特許 6824654 細胞情報取得方法および細胞情報取得装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6824654

(24)【登録日】2021年1月15日

(45)【発行日】2021年2月3日

(54)【発明の名称】細胞情報取得方法および細胞情報取得装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/483 20060101AFI20210121BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20210121BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20210121BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/483 C

   G01N33/48 P

   G01N21/64 F

【請求項の数】28

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2016-145835(P2016-145835)

(22)【出願日】2016年7月25日

(65)【公開番号】特開2017-83426(P2017-83426A)

(43)【公開日】2017年5月18日

【審査請求日】2019年3月28日

(31)【優先権主張番号】特願2015-215201(P2015-215201)

(32)【優先日】2015年10月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100111383

【弁理士】

【氏名又は名称】芝野 正雅

(72)【発明者】

【氏名】吉川 景子

【審査官】 倉持 俊輔

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−２２５３８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−０９６８４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−３０１５６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０３２１８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０３６１４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０００−５０９８２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０６８００２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１２５０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１５／０１３２７６６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０２７８４７１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 RAJ Arjun et al.，Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes，Nature Methods，２００８年１０月，Vol.5, No.10，pp.877-879

【文献】 LUBECK Eric, Cai Long，Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling，Nature Methods，２０１２年 ７月，Vol.9, No.7，pp.743-748

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８３，３３／５８，

Ｇ０１Ｎ １５／１４，

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞に含まれる被検物質に、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、
前記細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して前記複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、
生じた前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記被検物質が核に局在しているか細胞質に局在しているかを判別する、細胞情報取得方法。

【請求項2】

細胞に含まれる被検物質に、基質を接触させて互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を生じさせ、
前記細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して前記複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、
生じた前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記被検物質が核に局在しているか細胞質に局在しているかを判別する、細胞情報取得方法。

【請求項3】

前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する、請求項１または２に記載の細胞情報取得方法。

【請求項4】

前記複数の蛍光物質は、励起用の光の波長が互いに異なっている、請求項１ないし３の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。

【請求項5】

前記複数の蛍光物質は、同一波長の光が照射されることにより生じる蛍光の波長および強度が互いに異なっている、請求項１ないし３の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。

【請求項6】

前記複数の蛍光物質から生じた各蛍光を、第１の蛍光と、前記第１の蛍光より強度の弱い第２の蛍光と、に分離する、請求項１ないし５の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。

【請求項7】

細胞に含まれる被検物質に蛍光物質を結合させ、
前記細胞に光を照射して１種類の前記蛍光物質から所定波長幅の蛍光を生じさせ、
生じた前記所定波長幅の蛍光を波長帯域により分割して波長および強度の異なる複数の蛍光を取得し、
取得した前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する、細胞情報取得方法。

【請求項8】

細胞に含まれる被検物質に基質を接触させて蛍光物質を生じさせ、
前記細胞に光を照射して１種類の前記蛍光物質から所定波長幅の蛍光を生じさせ、
生じた前記所定波長幅の蛍光を波長帯域により分割して波長および強度の異なる複数の蛍光を取得し、
取得した前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する、細胞情報取得方法。

【請求項9】

前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の局在状況を判別する、請求項７または８に記載の細胞情報取得方法。

【請求項10】

前記蛍光物質から生じた前記蛍光を、第１の蛍光と、前記第１の蛍光より強度の弱い第２の蛍光と、に分離する、請求項７ないし９の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。

【請求項11】

第１の光が照射された前記細胞から生じた第１の蛍光波長の第１の蛍光画像を取得し、
前記第１の光より強度の弱い第２の光が照射された前記細胞から生じた第２の蛍光波長の第２の蛍光画像を取得する、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。

【請求項12】

前記細胞を含む試料をフローセルに流し、
前記フローセルを流れる前記細胞に光を照射して、前記蛍光を生じさせる、請求項１ないし１１の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。

【請求項13】

前記被検物質の前記局在状況の判別は、前記細胞の解析対象部位における前記被検物質の局在量の、前記細胞全体における前記被検物質の量に対する割合の算出を含む、請求項９に記載の細胞情報取得方法。

【請求項14】

前記被検物質の前記局在状況の判別は、強度が異なる複数の前記蛍光から得られた前記蛍光情報のうち、前記強度が所定の範囲に含まれる前記蛍光から得られた前記蛍光情報に基づいて行われる、請求項９または１３に記載の細胞情報取得方法。

【請求項15】

前記被検物質の前記局在状況の判別は、強度が異なる複数の前記蛍光から得られた前記蛍光情報のうち、前記細胞の解析対象部位における蛍光強度と、前記解析対象部位以外の前記細胞部分における蛍光強度との差が、所定の閾値より大きい前記蛍光情報に基づいて行われる、請求項９、１３、または１４の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。

【請求項16】

前記被検物質は、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、細胞質、細胞小器官、または細胞膜である、請求項１ないし１５の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。

【請求項17】

試料に含まれる前記細胞のうち前記被検物質が特定の部位に局在する細胞の割合または数を、前記複数の蛍光情報に基づいて算出する、請求項１ないし１６の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。

【請求項18】

互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質が結合した被検物質を含む細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して、前記複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせる光照射部と、
前記複数の蛍光物質から生じた前記各蛍光を受光する受光部と、
強度が異なる前記蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得する取得部と、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記被検物質が核に局在しているか細胞質に局在しているかを判別する解析部と、を備える、細胞情報取得装置。

【請求項19】

前記複数の蛍光物質から生じた各蛍光を分離するためのフィルタ部材を備える、請求項１８に記載の細胞情報取得装置。

【請求項20】

第１の蛍光を受光する第１の受光部と、前記第１の蛍光より強度の弱い第２の蛍光を受光する第２の蛍光を受光する第２の受光部と、を備える、請求項１８または１９の何れか一項に記載の細胞情報取得装置。

