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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6821947
(24)【登録日】2021年1月12日
(45)【発行日】2021年1月27日
(54)【発明の名称】粒子の収容方法、及び、粒子の封入方法
(51)【国際特許分類】
G01N 35/10 20060101AFI20210114BHJP
【ＦＩ】
G01N35/10 Z
【請求項の数】8
【全頁数】21
(21)【出願番号】特願2016-91896(P2016-91896)
(22)【出願日】2016年4月28日
(65)【公開番号】特開2017-198626(P2017-198626A)
(43)【公開日】2017年11月2日
【審査請求日】2019年3月14日
(73)【特許権者】
【識別番号】000003193
【氏名又は名称】凸版印刷株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100139686
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 史朗
(74)【代理人】
【識別番号】100169764
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(74)【代理人】
【識別番号】100064908
【弁理士】
【氏名又は名称】志賀 正武
(74)【代理人】
【識別番号】100108578
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 詔男
(74)【代理人】
【識別番号】100152146
【弁理士】
【氏名又は名称】伏見 俊介
(72)【発明者】
【氏名】堀内 陽介
【審査官】
萩田 裕介
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１２／１２１３１０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２０１４−５０３８３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００９−１０９２１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１１−５２５８１０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３５／００ − ３７／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のウェルが開口するマイクロウェルアレイと、前記マイクロウェルアレイ上に流路を形成するように配置され、第一貫通孔および第二貫通孔を有する蓋部材と、を備えるマイクロ流体デバイスに粒子を収容する粒子の収容方法であって、
溶媒流体、多数の粒子及び検出試薬を含む粒子含有流体を前記第一貫通孔から注入し、前記流路および前記ウェル内に満たした上で前記第二貫通孔に到達させる注入工程と、
前記注入工程の後に、前記第二貫通孔内に前記粒子含有流体を残しつつ前記第一貫通孔から前記粒子含有流体を吸い上げる吸い上げ工程と、
を含み、
前記溶媒流体が液体である、
粒子の収容方法。
溶媒流体、多数の粒子及び検出試薬を含む粒子含有流体を前記第一貫通孔から注入し、前記流路および前記ウェル内に満たした上で前記第二貫通孔に到達させる注入工程と、
前記注入工程の後に、前記第二貫通孔内に前記粒子含有流体を残しつつ前記第一貫通孔から前記粒子含有流体を吸い上げる吸い上げ工程と、
を含み、
前記溶媒流体が液体である、
粒子の収容方法。
【請求項2】
前記粒子の比重が、前記溶媒流体の比重と異なる請求項１に記載の粒子の収容方法。
【請求項3】
前記吸い上げ工程の後に、所定時間静置する請求項２に記載の粒子の収容方法。
【請求項4】
前記吸い上げ工程の後に、前記粒子が前記ウェルに向かうように遠心力を付与する請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の粒子の収容方法。
【請求項5】
前記粒子が磁性を有し、
前記粒子が前記ウェルに向かうように磁力を付与する磁力付与工程をさらに含む、
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の粒子の収容方法。
前記粒子が前記ウェルに向かうように磁力を付与する磁力付与工程をさらに含む、
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の粒子の収容方法。
【請求項6】
前記溶媒流体を液体とし、
前記流路において前記粒子含有流体を流す流速を、０．４ｍｍ／ｓｅｃ以上２５ｍｍ／ｓｅｃ以下とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の粒子の収容方法。
前記流路において前記粒子含有流体を流す流速を、０．４ｍｍ／ｓｅｃ以上２５ｍｍ／ｓｅｃ以下とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の粒子の収容方法。
【請求項7】
前記ウェルが開口する面に直交する方向における前記流路の高さ寸法が、前記粒子の直径の１倍よりも大きく１００倍以下である請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の粒子の収容方法。
【請求項8】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の粒子の収容方法の後に、液体である前記溶媒流体を含む前記粒子含有流体と混ざり合わない封止液を前記流路に流して、前記粒子含有流体の上層に封止液の層を形成させ、前記粒子を前記溶媒流体及び前記検出試薬と共に前記ウェルに封入する粒子の封入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、粒子をウェルに収容する粒子の収容方法、及び、粒子をウェルに封入する粒子の封入方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、患者の血液等の体液に含まれるバイオマーカー（例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、タンパク質など）を検出することで、がんやアルツハイマー、その他の遺伝子疾患などの病気や細菌などによる感染症などを診断する方法（リキッドバイオプシー）が注目されている。
【0003】
バイオマーカーを測定する方法としては、デジタルＥＬＩＳＡ、デジタルＰＣＲ、デジタルインベーダーなどのように、デジタルカウント法を用いたバイオマーカーの定量方法がある。デジタルカウント法とは、バイオマーカーを多数の微細（例えば数μｍサイズ）なウェルにひとつずつ分けて、バイオマーカーが入っているウェルを数えることで、バイオマーカーの濃度を調べる手法である。
