特許 6823936 金属酵素阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6823936

(24)【登録日】2021年1月14日

(45)【発行日】2021年2月3日

(54)【発明の名称】金属酵素阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/555 20060101AFI20210121BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20210121BHJP

   A61P 17/18 20060101ALI20210121BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210121BHJP

   C12N 9/64 20060101ALI20210121BHJP

   C12N 9/99 20060101ALI20210121BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/555

   A61P9/12

   A61P17/18

   A61P43/00 111

   C12N9/64

   C12N9/99

【請求項の数】5

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2016-60881(P2016-60881)

(22)【出願日】2016年3月24日

(65)【公開番号】特開2017-171622(P2017-171622A)

(43)【公開日】2017年9月28日

【審査請求日】2019年3月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】502306235

【氏名又は名称】新洋水産有限会社

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】世古 卓也

(72)【発明者】

【氏名】山下 倫明

(72)【発明者】

【氏名】山下 由美子

(72)【発明者】

【氏名】石原 賢司

(72)【発明者】

【氏名】今村 伸太郎

(72)【発明者】

【氏名】山内 健

(72)【発明者】

【氏名】横澤 美紀

(72)【発明者】

【氏名】高柳 周

【審査官】 大島 彰公

(56)【参考文献】

【文献】 特許第５６６９０５６（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 Bayse et al.，Biochalcogen Chemistry: The Biological Chemistry of Sulfer, Selenium, and Tellurium，ACS SYMPOSIUM SERIES，２０１３年，vol.1152，33-70

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／５５５

Ａ６１Ｐ ９／１２

Ａ６１Ｐ １７／１８

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ１２Ｎ ９／６４

Ｃ１２Ｎ ９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉ：

【化1】

［式中、
Ｒは、水素、エルゴチオニル基、グルタチオニル基、又はシステイニル基である］
で表されるセレン含有化合物を有効成分として含有する金属酵素阻害剤。

【請求項2】

チロシナーゼを阻害することを特徴とする、請求項１に記載の金属酵素阻害剤。

【請求項3】

メラニン合成阻害を特徴とする、請求項１又は２に記載の金属酵素阻害剤。

【請求項4】

アンジオテンシン変換酵素を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の金属酵素阻害剤。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の金属酵素阻害剤を含有する血圧降下用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、セレン含有化合物を有効成分とする金属酵素阻害剤、該金属酵素阻害剤を含有する血圧降下用組成物、並びに美白用および美肌用化粧品および食品に関する。

【背景技術】

【0002】

セレン含有化合物であるセレノネインは、強い抗酸化能（ラジカル消去活性）を有し、ヒト細胞に対して生体抗酸化作用を示すことが見出されている（特許文献１）。抗酸化作用を有する物質は、生体内の活性酸素種を除去し、様々な生理活性を示す。そのため、セレノネインの機能性食品、化粧品、飼料、試薬等への応用が期待されている。

【0003】

魚食には、がんや糖尿病などの生活習慣病に対する予防効果やアンチエイジングの効果が知られていることから、セレノネインがこのような生活習慣病予防やアンチエイジングに対して寄与することが考えられるが、セレノネインによる生活習慣病予防効果やその分子機序、セレノネインと他の生体分子との相互作用については検証されていなかった。とくに、人体や動物細胞に対するセレノネインの健康機能性については、ラジカル消去活性など抗酸化能以外の生理活性は、これまで調べられていない。そのため、生体分子や、モデル細胞に対するセレノネインの生理活性を検証し、セレノネインの新たな用途の開発が必要であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第５６６９０５６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、本発明者らによって開発されたセレノネインの生理活性を検証し、その新たな用途を見出すことを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、セレノネインの健康機能性を生化学的に解析したところ、血圧上昇を促す亜鉛酵素であるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）やメラニン合成を促進する銅酵素であるチロシナーゼなど、亜鉛や銅などの金属イオンを活性中心にもつ金属酵素群に対する阻害活性をセレノネインが示すことが新たに見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は、セレノネインを含有する金属酵素阻害剤、その組成物および血圧降下作用や美白効果、美肌効果などの新規機能性を有する食品または化粧品を提供する。

【0007】

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］式Ｉ：

【0008】

【化1】

【0009】

［式中、
Ｒは、水素、エルゴチオニル基、グルタチオニル基、又はシステイニル基である］
で表されるセレン含有化合物を有効成分として含有する金属酵素阻害剤。
［２］チロシナーゼを阻害することを特徴とする、上記［１］に記載の金属酵素阻害剤。
［３］メラニン合成阻害を特徴とする、上記［１］又は［２］に記載の金属酵素阻害剤。
［４］アンジオテンシン変換酵素を阻害することを特徴とする、上記［１］に記載の金属酵素阻害剤。
［５］上記［１］〜［４］のいずれかに記載の金属酵素阻害剤を含有する血圧降下用組成物。
［６］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の金属酵素阻害剤を含有する美白用又は美肌用化粧品。
［７］上記［１］〜［４］のいずれかに記載の金属酵素阻害剤を含有する美白用又は美肌用食品。

