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特許6816885リパーゼ活性測定用基質溶液並びに試料中のリパーゼ活性の測定方法及び測定試薬

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6816885

(24)【登録日】2020年12月28日

(45)【発行日】2021年1月20日

(54)【発明の名称】リパーゼ活性測定用基質溶液並びに試料中のリパーゼ活性の測定方法及び測定試薬

(51)【国際特許分類】

C12Q 1/44 20060101AFI20210107BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/44

【請求項の数】6

【全頁数】64

(21)【出願番号】特願2017-524864(P2017-524864)

(86)(22)【出願日】2016年6月17日

(86)【国際出願番号】JP2016068116

(87)【国際公開番号】WO2016204276

(87)【国際公開日】20161222

【審査請求日】2019年6月6日

(31)【優先権主張番号】特願2015-124010(P2015-124010)

(32)【優先日】2015年6月19日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000131474

【氏名又は名称】株式会社シノテスト

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】飯塚直美

(72)【発明者】

【氏名】引地篤

【審査官】野村英雄

(56)【参考文献】

【文献】特開２００２−２１４２３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０９−２１５５００（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１１−３１８４９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０９−１５４５９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／０９２９８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／０２４５４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】宇治義則、外２名，「新しい基質レゾルフィンを用いた血清膵リパーゼ測定法」，胆と膵，２００２年，Vol.23, No.6，P.455-459

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ１／００−３／００

Ｃ１２Ｎ９／００−９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液。

【請求項2】

１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定試薬。

【請求項3】

１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して、試料中のリパーゼ活性を測定することを特徴とする、試料中のリパーゼ活性の測定方法。

【請求項4】

１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液。

【請求項5】

１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とする、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として用いるリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法。

【請求項6】

１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とする、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液であって、その保存安定性が優れたリパーゼ活性測定用基質溶液に関するものである。
また、本発明は、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための試薬であって、その保存安定性が優れたリパーゼ活性の測定試薬に関するものである。
また、本発明は、試料中のリパーゼ活性の測定のための方法であって、長期間正確な測定値を得ることができる試料中のリパーゼ活性の測定方法に関するものである。
また、本発明は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、その保存安定性が優れた当該ミセル粒子からなるエマルジョン溶液に関するものである。
また、本発明は、リパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法であって、リパーゼ活性測定用基質溶液の保存安定性を改善する方法に関するものである。
また、本発明は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法であって、当該ミセル粒子からなるエマルジョン溶液の保存安定性を改善する方法に関するものである。

【0002】

本発明は、臨床検査などの生命科学分野、及び分析化学などの化学分野等において有用なものである。

【背景技術】

【0003】

血清又は血漿中のリパーゼ活性は、急性膵炎、慢性膵炎又は膵臓癌等の膵疾患において上昇することから、これらの膵炎等のマーカーとして有用なものである。
このリパーゼは、長鎖脂肪酸の３分子がそれぞれグリセロールにエステル結合したトリグリセライド（ＴＧ）のα位（１位、３位）のエステル結合を加水分解して、２分子の脂肪酸及び１分子のβ−モノグリセライドを生成する反応を触媒する酵素である。
この１分子のβ−モノグリセライドは、α型に異性化され、これがリパーゼの作用を受けて加水分解されてグリセロールと脂肪酸とになる。

【0004】

血清又は血漿中のリパーゼ活性の測定方法としては、次のような方法が知られていた（非特許文献１及び非特許文献２参照。）。
例えば、オリーブ油のエマルジョンをリパーゼの基質として用い、このオリーブ油のエマルジョンを血清試料等と接触させ、３７℃で２４時間反応させた後、リパーゼによる加水分解反応により生成した脂肪酸をアルカリで滴定するＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒａｎｄａｌｌの方法が知られていた。
しかし、この方法は反応時間が長く、測定しようとするリパーゼの不活性化や反応阻害が著しい方法であった。

【0005】

また、トリオレイン又はオリーブ油のエマルジョンをリパーゼの基質として用い、このトリオレイン又はオリーブ油のエマルジョンを血清試料等と接触させ、反応させて、リパーゼによる乳化ミセルの加水分解反応にともなって起こる反応液の濁度の減少からリパーゼ活性を測定するＶｏｇｅｌ−Ｚｉｅｖｅ法及びこの変法が知られていた。
しかし、これらの方法は、血清蛋白による阻害やリウマチ因子による凝集塊の干渉を受け、均一かつ安定なエマルジョンを作るのが難しく、再現性に乏しいという短所を有する方法であった。

【0006】

また、ＢＡＬＢ（２，３−ジメルカプト−１−プロパノール三酪酸）をリパーゼの基質として用い、このＢＡＬＢを血清試料等と接触させ、反応させて、リパーゼによる加水分解反応により生成したＢＡＬ（２，３−ジメルカプト−１−プロパノール）をＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸）と反応させて、生じたＴＮＢアニオンの黄色の発色を４１２ｎｍで測定することによってリパーゼ活性を測定する方法が知られていた。
しかし、この方法は、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル（プローブ）を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。

【0007】

また、天然型基質である１，２−ジリノレオイルグリセロールをリパーゼの基質として用い、この１，２−ジリノレオイルグリセロールを血清試料等と接触させ、反応させて、リパーゼによる加水分解反応により生成したリノール酸が、コエンザイムＡ、ＮＡＤ^＋及びＡＴＰの存在下で、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ−３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ複合酵素の共同作用によってβ−酸化を受ける際に起こるＮＡＤＨの生成速度を測定することによってリパーゼ活性を測定する方法が知られていた。
しかし、この方法も、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル（プローブ）を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。

【0008】

前記の各測定方法に加えて、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［以下、「ＤＧＧＭＲ」ということがある］をリパーゼの基質として用いる血清又は血漿中のリパーゼ活性の測定方法が開発された（特許文献１及び非特許文献２参照。）。
この方法では、この１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］を血清試料等と接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成する。
このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。
このＤＧＧＭＲをリパーゼの基質として用いるリパーゼ活性の測定方法は、測定が一連の反応で進むシンプルなものであり、かつ他の測定試薬から反応セル又はノズル（プローブ）を介して混入するエステラーゼの影響を受けにくいという長所を有する方法である。

【0009】

また、血清又は血漿等に含まれるリパーゼは、エマルジョン化したトリグリセライド基質の水と油との界面で最も効率よく作用し、このリパーゼの反応速度は分散した基質の表面積に関係するので、このリパーゼの活性測定には安定で均一なミセル粒子からなる基質の調製が重要であるとされている（非特許文献２参照。）。
このため、従来、リパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液（リパーゼ活性測定用基質溶液）を製造するに当っては、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化（乳化）した基質溶液となるよう、種々の方法が考えられてきたが、基質を界面活性剤を含む水溶液に混合したり、基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、基質含有液を溶液に噴射注入したり、基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又は基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理が必要であったり、又は特別な装置若しくは器具などの物等が必要であった。

【0010】

ところで、リパーゼ活性測定用基質を含有する溶液は一般に不安定であり、その保存安定性に問題があった。
このため、リパーゼ活性測定用基質を含有する溶液の保存安定性の改善を目的として種々の試みが行われた。

【0011】

例えば、リパーゼの基質となるトリグリセライド等の非水溶性物質を非イオン性界面活性剤を含む水溶液に加え、撹拌しながら加熱し、一度非イオン性界面活性剤の曇点より高い温度に上げ、更に撹拌を続けながら曇点以下に冷却することを特徴とする、非水溶性物質の透明な可溶化水溶液の製造方法が、従来困難であった非水溶性物質の可溶化を可能にし、しかも得られる可溶化水溶液は極めて安定であるとの効果を奏するものとして開示された（特許文献２参照。）。

【0012】

また、低濃度のｐＨ緩衝液、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液が、長期保存安定性に優れたジグリセリドの水溶液を提供すること等が可能であるとの効果を奏するものとして開示された（特許文献３参照。）。

【0013】

また、少なくともポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤等の非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質として用いることを特徴とする植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物が、長期保存安定性に優れたジグリセリドの水溶液を含有するキット、組成物の提供が可能になる等の効果を奏するものとして開示された（特許文献４参照。）。

【0014】

また、前記のＤＧＧＭＲよりなるリパーゼ基質等に対して、新規なリパーゼ基質可溶化剤である１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンにより可溶化した酵素活性測定用リパーゼ基質溶液等が、保存安定性が大きく、溶液の高い透明度を長期間にわたって保持することも可能であるとの効果を奏するものとして開示された（特許文献５参照。）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0015】

【特許文献1】特開昭６１−２５４１９７号公報

【特許文献2】特開昭５８−１５６３３０号公報

【特許文献3】国際公開第０６／０５４６８１号パンフレット

【特許文献4】特開２００７−３０６８２１号公報

【特許文献5】特開平１１−３１８４９４号公報

【非特許文献】

【0016】

【非特許文献1】臨床検査法提要，第３０版，第６７０頁〜第６７４頁，金井正光編著，金原出版，１９９３年８月２０日発行

【非特許文献2】臨床検査法提要，第３３版，第５４５頁〜第５４７頁，金井正光監修，金原出版，２０１０年４月１日発行

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

前記の通り、特許文献５には、リパーゼ活性測定用基質としてＤＧＧＭＲを使用する場合に、新規なリパーゼ基質可溶化剤である１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを共に含有させた酵素活性測定用リパーゼ基質溶液においては、その保存安定性が大きいということが記載されていたが、この１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンは高価であり、当該基質溶液の原料費が高くなってしまうという欠点があった。

【0018】

これに対して、本発明の課題は、前記の通りリパーゼ活性測定用基質として使用する場合に種々の長所を有するＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含有するリパーゼ活性測定用基質溶液であって、その保存安定性が優れたリパーゼ活性測定用基質溶液を提供することである。
また、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含有するリパーゼ活性測定用基質溶液を含むリパーゼ活性の測定試薬であって、その保存安定性が優れたリパーゼ活性の測定試薬を提供することである。
また、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含有するリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法であって、長期間正確な測定値を得ることができる試料中のリパーゼ活性の測定方法を提供することである。
また、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲ等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、その保存安定性が優れた当該ミセル粒子からなるエマルジョン溶液を提供することである。
また、本発明の課題は、リパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法であって、リパーゼ活性測定用基質溶液の保存安定性を改善する方法を提供することである。
また、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲ等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法であって、当該ミセル粒子からなるエマルジョン溶液の保存安定性を改善する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明者らは、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含有するリパーゼ活性測定用基質溶液の保存安定性を改善する方法、及びＤＧＧＭＲよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液を安定化する方法等について検討を重ねたところ、ＤＧＧＭＲと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0020】

本発明の要旨は以下の通りである。
［１］１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液。
［２］１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定試薬。
［３］１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して、試料中のリパーゼ活性を測定することを特徴とする、試料中のリパーゼ活性の測定方法。
［４］１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液。
［５］１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とする、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として用いるリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法。
［６］１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とする、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法。

【発明の効果】

【0021】

本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、その保存安定性が優れたリパーゼ活性測定用基質溶液である。
また、本発明のリパーゼ活性の測定試薬は、その保存安定性が優れたリパーゼ活性の測定試薬である。
また、本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法は、長期間正確な測定値を得ることができる方法である。
また、本発明のＤＧＧＭＲ等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液は、その保存安定性が優れたエマルジョン溶液である。
また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法は、リパーゼ活性測定用基質溶液の保存安定性を改善することができる方法である。
また、本発明のＤＧＧＭＲ等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法は、当該エマルジョン溶液の保存安定性を改善することができる方法である。

【0022】

上記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液、リパーゼ活性の測定試薬、及びエマルジョン溶液、並びに本発明の各方法により、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含有するリパーゼ活性測定用基質溶液、当該リパーゼ活性測定用基質溶液を含むリパーゼ活性測定試薬、及びＤＧＧＭＲ等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液を、それぞれ長期間安定に使用することが可能になったため、これらの物の使用者にとっては至便なものであり、また、コスト的にもメリットが大きいものである。

【0023】

また、上記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液、リパーゼ活性の測定試薬、及びエマルジョン溶液、並びに本発明の各方法により、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含有するリパーゼ活性測定用基質溶液、当該リパーゼ活性測定用基質溶液を含むリパーゼ活性測定試薬、及びＤＧＧＭＲ等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液を、それぞれ長期間安定に使用することが可能になったため、長期間正確な測定結果（測定値）を提供するリパーゼ活性測定用基質溶液及びこれを含むリパーゼ活性測定試薬等を医療機関等が入手可能となった。そして、試料中のリパーゼ活性の正確な測定結果（測定値）を、医療機関等において長期間取得可能となった。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた混合液の吸収曲線を示した図である。

【0025】

【図2】保存した対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた混合液の吸収曲線を示した図である。

【0026】

【図3】本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液及び対照市販試薬の基質液それぞれにおける保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率を示した図である。

【0027】

【図4】本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液及び対照市販試薬の基質液それぞれにおける保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率を示した図である。

【0028】

【図5】本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液及び対照市販試薬の基質液それぞれにおける保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率を示した図である。

