が増幅されるように、ＣＡＲ遺伝子内にアニーリングする１つのプライマーと３’相同アームの外側にアニーリングする１つのプライマーからなる。ＶＩＣ標識プローブは、第１のプライマーセットから生成されたアンプリコン内にアニーリングし、ＦＡＭ標識プローブは、第２のプライマーセットによって生成されたアンプリコン内にアニーリングする。ＦＡＭ標識プローブによって検出されたアンプリコンの数を、ＶＩＣ標識プローブによって検出された参照配列アンプリコンの数で割ることにより、ＣＡＲ遺伝子の挿入によって改変されたＴＲＣ１−２認識配列座のパーセントを正確に定量することが可能となる。

【0348】

図２８Ｂは、擬似電気穿孔し、次いで形質導入したサンプル、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで擬似形質導入したサンプル、又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入したサンプルのいずれかについてのデジタルＰＣＲの結果を示す。デジタルＰＣＲは、形質導入の約１週間後に細胞から単離したゲノムＤＮＡを用いて行った。図２７に記載されたＰＣＲからの観察と一致して、両方の対照サンプル（形質導入のみ、又は電気穿孔のみ）は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ認識配列に挿入されたＣＡＲ遺伝子が０％であったことが判明した。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入したサンプルは、約１．５％〜７％を有することが判明した。アッセイは２つの異なる機器（商標ＱＸ２００及びＱＳ３Ｄ）で実施され、このデジタルＰＣＲベースのアッセイの感度及び精度を実証する顕著な一致を示した。

【0349】

２．Ｔ細胞上の抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現
ＣＡＲの挿入が分子レベルで起こったかどうかを決定することに加えて、ＡＡＶ４０８をＨＤＲ鋳型として使用してＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入した細胞における抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを決定しようと努めた。更に、ＣＡＲのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ認識配列への挿入がＴ細胞受容体のノックアウトをもたらす効率を調べた。上記並びに図２７及び２８で分析したサンプルも、フローサイトメトリによってＣＡＲ及びＣＤ３の発現について分析した。形質導入の約４日後、細胞を抗ＣＤ１９ＣＡＲ（抗Ｆａｂ−Ａｌｅｘａ６４７）又はＣＤ３（ＣＤ３−ＢＢ５１５）を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図２９Ａは、Ｙ軸に抗ＣＡＲ標識を示し、Ｘ軸に抗ＣＤ３標識を示すフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔及び擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）は、圧倒的にＣＤ３^＋／ＣＡＲ⁻であった（右下の象限、９８．７％）。擬似電気穿孔し、次に漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思われ、ＣＤ３^＋／ＣＡＲ⁻集団は９８．８％、９９、９９％、及び９９．１％であった。従って、本発明者らは、ＡＡＶ４０８ウイルス単独では検出可能なレベルのＣＡＲ発現を駆動しておらず、Ｔ細胞受容体の発現を破壊することもできないと結論する。

【0350】

図２９Ｂは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔した後、擬似形質導入したサンプル、又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔した後、漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入した細胞のフローサイトメトリプロットを示す。電気穿孔し、次いで擬似形質導入した細胞は、４７．１％のＣＤ３⁻細胞を示し、Ｔ細胞受容体複合体の効率的なノックアウトを示す。抗ＣＤ１９ＣＡＲで標識したバックグラウンドは非常に低く、ＣＤ３⁻集団で０．６％、ＣＤ３^＋集団で０．７８％であった。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入したサンプルは、ＣＤ３⁻集団において２．０９％〜５．９％の範囲のＣＡＲ標識を示した。また、ＣＤ３^＋集団におけるＣＡＲ標識のわずかな増加もあり、１．０８％から１．９１％に及ぶ。本発明者らは、ＣＤ３^＋集団におけるＣＡＲ^＋細胞の増加の原因を特定しなかったが、ＣＡＲが非発現Ｔ細胞受容体対立遺伝子に挿入された可能性がある（Ｔ細胞受容体アルファ鎖の１つの対立遺伝子のみが発現され、Ｔ細胞受容体複合体へ組み込まれている）。

【0351】

これらのデータは、上記の定量的デジタルＰＣＲベースのアッセイとよく相関していた。例えば、ＡＡＶ４０８の最高ＭＯＩ（２．５ｅ^４ウイルスゲノム／細胞）において、デジタルＰＣＲアッセイは約６％のＣＡＲ挿入を示し、フローサイトメトリアッセイは５．９％のＣＡＲ^＋／ＣＤ３⁻細胞を示した。ＣＡＲ^＋／ＣＤ３^＋集団を考慮に入れると、このデータは、フローサイトメトリアッセイが示す約７．８％ＣＡＲ^＋はデジタルＰＣＲによる６％と比較していまだ全く同等である。

【0352】

実施例６；更なるＡＡＶベクターの特徴付け

【0353】

１．キメラ抗原受容体配列のＴＲＣ１−２認識配列への挿入
ＡＡＶベクターがＣＡＲ遺伝子をＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ認識配列に挿入するのに適したＨＤＲ鋳型を提供できることを示したので、本発明者らはＡＡＶベクターの構成を最適化しようと努めた。本発明者らは、ＴＲＣ１−２認識配列座及びＡＡＶ ＩＴＲに対する短い相同領域に隣接する、ＪｅＴプロモータによって駆動されるＣＡＲ遺伝子発現カセットを含む自己相補的ＡＡＶゲノムを作製するために使用できるベクターを作製した。このベクターはＡＡＶ４２１（図３０；配列番号１２３）と呼ばれる。自己相補的ＡＡＶのパッケージング能力が限られているため、短い相同アームが必要であった。更に、長い相同アーム及びＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、ＣＭＶプロモータによって駆動されるＣＡＲ遺伝子発現カセットを含む一本鎖ＡＡＶゲノムを作製するために使用できるベクターを作製した。このベクターはＡＡＶ４２２（図３１；配列番号１２４）と呼ばれる。一本鎖ＡＡＶゲノムはより大きなカーゴ容量を有するので、自己相補的ベクターよりも長い相同アームを利用することができた。