【0004】
デジタルカウント法には、バイオマーカーであるターゲット物質（検出対象）を粒子に結合させ、多数の粒子を多数のウェルに封入した上で、ターゲット物質の数（ターゲット物質が入っているウェルの数）を検出する方法がある。
【0005】
特許文献１には、ターゲット物質を磁性ビーズ（粒子）に結合させた上で、多数の磁性ビーズを含むサンプル流体を、多数の微細なウェルが開口するチャンネル（流路）において流すことにより、多数のウェルに磁性ビーズを収容することが開示されている。また、特許文献１には、磁性ビーズをウェルに収容した後に、蛍光発生基質（ＲＧＰ）等の試薬流体（検出試薬）をチャンネルに供給することが記載されている。試薬流体は、ターゲット物質と反応することで蛍光現象を発生する酵素などであり、ターゲット物質が入っているウェルを数えるために用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特表２０１４−５０３８３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、特許文献１に記載された方法では、粒子をウェルに収容した後に検出試薬を供給するため、ウェルに収容された粒子に検出試薬が到達しない可能性がある。この場合、ウェル内の検出対象と反応せず、検出対象が入っているウェルの数を正確に数えることができない可能性があり、好ましくない。また、粒子を用いたデジタルカウント法では、より多くのウェルに粒子を効率よく収容することが求められている。
【0008】
本発明は、上述した事情に鑑みたものであって、より多くのウェルに粒子を効率よく収容でき、かつ、検出試薬をウェル内に収容された粒子に結合した検出対象と確実に反応させることが可能な粒子の収容方法、及び、粒子の封入方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の第一態様は、複数のウェルが開口するマイクロウェルアレイと、マイクロウェルアレイ上に流路を形成するように配置され、第一貫通孔および第二貫通孔を有する蓋部材と、を備えるマイクロ流体デバイスに粒子を収容する粒子の収容方法である。この収容方法は、溶媒流体、多数の粒子及び検出試薬を含む粒子含有流体を第一貫通孔から注入し、流路およびウェル内に満たした上で第二貫通孔に到達させる注入工程と、注入工程の後に、第二貫通孔内に粒子含有流体を残しつつ第一貫通孔から粒子含有流体を吸い上げる吸い上げ工程とを含む。溶媒流体は液体である。
【0010】
前記粒子の比重は、前記溶媒流体の比重と異なってもよい。
【0011】
前記吸い上げ工程の後に、所定時間静置してもよい。
【0012】
前記吸い上げ工程の後に、前記粒子が前記ウェルに向かうように遠心力を付与してもよい。
【0013】
前記粒子が磁性を有し、前記粒子が前記ウェルに向かうように磁力を付与する磁力付与工程をさらに含んでもよい。
【0014】
前記溶媒流体を液体とし、前記流路において前記粒子含有流体を流す流速を、０．４ｍｍ／ｓｅｃ以上２５ｍｍ／ｓｅｃ以下としてもよい。
【0015】
前記ウェルが開口する面に直交する方向における前記流路の高さ寸法は、前記粒子の直径の１倍よりも大きく１００倍以下であってもよい。
【0016】
本発明の第二態様は、前記粒子の収容方法の後に、液体である前記溶媒流体を含む前記粒子含有流体と混ざり合わない封止液を前記流路に流して、前記粒子含有流体の上層に封止液の層を形成させ、前記粒子を前記溶媒流体及び前記検出試薬と共に前記ウェルに封入する粒子の封入方法である。
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、粒子含有流体をウェル上の流路において２回以上流すことで、より多くのウェルに粒子を効率よく収容できる。また、粒子含有流体が検出試薬を含むことで、粒子がウェルに収容されると同時に検出試薬もウェルに収容される。このため、粒子に結合した検出対象と検出試薬とを確実に反応させることができる。すなわち、検出対象を確実に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】本発明の一実施形態に係る粒子の収容方法及び封入方法に用いるマイクロ流体デバイスの一例を示す斜視図である。
【図5】本発明の一実施形態に係る粒子の収容方法を説明するための図である。
【図6】本発明の一実施形態に係る粒子の収容方法を説明するための図である。
【図7】本発明の一実施形態に係る粒子の収容方法を説明するための図である。
【図8】本発明の一実施形態に係る粒子の収容方法を説明するための図である。
【図9】本発明の一実施形態に係る粒子の収容方法を説明するための図である。
【図10】本発明の一実施形態に係る粒子の収容方法を説明するための図である。
【図11】本発明の一実施形態に係る粒子の封入方法を説明するための図である。
【図12】本発明の一実施形態に係る粒子の封入方法を説明するための図である。
【図13】粒子の収容方法の検討１に関する実施例１の撮影画像である。
【図14】粒子の収容方法の検討１に関する比較例１の撮影画像である。
【図15】粒子の収容方法の検討１に関する比較例２の撮影画像である。
【図16】粒子の収容方法の検討１に関する比較例３の撮影画像である。
【図17】粒子の収容方法の検討１に関する実験結果を示す表である。
【図18】粒子の収容方法の検討２に関し、粒子含有流体を１回流した場合の撮影画像である。
【図19】粒子の収容方法の検討２に関し、粒子含有流体を３回流した場合の撮影画像である。
【図20】粒子の収容方法の検討２に関し、粒子含有流体を５回流した場合の撮影画像である。
【図21】粒子の収容方法の検討２に関し、粒子含有流体を７回流した場合の撮影画像である。
【図22】粒子の収容方法の検討２に関し、粒子含有流体を９回流した場合の撮影画像である。
【図23】粒子の収容方法の検討２に関する実験結果を示すグラフである。
【図24】粒子の収容方法の検討２に関する実験結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
〔マイクロ流体デバイス〕はじめに、本実施形態に係る粒子の収容方法及び封入方法に用いるマイクロ流体デバイスについて説明する。
図１，２に示すように、マイクロ流体デバイス１は、流路２と、流路２に開口する複数のウェル３とを有する。本実施形態のマイクロ流体デバイス１は、複数のウェル３を有するマイクロウェルアレイ４と、マイクロウェルアレイ４と共に流路２を構成する蓋部材５と、を備えている。
【0021】
マイクロウェルアレイ４の複数のウェル３は、図３（ａ）に例示するように、アレイ状に配列されている。複数のウェル３が開口するマイクロウェルアレイ４の面（開口面６）は平坦となっている。複数のウェル３は、例えばマイクロウェルアレイ４の開口面６全体に形成されてもよいが、本実施形態では、図４に例示するように、マイクロウェルアレイ４の開口面６のうち周縁領域７を除く領域（ウェル形成領域８）に形成されている。ウェル形成領域８の周縁形状は任意であってよいが、本実施形態では長方形となっている。