【発明の効果】

【0010】

本発明の金属酵素阻害剤は、従来知られていたセレノネインのラジカル消去活性に基づく抗酸化剤としての効果に加えて、金属酵素阻害剤としての新規用途が見出され、新規の血圧降下剤や美白剤として、食品および化粧品の原料として利用することができる。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、セレン含有化合物を有効成分とする金属酵素阻害剤、該金属酵素阻害剤を含有する血圧降下用組成物、並びに美白用および美肌用化粧品および食品に関する。

【0012】

（１）セレン含有化合物
本発明の金属酵素阻害剤の有効成分となるセレン含有化合物は、特許第５６６９０５６号公報に記載の方法に従って得ることができる。本明細書において別段の指示がない限り、「セレン含有化合物」には、「セレン含有組成物」および「セレノネイン」（後述）を含むことが意図される。ここで、セレン含有化合物は、魚類等の生物由来の試料を有機溶媒で抽出することによりセレン濃縮物を得た後、クロマトグラフィーによって分離・精製することによって得ることができる。ここで、「セレン濃縮物」とは、本発明の化学式１〜４に表されるセレン含有化合物（後述）を含むセレン濃縮物を指し、試料を有機溶媒または水で抽出した後、ロータリーエバポレーター等で濃縮して得られるもの等が挙げられる。セレン濃縮物は、溶液状である場合には、本発明のセレン含有化合物を５μｇ／ｍＬ以上を含有しているものであることが好ましい。

【0013】

本発明のセレン含有化合物は、限定されないが、一般的には、式Ｉ：

【0014】

【化2】

【0015】

で表される化合物であり、置換基Ｒが、エルゴチオネイン、グルタチオン、システイン、アセチルシステイン、ホモシステイン、メチル水銀、生体内で生成されると推定されるチオール化合物と結合した「セレン含有化合物」であり、また、「セレン含有化合物」がセレノール基を介して結合した金属や高分子材料も含まれる。

【0016】

一実施形態において、本発明のセレン含有化合物には、式ＩＩ：

【0017】

【化3】

【0018】

で表される３−（２−ヒドロセレノ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエート、および

【0019】

【化4】

【0020】

で表される３−（２−セレノキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエートが挙げられる。上記の通り、式ＩＩおよび式ＩＩＩで表されるセレン含有化合物はいずれもセレン含有化合物の単量体である。式ＩＩのセレン含有化合物は、イミダゾール環の２位の炭素原子にセレノール基が結合した分子構造を有しており、セレノール基はセレノケトン基との平衡状態にある互変異性体を形成することから、溶液状態では溶媒の条件によって、セレノ−ル型（式ＩＩ）とセレノケトン型（式ＩＩＩ）の２つの化学形態を有している。セレノール型異性体に平衡が傾く非極性溶媒存在下では，容易に酸化型二量体が形成される一方、極性溶媒中ではセレノケトン型異性体に化学平衡が片寄り，主に単量体として存在する性質がある。

【0021】

さらに、本発明のセレン含有化合物には、式ＩＶ：

【0022】

【化5】

【0023】

で表される酸化型二量体（３，３'−（２，２’−ジセランジイルビス（１Ｈ−イミダゾール−５，２−ジイル））ビス（２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエート））のイミダゾール環にセレノール基とトリメチルアンモニウム基が結合した分子構造を持つ化合物を基本単位として、この化合物がセレノール基を介してジセレニドを形成した二量体も含まれる。

【0024】

別の実施形態において、本発明のセレン含有化合物は、例えば、式ＩＩで表される化合物（「セレノネイン」）を含有する組成物の形態で提供されてもよい。本発明のセレノネインを含有する組成物は、限定されないが、セレノネイン濃縮物、その乾固物またはセレノネイン精製品をセレンとして１〜１００μｇを含有する錠剤、ペーストまたは飲料の形状であってもよい。サプリメント剤や飲料など食品として利用する場合は、１日あたりのセレンの必要量を服用するのに適した形状に成形するのが望ましい。他の食品素材や甘味料、香料、賦形剤、増粘剤、保存料など食品添加物を含んでいてもよい。皮膚に塗布する化粧品として利用する場合は、尿素、ワセリン、グリセリン、ヒアルロン酸、コラーゲン、セラミド、スクワレンなど他の化粧品素材に対してセレノネイン濃縮物を混合して用いてもよい。

