特許 6817939 ペプチド産生のための融合パートナー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6817939

(24)【登録日】2021年1月4日

(45)【発行日】2021年1月20日

(54)【発明の名称】ペプチド産生のための融合パートナー

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20210107BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210107BHJP

   C12N 9/48 20060101ALI20210107BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20210107BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210107BHJP

   C07K 14/46 20060101ALI20210107BHJP

   C07K 14/475 20060101ALI20210107BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20210107BHJP

   C07K 14/575 20060101ALI20210107BHJP

   C07K 14/745 20060101ALI20210107BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00

   C12N15/62 Z

   C12N9/48ZNA

   C12P21/00 C

   C12P21/00 E

   C12P21/00 K

   C12P21/00 F

   C12N1/21

   C07K14/46

   C07K14/475

   C07K14/52

   C07K14/575

   C07K14/745

【請求項の数】18

【全頁数】151

(21)【出願番号】特願2017-530121(P2017-530121)

(86)(22)【出願日】2015年11月30日

(65)【公表番号】特表2017-536835(P2017-536835A)

(43)【公表日】2017年12月14日

(86)【国際出願番号】US2015063027

(87)【国際公開番号】WO2016089782

(87)【国際公開日】20160609

【審査請求日】2018年11月22日

(31)【優先権主張番号】62/086,119

(32)【優先日】2014年12月1日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】517192537

【氏名又は名称】フェネックス インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】レタラック，ダイアン エム．

(72)【発明者】

【氏名】チャップマン，アダム

(72)【発明者】

【氏名】ブルック，トーベン アール．

(72)【発明者】

【氏名】ジン，ホンファン

【審査官】 佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−１３８６００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５３５１９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／１１３７６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−００６７４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０７５８７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Database GenBank [online], Accession No. AFJ56873.1，31-Jan-2014 updated, [retrieved on 24-Oct-2019]，Definition: hypothetical protein PflA506_1569 [Pseudomonas fluorescens A506]，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/387161674?sat=21&satkey=2591049

【文献】 Database NCBI Reference Sequence Database [online], Accession No. WP_003188927.1，28-May-2013 updated, [retrieved on 24-Oct-2019]，Definition: DSBA oxidoreductase [Pseudomonas fluorescens]，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/489281296?sat=46&satkey=76681892

【文献】 Database NCBI Reference Sequence Database [online], Accession No. WP_003190451，28-May-2013 updated, [retrieved on 24-Oct-2019]，Definition: molecular chaperone EcpD [Pseudomonas fluorescens]，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/489282834?sat=21&satkey=50645917

【文献】 Gene, 2009, 440(1-2), pp.9-15

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

組み換え融合タンパク質であって、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の配列を有する完全長のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ） ＦｋｌＢタンパク質；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列を有する完全長のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ） ＦｋｂＰタンパク質；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の配列を有する完全長のシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ） ＥｃｐＤタンパク質から選択されるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）シャペロンまたはフォールディングモジュレータータンパク質である、Ｎ末端融合パートナーと、
（ｉｉ）対象のポリペプチドと、
（ｉｉｉ）Ｎ末端融合パートナーと対象のポリペプチドとの間のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチドリンカーと
を含み、
プロテアーゼ切断部位での組み換え融合タンパク質の切断が対象のポリペプチドを放出し、放出された対象のポリペプチドが可溶性である、
組み換え融合タンパク質。

【請求項2】

対象のポリペプチドは、試薬タンパク質；治療用タンパク質；細胞外の受容体またはリガンド；プロテアーゼ；キナーゼ；血液タンパク質；ケモカイン；サイトカイン；抗体；抗体ベースの薬物；抗体断片；Ｆｃ融合タンパク質；抗凝血剤；血液因子；骨形態形成タンパク；改変タンパク質スキャホールド；酵素；成長因子；インターフェロン；インターロイキン；血栓溶解剤；またはホルモン；ヒト抗血友病因子；ヒト抗血友病因子フォンビルブラント因子複合体；抗血友病因子；アルビグルチド；アルグルコシダーゼアルファ；ヒト・アルファ−１プロテアーゼ阻害剤；ボツリヌス毒素タイプＢ；凝固ＩＸ因子Ｆｃ融合；凝固ＩＸ因子；凝固因子ＶＩＩａ；凝固ＸＩＩＩ因子Ａサブユニット；コラゲナーゼ・ヒストリチクス菌；ヒト血小板由来成長因子；アバタセプト；アブシキシマブ；アダリムマブ；アフリベルセプト；アガルシダーゼベータ；アルデスロイキン；アレファセプト；アレムツズマブ；アルグルコシダーゼアルファ；アルテプラーゼ；アナキンラ；オクトコグアルファ；ヒト抗トロンビン；バシリキシマブ；ベラタセプト；ベリムマブ；ベバシズマブ；Ａ型ボツリヌス毒素；Ｃ１エステラーゼ阻害剤；カナキヌマブ；セルトリズマブ；セツキシマブ；ダクリズマブ；ダルベポエチンアルファ；デノスマブ；ジゴキシン免疫Ｆａｂ；ドルナーゼアルファ；エカランチド；エクリズマブ；エタネルセプト；フィブリノゲン；フィルグラスチム；ゴリムマブ；イデュルスルファーゼ；インフリキシマブ；インターフェロンアルファ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファコン−１；インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−１ａ；インターフェロンベータ−１ｂ；インターフェロンガンマ−１ｂ；イピリムマブ；ラロニダーゼ；エポエチンアルファ；モロクトコグ（Ｍｏｒｏｃｔｏｃｏｇ）アルファ；ナタリズマブ；オクリプラスミン；オファツムマブ；オマリズマブ；オプレルベキン；パリフェルミン；パリビズマブ；パニツムマブ；ペルツズマブ；ラニビズマブ；ラスブリカーゼ；ラキシバクマブ；レテプラーゼ；リロナセプト；リツキシマブ；ロミプロスチム；サルグラモスチム；テネクテプラーゼ；トシリズマブ；トラスツズマブ；ウステキヌマブ；デシルジン；エンフビルチド；エキセナチド；フォリトロピンベータ；ヒアルロニダーゼ；インスリン、プロインスリン、長時間作用性のインスリンアナログ、即効性のインスリンアナログまたは即効性のインスリンアナログを形成するようにプロセシングされるプロインスリン、インスリンＣペプチド、ＩＧＦ−１、Ｇｌｐ−１、Ｇｌｐ−１アナログ、Ｇｌｐ−２、Ｇｌｐ−２アナログ、プラムリンチド、ジコノチド、ベカプレルミン、エンフビルチド、またはネシリチド、インスリンアスパルト；インスリンデグルデク；インスリンデテミル；インスリングラルギン；インスリングルリジン；ヒトインスリン；インスリンリスプロ；インスリンリスプロ・プロタミン；インスリンリスプロ；ランレオチド；リラグルチド；サーファクシン；メカセルミン；インスリン様増殖因子；ネシリチド；プラムリンチド；テデュグルチド；アボボツリヌストキシンＡ；アガルシダーゼアルファ；アンセスチム；アニストレプラーゼ；バトロキソビン；カルペリチド；カツマキソマブ；凝固ＶＩＩＩ因子；ジボテルミンアルファ；ドロトレコギンアルファ；エドトレオチド；エファリズマブ；エノキサパリンナトリウム；エポエチンデルタ；エプチフィバチド；エプトテルミンアルファ；フォリトロピンアルファ；ホミビルセン；ゴナドレリン；絨毛性ヒト性腺刺激ホルモン；（性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト）；イミグルセラーゼ；イソフェンインスリン；レノグラスチム；レピルジン；リペグフィルグラスチム；リキシセナチド；ルトロピンアルファ（ヒトの黄体ホルモン）；メポリズマブ；ミリモスチム（マクロファージコロニー刺激因子）；モガムリズマブ；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；モンテプラーゼ；オクトレオチド；パミテプラーゼ；パンクレリパーゼ；プラルモレリン（成長ホルモン放出因子ペプチド）；プロチレリン；ＰＴＨ １−８４；ｒｈＢＭＰ−２；ｒｈＢＭＰ−７；エプトテルミンアルファ；ロムルチド；セルモレリン；ソマトスタチン；ソマトレム；バソプレッシン；デスモプレシン；タリグルセラーゼアルファ；タルチレリン（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ）；タソネルミン；タスポグルチド；トロンボモジュリンアルファ；チロトロピンアルファ；トラフェルミン；ウロキナーゼ；ベラグルセラーゼアルファ；コレラ毒素Ｂ；抗血友病因子（エフラロクトコグアルファ）；ヒト・アルファ−１プロテアーゼ阻害剤；カプロマブペンデチド；デニロイキンジフチトクス；羊のジゴキシン免疫Ｆａｂ；エロスルファーゼアルファ；エポエチンアルファ；ＸＩＩＩ因子；インフルエンザ赤血球凝集素；インフルエンザノイラミニダーゼ；グルカルピダーゼ；ＨｅｐＢ表面抗原；ヒト・アルブミン；インコボツリヌムトキシン(Incobotulinumtoxin)；ノフェツモマブ(Nofetumomab)；オビヌツズマブ；大腸菌(Escherichia. coli)Ｌ−アスパラギナーゼ；エルウィニア(Erwinia)Ｌ−アスパラギナーゼ；シュードモナス(Pseudomonas)Ｌ−アスパラギナーゼ；ペムブロリズマブ；ラムシルマブ；シルツキシマブ；Ｔｂｏ−フィルグラスチム；百日咳毒素サブユニットＡ−Ｅ；ウシトロンビン；ヒトトロンビン；トシツモマブ；ベドリズマブ；Ｚｉｖ−アフリベルセプト；グルカゴン；ソマトロピン；プラスモジウムファルシパルム(Plasmodium falciparum)または三日熱マラリア原虫抗原；牛のエンテロキナーゼ、プラムリンチド、ジコノチド、ベカプレルミン、またはエンフビルチドである、請求項１に記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項3】

対象のポリペプチドは、小ペプチドまたは急速に分解するペプチドと、容易に分解するＮ末端を備えたタンパク質と、典型的には不溶性形態の細菌発現系で発現するタンパク質とから選択される、発現することが困難なタンパク質である、請求項１または２に記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項4】

対象のポリペプチドは小ペプチドまたは急速に分解するペプチドであり、ここで、対象のポリペプチドは、ｈＰＴＨ１−３４、Ｇｌｐ１、Ｇｌｐ２、ＩＧＦ−１ エキセナチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、テデュグルチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、プラムリンチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、ジコノチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、ベカプレルミン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、エンフビルチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、およびネシリチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）から選択される、請求項１−３のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項5】

対象のポリペプチドは容易に分解するＮ末端を備えたタンパク質であり、ここで、対象のポリペプチドはＮ−ｍｅｔ−ＧＣＳＦまたはプラスモジウムファルシパルム(P.falciparum) スポロゾイト周囲タンパクである、請求項１−３のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項6】

対象のポリペプチドは、非可溶性タンパク質として細菌発現系で一般的に発現されるタンパク質であり、ここで、対象のポリペプチドは、インスリンまたはインスリンアナログ、Ｎ−ｍｅｔ−ＧＣＳＦ、ＧＣＳＦ、またはＩＦＮ−βへとプロセシングされるプロインスリンである、請求項１−３のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項7】

対象のポリペプチドはプロインスリンであり、プロインスリンはインスリンまたはインスリンアナログへとプロセシングされ、プロインスリンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９；および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００から選択されるアミノ酸配列を有するＣペプチドを含む、請求項６に記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項8】

インスリンアナログは、インスリングラルギン、インスリンアスパルト、リスプロ、グルリジン、デテミル、またはデグルデクである、請求項６または７に記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項9】

切断部位は、エンテロキナーゼ、トリプシン、因子Ｘａ、および、フューリンからなる群の中の切断酵素によって認識される、請求項１−８のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項10】

リンカーはアフィニティータグを含む、請求項１−９のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項11】

リンカーは、
ａ．（Ｇ４Ｓ）_１、（Ｇ４Ｓ）_２、（Ｇ４Ｓ）_３、（Ｇ４Ｓ）_４、および（Ｇ４Ｓ）_５から選択されるスペーサー；
ｂ．マルトース結合タンパク質タグ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、およびＮｕｓタグから選択されるアフィニティータグ；および
ｃ．エンテロキナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、因子Ｘａ、およびフューリンから選択されるプロテアーゼ切断部位
を含む、請求項１−１０のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項12】

リンカーは、Ｎ末端からＣ末端に、（Ｇ４Ｓ）_２スペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）、ヘキサヒスチジンアフィニティータグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）、およびプロテアーゼ切断部位ＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）；Ｎ末端からＣ末端に、（Ｇ４Ｓ）_２スペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）、ヘキサヒスチジンアフィニティータグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）、およびプロテアーゼ切断部位ＲＫＲ；Ｎ末端からＣ末端に、（Ｇ４Ｓ）_２スペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）、ヘキサヒスチジンアフィニティータグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）、およびプロテアーゼ切断部位ＲＲＲ；Ｎ末端からＣ末端に、（Ｇ４Ｓ）_２スペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）、ヘキサヒスチジンアフィニティータグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）、およびプロテアーゼ切断部位ＬＶＰＲ；および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１−１１のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項13】

対象のポリペプチドはｈＰＴＨ１−３４であり、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１、９、１０、１１、または１２のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。

【請求項14】

請求項１−１３のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質の発現のための発現ベクターであって、前記組み換え融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。

【請求項15】

可溶性の対象のポリペプチドを産生する方法であって、
前記方法は、
（ｉ）発現構築物を含む発現ベクターを用いて形質転換された微生物の宿主細胞を培養する工程であって、ここで、発現構築物は請求項１−１３のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、工程と、
（ｉｉ）組み換え融合タンパク質を発現するために工程（ｉ）の宿主細胞を誘導する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の誘導された宿主細胞中で発現した組み換え融合タンパク質を精製する工程と、
（ｉｖ）対象のポリペプチドを放出するためにリンカー中の切断部位を認識する切断酵素を用いるインキュベーションによって工程（ｉｉｉ）の精製された組み換え融合タンパク質を切断する工程であって、それによって可溶性の対象のポリペプチドを得る工程、
を含む、方法。

【請求項16】

工程（ｉｉ）で発現した組み換え融合タンパク質の発現レベルを測定する工程、工程（ｉｉｉ）で精製された組み換え融合タンパク質の量を測定する工程、または適切に放出された工程（ｉｖ）で得られた可溶性の対象のポリペプチドの量を測定する工程、あるいはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）で得られた可溶性の対象のポリペプチドの量は、約０．１ｇ／Ｌから約２５ｇ／Ｌである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

得られた適切に放出された対象のポリペプチドは、無傷である、請求項１７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

異種の組み換えポリペプチドは、貧弱な溶解性と宿主細胞からの貧弱な分泌を引き起こし得る、タンパク質分解、低発現レベル、不適当なタンパク質フォールディングを含む原因により細菌発現系において高収率で発現することが困難な場合が多い。

【発明の概要】

【0002】

本発明は、対象のポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質を提供する。本明細書に記載されるような組み換え融合タンパク質の一部としての対象のポリペプチドの発現は、大量の高品質ポリペプチドの産生を可能にする。対象のポリペプチドは、小ペプチドまたは急速に分解するペプチド、例えば、副甲状腺ホルモンＮ末端断片（ＰＴＨ １−３４）、分解に弱いＮ末端を有するタンパク質、例えば、ＧＣＳＦ、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ スポロゾイト周囲タンパク、および、微生物発現系における不溶性形態で典型的に産生されるタンパク質、例えばインスリンまたはインスリンアナログＧＣＳＦまたはＩＦＮ−βへとプロセシング可能なプロインスリンを含んでいる。図１に概略的に示された組み換え融合タンパク質は、Ｎ末端の細菌融合パートナー、例えば、細菌シャペロンまたはフォールディングモジュレーターを含む。対象のポリペプチドとＮ末端の細菌シャペロンまたはフォールディングモジュレーターは、プロテアーゼ切断部位を含む柔軟なリンカー配列によって接続される。対象のポリペプチドは切断されると、Ｎ末端融合パートナーから解放される。本発明は、組み換え融合タンパク質を発現するためのベクターと、高収率で細菌の宿主細胞中の組み換え融合タンパク質を産生する方法とをさらに開示する。

【0003】

本発明の組み換え融合構築物は、例えば、タンパク質分解、低発現レベル、貧弱なフォールディング、および／または貧弱な分泌により、細菌発現系で過剰発現するのが難しい高収率の対象の組み換えポリペプチドを産生するのに役立つ。本発明の実施形態では、本発明の組み換え融合タンパク質は０．５ｇ／Ｌよりも高い力価で細菌の宿主細胞中で産生される。実施形態では、対象の組み換えポリペプチドは過剰発現するのが難しい細菌の宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。

【0004】

例えば、高濃度の尿素（例えば７Ｍ）を可溶化することを必要とする封入体中の融合タンパク質の一部として発現すると以前報告されていたＰＴＨ １−３４タンパク質は、高い力価発現（０．５ｇ／Ｌ以上）で溶解可能なＰＴＨ １−３４融合タンパク質の一部として産生されると本明細書では記載される。さらに、未変性条件下、例えば４Ｍ以下の濃度の尿素で、または一緒に尿素を用いることなく、精製を実行することができる。さらに本発明の方法を用いて、容易に分解するＮ末端を備えるタンパク質、例えば、Ｎ−ｍｅｔ−ＧＣＳＦまたはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ スポロゾイト周囲タンパクは、記載された融合タンパク質の一部として産生可能であり、宿主細胞プロテアーゼが融合タンパク質調製から取り除かれた後に、切断によってＮ末端融合パートナーから分離した。さらに本明細書に記載されるように、通常不溶性の形態で産生したプロインスリンは、リフォールディングする必要なく、本発明の組み換え融合タンパク質中の溶解可能な形態で大量に生産可能である。

【0005】

ゆえに、本発明は組み換え融合タンパク質を提供し、該組み換え融合タンパク質は、細菌シャペロンまたはフォールディングモジュレーターであるＮ末端融合パートナーと、対象のポリペプチドと、Ｎ末端融合パートナーと対象のポリペプチドとの間の切断部位を含むリンカーとを含む。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは以下から選択される：ＤｎａＪ様タンパク質；ＦｋｌＢタンパク質またはその切断；ＦｒｎＥタンパク質またはその切断；ＦｋｐＢ２タンパク質またはその切断；ＥｃｐＤタンパク質またはその切断；あるいは、Ｓｋｐタンパク質またはその切断。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは以下から選択される：Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪ様タンパク質；Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢタンパク質またはそのＣ末端切断；Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥタンパク質またはその切断；Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｐＢ２タンパク質またはそのＣ末端切断；あるいは、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤタンパク質またはそのＣ末端切断。ある実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、Ｃ末端から１〜２００のアミノ酸を取り除くために切断したＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢタンパク質、Ｃ末端から１〜２００のアミノ酸を取り除くために切断したＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤタンパク質、またはＣ末端から１〜１８０のアミノ酸を取り除くために切断したＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥタンパク質である。実施形態では、対象のポリペプチドは発現することが困難なタンパク質であり、以下から選択される：小ペプチドまたは急速に分解するペプチドと、容易に分解するＮ末端を備えたタンパク質と、典型的には不溶性形態の細菌発現系で発現するタンパク質。実施形態では、対象のポリペプチドは小ペプチドまたは急速に分解するペプチドであり、ここで、対象のポリペプチドは以下から選択される：ｈＰＴＨ１−３４、Ｇｌｐ１、Ｇｌｐ２、ＩＧＦ−１ エキセナチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、テデュグルチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、Ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、ベカプレルミン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、エンフビルチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、ネシリチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）。実施形態では、対象のポリペプチドは容易に分解するＮ末端を備えたタンパク質であり、ここで、対象のポリペプチドはＮ−ｍｅｔ−ＧＣＳＦまたはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ スポロゾイト周囲タンパクである。実施形態では、対象のポリペプチドは、非可溶性タンパク質として細菌発現系で一般的に発現したタンパク質であり、ここで、対象のポリペプチドは、インスリンまたはインスリンアナログＧＣＳＦまたはＩＦＮ−βへとプロセシングされるプロインスリンである。これらの実施形態のいずれかにおいて、プロインスリンＣペプチドは以下から選択されるアミノ酸配列を有する：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９；または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００。実施形態では、インスリンアナログは、インスリングラルギン、インスリンアスパルト、リスプロ、グルリジン（ｇｌｕｌｉｓｉｎｅ）、デテミル、またはデグルデクである。ある実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で説明されるアミノ酸配列を有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪ様タンパク質である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２で説明されるアミノ酸配列を有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢタンパク質である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４で説明されるアミノ酸配列を有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥタンパク質である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７で説明されるアミノ酸配列を有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤタンパク質である。実施形態では、組み換え融合タンパク質中の切断部位は、以下からなる群の中の切断酵素によって認識される：エンテロキナーゼ；トリプシン、因子Ｘａ；および、フューリン。請求項１〜１５のいずれかの組み換え融合タンパク質であって、リンカーはアフィニティータグを含む。ある実施形態では、アフィニティータグは以下から選択される：ポリヒスチジン；ＦＬＡＧタグ；ｍｙｃタグ；ＧＳＴタグ；ＭＢＰタグ；カルモジュリン・タグ；ＨＡタグ；Ｅ−タグ；Ｓ−タグ；ＳＢＰタグ；Ｓｏｆｔａｇ ３；Ｖ５タグ；および、ＶＳＶタグ。実施形態では、リンカーは以下から選択されるアミノ酸配列を有する：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６。実施形態では、対象のポリペプチドはｈＰＴＨ１−３４であり、組み換え融合タンパク質は、以下から選択されたアミノ酸配列を含む：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６；および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７。実施形態では、対象のポリペプチドの等電点は、Ｎ末端融合パートナーの等電点より少なくとも約１．５倍高い。実施形態では、対象のポリペプチドの分子量は、組み換え融合タンパク質の分子量の約１０％〜約５０％を構成する。

【0006】

本発明は組み換え融合タンパク質の発現のための発現ベクターをさらに提供する。実施形態では、発現ベクターは、上に記載された実施形態のいずれかの組み換え融合タンパク質の発現のためのものである。実施形態では、発現ベクターは、上記の実施形態のうちのいずれかの組み換え融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0007】

本発明は、対象のポリペプチドを産生する方法をさらに提供し、該方法は、（ｉ）発現構築物を含む発現ベクターを用いて形質転換された微生物の宿主細胞を培養する工程であって、発現構築物が組み換え融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、工程と、（ｉｉ）組み換え融合タンパク質を発現するために工程（ｉ）の宿主細胞を誘導する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の誘導された宿主細胞中で発現した組み換え融合タンパク質を精製する工程と、（ｉｖ）対象のポリペプチドを解放するためにリンカー中の切断部位を認識する切断酵素を用いるインキュベーションによって工程（ｉｉｉ）の精製された組み換え融合タンパク質を切断する工程であって、それによって対象のポリペプチドを得る工程、を含む。実施形態では、工程（ｉ）の組み換え融合タンパク質は、上に記載された実施形態のいずれかで記載されるものである。実施形態では、方法はさらに、工程（ｉｉ）で発現した融合タンパク質の発現レベルを測定する工程、工程（ｉｉｉ）で精製された組み換え融合タンパク質の量を測定する工程、または適切に解放された工程（ｉｖ）で得られた対象のポリペプチドの量を測定する工程、あるいはこれらの組み合わせを含む。実施形態では、工程（ｉｉ）で発現した融合タンパク質の発現レベルは、０．５ｇ／Ｌよりも大きい。実施形態では、工程（ｉｉ）で発現した融合タンパク質の発現レベルは、約０．５ｇ／Ｌから約２５ｇ／Ｌである。実施形態では、工程（ｉｉ）で発現した融合タンパク質は、細胞質に向けられる。実施形態では、工程（ｉｉ）で発現した融合タンパク質は、周辺質に向けられる。実施形態では、工程（ｉｖ）のインキュベーションは約１時間から約１６時間であり、切断酵素はエンテロキナーゼである。

【0008】

実施形態では、工程（ｉｖ）のインキュベーションは約１時間から約１６時間であり、切断酵素はエンテロキナーゼであり、ここで、工程（ｉｖ）で適切に解放される工程（ｉｉｉ）で精製された組み換え融合タンパク質の量は、約９０％から約１００％である。実施形態では、工程（ｉｖ）で適切に解放される工程（ｉｉｉ）で精製された組み換え融合タンパク質の量は、約１００％である。実施形態では、工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）で得られた対象のポリペプチドの量は、約０．１ｇ／Ｌから約２５ｇ／Ｌである。実施形態では、得られた対象の適切に解放されたポリペプチドは溶解可能であり、未処置であり、またはその両方である。実施形態では、工程（ｉｉｉ）は未変性条件下で実行される。実施形態では、組み換え融合タンパク質は尿素を使用することなく可溶化される。実施形態では、未変性条件はカオトロピック剤の未変性濃度を含む緩衝液を用いて工程（ｉｉ）の誘導細胞を溶解することを含む。実施形態では、カオトロピック剤の未変性濃度は４Ｍ未満の尿素である。

【0009】

実施形態では、微生物の宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ またはＥ．ｃｏｌｉの宿主細胞である。実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ 宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ ｈｏｓｔ細胞である。実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ 宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。

【0010】

特定の実施形態では、宿主細胞は、以下からなる群から選択された少なくとも１つのプロテアーゼが欠けている：Ｌｏｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；Ｌａ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；ＡｐｒＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）；ＨｔｐＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）；ＤｅｇＰ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）；ＤｅｇＰ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）；Ｎｐｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）；Ｐｒｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）；Ｐｒｃ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）；Ｍ５０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）；ＰｒｌＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）；Ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎ（ＲＸＦ０４４９５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７）、および、ＰｒｔＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）。関連する実施形態では、宿主細胞は、プロテアーゼＬｏｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ｌａ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、およびＡｐｒＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）が欠けている。実施形態では、宿主細胞は、プロテアーゼＡｐｒＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）とＨｔｐＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）が欠けている。他の実施形態では、宿主細胞は、プロテアーゼＬｏｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ｌａ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）およびＤｅｇＰ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）が欠けている。実施形態では、宿主細胞は、プロテアーゼＮｐｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＤｅｇＰ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）およびＤｅｇＰ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）が欠けている。関連する実施形態では、宿主細胞は、プロテアーゼＳｅｒｒａｌｙｓｉｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７）とＡｐｒＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）が欠けている。
＜参照による組み込み＞

【0011】

本明細書で言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのような同程度まで引用により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の請求項で説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。

【0013】

【図1】組み換え融合タンパク質の概略図。ドメイン１はＮ末端融合パートナーに相当し、ドメイン２はリンカーに相当し、ドメイン３は対象のポリペプチドに相当する。Ｎ末端融合パートナーと対象のポリペプチドの非限定的な例は、以下の個々のそれぞれのドメインで列挙される。

【図2】３つの組み換え融合タンパク質アミノ酸配列。対象のポリペプチドとしてｈＰＴＨ １−３４を含む、３つの組み換え融合タンパク質のアミノ酸配列が示される。ｈＰＴＨ １−３４配列は各々においてイタリック体で示されており、Ｎ末端融合パートナーとＰＴＨ １−３４の間のリンカーが下線を引かれている。２Ａ．ＤｎａＪ様タンパク質Ｎ末端融合パートナーを含む組み換え融合タンパク質。（ＤｎａＪ様タンパク質、ａａ １−７７；リンカー、ａａ ７８−９８； ｈＰＴＨ １−３４、ａａ ９９−１３２．）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）。２Ｂ．ＦｋｌＢ Ｎ末端融合パートナーを含む組み換え融合タンパク質。（ＦｋｌＢ、ａａ １−２０５； リンカー、ａａ ２０６−２２６； ｈＰＴＨ １−３４、ａａ ２２７−２６０．）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）。２Ｃ．ＦｒｎＥ Ｎ末端融合パートナーを含む組み換え融合タンパク質。（ＦｒｎＥ、ａａ １−２１６； リンカー、ａａ ２１７−２３７； ｈＰＴＨ １−３４、ａａ ２３８−２７１．）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）。

【図3】振盪フラスコ発現サンプルのＳＤＳ−ＣＧＥ分析。サンプルは、図の下部で示されるように３つのセットで示されている：全細胞培養液（レーン１−６）；無細胞培養液；（レーン７−１２）および、可溶性画分（レーン１３−１８）。分子量マーカーは、画像の両側（上から下まで６８、４８、２９、２１、１６ ｋＤ）に示される。３つのセットの各々のレーンは、レーンの上に示されるように、左から右に以下を表す：ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３５９７０）；ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３５９８４）；ＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３６０３４）；ＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３６０８５）；ＦｒｎＥ−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３６１５０）；および、ＦｒｎＥ−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３６１６９）。ＤｎａＪ様−ＰＴＨ融合タンパク質バンドは実線の矢印によってマークされ、ＦｋｌＢ−ＰＴＨとＦｒｎＥ−ＰＴＨの融合タンパク質バンドは波線の矢印によってマークされる。

【図4】精製された組み換え融合タンパク質のエンテロキナーゼ切断。サンプルは３つのセットで示されている：エンテロキナーゼ処置をしていない（レーン１−６）。エンテロキナーゼ処置４０μｇ／ｍｌ（レーン７−１２）；および、エンテロキナーゼ処置１０μｇ／ｍｌ（レーン１３−１８）。３つのセットの各々のレーンは左から右に以下を表す：ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３５９７０）；ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３５９８４）；ＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３６０３４）；ＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３６０８５）；ＦｒｎＥ−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３６１５０）；および、ＦｒｎＥ−ＰＴＨ １−３４融合（ＳＴＲ３６１６９）。ＤｎａＪ様融合タンパク質の移動は下部の対の矢印中の実線の矢印によって示される。切断されたＤｎａＪ様タンパク質Ｎ末端融合パートナーの移動は、下部の対の矢印中の波線の矢印によって示される。ＦｋｌＢとＦｒｎＥの融合タンパク質の移動は上部の対の矢印中の実線の矢印によって示される。ＦｋｌＢとＦｒｎＥのＮ末端融合パートナーの移動は上部の対の矢印中の波線の矢印によって示される。分子量マーカーは、画像の右側（上から下まで２９、２０および１６ｋＤ）に示される。

【図5】エンテロキナーゼ分解産物のインタクト質量分析。発現株ＳＴＲ３５９７０から精製され、１時間エンテロキナーゼに温浸させた、ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ １−３４融合タンパク質のデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）質量スペクトルが示される。ＰＴＨ １−３４に対応するピークは実線の矢印によって示される。