【請求項21】

前記取得部は、第１の光が照射された前記細胞から生じた第１の蛍光波長の第１の蛍光画像と、前記第１の光より強度の弱い第２の光が照射された前記細胞から生じた第２の蛍光波長の第２の蛍光画像を取得する、請求項１８ないし２０の何れか一項に記載の細胞情報取得装置。

【請求項22】

蛍光物質が結合した被検物質を含む細胞に光を照射して１種類の前記蛍光物質から所定波長幅の蛍光を生じさせる光照射部と、
前記１種類の蛍光物質から生じた前記所定波長幅の蛍光を波長帯域により分割して波長および強度の異なる複数の蛍光を受光する受光部と、
受光した前記複数の蛍光に基づいて、複数の蛍光情報を取得する取得部と、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する解析部と、を備える、細胞情報取得装置。

【請求項23】

基質に接触することにより蛍光物質を生じさせた被検物質を含む細胞に光を照射して１種類の前記蛍光物質から所定波長幅の蛍光を生じさせる光照射部と、
前記１種類の蛍光物質から生じた前記所定波長幅の蛍光を波長帯域により分割して波長および強度の異なる複数の蛍光を受光する受光部と、
受光した前記複数の蛍光に基づいて、複数の蛍光情報を取得する取得部と、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する解析部と、を備える、細胞情報取得装置。

【請求項24】

前記蛍光物質から生じた前記蛍光を、第１の蛍光と、強度の弱い第２の蛍光と、に分離するためのフィルタ部材を備える、請求項２２または２３に記載の細胞情報取得装置。

【請求項25】

細胞に含まれる被検物質に、同一波長の光が照射されることにより生じる蛍光の波長および強度が互いに異なる複数の蛍光物質を結合させ、
前記細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して前記複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、
生じた前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得する、細胞情報取得方法。

【請求項26】

細胞に含まれる被検物質に、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、
前記細胞を含む試料をフローセルに流し、
前記フローセルを流れる前記細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して前記複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、
生じた前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得する、細胞情報取得方法。

【請求項27】

細胞に含まれる被検物質に、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、
前記細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して前記複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、
生じた前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、
強度が異なる複数の前記蛍光から得られた前記蛍光情報のうち、前記強度が所定の範囲に含まれる前記蛍光から得られた前記蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の局在状況を判別する、細胞情報取得方法。

【請求項28】

細胞に含まれる被検物質に、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、
前記細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して前記複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、
生じた前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、
強度が異なる複数の前記蛍光から得られた前記蛍光情報のうち、前記強度が所定の範囲に含まれる前記蛍光から得られた前記蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の局在状況を判別し、
前記被検物質の前記局在状況の判別は、前記細胞の解析対象部位における前記被検物質の局在量の、前記細胞全体における前記被検物質の量に対する割合の算出を含む、細胞情報取得方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞情報取得方法および細胞情報取得装置に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞の増殖や分化を始めとする様々な生命現象は、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどの種々の分子の細胞における局在が関与している。細胞における種々の分子の局在を解析することは、分子の機能解析、タンパク質間相互作用の解析、シグナル伝達経路の解析など、多くの生命現象の解明につながることが期待される。

【0003】

以下の特許文献１には、細胞内における分子の局在について、蛍光顕微鏡およびイメージングフローサイトメータにより解析する方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２００５／０９８４３０号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

由来を同じくする同種の細胞であっても、個々の細胞は多様であるため、たとえば、図２３（ａ）に示すように、特定の分子が特定の部位に局在している細胞もあれば、図２３（ｂ）に示すように、特定の分子が別の部位に局在している細胞もある。また、たとえば、図２３（ｃ）に示すように、種々の要因により分子の量が細胞間において均一でないこともある。そして、発明者は、細胞における分布および量が多様な分子から情報を取得しようとすると、取得結果にばらつきが生じてしまうことを見いだした。よって、このように細胞における分布および量が多様な分子を、精度良く解析する手法が望まれる。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の第１の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞に含まれる被検物質に、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、細胞に、第１の光および第１の光より強度の弱い第２の光を照射して複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、生じた各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、複数の蛍光情報に基づいて、被検物質が核に局在しているか細胞質に局在しているかを判別する。

【0007】

本態様に係る細胞情報取得方法において、「互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質」とは、光が照射されたときに、複数の蛍光物質が、それぞれ互いに異なる波長の蛍光を発することを示す。複数の蛍光物質から波長および強度が異なる蛍光を生じさせるためには、たとえば、複数の蛍光物質において励起用の光の波長が互いに異なっている場合、細胞に対して波長および強度の異なる複数の光を照射する。蛍光情報は、たとえば、蛍光に基づく画像である。なお、「被検物質に複数の蛍光物質を結合させる」とは、必ずしも細胞に含まれる同種の被検物質の各分子の全てが複数の蛍光物質と結合していなくてもよく、少なくとも一部の同種の被検物質の分子に複数の蛍光物質が特異的に結合していればよいことを示す。

【0008】

細胞における被検物質の分布および量が多様である場合、蛍光物質から生じる蛍光の強度は強すぎる場合や弱すぎる場合があるため、１つの蛍光情報を用いて必ずしも被検物質の分布状況等を適正に判別できるとは限らない。しかしながら、本態様に係る細胞情報取得方法によれば、被検物質に結合する複数の蛍光物質から強度が異なる蛍光を生じさせ、強度が異なる蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得できる。これにより、一の蛍光情報においては、蛍光が強すぎるために被検物質の分布状況等を適正に判別できない場合でも、他の蛍光情報を用いれば、被検物質の分布状況等を適正に判別できるようになる。よって、いずれかの蛍光情報を用いれば被検物質の分布状況等を適正に判別できるようになるため、細胞における被検物質の分布および量が多様であっても、被検物質を精度良く解析できる。

【0009】

本発明の第２の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞に含まれる被検物質に、基質を接触させて互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を生じさせ、細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、生じた蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、複数の蛍光情報に基づいて、被検物質が核に局在しているか細胞質に局在しているかを判別する。