【0354】

ＡＡＶ４２１及びＡＡＶ４２２がＣＡＲ遺伝子のＴＲＣ１−２認識配列への挿入を標的とするのに有用であるかどうかを試験するために、上記と同様のいくつかの実験をヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞で行った。第１の実験では、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞（１ｅ^６細胞）に擬似電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２１若しくは４２２を形質導入するか、又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡ（２μｇ）を電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２１又はＡＡＶ４２２を形質導入するかのいずれかを行った。前述のＡＡＶ４０８による実験は、ＭＯＩが高いほどより効率的なＣＡＲ挿入をもたらすことを示唆したので、ＡＡＶ４２２ ＭＯＩは、上記の実験よりこの実験においてＡＡＶ４２１より有意に高かった（およそＭＯＩは１．２５ｅ^４、２．５ｅ^４、５ｅ^４、及び１ｅ^５ウイルスゲノム／細胞であった）。ＡＡＶ４２１ウイルスストックは、前述の実験より有意に高い力価を可能にするほど十分に濃縮されていなかった。対照として、細胞を電気穿孔（擬似又はＴＲＣ１〜２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡで）し、次いで擬似形質導入した。この実験の追加成分として、「大規模」条件を実施し、１０ｅ^６細胞（典型的な実験よりも１０倍多い）にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次いでＡＡＶ４２２（２．５ｅ^４ウイルスゲノム／細胞）を形質導入した）。最後に、本発明者らはまた、第１のウイルスストックと比較するために、ＡＡＶ４２１の第２のウイルスストックを試験した。

【0355】

ＣＡＲ遺伝子の挿入は、ＣＡＲ遺伝子がＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ認識配列に挿入されている場合にのみ産物を増幅するプライマー対を使用して、上記のようにＰＣＲによって決定した。ＰＣＲを、図３２Ａ及び３２Ｂに示されるアガロースゲルによって分離した（レーンの説明は、表９及び１０に示す）。図３２Ａのサンプル１には擬似電気穿孔し、次いで擬似形質導入し、サンプル２〜５には擬似電気穿孔し、次いでＡＡＶ４２１を形質導入した。ゲルは、これらのサンプルが全てＰＣＲ産物を生成せず、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡの不在下で、ＡＡＶ４２１がＣＡＲ遺伝子のＴＲＣ１−２認識配列への挿入を駆動できないことを示している。更に、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで擬似形質導入した対照サンプル（サンプル６）は、ＰＣＲ産物を示さなかった。図３２Ａのサンプル７〜１０には、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次に漸増量のＡＡＶ４２１を形質導入した。ゲルは、５’及び３’相同アームの両方を越えて伸長した産物のＰＣＲバンドを示し（各サンプル番号の下の２つのバンド）、ＣＡＲ遺伝子のＴＲＣ１−２認識配列への組み込みを実証している。最後に、図３２Ａにおいて、レーン１１及び１２は、それぞれ１ｅ^６又は１０ｅ^６細胞／サンプルのいずれかで開始した、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次いでＡＡＶ４２２を形質導入されたサンプルを表す。両方のＰＣＲバンド（相同アームが長いことを考慮して異なるプライマーが使用されたため、最初のセットのほうがより大きい）の存在は、ＣＡＲ遺伝子のＴＲＣ１−２認識配列への挿入が成功したことを示す。

【0356】

図３２Ｂのサンプル１には擬似電気穿孔し、次いで擬似形質導入し、サンプル２〜５には擬似電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入した。（表１０）。ゲルは、これらのサンプルが全てＰＣＲ産物を生成せず、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡの不在下で、ＡＡＶ４２２がＣＡＲ遺伝子のＴＲＣ１−２認識配列への挿入を駆動できないことを示している。図３２Ｂのサンプル７〜１０には、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次に漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入した。ゲルは、５’及び３’相同アームの両方を越えて伸長した産物のＰＣＲバンドを示し、ＣＡＲ遺伝子のＴＲＣ１−２認識配列への組み込みを実証している。最後に、サンプル１１は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで図３２Ａに示されるサンプルとは異なるウイルスストック由来のＡＡＶ４２１を形質導入したサンプルを表す。バンドの存在は、ＣＡＲ遺伝子のＴＲＣ１−２認識配列への挿入を示し、異なるウイルスストック間の再現性を裏付けている。まとめると、図３２は、ＡＡＶ４２１及びＡＡＶ４２２の両方が、ＣＡＲ遺伝子をＴＲＣ１−２認識配列に挿入するのに適したＨＤＲ鋳型を生成できることを明確に実証している。