【図6】ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ １−３４融合タンパク質精製画分のエンテロキナーゼ切断。従来のバイオリアクター中での育成後、発現株ＳＴＲ３６００５からＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合タンパク質が精製された。精製画分は、エンテロキナーゼで１時間（レーン２−４）、１６時間（レーン６−８）、エンテロキナーゼ（対照）なしで１時間（レーン１）、エンテロキナーゼ（対照）なしで１６時間（レーン５）インキュベートされた。分析された画分は以下のとおりだった：画分１（レーン１、２、５、および６）；画分２（レーン３と７）；および、画分３（レーン４と８）。完全長のＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ １−３４組換え体融合タンパク質バンドは、実線の黒い矢印によって示される。切断されたＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ １−３４融合パートナーバンドは、波線の矢印によって示される。分子量マーカーは、画像の両側（上から下まで４９、２９、２１および１６ ｋＤ）に示される。

【図7A】ＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４の融合タンパク質に由来するＰＴＨ １−３４エンテロキナーゼ分解産物のインタクト質量分析。図面は、エンテロキナーゼに温浸させたＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４の融合タンパク質精製画分のデコンボリューション質量スペクトルを示す。ＰＴＨ １−３４に対応するピークは実線の矢印によって示される。７Ａ．ＳＴＲ３６０３４から精製されたＦｋｌＢ−ＰＴＨ融合タンパク質。

【図7B】ＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４の融合タンパク質に由来するＰＴＨ １−３４エンテロキナーゼ分解産物の未処置の質量分析。図面は、エンテロキナーゼに温浸させたＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４の融合タンパク質精製画分のデコンボリューション質量スペクトルを示す。ＰＴＨ １−３４に対応するピークは実線の矢印によって示される。７Ｂ．ＳＴＲ３６０８５から精製されたＦｋｌＢ−ＰＴＨ融合タンパク質。

【図7C】ＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４の融合タンパク質に由来するＰＴＨ １−３４エンテロキナーゼ分解産物の未処置の質量分析。図面は、エンテロキナーゼに温浸させたＦｋｌＢ−ＰＴＨ １−３４の融合タンパク質精製画分のデコンボリューション質量スペクトルを示す。ＰＴＨ １−３４に対応するピークは実線の矢印によって示される。７Ｃ．ＳＴＲ３６０９８から精製されたＦｋｌＢ−ＰＴＨ融合タンパク質。

【発明を実施するための形態】

【0014】

（配列）
本出願はヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２３７を含み、これらのヌクレオチド配列は請求項の前に配列表で列挙される。

【0015】

（概観）
本発明は、細菌発現系における対象の組み換えポリペプチドを過剰発現するための組み換え融合タンパク質と、組み換え融合タンパク質を発現するための構築物と、組み換え融合タンパク質、および溶解可能な形態の対象の組み換えポリペプチドを高収率で産生するための方法とに関する。実施形態では、本発明の方法は、精製後に０．５ｇ／Ｌを越える組み換え融合タンパク質の産生を可能にする。実施形態では、本発明の方法は、変性濃度のカオトロピック剤を使用することなく高収率の組み換え融合タンパク質を産生する。実施形態では、本発明の方法は、任意のカオトロピック剤を使用することなく高収率の組み換え融合タンパク質を産生する。

【0016】

本明細書で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変化形「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、任意の詳述された特徴を含むことを示すものであるが、任意の他の特徴を除外することを意味するものではない。したがって、本明細書で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は包括的であり、追加の詳述されていない特徴を除外するものではない。本明細書で提供される組成物と方法のいずれかの実施形態において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と置き換えられもよい。成句「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、指定された特性や、本発明の特徴や機能に実質的に影響を与えない特性を要求するために使用される。本明細書で使用されるように、用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は詳述された特性（例えば核酸塩基配列）のみの存在を示すために用いられる（その結果、指定された核酸塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーの場合には、追加の詳述されていない核酸塩基の存在が除外される）。

【0017】

（組み換え融合タンパク質）
図１で一般に例証されるように、本発明の組み換え融合タンパク質は３つのドメインを含む。左から、融合タンパク質はＮ末端融合パートナー、リンカー、および対象のポリペプチドを含み、ここで、リンカーはＮ末端融合パートナー間にあり、対象のポリペプチドはリンカーへのＣ末端である。実施形態では、リンカー配列はプロテアーゼ切断部位を含む。実施形態では、対象のポリペプチドはリンカー内のプロテアーゼ切断部位の切断によって組み換え融合タンパク質から解放することができる。

【0018】

実施形態では、組み換え融合タンパク質の分子量は約２ｋＤａから約１０００ｋＤａである。実施形態では、組み換え融合タンパク質の分子量は、約２ｋＤａ、約３ｋＤａ、約４ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２６ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約２８ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約５５ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約６５ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約８５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約９５ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約５５０ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約９００ｋＤａ、約１０００ｋＤａ、またはそれ以上である。実施形態では、組み換え融合タンパク質の分子量は、約２ｋＤａから約１０００ｋＤａ、約２ｋＤａから約５００ｋＤａ、約２ｋＤａから約２５０ｋＤａ、約２ｋＤａから約１００ｋＤａ、約２ｋＤａから約５０ｋＤａ、約２ｋＤａから約２５ｋＤａ、約２ｋＤａから約３０ｋＤａ、約２ｋＤａから約１０００ｋＤａ、約２ｋＤａから約５００ｋＤａ、約２ｋＤａから約２５０ｋＤａ、約２ｋＤａから約１００ｋＤａ、約２ｋＤａから約５０ｋＤａ、約２ｋＤａから約２５ｋＤａ、約３ｋＤａから約１０００ｋＤａ、約３ｋＤａから約５００ｋＤａ、約３ｋＤａから約２５０ｋＤａ、約３ｋＤａから約１００ｋＤａ、約３ｋＤａから約５０ｋＤａ、約３ｋＤａから約２５ｋＤａ、約３ｋＤａから約３０ｋＤａ、約４ｋＤａから約１０００ｋＤａ、約４ｋＤａから約５００ｋＤａ、約４ｋＤａから約２５０ｋＤａ、約４ｋＤａから約１００ｋＤａ、約４ｋＤａから約５０ｋＤａ、約４ｋＤａから約２５ｋＤａ、約４ｋＤａから約３０ｋＤａ、約５ｋＤａから約１０００ｋＤａ、約５ｋＤａから約５００ｋＤａ、約５ｋＤａから約２５０ｋＤａ、約５ｋＤａから約１００ｋＤａ、約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、約５ｋＤａから約２５ｋＤａ、約５ｋＤａから約３０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約１０００ｋＤａ、約１０ｋＤａから約５００ｋＤａ、約１０ｋＤａから約２５０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約１００ｋＤａ、約１０ｋＤａから約５０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約２５ｋＤａ、約１０ｋＤａから約３０ｋＤａ、約２０ｋＤａから約１０００ｋＤａ、約２０ｋＤａから約５００ｋＤａ、約２０ｋＤａから約２５０ｋＤａ、約２０ｋＤａから約１００ｋＤａ、約２０ｋＤａから約５０ｋＤａ、約２０ｋＤａから約２５ｋＤａ、約２０ｋＤａから約３０ｋＤａ、約２５ｋＤａから約１０００ｋＤａ、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａ、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａ、約２５ｋＤａから約１００ｋＤａ、約２５ｋＤａから約５０ｋＤａ、約２５ｋＤａから約２５ｋＤａ、または約２５ｋＤａから約３０ｋＤａである。

【0019】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４７０、５００、５３０、５６０、５９０、６１０、６４０、６７０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、または２５００あるいはそれ以上のアミノ酸の長さである。実施形態では、組み換え融合タンパク質は、約５０〜２５００、１００〜２０００、１５０〜１８００、２００〜１６００、２５０〜１４００、３００〜１２００、３５０〜１０００、４００〜９５０、４５０〜９００、４７０〜８５０、５００〜８００、５３０〜７５０、５６０〜７００、５９０〜６７０、６１０〜６４０のアミノ酸の長さである。

【0020】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、以下から選択されるＮ末端融合パートナーを含む：

【0021】

Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪ様タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＦｒｎＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＦｒｎＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、ＦｒｎＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、ＦｋｌＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＦｋｌＢ３^＊（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ＦｋｌＢ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、ＦｋｌＢ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）、ＦｋｐＢ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＳｅｃＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＳｅｃＢの切断、ＥｃｐＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ＥｃｐＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）、ＥｃｐＤ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）、およびＥｃｐＤ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）；

【0022】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、および２２６から選択されるリンカー；

【0023】

および、以下から選択される対象のポリペプチド：ｈＰＴＨ １−３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｍｅｔ−ＧＣＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）、ｒＣＳＰ、プロインスリン（例えば、ヒト・プロインスリンＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２のいずれか、インスリン・グラルギン・プロインスリン ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、８９、９０、または９１）、インスリンスリプロＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、インスリングルリジンＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、インスリンＣ−ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）；メカセルミン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、Ｇｌｐ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、エキセナチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、テデュグルチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、Ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、ベカプレルミン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、エンフビルチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、ネシリチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、またはエンテロキナーゼ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）。

【0024】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１のアミノ酸配列を有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪ様タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２である。

【0025】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２または１０３のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２または１０３をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２または２２８である。

【0026】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０４である。

【0027】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５である。

【0028】

実施形態では、組み換え融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６である。

【0029】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７である。

【0030】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８である。

【0031】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９である。

【0032】

実施形態では、組み換え融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０である。

【0033】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１である。

【0034】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪ様タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２である。

【0035】

実施形態では、組み換え融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３である。

【0036】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４である。

【0037】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５である。

【0038】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６である。

【0039】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７である。

【0040】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８である。

【0041】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９である。

【0042】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０である。実施形態では、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１である。

【0043】

実施形態では、組み換え融合タンパク質の対象のＮ末端融合パートナー、リンカー、およびポリペプチドはそれぞれ：Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓフォールディングモジュレーターＤｎａＪ様 タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で説明されるリンカー、およびヒト副甲状腺ホルモンアミノ酸１−３４（ｈＰＴＨ １−３４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）である。実施形態では、組み換え融合タンパク質の対象のＮ末端融合パートナー、リンカー、およびポリペプチドはそれぞれ：Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ フォールディングモジュレーターＦｒｎＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で説明されるリンカー、およびｈＰＴＨ １−３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）である。実施形態では、組み換え融合タンパク質の対象のＮ末端融合パートナー、リンカー、およびポリペプチドはそれぞれ：Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ フォールディングモジュレーターＦｋｌＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で説明されるリンカー、およびｈＰＴＨ １−３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）である。実施形態では、組み換えｈＰＴＨ融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６および４７の１つで説明されるようなアミノ酸配列を有する。

【0044】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、以下の要素を有するインスリン融合タンパク質である：

【0045】

Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓから選択されたＮ末端融合パートナー：ＤｎａＪ様タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＦｒｎＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＦｒｎＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、ＦｒｎＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、ＦｋｌＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＦｋｌＢ３＊（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ＦｋｌＢ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、ＦｋｌＢ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）、ＦｋｐＢ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＥｃｐＤ ＥｃｐＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）、ＥｃｐＤ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）、またはＥｃｐＤ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）；

【0046】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６で説明される配列セットを有するリンカー；および、

【0047】

以下から選択される対象のポリペプチド：グラルギン・プロインスリン ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、８９、９０、または９１。

【0048】

実施形態では、対象のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０または８４で説明されるヌクレオチド配列によってコード化されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８で説明されるグラルギン・プロインスリンである。実施形態では、対象のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１または８５で説明されるヌクレオチド配列によってコード化されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９で説明されるグラルギン・プロインスリンである。実施形態では、対象のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２または８６で説明されるヌクレオチド配列によってコード化されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０で説明されるグラルギン・プロインスリンである。実施形態では、対象のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３または８７で説明されるヌクレオチド配列によってコード化されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１で説明されるインスリン・グラルギン・プロインスリンである。

【0049】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪ様タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２である。

【0050】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２または１０３のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２または１０３をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２または２２８である。

【0051】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０４である。

【0052】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５である。

【0053】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６である。

【0054】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７である。

【0055】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８である。

【0056】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９である。

【0057】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０である。

【0058】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとトリプシン切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１である。

【0059】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪ様タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２である。

【0060】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３である。

【0061】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４である。

【0062】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃｐＤ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５である。

【0063】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６である。

【0064】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７である。

【0065】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８である。

【0066】

実施形態では、インスリン融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ１タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９である。

【0067】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ２タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０である。

【0068】

実施形態では、インスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸配列をともに有する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥ３タンパク質Ｎ末端融合パートナーとエンテロキナーゼ切断部位リンカーを含む。実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１である。

【0069】

実施形態では、組み換えインスリン融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２〜２０１の１つで説明されるようなアミノ酸配列を有する。

【0070】

実施形態では、組み換え融合タンパク質は、以下の成分を有するＧＣＳＦ融合タンパク質である：

【0071】

以下から選択されるＮ末端融合パートナー：Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪ様タンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＦｒｎＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＦｒｎＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、ＦｒｎＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、ＦｋｌＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＦｋｌＢ３＊（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ＦｋｌＢ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、ＦｋｌＢ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）、ＦｋｐＢ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＥｃｐＤ ＥｃｐＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）、ＥｃｐＤ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）、またはＥｃｐＤ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）；

【0072】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９として説明される配列セットを有するリンカー；および、

【0073】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８として説明される配列を有する対象のポリペプチド。

【0074】

（対象のポリペプチド）
対象のＣ末端ポリペプチド、対象の組み換えポリペプチド、およびＣ末端融合パートナーとも呼ばれる、組み換え融合タンパク質の対象のタンパク質またはポリペプチドは、溶解可能な形態および高収率で発現されることも目的としたポリペプチドである。実施形態では、対象のポリペプチドは、例えば、タンパク質分解、低発現レベル、貧弱なフォールディング、および／または宿主細胞からの貧弱な分泌により、細菌発現系において高収率で発現しないことが分かっている異種のポリペプチドである。対象のポリペプチドは小ペプチドまたは急速に分解するペプチド、分解に弱いＮ末端を有するタンパク質、および微生物または細菌発現系において不溶性形態で典型的に産生されるタンパク質を含む。実施形態では、対象のポリペプチドのＮ末端は分解から保護されるが、Ｎ末端融合パートナーに縮合し、高い収率のＮ−末端の未処置のタンパク質をもたらす。実施形態では、異種のポリペプチドは、微生物または細菌発現系において高収率で溶解可能な形態で発現しないと記載されている。例えば、実施形態では、異種のポリペプチドは、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ｏｒ Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ． ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ｏｒ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ 宿主細胞において高収率で溶解可能な形態で発現しないと記載されている。実施形態では、対象のポリペプチドは、真核生物のポリペプチドであるか、または真核生物のポリペプチド（例えば、そのアナログである）に由来する。実施形態では、対象のポリペプチドは、哺乳類のポリペプチドであるか、または哺乳類のポリペプチドに由来する。実施形態では、対象のポリペプチドはヒト・ポリペプチドであるか、またはヒト・ポリペプチドに由来する。実施形態では、対象のポリペプチドは原核生物のポリペプチドであるか、または原核生物のポリペプチドに由来する。実施形態では、対象のポリペプチドは微生物のポリペプチドであるか、または微生物のポリペプチドに由来する。実施形態では、対象のポリペプチドは細菌のポリペプチドであるか、または細菌のポリペプチドに由来する。「非相同」によって、対象のポリペプチドは発現宿主細胞以外の生命体に由来することを意味する。実施形態では、対象の融合タンパク質および／またはポリペプチドは、別の微生物の発現系の場合よりも高い収率で本発明の方法によってＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ 宿主細胞（つまり、ほぼＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ程度の宿主細胞）中で産生される。実施形態では、対象の融合タンパク質またはポリペプチドは、実質的に比較可能な条件下で、Ｅ． ｃｏｌｉあるいは他の微生物または細菌発現系、例えば、上に列挙した発現系のときよりも高い収率で、例えば、およそ１．５倍からおよそ１０倍まで、およそ１．５倍、およそ２倍、およそ２．５倍、およそ３倍、およそ５倍、またはおよそ１０倍以上で、本発明の方法にしたがって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、または、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの発現系で産生される。実施形態では、融合タンパク質またはＣ末端ポリペプチドは、０．５グラム／リットル未満、０．４グラム／リットル未満、０．３グラム／リットル未満、０．２グラム／リットル未満、または０．１グラム／リットル未満の収率でＥ． ｃｏｌｉ 発現系で産生される。

【0075】

実施形態では、対象のポリペプチドは小ペプチドおよび／または急速に分解するペプチドである。実施形態では、小ペプチドおよび／または急速に分解するペプチドは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である。実施形態では、対象のポリペプチドはヒトｈＰＴＨ １−３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）である。ＰＴＨは、上皮小体によって分泌され、血液中のカルシウム濃度を増加させるように作用する、１１５ａａｐｒｅ−ｐｒｏ−ペプチドに由来する８４のアミノ酸（ａａ）ペプチドであり、骨形成を刺激することが知られている。Ｎ末端３４ａａペプチドは骨粗鬆症を処置するために承認される（Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；添付文書を参照）。Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）中の活性成分 ＰＴＨ １−３４は、Ｃ末端融合タンパク質の一部としてＥ． ｃｏｌｉ の中で産生される（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００−２００１； ｓｅｅ ａｌｓｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ｒｅｖｉｅｗ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００−２００１を参照）。Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ’ｓ ＬＹ３３３３３４）の精製は、例えば、「Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ １−３４ ａｔ ０．９ Ａ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（３５）：２７２３８−４４、２０００）に記載されており、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。この報告書は、封入体としてのタンパク質の発現と７Ｍの尿素中でのその後の可溶化について記載している。

【0076】

実施形態では、対象のポリペプチドは、細菌発現系で過剰発現する際、典型的には不溶性形態で産生される。実施形態では、細菌発現系で過剰発現する際に不溶性の形態で典型的には産生される対象のポリペプチドは、真核生物のポリペプチドまたはその誘導体あるいはアナログである。実施形態では、細菌発現系で過剰発現する際に不溶性の形態で典型的には産生される対象のポリペプチドは、プロインスリン（インスリンの前駆体）である。プロインスリンは、３つの指定されたセグメント（ＮからＣ末端まで：Ｂ−Ｃ−Ａ）で構成される。内部Ｃペプチドがプロテアーゼ切断によって取り除かれる際、プロインスリンはインスリンに（または、プロインスリンに依存して、インスリンアナログに）にプロセシングされる。ＡとＢのペプチド間のジスルフィド結合は、Ｃペプチドインスリンの切除後に、こうした会合を維持する。ここでのインスリンとインスリンアナログに関して、「Ａペプチド」と「Ａ鎖」とは交換可能に使用され、「Ｂペプチド」と「Ｂ鎖」は交換可能に使用される。例えば、こうした鎖内の位置は、鎖のアミノ末端からの鎖とアミノ酸の番号によって参照され、「Ｂ３０」とは、Ｂペプチド（つまり、Ｂ鎖）中の３０番目のアミノ酸を指す。実施形態では、対象のポリペプチドはプロインスリンであり、これは長時間作用性のインスリンアナログまたは即効性のあるインスリンアナログを形成するようにプロセシングされる。

【0077】

実施形態では、対象のポリペプチドは、長時間作用性のインスリンアナログを形成するようにプロセシングされるプロインスリンである。長時間作用性のインスリンアナログは、例えば、インスリングラルギン、４３−アミノ酸（６０５０．４１Ｄａ）、Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）として販売されている長時間作用性のインスリンアナログ、Ｔｒｅｓｉｂａ（登録商標）として販売されているインスリンデグルデク、Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標）として販売されているインスリンデテミルを含む。インスリングラルギンでは、Ｎ２１（Ａｓｎ２１）のアスパラギンがグリシンと置き換えられ、２つのアルギニンがＢペプチドのＣ末端に存在している。インスリンでは、こうした２つのアルギニンはプロインスリン中には存在するが、プロセシングされた成熟分子には存在しない。実施形態では、対象のポリペプチドはグラルギンにプロセシングされ、対象のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、８９、９０、または９１で説明されるような８７−アミノ酸プロインスリンである。非限定的な実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８のコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０または８４で説明されるヌクレオチド配列である。非限定的な実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１または８５で説明されるヌクレオチド配列である。非限定的な実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０のコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２または８６で説明されるヌクレオチド配列である。非限定的な実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１のコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３または８７で説明されるヌクレオチド配列である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０−８７の各々は、５’末端で当初の１５ｂｐクローニング部位を含み、したがって、これらの実施形態では、参照されるプロインスリンコード配列は、最初のＰｈｅコドン、ＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）またはＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１−８７）から始まる配列である。インスリンデグルデクは、位置Ｂ３０でトレオニンの欠失があり、位置Ｂ２９のアミノ酸リジンでγ−Ｌ−グルタミルスペーサーによってヘキサデカン二酸に共役する。インスリンデテミルは脂肪酸（ミリスチン酸）を有し、位置Ｂ２９でリジン・アミノ酸に結合する。

【0078】

実施形態では、対象のポリペプチドは即効性のインスリンアナログを形成するようにプロセシングされるプロインスリンである。即効性の（または速効性の）インスリンアナログとして、例えば、位置Ｂ２８のプロリンがアスパラギン酸に置き換えられるインスリンアスパルト（ＮｏｖｏＬｏｇ／ＮｏｖｏＲａｐｉｄ（登録商標））（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）、および、Ｂ鎖のＣ末端で生じる最後のリジンとプロリンの残基が逆になるインスリンスリプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））（リスプロプロインスリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３）、ならびに位置Ｂ３のアスパラギンがリジンに置き換えられ、位置Ｂ２９のリジンがグルタミン酸に置き換えられるインスリングルリジン（Ａｐｉｄｒａ（登録商標））（グルリジンプロインスリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４）を含んでいる。他のすべての位置では、こうした分子は、レギュラーインスリン（プロインスリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２；インスリンＡペプチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２；インスリンＢペプチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）に対して同一のアミノ酸配列を有する。

【0079】

実施形態では、細菌発現系で過剰発現する際に不溶性の形態で一般的に産生される対象のポリペプチドは、ＧＣＳＦ（例えばＭｅｔ−ＧＣＳＦ）である。実施形態では、細菌発現系で過剰発現する際に不溶性の形態で一般的に産生される対象のポリペプチドは、ＩＦＮ−β、例えば、ＩＦＮ−β−１ｂである。実施形態では、対象の組み換えポリペプチドは過剰発現するのが難しい細菌発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ 発現系である。

【0080】

実施形態では、対象のポリペプチドは容易に分解するＮ末端を有するタンパク質である。本発明の方法によって産生される融合タンパク質が、対象のポリペプチドを放出する切断の前に宿主プロテアーゼから分離するので、対象のポリペプチドのＮ末端は精製工程全体にわたって保護される。これにより対象のＮ−末端の未処置のポリペプチドの最大で１００％の調製の産生が可能となる。

【0081】

実施形態では、容易に分解するＮ末端を有する対象のポリペプチドは、フィルグラスチム、ＧＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子、またはコロニー刺激因子３（ＣＳＦ ３））のアナログである。ＧＣＳＦは、顆粒球と幹細胞を生成し、かつそれらを血流へ放出するために骨髄を刺激する１７４のアミノ酸糖タンパク質である。非グリコシル化されているととともにＮ末端メチオニンを有するフィルグラスチムは、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）として市販されている。ＧＣＳＦ（フィルグラスチム）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９で説明されている。実施形態では、本発明の方法は、Ｎ末端メチオニンを含む未処置のＮ末端を有する高いレベルのＧＣＳＦ（フィルグラスチム）を産生するために使用される。プロテアーゼ欠損宿主細胞中のＧＣＳＦの産生は米国特許第８，４５５，２１８号「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇ−ＣＳＦ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ」に記載され、該文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の実施形態では、Ｎ末端メチオニンを含む未処置のＧＣＳＦは、細菌の宿主細胞（例えば、プロテアーゼ欠損ではないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 宿主細胞）において高いレベルで融合タンパク質内において産生される。

【0082】

実施形態では、容易に分解するＮ末端を有する対象のポリペプチドは、米国特許第９，１６９，３０４号「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ」に記載されている、組み換えＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ スポロゾイト周囲タンパク（ｒＣＳＰ）であり、当該文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0083】

実施形態では、対象のポリペプチドは以下のとおりである：試薬タンパク質；治療用タンパク質；細胞外の受容体またはリガンド；プロテアーゼ；キナーゼ；血液タンパク質；ケモカイン；サイトカイン；抗体；抗体ベースの薬物；抗体断片、例えば、一本鎖抗体、抗原結合（ａｂ）断片、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ）’２、ＩｇＧまたはＩｇＭの可変領域から生成されたＦｖ、抗体の重鎖不変部領域から生成されたＦｃ断片、還元されたＩｇＧ断片（例えば、ＩｇＧのヒンジ領域ジスルフィド結合の還元により生成される）、例えば、対象のタンパク質またはペプチドとともに融合されたＩｇＧのＦｃドメインを含むＦｃ融合タンパク質、または、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」に記載される当該技術分野の他の抗体断片（当該文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる）；抗凝血剤；血液因子；骨形態形成タンパク；改変タンパク質スキャホールド；酵素；成長因子；インターフェロン；インターロイキン；血栓溶解剤；またはホルモン。実施形態では、対象のポリペプチドは以下から選択される：ヒト抗血友病因子；ヒト抗血友病因子フォンビルブラント因子複合体；組み換え抗血友病因子（ツロクトコグアルファ）；Ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン；アルビグルチド；アルグルコシダーゼアルファ；ヒト・アルファ−１プロテアーゼ阻害剤；ボツリヌス毒素タイプＢ（Ｒｉｍａｂｏｔｕｌｉｎｕｍｔｏｘｉｎ Ｂ）；凝固ＩＸ因子Ｆｃ融合；組み換え凝固ＩＸ因子；組み換え凝固因子ＶＩＩａ；組み換え凝固ＸＩＩＩ因子Ａサブユニット；ヒト凝固ＶＩＩＩ因子フォンビルブラント因子複合体；コラゲナーゼ・ヒストリチクス菌；ヒト血小板由来成長因子（ベカプレルミン（Ｃｅｃａｐｌｅｒｍｉｎ））；アバタセプト；アブシキシマブ；アダリムマブ；アフリベルセプト；アガルシダーゼベータ；アルデスロイキン；アレファセプト；アレムツズマブ；アルグルコシダーゼアルファ；アルテプラーゼ；アナキンラ；オクトコグアルファ；組み換えヒト抗トロンビン；Ａｚｆｉｃｅｌ−Ｔ；バシリキシマブ；ベラタセプト；ベリムマブ；ベバシズマブ；Ａ型ボツリヌス毒素；ブレンツキシマブベドチン；組み換えＣ１エステラーゼ阻害剤；カナキヌマブ；セルトリズマブペゴル；セツキシマブ；ノナコグアルファ；ダクリズマブ；ダルベポエチンアルファ；デノスマブ；ジゴキシン免疫Ｆａｂ；ドルナーゼアルファ；エカランチド；エクリズマブ；エタネルセプト；フィブリノゲン；フィルグラスチム；ガルスルファーゼ；ゴリムマブ；イブリツモマブチウキセタン；イデュルスルファーゼ；インフリキシマブ；インターフェロンアルファ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファコン−１；インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−１ａ；インターフェロンベータ−１ｂ；インターフェロンガンマ−１００Ｂ；イピリムマブ；ラロニダーゼ；エポエチンアルファ；モロクトコグ（Ｍｏｒｏｃｔｏｃｏｇ）アルファ；ムロモナブ−ＣＤ３；ナタリズマブ；オクリプラスミン；オファツムマブ；オマリズマブ；オプレルベキン；パリフェルミン；パリビズマブ；パニツムマブ；ペグフィルグラスチム；ペルツズマブ；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ６；１１；１６；１８のＬ１ウィルスタンパク質ウイルス様粒子（ＶＬＰ）；ＨＰＶタイプ１６と１８のＬ１タンパク質ＶＬＰ；ラニビズマブ；ラスブリカーゼ；ラキシバクマブ；組み換え因子ＩＸ；レテプラーゼ；リロナセプト；リツキシマブ；ロミプロスチム；サルグラモスチム；テネクテプラーゼ；トシリズマブ；トラスツズマブ；ウステキヌマブ；アバレリックス；セトロレリクス；デシルジン；エンフビルチド；エキセナチド；フォリトロピンベータ；ガニレリクス；デガレリクス；ヒアルロニダーゼ；インスリンアスパルト；インスリンデグルデク；インスリンデテミル；インスリングラルギンｒＤＮＡ注射（長時間作用性のヒトインスリン・アナログ）；組み換えインスリングルリジン；ヒトインスリン；インスリンスリプロ（即効性のインスリンアナログ）；組み換えインスリンスリプロ・プロタミン；組み換えインスリンスリプロ；ランレオチド；リラグルチド；サーファクシン（ルシナクタント；シナプルチド（Ｓｉｎａｐｕｌｔｉｄｅ））；メカセルミン；インスリン様増殖因子；ネシリチド；プラムリンチド；組み換えテデュグルチド；酢酸テサモレリン；酢酸ジコノチド；１０．８ｍｇの酢酸ゴセレリン移植組織；アボボツリヌストキシンＡ；アガルシダーゼアルファ；アリポジーン・チパルボベック；アンセスチム；アニストレプラーゼ；アルデパリンナトリウム；鳥類のＴＢワクチン；バトロキソビン；ビバリルジン；ブセレリン（性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト）；カボザンチニブ Ｓ−リンゴ酸塩；カルペリチド；カツマキソマブ；セルレチド；凝固ＶＩＩＩ因子；コクシジウム症ワクチン；ダルテパリンナトリウム；デフェリプロン；デフィブロチド；ジボテルミンアルファ；ドロトレコギンアルファ；エドトレオチド；エファリズマブ；エノキサパリンナトリウム；エポエチンデルタ；エプチフィバチド；エプトテルミンアルファ；注射用のフォリトロピンアルファ；ホミビルセン；ジェムツツマブオゾガミシン；ゴナドレリン；組み換え絨毛性ヒト性腺刺激ホルモン；酢酸ヒストレリン（性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト）；ＨＶＴ ＩＢＤワクチン；イミグルセラーゼ；イソフェンインスリン；レノグラスチム（果粒球コロニー刺激因子）；レピルジン；犬のレプトスピラワクチン；リュープロレリン；リナクロチド；リペグフィルグラスチム；リキシセナチド；ルトロピンアルファ（ヒトの黄体ホルモン）；メポリズマブ；ミファムルチド；ミポメルセンナトリウム；ミリモスチム（マクロファージコロニー刺激因子）；モガムリズマブ；モルグラモスチム（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）；モンテプラーゼ；ナドロパリンカルシウム；ナファレリン；ネバクマブ；オクトレオチド；パミテプラーゼ；パンクレリパーゼ；パルナパリンナトリウム；Ｄアスパラギン酸パシレオチド；酢酸ペギネサチド；ペグビソマント；ペンテトレオチド；ボラクタントアルファ；プラルモレリン（成長ホルモン放出因子ペプチド）；プロチレリン；ＰＴＨ １−８４；ｒｈＢＭＰ−２；ｒｈＢＭＰ−７；エプトテルミンアルファ；ロムルチド；セルモレリン；ソマトスタチン；ソマトレム；バソプレッシン；デスモプレシン；タリグルセラーゼアルファ；タルチレリン（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ）；タソネルミン；タスポグルチド；トロンボモジュリンアルファ；チロトロピンアルファ；トラフェルミン；トリプトレリンパモエート；注射用のウロフォリトロピン；ウロキナーゼ；ベラグルセラーゼアルファ；コレラ毒素Ｂ；組み換え抗血友病因子（エフラロクトコグアルファ）；ヒト・アルファ−１プロテアーゼ阻害剤；アスパラギナーゼ黒脚病菌；カプロマブペンデチド；デニロイキンジフチトクス；羊のジゴキシン免疫Ｆａｂ；エロスルファーゼアルファ；エポエチンアルファ；ＩＸ因子複合体；ＸＩＩＩ因子濃縮物；テクネチウム（ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ））；フィブリノゲン；トロンビン；インフルエンザ赤血球凝集素とノイラミニダーゼ；グルカルピダーゼ；注射用ヘミン；ＨｅｐＢ表面抗原；ヒト・アルブミン；Ｉｎｃｏｂｏｔｕｌｉｎｕｍｔｏｘｉｎ；Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ；オビヌツズマブ；Ｌ−アスパラギナーゼ；（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ． ｃｏｌｉ； Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ；など）、ペムブロリズマブ；プロテインＣ濃縮物；ラムシルマブ；シルツキシマブ；Ｔｂｏ−フィルグラスチム；百日咳毒素サブユニットＡ−Ｅ；局所的ウシトロンビン；局所的ヒトトロンビン；トシツモマブ；ベドリズマブ；Ｚｉｖ−アフリベルセプト；グルカゴン；ソマトロピン；Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ または三日熱マラリア原虫抗原（例えば、ＣＳＰ、ＣｅｌＴＯＳ、トラップ、Ｒｈ５、子守女−１、ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−３、Ｐｆｓ２５、ＭＳＰ−１、ＭＳＰ−３、ＳＴＡＲＰ、ＥＸＰ１、ｐｂ９、ＧＬＵＲＰ）。変化形を含むこうしたポリペプチドの配列は文献で入手可能であり、当業者に知られている。列挙されたポリペプチドのいずれかの任意のいかなる配列も本発明の方法での使用について企図される。