【0022】
図３に例示するように、各ウェル３は、有底の穴であり、後述する粒子含有流体２０に含まれる粒子２１（図７等参照）を少なくとも１個以上収容可能である。ウェル３の形状は、任意であってよく、例えば円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であってもよい。逆円錐形、逆角錐形とは、円錐や角錐の底面がウェル３の開口部となるようなウェル３の形状を意味する。ウェル３の形状が逆円錐形、逆角錐形である場合には、例えば円錐や角錐の頂部を切り取り、ウェル３の底面９を平坦にしてもよい。他の例として、ウェル３の底面９を、ウェル３の開口部に向けて凸または凹となる曲面状に形成してもよい。
ウェル３の形状は、例えば上述の形状を二つ以上組み合わせたような形状であってもよい。例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。
【0023】
ウェル３の形状が円筒形である場合、ウェル３の直径は、例えば０．１μｍ〜１００μｍ、好ましくは１μｍ〜１０μｍの範囲で設定することができる。ウェル３の直径が０．１μｍ（又は１μｍ）よりも小さいと、ウェル３に収容される粒子２１の直径も０．１μｍ（又は１μｍ）よりも小さくする必要がある。この場合には、粒子２１がウェル３に収容されている様子を光学的に観察し難しくなってしまう。すなわち、ウェル３の直径が０．１μｍ（又は１μｍ）以上であれば、粒子２１がウェル３に収容されている様子を光学的に観察しやすくなる程度に、粒子２１の直径を設定できる。
ウェル３の直径が１００μｍ（又は１０μｍ）よりも大きいと、ウェル３の体積が過度に大きくなってしまう。その結果、デジタルカウント法でバイオマーカーなどの検出対象の有無を検出する際、蛍光などのシグナルが小さくなってしまう。また、ウェル３内でシグナルを発生させるための化学反応が遅くなるなどのデメリットも発生してしまう。すなわち、ウェル３の直径が１００μｍ（又は１０μｍ）以下であれば、検出対象の有無を検出するためのシグナルを十分な大きさとすることができる。また、ウェル３内でシグナルを発生させるための化学反応が遅くなることを好適に抑制できる。
【0024】
マイクロウェルアレイ４は、光を通すように構成されてもよいが、これに限ることはない。マイクロウェルアレイ４を構成する材料は、ウェル３（特にウェル３の内面）に求める特性を考慮し、親水性材料又は疎水性材料の何れかを選択すればよい。マイクロウェルアレイ４を構成する材料としては、例えばガラス、樹脂、金属の少なくとも１つ、又は、複数を混合した材料が挙げられる。以下、本実施形態のマイクロウェルアレイ４の構成について、より具体的に説明する。
【0025】
本実施形態のマイクロウェルアレイ４は、図２，３に示すように、板状の底部層１１と、底部層１１上に重ねて形成された板状の壁部層１２とを備える。底部層１１のうち壁部層１２が配置される面は、ウェル３の底面９を構成する。底部層１１には、例えばガラスや樹脂を用いることができる。
壁部層１２は、その厚さ方向に貫通し、厚さ方向から見てアレイ状に配列された複数の孔部を有する。各孔部の内面は、ウェル３の内周面１０を構成する。壁部層１２には、例えば樹脂を用いることができる。
【0026】
底部層１１及び壁部層１２は、図２，３に例示するように別個に形成されてもよいし、例えば樹脂の射出成形等によって一体に形成されてもよい。マイクロウェルアレイ４のウェル３は、例えばフォトリソグラフィを使って形成されてもよいし、上記した射出成形等の際に同時に形成されてもよい。
【0027】
図１，２に示すように、蓋部材５は、板状又はシート状に形成された部材であり、マイクロウェルアレイ４の開口面６に対向して配置されている。マイクロウェルアレイ４と蓋部材５との間には隙間が存在する。この隙間は、複数のウェル３が開口するマイクロ流体デバイス１の流路２として機能する。
【0028】
蓋部材５は、その厚さ方向に貫通する複数の貫通孔１５を有する。各貫通孔１５は、マイクロ流体デバイス１の流路２に連通し、流路２内に流体を供給する入口や、流体を排出する出口として機能する。本実施形態において、蓋部材５は二つの貫通孔１５Ａ，１５Ｂ（第一貫通孔１５Ａ及び第二貫通孔１５Ｂ）を有する。二つの貫通孔１５Ａ，１５Ｂは、長方形とされたウェル形成領域８のうち互いに向かい合う二つの角部に対応する位置に配されている。
【0029】
本実施形態において、各貫通孔１５は、小孔部１６と、貫通方向から見た大きさが小孔部１６よりも大きな大孔部１７とを有する。小孔部１６と大孔部１７とは、貫通孔１５の貫通方向に並んでいる。小孔部１６は、マイクロ流体デバイス１の流路２側に開口する貫通孔１５の開口端を構成している。大孔部１７は、マイクロ流体デバイス１の流路２と反対側に開口する貫通孔１５の開口端を構成している。大孔部１７は、例えばマイクロ流体デバイス１の流路２から溢れた流体（後述の粒子含有流体２０等）を貯留する流体貯留部として機能する。上記した複数の貫通孔１５は、例えば同じ形状、大きさに形成されてもよし、互いに異なる形状、大きさに形成されてもよい。
【0030】
蓋部材５は、例えば光を通すように構成されてもよいが、これに限ることはない。例えば、ウェル３に収容された粒子２１や、バイオマーカー等の検出対象が存在することによる蛍光などのシグナルを光学的手法で検出する場合には、蓋部材５及び前述のマイクロウェルアレイ４の少なくとも一方が、光を通すように構成されているとよい。また、ウェル３に収容された粒子２１や、バイオマーカー等の検出対象が存在することによる蛍光などのシグナルを光学的手法以外の手法で検出する場合には、蓋部材５及びマイクロウェルアレイ４は、例えば光を通すように構成されなくてもよい。
蓋部材５を構成する材料としては、例えばガラス、樹脂、金属のうち少なくとも１つ、又は、複数を混合した材料が挙げられる。蓋部材５は、粒子含有流体２０等が流路２において流れる際に変形しない程度の剛性を有してもよい。
【0031】
本実施形態のマイクロ流体デバイス１は、マイクロウェルアレイ４と蓋部材５との間に介在し、マイクロウェルアレイ４のウェル形成領域８を囲むスペーサ１８を備える。スペーサ１８は、前述したマイクロウェルアレイ４と蓋部材５との隙間を確保し、マイクロウェルアレイ４及び蓋部材５と共にマイクロ流体デバイス１の流路２を構成する。スペーサ１８は、例えば前述のマイクロウェルアレイ４や蓋部材５と一体に形成されてもよいが、本実施形態では別個に形成されている。スペーサ１８の材質等に特に制限はないが、例えばシリコーンゴムやアクリル発泡体からなる芯材フィルムの両面に粘着剤（例えばアクリル系粘着剤）が積層された両面粘着テープ、接着剤を両面に塗布した紙等が挙げられる。
【0032】
ウェル３が開口するマイクロウェルアレイ４の開口面６に直交する方向における流路２の高さ寸法（マイクロウェルアレイ４と蓋部材５との隙間寸法）は、上記したスペーサ１８によって設定される。本実施形態において、流路２の高さ寸法は、後述する粒子２１の直径の１倍よりも大きく１００倍以下とすることができる。流路２の高さ寸法が粒子２１の直径の１倍よりも小さいと、粒子２１を流路２においてスムーズに流すことが難しくなってしまう。一方、流路２の高さ寸法が粒子２１の直径の１００倍よりも大きいと、流路２のうちマイクロウェルアレイ４の開口面６から過度に離れた領域で粒子２１が流れる場合があり、その結果、粒子２１がウェル３に収容され難くなってしまう。