【0025】

本発明のセレン含有化合物の典型例としてのセレノネインの由来原料としては、例えば、マグロ類（クロマグロ、ミナミマグロ、キハダ、メバチ、ビンナガ）、カジキ類（メカジキ、マカジキ、バショウカジキ、クロカジキ）、カツオ類（カツオ、マルソウダガツオ、ヒラソウダガツオ、ハガツオ、スマ）、サバ類（マサバ、ゴマサバ、ノルウェーサバ、ニジョウサバ、グルクマ）、ブリ類、アジ類（マアジ）、イワシ類（マイワシ、カタクチイワシ）、タイ類（マダイ）を含む魚類、イルカ類、ハクジラ類を含む海洋性哺乳類、酵母（Schizosaccharomyces pombe）等の微生物が挙げられる（「水産物のメチル水銀とセレン」化学と生物 50(11), 807-817, 2012-11-01；Genetic and Metabolomic Dissection of the Ergothioneine and Selenoneine Biosynthetic Pathway in the Fission Yeast, S. pombe, and Construction of an Overproduction System, PLoS One. 2014 July 31; 9(7): e105177参照）。

【0026】

セレノネインを含有する製品もまた知られ、セレノネインは、例えば、サバ、カジキ、カツオ、メバチ、ビンナガ、マグロ、アジ、タイを原料とする食品中に含有されると考えられている。具体的には、上記魚類の刺身及び煮付け及び焼き物及び蒸し物及び揚げ物、上記魚類の加工品としては水煮缶詰、油漬缶詰、味付缶詰、マグロ・カツオ角煮、魚肉ソーセージ、カマボコ、さつま揚げ等の練り物、スープ、煮汁濃縮物、液体出汁、顆粒出汁、かつお煎じ、干物、みりん干し、味噌漬け、塩麹漬け、燻製等がある。

【0027】

（２）金属酵素阻害剤
本発明は、上記のセレン含有化合物が、金属酵素、例えば、アンジオテンシン変換酵素（亜鉛酵素）やチロシナーゼ（銅酵素）に対する酵素活性阻害作用を有することを見出し、セレン含有化合物を有効成分として含有する金属酵素阻害剤を提供するものである。本発明の金属酵素阻害剤に含まれるセレン含有化合物の含有量は、金属酵素阻害剤の全重量に対して、１〜９９重量％であってよく、当業者であれば、所望の効果を得るためにセレン含有化合物の含有量を適宜調整することができる。また、セレン含有組成物を有効成分とする場合は、上記の通り、セレンとして１〜１００μｇを含有する形態をとることができる。また、金属酵素阻害剤の原料については、セレノネインを含有するものであれば特に限定されず、例えば、上記魚類、海洋性哺乳類、酵母等の微生物の他、菌糸類、植物、海藻、藻類も原料となり得る。

【0028】

本明細書において、本発明の金属酵素阻害剤との関連で対象とされる「金属酵素」には、限定されないが、分子中に亜鉛、銅、鉄、マンガン、マグネシウム、ニッケル、またはモリブデンである金属原子を含む酵素が挙げられる。