【0084】

実施形態では、対象のポリペプチドは、エンテロキナーゼ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１［ウシ］）、インスリン、プロインスリン（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、長時間作用性のインスリンアナログ、または、長時間作用性のインスリンアナログを形成するようにプロセシングされるプロインスリン（例えばインスリングラルギン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、インスリンデテミル、またはインスリンデグルデク）、即効性のインスリンアナログ、または即効性のインスリンアナログを形成するようにプロセシングされるプロインスリン（例えば、インスリンスリプロ、インスリンアスパルト、またはインスリングルリジン）、インスリンＣペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）、ＩＧＦ−１（例えばメカセルミン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、Ｇｌｐ−１（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、Ｇｌｐ−１アナログ（例えばエキセナチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、Ｇｌｐ−２（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、Ｇｌｐ−２アナログ（例えば、テデュグルチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、プラムリンチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、ジコノチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、ベカプレルミン（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、エンフビルチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、またはネシリチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）である。

【0085】

実施形態では、対象のポリペプチドの分子量は、約１ｋＤａ、約２ｋＤａ、約３ｋＤａ、約４ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約１６ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約１８ｋＤａ、約１９ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ、またはそれ以上である。実施形態では、組み換えポリペプチドの分子量は、約１から約１０ｋＤａ、約１から約２０ｋＤａ、約１から約３０ｋＤａ、約１から約４０ｋＤａ、約１から約５０ｋＤａ、約１から約６０ｋＤａ、約１から約７０ｋＤａ、約１から約８０ｋＤａ、約１から約９０ｋＤａ、約１から約１００ｋＤａ約１ｋＤａから約２００ｋＤａ、約１ｋＤａから約３００ｋＤａ、約１ｋＤａから約４００ｋＤａ、約１ｋＤａから約５００ｋＤａ、約２から約１０ｋＤａ、約２から約２０ｋＤａ、約２から約３０ｋＤａ、約２から約４０ｋＤａ、約２から約５０ｋＤａ、約２から約６０ｋＤａ、約２から約７０ｋＤａ、約２から約８０ｋＤａ、約２から約９０ｋＤａ、約２から約１００ｋＤａ、約２ｋＤａから約２００ｋＤａ、約２ｋＤａから約３００ｋＤａ、約２ｋＤａから約４００ｋＤａ、約２ｋＤａから約５００ｋＤａ、約３から約１０ｋＤａ、約３から約２０ｋＤａ、約３から約３０ｋＤａ、約３から約４０ｋＤａ、約３から約５０ｋＤａ、約３から約６０ｋＤａ、約３から約７０ｋＤａ、約３から約８０ｋＤａ、約３から約９０ｋＤａ、約３から約１００ｋＤａ、約３ｋＤａから約２００ｋＤａ、約３ｋＤａから約３００ｋＤａ、約３ｋＤａから約４００ｋＤａ、または約３ｋＤａから約５００ｋＤａである。実施形態では、対象のポリペプチドの分子量は約４．１ｋＤａである。

【0086】

実施形態では、対象のポリペプチドは２５またはそれ以上のアミノ酸の長さである。実施形態では、対象のポリペプチドは約２５から約２０００までまたはそれ以上のアミノ酸の長さである。実施形態では、対象のポリペプチドは、約または少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００ １６００、１８００、または２０００のアミノ酸の長さである。実施形態では、対象のポリペプチドは約２５〜約２０００、約２５〜１０００、約２５〜約５００、約２５〜約２５０、約２５〜約１００、または約２５〜約５０のアミノ酸の長さである。実施形態では、対象のポリペプチドは、３２、３６、３９、７１、１０９、または１１０のアミノ酸の長さである。実施形態では、対象のポリペプチドは３４のアミノ酸の長さである。

【0087】

（Ｎ末端融合パートナー）
組み換え融合タンパク質のＮ末端融合パートナーは、細菌発現系を使用して得られた組み換え融合タンパク質の収率を改善する細菌タンパクである。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、細菌の宿主細胞中の組み換え構築物から安定して過剰発現させることができる。実施形態では、対象のポリペプチドの収率および／または溶解性、Ｎ末端融合パートナーの存在によって増加または改善される。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、組み換え融合タンパク質の適切なフォールディングを促す。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは細菌のフォールディングモジュレーターまたはシャペロンタンパク質である。

【0088】

実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、大型のアフィニティータグタンパク質、フォールディングモジュレーター、分子シャペロン、リボソームタンパク質、翻訳関連因子、ＯＢ倍のタンパク質（オリゴヌクレオチド結合フォールディングタンパク質）、または、例えば、文献Ａｈｎ、ｅｔ ａｌ．，２０１１、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒｓ ｆｒｏｍ ａｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｏｍｅ ｆｏｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ，” ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、６（１１）： ｅ２６８７５に記載される別のタンパク質である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、ＭＢＰ、ＧＳＴ、ＮｕｓＡ、ユビキチン、ＩＦ−２のドメイン１、およびＬ９のＮ−末端ドメインから選択された大型のアフィニティータグタンパク質である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、３０Ｓリボソームサブユニットからのリボソームタンパク質、または５０Ｓリボソームサブユニットからのリボソームタンパク質である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、Ｅ． ｃｏｌｉ またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ シャペロンまたはフォールディングモジュレータータンパク質である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓシャペロンまたはフォールディングモジュレータータンパク質である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは表１から選択されたシャペロンまたはフォールディングモジュレータータンパク質である。

【0089】

実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪ様タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＦｒｎＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＦｒｎＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、ＦｒｎＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、ＦｋｌＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＦｋｌＢ３＊（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ＦｋｌＢ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、ＦｋｌＢ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）、ＦｋｐＢ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＳｅｃＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＥｃｐＤ（ＲＸＦ０４５５３．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ＥｃｐＤ（ＲＸＦ０４２９６．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、本明細書ではＥｃｐＤ１とも呼ばれる）、ＥｃｐＤ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）、またはＥｃｐＤ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーはＥ． ｃｏｌｉ タンパク質Ｓｋｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）である。

【0090】

実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは完全長の融合パートナーポリペプチドに対して切断される。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは少なくとも１つのＣ末端アミノ酸を取り除くためにＣ末端から切断される。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは完全長のポリペプチドのＣ末端から１〜３００のアミノ酸を取り除くために切断される。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、ポリペプチドのＣ末端から３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１から３００、１から２９５、１から２９０、１から２８０、１から２７０、１から２６０、１から２５０、１から２４０、１から２３０、１から２２０、１から２１０、１から２００、１から１９０、１から１８０、１から１７０、１から１６０、１から１５０、１から１４０、１から１３０、１から１２０、１から１１０、１から１００、１から９０、１から８０、１から７０、１から６０、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、１から１５、１から１０、または１から５のアミノ酸を取り除くために切断される。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーポリペプチドは、完全長のポリペプチドの最初のＮ−末端３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、１５０から４０、最初の１５０から５０、最初の１５０から７５、最初の１５０−１００、最初の１００から４０、最初の１００から５０、最初の１００から７５、最初の７５−４０、最初の７５−５０、最初の３００、最初の２５０、最初の２００、最初の１５０、最初の１４０、最初の１３０、最初の１２０、最初の１１０、最初の１００、最初の９０、最初の８０、最初の７５、最初の７０、最初の６５、最初の６０、最初の５５、最初の５０、または最初の４０のアミノ酸を維持するために、Ｃ末端から切断される。

【0091】

実施形態では、切断されるＮ末端融合パートナーはＦｋｌＢ、ＦｒｎＥ、またはＥｃｐＤ１である。実施形態では、切断されるＮ末端融合パートナーはＦｋｌＢであり、ここで、ＦｋｌＢは、１４８、１９８、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、１から２１０、１から２００、１から１９０、１から１８０、１から１７０、１から１６０、１から１５０、１から１４０、１から１３０、１から１２０、１から１１０、１から１００、１から９０、１から８０、１から７０、１から６０、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、１から１５、１から１０、または１から５のアミノ酸を取り除くために、Ｃ末端から切断される。実施形態では、切断されるＮ末端融合パートナーはＥｃｐＤであり、ここで、ＥｃｐＤは、１４８、１９８、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、１から２１０、１から２００、１から１９０、１から１８０、１から１７０、１から１６０、１から１５０、１から１４０、１から１３０、１から１２０、１から１１０、１から１００、１から９０、１から８０、１から７０、１から６０、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、１から１５、１から１０、または１から５のアミノ酸を取り除くために、Ｃ末端から切断される。実施形態では、切断されるＮ末端融合パートナーはＦｒｎＥであり、ここで、ＦｒｎＥは、１１８、１６８、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、１から１９０、１から１８０、１から１７０、１から１６０、１から１５０、１から１４０、１から１３０、１から１２０、１から１１０、１から１００、１から９０、１から８０、１から７０、１から６０、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、１から１５、１から１０、または１から５ のアミノ酸を取り除くために、Ｃ末端から切断される。

【0092】

実施形態では、Ｎ末端融合パートナーはβ−ガラクトシダーゼではない。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーはチオレドキシンではない。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーはβ−ガラクトシダーゼまたはチオレドキシンのいずれでもない。

【0093】

実施形態では、Ｎ末端融合パートナーの分子量は、約１ｋＤａ、約２ｋＤａ、約３ｋＤａ、約４ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約１６ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約１８ｋＤａ、約１９ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ、またはそれ以上である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーの分子量は、約１から約１０ｋＤａ、約１から約２０ｋＤａ、約１から約３０ｋＤａ、約１から約４０ｋＤａ、約１から約５０ｋＤａ、約１から約６０ｋＤａ、約１から約７０ｋＤａ、約１から約８０ｋＤａ、約１から約９０ｋＤａ、約１から約１００ｋＤａ約１ｋＤａから約２００ｋＤａ、約１ｋＤａから約３００ｋＤａ、約１ｋＤａから約４００ｋＤａ、約１ｋＤａから約５００ｋＤａ、約２から約１０ｋＤａ、約２から約２０ｋＤａ、約２から約３０ｋＤａ、約２から約４０ｋＤａ、約２から約５０ｋＤａ、約２から約６０ｋＤａ、約２から約７０ｋＤａ、約２から約８０ｋＤａ、約２から約９０ｋＤａ、約２から約１００ｋＤａ、約２ｋＤａから約２００ｋＤａ、約２ｋＤａから約３００ｋＤａ、約２ｋＤａから約４００ｋＤａ、約２ｋＤａから約５００ｋＤａ、約３から約１０ｋＤａ、約３から約２０ｋＤａ、約３から約３０ｋＤａ、約３から約４０ｋＤａ、約３から約５０ｋＤａ、約３から約６０ｋＤａ、約３から約７０ｋＤａ、約３から約８０ｋＤａ、約３から約９０ｋＤａ、約３から約１００ｋＤａ、約３ｋＤａから約２００ｋＤａ、約３ｋＤａから約３００ｋＤａ、約３ｋＤａから約４００ｋＤａ、または約３ｋＤａから約５００ｋＤａである。

【0094】

実施形態では、Ｎ末端融合パートナーまたは切断されたＮ末端融合パートナーは、２５またはそれ以上のアミノ酸の長さである。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは約２５から約２０００またはそれ以上のアミノ酸の長さである。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、約または少なくとも約２５、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４７０、５００、５３０、５６０、５９０、６１０、６４０、６７０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００のアミノ酸の長さである。実施形態では、対象のポリペプチドは約２５〜約２０００、約２５〜１０００、約２５〜約５００、約２５〜約２５０、約２５〜約１００、または約２５〜約５０のアミノ酸の長さである。

【0095】

（対象のポリペプチドと組み換え融合タンパク質の相対的なサイズ）
対象のポリペプチドの収率は十分な組み換え融合タンパク質の収率に比例する。この割合は、対象のポリペプチドと組み換え融合タンパク質の相対的なサイズ（例えば、アミノ酸中の分子量および／または長さ）に依存する。例えば、融合タンパク質中のＮ末端融合パートナーのサイズを減少させることで、産生された融合タンパク質の大部分が対象のポリペプチドになる。実施形態では、対象のポリペプチドの収率を最大限にするために、Ｎ末端融合パートナーは対象のポリペプチドに対するそのサイズに基づいて選択される。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは対象のポリペプチドに対して最小限のサイズ（例えばアミノ酸中のＭＷまたは長さ）となるように選択される。実施形態では、組み換え融合タンパク質は、対象のポリペプチドの分子量が、組み換え融合タンパク質の分子量の約１０％から約５０％までを構成するように設計される。実施形態では、対象のポリペプチドの分子量は、組み換え融合タンパク質の分子量の約または少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％ ４５％、または５０％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドの分子量は、組み換え融合タンパク質の分子量の約または少なくとも約１０％〜約５０％、１１％〜約５０％、１２％〜約５０％、１３％〜約５０％、１４％〜約５０％、１５％〜約５０％、２０％〜約５０％、２５％〜約５０％、３０％〜約５０％ ３５％〜約５０％ ４０％〜約５０％ １３％〜約４０％、１４％〜約４０％、１５％〜約４０％、２０％〜約４０％、２５％〜約４０％、３０％〜約４０％、３５％〜約４０％、１３％〜約３０％、１４％〜約３０％、１５％〜約３０％ ２０％〜約３０％ ２５％〜約３０％ １３％〜約２５％、１４％〜約２５％、１５％〜約２５％、または２０％〜約２５％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはｈＰＴＨであり、対象のポリペプチドの分子量は、組み換え融合タンパク質の分子量の約１４．６％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはｈＰＴＨであり、対象のポリペプチドの分子量は、組み換え融合タンパク質の分子量の約１３．６％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはｈＰＴＨであり、対象のポリペプチドの分子量は、組み換え融合タンパク質の分子量の約２７．３％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはｍｅｔ−ＧＣＳＦであり、対象のポリペプチドの分子量は、組み換え融合タンパク質の分子量の約３９％から約７２％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはプロインスリンであり、対象のポリペプチドの分子量は、組み換え融合タンパク質の分子量の約２０％から約５７％を構成する。

【0096】

実施形態では、対象のポリペプチドの長さは、組み換え融合タンパク質の全長の約１０％から約５０％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドの長さは、組み換え融合タンパク質の全長の約または少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドの長さは、組み換え融合タンパク質の全長の約または少なくとも約１０％〜約５０％、１１％〜約５０％、１２％〜約５０％、１３％〜約５０％、１４％〜約５０％、１５％〜約５０％、２０％〜約５０％、２５％〜約５０％、３０％〜約５０％、３５％〜約５０％、４０％〜約５０％、１３％〜約４０％、１４％〜約４０％、１５％〜約４０％、２０％〜約４０％、２５％〜約４０％、３０％〜約４０％、３５％〜約４０％、１３％〜約３０％、１４％〜約３０％、１５％〜約３０％ ２０％〜約３０％、２５％〜約３０％、１３％〜約２５％、１４％〜約２５％、１５％〜約２５％、または２０％〜約２５％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはｈＰＴＨであり、対象のポリペプチドの長さは、組み換え融合タンパク質の全長の約１３．１％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはｈＰＴＨであり、対象のポリペプチドの長さは、組み換え融合タンパク質の全長の約１２．５％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはｈＰＴＨであり、対象のポリペプチドの長さは、組み換え融合タンパク質の全長の約２５．７％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはｍｅｔ−ＧＣＳＦであり、対象のポリペプチドの長さは、組み換え融合タンパク質の全長の約４０％〜約７２％を構成する。実施形態では、対象のポリペプチドはプロインスリンであり、対象のポリペプチドの長さは、組み換え融合タンパク質の全長の約１９％〜約５６％を構成する。

【0097】

（対象のポリペプチドとＮ末端融合パートナー等電点の差）
タンパク質（ｐＩ）の等電点は、タンパク質が正味電荷を運ばないｐＨとして定義される。ｐＩ値は所定のｐＨでタンパク質の溶解性に影響を与えることが知られている。そのｐＩよりも下のｐＨでは、タンパク質は正味の正電荷を運び、ｐＩよりも上のｐＨでは、タンパク質は正味の負電荷を運ぶ。タンパク質はこうした等電点（全電荷）によって分離可能である。実施形態では、対象のポリペプチドのｐＩとＮ末端融合タンパク質のそれは実質的に異なる。これにより、Ｎ末端融合タンパク質から離して対象のポリペプチドの精製を促すことができる。実施形態では、対象のポリペプチドのｐＩはＮ末端融合パートナーのそれよりも少なくとも２倍高い。実施形態では、対象のポリペプチドのｐＩはＮ末端融合パートナーのそれよりも１．５〜３倍高い。実施形態では、対象のポリペプチドのｐＩは、Ｎ末端融合パートナーのそれよりも１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３倍以上高い。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーのｐＩは、約４、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、または約５である。実施形態では、Ｎ末端融合パートナーのｐＩは、約４〜約５、約４．１〜約４．９、４．２〜約４．８、約４．３〜約４．７、約４．４〜約４．６である。

【0098】

実施形態では、Ｎ末端融合パートナーは、列挙されるｐＩを有する表８または１８に列挙されたパートナーである。実施形態では、対象のＣ末端ポリペプチドは、８．５２のｐＩと４１１７．６５ダルトンの分子量を有するｈＰＴＨ １−３４である。実施形態では、対象のＣ末端ポリペプチドは、５．６６のｐＩと１８８０１．９ダルトンの分子量を有する、ｍｅｔ−ＧＣＳＦである。実施形態では、対象のＣ末端ポリペプチドは、約５．２のｐＩと約９．３４ＫＤａの分子量を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８で説明されるようなプロインスリンである。実施形態では、対象のＣ末端ポリペプチドは、約６．０７のｐＩと８．８１ＫＤａの分子量を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９で説明されるようなプロインスリンである。実施形態では、対象のＣ末端ポリペプチドは、約５．５２のｐＩと約８．７５ＫＤａの分子量を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０で説明されるようなプロインスリンである。実施形態では、対象のＣ末端ポリペプチドは、６．０７のｐＩと約７．３ＫＤａの分子量を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１で説明されるようなプロインスリンである。タンパク質のｐＩは文献に記載され、かつ当業者に知られているような任意の方法によって決定できる。

【0099】

（シャペロンとタンパク質フォールディングモジュレーター）
非天然の宿主細胞（異種タンパク質が天然ではない細胞）中において高収率での異種タンパク質の産生に対する障害は、溶解可能なおよび／または活性な形態の異種タンパク質を産生するために細胞がしばしば十分に備わっていないということである。タンパク質の一次構造はそのアミノ酸配列によって定義されるが、二次構造は、アルファ螺旋またはベータシートの存在により定義され、三次構造は、タンパク質内（例えばタンパク質ドメイン間）のアミノ酸側鎖相互作用によって定義される。異種タンパク質を発現する場合、とりわけ大規模な産生においては、タンパク質そのものの二次と三次構造が決定的に重要である。タンパク質構造のいかなる有意な変化も機能的に不活性な分子、または著しく還元された生物学的活性を備えたタンパク質を産生し得る。多くの症例では、宿主細胞は、活性な異種タンパク質の適切な産生に必要なシャペロンまたはタンパク質フォールディングモジュレーター（ＰＦＭ）を発現する。しかしながら、使用することができて経済的に満足なバイオテクノロジー製品を産生するのに一般に必要な高いレベルでの発現では、細胞は、異種で発現したタンパク質をプロセシングするために十分な天然タンパク質フォールディングモジュレーターまたはモジュレーターを生成することができないことが多い。

【0100】

ある発現系では、異種タンパク質の過剰生産は、ミスフォールディングと不溶性凝集体への分離が伴う場合がある。細菌細胞では、こうした凝集体は封入体として知られている。封入体にプロセシングされたタンパク質は、場合によっては、不溶性画分のさらなるプロセシングを介して回復可能である。封入体で見られるタンパク質は一般的に変性と再生を含む多重ステップによって精製されなければならない。封入体タンパク質の典型的な再生プロセスは、濃縮した変性剤中で凝集体を溶かし、希釈による変性剤のその後の除去を伴う試みを含んでいる。凝集体は、この段階で頻繁に再形成される。追加のプロセシングはコストがかさみ、インビトロでのリフォールディングが生物学的に活性な生成物を生み出すという保証はなく、回復されたタンパク質は大量の断片不純物を含むことがあり得る。

【0101】

インビボのタンパク質フォールディングは分子シャペロンによって支援され、該シャペロンはフォールディング中間体と一時的に相互に作用することにより、およびフォールディング経路に沿って律速段階を加速させるｆｏｌｄａｓｅｓにより、他のポリペプチドの適切な異性化と細胞のターゲッティングを促す。場合によっては、シャペロンの過剰発現が、凝集しがちなタンパク質の溶解可能な収率を増加させるとことが分かっている（Ｂａｎｅｙｘ，Ｆ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ． １０：４１１−４２１を参照）。こうしたシャペロンの細胞内の濃度の増大に関連した有益な効果は、過剰生産されたタンパク質の性質に大きく依存するように思われ、すべての異種タンパク質で同じタンパク質フォールディングモジュレーターの過剰発現を必要とするわけはないことがある。シャペロン、ジスルフィド結合イソメラーゼ、およびペプチジル−プロリル シス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅｓ）を含むタンパク質フォールディングモジュレーターは、新生ポリペプチドのフォールディング、アンフォールディング、および分解を助けるすべての細胞中に存在するタンパク質のクラスである。

【0102】

シャペロンは、新生ポリペプチドに結合し、それらを安定させ、適切にフォールディングさせることで作用する。タンパク質は疎水性および親水性の残基を有し、前者は表面上で通常露出されるが、後者は、残基が分子を囲む水ではなく他の親水性の残基と相互に作用する構造内に埋められている。しかしながら、ポリペプチド鎖のフォールディングの際に、タンパク質が部分的に折り畳まれた状態または誤って折り畳まれた状態で存在するため、親水性の残基はある期間にわたってしばしば露出される。形成ポリペプチドが永久的に誤って折り畳まれるか、または他の誤って折り畳まれたタンパク質と相互に作用し、細胞内の大きな凝集体または封入体を形成することができるのはこの期間である。シャペロンは一般に、部分的な折り畳み鎖の疎水性領域に結合することと、それらが完全に誤って折り畳むか、または他のタンパク質とともに凝集するのを防ぐことによって作用する。シャペロンは封入体中のタンパク質とすら結合し、脱凝集させることができる。フォールディングモジュレーターのＧｒｏＥＳ／ＥＬ、ＤｎａＫＪ、Ｃｌｐ、Ｈｓｐ９０、およびＳｅｃＢファミリーはすべてシャペロンのような活性を持つタンパク質の例である。

【0103】

ジスルフィド結合イソメラーゼはフォールディングモジュレーターの別の重要なタイプである。こうしたタンパク質は、フォールディングポリペプチドが適切なイントラタンパク質ジスルフィド結合を組織するのを助けるために一連の非常に特異的な反応を触媒する。２つを超えるシステインを有するどんなタンパク質も間違った残基間でジスルフィド結合を組織する危険がある。ジスルフィド結合形成ファミリーは、周辺質の非還元環境下でジスルフィド結合の形成を触媒するＤｓｂタンパク質からなる。周辺質のポリペプチドがジスルフィド結合イソメラーゼを誤って折り畳むと、ＤｓｂＣはジスルフィド結合を再調整し、タンパク質を適切な結合で改良させる。

【0104】

ＦｋｌＢとＦｒｎＥのタンパク質は、フォールディングモジュレーターのペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼファミリーに属する。これは、オリゴペプチド中のプロリンイミド酸ペプチド結合のシス−トランス異性化を触媒する酵素のクラスである。プロリン残基は、その直前のペプチジル結合がシスまたはトランスの配座を取ることができるという点で、アミノ酸のなかでも独特である。他のすべてのアミノ酸については、立体障害のせいで上記は好ましくない。ペプチジル−プロリル シス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅｓ）は、１つの形態から別の形態へのこの結合の転換を触媒する。この異性化は、タンパク質のフォールディング、リフォールディング、サブユニットのアセンブリ、および細胞内の輸送を促進および／または支援することもある。

【0105】

非特異的なやり方でタンパク質と相互に作用するように見える一般的なシャペロンに加えて、特定の標的のフォールディングを助けるシャペロンもある。こうしたタンパク質に特異的なシャペロンは、標的と複合体を形成し、凝集と分解を防ぎ、それらが集合してマルチサブユット構造を構築する時間を考慮に入れる。ＰａｐＤシャペロンは１つの例であり（Ｌｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＰａｐＤ， ｉｎ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｏｌｄｉｎｇ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ， Ｇｅｔｈｉｎｇ Ｍ−Ｊ Ｅｄ． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：４６３−４６５に記載されている）、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0106】

フォールディングモジュレーターは、例えば、ＨＳＰ７０タンパク質、ＨＳＰ１１０／ＳＳＥタンパク質、ＨＳＰ４０（ＤｎａＪ−関連）タンパク質、ＧＲＰＥ様タンパク質、ＨＳＰ９０タンパク質、ＣＰＮ６０およびＣＰＮ１０タンパク質、細胞質シャペロニン、ＨＳＰ１００タンパク質、小さなＨＳＰ、カルネキシンとカルレティキュリン、ＰＤＩおよびチオレドキシン関連タンパク質、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、シクロフィリンＰＰＩａｓｅｓ、ＦＫ−５０６結合タンパク質、ｐａｒｖｕｌｉｎ ＰＰＩａｓｅｓ、シャペロニン、タンパク質特異的なシャペロン、または分子内シャペロンを含む。フォールディングモジュレーターは基本的に、Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｏｌｄｉｎｇ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ，“ １９９７， ｅｄ． Ｍ． Ｇｅｔｈｉｎｇ， Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａに記載されている（当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0107】

Ｅ．ｃｏｌｉ の細胞質で最も特徴づけられた分子シャペロンは、ＡＴＰ依存性のＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥとＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ系である。Ｅ． ｃｏｌｉ では、フォールディングモジュレーター／シャペロンのネットワークはＨｓｐ７０ファミリーを含む。主要なＨｓｐ７０シャペロンであるＤｎａＫは、タンパク質凝集を効率的に防ぎ、損傷を受けたタンパク質のリフォールディングを支援する。タンパク質凝集物への熱ショックタンパク質のとり込みにより、分解を促進させることが可能である。インビトロの研究と相同性の考察に基づいて、多くの追加の細胞質タンパク質はＥ． ｃｏｌｉ 中の分子シャペロンとして機能することが提案されてきた。これらは、ＣｌｐＢ、ＨｔｐＧ、およびＩｂｐＡ／Ｂを含み、これらはＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥとＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳのように、ストレスレギュロンに属する熱ショックタンパク質（Ｈｓｐｓ）である。

【0108】

Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓであるＤｎａＪ様タンパク質は、タンパク質のＤｎａＪ／Ｈｓｐ４０ファミリーに属する分子シャペロンであり、高度に保存されたＪ−ドメインを特徴とする。Ｊ−ドメイン（７０のアミノ酸の領域である）は、ＤｎａＪタンパク質のＣ末端に位置する。Ｎ末端は膜への挿入を促す膜貫通（ＴＭ）ドメインを有する。Ａ−ドメインはＪ−ドメインからＴＭドメインを分離させる。ＤｎａＪファミリー中のタンパク質は別のシャペロンタンパク質ＤｎａＫ（コシャペロンとして）と相互に作用することにより、タンパク質フォールディングにおいて決定的な役割を果たす。高度に保存されたＪ−ドメインはＤｎａＪタンパク質とＤｎａＫタンパク質との間の相互作用の部位である。Ｉ型ＤｎａＪタンパク質は真のＤｎａＪタンパク質と考えられるが、ＩＩ型およびＩＩＩ型は通常ＤｎａＪ様タンパク質と呼ばれる。ＤｎａＪ様タンパク質は、ストレス変性した変性タンパク質の凝集を防ぐことによって、およびＤｎａＫに依存したやり方とＤｎａＫ非依存的なやり方の両方でタンパク質を分解することによって、高浸透圧ショックと熱ショックに対する応答に活発に参加することをも知られている。