【0357】

【表9】

【0358】

【表10】

【0359】

２．ＡＡＶ４２１を使用したＴ細胞上の抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現
ここでは、ＡＡＶ４２１を用いてＣＡＲ遺伝子をＴＲＣ１−２認識配列に挿入した細胞における、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを決定するよう努めた。上記及び図３２Ａで分析したサンプルも、フローサイトメトリによってＣＡＲ及びＣＤ３の発現について分析した。形質導入の約４日後、細胞を抗ＣＤ１９ＣＡＲ又はＣＤ３を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図３３Ａは、擬似電気穿孔し、ＡＡＶ４２１を形質導入した細胞と、擬似電気穿孔し、擬似形質導入した対照細胞とについてのフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔および擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）は、圧倒的にＣＤ３^＋／ＣＡＲ⁻であった（右下の象限、９８．８％）。擬似電気穿孔し、次に漸増量のＡＡＶ４２１を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思われ、ＣＤ３^＋／ＣＡＲ⁻集団は９８．８％、９８．６％、９８．８％、及び９７．９％であった。従って、本発明者らは、ＡＡＶ４２１ウイルス単独では検出可能なレベルのＣＡＲ発現を駆動しておらず、Ｔ細胞受容体の発現を破壊することもできないと結論づける。

【0360】

図３３Ｂは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔した後、擬似形質導入したサンプル、又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔した後、漸増量のＡＡＶ４２１を形質導入した細胞のフローサイトメトリプロットを示す。電気穿孔し、次いで擬似形質導入した細胞は、５６．７％のＣＤ３⁻細胞を示し、Ｔ細胞受容体複合体の効率的なノックアウトを示す。抗ＣＤ１９ＣＡＲで標識したバックグラウンドは非常に低く、ＣＤ３⁻集団で０．４８％、ＣＤ３^＋集団で０．３６％であった。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４１２を形質導入したサンプルは、ＣＤ３⁻集団において４．９９％〜１３．４％の範囲の有意な量のＣＡＲ標識を示した。また、ＣＤ３^＋集団におけるＣＡＲ標識のわずかな増加もあり、１．２７％から３．９５％に及ぶ。上記のように、ＣＡＲ遺伝子が非発現Ｔ細胞受容体対立遺伝子に挿入されている可能性がある。また、ＡＡＶ４０８を用いた実験とは対照的に、ＣＡＲ^＋集団はより高い平均蛍光強度で、より良好に定義され、ＪｅＦプロモータがｅＦ１αコアプロモータよりも高い発現を駆動することが示唆された。

【0361】

ＡＡＶ４２１をＴＲＣ１−ｘ．８７ＥＥと併せて使用するＣＡＲ遺伝子の挿入を評価する一方で、本発明者らはＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団を優先的に増殖及び濃縮させる方法を決定しようと努めた。上記及び図３３に示す実験から、本発明者らは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡ（２μｇ）を電気穿孔し、次いでＡＡＶ４２１（３．１３ｅ^４ウイルスゲノム／細胞）を形質導入した細胞を使用した。対照試料は、上記及び図３３に示す実験から採取した、擬似電気穿孔及び擬似形質導入、擬似電気穿孔及びＡＡＶ４２１の形質導入、又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥの電気穿孔及び擬似形質導入を行ったものであった。対照の濃縮及び増殖プロセスとして、これらの細胞を、ＩＬ−７及びＩＬ−１５（いずれも１０ｎｇ／ｍＬ）を補充した完全成長培地において６日間インキュベートした。次いで、細胞を抗ＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ３に対する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した（図３４Ａ）。擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は、ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋象限において低レベルのバックグラウンド染色を示した（０．１３％）。ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団は、擬似電気穿孔し、次いでＡＡＶを形質導入したサンプル、又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで擬似形質導入したサンプルにおいて本質的に同じであった（それぞれ０．１６％及び０．５５％）。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は５３．２％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ⁻集団を有し、図３３Ｂに示されたこの実験の最初の部分で染色された量に非常に近い（５６．７％）。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、ＡＡＶを形質導入した細胞は１２．６％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞を示し、図３３に示されるこれらの細胞の元の標識とほぼ同一であり（１３．４％）、ＩＬ−７とＩＬ−１５の混合物が、特異的ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞集団を濃縮又は増殖させるには不十分であることを実証した。

【0362】

次に、上記の４つのサンプルを、細胞表面上にＣＤ１９を提示するＩＭ−９細胞と共にインキュベートすることにより、抗原特異的様式でＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団を濃縮しようと努めた。ＩＭ−９細胞をマイトマイシンＣで前処理することによって不活性化し、１：１の比でサンプルと共に、ＩＬ−７及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で６日間インキュベートした。次いで、細胞を、ＣＤ３及び抗ＣＤ１９ＣＡＲに対する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した（図３４Ｂ）。擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は、ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋象限において低レベルのバックグラウンド染色を示した（０．２％）。ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団は、擬似電気穿孔し、次いでＡＡＶを形質導入したサンプルにおいて同じであり（０．２％）、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞においてわずかに高かった（１．２４％）。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ単独対照のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞の増加は、ＣＡＲ核酸がシステムに導入されていないため、バックグラウンドと見なされる。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は、４２．５％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ⁻集団を有し、増殖前（５６．７％、図３３）より有意に低く、ＣＤ^＋細胞がこのシステムにおいて増殖優位性を有し得ることを示唆している。しかし、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、ＡＡＶを形質導入した細胞は、４９．９％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞を示し、図３３に示すこれらの細胞の元の標識（１３．４％）と比較して劇的に増加し、ＩＬ−７及びＩＬ−１５の存在下におけるこのサンプルとＩＭ−９細胞とのインキュベーションが、ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団を濃縮及び増殖させるのに非常に有効であることを実証している。ＣＤ３^＋／ＣＡＲ^＋集団もまた同じ条件下で増殖させ、擬似電気穿孔／ＡＡＶ形質導入サンプル及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ電気穿孔／ＡＶ形質導入サンプルは、それぞれ２．５３％及び１５．３％のＣＤ３^＋／ＣＡＲ^＋を示す。