【0010】

本態様に係る細胞情報取得方法において、細胞に含まれる被検物質に基質を接触させて互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を生じさせることにより、被検物質を複数の蛍光物質で標識する。本態様に係る細胞情報取得方法においても、第１の態様と同様、いずれかの蛍光情報を用いれば被検物質の分布状況等を適正に判別できるようになるため、被検物質を精度良く解析できる。

【0011】

本発明の第３の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞に含まれる被検物質に蛍光物質を結合させ、細胞に光を照射して１種類の蛍光物質から所定波長幅の蛍光を生じさせ、生じた所定波長幅の蛍光を波長帯域により分割して波長および強度の異なる複数の蛍光を取得し、取得した各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、複数の蛍光情報に基づいて、細胞における被検物質の分布状況を判別する。

【0012】

本態様に係る細胞情報取得方法において、被検物質には１種類の蛍光物質が結合される。生じた蛍光から波長および強度の異なる複数の蛍光を取得するためには、たとえば、蛍光物質から生じた蛍光を、透過波長帯域の異なる複数のフィルタ部材に通して分離する。なお、本態様に係る細胞情報取得方法においても、蛍光情報は、たとえば、蛍光に基づく画像である。また、必ずしも細胞に含まれる同種の被検物質の各分子の全てが蛍光物質と結合していなくてもよく、少なくとも一部の同種の被検物質の分子に蛍光物質が特異的に結合していればよい。本態様に係る細胞情報取得方法においても、第１の態様と同様、いずれかの蛍光情報を用いれば被検物質の分布状況等を適正に判別できるようになるため、被検物質を精度良く解析できる。

【0013】

本発明の第４の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞に含まれる被検物質に基質を接触させて蛍光物質を生じさせ、細胞に光を照射して１種類の蛍光物質から所定波長幅の蛍光を生じさせ、生じた所定波長幅の蛍光を波長帯域により分割して波長および強度の異なる複数の蛍光を取得し、取得した各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、複数の蛍光情報に基づいて、細胞における被検物質の分布状況を判別する。

【0014】

本態様に係る細胞情報取得方法において、細胞に含まれる被検物質に基質を接触させて蛍光物質を生じさせることにより、被検物質を蛍光物質で標識する。本態様に係る細胞情報取得方法においても、第３の態様と同様、いずれかの蛍光情報を用いれば被検物質の分布状況等を適正に判別できるようになるため、被検物質を精度良く解析できる。

【0015】

本発明の第５の態様は、細胞情報取得装置に関する。本態様に係る細胞情報取得装置は、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質が結合した被検物質を含む細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して、複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせる光照射部と、複数の蛍光物質から生じた各蛍光を受光する受光部と、強度が異なる蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得する取得部と、複数の蛍光情報に基づいて、被検物質が核に局在しているか細胞質に局在しているかを判別する解析部と、を備える。

【0016】

本態様に係る細胞情報取得装置によれば、第１の態様と同様の効果が奏され得る。

【0017】

本発明の第６の態様は、細胞情報取得装置に関する。本態様に係る細胞情報取得装置は、蛍光物質が結合した被検物質を含む細胞に光を照射して１種類の蛍光物質から所定波長幅の蛍光を生じさせる光照射部と、１種類の蛍光物質から生じた所定波長幅の蛍光を波長帯域により分割して波長および強度の異なる複数の蛍光を受光する受光部と、受光した複数の蛍光に基づいて、複数の蛍光情報を取得する取得部と、複数の蛍光情報に基づいて、細胞における被検物質の分布状況を判別する解析部と、を備える。

【0018】

本態様に係る細胞情報取得装置によれば、第３の態様と同様の効果が奏され得る。

【0019】

本発明の第７の態様は、細胞情報取得装置に関する。本態様に係る細胞情報取得装置は、基質に接触することにより蛍光物質を生じさせた被検物質を含む細胞に光を照射して１種類の蛍光物質から所定波長幅の蛍光を生じさせる光照射部と、１種類の蛍光物質から生じた所定波長幅の蛍光を波長帯域により分割して波長および強度の異なる複数の蛍光を受光する受光部と、受光した複数の蛍光に基づいて、複数の蛍光情報を取得する取得部と、複数の蛍光情報に基づいて、細胞における被検物質の分布状況を判別する解析部と、を備える。

【0020】

本態様に係る細胞情報取得装置によれば、第４の態様と同様の効果が奏され得る。
本発明の第８の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞に含まれる被検物質に、同一波長の光が照射されることにより生じる蛍光の波長および強度が互いに異なる複数の蛍光物質を結合させ、細胞に、第１の光および第１の光より強度の弱い第２の光を照射して複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、生じた前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得する。
本発明の第９の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞に含まれる被検物質に、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、細胞を含む試料をフローセルに流し、フローセルを流れる細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、生じた各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得する。
本発明の第１０の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞に含まれる被検物質に、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、細胞に、第１の光および第１の光より強度の弱い第２の光を照射して複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、生じた各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、強度が異なる複数の蛍光から得られた蛍光情報のうち、強度が所定の範囲に含まれる蛍光から得られた蛍光情報に基づいて、細胞における被検物質の局在状況を判別する。
本発明の第１１の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞に含まれる被検物質に、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、細胞に、第１の光および前記第１の光より強度の弱い第２の光を照射して複数の蛍光物質から波長および強度が互いに異なる複数の蛍光を生じさせ、生じた各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、強度が異なる複数の蛍光から得られた蛍光情報のうち、強度が所定の範囲に含まれる蛍光から得られた蛍光情報に基づいて、細胞における被検物質の局在状況を判別し、被検物質の局在状況の判別は、細胞の解析対象部位における被検物質の局在量の、細胞全体における被検物質の量に対する割合の算出を含む。

【発明の効果】

【0021】

本発明によれば、細胞における分布および量が多様な分子を、精度良く解析できる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、実施形態１に係る細胞情報取得方法を示すフローチャートである。