【0033】
〔粒子〕次に、本実施形態に係る粒子の収容方法及び封入方法に用いる粒子２１について説明する。
粒子２１は、バイオマーカーなどの等の検出対象を捕捉可能なものであればよい。粒子２１としては、ビーズ、磁性ビーズ、エクソソームなどが挙げられる。粒子２１の表面には、検出対象を捕捉可能な有機物質や無機物質が付着又は結合していてもよい。有機物質としては、プラスチック、ストレプトアビジン、カルボキシル基、アビジン、アミノ基、糖鎖、糖たんぱく質、核酸からなる群から選択された１つ又は複数の物質を含むものが挙げられる。無機物としては、鉄、銅などの金属等が挙げられる。
【0034】
粒子２１の直径は、少なくともウェル３に収容可能な大きさであれば、任意であってよいが、好ましくは０．１μｍ〜１０μｍの範囲で設定することができる。粒子２１の直径が０．１μｍよりも小さいと、粒子２１を光学的に検出、観察することが難しくなってしまう。すなわち、粒子２１の直径が０．１μｍ以上であれば、粒子２１を容易に光学的に検出、観察できる。
粒子２１の直径が１０μｍよりも大きいと、マイクロウェルアレイ４のアレイのサイズも大きく設定する必要がある。このため、同一数のウェル３を有するマイクロウェルアレイ４のサイズが過度に大きくなってしまい、マイクロウェルアレイ４の製造コスト（特に材料コスト）が高くなってしまう。すなわち、粒子２１の直径が１０μｍ以下であれば、マイクロウェルアレイ４の製造コストを抑えることができる。
【0035】
〔粒子の収容方法〕次に、本実施形態に係る粒子の収容方法について説明する。
粒子の収容方法では、図７に示すように、前述した粒子２１が含まれる粒子含有流体２０を用いる。粒子含有流体２０は、溶媒流体２２に、多数の粒子２１を分散し、さらに、検出対象を検出するための検出試薬を含ませたものである。
粒子含有流体２０に含まれる粒子２１には、検出対象が結合されていてもよい。検出対象は、任意のものであってよいが、例えばバイオマーカーであってもよい。バイオマーカーとしては、例えばＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、タンパク質などが挙げられる。
【0036】
溶媒流体２２は、例えば気体であってもよいが、液体であってもよい。溶媒流体２２が液体である場合、溶媒流体２２としては、粒子２１との親和性が高い液体を選択するとよい。粒子２１が親水性である場合、溶媒流体２２として親水性の液体を選択するとよい。親水性の液体としては、例えば、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる群から選択された１つ又は複数を含むものが挙げられる。
粒子２１が疎水性である場合、溶媒流体２２として疎水性の液体を選択するとよい。疎水性の液体としては、例えば、オイル、疎水性アルコール、液化炭化水素からなる群から選択された１つ又は複数を含むものが挙げられる。
【0037】
溶媒流体２２の比重は、例えば粒子２１の比重と異なってもよい。すなわち、溶媒流体２２の比重は、例えば粒子２１よりも小さくてもよいし、粒子２１よりも大きくてもよい。
【0038】
検出試薬としては、例えば、蛍光発生基質（ＲＧＰ）、ＴａｑＭａｎプローブ法試薬、インベーダー（登録商標）反応試薬、ＬＡＭＰ法反応試薬などが挙げられるが、等温反応で検出対象を検出できる試薬が好ましい。検出試薬は、粒子２１との親和性が高いものであるとよい。
【0039】
そして、本実施形態の粒子の収容方法においては、図７から図１０に示すように、粒子２１が含まれる粒子含有流体２０を、複数のウェル３が開口する流路２において２回以上流して、粒子２１が含まれる粒子含有流体２０をマイクロ流体デバイス１のウェル３に収容する。
【0040】
収容方法において、粒子２１の比重が溶媒流体２２よりも大きい場合には、図７から図１０に示すように、ウェル３の開口が鉛直方向において上向きとなるようにマイクロ流体デバイス１を配置するとよい。また、粒子２１の比重が溶媒流体２２よりも小さい場合には、ウェル３の開口が鉛直方向において下向きとなるようにマイクロ流体デバイス１を配置するとよい。
【0041】
収容方法においては、はじめに、図７に示すように、粒子含有流体２０を一の貫通孔１５（例えば第一貫通孔１５Ａ）からマイクロウェルアレイ４と蓋部材５との間の流路２に注入する（注入工程）。注入工程では、粒子含有流体２０を流路２において流し、他の貫通孔１５（例えば第二貫通孔１５Ｂ）に到達させる。粒子含有流体２０の溶媒流体２２が液体である場合には、注入工程において例えば一部の粒子含有流体２０を他の貫通孔１５内に流入させてもよい。このように粒子含有流体２０が流路２において流れることで、粒子２１が一部のウェル３に入り込む。
【0042】
次いで、図８に示すように、一の貫通孔１５（例えば第一貫通孔１５Ａ）から流路２内の粒子含有流体２０を吸い上げる（吸い上げ工程）。吸い上げ工程では、粒子含有流体２０を流路２において流す。これにより、注入工程とは別のウェル３に粒子２１を入り込ませることができる。粒子含有流体２０の溶媒流体２２が液体である場合には、吸い上げ工程後の状態において吸い上げに用いない他の貫通孔１５に粒子含有流体２０が残るように、吸い上げ工程を実施してもよい。この場合、吸い上げ工程を実施しても、吸い上げの際に気体が流路２に入り込むことを防止できる。
【0043】
本実施形態の収容方法は、上記の吸い上げ工程を実施することで完了してもよいが、図９に例示するように、吸い上げ工程後に、再び注入工程を実施し、粒子含有流体２０を流路２において流してもよい。すなわち、収容方法では、注入工程及び吸い上げ工程を少なくとも１回ずつ以上実施すればよい。２回目以降の注入工程や吸い上げ工程を実施する場合には、図１０に例示するように、最初の注入工程及び吸い上げ工程とは別のウェル３に粒子２１を入り込ませることができる。粒子含有流体２０の溶媒流体２２が液体である場合、上記した収容方法では、例えば、最後に注入工程を実施してもよい。この場合、収容方法が完了した後の状態において、流路２を確実に粒子含有流体２０で満たすことができ、流路２に気泡が残ることを好適に抑制できる。
【0044】
上記した収容方法では、例えば、全ての注入工程や吸い上げ工程において同一の貫通孔１５（例えば第一貫通孔１５Ａ）を使って粒子含有流体２０の注入や吸い上げを行ってもよい。この場合、吸い上げ工程において粒子含有流体２０を流す方向は、図７，８に例示するように注入工程において粒子含有流体２０を流す方向と逆向きとなる。
【0045】