【0029】

金属酵素としては、例えば、アンジオテンシン変換酵素、チロシナーゼのほか、チトクロームＰ４５０ファミリ、ホスホジエステラーゼ、アロマターゼ（ＣＹＰ１９）、シクロオキシゲナーゼ、ラノステロールデメチラーゼ（ＣＹＰ５１）、トロンボキサン合成酵素（ＣＹＰ５ａ）、甲状腺ペルオキシダーゼ、１７−αヒドロキシラーゼ／１７，２０−リアーゼ（ＣＹＰ１７）、アルドステロン合成酵素（ＣＹＰ１１Ｂ２）、チトクロームＰ４５０ ２Ａ６、ヘムオキシゲナーゼ、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ、レチノイン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２６）、ビタミンＤヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２４）、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、５−リポキシゲナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルコール脱水素酵素、アミノペプチダーゼＮ、カルシニューリン、カルバモイルリン酸合成酵素、炭酸脱水酵素ファミリ、カテコール−Ｏ−メチル転移酵素、シクロオキシゲナーゼファミリ、ジヒドロピリミジン脱水素酵素−１、ＤＮＡポリメラーゼ、ファルネシル二リン酸合成酵素、ファルネシル転移酵素、フマル酸還元酵素、ＧＡＢＡアミノ基転移酵素、ＨＩＦ−プロリルヒドロキシラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素ファミリ、ＨＩＶインテグラーゼ、ＨＩＶ−１逆転写酵素、イソロイシンｔＲＮＡリガーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼファミリ、メチオニンアミノペプチダーゼ、中性エンドペプチダーゼ、一酸化窒素合成酵素ファミリ、ホスホジエステラーゼＩＩＩ、ホスホジエステラーゼＩＶ、ホスホジエステラーゼＶ、ピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素、腎臓ペプチダーゼ、リボヌクレオシド二リン酸還元酵素、ウレアーゼおよびキサンチン酸化酵素であるか、あるいは１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、１７−αヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ１７）、アルドステロン合成酵素（ＣＹＰ１１Ｂ２）、アミノペプチダーゼＰ、炭疽菌致死因子、アルギナーゼ、β−ラクタマーゼ、チトクロームＰ４５０ ２Ａ６、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ、ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ、エンドセリン変換酵素−１、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、グルタミニルシクラーゼ、グリオキサラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ、ＨＰＶ／ＨＳＶ Ｅ１ヘリカーゼ、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ、ロイコトリエンＡ４加水分解酵素、メチオニンアミノペプチダーゼ２、ペプチド脱ホルミル酵素、ホスホジエステラーゼＶＩＩ、レラキサーゼ、レチノイン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２６）、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）、ＵＤＰ−（３−Ｏ−（Ｒ−３−ヒドロキシミリストイル））−Ｎ−アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素（ＬｐｘＣ）、血管接着タンパク質−１（ＶＡＰ−１）またはビタミンＤヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２４）などであってもよい。

【0030】

本発明の金属酵素阻害剤はまた、有効成分であるセレン含有化合物以外に、目的に応じて他の成分を含有してもよい。本発明の金属酵素阻害剤に含有され得る他の成分としては、限定されないが、水；アルコール；食肉加工品；米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、コンブ、ワカメ、テングサなどの一般食品材料およびそれらの粉末；デンプン、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどの糖類；香辛料、甘味料、食用油、ビタミン類などの一般的な食品添加物；界面活性剤；賦形剤；着色料；保存料；コーティング助剤；ラクトース；デキストリン；コーンスターチ；ソルビトール；結晶性セルロース；ポリビニルピロリドン；油分；保湿剤；増粘剤；防腐剤；香料；ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。本発明の金属酵素阻害剤は、さらに、必要に応じて他の薬剤を含有してもよい。このような他の成分および／または他の薬剤の含有量は、特に限定されず、当業者によって適宜選択され得る。

【0031】

（３）金属酵素阻害剤の酵素活性
本発明の金属酵素阻害剤の酵素活性は、一般的に知られている方法に従って測定することができる。
ａ．アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性の測定
アンジオテンシン変換酵素（ＥＣ３．４．１５．１）活性は、アンジオテンシンＩのアナログであるＮ−ヒプリル−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを基質とし、その加水分解によって生成する馬尿酸量を測定することによって決定することができる（食品機能研究法（光琳），１０９−１１２，２０００）。本発明の金属酵素阻害剤によるＡＣＥ阻害活性の測定は、本発明の金属酵素阻害剤に有効成分として含有されるセレン含有組成物、例えば、セレノネインを含有する濃縮物や精製品をホウ酸緩衝液中に溶解し、阻害活性測定用の希釈液を調製して、ＡＣＥ活性測定用反応液に添加することにより、基質の分解によって生じる馬尿酸量の低下を測定することによって行うことができる。

【0032】

この方法において、例えば、セレノネインと、ＡＣＥ阻害活性を有し、血圧降下作用が報告されている食品由来のペプチドであるバリルチロシン（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５（２），４０１−４０７，１９８０）とを同濃度で阻害活性について比較すると、セレノネインは、バリルチロシンが阻害活性を示さない濃度でＡＣＥを阻害する（実施例１）。カプトプリルという血圧降下剤のセレンアナログ（ＳｅＣａｐ）は、ＡＣＥの活性中心の亜鉛イオンに配位し、阻害作用を示すことが報告されている（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，９，１３５６−１３６５，２０１１；ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，２７８，３６４４−３６５０，２０１１）。そのため、セレノネインのＡＣＥ阻害作用も、Ｓｅの亜鉛イオンへの配位によるものと予想される。これらのことから、セレノネインは、従来のＡＣＥ阻害ペプチドよりも強い阻害能を有する。また、サケ卵やホタテ外套膜、オキアミ、サバ（特開２００５−１４５８２７号；特開２００８−３７７６６号；特開２０１０−２４１６５号；特開２０１３−４３８３９号）、マグロ、イワシ、ワカメ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１，３３２−３３７，１９８８；栄食誌，５２，２７１−２７７，１９９９；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，５０，６１−６６，２００２）といった水産物由来のペプチドの他、乳タンパク質、酒粕由来のペプチド（特開２００８−３０８４４５号；特表２０１１−５２６６００号）といったＡＣＥ阻害ペプチドのように、基質と競合するのではなく、酵素に直接作用して阻害する天然成分として、食品原料などに利用可能である。