【0363】

ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、次いでＡＡＶ４２１を形質導入した細胞では、ＣＤ３−集団の２４．２％が増殖前にＣＡＲ^＋であった（図３３Ｂ）。ＩＬ−７及びＩＬ−１５を補充した培地中でのインキュベーション後、ＣＤ３⁻細胞の２５．３％がＣＡＲ^＋であり（図３４Ａ）、遺伝子ノックイン対遺伝子ノックアウトの比率は変化しなかったことが示された。しかし、ＩＬ−７及びＩＬ−１５に加えてＩＭ−９細胞と共にインキュベートした後、ＣＤ３⁻細胞の８０％以上（８０．３５％、図３４Ｂ）がＣＡＲ^＋であり、ＩＭ−９細胞とのインキュベーションが抗原特異的濃縮をもたらすことを実証している。

【0364】

マイトマイシン（ｍｉｔｏｃｍｙｉｎ）Ｃは細胞を非常に強力に活性化し、ＩＭ−９細胞は混合培養物中で長く生き残れないので、ＩＭ−９細胞の２回目の注入は更にＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞の濃縮を増加させる可能性があると推論した。上記及び図３４Ｂに示す細胞のいくつかを、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含有する培地において新鮮なＩＭ−９細胞（マイトマイシン（ｍｉｔｏｃｍｙｃｉｎ）Ｃで前処理）と混合し、更に６日間インキュベートした。次いで、細胞をＣＤ３及び抗ＣＤ１９ＣＡＲについて染色し、フローサイトメトリによって分析した（図３４Ｃ）。対照サンプルのいずれかにおけるＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞のパーセンテージは、ＩＭ−９細胞についての第１ラウンドの濃縮と比較して本質的に変わらなかった。

【0365】

しかし、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、ＡＡＶ４２１を形質導入した細胞は、ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞の有意な濃縮を示し、４９．９％（ＩＭ−９細胞とのインキュベーションの第１ラウンド後、図３４Ｂ）から６５．７％であった（図３４Ｃ）に増加した。重要なことに、ＣＤ３⁻集団の９３．７５％はＣＡＲ^＋であり、更なる抗原特異的増殖を示している。

【0366】

３．ＡＡＶ４２２を使用したＴ細胞上の抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現
本発明者らは、ＡＡＶ４２２を使用してＨＤＲ鋳型を提供する細胞（上記、ＰＣＲ結果は図３２Ｂに示す）からの抗ＣＤ１９ＣＡＲの発現も調べた。形質導入の約４日後、細胞を抗ＣＤ１９ＣＡＲ又はＣＤ３を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図３５Ａは、擬似電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入した細胞と、擬似電気穿孔し、擬似形質導入した対照細胞とについてのフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔および擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）は、圧倒的にＣＤ３^＋／ＣＡＲ⁻であった（右下の象限、９８．８％）。擬似電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思われ、ＣＤ３^＋／ＣＡＲ⁻集団は９８．６％、９８．６％、９８．９％、及び９８．４％であった。従って、本発明者らは、ＡＡＶ４２２ベクター単独では検出可能なレベルのＣＡＲ発現を駆動しておらず、Ｔ細胞受容体の発現を破壊することもできない。

【0367】

図３５Ｂは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔した後、擬似形質導入したサンプル、又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔した後、漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入した細胞のフローサイトメトリプロットを示す。電気穿孔し、次いで擬似形質導入した細胞は、５９．３％のＣＤ３⁻細胞を示し、Ｔ細胞受容体複合体の効率的なノックアウトを示す。抗ＣＤ１９ＣＡＲで標識したバックグラウンドは非常に低く、ＣＤ３⁻集団で１．４７％、ＣＤ３^＋集団で０．５２％であった。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入したサンプルは、ＣＤ３⁻集団において１４．７％〜２０．３％の範囲の有意な量のＣＡＲ標識を示した。また、ＣＤ３^＋集団におけるＣＡＲ標識のわずかな増加もあり、２．３％から２．７％に及ぶ。

【0368】

驚くべきことに、本発明者らはＡＡＶ４２２の存在下でＴ細胞受容体ノックアウト効率の顕著な増加を観察した。漸増ＡＡＶ４２２による全体のＣＤ３ノックアウト効率は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥの電気穿孔単独では５９．３％であったのに対し、７１．６％、７４．９％、７７．８％、及び７４．４％であった。対照的に、漸増ＡＡＶ４２１による全体のＣＤ３ノックアウト効率は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥの電気穿孔単独では５７．１８％であったのに対し、５６．９９％、５６．６２％、５７．４％、及び５５．４％であった（図３３Ｂ）。従って、一本鎖ＡＡＶゲノムの存在下でのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥの電気穿孔は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥヌクレアーゼの全体的なノックアウト効率の増加をもたらすが、自己相補的ＡＡＶゲノムの存在下ではもたらさないと思われる。この増加のために、ＣＡＲ^＋であるＣＤ３⁻細胞のパーセントは、ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞の数がより多いにもかかわらず、ＡＡＶ４２１及びＡＡＶ４２２で形質導入された細胞間で有意に異ならない。ＡＡＶ４２１を使用したＣＡＲ^＋のＣＤ３⁻細胞の最も高いパーセントは２４．１８％であり、（ＭＯＩ＝３．１３ｅ^４ウイルスゲノム／細胞）、これと比較してＡＡＶ４２２によるものは２６．４８％（ＭＯＩ＝１ｅ^５ウイルスゲノム／細胞）であった。この観察は、ＡＡＶ４２１とＡＡＶ４２２との間のＭＯＩの大きな差を考慮すると特に興味深い。