【0029】

【図6】本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液及び対照市販試薬の基質液それぞれにおける保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率を示した図である。

【0030】

【図7】保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の分布を示した図である。

【0031】

【図8】保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の分布を示した図である。

【0032】

【図9】保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の分布を示した図である。

【0033】

【図10】保存した本発明のリパーゼ活性測定試薬により試料中のリパーゼ活性の測定を行った結果を示した図である。

【0034】

【図11】保存した本発明のリパーゼ活性測定試薬により試料中のリパーゼ活性の測定を行った結果を示した図である。

【0035】

【図12】保存した本発明のリパーゼ活性測定試薬により試料中のリパーゼ活性の測定を行った結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0036】

〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液
Ｉ．総論
１．リパーゼ活性測定用基質溶液
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とするものである。

【0037】

そして、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、上記の構成により、その保存安定性が優れたものである。

【0038】

２．リパーゼ
本発明において、リパーゼは、リパーゼとしての活性、すなわちリパーゼ活性を有するものであればよく、このリパーゼ活性を有するものであれば特に限定はない。

【0039】

本発明において、リパーゼとしては、例えば、長鎖脂肪酸の３分子がそれぞれグリセロールにエステル結合したトリグリセライド（ＴＧ）のα位（１位、３位）のエステル結合を加水分解して、２分子の脂肪酸及び１分子のβ−モノグリセライドを生成する反応を触媒する膵リパーゼ［ＥＣ３．１．１．３］等を挙げることができる。

【0040】

本発明は、体液、臓器又は組織に存在するリパーゼの活性測定にとって好適であり、体液に存在するリパーゼの活性測定にとってより好適であり、血液、血清又は血漿に存在するリパーゼの活性測定にとって更に好適であり、血清又は血漿に存在するリパーゼの活性測定にとって特に好適である。

【0041】

また、本発明は、膵リパーゼの活性測定にとって好適である。

【0042】

３．試料
本発明において、リパーゼの活性を測定する試料は、前記のリパーゼを含む可能性がある試料であればよく、前記のリパーゼを含む可能性があるものであれば特に限定されない。
この試料としては、例えば、ヒト若しくは動物又は植物に由来する試料等を挙げることができる。

【0043】

ヒト若しくは動物に由来する試料としては、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、若しくは羊水などの体液；大便などの排泄物；膵臓、肝臓、若しくは胃などの臓器；毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織；又は細胞等を挙げることができる。

【0044】

本発明は、ヒト又は動物に由来する試料を試料とする場合に好適であり、ヒトに由来する試料を試料とする場合に特に好適である。

【0045】

また、本発明は、体液、臓器又は組織を試料とする場合に好適であり、体液を試料とする場合により好適であり、血液、血清又は血漿を試料とする場合に更に好適であり、血清又は血漿を試料とする場合に特に好適である。

【0046】

なお、本発明において、試料は、液体である場合に好適であるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。
また、試料は、必要に応じて、希釈又は濃縮処理等を行ってもよい。

【0047】

ＩＩ．本発明のエマルジョン溶液
１．総論
前記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とするものである。

【0048】

本発明における、この１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液について、以下説明する。

【0049】

なお、この本発明のエマルジョン溶液［すなわち、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液］は、後述の通り、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル以外の物を含んでよいものである。

【0050】

２．リパーゼ活性測定用基質
（１）総論
本発明において、試料中に含まれるリパーゼの活性の測定に使用するためのリパーゼの基質、すなわちリパーゼ活性測定用基質は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］である。

【0051】

本発明においては、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲを試料と接触させ、試料中に含まれるリパーゼと反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、ＤＧＧＭＲより１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成する。
このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
本発明においては、この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。

【0052】

なお、ＤＧＧＭＲは、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］、又はシグマアルドリッチジャパン合同会社［日本国］等より市販されている。

【0053】

（２）リパーゼ活性測定用基質の濃度
本発明のエマルジョン溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度であるが、この本発明のエマルジョン溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度が０．０５ｍＭ以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液とする上で好ましい。

【0054】

なお、この本発明のエマルジョン溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．２ｍＭ以上である。

【0055】

また、この本発明のエマルジョン溶液に含有させるＤＧＧＭＲの濃度であるが、前記の目的の上から、２ｍＭ以下であることが好ましい。

【0056】

なお、この本発明のエマルジョン溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．８ｍＭ以下である。

【0057】

２．本変性シリコーンオイル
（１）総論
前記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲ、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とするものである。

【0058】

すなわち、本発明のエマルジョン溶液は、ＤＧＧＭＲと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させたものである。

【0059】

（２）側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル
本発明において用いる、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル［以下、「本変性シリコーンオイル」ということがある］について、以下説明する。

【0060】

シリコーン化合物は、シロキサン結合〔−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−〕が主鎖であって、側鎖としてメチル基〔ＣＨ_３−〕等の有機基がケイ素原子に結合した重合体化合物である。
そして、直鎖状のシリコーン化合物がシリコーンオイルである。

【0061】

なお、変性シリコーンオイルは、直鎖状のジメチルシリコーン化合物〔Ｓｉ（ＣＨ_３）_３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ_３）_２−Ｏ−］ｍ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３〕の一部のケイ素原子に有機基を導入した化合物である。
この変性シリコーンオイルとしては、ポリシロキサンの側鎖の一部、ポリシロキサンのどちらか片方の末端、ポリシロキサンの両方の末端、又はポリシロキサンの側鎖の一部と両方の末端に、各種の有機基を導入したシリコーンオイルが存在する。

【0062】

この内、ポリシロキサンの側鎖の一部に各種の有機基を導入したシリコーンオイルが、側鎖型の変性シリコーンオイル〔Ｓｉ（ＣＨ_３）_３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ_３）_２−Ｏ−］ｍ−［Ｓｉ（ＣＨ_３）（有機基）−Ｏ−］ｎ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３〕である。

【0063】

なお、この導入する有機基の性質によって、変性シリコーンオイルは、反応性シリコーンオイルと非反応性シリコーンオイルに分類される。

【0064】

この内、非反応性の変性シリコーンオイルとしては、その導入有機基により、ポリエーテル変性タイプ、アラルキル変性タイプ、フロロアルキル変性タイプ、長鎖アルキル変性タイプ、高級脂肪酸エステル変性タイプ、高級脂肪酸アミド変性タイプ、ポリエーテル・長鎖アルキル・アラルキル変性タイプ、長鎖アルキル・アラルキル変性タイプ、又はフェニル変性タイプ等を挙げることができる。

【0065】

そして、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル〔Ｓｉ（ＣＨ_３）_３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ_３）_２−Ｏ−］ｍ−［Ｓｉ（ＣＨ_３）（有機基）−Ｏ−］ｎ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３〕としては、その変性タイプが、例えば、ポリエーテル変性タイプのもの〔有機基：−Ｒ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂＲ’〕、ポリエーテル・長鎖アルキル・アラルキル変性タイプのもの〔有機基：−Ｒ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂＲ’、−Ｃ_ａＨ_２ａ＋１、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ_６Ｈ_５〕、アラルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ_６Ｈ_５〕、フロロアルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＦ_３〕、長鎖アルキル変性タイプのもの〔有機基：−Ｃ_ａＨ_２ａ＋１〕、長鎖アルキル・アラルキル変性タイプのもの〔有機基：−Ｃ_ａＨ_２ａ＋１、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ_６Ｈ_５〕、高級脂肪酸エステル変性タイプのもの〔有機基：−ＯＣＯＲ〕、高級脂肪酸アミド変性タイプのもの〔有機基：−ＲＮＨＣＯＲ’〕、又はフェニル変性タイプのもの〔有機基：−Ｃ_６Ｈ_５〕等を挙げることができる。

【0066】

本発明においては、この側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル〔Ｓｉ（ＣＨ_３）_３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ_３）_２−Ｏ−］ｍ−［Ｓｉ（ＣＨ_３）（有機基）−Ｏ−］ｎ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３〕［有機基：−Ｒ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂＲ’］を用いる。

【0067】

この側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルとしては、例えば、「ＫＦ−３５１Ａ」、「ＫＦ−３５４Ｌ」、「ＫＦ−３５５Ａ」、又は「ＫＦ−６０１１」［販売元はいずれの製品も信越化学工業株式会社（日本国）］等が市販されている。

【0068】

（３）本変性シリコーンオイルの濃度
本発明のエマルジョン溶液における本変性シリコーンオイルの濃度であるが、この本発明のエマルジョン溶液における本変性シリコーンオイルの濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液とする上で好ましい。

【0069】

なお、この本発明のエマルジョン溶液における本変性シリコーンオイルの濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。

【0070】

また、この本発明のエマルジョン溶液に含有させる本変性シリコーンオイルの濃度であるが、前記の目的の上から、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。

【0071】

なお、この本発明のエマルジョン溶液における本変性シリコーンオイルの濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。

【0072】

３．リパーゼ賦活化剤
（１）リパーゼ賦活化剤
本発明のエマルジョン溶液には、リパーゼ賦活化剤を含有させてもよい。

【0073】

本発明において、リパーゼ賦活化剤としては、リパーゼを賦活化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、胆汁酸又はその塩等を挙げることができる。

【0074】

この胆汁酸としては、例えば、デオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、コール酸、リトコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、１２−オキソリトコール酸、１２−オキソケノデオキシコール酸、７−オキソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、デヒドロコール酸、又はコール酸誘導体等を挙げることができる。

【0075】

また、この胆汁酸の塩としては、例えば、胆汁酸とアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属との塩又はアンモニウム塩等を挙げることができる。
このアルカリ金属としては、例えば、カリウム、ナトリウム又はリチウム等を挙げることができ、また、このアルカリ土類金属としては、例えば、マグネシウム又はカルシウム等を挙げることができる。

【0076】

リパーゼ賦活化剤としては、そのリパーゼ賦活化能、リパーゼ活性測定用基質よりなる界面の形成能力、水溶性、及びコストの点から、胆汁酸又はその塩が好ましい。

【0077】

そして、胆汁酸としては、リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲが安定な酸性域において溶解可能な点でタウロデオキシコール酸が好ましく、また、コストの点からデオキシコール酸が好ましい。
この胆汁酸としては、タウロデオキシコール酸が特に好ましい。

【0078】

そして、胆汁酸の塩としては、胆汁酸とアルカリ金属の塩が好ましく、胆汁酸のカリウム塩又はナトリウム塩がより好ましく、胆汁酸のナトリウム塩が特に好ましい。

【0079】

よって、胆汁酸の塩としては、デオキシコール酸又はタウロデオキシコール酸のアルカリ金属（カリウム若しくはナトリウム等）の塩が好ましく、タウロデオキシコール酸のアルカリ金属（カリウム又はナトリウム等）の塩がより好ましく、タウロデオキシコール酸のナトリウム塩が特に好ましい。

【0080】

（２）リパーゼ賦活化剤の濃度
本発明のエマルジョン溶液において、リパーゼ賦活化剤は、その濃度が０．２％（ｗ／ｖ）以上の濃度であることが好ましい。

【0081】

なお、本発明のエマルジョン溶液において、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは０．４％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上である。

【0082】

また、このリパーゼ賦活化剤の濃度であるが、本発明のエマルジョン溶液において、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。

【0083】

なお、本発明のエマルジョン溶液において、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。

【0084】

４．リパーゼ活性化剤
（１）リパーゼ活性化剤
本発明のエマルジョン溶液には、リパーゼ活性化剤を含有させてもよい。

【0085】

本発明において、リパーゼ活性化剤としては、リパーゼを活性化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、アルカリ土類金属イオン又はその塩等を挙げることができる。

【0086】

このアルカリ土類金属イオン又はその塩としては、例えば、ベリリウムイオン若しくはベリリウム塩、マグネシウムイオン若しくはマグネシウム塩、又はカルシウムイオン若しくはカルシウム塩等を挙げることができる。

【0087】

このカルシウム塩としては、例えば、水溶性のカルシウム塩等を挙げることができ、より具体的には、１価又は２価以上の陰イオンとカルシウムイオンよりなる塩であって水溶性であるもの等を挙げることができる。

【0088】

なお、この陰イオンとしては、例えば、ハロゲンイオン、有機化合物よりなる酸基、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。

【0089】

そして、ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、又は塩素イオン等を挙げることができる。

【0090】

有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、又はグルコン酸イオン等を挙げることができる。

【0091】

その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、リン酸イオン、又は炭酸イオン等を挙げることができる。

【0092】

このリパーゼ活性化剤としては、アルカリ土類金属イオン又はその塩が好ましい。

【0093】

なお、アルカリ土類金属イオン又はその塩としては、次の（ｉ）及び（ｉｉ）の点から、カルシウムイオン又はカルシウム塩が好ましい。
（ｉ）リパーゼの活性化能。
（ｉｉ）リパーゼの触媒作用を受けることによりリパーゼ活性測定用基質から遊離した脂肪酸は、リパーゼ活性測定用基質よりなる界面を壊すが、カルシウムイオン又はカルシウム塩はこの遊離した脂肪酸を捕捉し、当該界面が壊れるのを抑制することができる。