【0033】

ｂ．セレン含有組成物によるチロシナーゼ阻害活性の測定
希釈したセレン含有組成物（例えば、セレノネイン）溶液をリン酸緩衝液中でチロシナーゼ（ＥＣ１．１４．１８．１）と混合し、チロシナーゼの基質であるＬ−ＤＯＰＡを加えると、Ｌ−ＤＯＰＡの酸化による溶液の褐色変化が抑制される。チロシナーゼは、チロシンとＬ−ＤＯＰＡを基質として、それらを酸化し、褐色のＤＯＰＡキノンを生成する。チロシナーゼは、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の一種であり、活性中心に銅イオンを有する金属酵素である。チロシナーゼの構造的特徴から、セレノネインは、活性中心の銅イオンに配位し、チロシナーゼを阻害すると予想される。チロシナーゼ精製品に対するセレノネインの阻害活性測定によって、セレノネインのチロシナーゼ阻害能は、チロシナーゼ阻害剤として知られているビタミンＣ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９３）２９５，３０９−３１２）よりも強いことを確認することができる。

【0034】

インビトロにおけるメラニン合成試験は、メラニン細胞であるＢ１６メラノーマ４Ａ５細胞を用いることによって測定することができる。メラニン細胞の培地に対して、メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の添加によって細胞内のメラニン量が増加するが（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４（７），１５０４−１５０６，２０１０）、セレン含有組成物（例えば、セレノネイン）の培地への添加によって、メラニン合成能は、抑制される。セレノネインのメラニン合成抑制作用は、皮膚の色素沈着の予防剤として利用されているアルブチン（特開平５―０８５９２６号）よりも強い。

【0035】

これらの結果から、セレノネインは、金属酵素であるチロシナーゼを阻害し、生体でのメラニン合成を抑制する。そのため、セレノネインをポリフェノールオキシダーゼ阻害剤として、酸化的褐色変化と、酵素的褐色変化防止剤として利用することができる。さらに、メラニン合成を抑制する点から、シミ予防剤、美白剤としても利用できる。

【0036】

（４）用途
本発明のセレン含有組成物を有効成分とする金属酵素阻害剤は、上記の通り、血圧調節に関わるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）や、シミ形成の原因物質であるメラニンの合成に関与するチロシナーゼを有効に阻害することができるため、本発明の金属酵素阻害剤は、血圧降下作用、ならびに美白および美肌効果が期待される。ここで、本明細書で使用するとき、「血圧降下作用」とは、高血圧症の発症者およびその予備軍（健常者に対して軽度に高血圧の者）に対する血圧降下作用を意味する。すなわち、高血圧症の発症者およびその予備軍に対しては、血圧降下作用により正常に近い血圧に戻す作用である。そのため、本発明の金属酵素阻害剤は、高血圧症の予防、改善および治療のための、例えば、血圧降下剤、血圧降下用組成物、および血圧降下用医薬組成物として提供される。また、本発明の金属酵素阻害剤は、メラニン合成に関与するチロシナーゼ活性を阻害できることから、シミの予防および除去、美白効果が期待される。また、本発明の金属酵素阻害剤は、上述のさまざまな金属酵素類に対する阻害作用によって、これらの金属酵素が関与する代謝の抑制または向上、体質の改善などの生理・生化学的効果が期待される。

【0037】

ａ．血圧降下作用
本発明の金属酵素阻害剤は、血圧降下作用を有する組成物（食品、医薬組成物を含む）として提供され得る。より具体的には、本発明のセレン含有化合物を含む金属酵素阻害剤は、高血圧を予防および／または改善するための健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、機能性表示食品の形態であってもよい。別の態様では、本発明の金属酵素阻害剤は、高血圧症を予防、改善および／または治療するための医薬組成物の形態であってもよい。

【0038】

本発明によれば、セレン含有化合物による金属酵素阻害活性を損なわない限りにおいて、血圧降下作用組成物および医薬組成物（以下、単に「本発明の組成物等」という場合がある。）には、所望の製品形態に応じた食品または医薬として許容されうる担体や、他の添加剤を含んでもよい。このような担体および添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、崩壊剤、滑沢剤、防腐剤等が挙げられる。本発明の組成物等は、経口または非経口的に投与または摂取することができる。経口用の形態としては、例えば、食品、食品添加剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤などの固形製剤、溶液、懸濁液、乳濁液などの液状製剤の形態が挙げられる。非経口用の形態としては、例えば、注射剤、点滴剤、外用剤や座剤の形態が挙げられる。これらは、当該技術分野で通常行われている手法により、必要に応じて担体や添加剤とともに、製剤化もしくは製品化することができる。