【0369】

この実験からの細胞を使用してＩＭ−９細胞を利用してＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞を特異的に濃縮する構想を試験した。この場合もまた、パネル全体を試験するのではなく、本発明者らは、擬似電気穿孔し、次いでＡＡＶ４２２を形質導入した細胞、又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、次いでＡＡＶ４２２（２．５ｅ^４ウイルスゲノム細胞）を形質導入した細胞のいずれかの濃縮のみを、新しい実験において試みた。図３６Ａは、形質導入後およそ４日目のフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔／形質導入細胞は、０．１３％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞のバックグラウンド染色を示した。これと比較して、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、ＡＡＶ４２２を形質導入した細胞は、４．４４％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞を示した。細胞を、上記のようにＩＬ−７及びＩＬ−１５の存在下でＩＭ−９細胞（マイトマイシンで前処理）と６日間インキュベートし、次いでフローサイトメトリによって分析した。図３６Ｂは、ＩＭ−９細胞とのインキュベーションが、ＡＡＶ４２２形質導入細胞中のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団を３５．８％まで劇的に増加したことを示す。ＣＡＲ^＋細胞は、濃縮前の６．６９％と比較して、全ＣＤ３⁻集団の４５．２％を構成する（図３６Ａ）。上記のように、本発明者らはまた、ＩＭ−９細胞の第２の添加により更に濃縮した（図３６Ｃ）。ＩＭ−９細胞を用いた２回のインキュベーションの結果、６５．１％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞が得られた。ＣＡＲ^＋細胞は全ＣＤ３⁻集団の７８．２５％を構成し、ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞の有意な抗原依存性濃縮を示している。

【0370】

これらのデータは、上記のデータと併せて、ＴＲＣ１−２認識配列に挿入された抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子を有していた細胞を、ＩＬ−７及びＩＬ−１５の存在下でＩＭ−９細胞とインキュベーションすることによりうまく濃縮することができ、わずか１２日の培養で９０％超がＣＡＲ^＋であるＣＤ３⁻集団をもたらし得ることを明確に実証している。

【0371】

４．一本鎖ＡＡＶベクターを使用した場合に観察されるノックアウト効率の増加
本研究では、一本鎖ＡＡＶベクターがＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥヌクレアーゼのノックアウト効率を増加させるという観察を追跡した。第１の実験では、細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ（２μｇ）を電気穿孔し、擬似形質導入又は漸増量のＡＡＶ４１２（６．２５ｅ^４、１．２５ｅ^４、２．５ｅ^４、又は５ｅ^４ウイルスゲノム／細胞）の形質導入のいずれかを行った。形質導入後４日目に、細胞をＣＤ３に対する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した（図３７Ａ）。擬似形質導入細胞では、２０．７％がＣＤ３⁻であり、これと比較して漸増ＡＡＶ４１２を形質導入した細胞では２１．６％、２３．７％、２５．５％、及び２５％であり、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのノックアウト効率はＡＡＶ４１２の存在下で最大２３％高い（２５．５％を２０．７％と比較）。

【0372】

このノックアウト効率の増加がヌクレアーゼ特異的であるかどうかを決定するために、更なる実験において、細胞に、β２−ミクログロブリン遺伝子を標的とするヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（２μｇ）を電気穿孔し、擬似形質導入又は漸増量のＡＡＶ４１２の形質導入のいずれかを行った。形質導入後４日目に、細胞をβ２−ミクログロブリンについて染色し、フローサイトメトリによって分析した（図３７Ｂ）。擬似形質導入細胞では、β２−ミクログロブリンノックアウト効率は６４．５％であり、漸増量のＡＡＶ４１２を形質導入した細胞では６８．６％、７０．７％、７７．２％、及び８２．５％に増加し、ノックアウト効率は最大２７．９％上昇した（８２．５％を６４．５％と比較）。

【0373】

平行した実験では、細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、擬似形質導入又はＡＡＶ４２２（ＡＡＶ４１２と同じＭＯＩを使用）を形質導入のいずれかを行った。細胞をＣＤ３に対する抗体で標識し、細胞をフローサイトメトリによって分析した（図３７Ｃ）。擬似形質導入細胞は６２．２％のＴ細胞受容体ノックアウトを示し、漸増量のＡＡＶによるものは、Ｔ細胞受容体ノックアウト頻度は７２．６％、７５．５％、７８．３％、及び７５．１％に増加した。ここで、ＡＡＶ４２２の存在は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのノックアウト効率を２５．８％増加させている（７８．３％を６２．２％と比較）。２つの異なるヌクレアーゼおよび２つの異なるＡＡＶベクターを使用して、これらの３つの実験の間で、ノックアウト効率のパーセント増加がほぼ同一であることは特筆すべきである。まとめると、これらのデータは、一本鎖ＡＡＶベクターによる細胞の形質導入が、ヌクレアーゼ又はＡＡＶカーゴとは無関係に、本発明者らのヌクレアーゼのノックアウト効率を増加させることを強く示している。

【0374】

５．抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の活性
上記の実験は、細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、直後に細胞にＡＡＶ４２１を形質導入することによるＣＡＲ Ｔ細胞の生成、及びＣＤ１９発現ＩＭ−９細胞と共培養することによって、これらの細胞をＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団に関して濃縮できることを明確に実証している。次に、これらのＣＡＲ Ｔ細胞の標的細胞に対する活性を調べた。第１の実験では、上記及び図３４Ｃに示す細胞を、ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞又はＣＤ１９−Ｕ９３７細胞のいずれかが標的集団であるＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに用いた。図３８Ａに示すように、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞をＵ９３７細胞と共にインキュベートした場合、それらは標的：エフェクター比にかかわらずＩＦＮ−γを分泌しなかった。しかし、ＣＡＲ Ｔ細胞をＲａｊｉ細胞と共にインキュベートすると、高レベルのＩＦＮ−γ分泌が用量依存的に起こり、ＩＦＮ−γの分泌が抗原特異的であることが示された。

