特許 6821006 抗ＥＧＦＲと抗ＣＤ３の二重特異性抗体及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6821006

(24)【登録日】2021年1月7日

(45)【発行日】2021年1月27日

(54)【発明の名称】抗ＥＧＦＲと抗ＣＤ３の二重特異性抗体及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20210114BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20210114BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20210114BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20210114BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210114BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210114BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210114BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210114BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210114BHJP

   C12N 15/70 20060101ALI20210114BHJP

   C12N 15/74 20060101ALI20210114BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20210114BHJP

   C12N 15/81 20060101ALI20210114BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210114BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20210114BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210114BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13

   C07K16/46ZNA

   C07K16/30

   C07K16/28

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N15/62 Z

   C12N15/70 Z

   C12N15/74 Z

   C12N15/85 Z

   C12N15/81 Z

   A61K39/395 T

   A61K39/395 U

   A61K47/65

   A61P35/00

【請求項の数】12

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2019-505507(P2019-505507)

(86)(22)【出願日】2017年9月28日

(65)【公表番号】特表2019-526246(P2019-526246A)

(43)【公表日】2019年9月19日

(86)【国際出願番号】CN2017103896

(87)【国際公開番号】WO2018068652

(87)【国際公開日】20180419

【審査請求日】2019年1月31日

(31)【優先権主張番号】201610886938.7

(32)【優先日】2016年10月11日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】512320009

【氏名又は名称】北京東方百泰生物科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＤＯＮＧＦＡＮＧ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．ＬＴＤ．

(73)【特許権者】

【識別番号】517058510

【氏名又は名称】北京精益泰翔技▲術▼▲発▼展有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】白 ▲義▼

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ ▲穏▼

(72)【発明者】

【氏名】徐 萌

(72)【発明者】

【氏名】裴 爽

(72)【発明者】

【氏名】▲ザン▼ ▲ヤン▼▲ル▼

(72)【発明者】

【氏名】文 ▲聖▼▲梅▼

【審査官】 高山 敏充

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１６／０７１００４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０８−２８０３８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／１６５８１８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１６／１１５２７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／１４６４３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／１４６４３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０２０６２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 薬学雑誌，２０１５年，Vol. 135, No. 7，pp.851-856

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）インタクトなモノクローナル抗体、（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖおよび（ｃ）リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、前記（ａ）はＥＧＦＲ抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなり、前記（ｂ）は免疫細胞抗原ＣＤ３に特異的に結合し、前記（ｂ）は２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖであり前記（ｂ）の２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖはそれぞれ前記（ｃ）リンカーを介して前記（ａ）の２つの重鎖のＣ末端に連結され、
前記（ａ）インタクトなモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１と配列番号：４、配列番号：２と配列番号：５または配列番号：３と配列番号：６という３種類の組み合わせのうちの１種類であることを特徴とする二重特異性抗体。

【請求項2】

前記（ｃ）リンカーのアミノ酸配列は(ＧＧＧＧＸ)_ｎであり、ＸはＡｌａまたはＳｅｒであり、ｎは１〜４の自然数であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項3】

前記ＸはＳｅｒであり、前記ｎは３であることを特徴とする請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

前記（ｂ）２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖのアミノ酸配列はいずれも配列番号：７であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

前記(ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：８であり、前記（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：９であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

前記(ａ）インタクトなモノクローナル抗体の重鎖定常領域はｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３またはｌｇＧ４のうちの１種の重鎖定常領域であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含むことを特徴とする抗体、ポリペプチドまたはタンパク質。

【請求項8】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ発現ベクター。

【請求項10】

宿主細胞であって、請求項９に記載の組換えＤＮＡ発現ベクターが形質転換されており、原核細胞、酵母または哺乳動物細胞を含むことを特徴とする宿主細胞。

【請求項11】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含むことを特徴とする薬物または薬物組成物。

【請求項12】

ＥＧＦＲ抗原特異的発現による腫瘍病気またはその他の病気を治療する薬物の調製における請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物技術分野に関し、具体的には、ＥＧＦＲとＣＤ３についての二重特異性抗体の構築および調製方法、並びにこの抗体の病気における応用に関する。

【背景技術】

【0002】

二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＢｉＡｂ）は２つの異なる抗体断片により構成される人工抗体であり、２つの異なる抗原または２つの異なる抗原エピトープを特異的に認識および結合することができる。