【0039】

本発明に係る金属酵素阻害剤において、所望のＡＣＥ阻害効果を得るためには、上述した有効成分であるセレン含有化合物を成人一人の体重１ｋｇあたり、１日に１ｎｇ〜６０μｇ投与または摂取することが好ましく、より好ましくは５ｎｇ〜２７．１μｇであり、さらに好ましくは１０ｎｇ〜１４．５μｇである。また、本発明においては、この量の有効成分を１日１〜数回に分けて、阻害剤そのままの形態で、または、食品、組成物、医薬、飲食品等の所望の形態とした上で、投与または摂取すればよい。

【0040】

なお、本発明の金属酵素阻害剤は、上記の通り、食品用途として提供され得るものであるが、本発明によれば、該金属酵素阻害剤を用いた、高血圧症の患者を予防、改善および／または治療する方法が提供され得る。

【0041】

ｂ．美白および美肌効果
本発明の金属酵素阻害剤は、これを含有する美白および／または美肌効果を有する組成物（食品、医薬組成物を含む）、化粧品として提供され得る。組成物に関しては、上記の血圧降下作用組成物に準ずる。一方、化粧品としては、本発明の金属酵素阻害剤によるメラニン細胞におけるメラニン合成を抑制する効果に起因したシミ発生の予防やシミの除去、皮膚の美白用および美肌用の化粧水、化粧クリーム、乳液、クリーム、パック、ヘアトニック、ヘアクリーム、シャンプー、ヘアリンス、トリートメント、ボディシャンプー、洗顔剤、石鹸、ファンデーション、スプレーなどが提供され得る。化粧品に含有される本発明の金属酵素阻害剤の含有量は、当業者により適宜調整することができる。

【0042】

以下の実施例は、本開示の様々な態様を例証する。材料と方法の両方に対する多数の修飾は、本開示の範囲から逸脱せずに実施されてもよいことは当業者に明らかである。市販品供給業者から購入される全ての試薬および溶媒は、さらに精製又は加工することなしに使用される。

【実施例】

【0043】

実施例１：アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性の測定
精製されたセレノネインを用いて、ＡＣＥ阻害活性を測定した（食品機能研究法（光琳），１０９−１１２，２０００）。具体的には、Ｎ−ヒプリル−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ水和物を基質とし、ウサギ肺由来ＡＣＥとの酵素反応による、馬尿酸の生成量から活性を測定した。ウサギ肺由来アセトンパウダー（Ｓｉｇｍａ社製）０．５ｇに、ｐＨ８．３の２００ｍＭホウ酸緩衝液を５ｍＬ加え、４℃でホモジナイズした。ホモジネートを１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を２００ｍＭホウ酸緩衝液で５倍希釈し、ＡＣＥ溶液とした。Ｎ−ヒプリル−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ水和物（Ｓｉｇｍａ社製）を７．６ｍＭになるように、６０８ｍＭ ＮａＣｌ含有２００ｍＭホウ酸緩衝液に溶解し、基質溶液とした。セレノネインは、１、５、２５μＭに蒸留水で調製した。バリルチロシン（Ｓｉｇｍａ社製）は、２５μＭ、２５ｍＭに蒸留水で調製した。

【0044】

試験管に各濃度のセレノネイン、バリルチロシン３０μＬと、基質溶液２５０μＬを加え、３７℃で５分間加熱した。コントロール群は、セレノネイン、バリルチロシンの代わりに蒸留水３０μＬを加えた。ＡＣＥ溶液１００μＬを加え、撹拌後、３７℃で２０分間加熱した。反応時のバリルチロシンとセレノネインの終濃度は、バリルチロシン１．９７μＭ、１．９７ｍＭ、セレノネイン０．０７８９μＭ、０．３９５μＭ、１．９７３μＭであった。加熱後、１Ｎ塩酸２５０μＬを加えて反応を停止した。ブランク群では、ＡＣＥ溶液を加える前に１Ｎ塩酸２５０μＬを加え、酵素を失活させた。酢酸エチル１．５ｍＬを加え、よく撹拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上層を１ｍＬ回収し、遠心エバポレーターで溶媒を除去した後、蒸留水４ｍＬを加え、馬尿酸を溶解した。２２８ ｎｍで吸光度を測定し、ＡＣＥ活性を測定した。
ＡＣＥ活性（％）＝（測定吸光度−ブランク吸光度）／（コントロール吸光度−ブランク吸光度）×１００
その結果、セレノネインは濃度依存的にＡＣＥ活性を阻害した。また、１．９７３μＭバリルチロシンはＡＣＥ阻害活性を示さなかったが、１．９７３μＭセレノネインはＡＣＥ活性を約７８．２％阻害した。