【0109】

Ｘ−Ｐｒｏ結合のトランス配座は、新生タンパク質鎖中でエネルギー的に有利である。しかしながら、すべてのプロリル・ペプチド結合のおよそ５％は、天然タンパク質中のシス配座で見られる。Ｘ−Ｐｒｏ結合のトランスからシスへの異性化は、多くのポリペプチドのフォールディング中で律速であり、ペプチジルプロリル・シス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅｓ）によって生体内で触媒される。３つの細胞質ＰＰＩａｓｅｓ、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、およびトリガー因子（ＴＦ）が現在までＥ．ｃｏｌｉ 中で同定されている。４８ｋＤａのタンパク質であるＴＦは、新しく合成されたタンパク質の適切なフォールディングを保証するために、Ｅ． ｃｏｌｉ 中のシャペロンと協同すると仮定されてき５０Ｓリボソームサブユニットに関連付けられる。少なくとも５つのタンパク質（チオレドキシン１と２、グルタレドキシン １、２、および３、ｔｒｘＡ、ｔｒｘｃ、ｇｒｘＡ、ｇｒｘＢ、およびｇｒｘＣの遺伝子のそれぞれの生成物）が、細胞質酵素中で一時的に発生するジスルフィド架橋の還元に関与する。したがって、Ｎ末端融合パートナーは、適切なジスルフィド結合形成を可能にするジスルフィド結合成形タンパク質またはシャペロンであり得る。

【0110】

本発明の方法に役立つフォールディングモジュレーターの例が表１に示されている。ＲＸＦ番号はオープンリーディングフレームを指す。米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０号と第２０１０／０１３７１６２号（両文献とも「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｈｏｓｔｓ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｙｉｅｌｄ ａｎｄ／ｏｒ Ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」という発明の名称で、全体として参照により本明細書に組み込まれる）は、表１に列挙されたタンパク質のオープンリーディングフレーム配列を開示している。プロテアーゼとフォールディングモジュレーターは、米国特許第８，６０３，８２４号（発明の名称「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、全体として参照により本明細書に組み込まれる）の表Ａ−Ｆでも提供されている。

【0111】

【表1-1】

【0112】

【表1-2】

【0113】

【表1-3】

【0114】

【表1-4】

【0115】

（リンカー）
本発明の組み換え融合タンパク質は、Ｎ末端融合パートナーと対象のＣ末端ポリペプチドとの間にリンカーを含む。実施形態では、リンカーは、切断酵素（つまりタンパク質を内部で切断するタンパク分解酵素）によって認識される切断部位を含む。実施形態では、切断部位でのリンカーの切断により、Ｎ末端融合パートナーから対象のポリペプチドを分離させる。タンパク分解酵素は、当該技術分野で知られている、または文献、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ２００３／０１０２０４「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ｆｒｏｍ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」、米国特許第５，７５０，３７４号「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ａｎｄ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓａｍｅ」、および、米国特許第５，９３５，８２４号に記載されている任意のプロテアーゼであり得る。当該文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0116】

実施形態では、リンカーは、例えば、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンプロテアーゼ、混合プロテアーゼ、または未知の触媒タイプのプロテアーゼによって切断された切断部位を含む。実施形態では、セリンプロテアーゼは、例えば、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、エラスターゼ、プロテイナーゼＫ、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、アシルアミノ酸放出酵素である。実施形態では、メタロプロテアーゼは、例えば、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ、サーモリシン、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢである。実施形態では、システインプロテアーゼは、例えばパパイン、クロストリパイン、カテプシンＣ、またはピログルタミン酸アミノペプチダーゼである。実施形態では、アスパラギン酸プロテアーゼは、例えばペプシン、キモシン、カテプシンＤである。実施形態では、グルタミン酸プロテアーゼは、例えば、スキタリドグルタミン（ｓｃｙｔａｌｉｄｏｇｌｕｔａｍｉｃ）ペプチダーゼである。実施形態では、アスパラギンプロテアーゼは、例えば、ノダウイルスペプチド・リアーゼ、インテイン含有葉緑体ＡＴＰ依存性のペプチド・リアーゼ、インテイン含有複製ＤＮＡヘリカーゼ前駆体、またはレオウイルス１型コートタンパク質である。実施形態では、未知の触媒型のプロテアーゼは、例えば、コラゲナーゼ、タンパク質Ｐ５ムレイン・エンドペプチダーゼ、ホモ多量体ペプチダーゼ、ミクロシン−プロセシング・ペプチダーゼ１、Ｄｏｐイソペプチダーゼである。

【0117】

実施形態では、リンカーは、アクロモペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、アンクロッド、アンギオテンシン変換酵素、ブロメライン、カルパイン、カルパインＩ、カルパインＩＩ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＧ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＷ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ（一般）、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、キモパパイン、キマーゼ、キモトリプシン、ａ−クロストリパイン、コラゲナーゼ、補体Ｃ１ｒ、補体Ｃ１ｓ、補体因子Ｄ、補体因子Ｉ、ククミシン、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、エラスターゼ、白血球、エラスターゼ、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、エンテロキナーゼ、因子Ｘａ、フィシン、フューリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＨＩＶプロテアーゼ、ＩＧａｓｅ、カリクレイン組織、ロイシンアミノペプチダーゼ（一般）、ロイシンアミノペプチダーゼ、細胞質ゾル、ロイシンアミノペプチダーゼ、ミクロソーム、マトリックスメタロプロテアーゼ、メチオニン・アミノペプチダーゼ、ニュートラーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ）、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロリダーゼ、プロナーゼＥ、前立腺特異性抗原、プロテアーゼ、ストレプトマイセス−グリセウスからの好アルカリ性、アスペルギルス属からのプロテアーゼ、アスペルギルスｓａｉｔｏｉからのプロテアーゼ、アスペルギルス ソーヤからのプロテアーゼ、プロテアーゼ（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（アルカリ性）、プロテアーゼ（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（Ａｌｃａｌａｓｅ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａからのプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）からのプロテアーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．からのプロテアーゼ、プロテアーゼＳ、プロテアソーム、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのプロテイナーゼ、プロテイナーゼ３、プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＫ、プロテインＣ、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ、レニン、レンニン、ストレプトキナーゼ、サブチリシン、サーモリシン、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、トリプターゼ、またはウロキナーゼの切断部位を含む。実施形態では、リンカーは、エンテロキナーゼ、因子Ｘａ、またはフューリンによって認識された切断部位を含む。実施形態では、リンカーは、エンテロキナーゼまたはトリプシンによって認識された切断部位を含む。実施形態では、リンカーは、牛のエンテロキナーゼによって認識された切断部位を含む。本発明の方法で有用なこれらおおび他のプロテアーゼとその切断認識部位は、当該技術分野で知られており、文献、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８８）； Ｗａｌｓｈ， ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．， Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ， Ｅｎｇｌａｎｄ （２００２）に記載されており、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0118】

実施形態では、リンカーはアフィニティータグを含む。アフィニティータグはタンパク質精製に役立ち得るペプチド配列である。アフィニティー技術を使用して、天然の生物学的ソースからのタンパク質の精製を促すために、アフィニティータグはタンパク質に融合される。当該技術分野で知られているいかなる適切なアフィニティータグも必要に応じて使用することが可能である。実施形態では、本発明で使用されるアフィニティータグは、例えば、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−転移酵素タンパク質、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９）、カルモジュリン・タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０）、Ｍｙｃタグ、ＢＰタグ、ＨＡタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１）、Ｅ−タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）、Ｓ−タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３）、ＳＢＰタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４）、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５）、Ｖ５タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６）、Ｘｐｒｅｓｓタグ、緑色蛍光タンパク質、Ｎｕｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、チオレドキシンタグ、ＭＢＰタグ、ＶＳＶタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７）、またはＡｖｉタグである。

【0119】

アフィニティータグは化学薬品によって、またはタンパク質分解のような酵素手段によって除去可能である。タンパク質精製においてアフィニティータグを使用する方法は、文献、例えば、Ｌｉｃｈｔｙ， ｅｔ ａｌ．， ２００５， “Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４１： ９８−１０５に記載されている。本発明のリンカーで役立つ他のアフィニティータグが当該技術分野で知られており、文献、例えば、上で参照される米国特許第５，７５０，３７４号、およびＴｅｒｐｅ Ｋ．， ２００３， “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｔａｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｓｉｏｎｓ： ｆｒｏｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｔｏ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ，” Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （６０）：５２３−５３３に記載されており、当該文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0120】

実施形態では、リンカーは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、または５０あるいはそれ以上のアミノ酸の長さである。実施形態では、リンカーは、４〜５０、４〜４５、４〜４０、４〜３５、４〜３０、４〜２５、４〜２０、４〜１５、４〜１０、５〜５０、５〜４５、５〜４０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、または２０〜２５のアミノ酸長さである。実施形態では、リンカーは１８のアミノ酸長さである。実施形態では、リンカーは１９のアミノ酸長さである。

【0121】

実施形態では、リンカーは複数のグリシン残基を含む。実施形態では、リンカーは１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のグリシン残基を含む。実施形態では、リンカーは、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、または１〜４のグリシン残基を含む。実施形態では、グリシン残基は連続している。実施形態では、リンカーは少なくとも１つのセリン残基を含む。実施形態では、グリシンおよび／またはセリンの残基はスペーサーを含む。実施形態では、スペーサーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で説明されるように、１０のアミノ酸を有する（Ｇ４Ｓ）２スペーサーである。実施形態では、スペーサーは、（Ｇ４Ｓ）１、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）４、または（Ｇ４Ｓ）５のスペーサーである。実施形態では、リンカーは６つのヒスチジン残基、または１つのＨｉｓ−タグを含んでいる。実施形態では、リンカーは、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（ＤＤＤＤＫ）によって説明されるようにエンテロキナーゼ切断部位を含む。実施形態では、組み換え融合タンパク質は、表２で列挙されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９〜１２、または２２６のいずれかで説明されるようなリンカーを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９中のエンテロキナーゼ切断部位は下線を引かれている。ポリヒスチジンアフィニティータグは，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９〜１２と２２６の各々においてイタリック体にされている。実施形態では、組み換え融合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対応するリンカーを含む。

【0122】

【表2】

【0123】

（発現ベクター）
実施形態では、組み換え融合タンパク質をコードする遺伝子断片は、組み換え融合タンパク質を発現するための発現ベクターを生成するために適切な発現プラスミドへ導入される。発現ベクターは例えばプラスミドであり得る。いくつかの実施形態では、組み換え融合タンパク質配列をコードするプラスミドは選択マーカーを含むことができり、プラスミドを維持する宿主細胞は選択的な条件下で成長可能である。いくつかの実施形態では、プラスミドは選択マーカーを含まない。いくつかの実施形態では、発現ベクターは宿主細胞ゲノムへ統合可能である。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、発現した融合タンパク質を細胞質へ導くことが可能な、リンカーとタンパク質とに融合したｈＰＴＨ１−３４をコードする。実施形態では、発現ベクターは、発現した融合タンパク質を周辺質へ導くことが可能な、リンカーとタンパク質とに融合したｈＰＴＨ１−３４をコードする。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、リンカーとＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＤｎａＪ様タンパク質とに融合したｈＰＴＨ１−３４をコードする。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、リンカーとＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢタンパク質とに融合したｈＰＴＨ１−３４をコードする。

【0124】

ＰＴＨ１−３４融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、本明細書の配列表で提供される。ＤｎａＪ様タンパク質Ｎ末端融合パートナーを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに最適化されたコード配列に対応する、指定された遺伝子ＩＤ１２６２０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）である。配列指定された遺伝子ＩＤ１２６２０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）は、最適化されたリンカーと融合した天然のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤｎａＪコード配列とＰＴＨ１−３４コード配列に対応する。遺伝子配列１２６２０３と１２６２０６は、それぞれ発現プラスミドｐ７０８−００１とｐ７０８−００４中に存在する配列である。ＦｋｌＢ Ｎ末端融合パートナーを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに最適化されたコード配列に対応する、指定された遺伝子ＩＤ １２６２０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）である。遺伝子ＩＤ １２６２０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）は、最適化されたリンカーとＰＴＨ１−３４コード配列に融合した天然のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｋｌＢコード配列に対応する。遺伝子配列１２６２０４と１２６２０７は、それぞれ発現プラスミドｐ７０８−００２とｐ７０８−００５中に存在する配列である。ＦｒｎＥ Ｎ末端融合パートナーを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに最適化されたコード配列に対応する指定された遺伝子ＩＤ １２６２０５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）である。配列指定された遺伝子ＩＤ １２６２０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）は、最適化されたリンカーとＰＴＨ１−３４コード配列に融合した天然のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦｒｎＥコード配列に対応する。遺伝子配列１２６２０５と１２６２０８は、それぞれ発現プラスミドｐ７０８−００３とｐ７０８−００６中に存在する。

【0125】

（コドン最適化）
本発明は、用いられている宿主細胞における発現のために最適化されたあらゆる配列を含む、融合タンパク質および／またはその個々の成分の各々の任意の適切なコード配列の使用を企図している。細菌の宿主における発現を改善するためにコドンを最適化する方法は、当該技術分野では知られており、文献に記載されている。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 宿主株中の発現のためのコドンの最適化は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２９２９１８号「Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ」に記載されており、当該文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。Ｅ． ｃｏｌｉ 中の発現のためのコドン最適化は、例えば、Ｗｅｌｃｈ， ｅｔ ａｌ．， ２００９， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， “Ｄｅｓｉｇｎ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， ４（９）： ｅ７００２に記載されており、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。融合タンパク質成分のためのコード配列の非限定的な例が本明細書で提供されているが、しかしながら、いかなる適切な配列も当業者に周知な方法によって必要に応じて生成可能であると考えられている。

【0126】

（発現系）
本方法に係る対象のポリペプチドを産生するのに役立つ適切な細菌発現系は、本明細書に記載の教示に基づいて当業者によって同定可能である。実施形態では、対象のポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物は、誘導可能な発現ベクターの一部として提供される。実施形態では、発現ベクターで形質転換された宿主細胞が培養され、発現ベクターからの融合タンパク質の発現が引き起こされる。発現ベクターは例えばプラスミドであり得る。実施形態では、発現ベクターは選択マーカーをさらに含む組み換え融合タンパク質コード配列をコードするプラスミドであり、宿主細胞は、プラスミドの維持を可能にする選択的な条件下で成長する。実施形態では、発現構築物は宿主細胞ゲノムへ統合される。実施形態では、発現構築物は、周辺質へ組み換え融合タンパク質を導くことができる分泌信号に融合した組み換え融合タンパク質をコードする。

【0127】

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞を含む本発明の方法に役立つ宿主細胞中で、有用な調節配列（例えば、プロモーター、分泌リーダー、およびリボソーム結合部位）を含む異種タンパク質を発現する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０号と第２０１０／０１３７１６２号、米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ」、および米国特許第８，６０３，８２４号に記載されており、各々の文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。こうした出版物はさらに本発明の方法を実行するのに役立つ細菌の宿主株について記載しており、これらはフォールディングモジュレーターを過剰発現させるように操作されているか、あるいは、例えば、異種タンパク質発現を増加させるために、プロテアーゼの活性を取り除くか、不活性化するか、または減少させるためにプロテアーゼ突然変異が導入されている。配列リーダーは、米国特許第７，６１８，７９９号「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と米国特許第７，９８５，５６４号「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｃ−ｓｙｓｔｅｍ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ」（両文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる）、および先に参照された米国特許出願公開第２０１０／０１３７１６２号に記載されている。

【0128】

本発明に合わせて使用されるプロモーターは、構成的プロモーターであることもあれば、調節されたプロモーターであることもある。誘導可能なプロモーターの例としては、ラックプロモーター（つまり、ｌａｃＺプロモーター）、例えば、米国特許第４，５５１，４３３号「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるｔａｃおよびｔｒｃのプロモーターや、Ｐｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、およびＴ７ｌａｃプロモーターに由来するファミリーのプロモーターを含む。実施形態では、プロモーターは宿主細胞の生物に由来しない。実施形態では、プロモーターはＥ． ｃｏｌｉ 生物に由来する。実施形態では、ラックプロモーターはプラスミドからの組み換え融合タンパク質の発現を調節するために使用される。ラックプロモーター誘導体またはファミリーメンバ（例えばｔａｃプロモーター）の場合には、誘導体はＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクトシド」）である。実施形態では、当該技術分野で周知の、および、文献、例えば、米国特許公開第２００６／００４０３５２号に記載されている方法にしたがって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 宿主細胞中のラックプロモーターからの組み換え融合タンパク質の発現を引き起こすために、ＩＰＴＧが宿主細胞の培養物に加えられる。

【0129】

本発明に係る発現系に役立つ非ラックプロモーターの例はとしては、例えば、Ｊ． Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ ＆ Ｖ． Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ （１９９９） Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ａ． Ｄｅｍａｉｎ ＆ Ｊ． Ｄａｖｉｅｓ， ｅｄｓ．） ｐｐ． ４６０−７４ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）； Ｈ． Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １２：４３９−４４５； ａｎｄ Ｒ． Ｓｌａｔｅｒ ＆ Ｒ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ （２０００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｊ． Ｗａｌｋｅｒ ＆ Ｒ． Ｒａｐｌｅｙ， ｅｄｓ．） ｐｐ． １２５−５４ （Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）に記載される、ＰＲ（高温によって誘導される）、ＰＬ（高温によって誘導される）、Ｐｍ（アルキル安息香酸塩またはハロ安息香酸塩によって誘導される）、Ｐｕ（アルキル−トルエンまたはハロ−トルエンによって誘導される）、またはＰｓａｌ（サリチル酸塩によって誘導される）が挙げられる。選択された細菌の宿主細胞に固有のプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーターは、対象のポリペプチドをコードする発現構築物の発現を制御するために使用されてもよく、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓアントラニル酸塩または安息香酸塩オペロンのプロモーター（Ｐａｎｔ，Ｐｂｅｎ）である。１つを超えるプロモーターが別のプロモーターに共有結合しているタンデムプロモーターが、配列において同じであろうとなかろうと、例えば、同じまたは異なる生物に由来するＰａｎｔ−ＰｂｅｎタンデムプロモーターであろうとＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモーター（内部プロモーターハイブリッド）であろうと、使用されてもよい。実施形態では、プロモーターは、例えば、米国特許７，４７６，５３２号や第８，０１７，３５５号に記載されるように、Ｐｍｔｌである（両文献とも「Ｍａｎｎｉｔｏｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ」という発明の名称で、全体として参照により本明細書に組み込まれる）。

【0130】

調節された（誘導可能）プロモーターは、プロモーターがその一部である遺伝子の転写を制御するためにプロモーター調節タンパク質を利用する。調節されたプロモーターが本明細書で使用される場合、対応するプロモーター調節タンパク質も本発明に係る発現系の一部になる。プロモーター調節タンパク質の例としては以下が挙げられる：活性化タンパク質（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ カタボライト活性化タンパク質、ＭａｌＴ タンパク質；ＡｒａＣファミリー転写活性化因子；リプレッサータンパク質（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｌａｄタンパク質）；および、二重機能調節タンパク質（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ ＮａｇＣタンパク質）。多くの調節されたプロモーター／プロモーター調節タンパク質の対が当該技術分野で知られている。

【0131】

プロモーター調節タンパク質は、エフェクター化合物、つまり、タンパク質が、プロモーターの制御下にある遺伝子の少なくとも１つのＤＮＡ転写制御領域を放出するか該領域に結合することができるように、調節タンパク質と可逆的または不可逆的に会合する化合物と相互作用し、それによって、遺伝子の転写を始める際にトランスクリプターゼ酵素の作用を許可するまたは阻害する。エフェクター化合物は誘導体またはコリプレッサーとして分類され、これらの化合物は天然のエフェクター化合物と無償性誘導物質化合物を含む。多くの調節されたプロモーター／プロモーター調節タンパク質／エフェクター化合物のトリオが当該技術分野で知られている。エフェクター化合物は細胞培養または発酵の全体にわたって使用可能であるが、調節されたプロモーターが使用される好ましい実施形態では、対象の量または密度の宿主細胞バイオマスの成長後、対象のタンパク質またはポリペプチドをコードする対象の遺伝子の発現を直接的または間接的にもたらすために適切なエフェクター化合物が培養物に加えられる。

【0132】

ｌａｃファミリープロモーターが利用される実施形態では、ｌａｃＩ遺伝子も系に存在し得る。ｌａｃＩ遺伝子（通常は構成的に発現された遺伝子である）は、ｌａｃファミリープロモーターのラックオペレーターに結合するＬａｃレプレッサータンパク質ＬａｃＩタンパク質をコードする。したがって、ｌａｃファミリープロモーターが利用される場合、ｌａｃ遺伝子も発現系に含まれ、発現され得る。

【0133】

（他の調節要素）
実施形態では、他の調節要素は組み換え融合タンパク質をコードする発現構築物中に存在する。実施形態では、溶解可能な組み換え融合タンパク質は、産生の間に細胞の細胞質または周辺質のいずれかの中に存在する。融合タンパク質を標的とするのに役立つ分泌リーダーは本明細書に別記される。実施形態では、本発明の発現構築物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ細胞の細胞質への組み換え融合タンパク質に輸送することができる分泌リーダーに融合した組み換え融合タンパク質をコードする。実施形態では、発現構築物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ細胞の周辺質に組み換え融合タンパク質を輸送することができる、分泌リーダーに融合した組み換え融合タンパク質をコードする。実施形態では、分泌リーダーは組み換え融合タンパク質から切断される。

【0134】

他の要素としては、限定されないが、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、活性化因子、翻訳の開始および停止シグナル、転写ターミネーター、シストロンレギュレーター、ポリシストロニックレギュレーター、前述のように、発現されたポリペプチドの同定、分離、精製、および／または単離を促す、ヌクレオチド配列「タグ（ｔａｇｓ）」と「タグ（ｔａｇ）」ポリペプチドコード配列などのタグ配列が挙げられる。実施形態では、発現構築物は、タンパク質コード配列に加えて、それに動作可能に結合した以下の調節要素：プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、転写ターミネーター、および翻訳の開始および停止のシグナルのいずれかを含む。有用なＲＢＳは、例えば、先に参照された米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０号と第２０１０／０１３７１６２号に係る発現系において、宿主細胞として有用な種のいずれかからも得ることが可能である。多くの特定かつ様々なコンセンサスＲＢＳが知られており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＤ．Ｆｒｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ２３４（２）：２５７−６５ （８ Ｊｕｌ． １９９９）； ａｎｄ Ｂ． Ｅ． Ｓｕｚｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７（１２）：１１２３−３０ （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００１）によって記載および参照されている。加えて、例えば、ＥＰ０２０７４５９（合成ＲＢＳ）；Ｏ． Ｉｋｅｈａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８１（３）：５６３−７０ （１９８９）に記載されるものなどといった天然または合成ＲＢＳが使用されてもよい。実施形態では、「Ｈｉ」リボソーム結合部位ａｇｇａｇｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）が構築物の中で使用される。ＲＢと翻訳開始コドンとの間の間隔の最適化を含むリボソーム結合部位は、文献、例えば、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９４， “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ａｌｉｇｎｅｄ ｓｐａｃｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍＲＮＡｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（２３）：４９５３−４９５７， ａｎｄ Ｍａ， ｅｔ ａｌ．， ２００２， “Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｓｕｃｈ ａｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ Ｏｐｅｒｏｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，” Ｊ． Ｂａｃｔ． １８４（２０）： ５７３３−４５によって記載されており、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0135】

方法、ベクター、および翻訳と転写の要素、ならびに本発明で有用な他の要素は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｇｉｌｒｏｙの米国特許第５，０５５，２９４号と、Ｇｉｌｒｏｙらの米国特許第５，１２８，１３０号と、Ｒａｍｍｌｅｒらの米国特許第５，２８１，５３２号と、Ｂａｒｎｅｓらの米国特許第４，６９５，４５５号と第４，８６１，５９５号；Ｇｒａｙ らの米国特許第４，７５５，４６５号；および、Ｗｉｌｃｏｘの米国特許第５，１６９，７６０号に、ならびに、参照により本明細書に組み込まれる他の出版物の多くに記載されている。

【0136】

（分泌リーダー配列）
実施形態では、分泌シグナルまたはリーダーのコード配列は、組み換え融合タンパク質をコードする配列のＮ末端に融合している。分泌シグナル配列を使用することで、細菌中の組換えタンパク質の産生を増加させることができる。さらに、多くのタイプのタンパク質は、既知の方法を使用して非効率的に達成される第２の改良を必要とする。分泌リーダーを利用することで、細胞内環境からタンパク質を分泌することにより適切に折り畳まれたタンパク質の収穫を増加させることが可能である。グラム陰性細菌において、細胞質から分泌されたタンパク質は、細胞膜周辺腔に行き着き、外膜に取り付けられて、または細胞外培養液に行き着くことがある。これらの方法は封入体の形成も回避する。細胞膜周辺腔へのタンパク質の分泌は、適切なジスルフィド結合形成（Ｂａｒｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４， Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇ， Ｃｈａｐｔｅｒ ４５， ２７０−５， ａｎｄ Ｍａｎｏｉｌ， ２０００， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２６：３５−４７）を促す効果を有する。組換えタンパク質の分泌の他の利点は、タンパク質のより効率的な単離、例えば活性型のタンパク質、封入体の形成の減少、宿主細胞に対する毒性の減少の割合と、溶解可能な形態の組換えタンパク質の割合の増加とによって表される収率の増大をもたらす、タンパク質の適切なフォールディングとジスルフィド結合の形成を含む。対象のタンパク質を培地に排出する可能性があるため、バッチよりも、タンパク質産生用の連続的な培地を潜在的に促すこともできる。

【0137】

実施形態では、対象の組み換え融合タンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞の周辺質または細胞外空間を標的としている。実施形態では、発現ベクターは、対象の組み換え融合タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に動作可能に結合した分泌シグナルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

【0138】

したがって、１つの実施形態では、組み換え融合タンパク質は、分泌シグナル、Ｎ末端融合パートナー、リンカー、および対象のポリペプチドを含み、ここで、分泌シグナルは融合パートナーのＮ末端である。タンパク質が周辺質を標的とするとき、分泌シグナルは組み換え融合タンパク質から切断可能である。実施形態では、分泌シグナルとタンパク質またはポリペプチドとの間の結合は、融合タンパク質からの分泌シグナルの切断を増加させるために修飾される。

【0139】

（宿主細胞と株）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ （つまり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ順の宿主細胞）と密接に関連する細菌生物を含む細菌の宿主細胞は、本発明の方法を実行する際の使用について企図されている。ある実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ 宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ でもあり得る。

【0140】

本発明の方法を実行する際に役立つ宿主細胞と構築物は、当該技術分野で知られている、および米国特許第８，２８８，１２７号「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載されている既知の試薬と方法を使用して、同定または作製可能であり、当該文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。本特許は、染色体のｌａｃＩ遺伝子挿入物を含む栄養要求性のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞への核酸構築物の導入による組み換えポリペプチドの産生について記載している。核酸構築物は、宿主細胞中の核酸の発現を方向づけることが可能なプロモーターに動作可能に結合した組み換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、栄養要求性の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。栄養要求性の選択マーカーは、栄養要求性の宿主細胞へ原栄養性を回復させるポリペプチドである。実施形態では、細胞はそれについてプロリン、ウラシル、またはその組み合わせについて栄養要求性である。実施形態では、宿主細胞はＭＢ１０１（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−７８４１）に由来する。米国特許第８，２８８，１２７号「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」とＳｃｈｎｅｉｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２００５， “Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｐｙｒＦ ａｎｄ ｐｒｏＣ ｃａｎ ｒｅｐｌａｃｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ ｈｉｇｈ−ｃｅｌｌ−ｄｅｎｓｉｔｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２１（２）： ３４３−８（両文献とも参照により本明細書に組み込まれる）は、株ＭＢ１０１中のｐｙｒＦ遺伝子を削除することによって構築されたウラシルに対して栄養要求性の産生宿主株について記載している。ｐｙｒＦ遺伝子は、プロトトロピーを回復させるためにｐｙｒＦ欠失を補完することができるプラスミドを生成するべく、株ＭＢ２１４（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−７８４０）からクローンを作製される。特定の実施形態では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞中のデュアルｐｙｒＦ−ｐｒｏＣデュアル栄養要求性の選択マーカー系が使用される。公表された文献を考慮すると、記載されているようなＰｙｒＦ産生宿主株は、標準的な組み換え法にしたがって当業者により作製可能であり、本発明の方法を実行する際に役立つような本明細書に記載されるものを含む他の対象のゲノムの変化を導入するためのバックグラウンドとして使用可能である。

【0141】

実施形態では、宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ 目（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄと呼ばれる）である。宿主細胞がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目である場合、それはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のメンバーであってもよい。ガンマプロテオバクテリアの宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 種のメンバーと、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ種のメンバーを含む。他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 生物も有用なことがある。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ および密接に関連する種とは、Ｒ． Ｅ． Ｂｕｃｈａｎａｎ ａｎｄ Ｎ． Ｅ． Ｇｉｂｂｏｎｓ （ｅｄｓ．）， Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ． ２１７−２８９ （８ｔｈ ｅｄ．， １９７４） （Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍｄ．， ＵＳＡ）によって「グラム陰性好気性桿菌および球菌」として記載された科および／または属に属するプロテオバクテリアのグループを含む、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１を含んでおり、当該文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。（つまり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目の宿主細胞）表３は生物のこれらの科と属を提示する。

【0142】

【表3】

【0143】

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよび密接に関連する細菌は一般に、「グラム（−）プロテオバクテリアサブグループ１」または「グラム陰性好気性桿菌および球菌」として定義されるグループの一部である（Ｂｕｃｈａｎａｎ ａｎｄ Ｇｉｂｂｏｎｓ （ｅｄｓ．） （１９７４） Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ． ２１７−２８９）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 宿主株は、文献、例えば、米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号に記載されており、当該文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0144】

「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」は、分類で使用される基準にしたがってこの表題に分類されるプロテオバクテリアを含んでいる。この表題はさらに、以前にこの段落に分類されていたがもはやそうではないグループ、例えば、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ属、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属、Ｏｃｅａｎｉｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、および Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓに属する（および、その主だと以前呼ばれていた）生物を再分類することによって作製されたＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属 （および、それらか由来するＢｌａｓｔｏｍｏｎａｓ属）、Ｂｅｒｇｅｙ （１９７４） で定義されるようなＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に属する生物を再分類することによって作製されるＡｃｉｄｏｍｏｎａｓ属である。加えて、宿主は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎａｌｉａ（ＡＴＣＣ １４３９３）属、、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓｉ（ＡＴＣＣ １９３７５）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ ８０７１）から細胞を含むことができ、これらはそれぞれ Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ、および、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓとして再分類されている。同様に、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ １５６６８）とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（ＡＴＣＣ １１９９６）はそれぞれ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓとＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉとして再分類され、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ １９３７５）とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ １５０５７）は、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓとＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｉｓｃｉｃｉｄａとして再分類されている。「グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ１」はさらに、科：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ， Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ （異名によりしばしばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅの「Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ基」と呼ばれる）、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、および、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ （異名によりしばしば「Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ」と呼ばれる）のいずれかに属するとして分類されたプロテオバクテリアを含んでいる。結果として、それ以外の本明細書に記載されるこうした属に加えて、さらに「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」に含まれるプロテオバクテリア属は以下を含む：１）Ａｚｏｒｈｉｚｏｐｈｉｌｕｓ属のＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ群の細菌；２） Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ、Ｏｌｉｇｅｌｌａ、およびＴｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒの属のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科の細菌；３） Ｃｈｅｌａｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｓｉｆｅｒ、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ（「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ」とも呼ばれる）、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍの属のＲｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科の細菌；および、４）種類Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｌｄｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓａｒｃｉｎａ、およびＭｅｔｈｙｌｏｓｐｈａｅｒａ属のＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科の細菌。