【0003】

モノクローナル抗体は、癌、炎症および他の疾患の治療に広く使用されている。これらの抗体は単一のターゲットに向けているので、多くの患者は単一の治療に十分に応答できず、薬物耐性が時に生じる。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原または抗原性エピトープを同時に認識でき媒介としてナチュラルキラー細胞およびＴ細胞などの免疫エフェクター細胞を再配向でき、腫瘍細胞の死滅機能を増強する。さらに、二重特異性抗体は、同じ細胞における２つの異なる抗原に位置付けられ、癌拡散シグナルまたは炎症シグナルを含む細胞シグナル伝達の変化をもたらすこともできる。長期にわたる研究開発の後、二重特異性ミニ抗体、二本鎖抗体、一本鎖二価抗体、および多価二重特異性抗体のような二重特異性抗体の様々な形態が出現した。これらの二重特異性抗体は、基本的に、Ｆｃ含有およびＦｃ非含有の二種類に分類される。前者はより良好な溶解性、安定性および半減期を有する一方で、Ｆｃが媒介する抗体依存性細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞溶解効果(ＣＤＣ）は、治療に必要な付加的効果を幾つかもたらすことができる。これに比べて、Ｆｃを欠く二重特異性抗体は、その抗原結合能力に完全に依存してその治療効果を発揮する。さらに、Ｆｃタンパク質はインビボでの薬物タンパク質（またはポリペプチド）の半減期を延長し、それによりインビボでの活性分子の作用時間を延長する。

【0004】

腫瘍細胞表面抗原である表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）：、表皮成長因子受容体は血管組織以外の上皮細胞膜に広く分布し、約１８０ＫＤａの分子量を有する膜貫通タンパク質であり、リガンド誘発チロシンプロテインキナーゼ活性を有し、ＥｒｂＢという保守的な受容体ファミリーのメンバーの１つである。このファミリーの他のメンバーとして、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４が含まれる。ＥｒｂＢ受容体の共通の特徴は、細胞外（ＥＣ）リガンド結合領域、２つの反復システインリッチ領域からなる単一膜貫通領域、およびチロシンプロテインキナーゼおよび自身リン酸化部位を含む細胞内配列を含むことと、リガンドと受容体との結合後、受容体の二量化を起こし、ホモまたはヘテロ型の二量体を形成することと、二量化の受容体が架橋リン酸化が発生し、細胞内領域におけるＴＫサブ領域を活性化し、それによって次のレベルのシグナル伝達を誘導し、細胞増殖、形質転換をもたらすこととを含む。ＥＧＦＲは、腫瘍細胞の増殖、血管形成、腫瘍浸潤、転移、およびアポトーシスの阻害に関し、その機制は、ＥＧＦＲ高発現による下流シグナル伝達の増強、変異体ＥＧＦＲ受容体またはリガンド発現の増加によるＥＧＦＲの連続的活性化、自己分泌ループの作用増強、受容体の下方調節機構の破壊、および異常シグナル伝達経路の活性化を含む。研究の結果、ＥＧＦＲが多くの固形腫瘍において高発現または異常発現し、腫瘍細胞の増殖、血管形成、腫瘍浸潤、転移およびアポトーシスの阻害に関連することを示している。ＥＧＦＲの過剰発現は、腫瘍の進化において重要な役割を果たし、神経膠腫、肺癌、前立腺癌、膵臓癌などの組織にＥＧＦＲの過剰発現がある。

【0005】

免疫細胞表面抗原分化クラスター３(ＣＤ３）：ＣＤ３分子は、Ｔ細胞膜上の重要な分化抗原であり、成熟Ｔ細胞の特徴的マーカーであり、６つのペプチド鎖からなり、非共有結合でＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）との間でＴＣＲ−ＣＤ３複合体を構成し、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体の細胞質内の組み立てに関与するだけでなく、各ポリペプチド鎖の細胞質基質領域の免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ，ＩＴＡＭ）を介して抗原刺激シグナルを送達する。ＣＤ３分子の主な機能は、ＴＣＲ構造を安定化させ、Ｔ細胞活性化シグナルを伝達することである。ＴＣＲが特異的に抗原を認識して結合すると、ＣＤ３はＴ細胞の活性化を誘導する最初のシグナルとして、Ｔ細胞の細胞質基質へのシグナルの伝達に参加する。それは、Ｔ細胞抗原認識および免疫応答産生において極めて重要な役割を果たす。