【図2】図２は、実施形態１に係る蛍光取得の概要を示す図である。

【図3】図３は、実施形態１に係る高強度の蛍光および低強度の蛍光に基づいて取得される画像を示す概念図である。

【図4】図４（ａ）は、実施形態１に係る検証において取得された画像を示す図である。図４（ｂ）は、実施形態１に係る検証において取得された数値を示す図である。

【図5】図５は、実施形態１に係る装置の構成を示すブロック図である。

【図6】図６は、実施形態１に係る光学検出部の構成を示す図である。

【図7】図７は、実施形態１の変更例に係る光学検出部の構成を示す図である。

【図8】図８は、実施形態１に係る細胞情報取得装置による処理を示すフローチャートである。

【図9】図９は、実施形態１に係る表示部に表示される画面を示す図である。

【図10】図１０は、実施形態１の変更例に係る高強度の蛍光および低強度の蛍光に基づいて取得されるグラフを示す概念図である。

【図11】図１１は、実施形態２に係る蛍光取得の概要を示す図である。

【図12】図１２は、実施形態３に係る蛍光取得の概要を示す図である。

【図13】図１３は、実施形態３に係るフィルタ部材の透過波長帯域および取得される蛍光の波長帯域を説明するための図である。

【図14】図１４は、実施形態３に係る検証において取得された画像を示す図である。

【図15】図１５は、実施形態３に係る光学検出部の構成を示す図である。

【図16】図１６は、実施形態４に係る蛍光取得の概要を示す図である。

【図17】図１７は、実施形態４に係る光学検出部の構成を示す図である。

【図18】図１８は、実施形態５に係る蛍光取得の概要を示す図である。

【図19】図１９は、実施形態５に係る光学検出部の構成を示す図である。

【図20】図２０は、実施形態６に係る蛍光取得の概要を示す図である。

【図21】図２１は、実施形態６に係る検証において取得された画像を示す図である。

【図22】図２２は、実施形態７に係る蛍光取得の概要を示す図である。

【図23】図２３は、発明が解決しようとする課題を説明するための模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

＜実施形態１＞
実施形態１は、細胞に含まれる被検物質に互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、蛍光物質から生じる複数の蛍光に基づいて被検物質の局在状況を判別する細胞情報取得方法に、本発明を適用したものである。実施形態１では、被検物質はＮＦ−κＢである。転写因子であるＮＦ−κＢは、ＩκＢと複合体を形成した状態で細胞質内に存在し、種々の刺激によるＩκＢの分解により核の内部に移行すると考えられている。実施形態１では、ＮＦ−κＢを被検物質として蛍光物質で特異的に標識し、蛍光物質からの蛍光に基づいて、ＮＦ−κＢが細胞質と核のいずれに存在するかを判定する解析が行われる。なお、被検物質は、ＮＦ−κＢ以外のタンパク質や分子であっても良い。たとえば、被検物質は、ＮＦ−κＢ以外の転写因子であっても良く、たとえば、STAT（Signal Transducer and Activator of Transcription）、NFAT（nuclear factor of activated T cells）、HIF（hypoxia-inducible factor）であっても良い。また、被検物質は、ｍＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡであっても良い。また、「被検物質に複数の蛍光物質を結合させる」とは、必ずしも細胞に含まれる同種の被検物質の各分子の全てが複数の蛍光物質と結合していなくてもよく、少なくとも一部の同種の被検物質の分子に複数の蛍光物質が特異的に結合していればよい。また、局在状況の判別は、被検物質が核に局在しているか細胞質に局在しているかの判別に限らない。たとえば、神経細胞のように突起形状を有している場合に、被検物質が突起の先端に局在しているのか否かを判別してもよい。

【0024】

図１に示すように、細胞情報取得方法は、ステップＳ１〜Ｓ４のステップを含む。以下には、オペレータが、蛍光画像を撮像可能なフローサイトメータと、撮像された画像を解析可能な処理装置を用いて、図１の細胞情報取得方法を実行する場合について説明する。図１の各ステップが、細胞情報取得装置における処理により実行されてもよい。細胞情報取得装置が図１の各ステップを行う場合の構成および処理については、追って、図５以降を参照して説明する。

【0025】

ステップＳ１において、オペレータは、被検者から採取した細胞に含まれるＮＦ−κＢを、互いに蛍光波長が異なる蛍光物質１１、１２で標識する。たとえば、図２に示すように、細胞に含まれるＮＦ−κＢに、一次抗体と二次抗体を介して蛍光物質１１、１２が結合される。蛍光物質１１、１２は、複数の一次抗体によってＮＦ−κＢに結合されても良く、抗体の一部または抗体の全部によってＮＦ−κＢに結合されても良い。また、ステップＳ１において、オペレータは、細胞に含まれる核を、蛍光物質１１、１２とは異なる蛍光波長の蛍光物質１３で標識する。

【0026】

蛍光物質１１、１２、１３は、蛍光色素である。蛍光物質１１、１２、１３は、それぞれ、波長λ１、λ２、λ３の光が照射されると互いに異なる波長帯域の蛍光を励起するよう構成されている。すなわち、蛍光物質１１〜１３から蛍光を励起させるための光の波長は、互いに異なるよう設定されている。こうして、ステップＳ１により試料が調製される。なお、被検物質がｍＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡの場合、被検物質には、核酸プローブを介して蛍光物質が結合される。

【0027】

ステップＳ２において、オペレータは、フローサイトメータを駆動させて、蛍光物質１１〜１３で標識された細胞を含む試料をフローセルに流し、フローセルを流れる細胞に波長λ１〜λ３の光を照射して、蛍光物質１１〜１３から蛍光を生じさせる。