また、上記した収容方法では、例えば、注入工程や吸い上げ工程毎に別の貫通孔１５を使って粒子含有流体２０の注入や吸い上げを行ってもよい。具体的には、１回目の注入工程及び吸い上げ工程において使用する貫通孔１５と、２回目の注入工程及び吸い上げ工程において使用する貫通孔１５とが異なってもよい。また、吸い上げ工程において使用する貫通孔１５は、吸い上げ工程の直前の注入工程において使用した貫通孔１５と異なってもよい。このような場合、注入工程や吸い上げ工程において、粒子含有流体２０を逆向きに限らず様々な方向に流すことができる。
【0046】
粒子含有流体２０の溶媒流体２２が液体である場合、上記した収容方法は、例えば、注入工程や吸い上げ工程の後に所定時間静置する静置工程を含んでもよい。静置工程は、例えば最後の注入工程（又は吸い上げ工程）を行った後、すなわち粒子含有流体２０を流路２において複数回流した後に実施してもよい。この場合、静置工程において溶媒流体２２中に浮遊する粒子２１に重力（又は浮力）が作用することで、粒子２１をウェル３に収容することができる。したがって、収容方法が静置工程を含む場合には、静置工程を含まない場合と比較して、粒子２１をより多くのウェル３に収容することができる。
静置工程における所定時間（静置時間）は、例えば３秒以上９００秒以下であるとよい。３秒以上である理由は、流路２内の粒子含有流体２０の対流を抑えて粒子２１をウェル３に沈降させやすくするためである。９００秒以下が良い理由は、９００秒より長く静置すると、単位時間あたりに粒子２１が入るウェル３の数が減るためである。
【0047】
また、上記した収容方法は、例えば、粒子２１がウェル３に向かうように遠心力や磁力等の外力を積極的に付与する外力付与工程を含んでもよい。外力が遠心力である場合、外力付与工程は、例えば注入工程や吸い上げ工程の後に実施してもよい。より具体的に、外力付与工程は、例えば、注入工程とその後の吸い上げ工程との間や、吸い上げ工程とその後の注入工程との間に実施してもよい。すなわち、外力付与工程は、粒子含有流体２０を流路２において１回流すごとに実施してもよい。また、外力付与工程は、最後の注入工程（又は吸い上げ工程）の後に実施してもよい。
また、外力が磁力である場合、粒子２１は磁性ビーズ等のように磁性を有していればよい。この場合、外力付与工程は、例えば注入工程と吸い上げ工程との間に実施してもよいし、注入工程や吸い上げ工程の最中に実施してもよい。また、外力付与工程は、最後の注入工程（又は吸い上げ工程）の後に実施してもよい。
収容方法が外力付与工程を含む場合、外力付与工程を含まない場合と比較して、粒子２１をより多くのウェル３に収容することができる。
【0048】
また、粒子含有流体２０の溶媒流体２２が液体である場合、上記した収容方法においては、例えば図５〜７に示すように、最初の注入工程を実施する前に、粒子２１を含まない粒子無し流体２３を一の貫通孔１５（例えば第一貫通孔１５Ａ）から流路２に注入する液体注入工程を実施してもよい。液体注入工程では、前述した最初の注入工程の場合と同様に、粒子無し流体２３を流路２において流し、他の貫通孔１５（例えば第二貫通孔１５Ｂ）に到達させ、一部の粒子無し流体２３を他の貫通孔１５内に流入させてもよい。
【0049】
粒子無し流体２３としては、粒子含有流体２０の溶媒流体２２と同様に、粒子２１との親和性が高い液体を選択するとよい。すなわち、粒子２１が親水性である場合には粒子無し流体２３として親水性の液体を選択するとよく、粒子２１が疎水性である場合、粒子無し流体２３として疎水性の液体を選択するとよい。粒子無し流体２３は、例えば粒子含有流体２０の溶媒流体２２と異なっていてもよいが、粒子含有流体２０の溶媒流体２２と同じであることがより好ましい。
【0050】
上記の液体注入工程を実施する場合には、注入工程や吸い上げ工程（特に最初の注入工程）を実施する際に、粒子２１が含まれる粒子含有流体２０をより多くのウェル３上に容易に行き渡らせることができる。液体注入工程においては、例えば粒子無し流体２３を注入した後に、ウェル３内に残っている空気を抜く脱気工程を実施してもよい。
【0051】
また、粒子含有流体２０の溶媒流体２２が液体である場合、上記した収容方法において粒子含有流体２０や粒子無し流体２３を流路２において流す流速は、例えば０．４ｍｍ／ｓｅｃ以上であってもよい。例えば、流路２における粒子含有流体２０や粒子無し流体２３の流速が０．４ｍｍ／ｓｅｃよりも小さい場合には、粒子含有流体２０や粒子無し流体２３が流路２全体に行き渡らない可能性が高まり、その結果として流路２中に気体（気泡）が残る場合がある。これに対し、粒子含有流体２０や粒子無し流体２３の流速が０．４ｍｍ／ｓｅｃ以上である場合には、流路２に気泡が残ることを好適に抑制することができる。
【0052】
また、粒子含有流体２０の溶媒流体２２が液体である場合、上記した収容方法において粒子含有流体２０を流路２において流す流速は、例えば２５ｍｍ／ｓｅｃ以下であってもよい。例えば、流路２における粒子含有流体２０の流速が２５ｍｍ／ｓｅｃよりも大きい場合には、粒子含有流体２０に含まれる粒子２１がウェル３に収容され難くなる。また、ウェル３内の粒子２１が粒子含有流体２０の流れによってウェル３から抜け出してしまう可能性が高くなる。これに対し、粒子含有流体２０の流速が２５ｍｍ／ｓｅｃ以下である場合には、粒子含有流体２０に含まれる粒子２１がウェル３に収容され易くなり、また、ウェル３内の粒子２１が粒子含有流体２０の流れによってウェル３から抜け出すことも好適に抑制できる。
【0053】
また、上記した収容方法では、例えば図７〜９に示すように、流路２における粒子含有流体２０の流れ方向が水平方向であってもよいが、例えば水平方向に対して傾斜してもよい。例えば、流路２における粒子含有流体２０の流れ方向は、水平方向に対して鉛直方向上側に傾斜しているとよい。流路２における粒子含有流体２０の流れ方向が水平方向に対して傾斜している場合には、傾斜していない場合と比較して、粒子２１を容易にウェル３に収容し、保持することができる。
【0054】
上記した収容方法において、粒子含有流体２０や粒子無し流体２３を流路２に注入したり吸い上げたりする道具は、任意であってよい。粒子含有流体２０の溶媒流体２２が液体である場合の道具としては、例えばマイクロピペットなどが挙げられる。粒子含有流体２０の溶媒流体２２が気体である場合の道具としては、例えばポンプや吸引器等が挙げられる。
【0055】
〔粒子の封入方法〕本実施形態では、上記した粒子の収容方法の後に、図１１，１２に示すように、粒子含有流体２０の上層に封止液２４の層を形成させ、ウェル３に収容された粒子２１を溶媒流体２２及び検出試薬と共にウェル３に封入する粒子の封入方法を実施する。
【0056】
封入方法において用いる封止液２４は、粒子２１及び溶媒流体２２との親和性が低く、粒子含有流体２０と混ざり合わない液体である。粒子２１や溶媒流体２２が親水性である場合、封止液２４として疎水性の溶液を選択するとよい。疎水性溶液としては、例えば、飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒からなる群から選択された１つ又は複数を含むものが挙げられる。