【0006】

医学、特に腫瘍の免疫療法において、二重特異性抗体は、良好な作用および見込みを有し、腫瘍細胞および免疫細胞上の特異的抗原−抗免疫活性細胞ＣＤＩ６またはＣＤ３部分に同時に結合でき、ＮＫ細胞またはＴ細胞を活性化するとともに、抗腫瘍特異抗原部分は、腫瘍細胞に結合でき、免疫細胞を腫瘍細胞にターゲティングさせ、局所のＮＫ細胞またはＴ細胞濃度を増加させ、これにより、免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞を特異的に殺傷可能にされる。先行技術では、市販されているＥＧＦＲおよびＣＤ３二重特異性抗体医薬品は存在せず、この技術はまだ研究されていない。
中国特許ＣＮ２０１５１００３０５１９．９と比較して、本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体の生物学的活性を完全に保留するため、四価二重特異性抗体を使用する。四価二重特異性抗体は、二重特異性抗体の生物学的活性をより良く発揮するために、腫瘍抗原およびエフェクター細胞（Ｔ細胞およびＮＫ細胞など）をよりよく認識する。米国特許第９２４９２１７Ｂ２号は、ＳｃＦｖ−ＳｃＦｖ(ＢＩＴＥ）の形態を使用するが、ＢＩＴＥは二価で、Ｆｃ断片がない。ＢＩＴＥと比較して、本発明は四価抗体の利点に加えてＦｃ断片を含む。Ｆｃ断片はインビボでのエフェクター分子の半減期を延長でき、それによりエフェクター分子のインビボでの作用時間を延長できる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】中国特許ＣＮ２０１５１００３０５１９．９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は二重特異性抗体を提供する。この二重特異性抗体は抗ＥＦＧＲのＣ−端に抗ＣＤ３のＳｃＦｖ配列を増加し、この二重特異性抗体は抗ＥＧＦＲ抗体完全分子構造を保留するとともに、ＣＤ３抗原を結合する能力を増加させる。このようにして、インビボでの元のＥＧＦＲ抗体の生物学的活性を維持するだけでなく、２つの異なる抗原を特異的に認識し、免疫エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化し、それによって免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞を殺す効果を高める。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、
（ａ）インタクトなモノクローナル抗体、（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖおよび（ｃ）リンカーを含み、前記（ａ）はＥＧＦＲ抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなり、前記（ｂ）は免疫細胞抗原ＣＤ３に特異的に結合し、前記（ｂ）は２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖであり、前記（ｂ）は２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖであり、前記（ｂ）の２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖはそれぞれ前記（ｃ）リンカーｌｉｎｋｅｒを介して前記（ａ）の２つの抗体重鎖のＣ末端に連結される抗ＥＧＦＲと抗ＣＤ３の二重特異性抗体及びその応用を提供する。

【0010】

前記二重特異性抗体において、前記（ｃ）リンカーｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列は(ＧＧＧＧＸ)_ｎであり、ＸはＳｅｒまたはＡｌａを含み、Ｘは好ましくはＳｅｒであり、ｎは１〜４の自然数であり、ｎは好ましくは３である。

【0011】

前記二重特異性抗体（ａ）インタクトなモノクローナル抗体は２つの軽鎖と２つの重鎖とからなり、各重鎖と軽鎖の間はジスルフィド結合を介して連結され、２つの重鎖の間はヒンジ領域のジスルフィド結合を介して連結される。前記重鎖および軽鎖の可変領域は腫瘍細胞表面ＥＧＦＲ抗原に特異的に結合する。

【0012】

前記（ａ）インタクトなモノクローナル抗体の重鎖定常領域はｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３またはｌｇＧ４のうちの１種であり、好ましくはｌｇＧ２である。

【0013】

前記（ａ）インタクトなモノクローナル抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３のうちの１種であり、前記（ａ）インタクトなモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４、ＳＥＱ ＩＤＮＯ ５またはＳＥＱ ＩＤＮＯ ６のうちの１種である。前記（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８であり、前記（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９である。

【0014】

前記（ｂ）２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖのアミノ酸配列はいずれもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７である。

【0015】

各（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖは重鎖可変領域と、（ｃ）リンカーｌｉｎｋｅｒと軽鎖可変領域とからなり、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域に免疫細胞表面ＣＤ３抗原を特異的に結合し、前記（ｃ）リンカーｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列は(ＧＧＧＧＳ)_ｎであり、ｎは１〜４の自然数であり、好ましくは(ＧＧＧＧＳ)_３である。

【0016】

二重特異性抗体の発現ベクターを構築し、二重特異性抗体が一つのベクターに構築されられるか、または二つの異なるベクター上にそれぞれに構築されられる。

【0017】

遺伝子工学的方法によって構築されたベクターを宿主細胞にトランスフェクトされ、前記宿主細胞は、原核細胞、酵母または哺乳動物細胞を含み、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ0細胞または他の哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である。

【0018】

二重特異性抗体は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換、疎水性クロマトグラフィーまたはモレキュラーシーブ法を含む従来の免疫グロブリン法によって得られる。