【0145】

宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」から選択可能である。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」は、以下のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 種（ＡＴＣＣまたは括弧の中に示される典型的な株の他の寄託番号を含む）のプロテオバクテリアの群として定義される：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ ７００６８９）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ （ＡＴＣＣ １０１４５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ （ＡＴＣＣ １４９０９）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ（ＡＴＣＣ ３３６６０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ １３６７４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ ５１５５５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ （ＡＴＣＣ ２５４１１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ ３３６３４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ ８０６２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ （ＡＴＣＣ １７４４０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ １４２３５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ（ＡＴＣＣ ３３６３６）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｇａｒｉｃｉ（ＡＴＣＣ ２５９４１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｇｉｎｏｖｏｒａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｓｐｌｅｎｉｉ（ＡＴＣＣ ２３８３５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｅｌａｉｃａ（ＡＴＣＣ ２７１６２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ（ＡＴＣＣ １９３７２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ ３３６６２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ（ＡＴＣＣ ４３６５５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓａ（ＡＴＣＣ ５５７０３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒａｎｔｉａｃａ（ＡＴＣＣ ３３６６３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ （ＡＴＣＣ ９４４６、ＡＴＣＣ １３９８５、ＡＴＣＣ １７４１８、ＡＴＣＣ １７４６１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ（ＡＴＣＣ ４９７３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ ４９９６８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ（ＡＴＣＣ ４６８３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｓｓｉｃｏｌａ（ＡＴＣＣ ３３６１６）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｔｅｒｐｅｎｉｐｈｉｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｎｇａｔａ（ＡＴＣＣ １０１４４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｅｃｔｅｎｓ（ＡＴＣＣ １２７７５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒｅｎｎｅｒｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｅｌｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ（ＡＴＣＣ ２９７３６）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ ３５８５８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｓｓａｒｄｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｎｄｅｌｉｉ（ＡＴＣＣ ７００８７１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ（ＡＴＣＣ １０８４４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｉｇｕｌａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ（ＡＴＣＣ ４６８５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｈｏｄｅｓｉａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ（ＡＴＣＣ ９８９０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ（ＡＴＣＣ ３３６１８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ（ＡＴＣＣ ７００４７４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ（ＡＴＣＣ １９３７４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｅｒｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ（ＡＴＣＣ １９８６７）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ １４６７０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ（ＡＴＣＣ ７００８７０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ（ＡＴＣＣ １４６６９）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｎｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｔｅ（ＡＴＣＣ ２５４１７）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｐｈｉｔｉｃａ （ＡＴＣＣ ３３６６５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ （ＡＴＣＣ １９２４４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ （ＡＴＣＣ １９０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｃｔｏｒｕｍ（ＡＴＣＣ ２３３２８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｉｌｖａ（ＡＴＣＣ ３１４１８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ（ＡＴＣＣ ７００４７６）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ（ＡＴＣＣ ４３２７２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ ７００３８３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ （ＡＴＣＣ １２６３３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅａｃｔａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ １４６０６）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂａｌｅａｒｉｃａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ（ＡＴＣＣ ４３２７３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ （ＡＴＣＣ １７５８８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｇｄａｌｉ（ＡＴＣＣ ３３６１４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｌｌａｎａｅ（ＡＴＣＣ ７００３３１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ（ＡＴＣＣ ３３６１５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ （ＡＴＣＣ １０８５７）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ（ＡＴＣＣ ３５１０４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｉａｅ（ＡＴＣＣ ３３０５０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ （ＡＴＣＣ １９３１０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ（ＡＴＣＣ １３２２３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ ３５９６１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ ７００６８８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ；および、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ。１つの実施形態では、宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。

【0146】

宿主細胞も「グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ１７」から選択可能である。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」は、例えば、以下のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒｅｎｎｅｒｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｅｌｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｓｓａｒｄｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｎｄｅｌｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｉｇｕｌａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｈｏｄｅｓｉａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ；および、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉに属するものを含む「ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ」として当該技術分野で知られているプロテオバクテリアの群として定義される。

【0147】

実施形態では、本発明の方法で使用される細菌の宿主細胞は、プロテアーゼの発現を欠いている。実施形態では、プロテアーゼの発現を欠いた細菌の宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄである。実施形態では、プロテアーゼの発現を欠いた細菌の宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ である。実施形態では、プロテアーゼの発現を欠いた細菌の宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。

【0148】

実施形態では、本発明の方法で使用される細菌の宿主細胞は、プロテアーゼの発現を欠いていない。実施形態では、プロテアーゼの発現を欠いていない細菌の宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄである。実施形態では、プロテアーゼの発現を欠いていない細菌の宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ である。実施形態では、プロテアーゼの発現を欠いていない細菌の宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。

【0149】

実施形態では、本発明の方法で使用されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 宿主細胞は、Ｌｏｎプロテアーゼ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ｌａ１プロテアーゼ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、ＡｐｒＡプロテアーゼ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、またはこれらの組み合わせの発現を欠いている。実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 宿主細胞は、ＡｐｒＡ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ＨｔｐＸ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、またはこれらの組み合わせの発現を欠いている。実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 宿主細胞は、Ｌｏｎ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ｌａ１（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、ＡｐｒＡ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ＨｔｐＸ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、またはこれらの組み合わせの発現を欠いている。実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 宿主細胞は、Ｎｐｒ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＤｅｇＰ１（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、ＤｅｇＰ２（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、またはこれらの組み合わせの発現を欠いている。実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 宿主細胞はＬａ１（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、Ｐｒｃ１（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、Ｐｒｃ２（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、ＰｒｔＢ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、またはこれらの組み合わせの発現を欠いている。これらのプロテアーゼは当該技術分野で知られており、例えば米国特許第８，６０３，８２４号「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０号、および、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１６２号に記載されており、当該文献は、上で列挙されたプロテアーゼのオープンリーディングフレーム配列を開示している。

【0150】

塩基株ＭＢ１０１（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−７８４１）に由来するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株の例は、本発明の方法に役立つ。実施形態では、ｈＰＴＨ融合タンパク質を発現させるために用いられるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、例えば、ＤＣ４５４、ＤＣ５５２、ＤＣ５７２、ＤＣ１０８４、ＤＣ１１０６、ＤＣ５０８、ＤＣ９９２．１、ＰＦ１２０１．９、ＰＦ１２１９．９、ＰＦ１３２６．１、ＰＦ１３３１、ＰＦ１３４５．６、またはＤＣ１０４０．１−１である。実施形態では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株はＰＦ１３２６．１である。実施形態では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株はＰＦ１３４５．６である。これらと、本発明の方法に役立つ他の株は、本明細書で提供される情報、当該技術分野で知られているおよび文献に記載されている組換えＤＮＡ方法、および入手可能な材料、例えば、記載されるようにＡＴＣＣに寄託されたＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株ＭＢ１０１を用いて、当業者によって容易に構築可能である。

【0151】

（発現株）
本発明の方法を実行するのに役立つ発現株は、本明細書と公開された文献に記載される方法を用いて構築可能である。実施形態では、本発明の方法に役立つ発現株は、１つ以上のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓシャペロンまたはフォールディングモジュレータータンパク質を過剰発現するプラスミドを含む。例えば、ＤｎａＪ様タンパク質、ＦｒｎＥ、ＦｋｌＢ、またはＥｃｐＤは発現株中で過剰発現可能である。実施形態では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓフォールディングモジュレーター過剰発現（ＦＭＯ）プラスミドはＣｌｐＸ、ＦｋｌＢ３、ＦｒｎＥ、ＣｌｐＡ、Ｆｋｂｐ、またはｐｐｉＡをコードする。Ｆｋｂｐをコードする発現プラスミドの一例はｐＤＯＷ１３８４−１である。実施形態では、フォールディングモジュレーターをコードしない発現プラスミドは、発現株へ導入される。これらの実施形態では、プラスミドは、例えばｐＤＯＷ２２４７である。実施形態では、本発明の方法においてｈＰＴＨ融合タンパク質を発現するのに役立つＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ発現株は、本明細書に別記されるように、ＳＴＲ３５９７０、ＳＴＲ３５９８４、ＳＴＲ３６０３４、ＳＴＲ３６０８５、ＳＴＲ３６１５０、ＳＴＲ３６１６９、ＳＴＲ３５９４９、ＳＴＲ３６０９８、またはＳＴＲ３５７８３である。

【0152】

実施形態では、本発明の方法で使用されるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株は、ＤＣ１１０６（ｍｔｌＤＹＺノックアウト突然変異体ΔｐｙｒＦΔｐｒｏＣΔｂｅｎＡＢ ｌｓｃ：：ｌａｃＩＱ１）、つまり、遺伝子ｐｙｒＦ、ｐｒｏＣ、ｂｅｎＡ、ｂｅｎＢ、およびマンニトール（ｍｔｌ）オペロンからのｍｔｌＤＹＺが除去され、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ転写リプレッサーが挿入されるとともにレバンスクラーゼ遺伝子（ｌｓｃ）と融合している寄託株ＭＢ１０１の誘導体である。こうした遺伝子の配列とそれを使用するための方法は、当該技術分野で知られており、文献、例えば、米国特許第８，２８８，１２７号、第８，０１７，３５５号「Ｍａｎｎｉｔｏｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ」、および第７，７９４，９７２号「Ｂｅｎｚｏａｔｅ−ａｎｄ ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」に記載されており、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0153】

ＤＣ１１０６と等価の宿主細胞または本明細書に記載される宿主細胞または発現株のいずれかは、本明細書や公開されている文献に記載される方法を用いてＭＢ１０１から構築可能である。実施形態では、ＤＣ１１０６と等価な宿主細胞が使用される。宿主細胞ＤＣ４５４は、それがＤＣ２０６と呼ばれているＳｃｈｎｅｉｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２００５、および、米国特許第８，５６９，０１５号「ｒＰＡ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ」で記載されており、当該文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。ＤＣ２０６はＤＣ４５４と同じ株である。それは、動物性食品を含まない媒体を３回通過した後にＤＣ４５４と再命名された。

【0154】

当業者は、実施形態において、ゲノムの欠失または突然変異（例えば、不活性化または衰弱性の突然変異）は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ内で複製しない欠失する遺伝子に隣接する領域を運ぶ欠失プラスミドを用いて、例えば、対立遺伝子交換によってなされ得る。欠失プラスミドは、欠失する遺伝子の上流と下流の領域を含んで、欠失する遺伝子を増幅するＰＣＲによって構築可能である。欠失は、アガロース・スラブ・ゲル中の電気泳動による分離後に観察される、分析的なプライマーを使用してゲノムＤＮＡから増幅されるＰＣＲ生成物を配列決定することと、その後の断片のＤＮＡ配列決定により証明可能である。実施形態では、遺伝子は、完全な欠失、部分的な欠失、または突然変異、例えば、フレームシフト、点、あるいは挿入突然変異によって不活性化される。

【0155】

実施形態では、使用される株は、当該技術分野で知られている方法にしたがってＦＭＯプラスミドで形質転換されている。例えば、ＤＣ１１０６宿主細胞は、発現株ＳＴＲ３６０３４を生成するために、ペプチジル−プロリル シス−トランスイソメラーゼファミリーに属するフォールディングモジュレーターである、ＦｋｂＰ（ＲＸＦ０６５９１．１）を過剰発現するＦＭＯプラスミドｐＤＯＷ１３８４で形質転換可能である。本発明の方法にしたがってｈＰＴＨを発現するのに役立つｈＰＴＨ融合タンパク質発現株と対応する宿主細胞の特定の例の遺伝子型が表４で説明されている。実施形態では、表４に記載される任意の宿主細胞と等価な宿主細胞は、本明細書の方法を用いてｈＰＴＨ１−３４を発現するための本明細書に記載される株と等価な発現株を得るために、本明細書に記載されるような等価なＦＭＯプラスミドで形質転換される。議論されるように、適切な発現株は、本明細書や文献に記載される方法にしたがって同様に導き出すことが可能である。

【0156】

【表4-1】

【0157】

【表4-2】

【0158】

実施形態において、表４に列挙される宿主細胞または宿主株、あるいは表４に列挙される宿主細胞または宿主株の同等物は、本発明の方法を使用して本明細書に記載されるような対象のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するために使用される。実施形態において、実施形態において、表４に列挙される宿主細胞または宿主株、あるいは表４に列挙される宿主細胞または宿主株の同等物は、本発明の方法を使用して、本明細書に記載されるような、ｈＰＴＨ、ＧＣＳＦ、またはインスリンポリペプチド（例えばプロインスリン）を含む融合タンパク質を発現するために使用される。実施形態において、野生型宿主細胞、例えばＤＣ４５４、またはその同等物は、本発明の方法を使用して本明細書に記載されるような対象のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するために使用される。

【0159】

これらおよび他のプロテアーゼの配列、および本発明の宿主株を生成するのに有用なフォールディングモジュレーターは、当該技術分野で既知であり、そして例えば、上述され且つ全体において参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６０３，８２４号の表Ａ〜Ｆにて提供されるように、文献中に公開されている。例えば、Ｍ５０ Ｓ２Ｐプロテアーゼファミリー膜メタロプロテアーゼの読取枠配列は、ＲＸＦ０４６９２としてその中で提供される。

【0160】

＜高スループットスクリーン＞
幾つかの実施形態において、可溶性の組み換え型融合タンパク質を発現するための最適条件を判定するために、高スループットスクリーンが行われ得る。スクリーンにおいて変動し得る条件は、例えば、宿主細胞、宿主細胞の遺伝的背景（例えば、異なるプロテアーゼの欠失）、発現構成物におけるプロモーターのタイプ、組み換え型タンパク質をコードする配列に融合する分泌リーダーのタイプ、増殖温度、誘導プロモーターが使用される場合の誘導におけるＯＤ、ｌａｃＺプロモーターが使用される場合の誘導に使用されるＩＰＴＧの濃度、タンパク質誘導の期間、培養物への誘導剤の添加後の増殖温度、培養物の撹拌の速さ、プラスミド維持のための選択法、容器における培養物の容量、および細胞を溶解する方法を含む。

【0161】

幾つかの実施形態において、宿主株のライブラリ（または「アレイ」）が提供され、ライブラリにおける各株（または「宿主細胞の母集団」）は、宿主細胞における１以上の標的遺伝子の発現を調節するように遺伝子を組み換えられる。「最適な宿主株」または「最適な発現系」は、アレイにおける表現型的に別個の宿主細胞の他の母集団と比較して、発現された組み換え型融合タンパク質の量、性質、および／または位置に基づいて、識別または選択され得る。故に、最適な宿主株は、所望の仕様に従って組み換え型融合タンパク質を生成する株である。所望の仕様は、生成されているタンパク質によって変動する一方で、この仕様は、例えば、タンパク質が隔絶されるかまたは分泌されるか、およびどんな量でも、タンパク質が適切にまたは望ましいように処理および／またはフォールドされるかどうかなどのように、タンパク質の性質および／または量を含む。実施形態において、改善したまたは望ましい性質は、高力価の発現を伴い且つ分解が低レベルである、組み換え型融合タンパク質の生成であり得る。実施形態において、最適な宿主株または最適な発現系は、指示株、即ち比較に使用される株により生成されるものに関連する特定の絶対レベルあるいは特定のレベルの、可溶性の組み換え型融合タンパク質の量または性質、復元可能な組み換え型融合タンパク質の量または性質、適切に処理された組み換え型融合タンパク質の量または性質、適切にフォールドされた組み換え型融合タンパク質の量または性質、活性な組み換え型融合タンパク質の量または性質、および／または組み換え型融合タンパク質の総量または品質を特徴とする、収量（ｙｉｅｌｄ）を生成する。

【0162】

組み換え型融合タンパク質の発現において改善された収量および／または品質により株を識別するために微生物宿主をスクリーニングする方法は、例えば米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０号に記載されている。

【0163】

＜発酵様式＞
本発明の発現株は、任意の発酵様式（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒｍａｔ）で培養され得る。例えば、バッチ式、流加式、半連続式、または連続式の発酵モードが本明細書で利用され得る。

【0164】

実施形態において、発酵培地は、富栄養培地、最少培地、および無機塩培地の中から選択され得る。他の実施形態において、最少培地または無機塩培地の何れかが選択される。特定の実施形態において、無機塩培地が選択される。

【0165】

無機塩培地は、無機塩と炭素源、例えば、グルコース、スクロース、またはグリセロールから成る。無機塩培地の例は、例えば、Ｍ９培地、シュードモナス培地（ＡＴＣＣ １７９）、およびＤａｖｉｓ ａｎｄ Ｍｉｎｇｉｏｌｉ培地（Ｄａｖｉｓ， Ｂ． Ｄ．， ａｎｄ Ｍｉｎｇｉｏｌｉ， Ｅ． Ｓ．， １９５０， Ｊ． Ｂａｃｔ． ６０：１７−２８を参照）を含む。無機塩培地を作るために使用される無機塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムまたは塩化マグネシウム、および、塩化カルシウム、ホウ酸塩、および鉄、銅、マンガン、ならびに亜鉛の硫酸塩などの微量金属の中から選択されるものを含む。典型的には、ペプトン、トリプトン、アミノ酸、または酵母抽出物などの有機窒素源は、無機塩培地に含まれていない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えばアンモニウム塩、アンモニア水、およびアンモニアガスの中から選択され得る。無機塩培地は、典型的には炭素源としてグルコースまたはグリセロールを含む。無機塩培地と比較して、最少培地も無機塩と炭素源を含み得るが、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン、または他の成分で補われ得るものの、これらは、ごく最低限のレベルで加えられる。本発明の方法における使用に適切な培地は、文献、例えば上述の参照により言及且つ組み込まれる米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号に記載される方法を用いて、調製され得る。本発明の方法に有用な培養手順および無機塩培地の詳細は、本明細書において参照により組み込まれる、Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ， Ｄ ｅｔ ａｌ．， １９９１， “Ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｔ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ，” Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０ （１）：１７−２７により説明されている。

【0166】

実施形態において、生成はバイオリアクター培養物において達成され得る。培養物は、例えば、無機塩培地を含有する２リットルまでのバイオリアクターにおいて増殖し、アンモニアの添加により３２℃およびｐＨ６．５に維持され得る。溶解酸素は、撹拌における増加、および発酵槽への散布された空気および酸素の流れにより、過度に維持され得る。グリセロールは、過剰なレベルを維持するために発酵の全体にわたり培養物に送達され得る。実施形態において、このような条件は、誘導のための標的培養細胞密度、例えば５７５ｎｍ（Ａ_５７５）の光学密度に到達し、ＩＰＴＧが標的タンパク質生成を開始するために添加されるまで、維持される。誘導時の細胞密度、ＩＰＴＧの濃度、ｐＨ、温度、ＣａＣｌ_２濃度、溶解酸素の流速はそれぞれ、発現に最適な条件を判定するために変更され得ることを理解されたい。実施形態において、誘導時の細胞密度は、４０から２００までの吸光度単位（ＡＵ）ののＡ_５７５で変動し得る。ＩＰＴＧ濃度は、０．０２から１．０ｍＭの範囲、６から７．５のｐＨ、２０から３５℃の温度、０から０．５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２濃度、および１ＬＰＭ（毎分リットル）から１０ＬＰＭの溶解酸素の流速で、変動し得る。６−４８時間後、各バイオリアクターからの培養物は、遠心分離により集められ、細胞ペレットは−８０℃で凍結される。その後、サンプルは、例えば、生成物形成についてＳＤＳ−ＣＧＥにより分析され得る。

【0167】

発酵は任意の規模で行なわれ得る。本発明による発現系は、任意の規模での組み換え型タンパク質発現に有用である。故に、例えば、マイクロリットルの規模、ミリリットルの規模、センチリットルの規模、およびデシリットルの規模の発酵容量が使用されてもよく、そして、１リットルの規模およびより大きな発酵容量が使用され得る。

【0168】

実施形態において、発酵容量は、約１リットルまたはそれ以上である。幾つかの実施形態において、発酵容量は約１リットル〜約１００リットルである。実施形態において、発酵容量は、約１リットル、約２リットル、約３リットル、約４リットル、約５リットル、約６リットル、約７リットル、約８リットル、約９リットル、または約１０リットルである。実施形態において、発酵容量は、約１リットル〜約５リットル、約１リットル〜約１０リットル、約１リットル〜約２５リットル、約１リットル〜約５０リットル、約１リットル〜約７５リットル、約１０リットル〜約２５リットル、約２５リットル〜約５０リットル、または約５０リットル〜約１００リットルである。他の実施形態において、発酵容量は、５リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、５００リットル、１，０００リットル、２，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットル、または５０，０００リットル、あるいはそれ以上である。

【0169】

一般に、より大きな培養物の容量、例えば５０ｍＬの振盪フラスコ培養物、１リットル以上の培養物により得られる組み換え型タンパク質の量は、より小さな培養物の容量、例えば０．５ｍＬの高スループットスクリーニング培養物において観察されるものに比べて増大される。このことは、培養物の大きさの増加だけでなく、例えば、（例えば培養物の吸光度により反映されるような）大規模での発酵において細胞をより高密度に増殖させる能力によるものであり得る。例えば、同じ株から得られる容量測定の収量は、ＨＴＰの規模から大規模の発酵まで、１０倍にまで増大され得る。実施形態において、同じ発現株について観察された容量測定の収量は、大規模の発酵後、ＨＴＰの規模の増殖よりも２倍から１０倍多い。実施形態において、同じ発現株について観察される収量は、大規模の発酵後、ＨＴＰの規模の増殖よりも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、２倍から１０倍、２倍から９倍、２倍から８倍、２倍から７倍、２倍から６倍、２倍から５倍、２倍から４倍、２倍から３倍、３倍から１０倍、３倍から９倍、３倍から８倍、３倍から７倍、３倍から６倍、３倍から５倍、３倍から４倍、４倍から１０倍、４倍から９倍、４倍から８倍、４倍から７倍、４倍から６倍、４倍から５倍、５倍から１０倍、５倍から９倍、５倍から８倍、５倍から７倍、５倍から６倍、６倍から１０倍、６倍から９倍、６倍から８倍、６倍から７倍、７倍から１０倍、７倍から９倍、７倍から８倍、８倍から１０倍、８倍から９倍、９倍から１０倍多い。例えば、全体において参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｔａｌｌａｃｋ， ｅｔ ａｌ．， ２０１２， “Ｒｅｌｉａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ． ８１：１５７−１６５を参照。

【0170】

＜細菌増殖条件＞
提供される本発明の方法に有用な増殖条件は、約４℃から約４２℃の温度、および約５．７から約８．８のｐＨを含み得る。ｌａｃＺプロモーターを含む発現構築物が使用される場合、発現は、の約０．０１ｍＭから約１．０ｍＭの終末濃度で培養物にＩＰＴＧを添加することにより誘導され得る。

【0171】

培養物のｐＨは、当業者に既知のｐＨ緩衝液および方法を使用して維持され得る。培養中のｐＨの制御も、アンモニア水を使用するので達成され得る。実施形態において、培養物のｐＨは約５．７から約８．８である。実施形態において、ｐＨは、約５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、または８．８である。実施形態において、ｐＨは、約５．７〜約８．８、約５．７〜約８．５、約５．７〜約８．３、約５．７〜約８、約５．７〜約７．８、約５．７〜約７．６、約５．７〜約７．４、約５．７〜約７．２、約５．７〜約７、約５．７〜約６．８、約５．７〜約６．６、約５．７〜約６．４、約５．７〜約６．２、約５．７〜約６、約５．９〜約８．８、約５．９〜約８．５、約５．９〜約８．３、約５．９〜約８、約５．９〜約７．８、約５．９〜約７．６、約５．９〜約７．４、約５．９〜約７．２、約５．９〜約７、約５．９〜約６．８、約５．９〜約６．６、約５．９〜約６．４、約５．９〜約６．２、約６〜約８．８、約６〜約８．５、約６〜約８．３、約６〜約８、約６〜約７．８、約６〜約７．６、約６〜約７．４、約６〜約７．２、約６〜約７、約６〜約６．８、約６〜約６．６、約６〜約６．４、約６〜約６．２、約６．１〜約８．８、約６．１〜約８．５、約６．１〜約８．３、約６．１〜約８、約６．１〜約７．８、約６．１〜約７．６、約６．１〜約７．４、約６．１〜約７．２、約６．１〜約７、約６．１〜約６．８、約６．１〜約６．６、約６．１〜約６．４、約６．２〜約８．８、約６．２〜約８．５、約６．２〜約８．３、約６．２〜約８、約６．２〜約７．８、約６．２〜約７．６、約６．２〜約７．４、約６．２〜約７．２、約６．２〜約７、約６．２〜約６．８、約６．２〜約６．６、約６．２〜約６．４、約６．４〜約８．８、約６．４〜約８．５、約６．４〜約８．３、約６．４〜約８、約６．４〜約７．８、約６．４〜約７．６、約６．４〜約７．４、約６．４〜約７．２、約６．４〜約７、約６．４〜約６．８、約６．４〜約６．６、約６．６〜約８．８、約６．６〜約８．５、約６．６〜約８．３、約６．６〜約８、約６．６〜約７．８、約６．６〜約７．６、約６．６〜約７．４、約６．６〜約７．２、約６．６〜約７、約６．６〜約６．８、約６．８〜約８．８、約６．８〜約８．５、約６．８〜約８．３、約６．８〜約８、約６．８〜約７．８、約６．８〜約７．６、約６．８〜約７．４、約６．８〜約７．２、約６．８〜約７、約７〜約８．８、約７〜約８．５、約７〜約８．３、約７〜約８、約７〜約７．８、約７〜約７．６、約７〜約７．４、約７〜約７．２、約７．２〜約８．８、約７．２〜約８．５、約７．２〜約８．３、約７．２〜約８、約７．２〜約７．８、約７．２〜約７．６、約７．２〜約７．４、約７．４〜約８．８、約７．４〜約８．５、約７．４〜約８．３、約７．４〜約８、約７．４〜約７．８、約７．４〜約７．６、約７．６〜約８．８、約７．６〜約８．５、約７．６〜約８．３、約７．６〜約８、約７．６〜約７．８、約７．８〜約８．８、約７．８〜約８．５、約７．８〜約８．３、約７．８〜約８、約８〜約８．８、約８〜約８．５、または約８〜約８．３である。実施形態において、ｐＨは約６．５〜約７．２である。

【0172】

幾つかの実施形態において、増殖温度は約４℃〜約４２℃に維持される。実施形態において、増殖温度は、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、または約４２℃である。実施形態において、増殖温度は約２５℃〜約３２℃である。実施形態において、増殖温度は、約２２℃〜約２７℃、約２２℃〜約２８℃、約２２℃〜約２９℃、約２２℃〜約３０℃、約２３℃〜約２７℃、約２３℃〜約２８℃、約２３℃〜約２９℃、約２３℃〜約３０℃、約２４℃〜約２７℃、約２４℃〜約２８℃、約２４℃〜約２９℃、約２４℃〜約３０℃、約２５℃〜約２７℃、約２５℃〜約２８℃、約２５℃〜約２９℃、約２５℃〜約３０℃、約２５℃〜約３１℃、約２５℃〜約３２℃、約２５℃〜約３３℃、約２６℃〜約２８℃、約２６℃〜約２９℃、約２６％〜約３０％、約２６％〜約３１％、約２６％〜約３２％、約２６％〜約３３％、約２７％〜約２９％、約２７％〜約３０％、約２７℃〜約３１℃、約２７℃〜約３２℃、約２７℃〜約３３℃、約２８℃〜約３０℃、約２８℃〜約３１℃、約２８℃〜約３２℃、約２９℃〜約３１℃、約２９℃〜約３２℃、約２９℃〜約３３℃、約３０℃〜約３２℃、約３０℃〜約３３℃、約３１℃〜約３３℃、約３１℃〜約３２℃、約２１℃〜約４２℃、約２２℃〜約４２℃、約２３℃〜約４２℃、約２４℃〜約４２℃、約２５℃〜約４２℃である。実施形態において、増殖温度は約２５℃〜約２８．５℃である。実施形態において、増殖温度は、約２０℃より上、約２１℃より上、約２２℃より上、約２３℃より上、約２４℃より上、約２５℃より上、約２６℃より上、約２７℃より上、約２８℃より上、約２９℃より上、または約３０℃より上である。

【0173】

実施形態において、温度は培養中に変更される。実施形態において、温度は、薬剤（例えばＩＰＴＧ）が構築物から発現を誘導するために培養物に添加される前に約３０℃〜約３２℃に維持され、誘導薬剤を添加した後、温度は約２５℃〜約２８℃に下げられる。実施形態において、温度は、薬剤（例えばＩＰＴＧ）が構築物から発現を誘導するために培養物に添加される前に約３０℃に維持され、誘導薬剤を添加した後、温度は約２５℃に下げられる。

【0174】

本明細書の他の場所にも記載されるように、誘導プロモーターは、組み換え型融合タンパク質、例えばｌａｃプロモーターの発現を制御するために、発現構築物において使用され得る。ｌａｃプロモーター誘導体またはファミリーのメンバー（例えばｔａｃプロモータ）の場合、エフェクター化合物は、ＩＰＴＧのような無償性誘導物質などの誘導因子である。実施形態において、ｌａｃプロモーター誘導体が使用され、細胞密度が約４０〜約１８０のＯＤ_５７５により識別されたレベルに到達した場合、組み換え型タンパク質発現は、約０．０１ｍＭ〜約１．０ｍＭの終末濃度へのＩＰＴＧの添加により誘導される。実施形態において、組み換え型タンパク質のための培養物誘導の時間におけるＯＤ_５７５は、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０であり得る。他の実施形態において、ＯＤ_５７５は、約４０〜約５０、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、または約９０〜約１００である。他の実施形態において、ＯＤ_５７５は、約４０〜約１００、約１００〜約１２０、約１２０〜約１３０、約１３０〜約１４０、約１４０〜約１５０、約１５０〜約１６０、約１６０〜約１７０、または約１７０〜約１８０である。他の実施形態において、ＯＤ_５７５は、約４０〜約１４０、または約８０〜１８０である。細胞密度は、他の方法により測定され、且つ他の単位（例えば容量当たりの細胞）で発現され得る。例えば、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ培養物の約４０〜約１６０のＯＤ_５７５は、１ｍＬ当たり約４×１０^１０〜約１．６×１０^１１のコロニー形成単位、または１７．５〜７０ｇ／ｌの乾燥菌体重量に等しい。実施形態において、培養物誘導の時間における細胞密度は、細胞密度の判定に使用される方法または測定の単位にかかわらず、ＯＤ_５７５での吸光度により本明細書で特定されるような細胞密度に等しい。当業者は、任意の細胞培養のために適切な変換を行う方法を知っている。