【0028】

図２に示すように、波長λ１〜λ３のレーザ光が細胞に照射されると、蛍光物質１１〜１３から、それぞれ異なる波長帯域の蛍光が生じる。フィルタ部材２１は、蛍光物質１１から生じた波長帯域Ｂ１の蛍光を通し、波長帯域Ｂ１以外の光を遮断する。フィルタ部材２１によって、蛍光物質１１から生じた波長帯域Ｂ１の蛍光が分離される。フィルタ部材２２は、蛍光物質１２から生じた波長帯域Ｂ２の蛍光を通し、波長帯域Ｂ２以外の光を遮断する。フィルタ部材２２によって、蛍光物質１２から生じた波長帯域Ｂ２の蛍光が分離される。フィルタ部材２３は、蛍光物質１３から生じた波長帯域Ｂ３の蛍光を通し、波長帯域Ｂ３以外の光を遮断する。フィルタ部材２３によって、蛍光物質１３から生じた波長帯域Ｂ３の蛍光が分離される。

【0029】

ここで、波長λ１のレーザ光は高パワーで細胞に照射され、波長λ２のレーザ光は低パワーで細胞に照射される。波長λ１のレーザ光が高パワーで細胞に照射されることにより、フィルタ部材２１を通過した波長帯域Ｂ１の蛍光は高強度となる。波長λ２のレーザ光が低パワーで細胞に照射されることにより、フィルタ部材２２を通過した波長帯域Ｂ２の蛍光は低強度となる。

【0030】

ステップＳ３において、処理装置は、蛍光物質１１〜１３から生じた蛍光に基づいて、細胞ごとに３つの蛍光情報を取得する。フローサイトメータは、フィルタ部材２１〜２３により分離された波長帯域Ｂ１〜Ｂ３の蛍光を、それぞれ、撮像素子により構成された受光部に結像させて、各蛍光に基づく画像を取得するための構成を備えている。処理装置は、フローサイトメータの受光部が出力する撮像信号に基づいて、蛍光情報として、波長帯域Ｂ１の高強度の蛍光に基づく画像と、波長帯域Ｂ２の低強度の蛍光に基づく画像と、波長帯域Ｂ３の蛍光に基づく画像とを取得する。

【0031】

波長帯域Ｂ１〜Ｂ３の蛍光は、３つの受光部により、それぞれ個別に撮像されても良く、１つの受光部により撮像されても良い。波長帯域Ｂ１〜Ｂ３の蛍光が１つの受光部により撮像される場合、波長帯域Ｂ１〜Ｂ３の蛍光が受光部の受光面上で異なる領域に結像するよう光学系が構成される。

【0032】

図３に示すように、ＮＦ−κＢが核に局在する細胞の場合、ステップＳ３において、たとえば画像３１、３２が取得される。画像３１は、波長帯域Ｂ１の高強度の蛍光に基づく画像であり、画像３２は、波長帯域Ｂ２の低強度の蛍光に基づく画像である。画像３１、３２には、核が存在する領域３３が設定される。領域３３は、画像３１、３２と同時に生成された波長帯域Ｂ３の蛍光、すなわち、核から生じた蛍光に基づく画像から取得される。

【0033】

ＮＦ−κＢが細胞質に局在する細胞の場合、ステップＳ３において、たとえば画像４１、４２が取得される。画像４１は、波長帯域Ｂ１の高強度の蛍光に基づく画像であり、画像４２は、波長帯域Ｂ２の低強度の蛍光に基づく画像である。画像４１、４２にも、核が存在する領域４３が設定される。領域４３は、画像４１、４２と同時に生成された波長帯域Ｂ３の蛍光に基づく画像から取得される。

【0034】

ＮＦ−κＢの発現量が少ない細胞の場合、画像３１によれば、蛍光の強度が適正であり核と細胞質の間で蛍光強度に差がでているため、ＮＦ−κＢが核の領域３３に局在することを判別できる。他方、画像３２によれば、蛍光の強度が低すぎるため、ＮＦ−κＢが核の領域３３に局在することを判別できない。一方、ＮＦ−κＢの発現量が多い細胞の場合、画像４１によれば、蛍光の強度が高すぎるため、核と細胞質の間で蛍光強度に差のでない状態となっている。このため、ＮＦ−κＢが、核の領域４３と、核の領域４３よりも広い細胞質の領域のどちらに局在するかを判別できない。他方、画像４２によれば、蛍光の強度が適正であり核と細胞質の間で強度に差が生じているため、ＮＦ−κＢが核の領域４３よりも広い細胞質の領域に局在することを判別できる。

【0035】

ＮＦ−κＢが細胞質に局在する場合、ＮＦ−κＢは、核を取り囲むように細胞内に分布する。すなわち、撮像方向に細胞を見たとき、核の手前にもＮＦ−κＢが分布する。このため、高強度の蛍光に基づく画像４１では、核の手前に分布するＮＦ−κＢにより核の領域にも強い蛍光が生じている。このため、画像４１では、ＮＦ−κＢが核に局在しているか細胞質に局在しているかを適正に判別できなくなる傾向がある。これに対し、低強度の蛍光に基づく画像４２では、核の手前に分布するＮＦ−κＢにより核の領域にも蛍光が生じるものの、この蛍光の強度は低い。このため、画像４１では、ＮＦ−κＢが細胞質に局在している場合であっても、局在状況を適正に判別できる。

【0036】

また、ＮＦ−κＢが核に局在する場合、ＮＦ−κＢは、一部が細胞質に分布するものの大半は核内に分布する。このため、高強度の蛍光に基づく画像３１では、核内に分布するＮＦ−κＢから強い蛍光が生じ、ＮＦ−κＢが核に局在することを適正に判別できる。他方、低強度の蛍光に基づく画像３２では、核内に分布するＮＦ−κＢからの蛍光が弱すぎるため、ＮＦ−κＢが核に局在しているか細胞質に局在しているかを適正に判別できない傾向がある。