【0019】

前記二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ高発現または異常発現の腫瘍組織の治療及び他のＥＧＦＲ過剰発現による病気の治療に用いられる。

【0020】

前記インタクトなモノクローナル抗体は全長抗体である。

【発明の効果】

【0021】

上記の技術的解決法が採用され、以下の有益な技術的効果を含む。
本発明の二重特異性抗体は、四価抗体の形態を採用し、腫瘍抗原に結合した抗体配列を完全に保留し、高い親和性を有する。同時に、四価二重特異性抗体は、腫瘍細胞とエフェクター細胞とをより良好に連結でき、それによって二重特異性抗体の生物学的機能を促進する。一般的に使用されるＢＩＴＥ二重特異性抗体形態に対して、本発明の分子はＦｃ断片も含み、Ｆｃ断片の存在はインビボでの薬物分子の半減期を延長し、それにより薬物分子のより良好な機能を発揮させ、患者の薬物使用頻度を低減可能にし、患者の苦しみを低減させる。本発明は高発現または異常発現ＥＧＦＲ腫瘍組織の治療、及び他のＥＧＦＲ過剰発現による病気の治療に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】二重特異性抗体の分子模式図である。

【図2】二重特異的分子プラスミド発現の構築図である。

【図3】精製二重特異性分子の変性ＳＤＳエレクトロフェログラムを例示的に示す図である。

【図4】抗原に対する二重特異性分子の結合能を検出するためのＥＬＩＳＡ法を例示的に示す図である。

【図5】Ａ４３１細胞に対する二重特異性抗体の結合を例示的に示す図である。

【図6】Ｊｕｋａｒｔ細胞に対する二重特異性抗体の結合を例示的に示す図である。

【図7】二重特異性抗体媒介によるＡ４３１に対するＰＢＭＣの結合を例示的に示す図である。

【図8】二重特異性抗体媒介によるＨ５２０に対するＰＢＭＣの死滅効果を例示的に示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、具体的な実施形態及び図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、（ａ）インタクトなモノクローナル抗体、（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖおよび（ｃ）リンカーを含み、前記（ａ）はＥＧＦＲ抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなり、前記（ｂ）は免疫細胞抗原ＣＤ３に特異的に結合し、前記（ｂ）は２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖであり、前記（ｂ）は２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖであり、前記（ｂ）の２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖはそれぞれ前記（ｃ）リンカーｌｉｎｋｅｒを介して前記（ａ）の２つの重鎖のＣ末端に連結される抗ＥＧＦＲと抗ＣＤ３の二重特異性抗体及びその応用を提供する。

【0024】

さらに好ましくは、前記二重特異性抗体において、前記（ｃ）リンカーｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列は(ＧＧＧＧＸ)_ｎであり、ＸはＳｅｒまたはＡｌａを含み、Ｘは好ましくはＳｅｒであり、ｎは１〜４の自然数であり、ｎは好ましくは３である。

【0025】

さらに好ましくは、前記二重特異性抗体（ａ）インタクトなモノクローナル抗体は２つの軽鎖と２つの重鎖とからなり、各重鎖と軽鎖の間はジスルフィド結合を介して連結され、２つの重鎖の間はヒンジ領域のジスルフィド結合を介して連結される。前記重鎖および軽鎖の可変領域は腫瘍細胞表面ＥＧＦＲ抗原に特異的に結合する。

【0026】

さらに好ましくは、前記（ａ）インタクトなモノクローナル抗体の重鎖定常領域はｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３またはｌｇＧ４のうちの１種であり、好ましくはｌｇＧ２である。

【0027】

さらに好ましくは、前記（ａ）インタクトなモノクローナル抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３のうちの１種である。

【0028】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １(ニモツズマブモノクローナル抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＩＹＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＮＰＴＳＧＧＳＮＦＮＥＫＦＫＴＫＡＴＬＴＶＤＥＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＱＧＬＷＦＤＳＤＧＲＧＦＤＦＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ。

【0029】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２(セツキシマブモノクローナル抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列）：
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ。

【0030】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３（パニツムマブモノクローナル抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ。
前記（ａ）インタクトなモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６ののうちの１種である。

【0031】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４(ニモツズマブモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列）：
ＤＶＬＭＴＱＩＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＮＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＲＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＹＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ。

【0032】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５(セツキシマブモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列）：
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。

【0033】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６(パニツムマブモノクローナル抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＨＦＤＨＬＰＬＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。

【0034】

さらに好ましくは、前記（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８であり、前記（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９である。