粒子２１や溶媒流体２２が疎水性である場合、封止液２４として親水性の溶液を選択するとよい。親水性溶液としては、例えば、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びN,N−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）からなる群から選択された１つ又は複数を含むものが挙げられる。親水性アルコールとしては、例えばメタノールやエタノールなどが挙げられる。
【0057】
封入方法においては、上記した封止液２４を一の貫通孔１５（例えば第一貫通孔１５Ａ）から流路２に注入し、封止液２４を流路２において流し、他の貫通孔１５（例えば第二貫通孔１５Ｂ）に到達させる。これにより、流路２に存在する粒子含有流体２０（特に粒子２１）が他の貫通孔１５から流路２の外側に排出され、流路２が封止液２４で満たされる。また、封止液２４は粒子２１や溶媒流体２２と混合しないため、各ウェル３に収容された粒子２１や溶媒流体２２は、他のウェル３に収容された粒子２１や溶媒流体２２と混合しない状態で隔離される。
【0058】
以上説明したように、本実施形態の粒子の収容方法によれば、粒子含有流体２０をウェル３上の流路２において２回以上流すことで、より多くのウェル３に粒子２１を効率よく収容できる。また、粒子含有流体２０が検出試薬を含むことで、粒子２１がウェル３に収容されると同時に検出試薬もウェル３に収容される。このため、粒子２１に結合した検出対象と検出試薬とを確実に反応させることができる。すなわち、検出対象を確実に検出することができる。
【0059】
また、本実施形態の粒子の収容方法において、粒子２１の比重が溶媒流体２２の比重と異なる場合には、粒子含有流体２０を流路２において流す際に、粒子２１に作用する重力や浮力によって粒子２１を効率よくウェル３に収容することができる。
【0060】
また、本実施形態の粒子の収容方法において、粒子含有流体２０を流路２において複数回流した後に、所定時間静置した場合には、静置した状態で流路２に浮遊する粒子２１を重力や浮力によってウェル３に効率よく収容することができる。
【0061】
また、本実施形態の粒子の収容方法において、粒子含有流体２０を流路２において複数回流している最中や複数回流した後に、粒子２１がウェル３に向かうように遠心力や磁力を付与した場合には、流路２に浮遊している粒子２１を好適にウェル３に収容することができる。したがって、より多くのウェル３に粒子２１を収容することができる。
【0062】
また、本実施形態の粒子の収容方法において、液体である粒子含有流体２０や粒子無し流体２３を流路２で流す流速を０．４ｍｍ／ｓｅｃ以上とした場合には、粒子含有流体２０や粒子無し流体２３を流路２全体に行き渡らせることができ、流路２に気泡が残ることを好適に抑制することができる。また、液体である粒子含有流体２０の流速を２５ｍｍ／ｓｅｃ以下とした場合には、粒子含有流体２０を流路２において流す際に、粒子２１がウェル３に収容されやすくなる。すなわち、粒子２１をより多くのウェル３に収容することができる。また、ウェル３内の粒子２１が粒子含有流体２０の流れによってウェル３から抜け出すことも好適に抑制できる。
【0063】
また、本実施形態の粒子の収容方法において、流路２の高さ寸法を粒子２１の直径の１倍よりも大きくした場合には、粒子含有流体２０に含まれる粒子２１を流路２においてスムーズに流すことができる。また、流路２の高さ寸法を粒子２１の直径の１００倍以下とした場合には、流路２のうちマイクロウェルアレイ４の開口面６から過度に離れた領域において粒子２１が流れることを抑制できるため、より多くのウェル３に粒子２１を収容することができる。
【実施例】
【0064】
本発明の粒子の収容方法について、下記の２つの検討を実施した。
【0065】
≪検討１≫まず、粒子含有流体２０をマイクロ流体デバイス１の流路２において複数回流すことの優位性について検討した（検討１）。検討１では、以下のマイクロ流体デバイス１、粒子含有流体２０、粒子無し流体２３、封止液２４を用いた。
【0066】
〔マイクロ流体デバイス〕検討１で用いたマイクロ流体デバイス１のマイクロウェルアレイ４は、以下のように作製した。
まず、マイクロウェルアレイ４の底部層１１として厚さ０．５ｍｍのガラス板を準備した。
次いで、底部層１１の一方の面に、無色透明で自家蛍光が低く抑えられた熱硬化樹脂（旭硝子社製のＣＹＴＯＰ）からなる壁部層１２を形成した。壁部層１２を形成する際には、はじめに、底部層１１の一方の面に、熱硬化樹脂をスピンコートにより塗布し、１８０℃で１時間ベークして硬化させた。硬化後における熱硬化樹脂（壁部層１２）の厚さは３μｍだった。次いで、熱硬化樹脂上にポジ型のフォトレジストを塗布し、フォトマスクを用いてフォトレジストに壁部層１２の複数の開口孔に対応する微小孔のパターンを形成した。その後、Ｏ２（酸素）プラズマによって熱硬化性樹脂をドライエッチングした。これにより、壁部層１２に複数の開口孔（マイクロウェルアレイ４のウェル３）が形成された。最後に、アセトン及びエタノールによって熱硬化樹脂の表面を洗浄、リンスし、フォトレジストを除去した。
【0067】
作製されたマイクロウェルアレイ４における各ウェル３は、図３に示すように、円筒形とし、各ウェル３の直径Ｗｄは５μｍとした。また、各ウェル３の深さ寸法は３μｍとした。ウェル３は、横方向（図３において左右方向）に間隔をあけて複数並べた。横方向に隣り合うウェル３同士の間隔Ｓ１は５μｍとした。また、横方向に並んだ複数のウェル３からなる横配列ウェル群３０を、縦方向（図３において上下方向）に複数並べた。第一横配列ウェル群３０Ａのウェル３と、第一横配列ウェル群３０Ａに隣り合う第二横配列ウェル群３０Ｂのウェル３とは、横方向においてこれらのウェル３の中心間距離Ｓ２が５μｍとなるように、かつ、縦方向においてこれらのウェル３の中心間距離Ｓ３が８．５μｍとなるように配した。
【0068】
また、図４に示すように、作製されたマイクロウェルアレイ４におけるウェル形成領域８は、横１０．１８ｍｍ、縦８．７５ｍｍの長方形の領域とした。また、ウェル形成領域８は、縦に１０個、横に１０個並ぶ合計１００個のウェル区画８０に区画した。各ウェル区画８０には、１万個のウェル３を前述した配列法則にしたがって配列した。このため、ウェル形成領域８には１００万個のウェル３が存在する。
【0069】
検討１で用いたマイクロ流体デバイス１の蓋部材５には、ヌンク社製の９６穴プレートを用いた。蓋部材５の貫通孔１５は、９６穴プレートの穴を利用して二つ形成した。９６穴プレートの穴を各貫通孔１５の大孔部１７とし、９６穴プレートの穴の底部に貫通して形成した孔を各貫通孔１５の小孔部１６とした。
【0070】
検討１で用いたマイクロ流体デバイス１のスペーサ１８には、厚さ１００μｍの両面テープを用いた。両面テープを、マイクロウェルアレイ４の開口面６のうち長方形とされたウェル形成領域８を囲む矩形環状に形成し、マイクロウェルアレイ４の開口面６の周縁領域７に貼り付けた。
【0071】