【0037】

このように、細胞内における被検物質であるＮＦ−κＢの量と分布によって、ＮＦ−κＢの局在を判別するための適正強度が異なる。

【0038】

したがって、波長λ１のレーザ光のパワーは、ＮＦ−κＢが核に局在する細胞において、画像３１に示すようにＮＦ−κＢが核に局在することを適正に判別できるよう設定される。波長λ２のレーザ光のパワーは、ＮＦ−κＢが細胞質に局在する細胞において、画像４２に示すようにＮＦ−κＢが細胞質に局在することを適正に判別できるよう設定される。これにより、判別対象となる細胞において、ＮＦ−κＢが核と細胞質のどちらに局在していたとしても、２つの画像の少なくとも何れか一方を用いてＮＦ−κＢの局在を判別できるようになる。

【0039】

図１に戻り、ステップＳ４において、オペレータは、波長帯域Ｂ１の高強度の蛍光に基づく画像と、波長帯域Ｂ２の低強度の蛍光に基づく画像を参照して、被検物質であるＮＦ−κＢの分布状況を判別する。具体的には、オペレータは、波長帯域Ｂ１の高強度の蛍光に基づく画像と、波長帯域Ｂ２の低強度の蛍光に基づく画像のうち、ＮＦ−κＢの局在位置が判別可能な画像を選択し、その画像に基づいて、当該細胞においてＮＦ−κＢが核と細胞質の何れに局在しているか、すなわち局在状況を判別する。局在状況に代えて、ＮＦ−κＢがどの位置に分布するか、たとえば細胞内における分布範囲等が判別されても良い。

【0040】

上記のように、実施形態１では、ＮＦ−κＢを標識した蛍光物質１１、１２から生じる２つの蛍光を調整することにより、高強度の蛍光に基づく画像と低強度の蛍光に基づく画像のうち、いずれか一方が適正にＮＦ−κＢの局在を判定できる状態となっている。よって、オペレータは、２つの画像に基づいて、細胞における分布が多様なＮＦ−κＢを精度良く解析できる。具体的には、細胞におけるＮＦ−κＢの局在状況、すなわちＮＦ−κＢが核と細胞質のいずれに局在しているかを精度良く判別できる。

【0041】

また、実施形態１において、ＮＦ−κＢが核に局在する場合でも、ＮＦ−κＢの量が多いために、画像３１の蛍光の強度が高すぎる状態となり、画像３２の蛍光の強度が適正な状態となることも考えられる。この場合でも、蛍光の強度が適正な画像３２を用いることにより、ＮＦ−κＢが核に局在することを判別できる。また、ＮＦ−κＢが細胞質に局在する場合でも、ＮＦ−κＢの量が少ないために、画像４１の蛍光の強度が適正な状態となり、画像４２の蛍光の強度が低すぎる状態となることも考えられる。この場合でも、蛍光の強度が適正な画像４１を用いることにより、ＮＦ−κＢが細胞質に局在することを判別できる。このように実施形態１によれば、２つの画像に基づいて、ＮＦ−κＢの量にかかわらず、細胞におけるＮＦ−κＢの局在状況を精度良く判別できる。

【0042】

ここで、血管内皮細胞は、血管の内壁から剥離して血液中に流れ込む。血管内皮細胞の剥離は、炎症による刺激の他、圧迫等による圧力の変化によっても生じる。炎症による刺激によって剥離した血管内皮細胞では、ＮＦ−κＢが核に局在する傾向にあり、炎症による刺激以外の刺激によって剥離した血管内皮細胞では、ＮＦ−κＢが核に局在しない傾向にある。実施形態１によれば、上記のようにＮＦ−κＢの局在を精度良く判別できるため、これらの剥離原因のうち炎症による刺激によって生じた剥離を、シグナル分子であるＮＦ−κＢが核に局在しているか否かによって判定でき、血管内皮細胞の活性化の有無を判定できる。これにより、たとえば、血管内皮細胞の剥離が採血時の圧迫により生じたものか、疾病等を要因として生じたものか判断することができ臨床的意義がある。

【0043】

波長λ１、λ２とは異なる波長の中パワーのレーザ光により、中強度の蛍光の画像が取得されても良い。すなわち、ＮＦ−κＢを互いに蛍光波長が異なる３つの蛍光物質で標識し、細胞に３つのレーザ光を照射して３つの蛍光物質から強度が異なる蛍光を生じさせて、各蛍光に基づく画像を取得しても良い。こうすると、蛍光の強度が異なる３つの画像から最も適正な画像を用いることにより、さらに精度良くＮＦ−κＢの局在を判別できる。被検物資から生じさせる蛍光の強度は、４段階以上であってもよく、１つの細胞について４つ以上の強度の蛍光に基づく４つ以上の画像を取得してもよい。

【0044】

さらに、ステップＳ４において、オペレータは、上記のように判別した細胞ごとの局在状況に基づいて、試料に含まれる細胞のうち、ＮＦ−κＢが特定部位に局在する細胞の割合を取得する。具体的には、ＮＦ−κＢが核に局在すると判別した細胞の数をＮ１とし、ＮＦ−κＢが細胞質に局在すると判別した細胞の数をＮ２とすると、オペレータは、以下の式によって、核局在率と細胞質局在率を取得する。なお、ステップＳ４において、オペレータは、核局在率と細胞質局在率に代えて、核局在数と細胞質局在数を取得しても良い。

【0045】

核局在率＝｛Ｎ１／（Ｎ１＋Ｎ２）｝×１００
細胞質局在率＝｛Ｎ２／（Ｎ１＋Ｎ２）｝×１００

【0046】

ステップＳ２では、上述したようにフローサイトメータを用いて各蛍光の画像が取得されたが、これに限らず、顕微鏡を用いて、各蛍光の画像が蛍光情報として取得されてもよい。すなわち、顕微鏡により、蛍光物質１１から生じた高強度の蛍光画像と、蛍光物質１２から生じた低強度の蛍光画像と、蛍光物質１３から生じた核に対応する画像とが、取得されても良い。