【0094】

そして、このカルシウム塩としては、陰イオンとカルシウムイオンよりなる塩であって水溶性であるものが好ましい。

【0095】

そして、この陰イオンとしては、ハロゲンイオン又は有機化合物よりなる酸基が好ましい。より具体的には、塩素イオン又は酢酸イオンが特に好ましい。

【0096】

よって、カルシウム塩としては、ハロゲンイオンのカルシウム塩又は有機化合物よりなる酸基のカルシウム塩が好ましく、より具体的には、塩化カルシウム又は酢酸カルシウムが特に好ましい。

【0097】

（２）リパーゼ活性化剤の濃度
本発明のエマルジョン溶液において、リパーゼ活性化剤は、その濃度が０．１ｍＭ以上の濃度であることが好ましい。

【0098】

なお、本発明のエマルジョン溶液において、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１ｍＭ以上であり、特に好ましくは５ｍＭ以上である。

【0099】

また、このリパーゼ活性化剤の濃度であるが、本発明のエマルジョン溶液において、１００ｍＭ以下であることが好ましい。

【0100】

なお、本発明のエマルジョン溶液において、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは５０ｍＭ以下であり、特に好ましくは２５ｍＭ以下である。

【0101】

５．コリパーゼ
（１）コリパーゼ
本発明のエマルジョン溶液には、コリパーゼを含有させてもよい。

【0102】

本発明において、コリパーゼとしては、コリパーゼの作用、機能又は活性を有しているものであればよく、特に限定はないが、例えば、ヒト、若しくはブタなどの哺乳類由来のコリパーゼ又は遺伝子工学等を用いて調製、修飾若しくは改変されたコリパーゼ等を挙げることができる。

【0103】

このコリパーゼとしては、ブタなどの哺乳類由来のコリパーゼが好ましく、ブタなどの哺乳類の膵臓由来のコリパーゼがより好ましい。

【0104】

（２）コリパーゼの活性値
本発明のエマルジョン溶液において、コリパーゼは、その活性値が１５Ｋ単位／Ｌ（１５ＫＵｎｉｔ／Ｌ）以上であることが好ましい。

【0105】

なお、本発明のエマルジョン溶液において、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは１５０Ｋ単位／Ｌ以上であり、特に好ましくは７５０Ｋ単位／Ｌ以上である。

【0106】

また、このコリパーゼの活性値であるが、本発明のエマルジョン溶液において、７，５００Ｋ単位／Ｌ以下であることが好ましい。

【0107】

なお、本発明のエマルジョン溶液において、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは３，７５０Ｋ単位／Ｌ以下であり、特に好ましくは２，２５０Ｋ単位／Ｌ以下である。

【0108】

なお、本明細書及び図面におけるコリパーゼの各活性値（単位／Ｌ）は、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］のブタ膵臓由来のコリパーゼの活性値の表示に基づくものである。［１ｍｇ／Ｌ＝７５Ｋ単位／Ｌ］

【0109】

なお、コリパーゼは、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］、又はシグマアルドリッチジャパン合同会社［日本国］等より市販されている。

【0110】

６．水
本発明のエマルジョン溶液には、水を含有させてもよい。
すなわち、本発明のエマルジョン溶液は、水溶液であってよい。

【0111】

この本発明のエマルジョン溶液に含有させる水は、特に限定はないが、例えば、純水、蒸留水又は精製水等を挙げることができる。

【0112】

７．ｐＨ
本発明におけるリパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲは、ｐＨ４又はその付近のｐＨにおいて安定である。
よって、本発明のエマルジョン溶液において、そのｐＨはｐＨ４を中心とする一定の範囲内のものであることが好ましい。

【0113】

具体的には、本発明のエマルジョン溶液は、ＤＧＧＭＲの安定性の点から、ｐＨ２〜ｐＨ７の範囲内にあることが好ましく、ｐＨ３〜ｐＨ５の範囲内にあることがより好ましく、そして、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５の範囲内にあることが特に好ましい。（前記のｐＨ値はいずれも２０℃での値である。）

【0114】

８．緩衝剤
（１）緩衝剤
本発明のエマルジョン溶液には、緩衝剤を含有させてもよい。

【0115】

本発明においては、本発明のエマルジョン溶液のｐＨを、前記７に記載のｐＨ範囲に保つため、前記７記載のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を本発明のエマルジョン溶液に適宜含有させてもよい。

【0116】

本発明のエマルジョン溶液に含有させることができる緩衝剤としては、特に限定はないが、例えば、酒石酸、コハク酸、マロン酸、若しくはクエン酸などの有機酸、又はグリシン、若しくはリン酸、或いはこれらの塩等を挙げることができる。

【0117】

（２）緩衝剤の濃度
本発明において、緩衝剤を本発明のエマルジョン溶液に含有させる場合の濃度は、特に限定はなく、設定するｐＨの範囲において緩衝能を発揮することができる濃度であればよい。

【0118】

例えば、本発明のエマルジョン溶液において、この緩衝剤の濃度は、好ましくは５ｍＭ以上であり、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、特に好ましくは３０ｍＭ以上である。

【0119】

また、この緩衝剤の濃度は、本発明のエマルジョン溶液において、好ましくは５００ｍＭ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下であり、特に好ましくは５０ｍＭ以下である。

【0120】

９．本発明のエマルジョン溶液のエマルジョンのミセル径
先に記載した通り、リパーゼは、エマルジョン化したトリグリセライド基質の水と油との界面で最も効率よく作用し、このリパーゼの反応速度は分散した基質の表面積に関係するので、このリパーゼの活性測定には安定で均一なミセル粒子からなる基質の調製が重要であるとされている（非特許文献２参照。）。

【0121】

本発明において、リパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］を含有するエマルジョン溶液は、そのエマルジョンのミセル径（ミセル粒子径）が６０〜１，５００ｎｍの範囲にあると、リパーゼとの反応の速度が高く、また、このエマルジョンが安定であり、この本発明のエマルジョン溶液を長期間保存・使用できるので好ましい。

【0122】

この理由により、本発明のエマルジョン溶液は、そのエマルジョンのミセル径（ミセル粒子径）が７０〜１，０００ｎｍの範囲にあることがより好ましく、８０〜６００ｎｍの範囲にあることが更に好ましく、そして、１００〜２００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。

【0123】

ＩＩＩ．本発明のエマルジョン溶液の製造方法
１．総論
本発明のエマルジョン溶液を製造する方法であるが、上記の「ＤＧＧＭＲ、及び本変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなる」という構成の本発明のエマルジョン溶液を製造することができる方法であればよく、特に限定はない。

【0124】

なお、本発明のエマルジョン溶液を製造する方法としては、例えば、次の（ａ）及び（ｂ）の工程よりなる方法等を挙げることができる。なお、本発明において、この「次の（ａ）及び（ｂ）の工程よりなる方法」は、「次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法」をも含むことを意味するものである。
この（ａ）及び（ｂ）の工程よりなる方法は、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要とせずに、本発明のエマルジョン溶液を製造することができるので、好ましい。

【0125】

（ａ）ＤＧＧＭＲと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程

【0126】

（ｂ）前記（ａ）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程

【0127】

２．ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程
前記１における（ａ）の工程、すなわち、「ＤＧＧＭＲと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」について、以下、詳細に説明する。

【0128】

（１）ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合
前記１の（ａ）の工程、すなわち、「ＤＧＧＭＲと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」においては、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合する。
すなわち、ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとを直接混合する。

【0129】

なお、本変性シリコーンオイルは、１種類のものをＤＧＧＭＲと混合してもよく、又は複数種類のものをＤＧＧＭＲと混合してもよい。

【0130】

（２）ＤＧＧＭＲの混合量
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲを混合する量は、特に限定されない。

【0131】

なお、このＤＧＧＭＲは、前記１の（ｂ）の工程である「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程」における当該「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物の全部又は一部」と当該「水又は水溶液」との混合（以下、「第２混合」ということがある）の後に、その濃度が０．０５ｍＭ以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。

【0132】

なお、この第２混合の後（第２混合後）、このＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．２ｍＭ以上である。

【0133】

また、このＤＧＧＭＲの濃度であるが、第２混合後、前記の目的の上から、２ｍＭ以下であることが好ましい。

【0134】

なお、第２混合後、このＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．８ｍＭ以下である。

【0135】

第２混合後のＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、以上述べた通りである。
なお、前記１の（ａ）の「ＤＧＧＭＲと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」における当該ＤＧＧＭＲと当該本変性シリコーンオイルとの混合（以下、「第１混合」ということがある）の時の当該ＤＧＧＭＲ及び当該本変性シリコーンオイルそれぞれの混合量を、第２混合後にＤＧＧＭＲの濃度が上記の通りになるように、考慮の上決めてもよく、このようにすることが、その製造手順の上から好ましい。

【0136】

なお、このＤＧＧＭＲの混合量及び濃度であるが、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。

【0137】

（ａ）リパーゼ活性測定用基質と本変性シリコーンオイルの混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そしてリパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとした場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。

【0138】

Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０^６）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）

【0139】

なお、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲの分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。

【0140】

Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０^６）÷（Ｖｆ×７５２．０５）

【0141】

よって、この場合の第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質（ＤＧＧＭＲ）の混合量Ｗｓ［単位：グラム］は次のように表すことができる。

【0142】

Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×ＭＷｓ）÷１０^６

【0143】

すなわち、Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×７５２．０５）÷１０^６

【0144】

（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と本変性シリコーンオイルの混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、リパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。

【0145】

Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０^６）×（Ａ÷１００）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）＝（Ｗｓ×Ａ×１０^４）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）

【0146】

なお、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲの分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。

【0147】

Ｃｓ＝（Ｗｓ×Ａ×１０^４）÷（Ｖｆ×７５２．０５）

【0148】

よって、この場合の第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量Ｗｓ［単位：グラム］は次のように表すことができる。

【0149】

Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×ＭＷｓ）÷（Ａ×１０^４）

【0150】

すなわち、Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×７５２．０５）÷（Ａ×１０^４）

【0151】

（３）本変性シリコーンオイルの混合量
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、この本変性シリコーンオイルを混合する量は、特に限定されない。

【0152】

なお、本変性シリコーンオイルは、第２混合の後に、その濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。

【0153】

なお、第２混合の後（第２混合後）、この本変性シリコーンオイルの好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。

【0154】

また、この本変性シリコーンオイルの濃度であるが、第２混合後、前記の目的の上から、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。

【0155】

なお、第２混合後、この本変性シリコーンオイルの好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。

【0156】

第２混合後の本変性シリコーンオイルの好ましい濃度は、以上述べた通りである。
なお、第１混合時の当該ＤＧＧＭＲ及び当該本変性シリコーンオイルそれぞれの混合量を、第２混合後に本変性シリコーンオイルの濃度が上記の通りになるように、考慮の上決めてもよく、このようにすることが、その製造手順の上から好ましい。

【0157】

なお、この本変性シリコーンオイルの混合量及び濃度であるが、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。

【0158】

（ａ）リパーゼ活性測定用基質と本変性シリコーンオイルの混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させる本変性シリコーンオイルの混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とした場合、第２混合後の本変性シリコーンオイルの濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。

【0159】

Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）÷Ｖｆ

【0160】

よって、この場合の第１混合時に混合させる本変性シリコーンオイルの混合量Ｗｐ［単位：グラム］は次のように表すことができる。

【0161】

Ｗｐ＝（Ｃｐ×Ｖｆ）÷１００

【0162】

（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と本変性シリコーンオイルの混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させる本変性シリコーンオイルの混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後の本変性シリコーンオイルの濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。

【0163】

Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）×（Ａ÷１００）÷Ｖｆ＝（Ｗｐ×Ａ）÷Ｖｆ

【0164】

よって、この場合の第１混合時に混合させる本変性シリコーンオイルの混合量Ｗｐ（単位：グラム）は次のように表すことができる。

【0165】

Ｗｐ＝（Ｃｐ×Ｖｆ）÷Ａ

【0166】

（４）混合の方法
ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとを混合する方法は、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルが混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。

【0167】

なお、当該混合においては、ＤＧＧＭＲをアルコールなどの有機溶媒及び本変性シリコーンオイルを含む溶液に混合したり、ＤＧＧＭＲを含有する液を滴々と滴下して本変性シリコーンオイルを含む溶液に混合したり、ＤＧＧＭＲを含有する液を本変性シリコーンオイルを含む溶液に噴射注入したり、ＤＧＧＭＲ及び本変性シリコーンオイルを含有する溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又はＤＧＧＭＲ及び本変性シリコーンオイルを含有する溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理や特別な装置等は必要なく、一般的なミキサーを用いて一般的な速度で撹拌する等、通常の方法で混合すればよく、これによりＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物を調製することができる。

【0168】

（５）混合時の温度
ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとを混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる本変性シリコーンオイルの曇点付近の温度又はこの曇点付近の温度以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。

【0169】

なお、曇点は、非イオン性の界面活性剤等の水溶液の温度を上げていった場合にその界面活性剤等のミセルが形成できなくなる温度であり、その水溶液が白濁する温度であって、その界面活性剤等毎に異なるものである。