【0045】

実施例２：ＡＣＥ阻害活性の比較（１）
実施例１と同様の実験方法でセレノネインとエルゴチオネイン（Ｓｉｇｍａ社製）のＡＣＥ阻害活性を比較した。セレノネインは２５μＭ、エルゴチオネインは５および２５μＭに蒸留水で調製し、反応時の終濃度をセレノネイン１．９７３μＭ、エルゴチオネインを０．３９５μＭ、１．９７３μＭとした。その結果、エルゴチオネインは０．３９５μＭ、１．９７３μでＡＣＥ阻害活性を示さなかった。

【0046】

実施例３：ＡＣＥ阻害活性の比較（２）
実施例１と同様の実験方法でセレノネインと亜セレン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）のＡＣＥ阻害活性を比較した。セレノネインは２５μＭ、亜セレン酸ナトリウムは５、２５μＭに蒸留水で調製した。その結果、亜セレン酸ナトリウムは５、２５μＭでＡＣＥ阻害活性を示さなかった。

【0047】

実施例４：マグロからのセレノネイン水溶液の調製
マグロから抽出、精製し、蒸留水に溶解して、１．５８ｍＭ調製したセレノネイン水溶液を原液とした。原液をさらに蒸留水で希釈し、６Ｎ塩酸と１Ｎ水酸化ナトリウムを用いることでｐＨ７．２４に調製し、１９０μＭに希釈した。

【0048】

実施例５：チロシナーゼ阻害活性の測定
実施例４で作成したセレノネイン水溶液を用いて、チロシナーゼ活性阻害試験を行った（沖縄県工業技術センター研究報告書，第１０号，６１−６３，２００８）。９６ｗｅｌｌマイクロプレートに、ｐＨ６．８の０．１Ｎリン酸緩衝液を１００μＬを添加し、さらに、１、１０、１００μＭに調製したセレノネイン水溶液を２０μＬ加えた。１００μＭセレノネイン水溶液は薄い黄色を示したため、各セレノネイン濃度でブランク群を設置した。酵素溶液として、ｐＨ６．８の０．１Ｎリン酸緩衝液に溶解した４０Ｕ／ｍＬに調製したマッシュルーム由来チロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液４０μＬをすべてのｗｅｌｌに加えた後、十分に撹拌し、２０℃で３分間インキュベートした。ブランク群のｗｅｌｌにミリＱ水を５０μＬ添加した。残りのｗｅｌｌには基質溶液として２．５ｍＭ ＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓｉｇｍａ社製）を５０μＬ加え、ただちに４９０ｎＭの吸光度（Ａｓ０）を測定した。２０℃で１０分後、４９０ｎｍの吸光度（Ａｓ１０）を測定した。反応時のセレノネインの終濃度はそれぞれ０．０９５μＭ、０．９５μＭ、９．５μＭであった。
チロシナーゼ阻害率（％）は１００−［１００＊｛（Ａｓ１０−Ａｂ１０）−（Ａｓ０−Ａｂ０）｝／（Ａｃ１０−Ａｃ０）］
として算出した（Ａｃ：コントロール群の吸光度、Ａｂ：ブランク群の吸光度）。

【0049】

実施例６：チロシナーゼ阻害活性の経時的変化
基質溶液の濃度を５．０ｍＭとして、実施例５と同様の方法でチロシナーゼ活性の経時変化を測定した。同時にエルゴチオネイン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＣのチロシナーゼ阻害活性を測定した。反応終濃度はセレノネインで１、１０μＭ、エルゴチオネイン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＣは１０μＭとした。その結果、終濃度１０μＭセレノネイン群のチロシナーゼ活性は０から６０分の間、常に他の群よりも低かった。抗酸化作用が報告されており、美白剤として化粧品成分として利用されているビタミンＣのチロシナーゼ活性は、６０分後でコントロール群の約０．９０７倍であった。セレノネインの６０分後のチロシナーゼ活性はコントロール群の約０．４４９倍であり、強いチロシナーゼ活性抑制作用を有することが示された。