そして、蓋部材５の各貫通孔１５の小孔部１６側がマイクロウェルアレイ４のウェル形成領域８に対向するように、また、二つの貫通孔１５が長方形とされたウェル形成領域８のうち互いに向かい合う二つの角部に対応する位置に配されるように、蓋部材５を両面テープに貼り付けた。両面テープの厚さを１００μｍとすることで、マイクロウェルアレイ４及び蓋部材５を重ね合せた方向におけるマイクロ流体デバイス１の流路２の高さ寸法を１００μｍとした。以上により、マイクロ流体デバイス１の作製を完了した。
【0072】
〔粒子含有流体〕検討１では、粒子含有流体２０の粒子２１として、直径３μｍの磁性ビーズの表面をストレプトアビジンでコーティングしたもの（具体的には、ＪＳＲ株式会社製のＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標） ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（容量２ｍｌ、品番ＭＳＰ―Ｓ３００―ＳＡＪＳＲ））を用いた。
また、検討１では、粒子含有流体２０の溶媒流体２２として、ＳＩＧＭＡ―ＡＬＤＲＩＣ社製の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、ＳＩＧＭＡ―ＡＬＤＲＩＣ社製のＴｗｅｅｎ２０、及び、ＡＸＹＧＥＮ社製のＭＯＰＳ ｐＨ７．９、Ｌｏｎｚａ社製のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ Ｗａｔｅｒ（以下「ＤＷ」と呼ぶ）を含むものを用いた。
【0073】
検討１の粒子含有流体２０は、以下のように調製した。はじめに、磁性ビーズが含まれるビーズ溶液（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標） ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）をボルテックスミキサーで撹拌して磁性ビーズを分散させた後、磁性ビーズが１×１０６個含まれているビーズ溶液をピペットマンによりマイクロチューブに分注した。次いで、マイクロチューブを磁気スタンドに１分間セットして、磁性ビーズをマイクロチューブ内で集め、ビーズ溶液の上清をマイクロチューブから取り除いた。その後、マイクロチューブにＴＥ ｂｕｆｆｅｒを１μｌ加え、調製用ビーズ溶液を調製した。
【0074】
また、液体である粒子含有流体２０の溶媒流体２２（１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ＤＷ）を２０μｌ調製した。溶媒流体２２の比重は１．０ｍｇ／ｍｍ３とし、磁性ビーズの比重１．１ｍｇ／ｍｍ３よりも小さくした。そして、２０μｌから１μｌ減らした１９μｌの上記溶媒流体２２に、調製用ビーズ溶液を１μｌ加えることで、２０μｌの粒子含有流体２０（磁性ビーズ：５×１０４個／μｌ）を調製した。
また、検討１では、検出対象としてヒトゲノム上にある遺伝子Ｔ７９０、及び、検出試薬としてインベーダー（登録商標）反応試薬（１μＭ インベーダープローブ、１μＭ アレルプローブ、２μＭ ＦＲＥＴプローブ、１０００Ｕ／μｌ ｃｌｅａｖａｓｅ）を、上記の粒子含有流体２０に加えた。
【0075】
〔粒子無し流体〕検討１では、粒子無し流体２３として、前述した粒子含有流体２０の溶媒流体２２を用いた。
【0076】
〔封止液〕検討１では、封止液２４として、ＳＩＧＭＡ社製のＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（登録商標）ＦＣ４０を用いた。
【0077】
〔粒子の収容方法〕検討１では、上記したマイクロ流体デバイス１及び粒子含有流体２０を用い、粒子２１をマイクロ流体デバイス１のウェル３に収容する粒子の収容方法を、以下のように実施した。
はじめに、図５〜１０に示すように、流路２における粒子含有流体２０、粒子無し流体２３、封止液２４の流れ方向が水平方向となるように、また、ウェル３の開口が鉛直方向において上側を向くように、マイクロ流体デバイス１を配置した。
【0078】
次いで、図５に示すように、液体である粒子無し流体２３を、マイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａから流路２に２０μｌ注入し、流路２を粒子無し流体２３で満たした。粒子無し流体２３は、流路２において流れる粒子無し流体２３の流速が２．０ｍｍ／ｓｅｃとなるように、流路２に注入した。
【0079】
次に、各ウェル３内に残っている空気を抜くための脱気を行った。脱気は、ウェル３の開口が鉛直方向において上側を向くようにマイクロ流体デバイス１を配置した状態で１分間行った。脱気を行った後の状態では、図６に示すように、流路２及び全てのウェル３が粒子無し流体２３で満たされた。
【0080】
その後、図７，８に示すように、液体である粒子含有流体２０を、マイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａから流路２に２０μｌ注入して流路２において１回流した。これにより、流路２を粒子含有流体２０で満たした。すなわち、流路２内の粒子無し流体２３を粒子含有流体２０に置換した。粒子含有流体２０は、流路２における流速が２．０ｍｍ／ｓｅｃとなるように、流路２に注入した。
【0081】
その後、粒子含有流体２０を流路２において再度流す場合には、図８に示すように、マイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａから流路２内の粒子含有流体２０を吸い上げて流路２において注入の際と逆向きに１回流した。粒子含有流体２０の吸い上げは、空気が第二貫通孔１５Ｂから流路２内に入り込まないように、すなわち粒子含有流体２０が第二貫通孔１５Ｂに残るように行った。吸い上げの際に流路２において流れる粒子含有流体２０の流速は、２．０ｍｍ／ｓｅｃとなるようにした。
【0082】
さらに、上記の吸い上げ後に粒子含有流体２０を流路２において再度流す場合には、図９に示すように、流路２の外側に吸い上げられた粒子含有流体２０を、マイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａから流路２に再び注入して流路２において１回流した。粒子含有流体２０を再度注入する際には、空気が第一貫通孔１５Ａから流路２内に入り込まないようにした。また、流路２において流れる粒子含有流体２０の流速は、最初に粒子含有流体２０を注入した際と同様に２．０ｍｍ／ｓｅｃとなるようにした。
【0083】
そして、流路２において粒子含有流体２０を所定回数流した後に、ウェル３の開口が鉛直方向において上側を向くようにマイクロ流体デバイス１を配置した状態で所定時間静置した。これにより、検討１での粒子の収容方法を完了した。
【0084】
〔粒子の封入方法〕検討１では、上記した収容方法の後に、ウェル３に収容された粒子２１を溶媒流体２２及び検出試薬と共にウェル３に封入する粒子の封入方法を実施した。