【0035】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ８(抗ＣＤ３一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列）：
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ。

【0036】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９(抗ＣＤ３一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列）：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。

【0037】

さらに好ましくは、前記（ｂ）２つの一本鎖抗体ＳｃＦｖのアミノ酸配列はいずれもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７である。

【0038】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７(抗ＣＤ３一本鎖抗体アミノ酸配列）：
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。

【0039】

さらに好ましくは、各（ｂ）一本鎖抗体ＳｃＦｖは重鎖可変領域と、（ｃ）リンカーｌｉｎｋｅｒと軽鎖可変領域とからなり、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は免疫細胞表面ＣＤ３抗原に特異的に結合し、前記（ｃ）リンカーｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列は(ＧＧＧＧＳ)_ｎであり、ｎは１〜４の自然数であり、好ましくは(ＧＧＧＧＳ)_３である。
さらに好ましくは、構築されたベクターを宿主細胞にトランスフェクトされ、前記宿主細胞は、原核細胞、酵母または哺乳動物細胞を含み、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ0細胞または他の哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である。

【0040】

さらに好ましくは、前記二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ高発現または異常発現の腫瘍組織の治療及び他のＥＧＦＲ過剰発現による病気の治療に用いられる。

【0041】

実施例１、二重特異性抗体分子の発現ベクターの構築
ａ）二重特異性一過性発現ベクターの構築
対応する遺伝子配列を、図１の二重特異性抗体の形態で設計した。抗ＥＧＦＲ軽鎖遺伝子および抗ＥＧＦＲ重鎖ＣＤ３のＳｃＦＶ融合遺伝子をクローニングし発現するための発現ベクターとしてＰＴＳＥを選択した。軽鎖遺伝子および融合遺伝子はコード領域配列両側にそれぞれＳａll、ＢａｍＨl酵素切断部位を付加し、２つの遺伝子を中美泰和生物技術（北京）有限公司によって合成し、ＰＵＣ１９ベクターにクローニングした。２つのプラスミドは、ＴＯＰコンピテント状態（匯天東方、シリアル番号ＨＴ７０２−０３）にそれぞれ転換し、康為世紀小型抽出キット（シリアル番号ＣＷ０５００）で小型抽出してからベクターと共にそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＳａll−ＨＦおよびＢａｍＨＩ−ＨＦで消化して、相同組換えが実施され、軽鎖および融合遺伝子を含む発現ベクター（図２Ａおよび図２Ｂに示される概略図）を取得した。プラスミドはそれぞれＰＴＳＥ−ＪＹ０１６Ｌ−ＴｅｔＢｉＡｂ、ＰＴＳＥ−ＪＹ０１６Ｈ−ＴｅｔＢｉＡｂと命名される。
ｂ）二重特異性の安定発現ベクターの構築

【0042】

抗ＥＧＦＲ軽鎖遺伝子および抗ＥＧＦＲ重鎖ＣＤ３のＳｃＦＶ融合遺伝子をクローニングし発現するための発現ベクターとしてＰＧＮ−２ＣＭＶを選択した。このベクターは、選択マーカーＮｅｏｍｙｃｉｎおよびＧＳを含み、また、２つのＧＭＶプロモーターおよび対応する構造単位を含む。軽鎖及び融合遺伝子のプライマーを設計し、Ｋｏｚａｋ配列、シグナルペプチド及び対応する酵素切断部位を導入し、中美泰和生物技術（北京）有限公司によって合成する。プラスミドＰＴＳＥ−ＪＹ０１６Ｌ−ＴｅｔＢｉＡｂ、ＰＴＳＥ−ＪＹ０１６Ｈ−ＴｅｔＢｉＡｂをテンプレートとし、ＰＣＲで対応するストリップを増幅し、ベクターと共に相同組換えを実施する（プラスミドスペクトラムは図２Ｃを参照）。

【0043】

実施例２、二重特異性抗体分子の発現と精製
ａ）四価抗体の発現
プラスミドをエンドトキシンフリー大型抽出キット（康為世紀、ＣＷ２１０４）で抽出し、キットによって提供される説明書に従って特定のステップを実施した。

【0044】

ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３ＥＳサスペンションセル）をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ(Ｇｉｂｃｏ、１２３３８−０２６）で培養し、細胞は1日または２日おきに継代され、継代された細胞の開始密度は０．２〜０．６×１０^６／ｍｌに維持し、細胞培養体積はシェイクボトル容積の１５〜３５％であり、細胞培養瓶をシェーカー（シェーカーの回転速度は１３５ｒｐｍとなり、温度は３７°Ｃとなり、ＣＯ_２は５％となる）に置い培養させる。トランスフェクションの前日、対数増殖期にあり、増殖状態が良好なＨＥＫ２９３ＥＳ細胞を、細胞密度０．５×１０^６／ｍｌまでに継代させ、シェーカー（１３５ｒｐｍ、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２）で培養し、第二日でトランスフェクションを行う。