【0050】

実施例７：メラノーマ細胞におけるメラニン合成阻害活性測定のための試料調製
マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６メラノーマ４Ａ５）を用いて、セレノネインが細胞のメラニン合成に与える影響を検証した（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０（６），１４９９−１５０１，２００６）。Ｂ１６メラノーマ４Ａ５は理研細胞バンクから購入し、１０％非動化済ＦＢＳと１％ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（ＧＥ社製）で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下培養した。Ｂ１６メラノーマ４Ａ５を１２ｗｅｌｌプレートに２．０×１０^５細胞／ｍＬで１ｍＬ播種した。２４時間後、培地を除去し、終濃度でそれぞれ１μＭセレノネイン、１μＭセレノネイン＋１μＭ α−ＭＳＨ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）、１μＭエルゴチオネイン＋１μＭ α−ＭＳＨ、１μＭ亜セレン酸ナトリウム＋１μＭ α−ＭＳＨ、１μＭビタミンＣ＋１μＭ α−ＭＳＨ、１μＭアルブチン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１μＭ α−ＭＳＨとしてＤＭＥＭ培地（１０％非動化済ＦＢＳ・１％ペニシリン・ストレプトマイシン）を調製し、ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０２０ＡＮ（Ａｖａｎｔｉ社製）で濾過滅菌したものを１ｍｌ加えた。培地に添加する前の各試験物質とα−ＭＳＨはミリＱ水で１００μＭに調製したものを用いた。コントロール、コントロール＋α−ＭＳＨ群には、試験物質とα−ＭＳＨの代わりにミリＱ水を添加した。

【0051】

３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養し、添加後２４、４８時間後に同様の組成の培地に交換した。最初の添加から７２時間後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを除去した後、細胞をプロテアーゼ阻害剤ミックス（ＤＭＳＯ溶液、動物細胞・組織抽出液用、和光純薬工業社製）を加えたＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ＮＰ−４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）５００μＬに溶解し、１．５ｍＬチューブに回収した。４℃で１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し上清５００μＬを回収し、チロシナーゼ活性測定用の試料として−４０℃で保存した。上清を回収した後の１．５ｍＬチューブに１Ｎ ＮａＯＨを２５０μＬ加え、沈殿を溶解し、メラニン定量用の試料として−４０℃で保存した。

【0052】

実施例８：メラニン合成阻害活性の測定
実施例７で得た試料を用いてチロシナーゼ活性の測定を行った（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０（６），１４９９−１５０１，２００６）。室温で試料を融解した後、５０μＬを９６ｗｅｌｌプレートに添加し、実施例５で用いたリン酸緩衝液１００μＬに溶解した。２５ｍＭ ＤＯＰＡを５０μＬ加えた直後、３７℃で４７５ｎｍの吸光度を測定した。その後３７℃でインキュベートし、吸光度を５分ごとに６０分間測定した。その結果、セレノネインはα−ＭＳＨを添加した時に上昇するチロシナーゼ活性を抑制した。

【0053】

実施例９：試料中のメラニン含量の測定
実施例７で得られた試料を用いて、細胞内のメラニンを定量した。試料を室温で融解した後、キャップを閉めた状態で、１００℃ ５分間の加熱を行った。卓上遠心機で３秒間遠心し、ボルテックスミキサーで十分に撹拌した後、１００μＬを９６ｗｅｌｌプレートに供した。また、メラニン標準品（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）を０、２、２０、１００、２００ｎｇ／１００μＬで供し、検量線を作成した。

【0054】

その結果、α−ＭＳＨの添加により、細胞のメラニン量は４６．１ｎｇ／ｗｅｌｌから１０３．１ｎｇ／ｗｅｌｌに上昇した。α−ＭＳＨと同時にセレノネインを添加した場合、メラニン量は４７．９ｎｇ／ｗｅｌｌとなり、メラニン合成の抑制が確認された。エルゴチオネイン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＣには抑制作用が認められなかった。

【0055】

上記から、本開示の具体的な実施形態は本明細書において例示を目的として記載されているが、様々な修正が本開示の精神と範囲から逸脱することなく行われてもよいことを理解されたい。従って、本開示は、添付の特許請求の範囲による場合を別として、限定されない。さらに、特許請求の範囲は、その全範囲および同等物に権利を有する。

【産業上の利用可能性】

【0056】

本発明のセレン含有化合物を有効成分として含有する金属酵素阻害剤は、血圧降下剤や美白剤として期待され得る。特に、水産加工残滓から抽出したセレノネイン濃縮物の新たな用途が見出されたことから、低未利用水産物の高付加価値化に貢献することができる。消費者の健康志向に対応する新たな食材や機能性素材を商品化することができる。

【0057】

本明細書に引用する全ての刊行物および特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。