検討１の封入方法では、図１１，１２に示すように、封止液２４を、マイクロ流体デバイス１の第一貫通孔１５Ａから流路２に１００μｌ注入し、流路２を封止液２４で満たした。すなわち、流路２内の粒子含有流体２０を封止液２４に置換した。封止液２４は、注入を開始してから流路２が封止液２４で満たされるまで３０秒程度かかるように、流路２に注入した。注入する際には、流路２に存在していた粒子２１（ウェル３に収容されなかった粒子２１）を排出した。
最後に、ウェル３の開口が鉛直方向において上側を向くようにマイクロ流体デバイス１を配置した状態で１分間静置した。これにより、検討１での粒子の封入方法を完了した。
【0085】
〔実施例１〕検討１では、上記した粒子の収容方法において、粒子含有流体２０の注入を４回、吸い上げを３回実施することで、粒子含有流体２０を流路２において７回流した後、２０秒間静置したもの（実施例１）を用意した。実施例１では、粒子の収容方法の実施後に、上記した粒子の封入方法を実施した。
【0086】
〔比較例１〜３〕また、検討１では、比較例として、上記した粒子の収容方法において、粒子含有流体２０の注入を１回実施することで、粒子含有流体２０を流路２において１回流した後、ウェル３の開口が鉛直方向において上側を向くようにマイクロ流体デバイス１を配置した状態で１分間静置したもの（比較例１）、１５分間静置したもの（比較例２）、３０分間静置したもの（比較例３）の３種類を用意した。比較例１〜３では、実施例１と同様に、粒子の収容方法の実施後に、上記した粒子の封入方法を実施した。
【0087】
〔粒子が入ったウェル数の評価〕検討１では、上記した実施例１及び比較例１〜３について、マイクロ流体デバイス１のマイクロウェルアレイ４側から顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で観察した。観察した箇所は、ウェル形成領域８のうち同一のウェル区画８０（１万個のウェル３が形成された領域）とした。観察箇所を撮影した画像を図１３〜１６に示す。各画像においては、粒子２１が黒い点として現れた。
そして、検討１では、実施例１及び比較例１〜３について、図１３〜１６の各画像を基に、粒子２１が入ったウェル３の数を数えた。その結果を図１７の表に示す。
【0088】
図１７に示すように、粒子含有流体２０を流路２において７回流した実施例１では、粒子含有流体２０を流路２において１回だけ流した比較例１〜３と比べて、粒子２１が入ったウェル３の数が多かった。比較例１〜３のように、粒子含有流体２０を流路２において１回だけ流す場合には、粒子２１が入るウェル３の数を増やすために、粒子含有流体２０を流した後に長時間静置する必要がある。
これに対し、実施例１のように、粒子含有流体２０を流路２において複数回流す場合には、粒子含有流体２０を流した後の静置時間が短くても、より多くのウェル３に粒子２１を入り込ませることができる。すなわち、粒子含有流体２０を流路２において複数回流すことで、短時間で効率よく、多くのウェル３に粒子２１を入り込ませることができる。
【0089】
≪検討２≫次に、粒子含有流体２０をマイクロ流体デバイス１の流路２において流した回数と、粒子２１が入ったウェル３の数との関係について検討した（検討２）。
検討２では、検討１と同様のマイクロ流体デバイス１、粒子含有流体２０、粒子無し流体２３、封止液２４を用い、検討１と同様の粒子の収容方法、及び、粒子の封入方法を実施した。
【0090】
検討２では、粒子の収容方法において、粒子含有流体２０を流路２において流す回数を、１回（最初の注入のみ）、３回（２回の注入及び１回の吸い上げ）、５回（３回の注入及び２回の吸い上げ）、７回（４回の注入及び３回の吸い上げ）、９回（５回の注入及び４回の吸い上げ）とした５種類のパターンを用意した。
【0091】
〔粒子が入ったウェル数の評価〕検討２では、これら５種類のパターンについて、検討１と同様に、顕微鏡によってマイクロ流体デバイス１のマイクロウェルアレイ４側からウェル形成領域８の同一のウェル区画８０を観察、撮影した。５種類のパターンについて撮影した画像を図１８〜２２に示す。各画像においては、粒子２１が黒い点として現れた。
そして、検討２では、５種類のパターンについて、図１８〜２２の各画像を基に、粒子２１が入ったウェル３の数、及び、粒子２１が１個のみ入ったウェル３の数を数えた。その結果を図２３，２４に示す。図２３は、粒子含有流体２０を流路２において流した回数と、粒子２１が入ったウェル３の数との関係を示すグラフである。図２４は、粒子含有流体２０を流路２において流した回数と、粒子２１が入ったウェル３の数Ｎ（総収容ウェル数Ｎ）、粒子２１が１個のみ入ったウェル３の数Ｍ（１個収容ウェル数Ｍ）、及び、これらの比（Ｍ／Ｎ）との関係を示す表である。
【0092】
図２３，２４に示すように、粒子含有流体２０を流路２において流した回数が増えるほど、総収容ウェル数Ｎ、及び、１個収容ウェル数Ｍが、共に増加した。すなわち、粒子含有流体２０を流路２において流す回数を増やすことで、より多くのウェル３に粒子２１を入り込ませることができる。
【0093】
また、図２４に示すように、総収容ウェル数Ｎに対する１個収容ウェル数Ｍの割合（Ｍ／Ｎ）は、粒子含有流体２０を流した回数が３回である場合に最も多かった。また、粒子含有流体２０を流した回数が３回よりも少なくなったり、多くなったりすると、総収容ウェル数Ｎに対する１個収容ウェル数Ｍの割合（Ｍ／Ｎ）が減少した。すなわち、粒子含有流体２０を流す回数を調整することで、粒子２１が１個のみ入ったウェル３の比率を増やすことができる。バイオマーカー等の検出対象を測定する方法としてデジタルカウント法を採用する場合には、各ウェル３に粒子２１が１個だけ入ることが好ましい。このため、粒子含有流体２０を流す回数を調整し、粒子２１が１個のみ入ったウェル３の数を増やすことは有効である。
【0094】
以上、本発明について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。
【0095】
本発明の粒子の収容方法及び封入方法において、粒子含有流体、粒子無し流体、封止液を流す流路は、少なくとも複数のウェルが開口する面上で確保されていればよい。すなわち、マイクロ流体デバイスは、例えば蓋部材を備えなくてもよい。
【0096】
本発明の粒子の収容方法において、粒子含有流体を流路で流す流速は、粒子含有流体を複数回流す中で互いに異なってもよい。例えば、粒子含有流体を流路において第一方向に流す流速と、第一方向と逆向きの第二方向に流す流速とが、互いに異なってもよい。
【0097】
本発明の粒子の収容方法において、粒子含有流体を流路で流す方向は、粒子含有流体を複数回流す中で互いに異なってもよい。例えば、所定の回において粒子含有流体を流す方向が第一方向である場合、所定の回とは別の回において粒子含有流体を流す方向は、第一方向と逆向きであってもよいし、第一方向に交差する方向であってもよい。
【0098】
本発明の粒子の収容方法において、粒子含有流体における粒子の含有率（粒子含有率）は、粒子含有流体を複数回流す中で互いに異なってもよい。
【符号の説明】
【0099】
１ マイクロ流体デバイス２ 流路
３ ウェル
４ マイクロウェルアレイ
５ 蓋部材
１５ 貫通孔
２０ 粒子含有流体
２１ 粒子
２２ 溶媒流体
２３ 粒子無し流体
２４ 封止液