【0175】

実施形態において、培養物の最終ＩＰＴＧ濃度は、約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０３ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．０９ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、または約１ｍＭである。実施形態において、培養物の最終ＩＰＴＧ濃度は、約０．０８ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約０．２ｍＭ、約０．２ｍＭ〜約０．３ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約０．４ｍＭ、約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ、約０．０８〜約０．２ｍＭ、または約０．１〜１ｍＭである。

【0176】

非ｌａｃ型プロモーターが使用される実施形態において、本明細書および文献に記載されるように、他の誘導因子またはエフェクターが使用され得る。１つの実施形態において、プロモーターは構成型プロモーターである。

【0177】

誘導剤を添加した後、培養物は、例えば約２４時間の期間にわたり増殖され得、その間に、組み換え型タンパク質が発現される。誘導剤を添加した後、培養物は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３６時間、または約４８時間にわたり増殖され得る。誘導剤が培養物に添加された後、培養物は、約１〜４８時間、約１〜２４時間、約１〜８時間、約１０〜２４時間、約１５〜２４時間、または約２０〜２４時間にわたり増殖され得る。細胞培養物は遠心分離により濃縮され、培養物ペレットは、後の溶解手順に適切な緩衝液または溶液において再懸濁され得る。

【0178】

実施形態において、高圧機械細胞分裂用の装置（商業上利用可能なものであり、例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ、Ｎｉｒｏ−Ｓｏａｖｉ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、またはＡＰＶ−Ｇａｕｌｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を用いて、細胞が分裂される。組み換え型タンパク質を発現する細胞は、例えば超音波処理を用いて分裂され得る。細胞の溶解に適切な、当該技術分野で既知の任意の方法が、可溶性画分を放出するために使用され得る。例えば、実施形態において、細胞壁溶菌酵素およびＥＤＴＡなどの、化学物質および／または酵素溶菌試薬が使用され得る。凍結されたまたは予め保存された培養物の使用も、本発明の方法で考慮される。培養物は溶解前にＯＤ標準化され得る。例えば、細胞は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０のＯＤ６００に標準化され得る。

【0179】

任意の適切な装置と方法を用いて遠心分離が行われ得る。不溶性画分から可溶性画分を分離するための細胞培養物または溶解物の遠心分離は、当該技術分野で周知である。例えば、溶解細胞は、（４℃で）２０分間、２０，８００×ｇで遠心分離され、手動または自動の液体処理を使用して上清が除去され得る。細胞培養物の遠心分離により得られた細胞ペレット、または細胞溶解物の遠心分離により得られた不溶性画分は、緩衝液において再懸濁され得る。細胞ペレットまたは不溶性画分の再懸濁は、例えばオーバーヘッドミキサー、磁気撹拌バー、ロッキングシェーカーなどに接続されるインペラーなどの装置を用いて行われ得る。

【0180】

＜未変性条件＞
誘導された宿主細胞の溶解は、未変性条件下で行なわれる。実施形態において、未変性条件は、例えば、細胞ペレットまたはペーストを再懸濁するために、未変性処置の緩衝液の使用を含む。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、リン酸ナトリウム、またはトリス緩衝液、グリセロール、および塩化ナトリウムを含む。親和性クロマトグラフィーが固定された金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により行なわれる実施形態において、未変性処置の緩衝液はイミダゾールを含む。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、０〜５０ｍＭのイミダゾールを含む。実施形態において、未変性処置の緩衝液はイミダゾールを含まない。実施形態において、未変性処置の緩衝液は２５ｍＭのイミダゾールを含む。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、１０−３０ｍＭのリン酸ナトリウム、またはｐＨ７〜９のトリスを含む。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、７．３、７．４、または７．５のｐＨを有する。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、２−１０％のグリセロールを含む。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、５０ｍＭ〜７５０ｍＭのＮａＣｌを含む。実施形態において、細胞ペーストは１０−５０％の固形物において再懸濁される。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、ｐＨ７．４で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５％のグリセロール、５００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾールを含み、２０％の固形物において再懸濁される。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、ｐＨ７．５で、２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌを含み、２０％の固形物において再懸濁される。

【0181】

実施形態において、未変性処置の緩衝液はカオトロピック剤を含まない。カオトロピック剤は、タンパク質または核酸の３次元構造を分裂し、変性を引き起こす。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、カオトロピック剤の未変性濃度を含む。実施形態において、カオトロピック剤は、例えば尿素またはグアニジン塩酸塩である。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、０〜４Ｍの尿素またはグアニジン塩酸塩である。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、４Ｍ未満、３．５Ｍ未満、３Ｍ未満、２．５Ｍ未満、２Ｍ未満、１．５Ｍ未満、１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、約１．０Ｍ、約０．２Ｍ、約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１．０Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、または約２．０Ｍ、約２．１Ｍ、約２．２Ｍ、約２．３Ｍ、約２．４Ｍ、約２．５Ｍ、約２．６Ｍ、約２．７Ｍ、約２．８Ｍ、約２．９Ｍ、約３Ｍ、約３．１Ｍ、約３．２Ｍ、約３．３Ｍ、約３．４Ｍ、約３．５Ｍ、約３．６Ｍ、約３．７Ｍ、約３．８Ｍ、約３．９Ｍ、約４Ｍ、約０．５〜約３．５Ｍ、約０．５〜約３Ｍ、約０．５〜約２．５Ｍ、約０．５〜約２Ｍ、約０．５〜約１．５Ｍ、約０．５〜約１Ｍ、約１〜約４Ｍ、約１〜約３．５Ｍ、約１〜約３Ｍ、約１〜約２．５Ｍ、約１〜約２Ｍ、約１〜約１．５Ｍ、約１．５〜約４Ｍ、約１．５〜約３．５Ｍ、約１．５〜約３Ｍ、約１．５〜約２．５Ｍ、約１．５〜約２Ｍ、約２〜約４Ｍ、約２〜約３．５Ｍ、約２〜約３Ｍ、約２〜約２．５Ｍ、約２．５〜約４Ｍ、約２．５〜約３．５Ｍ、約２．５〜３Ｍ、約３〜約４Ｍ、約３〜約３．５Ｍ、または０．５〜約１Ｍの濃度で、尿素またはグアニジン塩酸塩を含む。

【0182】

未変性処置の緩衝液が使用される実施形態において、細胞ペーストは、２−８℃で約１−２．５時間にわたり、２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、４Ｍの尿素、ｐＨ７．５の２０％の固形物にてスラリー状にされる。実施形態において、細胞ペーストは、例えば１５，０００ｐｓｉでＮｉｒｏホモジナイザーにより溶解にさらされ、１４，０００ｘｇで３５分間バッチ式遠心分離または１５，０００ｘｇで連続遠心分離を行い、３４０ｍＬ／ｍｉｎを供給し、ｓｕｐｅ／遠心分離液をデプスフィルターおよびメンブレンフィルターで濾過し、再懸濁緩衝液において２倍に希釈し（例えば１Ｘ ＰＢＳ ｐＨ７．４）、捕捉カラムに充填される。実施形態において、未変性処置の緩衝液は、本明細書の他の場所に記載されるような付加的な構成要素、例えばＩＭＡＣのためのイミダゾールを含む。

【0183】

カオトロピック剤の変性濃度はｐＨにより影響を受け、変性レベルはタンパク質の特徴に依存することが、当業者に理解されている。例えば、より低濃度のカオトロピック剤にもかかわらずタンパク質変性を引き起こすようにｐＨが増大され得る。

【0184】

＜生成物の評価＞
対象の生成された組み換え型融合タンパク質またはポリペプチドの性質は、当該技術分野で既知の、または文献に記載される任意の方法により評価され得る。実施形態において、タンパク質の変性は、その可溶性に基づき、または、生物活性の欠如あるいは損失により、評価される。多くのタンパク質について、生物活性アッセイは市販で入手可能である。生物活性アッセイは、例えば抗体結合アッセイを含み得る。実施形態において、対象の組み換え型融合タンパク質またはポリペプチドの物理的特性は、当該技術分野で利用可能な方法、例えばクロマトグラフィーおよび分光光度法を用いて行われる。対象のポリペプチドの評価は、ポリペプチドが適切に放出された、例えばそのＮ末端基が無傷であるという判定を含み得る。

【0185】

ｈＰＴＨ（例えばｈＰＴＨ １−３４または１−８４）の活性は、例えばタンパク質のＮ末端基を認識する抗体を用いて、当該技術分野で既知の、または本明細書に記載される、あるいは文献中の任意の方法を使用して評価され得る。方法は、例えばインタクト質量分析（ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む。ＰＴＨの生物活性は、例えば、ｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡ、均質な時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイする（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、または、Ｎｉｓｓｅｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８５， “Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｎａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｆａｃｔｏｒ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５：５３５８−５３６３、および米国特許第７，１５０，９７４号“Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ”に記載されるように測定され得、前記文献の各々は本明細書において参照により組み込まれる。ＰＴＨを評価する方法はまた、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｍｉｚｕ， ｅｔ ａｌ．， ２００１， “Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ （１−１４） ａｎｄ （１−１１） ａｎａｌｏｇｓ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｂｙ α−ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｆｕｌｌ ａｇｏｎｉｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｖｉａ ｔｈｅ Ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＴＨ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６： ４９００３−４９０１２に記載される。

【0186】

＜対象の組み換え型融合タンパク質とポリペプチドの精製＞
対象の可溶化された組み換え型融合タンパク質またはポリペプチドは、当該技術分野で既知の、または文献中に記載される任意の方法、例えば、サイズ排除、陰イオンまたは陽イオン交換、疎水的相互作用、または親和性クロマトグラフィーなどの、遠心分離方法および／またはクロマトグラフィー方法により、他のタンパク質および細胞破片から分離または精製され得る。実施形態において、可溶化されたタンパク質は、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を使用して精製され得る。ＦＰＬＣは、様々な樹脂に対する親和性に基づいてタンパク質を分離するために使用される液体クロマトグラフィーの形態である。実施形態において、融合タンパク質により発現されたアフィニティータグは、可溶化緩衝液に溶解される融合タンパク質を樹脂に結合させ、その一方で不純物は可溶化緩衝液において行なわれる。後に、溶出緩衝液において、イオン交換樹脂から融合タンパク質を分離し且つ純粋な融合タンパク質を単離するために、溶出緩衝液が、徐々に増大する勾配で使用され、または段階的な方法で添加される。

【0187】

実施形態において、誘導の完了後、発酵培養液が、６０〜９０分間、例えば１５，９００ｘｇでの遠心分離により集められる。細胞ペーストおよび上清は分離され、ペーストは−８０℃で凍結される。凍結された細胞ペーストは、本明細書の他の場所に記載されるような緩衝液、例えば未変性緩衝液または尿素の無い緩衝液の中で溶かされる。実施形態において、凍結された細胞ペーストは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５％のグリセロール、５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４の中で溶かされ、且つ再懸濁される。実施形態において、緩衝液はイミダゾールを含む。実施形態において、懸濁液の最終容量は、所望のパーセントの固形物（例えば２０％の固形物）に調整される。細胞は化学的または機械的に溶解することができ、例えば、物質は後に、１５，０００ｐｓｉで微細流動装置により均質化され得る。溶解物は、３０分間、例えば１２，０００ｘｇで遠心分離され、例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ １５０（０．４５／０．２μｍ）のフィルターカプセルに通して濾過される。

【0188】

実施形態において、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）は、例えばＦｒａｃ−９５０フラクションコレクターを備えたＡｅＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００のクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる精製のために使用され得る。Ｈｉｓ−タグが使用される実施形態において、サンプルは、ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ、１０ｍＬカラム（連続して接続される２つの５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカートリッジ［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、部品番号１７−５２５５−０１］）の上に乗せられ、洗浄されて、例えば０ｍＭ〜２００ｍＭにイミダゾール濃度を変更することにより溶出緩衝液の１０のカラム容量直線濃度勾配を使用して溶出され、画分が集められる。

【0189】

実施形態において、クロマトグラフィーは、対象のポリペプチドに適切なものとして行われ得る。例えば、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー精製は、実施例において本明細書に記載されるように（例えば、Ｎｉｃｋｅｌ ＩＭＡＣを使用して）行われ得る。

【0190】

＜組み換え型融合タンパク質の切断＞
実施形態において、精製された組み換え型融合タンパク質の画分は、リンカーおよびＮ末端融合パートナーから対象のポリペプチドを切断するために、切断酵素でインキュベートされる。実施形態において、切断酵素は、プロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼ、例えばウシのエンテロキナーゼ、ブタのエンテロキナーゼ、トリプシン、または本明細書の他の場所に記載されるような他の適切なプロテアーゼである。当該技術分野で既知の、または文献中に記載される任意の適切なプロテアーゼ劈開方法が、使用され得る。プロテアーゼは、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）、およびＰｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から市販で入手可能である。例えば、実施形態において、ウシのエンテロキナーゼ（例えばＮｏｖａｇｅｎ ｃａｔ＃６９０６６−３、バッチＤ００１５５７４７）の切断融合タンパク質の精製画分は、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する緩衝液の中で濃縮且つ再懸濁され得る。２つの単位のウシのエンテロキナーゼは、１００μＬの反応物における１００μｇのタンパク質に添加される。融合タンパク質の精製画分とエンテロキナーゼの混合物は、は適切な長さの時間にわたりインキュベートされる。実施形態において、エンテロキナーゼの無い対象の反応物も、比較のためにインキュベートされる。酵素反応は、４−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ、Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃Ｐ８４６５）を含有する完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルの添加により止めることができる。

【0191】

実施形態において、切断酵素インキュベーションは、約１時間〜約２４時間にわたり行なわれる。実施形態において、インキュベーションは、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約２３時間、約１時間〜約２２時間、約１時間〜約２１時間、約１時間〜約２０時間、約１時間〜約１９時間、約１時間〜約１８時間、約１時間〜約１７時間、約１時間〜約１６時間、約１時間〜約１５時間、約１時間〜約１４時間、約１時間〜約１３時間、約１時間〜約１２時間、約１時間〜約１１時間、約１時間〜約１０時間、約１時間〜約９時間、約１時間〜約８時間、約１時間〜約７時間、約１時間〜約６時間、約１時間〜約５時間、約１時間〜約４時間、約１時間〜約３時間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約２４時間、約２時間〜約２３時間、約２時間〜約２２時間、約２時間〜約２１時間、約２時間〜約２０時間、約２時間〜約１９時間、約２時間〜約１８時間、約２時間〜約１７時間、約２時間〜約１６時間、約２時間〜約１５時間、約２時間〜約１４時間、約２時間〜約１３時間、約２時間〜約１２時間、約２時間〜約１１時間、約２時間〜約１０時間、約２時間〜約９時間、約２時間〜約８時間、約２時間〜約７時間、約２時間〜約６時間、約２時間〜約５時間、約２時間〜約４時間、約２時間〜約３時間、約３時間〜約２４時間、約３時間〜約２３時間、約３時間〜約２２時間、約３時間〜約２１時間、約３時間〜約２０時間、約３時間〜約１９時間、約３時間〜約１８時間、約３時間〜約１７時間、約３時間〜約１６時間、約３時間〜約１５時間、約３時間〜約１４時間、約３時間〜約１３時間、約３時間〜約１２時間、約３時間〜約１１時間、約３時間〜約１０時間、約３時間〜約９時間、約３時間〜約８時間、約３時間〜約７時間、約３時間〜約６時間、約３時間〜約５時間、約３時間〜約４時間、約４時間〜約２４時間、約４時間〜約２３時間、約４時間〜約２２時間、約４時間〜約２１時間、約４時間〜約２０時間、約４時間〜約１９時間、約４時間〜約１８時間、約４時間〜約１７時間、約４時間〜約１６時間、約４時間〜約１５時間、約４時間〜約１４時間、約４時間〜約１３時間、約４時間〜約１２時間、約４時間〜約１１時間、約４時間〜約１０時間、約４時間〜約９時間、約４時間〜約８時間、約４時間〜約７時間、約４時間〜約６時間、約４時間〜約５時間、約５時間〜約２４時間、約５時間〜約２３時間、約５時間〜約２２時間、約５時間〜約２０時間、約５時間〜約２１時間、約５時間〜約１９時間、約５時間〜約１８時間、約５時間〜約１７時間、約５時間〜約１６時間、約５時間〜約１５時間、約５時間〜約１４時間、約５時間〜約１３時間、約５時間〜約１２時間、約５時間〜約１１時間、約５時間〜約１０時間、約５時間〜約９時間、約５時間〜約８時間、約５時間〜約７時間、約５時間〜約６時間、約６時間〜約２４時間、約６時間〜約２３時間、約６時間〜約２２時間、約６時間〜約２１時間、約６時間〜約２０時間、約６時間〜約１９時間、約６時間〜約１８時間、約６時間〜約１７時間、約６時間〜約１６時間、約６時間〜約１５時間、約６時間〜約１４時間、約６時間〜約１３時間、約６時間〜約１２時間、約６時間〜約１１時間、約６時間〜約１０時間、約６時間〜約９時間、約６時間〜約８時間、約６時間〜約７時間、約７時間〜約２４時間、約７時間〜約２３時間、約７時間〜約２２時間、約７時間〜約２１時間、約７時間〜約２０時間、約７時間〜約１９時間、約７時間〜約１８時間、約７時間〜約１７時間、約７時間〜約１６時間、約７時間〜約１５時間、約７時間〜約１４時間、約７時間〜約１３時間、約７時間〜約１２時間、約７時間〜約１１時間、約７時間〜約１０時間、約７時間〜約９時間、約７時間〜約８時間、約８時間〜約２４時間、約８時間〜約２３時間、約８時間〜約２２時間、約８時間〜約２１時間、約８時間〜約２０時間、約８時間〜約１９時間、約８時間〜約１８時間、約８時間〜約１７時間、約８時間〜約１６時間、約８時間〜約１５時間、約８時間〜約１４時間、約８時間〜約１３時間、約８時間〜約１２時間、約８時間〜約１１時間、約８時間〜約１０時間、約８時間〜約９時間、約９時間〜約２４時間、約９時間〜約２３時間、約９時間〜約２２時間、約９時間〜約２１時間、約９時間〜約２０時間、約９時間〜約１９時間、約９時間〜約１８時間、約９時間〜約１７時間、約９時間〜約１６時間、約９時間〜約１５時間、約９時間〜約１４時間、約９時間〜約１３時間、約９時間〜約１２時間、約９時間〜約１１時間、約９時間〜約１０時間、約１０時間〜約２４時間、約１０時間〜約２３時間、約１０時間〜約２２時間、約１０時間〜約２１時間、約１０時間〜約２０時間、約１０時間〜約１９時間、約１０時間〜約１８時間、約１０時間〜約１７時間、約１０時間〜約１６時間、約１０時間〜約１５時間、約１０時間〜約１４時間、約１０時間〜約１３時間、約１０時間〜約１２時間、約１０時間〜約１１時間、約１１時間〜約２４時間、約１１時間〜約２３時間、約１１時間〜約２２時間、約１１時間〜約２１時間、約１１時間〜約２０時間、約１１時間〜約１９時間、約１１時間〜約１８時間、約１１時間〜約１７時間、約１１時間〜約１６時間、約１１時間〜約１５時間、約１１時間〜約１４時間、約１１時間〜約１３時間、約１１時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、約１２時間〜約２３時間、約１２時間〜約２２時間、約１２時間〜約２１時間、約１２時間〜約２０時間、約１２時間〜約１１２時間、約１２時間〜約１８時間、約１２時間〜約１７時間、約１２時間〜約１６時間、約１２時間〜約１５時間、約１２時間〜約１４時間、約１２時間〜約１３時間、約１３時間〜約２４時間、約１３時間〜約２３時間、約１３時間〜約２２時間、約１３時間〜約２１時間、約１３時間〜約２０時間、約１３時間〜約１９時間、約１３時間〜約１８時間、約１３時間〜約１７時間、約１３時間〜約１６時間、約１３時間〜約１５時間、約１３時間〜約１４時間、約１４時間〜約２４時間、約１４時間〜約２３時間、約１４時間〜約２２時間、約１４時間〜約２１時間、約１４時間〜約２０時間、約１４時間〜約１９時間、約１４時間〜約１８時間、約１４時間〜約１７時間、約１４時間〜約１６時間、約１４時間〜約１５時間、約１５時間〜約２４時間、約１５時間〜約２３時間、約１５時間〜約２２時間、約１５時間〜約２１時間、約１５時間〜約２０時間、約１５時間〜約１９時間、約１５時間〜約１８時間、約１５時間〜約１７時間、約１６時間〜約２４時間、約１６時間〜約２３時間、約１６時間〜約２２時間、約１６時間〜約２１時間、約１６時間〜約２０時間、約１６時間〜約１９時間、約１６時間〜約１８時間、または約１６時間〜約１７時間、約１７時間〜約２４時間、約１７時間〜約２３時間、約１７時間〜約２２時間、約１７時間〜約２１時間、約１７時間〜約２０時間、約１７時間〜約１９時間、約１７時間〜約１８時間、約１８時間〜約２４時間、約１８時間〜約２３時間、約１８時間〜約２２時間、約１８時間〜約２１時間、約１８時間〜約２０時間、約１８時間〜約１９時間、約１９時間〜約２４時間、約１９時間〜約２３時間、約１９時間〜約２２時間、約１９時間〜約２１時間、約１９時間〜約２０時間、約２０時間〜約２４時間、約２０時間〜約２３時間、約２０時間〜約２２時間、約２０時間〜約２１時間、約２１時間〜約２４時間、約２１時間〜約２３時間、約２１時間〜約２２時間、約２１時間〜約２４時間、または約２２時間〜約２３時間にわたり行われる。

【0192】

実施形態において、プロテアーゼでのインキュベーション後の組み換え型融合タンパク質の切断の範囲は、約９０％〜約１００％である。実施形態において、プロテアーゼでのインキュベーション後の組み換え型融合タンパク質の切断の範囲は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、約９１％〜約１００％、約９２％〜約１００％、約９３％〜約１００％、約９４％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約９６％〜約１００％、約９７％〜約１００％、約９８％〜約１００％、約９９％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９１％〜約９９％、約９２％〜約９９％、約９３％〜約９９％、約９４％〜約９９％、約９５％〜約９９％、約９６％〜約９９％、約９７％〜約９９％、約９８％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９１％〜約９８％、約９２％〜約９８％、約９３％〜約９８％、約９４％〜約９８％、約９５％〜約９８％、約９６％〜約９８％、約９７％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９１％〜約９７％、約９２％〜約９７％、約９３％〜約９７％、約９４％〜約９７％、約９５％〜約９７％、約９６％〜約９７％、約９０％〜約９６％、約９１％〜約９６％、約９２％〜約９６％、約９３％〜約９６％、約９４％〜約９６％、約９５％〜約９６％、約９０％〜約９５％、約９１％〜約９５％、約９２％〜約９５％、約９３％〜約９５％、約９４％〜約９５％、約９０％〜約９４％、約９１％〜約９４％、約９２％〜約９４％、約９３％〜約９４％、約９０％〜約９３％、約９１％〜約９３％、約９２％〜約９３％、約９０％〜約９２％、約９１％〜約９２％、または約９０％〜約９１％である。

【0193】

実施形態において、プロテアーゼ切断は、組み換え型融合タンパク質からの対象のポリペプチドの放出を結果としてもたらす。実施形態において、組み換え型融合タンパク質は適切に切断されることで、対象のポリペプチドを適切に放出する。実施形態において、組み換え型融合タンパク質の適切な切断は、無傷の（劣化していない）Ｎ末端基を持つ、対象の適切に放出されたポリペプチドを結果としてもたらす。実施形態において、組み換え型融合タンパク質の適切な切断は、第１の（Ｎ−末端）アミノ酸を含有する、対象の適切に放出されたポリペプチドを結果としてもたらす。実施形態において、プロテアーゼ切断後の適切に放出されたポリペプチドの量は、約９０％〜約１００％である。実施形態において、プロテアーゼ切断後の適切に放出されたポリペプチドの量は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、約９１％〜約１００％、約９２％〜約１００％、約９３％〜約１００％、約９４％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約９６％〜約１００％、約９７％〜約１００％、約９８％〜約１００％、約９９％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９１％〜約９９％、約９２％〜約９９％、約９３％〜約９９％、約９４％〜約９９％、約９５％〜約９９％、約９６％〜約９９％、約９７％〜約９９％、約９８％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９１％〜約９８％、約９２％〜約９８％、約９３％〜約９８％、約９４％〜約９８％、約９５％〜約９８％、約９６％〜約９８％、約９７％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９１％〜約９７％、約９２％〜約９７％、約９３％〜約９７％、約９４％〜約９７％、約９５％〜約９７％、約９６％〜約９７％、約９０％〜約９６％、約９１％〜約９６％、約９２％〜約９６％、約９３％〜約９６％、約９４％〜約９６％、約９５％〜約９６％、約９０％〜約９５％、約９１％〜約９５％、約９２％〜約９５％、約９３％〜約９５％、約９４％〜約９５％、約９０％〜約９４％、約９１％〜約９４％、約９２％〜約９４％、約９３％〜約９４％、約９０％〜約９３％、約９１％〜約９３％、約９２％〜約９３％、約９０％〜約９２％、約９１％〜約９２％、または約９０％〜約９１％である。

【0194】

＜組み換え型融合タンパク質の評価と収量＞
対象の生成された融合タンパク質および／またはポリペプチドは、タンパク質を特徴化するために、例えばタンパク質の収量または性質の評価のために、当該技術分野で既知の、または文献中に記載される適切なアッセイ方法を使用して、任意の適切な画分において特徴化され得る。

【0195】

実施形態において、ＬＣ−ＭＳ、または当該技術分野で既知の他の適切な方法は、タンパク質分解のクリッピング、脱アミド化、酸化、および断片化をモニタリングし、且つ対象のポリペプチドのＮ末端が無傷の以下のリンカー切断であることを確認するために、使用される。対象の組み換え型融合タンパク質またはポリペプチドの収量は、当業者に既知の方法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）、またはウエスタンブロット解析により、判定され得る。実施形態において、ＥＬＩＳＡ方法が宿主細胞タンパク質を測定するために使用される。例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のＥＬＩＳＡは、製造業者のプロトコルに従って、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．のカタログ番号Ｆ４５０の“Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”キットを用いて行われ得る。プレートは、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ｖ３．１．２ソフトウェアを使用して、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）の上で読み取ることができる。

【0196】

ＳＤＳ−ＣＧＥは、ＨＴタンパク質発現ｖ３クリップおよび対応する試薬（それぞれ部品番号７６０４９９および７６０３２８、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ器機（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， Ｍ）を用いて行われ得る。サンプルは、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｎｏ． ４５０５８９， Ｒｅｖ． ３）に従い調製され、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけられ得る。分離後、ゲルは染色され、脱染され、且つデジタル画像化され得る。

【0197】

タンパク質、例えば、本明細書に記載されるような対象の精製された組み換え型融合タンパク質またはポリペプチドの濃度は、当該技術分野で既知の、または文献中に記載される方法による、吸光度分光法により判定され得る。実施形態において、２８０ｎｍでのタンパク質サンプルの吸光度が測定され（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙを使用して）、タンパク質の濃度はランベルト・ベールの法則を使用して計算される。タンパク質に関する正確なモル吸光係数は、例えば、本明細書で参照により組み込まれる、Ｇｒｉｍｓｌｅｙ， Ｇ． Ｒ．， ａｎｄ Ｐａｃｅ， Ｃ． Ｎ．， “Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，” ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３．１．１−３．１．９， Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ ｃ ２００３ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．に記載されるような既知の方法により計算され得る。

【0198】

表５は、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより計算されたモル吸光係数を用いて判定される、１のＡ_２８０での本明細書に記載されるタンパク質の濃度を列挙する。

【0199】

【表5-1】

【0200】

【表5-2】

【0201】

【表5-3】

【0202】

【表5-4】

【0203】

【表5-5】

【0204】

【表5-6】

【0205】

【表5-7】

【0206】

【表5-8】

【0207】

【表5-9】

【0208】

【表5-10】

【0209】

【表5-11】

【0210】

対象のポリペプチドの収量または純度を判定するウエスタンブロット解析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に移して、対象のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体で膜をインキュベートすることにより、当該技術分野で既知の適切な方法に従い、行われ得る。本明細書に記載される任意の分析方法に有用な抗体は、当業者に既知の適切な手順により生成され得る。

【0211】

本明細書に記載され、且つ当該技術分野で既知の活性のアッセイも、タンパク質収量に関する情報を提供することができる。実施形態において、これらの、または当該技術分野で既知の他の任意の方法は、タンパク質の適切な処理、例えば適切な分泌リーダー切断を評価するために使用される。

【0212】

組み換え型融合タンパク質の収量の有用な測定値（ｍｅａｓｕｒｅｓ）は、例えば、培養物容量当たりの可溶性の組み換え型融合タンパク質の量（例えば、タンパク質のグラムまたはミリグラム／培養物のリットル）、得られた可溶性の組み換え型融合タンパク質のパーセントまたは画分（例えば、可溶性組み換え型融合タンパク質の量／合計の可溶性の組み換え型融合タンパク質の量）、合計の細胞タンパク質（ｔｃｐ）のパーセントまたは画分、および乾燥バイオマスのパーセントまたは比率を含む。実施形態において、本明細書に記載されるような組み換え型融合タンパク質の収量の測定値は、得られた可溶性の組み換え型融合タンパク質の量に基づく。実施形態において、可溶性の組み換え型融合タンパク質の測定は、細胞溶解後に得られる可溶性画分、例えば、１以上の遠心分離工程、または組み換え型融合タンパク質の精製後に得られる可溶性画分において行われる。

【0213】

対象のポリペプチドの収量に有用な測定値は、例えば、培養物容量当たりの得られた対象の可溶性ポリペプチドの量（例えば、タンパク質のグラムまたはミリグラム／培養物のリットル）、得られた対象の可溶性ポリペプチドのパーセントまたは画分（例えば、対象の可溶性ポリペプチドの量／合計の対象のポリペプチドの量）、得られた対象の活性ポリペプチドのパーセントまたは画分（例えば、活性アッセイにおける、対象の活性ポリペプチドの量／対象のポリペプチドの総量）、合計の細胞タンパク質（ｔｃｐ）のパーセントまたは画分、および乾燥バイオマスのパーセントまたは比率を含む。