【0045】

トランスフェクション前に、準備した１×１０^６／ｍｌ細胞サスペンションをシェーカー（１３５ｒｐｍ、３９°Ｃ、５％ＣＯ_２）２ｈ培養し、トランスフェクション時、順にＰＴＳＥ−ａｎｔｉＥＧＦＲ−Ｈ−ＴｅｔＢｉＡｂ(最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）、ＰＴＳＥ−ａｎｔｉＥＧＦＲ−Ｌ(最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）、ポリエチレンイミンＰＥＩ(Ｓｉｇｍａ）(最終濃度２ｕｇ／ｍｌ）を加入し、均一に混合し、一緒にＨＥＫ２９３ＥＳサスペンションセルにトランスフェクションし、その後、シェーカー（１３５ｒｐｍ、３９°Ｃ、５％ＣＯ_２）で４０ｍｉｎ培養した。トランスフェクション後の細胞は続いて１３５ｒｐｍ、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２のシェーカーで培養し、抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３の四価抗体が発現した。トランスフェクションの９６時間後、発現上清を遠心分離によって集めた。

【0046】

ｂ）四価二重特異性抗体の精製
発現上清を０．２２ｕＭ濾過フィルムで濾過し、アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて発現上清からＦｃドメインを有する抗体を取得する。平衡緩衝液および溶出緩衝液はそれぞれ５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ ＰＨ７．０および０．１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウムＰＨ３．０である。陽イオン交換クロマトグラフィーにより標的二重特異性抗体を取得し、陽イオン交換カラムはＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦであり、平衡緩衝液２０ｍＭ ＰＢ ＰＨ６．３でＳＰクロマトグラフィーカラムを平衡させ、溶出緩衝液２０ｍＭ ＰＢ＋１Ｍ ＮａＣｌ（ＰＨ６．３）で溶出し、最後に、ＰＢＳ緩衝液で液体交換及び濃縮を行う。精製後の二重特異的分子還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは図３に示す。Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ−１のＥＧＦＲ抗体配列はニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）配列であり、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ−２のＥＧＦＲ抗体配列はセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）；Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ−３のＥＧＦＲ抗体配列はパニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）である。

【0047】

実施例３:二重特異性抗体分子とＣＤ３、ＥＧＦＲ分子との結合状況
ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液でＥＧＦＲ細胞外領域またはＣＤ３ＥとＣＤ３Ｇサブユニットとの細胞外領域の二量体をコーティングし、１００ｎｇ／孔／１００ｕｌで、４°Ｃでコーティングして一夜を置いた。３００ｕｌ／孔 ０．１％のＰＢＳ(ＰＢＳ−Ｔ）緩衝液で５回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加入して室温で２ｈ密封した。異なる希釈度の二重特異性抗体または対応する抗体を加入した。二重特異性抗体（または抗体）最高濃度は１ｕＭであり、３倍希釈して１０つのグラジエントになり、最後１つの孔に希釈液ＰＢＳのみをいれて陰性対照とし、３７°Ｃで１ｈインキュベートした。３００ｕｌ／孔に従ってＰＢＳ−Ｔ溶液で５回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１:４００００希釈されたＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｆｃ−ＨＲＰ第二抗を加入して３７°Ｃで１ｈインキュベートした。１００ｕｌ／孔のＴＭＢ現像キットで現像し、室温で８ｍｉｎ現像し、そして、２Ｍ Ｈ_２Ｓ０_４で現像を終了させ、５０ｕｌ／孔、４５０ｎｍ／６３０ｎｍで数を読む。実験結果は図４に示すように、すべての二重特異性抗体のＥＧＦＲとの結合能力はいずれもその対応する単一抗体能力に類似する。［即ち、ニモツズマブ単一抗体配列により構築される二重特異性抗体のＥＧＦＲとの結合能力はニモツズマブ単一抗体の能力に類似する（図４Ａ）。セツキシマブ単一抗体配列により構築される二重特異性抗体のＥＧＦＲとの結合能力はセツキシマブ単一抗体の能力に類似する（図４Ｂ）。パニツムマブ単一抗体配列により構築される二重特異性抗体のＥＧＦＲとの結合能力はパニツムマブ単一抗体の能力に類似する（図４Ｃ）］。各二重特異性抗体のＣＤ３ＥおよびＣＤ３Ｇ二量体との結合能力が類似する（図４Ｄ）。結果によって、用いた二重特異性抗体の形態は抗原に対する元の抗体の結合能力を完全に保持したことを示す。かつ、ＣＤ３のＳｃＦｖのＣＤ３に対する結合能力はそれに連結する異なる抗体には関わらない(図４Ｄ）。