【0170】

また、本発明において、本変性シリコーンオイルの曇点付近の温度としては、その本変性シリコーンオイルの曇点の温度のプラスマイナス（±）２５℃の範囲を意味する。
この本変性シリコーンオイルの曇点付近の温度としては、その本変性シリコーンオイルの曇点の温度のプラスマイナス（±）１５℃の範囲が好ましく、プラスマイナス（±）１０℃の範囲がより好ましく、プラスマイナス（±）５℃の範囲が特に好ましい。

【0171】

そして、本発明においては、上記の本変性シリコーンオイルの曇点付近の温度以下の温度において、ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程を行うことも好ましい。

【0172】

なお、例えば、本変性シリコーンオイルである、ＫＦ−３５１Ａの曇点は５２℃（自己実測値）であり、ＫＦ−３５５Ａの曇点は６７℃（自己実測値）であり、そして、ＫＦ−６０１１の曇点は６４℃（自己実測値）である
なお、ＫＦ−３５４Ｌは、曇点の測定に使用した恒温水槽の設定温度の上限の７７℃においても曇点に至らなかったので、これの曇点は７７℃超である。

【0173】

前記のＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程は、前記の目的の上から、用いる本変性シリコーンオイルの曇点の温度のプラスマイナス２５℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことが好ましく、用いる本変性シリコーンオイルの曇点の温度のプラスマイナス１５℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことがより好ましく、用いる本変性シリコーンオイルの曇点の温度のプラスマイナス１０℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことが更に好ましく、そして、用いる本変性シリコーンオイルの曇点の温度のプラスマイナス５℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことが特に好ましい。

【0174】

また、本発明におけるＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとを混合する時の温度であるが、この工程を、ＤＧＧＭＲ、及び用いる本変性シリコーンオイルそれぞれの融点以上の温度において行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。

【0175】

そして、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程は、前記の目的の上から、２℃以上で行うことがより好ましく、５℃以上で行うことが更に好ましく、１０℃以上で行うことが特に好ましい。

【0176】

（６）混合の時間
ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとを混合する時間であるが、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとが均質に混合されればよく、特に限定されない。
通常は、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から、この混合を５分間又はそれ以上行うことが好ましい。なお、一般的には、５分間で十分である。

【0177】

また、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとを混合する時間は、特に上限はなく、例えば数時間混合しても構わないのであるが、時間もコストであるという観点から考えると、念入りに行うとしても通常は１０分間以内でよい。

【0178】

３．ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物を水又は水溶液と混合する工程
前記１における（ｂ）の工程、すなわち、『「ＤＧＧＭＲと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程』について、以下、詳細に説明する。

【0179】

（１）水又は水溶液
前記１の（ｂ）の工程、すなわち、「前記１の（ａ）の工程において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程」において、この水又は水溶液については、特に限定はない。

【0180】

この水としては、特に限定はないが、例えば、純水、蒸留水又は精製水等を挙げることができる。

【0181】

また、この水溶液としては、水を溶媒とするものであればよく、特に限定はないが、例えば、リパーゼ賦活化剤、リパーゼ活性化剤、コリパーゼ、及び緩衝剤からなる群から選ばれる少なくとも一つのもの等を含有する水溶液等を挙げることができる。

【0182】

（ａ）リパーゼ賦活化剤
本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ賦活化剤としては、リパーゼを賦活化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、胆汁酸又はその塩等を挙げることができる。

【0183】

このリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩については、前記ＩＩの３の「（１）リパーゼ賦活化剤」の項に記載した通りである。

【0184】

なお、このリパーゼ賦活化剤は、第２混合後、その濃度が０．２％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。

【0185】

なお、第２混合後、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは０．４％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上である。

【0186】

また、このリパーゼ賦活化剤の濃度であるが、第２混合後、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。

【0187】

なお、第２混合後、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。

【0188】

この第２混合後のリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。
第２混合後のリパーゼ賦活化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「ＤＧＧＭＲ及び本変性シリコーンオイルの混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ賦活化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。

【0189】

（ｂ）リパーゼ活性化剤
本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ活性化剤としては、リパーゼを活性化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、アルカリ土類金属イオン又はその塩等を挙げることができる。

【0190】

このリパーゼ活性化剤としてのアルカリ土類金属イオン又はその塩については、前記ＩＩの４の「（１）リパーゼ活性化剤」の項に記載した通りである。

【0191】

なお、このリパーゼ活性化剤は、第２混合後、その濃度が０．１ｍＭ以上であることが好ましい。

【0192】

なお、第２混合後、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１ｍＭ以上であり、特に好ましくは５ｍＭ以上である。

【0193】

また、このリパーゼ活性化剤の濃度であるが、第２混合後、１００ｍＭ以下であることが好ましい。

【0194】

なお、第２混合後、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは５０ｍＭ以下であり、特に好ましくは２５ｍＭ以下である。

【0195】

この第２混合後のリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。
第２混合後のリパーゼ活性化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「ＤＧＧＭＲ及び本変性シリコーンオイルの混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ活性化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。

【0196】

（ｃ）コリパーゼ
本発明において、水溶液に含有させることができるコリパーゼとしては、コリパーゼの作用、機能又は活性を有しているものであればよく、特に限定はない。

【0197】

このコリパーゼについては、前記ＩＩの５の「（１）コリパーゼ」の項に記載した通りである。

【0198】

なお、このコリパーゼは、第２混合後、その活性値が１５Ｋ単位／Ｌ（１５ＫＵｎｉｔ／Ｌ）以上であることが好ましい。

【0199】

なお、第２混合後、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは１５０Ｋ単位／Ｌ以上であり、特に好ましくは７５０Ｋ単位／Ｌ以上である。

【0200】

また、このコリパーゼの活性値であるが、第２混合後、７，５００Ｋ単位／Ｌ以下であることが好ましい。

【0201】

なお、第２混合後、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは３，７５０Ｋ単位／Ｌ以下であり、特に好ましくは２，２５０Ｋ単位／Ｌ以下である。

【0202】

この第２混合後のコリパーゼの好ましい活性値は、以上述べた通りである。
第２混合後のコリパーゼの活性値が上記の活性値となるよう、前記の「ＤＧＧＭＲ及び本変性シリコーンオイルの混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にコリパーゼを適当な活性値で含有させることが好ましい。

【0203】

（ｄ）ｐＨ
本発明においてリパーゼ活性測定用基質として用いるＤＧＧＭＲは、ｐＨ４又はその付近のｐＨにおいて安定である。
よって、第２混合後、そのｐＨはｐＨ４を中心とする一定の範囲内のものであることが好ましい。

【0204】

具体的には、第２混合後のｐＨは、ＤＧＧＭＲの安定性の点から、ｐＨ２〜ｐＨ７の範囲内にあることが好ましく、ｐＨ３〜ｐＨ５の範囲内にあることがより好ましく、そして、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５の範囲内にあることが特に好ましい。（前記のｐＨ値はいずれも２０℃での値である。）

【0205】

この第２混合後のｐＨは、以上述べた通りである。
第２混合後のｐＨが上記のｐＨとなるよう、前記水溶液のｐＨを適当なｐＨにすることが好ましい。

【0206】

（ｅ）緩衝剤
本発明においては、第２混合後のｐＨを、前記（ｄ）に記載のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を前記水溶液に適宜含有させてもよい。

【0207】

この緩衝剤については、前記ＩＩの８の「（１）緩衝剤」の項に記載した通りである。

【0208】

この緩衝剤を含有する水溶液（すなわち、緩衝液）における緩衝剤の濃度は、特に限定はなく、設定するｐＨの範囲において緩衝能を発揮することができる濃度であればよい。

【0209】

例えば、第２混合後、この緩衝剤の濃度は、好ましくは５ｍＭ以上であり、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、特に好ましくは３０ｍＭ以上である。

【0210】

また、この緩衝剤の濃度は、第２混合後、好ましくは５００ｍＭ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下であり、特に好ましくは５０ｍＭ以下である。

【0211】

この第２混合後の緩衝剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。
第２混合後の緩衝剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の水溶液に緩衝剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。

【0212】

（２）ＤＧＧＭＲ及び本変性シリコーンオイルの混合物の水又は水溶液との混合
前記１における（ｂ）の工程、すなわち、『「ＤＧＧＭＲと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程』においては、当該「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物」の全部又は一部を、当該「水又は水溶液」と混合する。

【0213】

ところで、リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程であるが、特に限定はなく、例えば、「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物」の全部又は一部を「水又は水溶液」へ添加し、混合するという態様でもよく、又は「水又は水溶液」を「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物」の全部又は一部へ添加し、混合するという態様でもよく、或いはその他の態様でもよい。

【0214】

なお、前記の「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物」と、前記の「水又は水溶液」との混合の比率は、特に限定はなく適宜定めればよい。

【0215】

なお、この「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物」と「水又は水溶液」との混合については、例えば、次の（ｉ）及び（ｉｉ）のように考えることができる。

【0216】

（ｉ）ＤＧＧＭＲの濃度の面から
前記２の「（２）ＤＧＧＭＲの混合量」の項に詳述した通り、第２混合後、ＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、そして、特に好ましくは０．２ｍＭ以上である。
また、これも前記２の「（２）ＤＧＧＭＲの混合量」の項に詳述した通り、第２混合後、ＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは２ｍＭ以下であり、より好ましくは１ｍＭ以下であり、そして、特に好ましくは０．８ｍＭ以下である。

【0217】

そして、このＤＧＧＭＲの好ましい濃度と、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量との関係は、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。

【0218】

【0219】

Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０^６）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）

【0220】

なお、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲの分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。

【0221】

Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０^６）÷（Ｖｆ×７５２．０５）

【0222】

よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。

【0223】

Ｖｆ＝（Ｗｓ×１０^６）÷（Ｃｓ×ＭＷｓ）

【0224】

すなわち、Ｖｆ＝（Ｗｓ×１０^６）÷（Ｃｓ×７５２．０５）

【0225】

従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望するリパーゼ活性測定用基質（ＤＧＧＭＲ）の濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。

【0226】

【0227】

Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０^６）×（Ａ÷１００）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）＝（Ｗｓ×Ａ×１０^４）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）

【0228】

なお、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲの分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。

【0229】

Ｃｓ＝（Ｗｓ×Ａ×１０^４）÷（Ｖｆ×７５２．０５）

【0230】

よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。

【0231】

Ｖｆ＝（Ｗｓ×Ａ×１０^４）÷（Ｃｓ×ＭＷｓ）

【0232】

すなわち、Ｖｆ＝（Ｗｓ×Ａ×１０^４）÷（Ｃｓ×７５２．０５）

【0233】

【0234】

（ｉｉ）本変性シリコーンオイルの濃度の面から
前記２の「（３）本変性シリコーンオイルの混合量」の項に詳述した通り、第２混合後、本変性シリコーンオイルの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、そして、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。

【0235】

また、これも前記２の「（３）本変性シリコーンオイルの混合量」の項に詳述した通り、第２混合後、本変性シリコーンオイルの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは２０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、そして、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。

【0236】

そして、この本変性シリコーンオイルの好ましい濃度と、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量との関係は、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。

【0237】

【0238】

Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）÷Ｖｆ

【0239】

よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。

【0240】

Ｖｆ＝（Ｗｐ×１００）÷Ｃｐ

【0241】

従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望する本変性シリコーンオイルの濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。

【0242】

【0243】

Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）×（Ａ÷１００）÷Ｖｆ＝（Ｗｐ×Ａ）÷Ｖｆ

【0244】

よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。

【0245】

Ｖｆ＝（Ｗｐ×Ａ）÷Ｃｐ

【0246】

【0247】

なお、このリパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程は、二段階以上の複数の段階（ステップ）によって行ってもよい。
なお、このように、この工程を複数の段階（ステップ）によって行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。

【0248】

この工程を複数の段階によって行う方法であるが、これは当該工程を複数の段階によって行うものであればよく、特に限定はないが、例えば、次の［Ａ］及び［Ｂ］の段階によって行うもの等を挙げることができる。

【0249】

［Ａ］ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、一定量の水又は水溶液と混合する段階
［Ｂ］前記［Ａ］の段階における当該混合物（ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとの混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液に、更に一定量の水又は水溶液を混合する段階

【0250】

なお、この場合、前記［Ａ］の段階において「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部」と混合する「水又は水溶液」の容量（一定量）をＶａ［単位：ｍＬ］とし、前記［Ｂ］の段階において当該混合液に「更に一定量の水又は水溶液」を混合した後の最終的な容量［すなわち、前記の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量］（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］としたとき、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）は、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から、１〜５００の範囲にあることが好ましい。

【0251】

すなわち、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）が１〜５００の範囲内になるように、前記のＶａ及びＶｆの値（容量）を選択することが、前記の目的の上から好ましい。

【0252】

なお、同様に、前記の目的の上から、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）は、２〜２００の範囲にあることがより好ましく、５〜１００の範囲にあることが特に好ましい。