【0047】

＜実施形態１の検証＞
次に、発明者が行った実施形態１の検証について説明する。

【0048】

１．準備
細胞として、ヒト心臓微小血管内皮細胞（HMVEC-C）（Lonza CatNo.CC-7030, Lot No.0000296500 (P4)）を用意した。一次抗体として、ＮＦ−κＢ p65 (D14E12) XP Rabbit mAb（Cell Signaling Technologies #8242S）を用意した。二次抗体として、Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate（Life technologies A-21245）、Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate（Life technologies A-11008）を用意した。二次抗体には、蛍光色素として、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488が結合している。核染色色素として、Cellstain Hoechst 33342 solution（DOjinDO H342）を用意した。この他、EGM-2MV Medium（Lonza Cat No.CC-3202）、EGM-2MV SingleQuots Kit（Lonza Cat No. CC-3202）、PBS pH7.4（GIBCO Cat No.10010-023）、BSA（LAMPIRE Cat No. 7500805）、PFA（WAKO Cat No.160-16061）、TritonX100（ナカライテスク CatNo.35501-15）を用意した。

【0049】

２．試薬調製
５００ｍＬのEGM-2MV MediumにEGM-2MV SingleQuots KitのFBS以外の試薬を添加し、１００ｍＬを滅菌ボトルへ移し、無血清培地を作製した。無血清培地作製の残量（４００ｍＬ）に、SingleQuots KitのFBSを２０ｍＬ添加して、培養培地を作製した。パラホルムアルデヒドを終濃度８％ w/vとなるようにｐＨ１２のPBSにて溶解した後に、ｐＨ７．４に調整した。PBSに１．５ｇのBSAを加えて溶解させ５０ｍＬにメスアップし、３％ BSA/PBSを調製した。PBSに０．５ｇのBSAを加えて溶解させ５０ｍＬにメスアップし、１％ BSA/PBSを調製した。TritonX100を終濃度０．１％ w/vとなるようにPBSにて調製した。

【0050】

３．手順
HMVEC-Cは、メーカー推奨プロトコルに準じてEGM-2MV培地にて培養した。購入後から継代回数６回以内の細胞を本検証に用いた。培養培地は開封後の使用期限を３週間とした。TNF-α刺激培養は、約７０％コンフルエントのHMVEC-C細胞の培養上清を除き、終濃度２５ｎｇ／ｍＬとなるようRecombinant Human TNF-alphaを添加したEGM-2MV培地を加え、３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内で１時間静置した。３ｍＬ程度残して電動ピペッターで培地を除去し、スクレーパーにて細胞を剥離した。回収した懸濁液と等量の８％ PFA/PBSを加え、室温で１５分反応させた。室温下、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞ペレットを１ｍＬのPBSで２回洗浄した。上清を除去し、０．１％ Triton X-100/PBSを１ｍＬ加えて、室温１５分反応させた。室温下、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。１ｍＬの１％ BSA/PBSで２回洗浄した。上清を除去し、３％ BSA/PBSを１ｍＬ加えて、室温で３０分静置した。３％ BSA/PBSで１／１６００とした４００μＬの一次抗体を添加した。室温で１時間反応させた。室温下、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。１ｍＬの１％ BSA/PBSで洗浄した。３％ BSA/PBSで１／１０００とした４００μＬの二次抗体を添加した。室温で３０分反応させた。１ｍＬの１％ BSA/PBSで２回洗浄した。上清を除去し、１％ BSA/PBSを５０μＬ添加した。

【0051】

４．フローサイトメータによる検出
蛍光画像を取得可能なフローサイトメータとして、ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer（Merck Millipore）を用いた。このフローサイトメータのフローセルに上記３に沿って調製した試料を流し、フローセルを流れる試料に、波長４８８ｎｍ、６４７ｎｍ、４０５ｎｍのレーザ光を照射した。波長４８８ｎｍ、６４７ｎｍ、４０５ｎｍのレーザ光は、上記波長λ１、λ２、λ３のレーザ光に対応する。波長４８８ｎｍ、６４７ｎｍ、４０５ｎｍのレーザ光の出射パワーは、それぞれ、５５ｍＷ、１０ｍＷ、１２０ｍＷとした。波長４８８ｎｍ、６４７ｎｍのレーザ光がＮＦ−κＢを標識する２種類の蛍光色素に照射されることにより、それぞれ、高強度の蛍光と低強度の蛍光が生じた。波長４０５ｎｍのレーザ光が核染色色素に照射されることにより蛍光が生じた。

【0052】

上記フローサイトメータにおいて、波長４８８ｎｍのレーザ光により生じた蛍光は、透過波長帯域５０５ｎｍ〜５６０ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、高強度の蛍光画像が取得された。波長６４７ｎｍのレーザ光により生じた蛍光は、透過波長帯域６４２ｎｍ〜７４０ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、低強度の蛍光画像が取得された。波長４０５ｎｍのレーザ光により生じた蛍光は、透過波長帯域４３０ｎｍ〜５０５ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、核に対応する蛍光画像が取得された。また、フローセルを流れる試料に、波長が４３０ｎｍ〜４８０ｎｍの間に設定されたレーザ光を照射した。このレーザ光が細胞を透過した光は、透過波長帯域４３０ｎｍ〜４８０ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、明視野画像が取得された。なお、上記フローサイトメータでは、対象となる波長帯域の光が適正に受光部に入射するよう、フィルタ部材等により不要な波長帯域の光が除去されている。なお、本検証においては明視野画像を取得したがこれに限られず、暗視野画像を取得してもよい。

【0053】

図４（ａ）を参照して、上記検出により取得された画像について説明する。

【0054】

「明視野」は、細胞の明視野画像を示す。「高強度の蛍光」と「低強度の蛍光」は、それぞれ、ＮＦ−κＢを標識した蛍光色素から生じた高強度の蛍光に基づく画像と、ＮＦ−κＢを標識した蛍光色素から生じた低強度の蛍光に基づく画像である。「核からの蛍光」は、核を染色した核染色用色素から生じた蛍光に基づく画像である。「合成」は、左側の４つの画像を合成した画像である。横に並ぶ５つの画像は、１つの細胞から取得された画像である。「高強度の蛍光」、「核からの蛍光」、「低強度の蛍光」、および「合成」が示す画像は、便宜上、取得されたカラー画像をグレースケール化したものである。「高強度の蛍光」、「核からの蛍光」、および「低強度の蛍光」が示す画像において、白い部分は蛍光の強度が強いことを示す。