【0375】

これらのＣＡＲ Ｔ細胞を、ルシフェラーゼ標識Ｒａｊｉ細胞を標的とする細胞死滅アッセイにも使用した。簡潔には、ＣＡＲ Ｔ細胞をルシフェラーゼ標識Ｒａｊｉ細胞と共に１０：１の比でインキュベートした。いくつかの時点で、細胞を洗浄し、溶解して、何個の細胞が残っているかの尺度としてルシフェラーゼ活性を測定した。対照細胞は、５５００任意単位を超えるルシフェラーゼ活性を示した（図３８Ｂ）。２時間、３時間、４時間、及び５時間の共インキュベーションにより、ルシフェラーゼ活性はそれぞれ４５９８、３２９２、２７５０、及び１９３２任意単位まで減少した。従って、共インキュベーションの５時間以内に、ルシフェラーゼ活性は約６５％低下し、ＣＡＲ Ｔ細胞の強力な細胞溶解活性を示した。

【0376】

まとめると、これらのデータは、本明細書に記載の方法に従って作製した抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞がＣＤ１９^＋細胞を死滅させるために有効であることを実証している。

【0377】

実施例７；線形化プラスミドＤＮＡ

【0378】

１．線形化プラスミドＤＮＡからのキメラ抗原受容体の発現
ＡＡＶによって生成されるＨＤＲ鋳型は線形ＤＮＡ分子であるので、任意の供給源由来の線形ＤＮＡが、ＣＡＲ遺伝子をＴＲＣ１−２認識配列に挿入するのに適したＨＤＲ鋳型であり得ると仮定した。これを試験するために、本発明者らは、ＴＲＣ１−２認識配列座に相同である相同アームに隣接する抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子を含むいくつかのプラスミドを作製した。いくつかのプラスミドでは異なるプロモータが使用され、相同アームは、自己相補的なＡＡＶベクターを模倣する「短い」（５’相同アームで２００ｂｐ及び３’相同アームで１８０ｂｐ）又は一本鎖ＡＡＶベクターを模倣する「長い」（５’相同アームで９８５ｂｐ及び３’相同アームで７６３ｂｐ）のいずれかであった。短い相同アームを有するプラスミドは「ｐＤＳ」と名付け、長い相同アームを有するものは「ｐＤＩ」と名付けた。更にいくつかのプラスミドは、ＣＡＲ遺伝子の上流にイントロンを含んでいた。

【0379】

ＣＡＲドナープラスミドをベクター骨格の制限部位において線形化し、ゲル精製した。ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞に、線形化されたＣＡＲドナープラスミド単独（精製された線状化プラスミドの濃度に応じて５００ｎｇ〜１０００ｎｇの量が変化する）を電気穿孔するか、又はＴＲＣ １−２．８７ＥＥｍＲＮＡ（２μｇ）と共電気穿孔した。対照として、細胞に擬似電気穿孔又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ単独の電気穿孔を行った。図３９のグラフには、全ての電気穿孔ンの説明を表示している。電気穿孔の約４日後、細胞を、ＣＤ３及び抗ＣＤ１９ＣＡＲに対する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した（図３９）。図３９Ａは、０．１５％のバックグラウンドＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋染色を示す。バックグラウンドＣＤ３^＋／ＣＡＲ^＋染色は４．３１％で異常に高かったことに留意すべきである。図３９Ｂは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡ単独を電気穿孔した細胞を示し、６０．８％のＣＤ３ノックアウトを実証している。図３９Ｃ及び３９Ｄは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡと、ＥＦ１αコアプロモータ及びＨＴＬＶエンハンサーを有する長い相同アームベクター又はＥＦ１αコアプロモータを有する短い相同アームベクター（エンハンサーを有さない）のいずれかとを、共電気穿孔したサンプルを示す。興味深いことに、ＥＦ１αコアプロモータのみを有する線形化ＣＡＲドナーは、２．３８％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団を生成したが、ＥＦ１αコアプロモータ及びＨＴＬＶエンハンサーを有するベクターは、有意なパーセンテージのＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞を生成しなかった。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡの不在下でこれらの２つのベクターを電気穿孔した細胞は、ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団の有意な増加を示さなかった（図３９Ｅ及び３９Ｆ）。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥの存在下でのＥＦ１αコアプロモータベクターによるＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団の増加は、線形化プラスミドがＴＲＣ１−２認識配列における二本鎖切断を修復するためのＨＤＲ鋳型として機能できることを示唆した。

【0380】

図３９Ｇ及び３９Ｈは、両方ともＣＡＲの発現を駆動するＭＮＤプロモータを含む２つの長い相同アーム構築物を示す。図３９Ｇに示すこれらの構築物の１つは、ＣＡＲ遺伝子の５’末端にイントロンも含む。驚くべきことに、ＭＮＤプロモータ及びイントロンを有する長い相同アームプラスミドは、有意なＣＡＲ発現を示したが（図３９Ｇ、４．１４％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋）、一方、イントロンレス構築物（図３９Ｈ）は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを共電気穿孔した場合に検出可能なＣＡＲ発現を示さなかった。ＭＮＤプロモータを有するが、イントロンを有さない短い相同アームプラスミドもＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを用いて試験して、ＣＡＲ発現は実証されなかった（図３９Ｉ）。ＭＮＤプロモータ含有構築物はいずれもＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡの不在下ではいずれのＣＡＲ^＋細胞も生成しなかった（図３９Ｊ、３９Ｋ、及び３９Ｌ）。