【0253】

すなわち、前記の目的の上から、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）が、２〜２００の範囲内になるように前記のＶａ及びＶｆの値（容量）を選択することがより好ましく、５〜１００の範囲内になるように前記のＶａ及びＶｆの値（容量）を選択することが特に好ましい。

【0254】

なお、前記［Ａ］の「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、一定量の水又は水溶液と混合する段階」であるが、特に限定はなく、例えば、「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物」の全部又は一部を一定量の「水又は水溶液」へ添加し、混合するという態様でもよく、又は一定量の「水又は水溶液」を「ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物」の全部又は一部へ添加し、混合するという態様でもよく、或いはその他の態様でもよい。

【0255】

また、前記［Ｂ］の「前記［Ａ］の段階における当該混合物（ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとの混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液に、更に一定量の水又は水溶液を混合する段階」であるが、特に限定はなく、例えば、「前記［Ａ］の段階における当該混合物（ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとの混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液」を一定量の「水又は水溶液」へ添加し、混合するという態様でもよく、又は一定量の「水又は水溶液」を「前記［Ａ］の段階における当該混合物（ＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルとの混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液」へ添加し、混合するという態様でもよく、或いはその他の態様でもよい。

【0256】

（３）混合の方法
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する方法は、当該混合物と、当該水又は水溶液が混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。

【0257】

なお、当該混合においては、リパーゼ活性測定用基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を溶液に噴射注入したり、リパーゼ活性測定用基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又はリパーゼ活性測定用基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理や特別な装置等は必要なく、一般的なミキサーを用いて一般的な速度で撹拌する等、通常の方法で混合すればよく、これにより、リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合することができる。

【0258】

（４）混合時の温度
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる本変性シリコーンオイルの曇点以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。

【0259】

そして、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程は、前記の目的の上から、用いる本変性シリコーンオイルの曇点より１０℃低い温度以下で行うことがより好ましく、２５℃以下で行うことが特に好ましい。

【0260】

また、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物の全部又は一部を、水又は水溶液とを混合する時の温度であるが、この工程を、ＤＧＧＭＲ、及び用いる本変性シリコーンオイルそれぞれの融点以上の温度において行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。

【0261】

そして、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程は、前記の目的の上から、１０℃以上で行うことがより好ましく、１５℃以上で行うことが特に好ましい。

【0262】

（５）混合の時間
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時間であるが、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物と、この水又は水溶液とが、均質に混合されればよく、特に限定されない。

【0263】

通常は、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から、この混合を５分間又はそれ以上行うことが好ましい。なお、一般的には、５分間で十分である。

【0264】

また、このＤＧＧＭＲと本変性シリコーンオイルの混合物と、水又は水溶液とを混合する時間は、特に上限はなく、例えば数時間混合しても構わないのであるが、時間もコストであるという観点から考えると、念入りに行うとしても通常は１０分間以内でよい。

【0265】

〔２〕本発明のリパーゼ活性測定試薬
Ｉ．総論
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とするものである。（なお、エマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。）

【0266】

そして、本発明のリパーゼ活性測定試薬は、上記の構成により、その保存安定性が優れたものである。

【0267】

ＩＩ．リパーゼ活性測定試薬
１．リパーゼ活性測定試薬の構成等
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のみからなるものであってもよく、又は本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなるもの（試薬キット）であってもよい。

【0268】

なお、次の（ａ）及び（ｂ）の理由から、本発明のリパーゼ活性測定試薬としては、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなる試薬キットであることが好ましい。
（ａ）本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］はｐＨ４又はその付近のｐＨにおいて安定であるのに対して、リパーゼはｐＨ８又はその付近のｐＨにおいてその活性は至適であり、それぞれ適するｐＨ域が異なっている。
（ｂ）本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］、コリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩を、一つの試薬に共存させると、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］の安定性が良くなくなる。

【0269】

よって、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなる試薬キットであることが好ましく、この場合、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］を含む試薬のｐＨはｐＨ４又はその付近のｐＨとし、これと組み合わせる他の構成試薬のうち少なくとも一つの試薬のｐＨはｐＨ８又はそれ以上とすることが好ましく、また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］、コリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩を、一つの試薬に共存させないことが好ましい。

【0270】

この本発明のリパーゼ活性測定試薬としては、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液と一つの他の構成試薬からなる２試薬系の試薬キットであることが好ましい。

【0271】

この場合、当該他の構成試薬を第１試薬とし、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を第２試薬として用いるものであることがより好ましい。

【0272】

そして、この場合に、当該他の構成試薬のｐＨはｐＨ８又はそれ以上とし、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のｐＨはｐＨ４又はその付近のｐＨとすることが更に好ましい。

【0273】

また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液に、「コリパーゼ」、及び「リパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩」の両方を含有させることはせず、「コリパーゼ」、及び「リパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩」の少なくとも一方は当該他の構成試薬に含有させることが更に好ましい。

【0274】

本発明のリパーゼ活性測定試薬は、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよいが、反応速度法（レート法）によるものが好ましい。

【0275】

また、本発明のリパーゼ活性測定試薬においては、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］と試料を接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成するが、このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。

【0276】

よって、この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度等を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めればよい。なお、この場合、一波長法でもよく、又は二波長法でもよい。

【0277】

また、本発明のリパーゼ活性測定試薬において、測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、変性又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。

【0278】

また、本発明のリパーゼ活性測定試薬において、測定反応の開始方法は、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］等を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法のものでもよい。

【0279】

また、本発明のリパーゼ活性測定試薬において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。

【0280】

また、本発明のリパーゼ活性測定試薬は、その構成試薬の全て又は一部が液状試薬であってよい。

【0281】

なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のリパーゼ活性の測定に使用することができる。

【0282】

また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、前記の他の構成試薬又はそれ以外の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中のリパーゼ活性の測定に使用することもできる。
前記の他の構成試薬、又はそれ以外の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。

【0283】

２．本発明のリパーゼ活性の測定試薬の具体例
本発明のリパーゼ活性測定試薬の具体例を以下挙げる。

【0284】

（１）例１
（ａ）第１試薬［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液；ｐＨ８．３（２０℃）］
デオキシコール酸ナトリウム［リパーゼ賦活化剤］２％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム［リパーゼ活性化剤］５ｍＭ
コリパーゼ（ブタ膵臓由来；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）３７５Ｋ単位／Ｌ（５ｍｇ／Ｌ）
Ｂｉｃｉｎｅ［緩衝剤］４０ｍＭ

【0285】

（ｂ）第２試薬（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液）［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液；ｐＨ４．０（２０℃）］
１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）［リパーゼ活性測定用基質］０．３ｍＭ
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル０．３％（ｗ／ｖ）
Ｌ−酒石酸［緩衝剤］４０ｍＭ

【0286】

（２）例２
（ａ）第１試薬［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液；ｐＨ８．４（２０℃）］
タウロデオキシコール酸ナトリウム［リパーゼ賦活化剤］２％（ｗ／ｖ）
デオキシコール酸ナトリウム［リパーゼ賦活化剤］０．２％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム［リパーゼ活性化剤］５ｍＭ
コリパーゼ（ブタ膵臓由来；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）１５０Ｋ単位／Ｌ（２ｍｇ／Ｌ）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕［緩衝剤］４０ｍＭ

【0287】

（ｂ）第２試薬（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液）［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液］
１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）［リパーゼ活性測定用基質］０．６ｍＭ
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル０．３％（ｗ／ｖ）
タウロデオキシコール酸ナトリウム［リパーゼ賦活化剤］２％（ｗ／ｖ）

【0288】

〔３〕本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法
Ｉ．総論
本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して、試料中のリパーゼ活性を測定することを特徴とするものである。（なお、エマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔２〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。）

【0289】

そして、本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法は、上記の構成により、長期間正確な測定値を得ることができる方法である。

【0290】

ＩＩ．リパーゼ活性測定方法
１．試料中のリパーゼ活性の測定の方法
本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法により、試料中のリパーゼ活性の測定を行う場合、その測定は終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよいが、反応速度法（レート法）によるものが好ましい。

【0291】

また、本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法により、試料中のリパーゼ活性の測定を行う場合、その測定は、一段階のステップにより行う１ステップ法、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより行う多ステップ法を適宜選択して測定を行えばよい。

【0292】

なお、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するリパーゼ活性測定試薬が、第１試薬、第２試薬、及び他の試薬（一つ又は二つ以上の試薬）よりなる場合、すなわち３以上の試薬よりなる場合は、これらの試薬を使用して測定を行うのに必要な数の段階（必要に応じ二段階又は三段階以上の段階）を経て測定反応を行わせ、試料中のリパーゼ活性の測定を行えばよい。

【0293】

また、本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法においては、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］と試料を接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成するが、このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。

【0294】

【0295】

なお、測定した吸光度（若しくは透過率）、又は吸光度（若しくは透過率）の変化量より、試料に含まれていたリパーゼの活性値を算出することは、６’−メチルレゾルフィンのモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又はリパーゼ活性値が分かっている標準物質（標準液、若しくは標準血清等）の吸光度（若しくは透過率）と対比して算出する方法等の方法を適宜選択して行えばよい。

【0296】

また、試料を測定して得た吸光度（若しくは透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて、試料に含まれていたリパーゼの活性値を算出することが好ましい。

【0297】

また、本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法において、その測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、変性又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。

【0298】

また、本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法において、その測定反応の開始方法は、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質等を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法のものでもよい。

【0299】

また、本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。

【0300】

２．試料中のリパーゼ活性の測定方法の具体例
本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法の具体例を以下挙げる。

【0301】

（１）リパーゼ活性測定試薬
（ａ）第１試薬
前記の〔２〕のＩＩの２の（１）の（ａ）の第１試薬を、この測定方法の具体例における第１試薬として用いた。

【0302】

（ｂ）第２試薬
前記の〔２〕のＩＩの２の（１）の（ｂ）の第２試薬を、この測定方法の具体例における第２試薬として用いた。

【0303】

（２）試料
ヒトの血清を試料として用いた。

【0304】

（３）測定
（ａ）第１段階
前記（２）の試料と前記（１）の（ａ）の第１試薬を混合して、混合液を調製する。

【0305】

この混合する試料及び第１試薬それぞれの量は、第２試薬の量、試料に含まれるリパーゼの活性値、及び他の条件に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、試料の量は０．５〜１００μＬ、第１試薬の量は２０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。

【0306】

この混合液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。

【0307】

また、インキュベートする際の温度は、前記の混合液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。

【0308】

この試料と第１試薬の混合液の調製及びインキュベートにより、試料に含まれていたリパーゼと、第１試薬に含まれる試薬成分とが接触し、これらの成分によるリパーゼの賦活化や活性化等が行われる。

【0309】

（ｂ）第２段階
前記の第１段階で調製した「試料と第１試薬の混合液」に、前記（１）の（ｂ）の第２試薬を混合する。これを最終反応液とする。

【0310】

この混合する第２試薬の量は、試料の量、第１試薬の量、試料に含まれるリパーゼの活性値、使用する分析装置の仕様等、及び他の条件に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、第２試薬の量は１０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。

【0311】

この最終反応液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。

【0312】

また、インキュベートする際の温度は、前記の最終反応液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。

【0313】

この最終反応液の調製及びインキュベートにより、前記の第１段階におけるリパーゼの賦活化や活性化等に引き続き、この第２段階における測定反応が開始し、試料に含まれていたリパーゼの活性測定反応が進められる。

【0314】

すなわち、本発明により安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化した基質溶液となっている第２試薬（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液）が、この第２段階において試料に含まれていたリパーゼと接触することにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、本発明のリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］より１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成する。
そして、このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であるので、容易に自然に加水分解されて、６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。

【0315】

この生成した６’−メチルレゾルフィンは、その極大吸収波長（λｍａｘ）が５８０ｎｍであるので、この６’−メチルレゾルフィンに由来する最終反応液の吸光度（又は透過率）を、５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度（又は透過率）を測ることによって測定する。

【0316】

次に、測定した吸光度（若しくは透過率）、又は吸光度（若しくは透過率）の変化量より、試料に含まれていたリパーゼの活性値を算出する。

【0317】

なお、これは、６’−メチルレゾルフィンのモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又はリパーゼ活性値が分かっている標準物質（標準液、若しくは標準血清等）の吸光度（若しくは透過率）と対比して算出する方法等の方法を適宜選択して行う。

【0318】

なお、上記の試料に含まれていたリパーゼの活性値の算出は、試料を測定して得た最終反応液の吸光度（若しくは透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて求めた吸光度差（ΔＡｂｓ．）を用いて行うことが好ましい。

【0319】

〔４〕本発明のエマルジョン溶液
本発明のエマルジョン溶液は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるものである。（なお、このエマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔２〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。また、試料中のリパーゼ活性の測定方法の詳細については、前記の「〔３〕本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法」の項に記載した通りである。）

【0320】

そして、本発明のエマルジョン溶液は、上記の構成により、その保存安定性が優れたものである。

【0321】

〔５〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法
本発明の１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］をリパーゼ活性測定用基質として用いるリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とするものである。（なお、エマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔２〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。また、試料中のリパーゼ活性の測定方法の詳細については、前記の「〔３〕本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法」の項に記載した通りである。）