【0214】

収量が培養物容量に関して発現される実施形態において、細胞培養密度は、特に異なる培養物間の収量が比較されている場合に考慮され得る。実施形態において、本発明の方法は、１リットル当たり約０．５グラム〜１リットル当たり約２５グラムの、可溶性のおよび／または活性なおよび／または適切に処理した（例えば、適切に切断された分泌リーダーを持つ）組み換え型融合タンパク質の収量を得るために使用され得る。実施形態において、組み換え型融合タンパク質は、熱ショックタンパク質のファミリーからの細胞質シャペロンまたはフォールディングモジュレーターであるＮ末端融合パートナーを含み、前記融合タンパク質は発現後に細胞質に向けられる。実施形態において、組み換え型融合タンパク質は、周辺質のペプチジルプロリルイソメラーゼのファミリーからの細胞質シャペロンまたはフォールディングモジュレーターであるＮ末端融合パートナーを含み、前記融合タンパク質は発現後に周辺質に向けられる。実施形態において、融合タンパク質、細胞質的に発現された融合タンパク質、または周辺質的に（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃａｌｌｙ）発現された融合タンパク質の収量は、約０．５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約１６ｇ／Ｌ、約１７ｇ／Ｌ、約１８ｇ／Ｌ、約１９ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２１ｇ／Ｌ、約２２ｇ／Ｌ、約２３ｇ／Ｌ、約２４ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、または約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌである。

【0215】

実施形態において、対象のポリペプチドはｈＰＴＨであり、細胞質に向けられる組み換え型融合タンパク質の収量は、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．４ｇ／Ｌである。

【0216】

実施形態において、対象のポリペプチドはｈＰＴＨであり、周辺質に向けられる組み換え型融合タンパク質の収量は、１リットル当たり約０．５グラム〜１リットル当たり約６．７グラムである。

【0217】

＜対象のポリペプチドの収量＞
実施形態において、対象のポリペプチドは、リンカー内のプロテアーゼ切断により、完全な組み換え型融合タンパク質から放出される。実施形態において、プロテアーゼによる切断後に得られる対象のポリペプチドは、適切に放出された対象のポリペプチドである。実施形態において、適切に放出されたタンパク質の測定に基づく、または、合計の融合タンパク質に対する対象のポリペプチドの既知の比率に基づき計算された、対象のポリペプチドの収量は、１リットル当たり約０．７グラム〜１リットル当たり約２５．０グラムである。実施形態において、対象のポリペプチドの収量は、０．５ｍＬ〜１００Ｌ、０．５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、またはそれより大きな規模で、約０．５ｇ／Ｌ（５００ｍｇ／Ｌ）、約１ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約１６ｇ／Ｌ、約１７ｇ／Ｌ、約１８ｇ／Ｌ、約１９ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２１ｇ／Ｌ、約２２ｇ／Ｌ、約２３ｇ／Ｌ、約２４ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜約２３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、または約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌである。

【0218】

実施形態において、ｈＰＴＨは、Ｎ末端融合パートナー、および表８に記載されるようなｈＰＴＨ構築物を持つ、融合タンパク質として生成される。実施形態において、ｈＰＴＨ融合タンパク質の発現は、０．５ｍＬ〜１００Ｌ、０．５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、またはそれより大きな規模で、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、または少なくとも１０００ｍｇ／Ｌの合計のｈＰＴＨ融合タンパク質を生成する。

【0219】

実施形態において、プロインスリン、例えばインスリンアナログ（例えばグラルギン）のためのプロインスリンは、Ｎ末端融合パートナー、および表１９に記載されるようなＣペプチド配列を含むプロインスリン構築物を持つ、プロインスリン融合タンパク質として生成される。実施形態において、本発明の方法によるプロインスリン融合タンパク質の発現は、適切に放出される場合に測定されるまたは融合タンパク質のその既知の比率に基づき計算されるように、０．５ｍＬ〜１００Ｌ、０．５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、またはそれより大きな規模で、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、または少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌの可溶性プロインスリンを生成する。

【0220】

実施形態において、本発明の方法によるプロインスリン融合タンパク質の発現は、適切に放出される場合に測定されるまたは融合タンパク質のその既知の比率に基づき計算されるように、０．５ｍＬ〜１００Ｌ、０．５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、またはそれより大きな規模で、約１０〜約５００、約１５〜約５００、約２０〜約５００、約３０〜約５００、約４０〜約５００、約５０〜約５００、約６０〜約５００、約７０〜約５００、約８０〜約５００、約９０〜約５００、約１００〜約５００、約２００〜約５００、約１０〜約４００、約１５〜約４００、約２０〜約４００、約３０〜約４００、約４０〜約４００、約５０〜約４００、約６０〜約４００、約７０〜約４００、約８０〜約４００、約９０〜約４００、約１００〜約４００、約２００〜約４００、約１０〜約３００、約１５〜約３００、約２０〜約３００、約３０〜約３００、約４０〜約３００、約５０〜約３００、約６０〜約３００、約７０〜約３００、約８０〜約３００、約９０〜約３００、約１００〜約３００、約２００〜約３００、約１０〜約２５０、約１５〜約２５０、約２０〜約２５０、約３０〜約２５０、約４０〜約２５０、約５０〜約２５０、約６０〜約２５０、約７０〜約２５０、約８０〜約２５０、約９０〜約２５０、約１００〜約２５０、約１０〜約２００、約１５〜約２００、約２０〜約２００、約３０〜約２００、約４０〜約２００、約５０〜約２００、約６０〜約２００、約７０〜約２００、約８０〜約２００、約９０〜約２００、または約１００〜約２００ｍｇ／Ｌの可溶性プロインスリンを生成する。

【0221】

実施形態において、プロインスリン融合タンパク質の発現は、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、または少なくとも約１０００ｍｇ／Ｌの合計の可溶性および不溶性のプロインスリンを生成する。実施形態において、プロインスリン融合タンパク質の発現は、０．５ｍＬ〜１００Ｌ、０．５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、またはそれより大きな規模で、約１００〜約２０００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約９００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約８００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約７００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約６００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約４００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約２０００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約１５００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約９００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約８００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約７００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約６００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約５００ｍｇ／Ｌ、約３００〜約２０００ｍｇ／Ｌ、約３００〜約１５００ｍｇ／Ｌ、約３００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約３００〜約９００ｍｇ／Ｌ、約３００〜約８００ｍｇ／Ｌ、約３００〜約７００ｍｇ／Ｌ、または約３００〜約６００ｍｇ／Ｌの合計の可溶性および不溶性のプロインスリンを生成する。実施形態において、プロインスリンは、Ｃペプチドを放出し且つ成熟したインスリンを生成するために切断される。実施形態において、プロインスリン融合タンパク質の発現は、適切に放出される場合に測定されるまたは融合タンパク質のその既知の比率に基づき計算されるように、０．５ｍＬ〜１００Ｌ、０．５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、またはそれより大きな規模で、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、約１００〜約２０００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約２０００ｍｇ／Ｌ、約３００〜約２０００ｍｇ／Ｌ、約４００〜約２０００ｍｇ／Ｌ、約５００〜約２０００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約２００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約３００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約４００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約５００〜約１０００ｍｇ／Ｌの成熟したインスリンを生成する。

【0222】

実施形態において、ＧＣＳＦは、Ｎ末端融合パートナー、および表２１に記載されるような構築物を持つ、ＧＣＳＦ融合タンパク質として生成される。実施形態において、本発明の方法によるＧＣＳＦ融合の発現は、適切に放出される場合に測定されるまたは融合タンパク質のその既知の比率に基づき計算されるように、０．５ｍＬ〜１００Ｌ、０．５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、またはそれより大きな規模で、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、または少なくとも１０００、約１００〜約１０００、約２００〜約１０００、約３００〜約１０００、約４００〜約１０００、または約５００〜約１０００ｍｇ／Ｌの可溶性ＧＣＳＦを生成する。実施形態において、本発明の方法によるＧＣＳＦ融合の発現は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、または少なくとも１０００ｍｇ／Ｌの可溶性ＧＣＳＦを生成する。実施形態において、ＧＣＳＦ融合の発現は、０．５ｍＬ〜１００Ｌ、０．５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、またはそれより大きな規模で、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも８５０、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、約１００〜約１０００、約２００〜約１０００、約３００〜約１０００、約４００〜約１０００、または約５００〜約１０００ｍｇ／Ｌの合計の可溶性および不溶性のＧＣＳＦを生成する。

【0223】

実施形態において、生成された組み換え型融合タンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の約１％〜約７５％である。特定の実施形態において、組み換え型融合タンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約１％〜約５％、約１％〜約１０％、約１％〜約２０％、約１％〜約３０％、約１％〜約４０％、約１％〜約５０％、約１％〜約６０％、約１％〜約７５％、約２％〜約５％、約２％〜約１０％、約２％〜約２０％、約２％〜約３０％、約２％〜約４０％、約２％〜約５０％、約２％〜約６０％、約２％〜約７５％、約３％〜約５％、約３％〜約１０％、約３％〜約２０％、約３％〜約３０％、約３％〜約４０％、約３％〜約５０％、約３％〜約６０％、約３％〜約７５％、約４％〜約１０％、約４％〜約２０％、約４％〜約３０％、約４％〜約４０％、約４％〜約５０％、約４％〜約６０％、約４％〜約７５％、約５％〜約１０％、約５％〜約２０％、約５％〜約３０％、約５％〜約４０％、約５％〜約５０％、約５％〜約６０％、約５％〜約７５％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約７５％、約２０％〜約３０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約５０％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約７５％、約３０％〜約４０％、約３０％〜約５０％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約７５％、約４０％〜約５０％、約４０％〜約６０％、約４０％〜約７５％、約５０％〜約６０％、約５０％〜約７５％、約６０％〜約７５％、または約７０％〜約７５％である。

【0224】

＜可溶性および活性＞
タンパク質の「可溶性」および「活性」は、性質に関連するものであるが、通常は異なる方法によって判定される。タンパク質、特に疎水性タンパク質の可溶性は、疎水性アミノ酸残基がフォールドされたタンパク質の外部に誤って位置付けられることを示す。当業者により対象のポリペプチドに適切であると判定されるような方法を使用して評価され得る、タンパク質活性は、適切なタンパク質構造の別の指標である。本明細書で使用されるように、「可溶性の、活性な、またはその両方」は、当業者に既知の方法により、可溶性であり、活性であり、または可溶性且つ活性であると判定されるタンパク質を指す。

【0225】

通常、アミノ酸配列に関して、用語「修飾」は、置換、挿入、伸長、欠失、および誘導体化を、単独でまたは組み合わせて含んでいる。実施形態において、組み換え型融合タンパク質は、「非必須」アミノ酸残基の１以上の修飾を含み得る。この文脈において、「非必須」アミノ酸残基は、組み換え型融合タンパク質の活性（例えばアゴニスト活性）を無くすまたは実質的に減少させることなく、新規のアミノ酸配列において変更、例えば削除または置換され得る残基である。一例として、組み換え型融合タンパク質は、連続的な様式で、または組み換え型融合タンパク質分子の全体で間隔をおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の置換を含み得る。単独で、または置換と組み合わせて、組み換え型融合タンパク質は、再度、連続的な様式で、または組み換え型融合タンパク質分子の全体で間隔をおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の挿入を含み得る。組み換え型融合タンパク質はまた、単独で、または置換および／または挿入と組み合わせて、再度、連続的な様式で、または組み換え型融合タンパク質分子の全体で間隔をおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の欠失を含み得る。組み換え型融合タンパク質はまた、単独で、または置換、挿入、および／または欠失と組み合わせて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸付加を含み得る。

【0226】

置換は、保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖または物理化学的特性（例えば、静電気的な、水素結合の、同配体の（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）、疎水性の特徴）を有するアミノ酸残基と置き換えられるものである。アミノ酸は、自然に生じるか、または非天然（ｎｏｒｍａｔｕｒａｌ）（非天然）であり得る。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で既知である。これらのファミリーは、塩基性の側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、アミノ酸を含んでいる。置換はまた、非保存的変化を含み得る。

【0227】

本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され且つ記載されてきた一方で、このような実施形態がほんの一例として提供されることは、当業者に明白であろう。多数の変形、変化、および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造は、それにより包含されることが、意図されている。

【実施例】

【0228】

＜実施例Ｉ：ｈＰＴＨ １−３４融合を発現する株の高スループットスクリーニング＞
この研究を、Ｎ末端融合パートナーとしてＤＮＡＪ様タンパク質、ＦｋｌＢ、またはＦｒｎＥを含むｈＰＴＨ １−３４融合タンパク質を発現する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株により生成された組み換え型タンパク質のレベルを試験するために行った。

【0229】

＜材料および方法＞
ＰＴＨ １−３４融合タンパク質発現プラスミドの構築：ＤＮＡ２．０、遺伝子設計、および合成サービス（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）を使用して、ＰＴＨ １−３４融合タンパク質をコードする遺伝子断片を合成した。各遺伝子断片は、ＰＴＨ １−３４のためのコード配列と融合される、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのフォールディングモジュレーター（ＤｎａＪ様タンパク質、ＦｋｌＢ、またはＦｒｎＥ）、およびリンカーを含んでいた。各遺伝子断片はまた、制限酵素ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩのための認識配列、「Ｈｉ」リボソーム結合部位、および、コード配列と３つの停止コドンの上流に添加されるリボソーム結合部位および制限部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）を含む１８の塩基対スペーサーを含んでいた。これらＰＴＨ １−３４融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：５２−５７として提供する。

【0230】

（表６に列挙される）発現プラスミドｐ７０８−００４、−００５および−００６を生成するために、ＰＴＨ １−３４融合タンパク質の遺伝子断片を、ＳｐｅＩとＸｈｏＩの制限酵素を用いて消化し、そして、ｐＴａｃプロモーターおよびｒｒｎＴ１Ｔ２の転写ターミネーターを含む発現ベクターｐＤＯＷ１１６９にサブクローン化した。ｐＤＯＷ１１６９は、文献、例えば米国特許出願公開第７，８３３，７５２号、そして共に本明細書において参照により組み込まれる“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｅａｄｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００５， “Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｐｙｒＦ ａｎｄ ｐｒｏＣ ｃａｎ ｒｅｐｌａｃｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ ｈｉｇｈ−ｃｅｌｌ−ｄｅｎｓｉｔｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２１（２）： ３４３−８に記載されている。プラスミドを、コンピテントなＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤＣ４５４の宿主細胞（ｐｙｒＦ ｌｓｃ：：ｌａｃＩ^Ｑ１）に電気穿孔した。

【0231】

【表6】

【0232】

ＤＮＡ配列決定：融合タンパク質発現プラスミドにおけるクローン化断片の存在を、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ４３３７４５５）を使用するＤＮＡ配列決定により確認した。分析されるプラスミドＤＮＡの５０ｆｍｏｌを含有するＤＮＡ配列決定反応を、１μＬの配列決定の事前の混合物（ｐｒｅｍｉｘ）、０．５μＬの１００μＭプライマー貯蔵溶液、３．５μＬの配列決定緩衝液、および２０μＬの最終容量に加えられる水を混合することにより、調製した。結果を集め、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ）を使用して分析した。

【0233】

９６ウェルのフォーマット（ＨＴＰ）における増殖と発現：融合タンパク質発現プラスミドを、アレイフォーマットにおいてＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの宿主株に形質転換した。３５μＬのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのコンピテント細胞と１０μＬの容量のプラスミドＤＮＡ（２．５ｎｇ）の混合により、形質転換反応を始めた。混合物の２５μＬのアリコートを、９６−マルチ−ウェルのＮｕｃｌｅｏｖｅｔｔｅ（登録商標）プレート（Ｌｏｎｚａ）に移した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）９６ウェルのＳｈｕｔｔｌｅ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ ＡＧ）を使用して電気穿孔を行い、次に電気穿孔した細胞を、１％のグルコース培地を補足した５００μＬのＭ９塩、および微量元素を含有する、新鮮な９６−ウェルディープウェルプレートに移した。４８時間振盪させながらプレートを３０℃でインキュベートして、種培養物を生成した。

【0234】

種培養物の１０μＬのアリコートを、複製して（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）９６ウェルディープウェルプレートに移した。各ウェルは、微量元素と５％のグリセロールを補足した、５００μＬのＨＴＰ−ＹＥ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）を含有していた。グリセロールを補足したＨＴＰ培地に蒔かれる種培養物を、２４時間振盪機の中、３０℃でインキュベートした。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、０．３ｍＭの終末濃度で各ウェルに加えて、ＰＴＨ １−３４融合タンパク質の発現を誘導した。プラスミドを過剰発現するフォールディングモジュレーター（表４を参照）を含む株について、ＩＰＴＧを１％の終末濃度でマンニトール（Ｓｉｇｍａ，Ｍ１９０２）を補足して、フォールディングモジュレーターの発現を誘導した。加えて、２５０ｕｎｉｔｓ／μのＬストック（ｓｔｏｃｋ）のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，７０７４６−３）の０．０１μＬを誘導時にウェルごとに加えて、培養物の粘性のためにポテンシャルを減少させた。誘導の２４時間後、６００ｎｍで光学密度（ＯＤ６００）を測定することにより細胞密度を計算した。次に細胞を集め、４００μＬの最終容量まで１Ｘのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：３に希釈して、後の処理のために凍結した。

【0235】

分析的特徴づけのための可溶性溶解物サンプルの調製：集めた細胞サンプルを希釈し、２４のプローブチップホーンを用いるＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＣＬＡＳＳ， Ｓｃｉｎｏｍｉｘ）による超音波処理により溶解させた。溶解物を８℃で１５分間、５，５００ｘｇで遠心分離した。上清を集めて、可溶性画分として標識化した。ペレットを集め、超音波処理を更にもう１回行うことで４００μＬの１Ｘ ＰＢＳ ｐＨ７．４の中で再懸濁し、不溶性画分として標識化した。

【0236】

ＳＤＳ−ＣＧＥ分析：可溶性および不溶性の画分を、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ２チップおよび対応する試薬（それぞれ部品番号７６０４９９と７６０３２８、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）と共にＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩの器具（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＨＴＰマイクロチップＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動により分析した。サンプルを、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｎｏ．４５０５８９， Ｒｅｖ．３）に従い調製した。簡潔に、可溶性または不溶性画分のサンプルの何れかの４μＬのアリコートを、９６ウェルのポリプロピレン円錐状ウェルのＰＣＲプレートの中にジチオトレイトール（ＤＴＴ）還元剤を用いてまたは用いずに、１４μＬの緩衝液と混合し、９５℃で５分間加熱し、７０μＬの脱イオン水で希釈した。融合タンパク質発現プラスミドにより形質転換しなかったヌルの宿主株からに溶解物を、試験サンプルと平行し制御として実行し、システム内部標準を使用して定量化した。

【0237】

振盪フラスコ発現：評価されている融合タンパク質発現株の各々に関する種培養物をＭ９ Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ）の中で増殖させ、中間の培養物を生成し、各中間の培養物の５ｍＬを使用して、２５０ｍＬのＨＴＰ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ ３Ｈ１１２９）を含有する、４つの１リットルのバッフル底フラスコの各々を播種した。３０℃で２４時間の増殖させた後、培養物を０．３ｍＭのＩＰＴＧと１％のマンニトールで誘導し、３０℃で更に２４時間インキュベートした。その後、振盪フラスコの培養液を遠心分離して細胞を集め、集めた細胞ペーストをこの先の使用のために凍結した。

【0238】

機械的な放出および精製：５グラムまたは１０グラムの量の凍結した細胞ペーストを溶かし、３ＸのＰＢＳ、５％のグリセロール、５０ｍＭのイミダゾール ｐＨ７．４の中で再懸濁して、それぞれ５０ｍＬまたは１００ｍＬの最終容量を調製した。次に懸濁液を、１５，０００ｐｓｉで微細流動装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ， Ｉｎｃ．， ｍｏｄｅｌ Ｍ １１０Ｙ）に２回通して均質化した。溶解物を３０分間、１２，０００ｘｇで遠心分離して、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ １５０（０．４５／０．２μｍ）のフィルターカプセルに通して濾過した。

【0239】

クロマトグラフィー：Ｆｒａｃ−９５０フラクションコレクターを備えたＡｅＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００のクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）の操作を行った。ＨＴＰ発現培養液から調製された可溶性画分サンプルを、３ＸのＰＢＳ、５％のグリセロール、５０ｍＭのイミダゾール ｐＨ７．４により予め平衡化した５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、部品番号１７−５２４８−０２）に積んだ。４のカラム容量の平衡緩衝液でカラムを洗浄し、そして、１０のカラム容量の溶出緩衝液を使用し、５０ｍＭ〜２００ｍＭのイミダゾールの直線濃度勾配を適用して、ＨｉｓＴｒａｐカラムから融合タンパク質を溶出した。全プロセスを、１．５分の滞留時間に等しい１００ｃｍ／ｈで行った。上述のＳＤＳ−ＣＧＥ分析法を使用し、ＳＤＳ−ＣＧＥにより精製画分を分析した。

【0240】

エンテロキナーゼ切断：７０００の分画分子量（ＭＷＣＯ）Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して２ｍＭのＣａＣｌ_２で捕捉された１ＸのＰＢＳ ｐＨ７．４に対して、４℃で一晩、融合タンパク質を含有する精製画分の透析により、サンプルの第１のセットを調製した。透析したサンプルを、約１ｍｇ／ｍＬの濃度に維持した。融合タンパク質を含有する精製画分を水で２Ｘに希釈することにより、サンプルの第２のセットを調製し、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で１．５ＸのＰＢＳ、２．５％のグリセロール、および〜３０−７０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液の中に貯蔵した。ブタのエンテロキナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｅ０６３２−１．５ＫＵ）の貯蔵溶液を、５Ｘまたは２０Ｘの希釈（それぞれ４０μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬのエンテロキナーゼ濃度に相当する）の何れかにおいてサンプルに加えた。ＣａＣｌ_２も２ｍＭの終末濃度に加えて、反応混合物を室温で一晩インキュベートした。

【0241】

液体クロマトグラフィー−質量分析：オートサンプラー、カラムヒーター、およびＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣに接続された、エレクトロスプレーインターフェース（ＥＳＩ）を備えるＱ−ＴｏＦ_{ｍｉｃｒｏ}質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）を、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）のために使用した。２．１ｍｍのＩＤの内部径、１５０ｍｍの長さ、５μｍの粒径、および３００Åの孔径（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号８８３７５０−９０５）を持つ、ＣＮ−逆相カラムを、ガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号８２０９５０−９２３）と共に使用した。ＨＰＬＣを５０℃の温度で行ない、流速を２℃で維持した。ＨＰＬＣ緩衝液は、０．１％のギ酸（移動相Ａ）、および０．１％のギ酸を含む９０％のアセトニトリル（移動相Ｂ）であった。約４μｇの融合タンパク質サンプルをＨＰＬＣカラムに積んだ。ＨＰＬＣ実行条件を、サンプルを積める間に９５％の移動相Ａに設定した。表７に例示した逆相勾配を使用して融合タンパク質を溶出した。

【0242】

【表7】

【0243】

ＭＳの前に、ＵＶ吸光度スペクトルを１８０ｎｍから５００ｎｍまで集めた。ＥＳＩ−ＭＳのソースを、２．５ｋＶのポジティブモードで使用した。毎秒２つのスキャンで６００−２６００ｍ／ｚの範囲を使用してＭＳスキャンを行った。ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してＭＳとＵＶのデータを分析した。ＵＶクロマトグラム、およびＭＳの合計のイオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを生成した。標的ピークのＭＳスペクトルを合計した。２，８００−６，０００の分子量範囲（ＰＴＨ １−３４に関するものであり、４１１８ｋＤａの理論的な分子量、および融合タンパク質またはＮ末端融合パートナーのためのより高い窓を有している）、１つのチャネルにつき１Ｄａの分解能、および０．２５Ｄａのガウス幅について、ＭａｘＥｎｔ １（Ｗａｔｅｒｓ）スキャンを使用して、これらスペクトルをデコンボリューションした。

【0244】

＜結果＞
ＰＴＨ １−３４遺伝子融合フラグメントの設計：ＰＴＨ １−３４融合タンパク質の高レベル発現を促進するために、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからの３つのフォールディングモジュレーター、即ちＤｎａＪ様タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、細胞質シャペロン）、ＦｒｎＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、細胞質ＰＰＩａｓｅ）、およびＦｋｌＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、周辺質ＰＩａｓｅ）を、高い可溶性発現、２５ｋＤａ未満の分子量、およびＰＴＨ １−３４（８．５２の等電位点（ｐＩ）を持つ）のものと著しく異なる等電位点（ｐＩ）に基づいて選択する。フォールディングモジュレーターの特徴を表８に示す。表８に示されるように、ＤｎａＪ様タンパク質、ＦｋｌＢ、およびＦｒｎＥのｐＩを、４．６と４．８の間で、ＰＴＨ １−３４のものから十分に分離した。これにより、イオン交換による即座の分離が可能となった。更に融合タンパク質の精製を支援するために、ヘキサ−ヒスチジンタグをリンカーの中に含めた。リンカーはまた、対象の所望のＰＴＨ １−３４ポリペプチドからのＮ末端融合パートナーの分離を促進するために、エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＤＫ）を含んでいた。ＰＴＨ １−３４融合タンパク質のためのアミノ酸配列を、図２Ａ（ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、２Ｂ（ＦｋｌＢ−ＰＴＨ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、および２Ｃ（ＦｒｎＥ−ＰＴＨ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）に示す。リンカーに相当するアミノ酸を強調し、ＰＴＨ １−３４に相当するものを、図２Ａ、ＢおよびＣにおいてイタリック体で表示する。

【0245】

【表8】

【0246】

ＰＴＨ融合発現ベクターおよびＨＴＰ発現の構築：表６に列挙される３つのＰＴＨ融合タンパク質の各々をコードする合成遺伝子フラグメントを、ＤＮＡ２．０により合成した。合成遺伝子フラグメントをＳｐｅＩおよびＸｈｏＩにより消化し、ｐＤＯＷ１１６９（同じ酵素により消化される）にライゲートして、発現プラスミドｐ７０８−００４、ｐ７０８−００５、およびｐ７０８−００６を生成した。挿入物の確認後、プラスミドを使用して、多くのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株を電気穿孔し、表４に列挙される発現株を生成した。結果として生じる形質転換された株を増殖させ、材料および方法に記載した手順に従いＩＰＴＧおよびマンニトールにより誘導させた。誘導後、細胞を集め、超音波処理し、遠心分離して、可溶性および不溶性の画分を分離した。可溶性および不溶性の画分を集めた。減少されたＳＤＳ−ＣＧＥを使用して可溶性および不溶性の画分を分析し、ＰＴＨ １−３４融合タンパク質発現レベルを測定した。３つのＰＴＨ １−３４融合タンパク質の各々のための２つの高ＨＴＰ発現株を含む、合計６つの株を、振盪フラスコ発現のために選択した。振盪フラスコ発現方法を使用してスクリーンした株を、表９に列挙する。

【0247】

振盪フラスコ発現：６つの株の各々を増殖させ、材料および方法（振盪フラスコ発現）のセクションに記載されるような２５０ｍＬの培養物の規模（各々４×２５０ｍＬの培養物）で誘導した。誘導後、各培養物（全体の細胞培養液、ＷＣＢ）からのサンプルを保持し、サンプルの亜群をＰＢＳで３Ｘに希釈し、超音波処理し、遠心分離して、可溶性および不溶性の画分を生成した。各培養物の残部を遠心分離して、細胞ペーストおよび上清無細胞培養液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｂｒｏｔｈ）（ＣＦＢ）を生成した。細胞ペーストを精製のために保持した。ＷＣＢ、ＣＦＢ、および可溶性画分を、減少されたＳＤＳ−ＣＧＥにより評価した（図３）。

【0248】

融合タンパク質（ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合については約１４ｋＤａ、およびＦｒｎＥ−ＰＴＨとＦｋｌＢ−ＰＴＨ融合については約２６ｋＤａの分子量に相当する結合）を、ＷＣＢおよび可溶性画分において観察し、融合タンパク質はＣＦＢにおいては観察されなかった。ＳＴＲ３５９８４、ＳＴＲ３６０８５、およびＳＴＲ３６１６９のための振盪フラスコの発現力価は、ＨＴＰの発現力価の５０％である一方、株ＳＴＲ３５９７０、ＳＴＲ３６０３４、およびＳＴＲ３６１５０のための振盪フラスコの発現力価は、ＨＴＰ規模で観察されたものの７０−１００％であった。ＨＴＰおよび振盪フラスコの発現力価を表９に列挙する。

【0249】

【表9】

【0250】

ＰＴＨ融合タンパク質を単離するための、ＨＴＰおよび振盪フラスコの規模において増殖されるＰＴＨ融合タンパク質発現株のＩＭＡＣ精製：６つの株の細胞ペーストを、機械的な溶解およびＩＭＡＣ精製にさらした。実行された精製はそれぞれ、非常に豊富な画分を結果としてもたらした。ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ発現株ＳＴＲ３５９７０に由来するピーク画分は６０−８０％純粋であり、ＦｋｌＢ−ＰＴＨ発現株ＳＴＲ３６０３４由来のものは６０−９０％純粋であり、ＦｒｎＥ−ＰＴＨ発現株ＳＴＲ３６１５０由来のものは９０−９５％純粋であった。

【0251】

ＰＴＨ融合タンパク質のエンテロキナーゼ切断：融合タンパク質を含有する、ＩＭＡＣ精製の実行からの非常に純粋な濃縮画分を、エンテロキナーゼ切断反応のために選択して、ＰＴＨ １−３４からＮ末端融合パートナーが切断され得ることを確認した。ブタ由来のエンテロキナーゼを研究のために使用した。対象である４ｋＤａのＰＴＨ １−３４ポリペプチドはＳＤＳ−ＣＧＥにより容易に検出可能であるため、ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合タンパク質については１４ｋＤａから１０ｋＤａ、およびＦｋｌＢ−ＰＴＨおよびＦｒｎＥ−ＰＴＨ融合タンパク質については２６ｋＤａから２２ｋＤａの融合タンパク質の合計の分子量推移を、エンテロキナーゼ切断の証拠として認めた。４０μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬのエンテロキナーゼの何れかでサンプルを一晩処理した。エンテロキナーゼの処理後、サンプルをＳＤＳ−ＣＧＥにより分析した。切断していないサンプル（レーン１−６）と比較して、ＭＷにおける推移によって図４に示されるように、４０μｇ／ｍＬのエンテロキナーゼが使用された場合にＰＴＨ １−３４からの融合パートナーの完全切断を観察し（レーン７−１２）、１０μｇ／ｍＬのエンテロキナーゼが使用された場合には部分切断を観察した（レーン１３−１８）。