【0048】

実施例４、二重特異性抗体分子と過剰発現ＥＧＦＲまたはＣＤ３細胞との結合状況
ａ）二重特異性抗体与Ａ４３１細胞の結合状況
本発明は過剰発現ＥＧＦＲの腫瘍細胞系（Ａ４３１）により異なる二重特異性抗体と細胞表面ＥＧＦＲの結合状況を検出し、陽性対照として対応する抗体を用い、同型対照として人のＩｇＧ(ｈｌｇＧ）を用いた。０．２５％トリプシンで消化、遠心してＡ４３１細胞を収集した。同時に各抗体を希釈させ、最高濃度は１ｕＭであり、３倍グラジエントで希釈した。収集した細胞をＰＢＳ＋１％ＢＳＡで３回洗浄し、そしてＰＢＳ＋１％ＢＳＡを加入して細胞を再懸濁し、細胞を９６孔板に置き、孔ごとに１×１０^５の細胞があり、希釈した１００ｕｌの二重特異性抗体を加入し、室温で１時間インキュベートした。遠心で上清を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして希釈した、Ａｌｅｘａ４８８でマークした抗人ＩｇＧ−Ｆｃ抗体で細胞を再懸濁し、室温で遮光して１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、そして１００ｕｌＰＢＳで再懸濁して、フローサイトメトリーにより蛍光強度を検出した。結果をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍで分析した。結果により（図５を参照）、各二重特異性抗体とＡ４３１との結合能力と、対応する抗体との間に比較可能性を有するが、ｈｌｇＧとＡ４３１との結合力が弱いことを示す。二重特異性抗体がその母本抗体の細胞表面ＥＧＦＲに特異結合する特異結合活性を保持することを証明した。

【0049】

ｂ）二重特異性抗体とＪｕｒｋａｔ細胞との結合状況
Ｊｕｒｋａｔ細胞がＣＤ３を過剰発現するので、二重特異性抗体と細胞表面ＣＤ３の結合状況を検出することに用いられる。二重特異性抗体とＪｕｒｋａｔ細胞との結合状況の実験工程は実施例４ａに類似し、その相違点はＪｕｒｋａｔ細胞がサスペンションセルであるが、Ａ４３１が接着細胞である。遠心してＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、各抗体を加入し、そのほかの操作はＡ４３１実験に同一である。結果により（図６を参照）、同型対照のＪｕｒｋａｔに対する結合能力が弱く、異なる二重特異性抗体はいずれも細胞によく結合でき、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する３種類の二重特異性抗体の結合能力が同一であり、図１においての二重特異性抗体の抗ＣＤ３のＳｃＦｖの細胞表面抗原に対する結合能力がそれに連結する抗体に影響されないことを示す。

【0050】

実施例５、エフェクター細胞に対する二重特異性抗体分子媒介のＰＢＭＣの死滅作用
ａ）Ａ４３１またはＨ５２０細胞に対するＰＫＨ２６マーキング
Ａ４３１はＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞株であるが、Ｈ５２０はＥＧＦＲを発現しない。本実験は実験細胞株としてＡ４３１を用い、陰性対照としてＨ５２０を用いる。
２×１０^６つの細胞を１．５ｍｌ遠心管に入れて、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、完全培地を捨てて、無血清培地で細胞を２回洗浄する。ＰＫＨ２６キット中のＤｉｌｕｅｎｔＣ溶液で細胞を再懸濁し、そして等体積の２×Ｐ ＫＨ２６染料液（調製割合：０．４μｌ染料原液を１００μｌのＤｉｌｕｅｎｔＣに溶解させる）を入れて、均一に混合して室温で１ｍｉｎを置く。反応後、管中溶液の体積と等体積の０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を入れて反応を終了させ、そして１ｍｌの対応する完全培養基を入れて細胞を希釈し再懸濁させ、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心して細胞沈殿を収集する。完全培養基で再懸濁した後、細胞培養瓶で培養する。