【0322】

そして、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法は、上記の構成により、リパーゼ活性測定用基質溶液の保存安定性を改善することができる方法である。

【0323】

〔６〕本発明のエマルジョン溶液の安定化方法
本発明の１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とするものである。（なお、エマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔２〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。また、試料中のリパーゼ活性の測定方法の詳細については、前記の「〔３〕本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法」の項に記載した通りである。）

【0324】

そして、本発明のエマルジョン溶液の安定化方法は、上記の構成により、当該エマルジョン溶液の保存安定性を改善することができる方法である。

【実施例】

【0325】

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0326】

〔実施例１〕（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の効果の確認−１）
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を確認した。

【0327】

１．試薬の調製
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液（本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液）を調製した。
また、対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液を調製した。
更に、緩衝液を調製した。

【0328】

〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の調製
（１）本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０９グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。

【0329】

（２）次に、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）である、ＫＦ−３５１Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）の４．０グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。

【0330】

（３）前記（２）の添加後、このビーカーを室温（２５℃）において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルであるＫＦ−３５１Ａとを混合した。

【0331】

この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」を調製した。

【0332】

なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。

【0333】

（４）次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の２％（ｗ／ｖ）の濃度のタウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。

【0334】

そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の２％（ｗ／ｖ）のタウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液」との混合を行った。

【0335】

【0336】

（５）次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物）と一定量の２％（ｗ／ｖ）タウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液との混合後の混合液」に、更に一定量の２％（ｗ／ｖ）タウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。

【0337】

（６）以上の操作により、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−３５１Ａ）」を調製した。
なお、このリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．６ｍＭであり、本変性シリコーンオイル（ＫＦ−３５１Ａ）の濃度は２．０％（ｗ／ｖ）である。
また、このリパーゼ活性測定用基質溶液に、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。

【0338】

〔２〕対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液の調製
（１）リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０９グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。

【0339】

（２）次に、非イオン性界面活性剤であるＮＩＫＫＯＬＢＴ−７［ポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテル］（販売元：日光ケミカルズ株式会社［日本国］）の１．０グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。

【0340】

（３）前記（２）の添加後、このビーカーを室温（２５℃）において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と前記の界面活性剤を混合した。

【0341】

この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。

【0342】

【0343】

（４）次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の２％（ｗ／ｖ）の濃度のタウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。

【0344】

そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して
調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の２％（ｗ／ｖ）のタウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液」との混合を行った。

【0345】

【0346】

（５）次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の２％（ｗ／ｖ）タウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液との混合後の混合液」に、更に一定量の２％（ｗ／ｖ）タウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。

【0347】

（６）以上の操作により、対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬＢＴ−７）」を調製した。
なお、この対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．６ｍＭであり、界面活性剤の濃度は０．５％（ｗ／ｖ）である。
また、このリパーゼ活性測定用基質溶液に、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。

【0348】

〔３〕緩衝液の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．４（２０℃）に調整して、緩衝液を調製した。

【0349】

Ｂｉｃｉｎｅ［緩衝剤］４０ｍＭ

【0350】

２．試薬の保存
（１）前記１の〔１〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を、２５℃で暗所に３０日間保存した。

【0351】

（２）前記１の〔２〕において調製した対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液を、２５℃で暗所に３０日間保存した。

【0352】

３．基質の分解量の測定
（１）前記１の〔３〕において調製した調製当日の緩衝液を第１試薬とし、前記２の（１）において２５℃（暗所）にて３０日間保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を第２試薬とした。
この第１試薬の１，６００μＬに、この第２試薬の９６０μＬを添加し、混合して、混合液とした。

【0353】

（２）次に、前記（１）において得た混合液の吸収曲線を測定した。
なお、この吸収曲線の測定は、ＤＵ７５００型分光光度計（販売元：ベックマンコールター株式会社［日本国］）を使用して行った。

【0354】

（３）また、前記（１）における第２試薬を本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液から、前記２の（２）において２５℃（暗所）にて３０日間保存した対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液に替えること以外は、前記（１）〜（２）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として前記２の（２）の対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の混合液の吸収曲線を測定した。

【0355】

４．測定結果
前記３において測定した第２試薬として前記２の（１）の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の混合液の吸収曲線を図１に示した。

【0356】

また、前記３において測定した第２試薬として前記２の（２）の対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の混合液の吸収曲線を図２に示した。

【0357】

なお、この図１及び図２それぞれにおいて、横軸は「波長」（単位：ｎｍ）を示し、そして縦軸は「吸光度」（単位：Ａｂｓ）を示す。

【0358】

５．考察
（１）ＤＧＧＭＲよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液、及びＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として用いるリパーゼ活性測定用基質溶液においては、その保存中ＤＧＧＭＲは徐々に加水分解される。
そして、このＤＧＧＭＲの分解により、６’−メチルレゾルフィンが最終的に生成する。

【0359】

ところで、この６’−メチルレゾルフィンは５８０ｎｍに吸収極大を有する。
そこで、図１及び図２それぞれの吸収曲線において、６’−メチルレゾルフィンの生成を示す５８０ｎｍのピークの高さ（増加度）より、６’−メチルレゾルフィンの生成量、すなわちＤＧＧＭＲの分解量（加水分解量）を求めた。

【0360】

（２）その結果、図１、すなわち本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を２５℃（暗所）にて３０日間保存した場合のＤＧＧＭＲの分解量は４．８％であった。
これに対して、図２、すなわち対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液を２５℃（暗所）にて３０日間保存した場合のＤＧＧＭＲの分解量は８．９％であった。

【0361】

（３）つまり、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の前記保存時におけるＤＧＧＭＲの分解量は、対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液の前記保存時におけるＤＧＧＭＲの分解量の５４％にしかすぎないことが分かる。

【0362】

（４）このことより、本発明は、ＤＧＧＭＲの分解を効果的に抑制することができ、保存安定性が優れ、そして長期間正確な測定値を得ることができるものであることが確かめられた。

【0363】

〔実施例２〕（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の効果の確認−２）
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。

【0364】

１．試薬
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液（本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液）を調製した。
そして、対照として、市販試薬の基質液を用いた。
また、緩衝液を調製した。

【0365】

〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の調製
（１）本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０４５グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。

【0366】

（２）次に、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）である、ＫＦ−３５５Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）の０．６グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。

【0367】

（３）前記（２）の添加後、このビーカーを６７℃において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルであるＫＦ−３５５Ａとを混合した。

【0368】

この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」を調製した。

【0369】

【0370】

（４）次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。

【0371】

そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」との混合を行った。

【0372】

【0373】

（５）次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物）と一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］との混合後の混合液」に、更に一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。

【0374】

（６）以上の操作により、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−３５５Ａ）」を調製した。
なお、このリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．３ｍＭであり、本変性シリコーンオイル（ＫＦ−３５５Ａ）の濃度は０．３％（ｗ／ｖ）である。
また、このリパーゼ活性測定用基質溶液に、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。

【0375】

〔２〕対照市販試薬
市販のリパーゼ活性測定試薬（リパーゼ活性測定試薬キット）である「リキテックリパーゼカラーＩＩ」（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を、対照として用いた。
なお、この「リキテックリパーゼカラーＩＩ」［以下、「対照市販試薬」ということがある］は、第１試薬である「緩衝液」、及び第２試薬である「基質液」（ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として０．２７ｍＭの濃度で含む）よりなるものである。
この「対照市販試薬」の「基質液」を本実施例における検討に用いた。

【0376】

〔３〕緩衝液の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．４（２０℃）に調整して、緩衝液を調製した。

【0377】

Ｂｉｃｉｎｅ［緩衝剤］４０ｍＭ

【0378】

２．試薬の保存
（１）前記１の〔１〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を、３０℃で暗所に３５日間保存した。

【0379】

（２）前記１の〔２〕の対照市販試薬の基質液を、３０℃で暗所に３５日間保存した。

【0380】

３．基質の分解量の測定
（１）前記１の〔３〕において調製した調製当日の緩衝液を第１試薬とし、前記２の（１）において３０℃（暗所）にて保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を第２試薬として、以下の測定を行った。
なお、この測定は、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の保存開始日（０日目）、保存７日後、保存１５日後、保存２１日後、及び保存３５日後の各々の日に、当該期間保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液をそれぞれ使用して行った。
まず、この第１試薬の１，６００μＬに、この第２試薬の９６０μＬを添加し、混合して、混合液とした。

【0381】

（２）次に、前記（１）において得た混合液の波長５８０ｎｍにおける吸光度を、ＤＵ７５００型分光光度計（販売元：ベックマンコールター株式会社［日本国］）を使用して測定した。

【0382】

（３）次に、前記１の〔３〕において調製した調製当日の緩衝液の波長５８０ｎｍにおける吸光度を盲検（ブランク）として、ＤＵ７５００型分光光度計（販売元：ベックマンコールター株式会社［日本国］）を使用して測定した。

【0383】

（４）次に、前記（２）において測定した吸光度値から前記（３）において測定した吸光度値［盲検（ブランク）］を差し引いて、吸光度差の値を得た。

【0384】

（５）次に、前記（４）で得た吸光度差の値を、６’−メチルレゾルフィンの５８０ｎｍにおけるモル吸光係数（６０．６５［単位：ｃｍ×μｍｏｌ^−１］）で除して、保存時のＤＧＧＭＲの分解により生成した６’−メチルレゾルフィンの濃度［単位：ｍＭ］を算出した。

【0385】

（６）次に、前記１の〔１〕の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．３ｍＭ）で、前記（５）で得た保存時の分解により生成した６’−メチルレゾルフィンの濃度［単位：ｍＭ］を除して、ＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの生成６’−メチルレゾルフィンの濃度の比率［単位：％］を算出した。
すなわち、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を算出した。

【0386】

（７）また、前記（１）における第２試薬を本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液から、前記２の（２）において３０℃（暗所）にて３５日間保存した対照市販試薬の基質液に替えること、及び前記（６）における本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．３ｍＭ）を、前記１の〔２〕の対照市販試薬の基質液におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．２７ｍＭ）に替えること以外は、前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として前記２の（２）の対照市販試薬の基質液を用いた場合のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの生成６’−メチルレゾルフィンの濃度の比率［単位：％］を算出した。
すなわち、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を算出した。

【0387】

４．測定結果
前記３において測定した、第２試薬として前記２の（１）の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を表１及び図３に示した。

【0388】

また、前記３において測定した、第２試薬として前記２の（２）の対照市販試薬の基質液を用いた場合の、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］も表１及び図３に示した。

【0389】

なお、この表１及び図３の各々においては、保存開始日（０日目）の「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「０（ゼロ）」として、この保存開始日（０日目）からの「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を示した。

【0390】

なお、この図３において、横軸は「試薬の保存期間」（単位：日）を示し、そして縦軸は「ＤＧＧＭＲの分解率」の値（単位：％）を示す。

【0391】

また、この図３において、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「■」で示し、そして、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「▲」で示す。

【0392】

【表1】

【0393】

５．考察
（１）３０℃で１５日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値が０．２％であるのに対して、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は１．４％であることが、表１及び図３より分かる。
すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「ＤＧＧＭＲの分解率」は、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の１４％にしかすぎないことが分かる。
（２）また、３０℃で３５日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値が０．４％であるのに対して、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は３．３％であることが、表１及び図３より分かる。
すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「ＤＧＧＭＲの分解率」は、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の１２％にしかすぎないことが分かる。
（３）従って、本実施例の検討結果からも、本発明は、ＤＧＧＭＲの分解を効果的に抑制することができ、保存安定性が優れ、そして長期間正確な測定値を得ることができるものであることが確かめられた。

【0394】

〔実施例３〕（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の効果の確認−３）
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。

【0395】

１．試薬
計４種類の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液（本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液）を調製した。
そして、対照として、市販試薬の基質液を用いた。
また、緩衝液を調製した。

【0396】

〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の調製
（１）本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を、４個のビーカー（容量：１０ｍＬ）のそれぞれに、０．０９グラム［ｇ］ずつ量り取った。

【0397】

（２）次に、下記の（ａ）〜（ｄ）の４種類の側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）をそれぞれ４．０グラム［ｇ］ずつ量り取り、これを１種類ごとにそれぞれ異なる前記（１）のビーカーに添加した。

【0398】

（ａ）ＫＦ−３５１Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）
（ｂ）ＫＦ−３５４Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）
（ｃ）ＫＦ−３５５Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）
（ｄ）ＫＦ−６０１１（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）

【0399】

（３）前記（２）の添加後、各々のビーカーを６７℃において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕とそれぞれの本変性シリコーンオイルとを混合した。

【0400】

この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」を調製した。

【0401】

【0402】

（４）次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の純水」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。

【0403】

そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の純水」との混合を行った。

【0404】

【0405】

（５）次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物）と一定量の純水との混合後の混合液」に、更に一定量の純水を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。