【0252】

エンテロキナーゼ切断後のＰＴＨ融合タンパク質のインタクト質量分析：株ＳＴＲ３５９７０から精製されたＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合タンパク質を、付加的なエンテロキナーゼ切断実験およびインタクト質量分析のために使用した。ＳＴＲ３５９７０に由来する、ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合タンパク質を含有する精製画分を、室温で１〜３時間、ブタのエンテロキナーゼでインキュベートし、その直後にインタクト質量分析を行った。図５に示されるように、Ｃ末端ＰＴＨ １−３４ポリペプチドを検出した。インタクト質量分析の詳細を表１０に要約する。完全長のＰＴＨ １−３４に加えて、５または８のアミノ酸のＮ末端欠失に相当するフラグメントも検出した。観察されたタンパク質分解はおそらく、宿主細胞タンパク質の汚染物質、またはブタのエンテロキナーゼ調製における汚染物質によるものであった。組み換え型エンテロキナーゼも使用することができ、それにより同様の工程を介して切断を評価することができる。観察された理論的な分子量（ＭＷ）を、インタクト質量分析により検出された主要な種のために表１０に示す。切断していない融合タンパク質の保持時間は、１〜３時間にわたりエンテロキナーゼ切断にさらされた融合タンパク質について２７分の平均保持時間と比較して、約３３分であった。

【0253】

【表10】

【0254】

＜実施例ＩＩ．ＰＴＨ １−３４融合タンパク質の大規模な発酵と発現＞
実施例Ｉに記載されるＰＴＨ １−３４融合タンパク質を更に、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおける大規模発現について評価して、ＰＴＨ １−３４の大規模製造について高生産性の発現株を識別した。この研究においてスクリーンされたＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株は、表１１と１２に列挙される、ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合発現株ＳＴＲ３５９７０、ＳＴＲ３５９８４、ＳＴＲ３５９４９、ＳＴＲ３６００５、ＳＴＲ３５９８５、ＦｋｌＢ−ＰＴＨ融合タンパク質発現株、ＳＴＲ３６０３４、ＳＴＲ３６０８５、ＳＴＲ３６０９８、およびＦｒｎＥ−ＰＴＨ融合タンパク質発現株、ＳＴＲ３６１５０、ＳＴＲ３６１６９であった。

【0255】

【表11】

【0256】

【表12】

【0257】

＜材料および方法＞
ＭＢＲ発酵：酵母抽出物で補足された培地を含有する振盪フラスコを、選択された株の凍結した培養物のストックで播種した。ミニバイオリアクター（ＭＢＲ）について、酵母抽出物で補足された化学的特定培地５０ｍＬを含有する２５０ｍＬの振盪フラスコを使用した。振盪フラスコ培養物を３０℃で振盪させることで、１６〜２４時間インキュベートした。振盪フラスコ培養物からのアリコートを使用し、ＭＢＲ（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏ−２４）に播種した。ｐＨ、温度、および溶解酸素のための制御条件下で、使い捨てのミニバイオリアクターカセットの各１０ｍＬのウェルにおいて、４ｍＬの容量でＭＢＲ培養物を操作した。培地に含まれる初期量のグリセロールが消耗した時、培養物をＩＰＴＧで誘導した。発酵は１６時間持続し、サンプルを分析のために集めて、凍結させた。

【0258】

ＣＢＲ発酵：酵母抽出物およびグリセロールを補足した化学的特定培地６００ｍＬを含有する振盪フラスコを、選択された株の凍結された培養物ストックで播種することにより、１リットルのＣＢＲ（従来のバイオリアクター）発酵槽培養物のための接種材料を生成した。３２℃での振盪による１６〜２４時間のインキュベーションの後、次いで各振盪フラスコ培養物からの等しいアリコートを、２リットルのバイオリアクター（１リットルの作業容量）を含む８ユニットの多重醗酵システムの各々に無菌で移した。流加高細胞密度の発酵プロセスは、一旦培養物が標的光学密度に到達した場合にＩＰＴＧの添加により開始される、増殖相、その後誘導相から成っていた。

【0259】

発酵の誘導相は８時間進むことが可能となり、分析サンプルを発酵槽から回収して、５７５ｎｍ（ＯＤ_５７５）で細胞密度を判定した。分析サンプルを後の分析のために凍結して、融合タンパク質発現のレベルを判定した。８時間の誘導が完了した後、各容器の全体の発酵培養液（２Ｌのバイオリアクターにつき約０．８Ｌの培養液）を、６０〜９０分間にわたり、１５，９００ｘｇでの遠心分離により集めた。細胞ペーストおよび上清を分離して、ペーストを−８０℃で凍結した。

【0260】

機械的な均質化および精製：上述のようなＣＢＲ発酵プロセスから得られた凍結の細胞ペースト（２０ｇ）を溶かして、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５％のグリセロール、５００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾール ｐＨ７．４の中で再懸濁した。懸濁液の最終容量を調整して、固形物の濃度が確実に２０％になるようにした。次に材料を、１５，０００ｐｓｉで微細流動装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ， Ｉｎｃ．， ｍｏｄｅｌ Ｍ １１０Ｙ）に２回通して均質化した。溶解物を３０分間、１２，０００×ｇで遠心分離して、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ １５０（０．４５／０．２μｍ）のフィルターカプセルに通して濾過した。

【0261】

クロマトグラフィー：Ｆｒａｃ−９５０フラクションコレクターを備えたＡｅＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００のクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）の操作を行った。ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ、１０ｍＬカラム（連続して接続される２つの５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカートリッジ［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、部品番号１７−５２５５−０１］）にサンプルを積んで、洗浄して、０ｍＭ〜２００ｍＭまでイミダゾール濃度を変えることにより溶出緩衝液の１０のカラム容量直線濃度勾配を使用して溶出した。２ミリリットルの容量画分を集めた。

【0262】

Ｎｉｃｋｅｌ ＩＭＡＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、部品番号１７−５３１８−０１）を使用して、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製を行った。ＣＢＲ発酵の後に集められた分析サンプルを、可溶性および不溶性の画分に分離した。可溶性画分の６００μＬのアリコートを、室温でロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）上で１時間、１００μＬのＩＭＡＣ樹脂でインキュベートし、１２，０００ｘｇで１分間遠心分離して、樹脂をペレット状にした。上清を除去し、通過画分として標識化した。その後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ７．３、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、および２０ｍＭのイミダゾールを含有する洗浄緩衝液１ｍＬで３回、樹脂を洗浄した。３回の洗浄後、４００ｍＭのイミダゾールを含有する洗浄緩衝液２００μＬの中で樹脂を再懸濁し、遠心分離した。上清を集めて、溶出液として標識化した。

【0263】

エンテロキナーゼ切断：ＰＴＨ １−３４融合タンパク質の精製画分を濃縮し、２０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する緩衝液の中で再懸濁した。エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ＃６９０６６−３、バッチＤ００１５５７４７）の２つのユニットを、１００μＬの反応中の１００μｇのタンパク質に加えた。融合タンパク質の精製画分とエンテロキナーゼの混合物を室温で、１時間または一晩にわたりインキュベートした。エンテロキナーゼの無い対照の反応物も室温で、１時間または一晩にわたりインキュベートした。酵素反応は、４−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ、Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃Ｐ８４６５）を含有する完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルの添加により止めることができた。

【0264】

＜結果＞
ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ、ＦｋｌＢ−ＰＴＨ、およびＦｒｎＥ−ＰＴＨ融合発現株の発酵評価：表９と１０に列挙される、５つの上部発現（ｔｏｐ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合株、３つのＦｋｌＢ−ＰＴＨ発現株、および２つのＦｒｎＥ−ＰＴＨ発現株をそれぞれ、最初にミニバイオリアクター（ＭＢＲ）の中で、次に従来のバイオリアクター（ＣＢＲ）の中で、発酵について評価した。

【0265】

ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合発現株の各ＭＢＲ発酵からの可溶性画分を、実施例Ｉの材料および方法のセクションに記載されるプロトコルに従い、ＳＤＳ−ＣＧＥにより分析した。ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合発現菌株のためのＭＢＲ発酵収量を、表１３に列挙する。全体として、可溶性の融合タンパク質の最も高いＭＢＲ発現レベルを持つ株は、２．１ｇ／ｌでＳＴＲ３５９４９であった。

【0266】

【表13】

【0267】

ＤｎａＪ様タンパク質ＰＴＨ融合菌株を、従来のバイオリアクター（ＣＢＲ）の中、１Ｌの規模で発酵について評価した。表１４に示されるように、ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合タンパク質株のＣＢＲ発現レベルは、ＭＢＲレベルに匹敵していた。発現レベルは、２４時間の誘導後の時点よりも８時間の誘導後の時点の方が高かった。

【0268】

【表14】

【0269】

ＦｋｌＢ−ＰＴＨおよびＦｒｎＥ−ＰＴＨ融合発現菌株のためのＭＢＲ発酵からの可溶性画分を、還元条件下でＳＤＳ−ＣＧＥにより分析した（表１５に示される結果）。

【0270】

【表15】

【0271】

全体として、可溶性の融合タンパク質の最も高い発現レベルを持つ株は、６．４ｇ／ｌでＳＴＲ３６０３４であった。同じ菌株も、従来のバイオリアクター（ＣＢＲ）における大規模発酵について評価した（表１６に示される結果）。ＣＢＲ発酵において最大収量を持つ株は、２４時間の誘導期間の後、６．７ｇ／ｌでＦｋｌＢ−ＰＴＨ融合タンパク質を発現する、ＳＴＲ３６０３４であった。

【0272】

【表16】

【0273】

ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨおよびＦｋｌＢ−ＰＴＨ融合タンパク質の精製とエンテロキナーゼ切断の評価：ＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合発現株ＳＴＲ３６００５における発現の誘導および増殖後に得た細胞ペーストを、材料および方法に記載されるように、機械的溶解およびＩＭＡＣ精製にさらした。実行された精製はそれぞれ、非常に豊富な画分を結果としてもたらした。ピーク画分の純度は９０％以上であった。

【0274】

株３６００５から精製されたＤｎａＪ様タンパク質−ＰＴＨ融合タンパク質の高純度の濃縮画分を、エンテロキナーゼ切断試験のために使用して、Ｎ末端融合パートナーは対象のＰＴＨ １−３４ポリペプチドから切断することができないことを確認した。組み換え型のウシのエンテロキナーゼを切断反応のために使用した。分析スケールのサンプルからの可溶性画分を、ＩＭＡＣ樹脂を使用する融合タンパク質の小規模バッチの豊富化のために使用した（図６）。エンテロキナーゼによるインキュベーションの１時間後、ＤｎａＪ様タンパク質融合パートナーの部分切断を観察した（レーン２−４）。一晩のインキュベーションの後、切断は完全であった（レーン６−８）。

【0275】

ＦｋｌＢ−ＰＴＨ融合菌株は、１リットルの規模で丈夫であると思われる。精製サンプルを更に分析して、融合タンパク質はエンテロキナーゼにより豊富化および切断され得ることを確認した。分析スケールのサンプルからの可溶性画分を、ＩＭＡＣ樹脂を使用する融合タンパク質の小規模バッチの豊富化のために使用した。３つの発現株、ＳＴＲ３６０３４、ＳＴＲ３６０８５、およびＳＴＲ３６０９８の各々について１つの豊富なサンプルをエンテロキナーゼで処理し、実施例Ｉに記載される方法を使用してインタクト質量分析にさらした。図７に示されるように、対象のＰＴＨ １−３４ポリペプチドを確認して、各サンプルについて正確な質量、即ち〜４１１８Ｄａであると観察した。

【0276】

＜実施例ＩＩＩ．エンテロキナーゼ融合の構築＞
組み換え型エンテロキナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）の発現に使用するために、ＤｎａＪ様タンパク質、ＦｋｌＢ、およびＦｒｎＥ Ｎ末端融合パートナー−エンテロキナーゼ融合タンパク質を設計し、発現構築物を生成した。

【0277】

エレテロキナーゼ融合発現プラスミドの構築：評価されたエンテロキナーゼ（ＥＫ）融合コード領域を、表１７に列挙する。融合タンパク質をコードする遺伝子断片を、ＤＮＡ２．０により合成した。断片はＳｐｅ１およびＸｈｏ１の制限酵素部位、「Ｈｉ」リボソーム結合部位、コード配列の上流に加えられた１８の塩基対スペーサー（５’−ａｃｔａｇｔａｇｇａｇｇｔｃｔａｇａ−３’）、および３つの停止コドンを含んでいた。

【0278】

標準クローニング法を使用して、発現プラスミドを構築した。各エンテロキナーゼ融合コード配列を含有するプラスミドＤＮＡを、ＳｐｅＩとＸｈｏＩの制限酵素を使用して消化し、次いで、ｐＴａｃプロモーターおよびｒｒｎＴ１Ｔ２転写ターミネーターを含有する、ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩで消化したｐＤＯＷ１１６９発現ベクターにサブクローン化した。挿入物とベクターを一晩、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＥＬ００１１）でライゲートした結果、エンテロキナーゼ融合タンパク質発現プラスミドを得た。プラスミドをコンピテントなＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤＣ４５４宿主細胞に電気穿孔した。Ｐｔａｃおよび末端（Ｔｅｒｍ）配列プライマー（ＡｃｃｕＳｔａｒｔ ＩＩ， ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｒｏｍ Ｑｕａｎｔａ ， ９５１３７−５００）を使用し、ＰＣＲによりエンテロキナーゼ融合タンパク質配列の挿入物の存在について、陽性のクローンをスクリーンした。

【0279】

【表17】

【0280】

＜実施例ＩＶ．エンテロキナーゼ融合タンパク質（ＤＮＡＪ様、ＦｋｌＢ、ＦｒｎＥ Ｎ−末端パートナー）の大規模発酵＞
実施例Ｉに記載のものと同様の方法に従い、ＨＴＰ分析により、組み換え型タンパク質の発現について、実施例ＩＩＩに記載される発現株を試験する。

【0281】

可溶性融合タンパク質の発現レベルに基づき、発酵研究のために発現株を選択する。選択した株を増殖させ、誘導させて、誘導した細胞を、ＰＴＨ １−３４融合タンパク質のために上述のように、遠心分離し、溶解し、そして再び遠心分離した。結果として生じる不溶性画分と可溶性画分を、上述の抽出条件を使用して抽出し、ＥＫ融合タンパク質抽出物の上清を、ＳＤＳ−ＣＧＥを使用して定量化する。

【0282】

＜実施例Ｖ．インスリン融合タンパク質を発現する株の高スループットスクリーニング＞
この研究を、Ｎ末端融合パートナーとしてＤＮＡＪ様タンパク質、ＥｃｐＤ、ＦｋｌＢ、ＦｒｎＥを含むプロインスリン融合タンパク質を発現する、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株により、または、ＥｃｐＤ、ＦｋｌＢ、ＦｒｎＥの切断により生成された組み換え型タンパク質のレベルを試験するために行った。

【0283】

＜材料および方法＞
プロインスリン発現ベクターの構築：プロインスリン（インスリングラルギン）をコードする、最適化された遺伝子断片を、ＤＮＡ ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）により合成した。遺伝子断片、および該遺伝子断片内に含まれるプロインスリンコード配列によりコードされたプロインスリンアミノ酸配列を、表１８に列挙する。各遺伝子断片は、ペプチドＡおよびＢのコード配列、そして以下４つの異なるグラルギンＣペプチド配列の１つを含んでいた：ＣＰ−Ａ（ＭＷ＝９３３６．９４Ｄａ；ｐＩ＝５．２；Ａ＋Ｂグラルギンの６５％）、ＣＰ−Ｂ（ＭＷ＝８８０６．４２Ｄａ；Ａ＋Ｂグラルギンの６９％）、ＣＰ−Ｃ（ＭＷ＝８７４９．３２Ｄａ；Ａ＋Ｂグラルギンの６９％）、およびＣＰ−Ｄ（ＭＷ＝７２９２．６７Ｄａ；Ａ＋Ｂグラルギンの８３％）。プロインスリンコード配列の上流および下流に加えられるＳａｐＩ制限酵素部位により遺伝子断片を設計することで、様々な発現ベクターへの遺伝子断片の迅速なクローン化を可能した。遺伝子断片はまた、エンテロキナーゼ切断部位またはトリプシン切断部位を含有する発現ベクターへのライゲーションを促進するために、５’フランキング領域内にリジンアミノ酸コドン（ＡＡＧ）またはアルギニンアミノ酸コドン（ＣＧＡ）の何れかを含んでいた。加えて、３つの停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）は、遺伝子断片全ての３’フランキング領域内に含まれていた。

【0284】

【表18】

【0285】

その後、プロインスリンコード配列を、をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｍ０２０２Ｓ）を使用する、コード配列の発現ベクターへのライゲーションにより、異なる融合パートナーを含む発現ベクター（表１９）へとサブクローン化した。ライゲートされたベクターを、コンピテントなＤＣ４５４ Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞へと、９６ウェルのフォーマットで電気穿孔した。

【0286】

【表19】

【0287】

９６ウェルのフォーマット（ＨＴＰ）における増殖および発現：プロインスリンコード配列および融合パートナーを含有しているプラスミドを、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤＣ４５４宿主株に 形質転換した。２５マイクロリットルのコンピテント細胞を、解凍し、９６マルチウェルのＮｕｃｌｅｏｖｅｔｔｅ（登録商標）プレート（Ｌｏｎｚａ ＶＨＮＰ−１００１）へと移し、前の工程で調製したライゲーション混合物と混合した。エレクトロポレーションを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）の９６ウェルのＳｈｕｔｔｌｅ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ ＡＧ）を使用して実行し、その後、形質転換細胞を、４００μＬのＭ９塩、１％のグルコース培地および微量元素とともに９６ウェルのディープウェルプレート（播種プレート）に移した。播種プレートを、４８時間振盪させながら３０℃でインキュベートして、種培養物を生成した。

【0288】

１０マイクロリットルの種培養物を、複製して新鮮な９６ウェルのディープウェルプレートに移し（各ウェルは５００μＬのＨＴＰ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ ３Ｈ１１２９）を含有している）、微量元素および５％のグリセロールを補足し、２４時間振盪させながら３０℃でインキュベートした。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、０．３ｍＭの終末濃度で各ウェルに加え、プロインスリン融合タンパク質の発現を誘導した。さらに、２５０ｕｎｉｔｓ／μｌストックのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、７０７４６−３）０．０１μＬを、誘導時にウェルごとに加え、培養物粘度のポテンシャルを低下させた。誘導の２４時間後に、６００ｎｍで光学密度（ＯＤ_６００）を測定することによって、細胞密度を定量化した。誘導の２４時間後に、細胞を採取し、４００μＬの最終容量まで１Ｘ ＰＢＳで１：３に希釈し、その後、後の処理のために凍結した。

【0289】

分析的特徴づけのための可溶性溶解物のサンプル調製：上に記載されるように調製され、冷凍保存された培養液サンプルを、解凍し、希釈し、超音波処理した。超音波処理によって得た溶解物を、８℃の温度で、１５分間５，５００×ｇで遠心分離にかけ、可溶性（上清）画分と不溶性（ペレット）画分を分離した。不溶性画分を、超音波処理を使用してＰＢＳ中に再懸濁した。

【0290】

ＳＤＳ−ＣＧＥ分析：上に議論されるように調製した試験タンパク質サンプルを、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ２のチップと対応する試薬（それぞれ、部品番号７６０４９９および７６０３２８、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）とともにＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩの器具（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ＨＴＰマイクロチップＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動によって分析した。サンプルを、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｎｏ． ４５０５８９， Ｒｅｖ． ３）に従って調製した。９６ウェルの円錐状ウェルＰＣＲプレートにおいて、４μＬのサンプルを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）還元剤を用いてまたは用いずに、１４μＬのサンプル緩衝液と混合した。混合物を、５分間９５℃で加熱し、７０μＬの脱イオン水を加えることによって希釈した。

【0291】

９６ウェルのスケールでのプロインスリン力価を、プロインスリンで構成された融合タンパク質のパーセンテージを掛けた融合タンパク質力価に基づいて判定した。総力価は、可溶性および不溶性の標的発現（ｍｇ／Ｌ）の合計を表わす。

【0292】

＜結果＞
表２０に示されるように、Ｎ末端融合パートナーとしてＤｎａＪ様のタンパク質を有するグラルギン・プロインスリン融合タンパク質は、最も高いレベルのプロインスリン発現を示した。驚くべきことに、ＥｃｐＤ融合パートナーの最も小さなバージョン、５０アミノ酸融合パートナーＥｃｐＤ３を含有しているプロインスリン融合タンパク質は、全長融合パートナーＥｃｐＤ１および１００アミノ酸の切断型バージョンＥｃｐＤ２と比較して、より高いレベルの発現を示した。ＦｋｌＢまたはＦｒｎＥのＮ末端融合パートナーを含有しているプロインスリン融合タンパク質に関して、最も小さな融合パートナー断片、それぞれ、ＦｋｌＢ３およびＦｒｎＥ３に融合したプロインスリンの発現は、より長いＮ末端融合パートナーを有している構築物の発現に等しかったかまたはそれよりわずかに低かった。表２０は、高スループット発現の研究の間に観察された、可溶性および総合計両方のプロインスリンタンパク質力価を要約している。

【0293】

それ故、成熟したグラルギンは、トリプシン切断後に精製された融合タンパク質（およびＣペプチド）から成功裡に放出されると判定された。選択された融合タンパク質（尿素の未変性濃度の存在下で精製された、ＤｎａＪ構築物Ｇ７３７−０３１およびＦｋｌＢ構築物Ｇ７３７−００９、ならびに尿素なしで精製された、ＦｒｎＥ１構築物Ｇ７３７−０１８）上で実行された、ＩＭＡＣ濃縮に続くトリプシン切断は、融合タンパク質が、グラルギン標準と比較して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＤＳ−ＣＧＥによって評価されるように成熟したインスリンを生成するために切断されることを実証した。受容体結合アッセイは、活性をさらに示した。

【0294】

【表20-1】

【0295】

【表20-2】

【0296】

【表20-3】

【0297】

実施例ＶＩ．ＧＣＳＦ融合タンパク質の高スループットスクリーニング
ＤｎａＪ様タンパク質、Ｎ末端融合パートナーとして様々な長さのＦｋｌＢ（ＦｋｌＢ、ＦｋｌＢ２、またはＦｋｌＢ３）、ＦｒｎＥ（ＦｒｎＥ、ＦｒｎＥ２、またはＦｒｎＥ３）、またはＥｃｐＤ（ＥｃｐＤ１、ＥｃｐＤ２、またはＥｃｐＤ３）を含有しているＧＣＳＦ融合タンパク質を発現するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株によって生成された、組み換えＧＣＳＦタンパク質のレベルを試験するために、本研究を行った。

【0298】

＜材料および方法＞
ＧＣＳＦ発現ベクターの構築：最適化されたｇｃｓｆコード配列、コード配列の下流および上流の両方の制限酵素ＳａｐＩに対する認識配列、およびにコード配列の下流の３つの停止コドンを含有している、ＧＣＳＦ遺伝子断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８）を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）によって合成した。プラスミドｐＪ２０１：２０７２３２のＧＣＳＦ遺伝子断片を、制限酵素ＳａｐＩで消化し、最適化されたｇｃｓｆコード配列を含有している断片を生成した。その後、ｇｃｓｆコード配列を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＥＬ００１１）を使用してＧＣＳＦ遺伝子断片および発現ベクターのライゲーションにより、異なる融合パートナーを含有している発現ベクターへとサブクローン化し、９６ウェルのフォーマットでコンピテントなＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤＣ４５４の宿主細胞へと電気穿孔した。ヘキサヒスチジンタグを、ＧＣＳＦからＮ末端融合パートナーを放出するためにエンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＫ）とととに、ＧＣＳＦと各Ｎ末端融合パートナーとの間のリンカーに含めた。結果として生じる融合タンパク質構築物を含有しているプラスミドは、表２１の３番目の列にリストされている。

【0299】

【表21】

【0300】

９６ウェルのフォーマット（ＨＴＰ）での増殖および発現：ｇｃｓｆ遺伝子に対するコード配列およびＮ末端融合パートナーを含有しているプラスミドを、一連のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株に形質転換した。３５マイクロリットルのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのコンピテント細胞を、解凍し、１０μＬの１０×希釈したプラスミドＤＮＡ（２．５ｎｇ）と混合した。２５マイクロリットルの混合物を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）の９６ウェルのＳｈｕｔｔｌｅ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ ＡＧ）を使用して、エレクトロポレーションを介する形質転換のために、９６マルチウェルのＮｕｃｌｅｏｖｅｔｔｅ（登録商標）プレート（Ｌｏｎｚａ ＶＨＮＰ−１００１）へと移し、その後、形質転換細胞を、５００μＬのＭ９塩、１％のグルコース培地および微量元素を含有している９６ウェルのディープウェルプレート（播種プレート）に移した。播種プレートを、４８時間振盪させながら３０℃でインキュベートし、種培養物を生成した。

【0301】

１０マイクロリットルの種培養物を、複製して新鮮な９６ウェルのディープウェルプレートに移し（各ウェルは５００μＬのＨＴＰ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ ３Ｈ１１２９）を含有している）、微量元素および５％のグリセロールを補足し、２４時間振盪させながら３０℃でインキュベートした。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、０．３ｍＭの終末濃度で各ウェルに加え、ＧＣＳＦ融合タンパク質の発現を誘導した。フォールディングモジュレーターを過剰発現するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株（ＦＭＯ株）中に、１％の終濃度のマンニトール（Ｓｉｇｍａ， Ｍ１９０２）を、ＩＰＴＧとともに加え、フォールディングモジュレーターの発現を誘導した。さらに、２５０ｕｎｉｔｓ／μｌストックのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、７０７４６−３）０．０１μＬを、誘導時にウェルごとに加え、培養物粘度のポテンシャルを低下させた。誘導の２４時間後に、６００ｎｍで光学密度（ＯＤ_６００）を測定することによって、細胞密度を定量化した。誘導の２４時間後に、細胞を採取し、４００μＬの最終容量まで１Ｘ ＰＢＳで１：３に希釈し、その後、後の処理のために凍結した。

【0302】

分析的特徴づけのための可溶性溶解物のサンプル調製：上に記載されるように調製され冷凍された培養液サンプルを、解凍し、希釈し、２４プローブチップホーンを有するＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＣＬＡＳＳ， Ｓｃｉｎｏｍｉｘ）を使用して超音波処理した。超音波処理によって得られた溶解物を、８℃の温度で、１５分間５，５００×ｇで遠心分離にかけ、可溶性（上清）画分と不溶性（ペレット）画分を分離した。不溶性画分を、超音波処理によっても、ｐＨ７．４で、４００μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。

【0303】

ＳＤＳ−ＣＧＥ分析：上に議論されるように調製された試験タンパク質サンプルを、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ２のチップと対応する試薬（それぞれ、部品番号７６０４９９および７６０３２８、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）とともにＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩの器具（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＨＴＰマイクロチップＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動によって分析した。サンプルを、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｎｏ． ４５０５８９， Ｒｅｖ． ３）に従って調製した。９６ウェルの円錐状ウェルＰＣＲプレートにおいて、４μＬのサンプルを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）還元剤を用いてまたは用いずに、１４μＬのサンプル緩衝液と混合した。混合物を、５分間９５℃で加熱し、７０μＬの脱イオン水を加えることによって希釈した。試験タンパク質サンプルと平行して、融合タンパク質を含有していない株（欠失株）からの溶解物も分析した。欠失株からの溶解物を、バックグラウンド除去なしでシステム内部標準を使用して定量化した。１株当たり１つのサンプルの量を、ＨＴＰスクリーン中に計った；典型的に、ＳＤＳ−ＣＧＥ方法の標準偏差は〜１０％である。

【0304】

＜結果＞
Ｎ末端Ｍｅｔ−ＧＣＳＦの高レベルの発現を可能にする株を特定するためにプロテアーゼ欠損宿主をスクリーニングする代替策を提供する、融合パートナーでのアプローチを用いて、ＧＣＳＦの高レベルの発現を、９６ウェルのスケールで達成した。融合タンパク質およびＧＣＳＦの力価（ＭＷによって総融合タンパク質のパーセントＧＣＳＦに基づいて計算された）を、表２２に示す。野生型菌株ＤＣ４５４は、４８４ｍｇ／Ｌの融合タンパク質、およびｄｎａＪ融合パートナーを有する３０５ｍｇ／ＬのＧＣＳＦを生成した。表２２に示されるように、融合パートナーの構築物はすべて、１００ｍｇ／Ｌを超える融合タンパク質力価をもたらした。ＨＴＰスケールで観察されたこれらの高レベルは、振盪フラスコまたは発酵スケールでの発現に対する大きな見込みを示した。さらに、ＨＴＰとより大きなスケールの培養物との間の容積力価の著しい増加を観察することは一般的である。従来の研究では、ｐｒｔＢプロテアーゼ欠損株は、０．５ｍＬのスケールで〜２４７ｍｇ／ＬのＭｅｔ−ＧＣＳＦの発現を可能にすると示された（Ｈ． Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７８：６９−７７、および米国特許第８，４５５，２１８号）。本研究では、記載されるように、融合タンパク質の部分としての高レベルのＭｅｔ−ＧＣＳＦの発現は、プロテアーゼ欠損がない宿主細胞でさえ観察された。記載された融合タンパク質のいずれかの部分としての発現およびプロテアーゼ切断による放出によって得られたＭｅｔ−ＧＣＳＦの調製は、切断がプロテアーゼの除去後に実行されるため、事実上１００％のＭｅｔ−ＧＣＳＦを含有する（およびｄｅｓ−Ｍｅｔ−ＧＣＳＦを含有しない）ことが留意される。

【0305】

【表22】

【0306】

本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され記載されるが、そのような実施形態が例示目的のみで提供されることは当業者にとって明白となる。多くの変更、変化および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に想到される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物が、それによって包含されるものであることが意図されている。

【0307】

【表23-1】

【0308】

【表23-2】

【0309】

【表23-3】

【0310】

【表23-4】

【0311】

【表23-5】

【0312】

【表23-6】

【0313】

【表23-7】

【0314】

【表23-8】

【0315】

【表23-9】

【0316】

【表23-10】

【0317】

【表23-11】

【0318】

【表23-12】

【0319】

【表23-13】

【0320】

【表23-14】

【0321】

【表23-15】

【0322】

【表23-16】

【0323】

【表23-17】

【0324】

【表23-18】

【0325】

【表23-19】

【0326】

【表23-20】

【0327】

【表23-21】

【0328】

【表23-22】

【0329】

【表23-23】

【0330】

【表23-24】

【0331】

【表23-25】

【0332】

【表23-26】

【0333】

【表23-27】

【0334】

【表23-28】

【0335】

【表23-29】

【0336】

【表23-30】

【0337】

【表23-31】

【0338】

【表23-32】

【0339】

【表23-33】

【0340】

【表23-34】

【0341】

【表23-35】

【0342】

【表23-36】

【0343】

【表23-37】

【0344】

【表23-38】

【0345】

【表23-39】

【0346】

【表23-40】

【0347】

【表23-41】

【0348】

【表23-42】

【0349】

【表23-43】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]