【0381】

最後にこの実験では、ＣＡＲの発現を駆動するＪｅＴプロモータを含んだ短い相同アーム構築物及びＣＡＲの発現を駆動するＣＭＶプロモータを有する「長い」相同性アーム構築物を試験した。単独では、これらの線形化プラスミドのいずれも有意なＣＡＲ^＋細胞をもたらさなかった（図３９Ｏ及び３９Ｐ）。細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを共電気穿孔した場合、ＪｅＴ含有構築物は２．６９％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞を示し、ＣＭＶ含有構築物は２．７％のＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋細胞を生じた。

【0382】

図３９に示すフロープロットは、相同アームに隣接する、ＣＡＲをコードする線形化プラスミドＤＮＡが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥによって引き起こされるＤＮＡ切断を修復するためのＨＤＲ鋳型として機能し、ＣＡＲ核酸の挿入をもたらすことを明確に実証している。プロモータ強度がＣＡＲの発現において重要な役割を果たし、遺伝子中にイントロンが存在する場合、いくつかのプロモータがより効率的な発現を駆動することは明らかである。

【0383】

線形化ＤＮＡ構築物を使用したＣＡＲの挿入がＴＲＣ１−２認識配列座に特異的であることを確認するために、本発明者らはＣＡＲ内および相同アームの外側に位置するプライマーを使用して上記のように細胞を分析した（図４０、表１１）。サンプル１及び２は、擬似電気穿孔又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡのみの電気穿孔のいずれかを行った細胞由来のＰＣＲ産物である。上記の結果と一致して、ＰＣＲバンドは存在せず、ＴＲＣ１−２認識部位におけるＣＡＲ遺伝子の欠落を示す。サンプル３、４、及び５は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ及び線形化ＣＡＲ相同プラスミドを共電気穿孔した細胞に由来する（サンプル名は図４０のものである）。各サンプルは、ＣＡＲ遺伝子発現カセットのＴＲＣ１−２認識部位への挿入を示す予測サイズの２つのＰＣＲバンドを示す。サンプル６、７、及び８は、サンプル３、４、及び５と同じ線形化ＣＡＲ相同プラスミドを電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは含まない細胞に由来する。予想どおり、ＰＣＲバンドは存在しない。サンプル９及び１０は、擬似電気穿孔又はＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡのみの電気穿孔のいずれかを行った細胞由来のＰＣＲ産物であり、ＰＣＲバンドは示していない。サンプル１１、１２、１３、及び１４は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ及び線形化ＣＡＲ相同プラスミドを共電気穿孔した細胞に由来する（サンプル名は図４０のものである）。各サンプルは、ＣＡＲ遺伝子のＴＲＣ１−２認識部位への挿入を示す予測サイズの２つのＰＣＲバンドを示す。試料１５、１６、１７、及び１８は、サンプル１１、１２、１３、及び１４と同じ線形化ＣＡＲ相同プラスミドを電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは含まない細胞に由来する。予想どおり、ＰＣＲバンドは存在しない。

【0384】

図３９及び４０は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡ及び線形化ＣＡＲ相同プラスミドをヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞に共電気穿孔することが、ＣＡＲ遺伝子をＴＲＣ１−２認識配列に挿入する有効な方法であることを明確に実証している。

【0385】

【表11】

【0386】

実施例８；更なるＡＡＶベクターの特徴付け

【0387】

１．ＪｅＴプロモータ及び長い相同アームを有するＡＡＶの使用
まとめると、上記のデータは、ＪｅＴプロモータを利用するベクターが、ＣＡＲの高い一貫した発現を駆動し、相同アームが長いほど遺伝子挿入効率を上昇させ得ることを示す。本発明者らは、長い相同アーム及び抗ＣＤ１９ＣＡＲの発現を駆動するＪｅＴプロモータを有する一本鎖ＡＡＶ（本明細書ではＡＡＶ４２３）を作製するために使用される、図４１に示すベクター（配列番号１２５）を設計し、作製した。ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した。上記のデータが、ＭＯＩが高いほど挿入効率を上昇させ得ることを示唆したので、本発明者らは１．８７５ｅ^４から１．５ｅ^５の範囲の力価を使用した。対照として、細胞に、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで擬似形質導入するか、又は擬似電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した。形質導入の約６日後、細胞をＣＤ３又は抗ＣＤ１９ＣＡＲを認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図４２に示されるように、擬似電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した細胞は、圧倒的にＣＤ３^＋／ＣＡＲ⁻（９６．６％〜９８．５％の範囲）である。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は、ＣＤ３⁻が３９％であり、Ｔ細胞受容体の効率的なノックアウトを示した。これらの細胞において、バックグラウンドＣＡＲ染色は非常に低かった（約２％）。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した細胞は、ＣＤ３のノックアウトと併せて劇的なＣＡＲ染色を示した。ＣＤ３⁻／ＣＡＲ^＋集団は２１．６％から２２．７％の範囲であり、一方ＣＤ３^＋／ＣＡＲ^＋集団は約２％であった。上記のように、一本鎖ＡＡＶの存在は、ＴＲＣ１−２認識部位での全体の遺伝子改変効率を増加させ、総ＣＤ３−集団は、対照細胞における４１．４４％から電気穿孔し後、次いで漸増量のＡＶ４２３を形質導入した細胞における５７．６％、５９．２％、５８．７％、及び５６．１％に増加した。ＣＡＲ^＋であるＣＤ３⁻細胞のパーセントは、３７．５％から３９．９％の範囲であり、上記のデータと比較して挿入効率の劇的な増加を示した。