【0406】

（６）以上の操作により、下記の（Ａ）〜（Ｄ）の計４種類の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を調製した。
なお、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計４種類）において、いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．６ｍＭであり、本変性シリコーンオイルの濃度は２．０％（ｗ／ｖ）である。
また、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計４種類）のいずれにも、濃度勾配や強い濁り等は見られず、それぞれ均質に混合されていることを目視にて確認した。

【0407】

（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−３５１Ａ）
（Ｂ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｂ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−３５４Ａ）
（Ｃ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｃ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−３５５Ａ）
（Ｄ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｄ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−６０１１）

【0408】

【0409】

〔３〕緩衝液の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．４（２０℃）に調整して、緩衝液を調製した。

【0410】

Ｂｉｃｉｎｅ［緩衝剤］４０ｍＭ

【0411】

２．試薬の保存
（１）前記１の〔１〕の（６）の（Ａ）〜（Ｄ）の４種類の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のそれぞれを、２５℃で暗所に３１日間保存した。

【0412】

（２）前記１の〔２〕の対照市販試薬の基質液を、２５℃で暗所に３２日間保存した。

【0413】

３．基質の分解量の測定
（１）前記１の〔３〕において調製した調製当日の緩衝液を第１試薬とし、前記２の（１）において２５℃（暗所）にて保存した「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」を第２試薬として、以下の測定を行った。
なお、この測定は、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の保存開始日（０日目）、保存５日後、保存２３日後、及び保存３１日後の各々の日に、当該期間保存した「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」をそれぞれ使用して行った。
まず、この第１試薬の１，６００μＬに、この第２試薬の９６０μＬを添加し、混合して、混合液とした。

【0414】

【0415】

【0416】

【0417】

【0418】

（６）次に、前記１の〔１〕の（６）の「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．６ｍＭ）で、前記（５）で得た保存時の分解により生成した６’−メチルレゾルフィンの濃度［単位：ｍＭ］を除して、ＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの生成６’−メチルレゾルフィンの濃度の比率［単位：％］を算出した。
すなわち、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を算出した。

【0419】

（７）前記（１）における第２試薬を「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」から、前記２の（１）において２５℃（暗所）にて３１日間保存した「（Ｂ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｂ」に替えること以外は、前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として前記２の（１）の「（Ｂ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｂ」を用いた場合のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの生成６’−メチルレゾルフィンの濃度の比率［単位：％］を算出した。
すなわち、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を算出した。

【0420】

（８）前記（１）における第２試薬を「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」から、前記２の（１）において２５℃（暗所）にて３１日間保存した「（Ｃ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｃ」に替えること以外は、前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として前記２の（１）の「（Ｃ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｃ」を用いた場合のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの生成６’−メチルレゾルフィンの濃度の比率［単位：％］を算出した。
すなわち、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を算出した。

【0421】

（９）前記（１）における第２試薬を「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」から、前記２の（１）において２５℃（暗所）にて３１日間保存した「（Ｄ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｄ」に替えること以外は、前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として前記２の（１）の「（Ｄ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｄ」を用いた場合のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの生成６’−メチルレゾルフィンの濃度の比率［単位：％］を算出した。
すなわち、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を算出した。

【0422】

（１０）また、前記（１）における第２試薬を「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」から、前記２の（２）において２５℃（暗所）にて３２日間保存した対照市販試薬の基質液に替えること、前記（１）における測定の日を保存開始日（０日目）、保存８日後、保存１５日後、保存２１日後、保存２９日後、及び保存３２日後の各々の日に替えること、並びに前記（６）における「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．６ｍＭ）を、前記１の〔２〕の対照市販試薬の基質液におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．２７ｍＭ）に替えること以外は、前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として前記２の（２）の対照市販試薬の基質液を用いた場合のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの生成６’−メチルレゾルフィンの濃度の比率［単位：％］を算出した。
すなわち、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を算出した。

【0423】

４．測定結果
前記３において測定した、第２試薬として前記２の（１）の４種類の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液［（Ａ）〜（Ｄ）］を用いた場合の、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を表２及び図４に示した。

【0424】

また、前記３において測定した、第２試薬として前記２の（２）の対照市販試薬の基質液を用いた場合の、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］も表２及び図４に示した。

【0425】

なお、この表２及び図４の各々においては、保存開始日（０日目）の「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「０（ゼロ）」として、この保存開始日（０日目）からの「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を示した。

【0426】

なお、この図４において、横軸は「試薬の保存期間」（単位：日）を示し、そして縦軸は「ＤＧＧＭＲの分解率」の値（単位：％）を示す。

【0427】

また、この図４において、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「＊」で示し、「（Ｂ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｂ」における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「◆」で示し、「（Ｃ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｃ」における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「■」で示し、
「（Ｄ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｄ」における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「●」で示し、そして、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「▲」で示す。

【0428】

【表2】

【0429】

５．考察
（１）表２及び図４より、２５℃で３１日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「（Ａ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ」における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は０．３％であり、「（Ｂ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｂ」における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は０．４％であり、「（Ｃ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｃ」における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は０．８％であり、そして「（Ｄ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｄ」における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は０．５％であることが分かる。

【0430】

また、表２及び図４より、２５℃で３２日間保存した場合、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は１．４％であることが分かる。

【0431】

すなわち、４種類の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液［（Ａ）〜（Ｄ）］のいずれにおいても、その「ＤＧＧＭＲの分解率」は、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」に比べ大幅に低いことが分かる。

【0432】

（２）よって、本実施例の検討結果からも、本発明は、ＤＧＧＭＲの分解を効果的に抑制することができ、保存安定性が優れ、そして長期間正確な測定値を得ることができるものであることが確かめられた。

【0433】

〔実施例４〕（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の効果の確認−４）
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。

【0434】

【0435】

【0436】

【0437】

【0438】

この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」を調製した。

【0439】

【0440】

【0441】

【0442】

【0443】

【0444】

【0445】

【0446】

〔３〕緩衝液の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．４（２０℃）に調整して、緩衝液を調製した。

【0447】

Ｂｉｃｉｎｅ［緩衝剤］４０ｍＭ

【0448】

２．試薬の保存
（１）前記１の〔１〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を、３０℃で暗所に３５日間保存した。

【0449】

（２）前記１の〔２〕の対照市販試薬の基質液を、３０℃で暗所に３５日間保存した。

【0450】

【0451】

【0452】

【0453】

【0454】

【0455】

【0456】

（７）また、前記（１）における第２試薬を本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液から、前記２の（２）において３０℃（暗所）にて３５日間保存した対照市販試薬の基質液に替えること、前記（１）における測定の日を保存開始日（０日目）、保存７日後、保存１５日後、保存２１日後、及び保存３５日後の各々の日に替えること、並びに前記（６）における本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．３ｍＭ）を、前記１の〔２〕の対照市販試薬の基質液におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．２７ｍＭ）に替えること以外は、前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として前記２の（２）の対照市販試薬の基質液を用いた場合のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの生成６’−メチルレゾルフィンの濃度の比率［単位：％］を算出した。
すなわち、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を算出した。

【0457】

４．測定結果
前記３において測定した、第２試薬として前記２の（１）の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を表３及び図５に示した。

【0458】

また、前記３において測定した、第２試薬として前記２の（２）の対照市販試薬の基質液を用いた場合の、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］も表３及び図５に示した。

【0459】

なお、この表３及び図５の各々においては、保存開始日（０日目）の「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「０（ゼロ）」として、この保存開始日（０日目）からの「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を示した。

【0460】

なお、この図５において、横軸は「試薬の保存期間」（単位：日）を示し、そして縦軸は「ＤＧＧＭＲの分解率」の値（単位：％）を示す。

【0461】

また、この図５において、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「■」で示し、そして、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「▲」で示す。

【0462】

【表3】

【0463】

５．考察
（１）表３及び図５より、３０℃で３５日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は０．４％であることが分かる。

【0464】

また、表３及び図５より、３０℃で３５日間保存した場合、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は３．３％であることが分かる。

【0465】

すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の「ＤＧＧＭＲの分解率」は、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」に比べ大幅に低いことが分かる。
（２）よって、本実施例の検討結果からも、本発明は、ＤＧＧＭＲの分解を効果的に抑制することができ、保存安定性が優れ、そして長期間正確な測定値を得ることができるものであることが確かめられた。

【0466】

〔実施例５〕（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の効果の確認−５）
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。

【0467】

【0468】

【0469】

【0470】

【0471】

この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」を調製した。

【0472】

【0473】

【0474】

【0475】

【0476】

【0477】

【0478】

【0479】

〔３〕緩衝液の調製
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．４（２０℃）に調整して、緩衝液を調製した。

【0480】

Ｂｉｃｉｎｅ［緩衝剤］４０ｍＭ

【0481】

２．試薬の保存
（１）前記１の〔１〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を、１０℃で暗所に３９０日間保存した。

【0482】

（２）前記１の〔２〕の対照市販試薬の基質液を、５℃で暗所に３００日間保存した。

【0483】

３．基質の分解量の測定
（１）前記１の〔３〕において調製した調製当日の緩衝液を第１試薬とし、前記２の（１）において１０℃（暗所）にて保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を第２試薬として、以下の測定を行った。
なお、この測定は、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の保存開始日（０日目）、保存９０日後、保存１８０日後、保存２７０日後、保存３６０日後、及び保存３９０日後の各々の日に、当該期間保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液をそれぞれ使用して行った。
まず、この第１試薬の１，６００μＬに、この第２試薬の９６０μＬを添加し、混合して、混合液とした。

【0484】

【0485】

【0486】

【0487】

【0488】

【0489】

（７）また、前記（１）における第２試薬を本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液から、前記２の（２）において５℃（暗所）にて３００日間保存した対照市販試薬の基質液に替えること、前記（１）における測定の日を保存開始日（０日目）、保存９０日後、保存１５０日後、及び保存３００日後の各々の日に替えること、並びに前記（６）における本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．３ｍＭ）を、前記１の〔２〕の対照市販試薬の基質液におけるＤＧＧＭＲの濃度（０．２７ｍＭ）に替えること以外は、前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として前記２の（２）の対照市販試薬の基質液を用いた場合のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの生成６’−メチルレゾルフィンの濃度の比率［単位：％］を算出した。
すなわち、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を算出した。

【0490】

４．測定結果
前記３において測定した、第２試薬として前記２の（１）の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］を表４及び図６に示した。

【0491】

また、前記３において測定した、第２試薬として前記２の（２）の対照市販試薬の基質液を用いた場合の、「試薬中のＤＧＧＭＲ濃度１ｍＭ当りの、試薬保存時に分解したＤＧＧＭＲの比率」（ＤＧＧＭＲの分解率）［単位：％］も表４及び図６に示した。

【0492】

なお、この表４及び図６の各々においては、保存開始日（０日目）の「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「０（ゼロ）」として、この保存開始日（０日目）からの「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を示した。

【0493】

なお、この図６において、横軸は「試薬の保存期間」（単位：日）を示し、そして縦軸は「ＤＧＧＭＲの分解率」の値（単位：％）を示す。

【0494】

また、この図６において、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「■」で示し、そして、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値を「▲」で示す。

【0495】

【表4】

【0496】

５．考察
（１）表４及び図６より、１０℃で３９０日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は０．６％であることが分かる。

【0497】

また、表４及び図６より、５℃で３００日間保存した場合、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」の値は２．１％であることが分かる。

【0498】

すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の「ＤＧＧＭＲの分解率」は、対照市販試薬の基質液における「ＤＧＧＭＲの分解率」に比べ大幅に低いことが分かる。
（２）よって、本実施例における冷蔵保存時の検討結果からも、本発明は、ＤＧＧＭＲの分解を効果的に抑制することができ、保存安定性が優れ、そして長期間正確な測定値を得ることができるものであることが確かめられた。

【0499】

〔実施例６〕（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の効果の確認−６）
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。

【0500】

１．試薬
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液（本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液）を計３ロット調製した。

【0501】

（１）本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０４５グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。

【0502】

【0503】

【0504】

この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」を調製した。

【0505】

【0506】

【0507】

【0508】

【0509】

【0510】

（６）以上の操作により、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−３５５Ａ）」を調製した。
これを第１ロットとした。

【0511】

（７）また、更に２回ずつ前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行うことにより、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−３５５Ａ）」を個別に２回調製した。
これらを第２ロット及び第３ロットとした。

【0512】

（８）なお、前記（１）〜（７）において調製した、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットそれぞれにおいて、いずれもリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．３ｍＭであり、本変性シリコーンオイル（ＫＦ−３５５Ａ）の濃度は０．３％（ｗ／ｖ）である。
また、これらのいずれのリパーゼ活性測定用基質溶液においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。

【0513】

２．試薬の保存
前記１において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットのそれぞれを、１０℃で暗所に１６ヶ月間保存した。

【0514】

３．本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径の測定
前記２において保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットについて、それぞれのエマルジョンのミセル径を測定した。

【0515】

なお、この測定は、前記の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の保存開始時（０日目）、及び保存１６ヶ月後の各々の時に、当該期間保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液をそれぞれ使用して行った。