【0051】

ｂ）ＰＢＭＣ分離
５０ｍｌ管に２０ｍｌ単核細胞分離液を入れる。収集した血液を全血希釈液で１:１で希釈処理し、均一に混合してコーニングチューブ内壁に沿って均一速度で徐々に分離液上層に敷き、各管内に希釈後２０ｍｌ全血を入れる。各管に液の入れが終わった後、２２°Ｃまでに予め冷めた遠心機内に置き、６００ｇで１５ｍｉｎ水平遠心(速度加減を１とする）した。遠心完成後、遠心管を取り出し、ピペットで分離液と血清との間に存在する、円弧状に分布した細胞層である単核細胞(ＰＢＭＣ）を吸い取り、新たな５０ｍｌ管に置いた。１:５の割合で細胞液に細胞洗浄液を入れて、均一に混合して遠心し、上清を捨て、再び１回洗浄し、細胞沈殿を収集し、ＲＰＭＩ−１６４０培養基で再懸濁し、細胞瓶に培養して置いた。

【0052】

ｃ）ＧＤ３＋Ｔ細胞磁気ビーズソーティング
ＰＢＳ(Ｐｈ７．２、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭＥＤＴＡ）は、濾過除菌して、同時に泡の発生を避ける。
遠心で血小板（２０℃、２００ｇ、１０〜１５分間）を除去し、３０μｍ濾過フィルムで細胞ペレットを除去した。２００ｇで１０分間遠心し、上清を捨てて、ＰＢＭＣ細胞を収集した。２×１０^７細胞を６０μｌ ｂｕｆｆｅｒ＋２０μｌＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔに再懸濁させる。２０μｌ磁気ビーズを入れて、均一に混合し、２〜８°Ｃで１５分間インキュベートし、１〜２ｍｌ ｂｕｆｆｅｒを入れ、３００ｇで、１０分間遠心し、上清を捨てた。５００μｌで再懸濁した。ソーティング柱をソーティングラックに置き、５００μｌで洗浄した。細胞サスペンションを入れて、未結合細胞を収集した。柱体頂端液体が流れ尽きた後、５００μｌで３回洗浄した。ソーティング柱をソーティングラックから取り除き、収集管に置き、１ｍｌで早速洗浄し、細胞を収集し、カウントして活細胞の割合を観察した。

【0053】

ｄ）二重特異性抗体の効果及び機能の検出
最終濃度１ｕＭから、１:３倍で希釈し、１０グラジエントで、２つの重複孔を設立する。同時に、２つの無薬物対照孔を設立し、培養基で体積を補足し、マークした後のＡ４３１またはＨ５２０細胞（２×１０^４個／孔／５０μｌ）とＣＤ３＋Ｔ細胞（２×１０^５個／孔／５０μｌ）を、必要量で均一に混合してＶ−ｂｏｔｔｏｍ９６孔板各孔に分け、同時に、（１）無マークのＲａｊｉ細胞（２×１０^４個／孔）（２）ＰＫＨ２６マーク後の細胞（２×１０^４個／孔）；（３）ＣＤ３＋Ｔ細胞（２×１０^５個／孔）という３つの流式対照孔を設立した。１８時間培養し、インキュベート終了後、１:５００００の割合でＴ０−ＰＲ０３染料を入れ、３７°Ｃで遮光して１０ｍｉｎインキュベートした。同時に、流式対照（４）Ｔ０−ＰＲ０３マーク後の細胞を設立した。３０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した後、培養基上清の一部を捨て、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で再懸濁し、流式検出した。
算出公式は、
細胞死亡率％＝(１−ＰＫＨ２６^＋ＴＯＰＲＯ３⁻細胞数（薬物作用組）／ＰＫＨ２６^＋ＴＯＰＲＯ３⁻細胞数（無薬物作用組））×１００となる。

【0054】

ｅ）結果分析
図７によれば、二重特異性抗体分子媒介によるＰＢＭＣのＥＧＦＲ過剰発現のＡ４３１エフェクター細胞に対する死滅作用が非常によいが、対応する抗体とｈｌｇＧに対する死滅効果が弱いことがわかった。同時に、全ての二重特異性抗体はＥＧＦＲを発現しないＨ５２０細胞に対する死滅効果が非常に弱く、且つ同型対照ｈｌｇＧに類似（図８）する。すべての構築した二重特異性抗体のターゲット細胞に対する死滅作用が特異的であることを示した。３種類の異なる二重特異性抗体が特異的なターゲット細胞を死滅する能力は類似し、かつ細胞死亡率は８０％左右にある。以上は図１においての二重特異性抗体がよい生物学活性を有することを示した。

【0055】

以上の説明は、本発明の好適な実施の形態に過ぎず、本発明を限定するものではなく、本発明に対して種々の変形や変更が可能である。本発明の精神および範囲内でなされる任意の修正、均等な置換、改善などは、本発明の範囲内に含まれることが意図される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]