【0388】

ＡＡＶ４２３を使用したＣＡＲの挿入がＴＲＣ１−２認識配列座に特異的であることを確認するために、本発明者らはＣＡＲ内及び相同アームの外側に位置するプライマーを使用して上記のように細胞を分析した（図４３、表１２）。

【0389】

【表12】

【0390】

サンプル１及び２は、擬似電気穿孔した細胞由来のＰＣＲ産物である。上記の結果と一致して、ＰＣＲバンドは存在せず、ＴＲＣ１−２認識部位におけるＣＡＲ遺伝子の欠落を示す。サンプル３〜６は、擬似電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した細胞に由来する。上記の結果と一致して、ＰＣＲバンドは存在していない。サンプル７は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで擬似形質導入した細胞に由来し、ＰＣＲバンドを示さない。サンプル８〜１１は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、次いで漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した細胞に由来し、ＣＡＲがＴＲＣ１−２認識配列に挿入された場合に予想されるＰＣＲバンドを示している。

【0391】

切断後にＣＡＲ配列をＴＲＣ１−２認識部位に挿入するＡＡＶ４２３の能力を考えると、ＡＴＲＣ１−２認識部位に組み込まれて、抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードすることができる線形化ＤＮＡ鋳型をＴ細胞にトランスフェクトすることができるように、ＡＶ４２３プラスミド（図４１）が１種の制限酵素による消化で線形化され、１又は複数の制限酵素による消化で細胞に送達され得ることがさらに想定される。

【0392】

実施例９；抗ＣＤ１９ ＴＣＲ−陰性ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ有効性

【0393】

１．播種性Ｂ細胞リンパ腫のマウスモデル
遺伝子編集抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を、播種性Ｂ細胞リンパ腫のマウスモデルにおいて評価した。上記のように活性化Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡを電気穿孔し、次にＪｅＴプロモータにより駆動され、相同アームに隣接する抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現カセットを含むＡＡＶ６ベクターを形質導入した。ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）と共に５日間培養した後、細胞表面のＣＤ３及び抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現について、細胞を、以前に記載したようにフローサイトメトリによって分析した（図４４Ａ）。ＣＤ３−細胞を、抗ＣＤ３磁気ビーズを使用してＣＤ３^＋細胞を枯渇させることにより濃縮した。次いで枯渇した細胞をＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ）中で３日間培養し、ＣＤ３及び抗ＣＤ１９ＣＡＲの細胞表面発現について再分析した（図４４Ｂ）。ＣＤ３⁻集団の単離は非常に効率的であり、ＣＤ３^＋細胞の枯渇後にフローサイトメトリによって測定して９９．９％の純度を得た（図４４Ｂ）。精製されたＣＤ３−集団は、５６％のＣＤ４^＋及び４４％のＣＤ８^＋細胞を含み（図４４Ｃ）、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯに対する染色によって決定される、セントラルメモリー、移行性メモリーの表現型を主に有していた（図４４Ｄ）。

【0394】

Ｒａｊｉ播種性リンパ腫モデルを利用する研究は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）によって実施された。ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）４４を安定に発現するＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞を、２．０×１０^５細胞／マウスの用量で、１日目に５〜６週齢の雌ＮＳＧマウスに静脈注射した。４日目に、ＰＢＳ、又は同じ健康なドナーＰＢＭＣから調製された遺伝子編集された対照ＴＣＲ ＫＯ Ｔ細胞を含有するＰＢＳ、又は同じドナーから調製されたＣＡＲ Ｔ細胞の表示の用量を含有するＰＢＳを、マウスに静脈注射した。表示の日に、生存マウスにルシフェリン基質（１５０ｍｇ／ｋｇ生理食塩水）を腹腔内注射し、麻酔し、７分後にＩＶＩＳ ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア４．５．１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してデータを分析し、エクスポートした。発光信号強度は、ｐ／秒／ｃｍ^２／ｓｒの輝度で表される。

【0395】

２．結果
図４５に示すように、ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞の成長は、８日目までに全てのマウスにおいて低レベルが明らかであり、１１日目までに未処置及びＴＣＲ−対照群で有意に増加した。対照群では、有意な腫瘍成長が１５日目まで観察され、１８日目又は１９日目までに全ての対照群を安楽死させた。対照的に、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスの群は全て、１１日目までに腫瘍成長の兆候を示さず、低用量群の単一のマウスを除いて、試験の２９日まで依然として腫瘍が生じないままであった。腫瘍再成長は、３６日目あたりで低用量コホートにおいて３匹のマウスで観察された。３匹のうちの１匹は４２日目に死亡したが、画像化によりこの動物では低レベルの腫瘍しか認められなかったため、死亡が腫瘍関連であるとは考えにくい。

【0396】

３．結論
これらの結果は、遺伝子編集されたＣＤ３−ＣＡＲ Ｔ細胞によるＣＤ１９^＋腫瘍細胞のインビボクリアランスの明確な証拠を提供し、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法のためのこのプラットフォームの更なる前臨床開発を支援する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29-1】

【図29-2】

【図30】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【図33-1】

【図33-2】

【図34-1】

【図34-2】

【図34-3】

【図35-1】

【図35-2】

【図36】

【図37-1】

【図37-2】

【図37-3】

【図38】

【図39-1】

【図39-2】

【図39-3】

【図40】

【図41】

【図42-1】

【図42-2】

【図43】

【図44】

【図45】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]