【0516】

（１）前記２において１０℃（暗所）にて１６ヶ月間保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットのそれぞれの２ｍＬを各々別個のプラスチックセルに入れた。

【0517】

（２）次に、これらのプラスチックセルについて順に動的光散乱式粒子径分布測定装置（型式：ＮａｎｏｔｒａｃＵＰＡ−ＥＸ２５０、販売元：日機装株式会社［日本国］）の光学プローブ（光ファイバー）を中に入れ、各々のプラスチックセル中の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットそれぞれのエマルジョンのミセル径（粒子径）の測定を行った。なお、この測定は室温（２５℃）にて行った。

【0518】

４．測定結果
前記３において測定した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第１ロットのエマルジョンのミセル径（粒子径）の分布を図７に示し、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第２ロットのエマルジョンのミセル径（粒子径）の分布を図８に示し、そして、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第３ロットのエマルジョンのミセル径（粒子径）の分布を図９に示した。

【0519】

なお、これらの図７、図８及び図９における本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の値は平均値の値を示す。

【0520】

また、これらの図７、図８及び図９において、横軸はエマルジョンのミセル径（粒子径）［平均値］（単位：μｍ）を示し、そして縦軸は頻度（単位：％）を示す。

【0521】

そして、これらの図７、図８及び図９において、保存開始時（０日目）の測定結果を破線で示し、そして、１６ヶ月間保存した時の測定結果を直線で示す。

【0522】

５．考察
これらの図７、図８及び図９より、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットのいずれにおいても、保存開始時（０日目）の測定結果及び１６ヶ月間保存時の測定結果の両方において、そのエマルジョンのミセル径（粒子径）の分布が１００ｎｍ〜２００ｎｍ（０．１μｍ〜０．２μｍ）の範囲及びその近辺にあることが分かる。

【0523】

また、これらの図７、図８及び図９より、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットのいずれにおいても、そのエマルジョンのミセル径（粒子径）の分布が、保存開始時（０日目）と１６ヶ月間保存時とでほぼ同様なものであることが分かる。

【0524】

従って、これらのことより、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、リパーゼとの反応の速度が高く、エマルジョンが安定であり、リパーゼ活性測定用基質溶液を長期間保存・使用できる効果の高い８０ｎｍ〜６００ｎｍの範囲にそのエマルジョンのミセル径（粒子径）があり、そして実際に、そのエマルジョンのミセル径（粒子径）の分布が長期間（１６ヶ月間）安定に保たれていることが確かめられた。

【0525】

〔実施例７〕（本発明のリパーゼ活性測定試薬の効果の確認）
本発明のリパーゼ活性測定試薬（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とする）における保存安定性の効果を確認した。

【0526】

１．本発明のリパーゼ活性測定試薬
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬をそれぞれ調製した。

【0527】

〔１〕第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．４（２０℃）に調整して、本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬を調製した。

【0528】

デオキシコール酸ナトリウム［リパーゼ賦活化剤］２％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム［リパーゼ活性化剤］２０ｍＭ
コリパーゼ（ブタ膵臓由来、販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）７５０Ｋ単位／Ｌ（１０ｍｇ／Ｌ）
Ｂｉｃｉｎｅ［緩衝剤］８０ｍＭ

【0529】

なお、この第１試薬を個別に計３回調製し、これらをそれぞれ本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬の第１ロット、第２ロット及び第３ロットとした。

【0530】

〔２〕第２試薬
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第２試薬を計３ロット調製した。

【0531】

【0532】

【0533】

【0534】

この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本変性シリコーンオイルの混合物」を調製した。

【0535】

【0536】

【0537】

【0538】

【0539】

【0540】

（６）以上の操作により、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−３５５Ａ）」を調製した。
これを本発明のリパーゼ活性測定試薬の第２試薬の第１ロットとした。

【0541】

（７）また、更に２回ずつ前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行うことにより、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本変性シリコーンオイル：ＫＦ−３５５Ａ）」を個別に２回調製した。
これらをそれぞれ本発明のリパーゼ活性測定試薬の第２試薬の第２ロット及び第３ロットとした。

【0542】

【0543】

２．試薬の保存
（１）前記１の〔１〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットのそれぞれを、１０℃で暗所に１３ヶ月間保存した。

【0544】

（２）前記１の〔２〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定試薬の第２試薬の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットのそれぞれを、１０℃で暗所に１３ヶ月間保存した。

【0545】

３．試料
下の「（１）管理血清−１」、「（２）管理血清−２」、及び「（３）管理血清−３」をそれぞれ試料として用いた。

【0546】

（１）管理血清−１
市販の精度管理用管理血清である「ＡａｌｔｏＣｏｎｔｒｏｌＩＭ」（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）と精度管理用管理血清である「ＡａｌｔｏＣｏｎｔｒｏｌＩＩ」の「試作品」（株式会社シノテスト［日本国］）を等量ずつ混合したものを、「管理血清−１」として用いた。

【0547】

（２）管理血清−２
精度管理用管理血清である「ＡａｌｔｏＣｏｎｔｒｏｌＩＩ」の「試作品」（株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−２」として用いた。

【0548】

（３）管理血清−３
市販の精度管理用管理血清である「ＱＡＰトロール２Ｘ」〔製造番号：ＱＬ−２１５〕（販売元：シスメックス株式会社［日本国］）を、「管理血清−３」として用いた。

【0549】

４．試料中のリパーゼ活性の測定
前記２において１０℃（暗所）にて１３ヶ月間保存した本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬を使用して、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ［日本国］）により、前記３の各試料のリパーゼ活性の測定を行った。
なお、この測定は、この本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬の保存開始時（０日目）、保存３ヶ月後、保存６ヶ月後、保存９ヶ月後、保存１２ヶ月後、及び保存１３ヶ月後の各々の時に、当該期間保存した本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬をそれぞれ使用して行った。

【0550】

（１）前記の７１８０形汎用自動分析装置において、前記３のそれぞれの試料（「（１）管理血清−１」、「（２）管理血清−２」、及び「（３）管理血清−３」）について、これらの試料の２．６μＬに、それぞれ前記２の（１）で保存した「第１試薬」の第１ロットの１６０μＬを第１試薬として添加し、３７℃で反応させた。

【0551】

（２）次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記２の（２）で保存した「第２試薬」の第１ロットの９６μＬを第２試薬として添加し、３７℃で反応させた。

【0552】

（３）次に、２０ポイント（第１試薬添加後３４０．５１０秒）から２４ポイント（第１試薬添加後４１１．８８７秒）に掛けての吸光度変化量を主波長５７０ｎｍ、副波長７００ｎｍにて測定した。（試料中に含まれていたリパーゼの活性値に応じて生成する６’−メチルレゾルフィンの濃度増加に基づく吸光度変化量の測定）

【0553】

（４）なお、較正（キャリブレーション）のための較正物質（キャリブレーター）として、「自動分析用キャリブレーターＩＩ（Ｃ．ｆ．ａ．ｓ．ＩＩ）」（製造番号：１６７２５５−０１、販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を用いた。
この「自動分析用キャリブレーターＩＩ（Ｃ．ｆ．ａ．ｓ．ＩＩ）」を試料とすること以外は、前記（１）〜（３）の記載の通りに操作を行い、較正物質である「自動分析用キャリブレーターＩＩ（Ｃ．ｆ．ａ．ｓ．ＩＩ）」を測定したときの吸光度変化量を測定した。（当該較正物質に含まれているリパーゼの活性値［既知値］に応じて生成する６’−メチルレゾルフィンの濃度増加に基づく吸光度変化量の測定）

【0554】

（５）また、試薬盲検（試薬ブランク）の測定のため、生理食塩水を用いた。
この生理食塩水を試料とすること以外は、前記（１）〜（３）の記載の通りに操作を行い、生理食塩水を測定したときの吸光度変化量を測定した。（試薬盲検の吸光度変化量の測定）

【0555】

（６）次に、前記（３）において求めた前記３のそれぞれの試料についての当該ポイント間の吸光度変化量から、前記（５）において求めた当該ポイント間の試薬盲検の吸光度変化量を差し引いて、「試料の吸光度変化量差の値」を求めた。

【0556】

また、前記（４）において求めた較正物質（リパーゼ活性値が既知）についての当該ポイント間の吸光度変化量から、前記（５）において求めた当該ポイント間の試薬盲検の吸光度変化量を差し引いて、「較正物質の吸光度変化量差の値」を求めた。

【0557】

次に、前記の「試料の吸光度変化量差の値」と、「較正物質の吸光度変化量差の値」と、既知である「較正物質のリパーゼ活性値」とを対比し、比例計算を行うことにより、前記３の各試料のリパーゼ活性値を求めた。

【0558】

（７）また、前記（１）における第１試薬を前記２の（１）で保存した「第１試薬」の第１ロットから第２ロットに替えること、及び前記（２）における第２試薬を前記２の（２）で保存した「第２試薬」の第１ロットから第２ロットに替えること以外は、前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行い、第１試薬として第２ロットを用い、かつ第２試薬として第２ロットを用いた場合の前記３の各試料のリパーゼ活性値を求めた。

【0559】

（８）また、前記（１）における第１試薬を前記２の（１）で保存した「第１試薬」の第１ロットから第３ロットに替えること、及び前記（２）における第２試薬を前記２の（２）で保存した「第２試薬」の第１ロットから第３ロットに替えること以外は、前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行い、第１試薬として第３ロットを用い、かつ第２試薬として第３ロットを用いた場合の前記３の各試料のリパーゼ活性値を求めた。

【0560】

５．測定結果
前記４において測定し、求めた前記３の各試料のリパーゼ活性値を表５に示した。

【0561】

なお、この表５において示した測定値（各試料のリパーゼ活性値）の単位は、「単位／Ｌ（Ｕｎｉｔ／Ｌ）」である。

【0562】

また、この表５において、（カッコ）の中の数値は、各測定値（リパーゼ活性値）を、保存開始時（０日目）の各試料の測定値（リパーゼ活性値）で除した値をパーセント表示で表したものである。

【0563】

なお、前記４において、第１試薬として第１ロットを用い、かつ第２試薬として第１ロットを用いて測定し、求めた前記３の各試料のリパーゼ活性値を図１０に示した。

【0564】

また、前記４において、第１試薬として第２ロットを用い、かつ第２試薬として第２ロットを用いて測定し、求めた前記３の各試料のリパーゼ活性値を図１１に示した。

【0565】

また、前記４において、第１試薬として第３ロットを用い、かつ第２試薬として第３ロットを用いて測定し、求めた前記３の各試料のリパーゼ活性値を図１２に示した。

【0566】

なお、これらの図１０、図１１及び図１２のそれぞれにおいて、横軸は「試薬の保存期間」［単位：月］を示し、そして縦軸は「測定値（各試料のリパーゼ活性値）」［単位：単位／Ｌ（Ｕｎｉｔ／Ｌ）］を示す。

【0567】

また、これらの図１０、図１１及び図１２のそれぞれにおいて、試料が「（１）管理血清−１」である場合の測定値を「●」で示し、試料が「（２）管理血清−２」である場合の測定値を「▲」で示し、そして、試料が「（３）管理血清−３」である場合の測定値を「■」で示す。

【0568】

【表5】

【0569】

６．考察
（１）これらの表５及び図１０より、本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬としてそれぞれの第１ロットを使用したとき、保存開始時（０日目）の測定値（リパーゼ活性値）に対する試薬保存中の測定値は、「（１）管理血清−１」においては９８％〜１００％であり、「（２）管理血清−２」においては１００％〜１０１％であり、そして、「（３）管理血清−３」においては９８％〜１０１％であることが分かる。

【0570】

（２）また、これらの表５及び図１１より、本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬としてそれぞれの第２ロットを使用したとき、保存開始時（０日目）の測定値（リパーゼ活性値）に対する試薬保存中の測定値は、「（１）管理血清−１」においては９８％〜１０１％であり、「（２）管理血清−２」においては１００％〜１０１％であり、そして、「（３）管理血清−３」においては９７％〜１０４％であることが分かる。

【0571】

（３）更に、これらの表５及び図１２より、本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬としてそれぞれの第３ロットを使用したとき、保存開始時（０日目）の測定値（リパーゼ活性値）に対する試薬保存中の測定値は、「（１）管理血清−１」においては９８％〜１０１％であり、「（２）管理血清−２」においては１００％〜１０１％であり、そして、「（３）管理血清−３」においては９９％〜１０４％であることが分かる。

【0572】

（４）すなわち、これらの表５、図１０、図１１及び図１２より、本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットのいずれにおいても、１０℃（暗所）にて１３ヶ月間保存したときの測定値（リパーゼ活性値）は、保存開始時（０日目）の測定値（リパーゼ活性値）とほぼ同一であることが分かる。

【0573】

つまり、本発明のリパーゼ活性測定試薬においては、その性能が長期間（１３ヶ月間）安定に保たれていることが分かる。

【0574】

（５）よって、本実施例の検討結果からも、本発明は、保存安定性が優れ、そして長期間正確な測定値を得ることができるものであることが確かめられた。

【図1】