【0055】

上段に示す細胞の場合、低強度の蛍光に基づく画像は強度が低すぎるため、ＮＦ−κＢの局在を判別するのは困難である。他方、高強度の蛍光に基づく画像は強度が適正であるため、ＮＦ−κＢが核に局在していると判別できる。下段に示す細胞の場合、高強度の蛍光に基づく画像は強度が高すぎるため、ＮＦ−κＢの局在を判別するのは困難である。他方、低強度の蛍光に基づく画像は強度が適正であるため、ＮＦ−κＢが細胞質に局在していると判別できる。

【0056】

５．核局在率の算出
取得された画像を目視することにより、細胞ごとにＮＦ−κＢの局在を判別した。この判別は、上記ステップＳ４と同様に行われた。すなわち、核からの蛍光画像に基づいて核の領域を設定し、核の領域以外の領域を細胞質の領域とした。そして、核の蛍光強度が細胞質の蛍光強度の約２倍以上と考えられる場合、この細胞においてＮＦ−κＢが核に局在していると判別し、核の蛍光強度が細胞質の蛍光強度の約２倍未満と考えられる場合、この細胞においてＮＦ−κＢが細胞質に局在していると判別した。

【0057】

図４（ｂ）を参照して、上記フローサイトメータで識別された１３１個の細胞について、ＮＦ−κＢの局在を判別した結果について説明する。

【0058】

核に局在していると判別できた細胞の数は４４であり、細胞質に局在していると判別できた細胞の数は８７であった。局在を判別できなかった細胞の数は０であった。このときの核局在率は、４４／１３１＝３４％であった。

【0059】

ここで、高強度の蛍光画像のみに基づいて局在を判別した比較例１と、低強度の蛍光画像のみに基づいて局在を判別した比較例２について説明する。比較例１の場合、核に局在していると判別できた細胞の数は４２であり、細胞質に局在していると判別できた細胞の数は１０であった。蛍光の強度が高すぎたために局在を判別できなかった細胞の数は７９であった。比較例１の核局在率は８１％であった。比較例２の場合、核に局在していると判別できた細胞の数は１６であり、細胞質に局在していると判別できた細胞の数は８４であった。蛍光強度が低すぎたために局在を判別できなかった細胞の数は３１であった。比較例２の核局在率は１６％であった。

【0060】

以上のように、本検証によれば、実施形態１のように強度の異なる２つの蛍光画像に基づいて局在を判別する場合、比較例１、２の場合に判別不可となった細胞についてもＮＦ−κＢの局在を判別できることが分かる。また、実施形態１のように局在を判別する場合、判別不可の細胞が少ないことから、細胞におけるＮＦ−κＢの局在を精度良く判別できることが分かる。したがって、実施形態１によれば、判別不可の細胞の数を低く抑えて、ＮＦ−κＢの局在を精度良く判別できる。これにより、たとえば、被検者から採取した細胞が少ない場合でも、判別できる細胞を確保しながら、精度良くＮＦ−κＢの局在を判別できる。

【0061】

実施形態１では、被検物質の分布状況の判別として、ＮＦ−κＢの局在状況を判別する例を示したが、被検物質の分子の量が変化する場合には、この分子の量を判別しても良い。この場合、オペレータは、分子を蛍光物質１１、１２で標識し、処理装置は、蛍光物質１１、１２から生じた強度の異なる２つの蛍光に基づいて画像を取得する。オペレータは、分子の量が多い場合、低強度の蛍光画像を用いて量を判別し、分子の量が少ない場合、高強度の蛍光画像を用いて量を判別する。これにより、精度良く分子の量を判別できる。

【0062】

＜実施形態１の装置構成＞
実施形態１の細胞情報取得方法に基づいて、細胞画像を撮像し、細胞における被検物質の局在を判別するための細胞情報取得装置の構成について説明する。

【0063】

図５に示すように、細胞情報取得装置１００は、処理部１１０と、試料調製部１２０と、光学検出部１３０と、駆動部１４０と、表示部１５０と、入力部１６０と、記憶部１７０と、を備える。

【0064】

処理部１１０は、マイクロコンピュータおよびＣＰＵ等により構成される。記憶部１７０は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。記憶部１７０は、処理部１１０によって実行される処理プログラムや、画像などの各種データを記憶する。処理部１１０は、細胞情報取得装置１００の各部との間で信号の送受信を行い、各部を制御する。処理部１１０には、記憶部１７０に記憶されたプログラムにより、取得部１１１と解析部１１２の機能が付与される。

【0065】

試料調製部１２０は、図１のステップＳ１に従って、細胞と試薬を混合することにより、試料を調製する。試料の調製はオペレータによって行われても良い。この場合、試料調製部１２０は細胞情報取得装置１００から省略される。光学検出部１３０は、フローサイトメータである。光学検出部１３０は、試料に含まれる細胞に光を照射して、生じた蛍光を撮像する。光学検出部１３０の構成については、追って図６を参照して説明する。駆動部１４０は、後述する光学検出部１３０の光源３０１〜３０４を駆動する。

【0066】

表示部１５０は、ディスプレイにより構成される。表示部１５０は、細胞ごとに取得された画像と、細胞ごとに判別されたＮＦ−κＢの局在と、ＮＦ−κＢが核に局在する細胞数と、ＮＦ−κＢが細胞質に局在する細胞数と、核局在率と、細胞質局在率などを表示する。入力部１６０は、マウスおよびキーボードにより構成される。オペレータは、入力部１６０を介して細胞情報取得装置１００に対して指示を入力する。

【0067】

図６に示すように、光学検出部１３０は、フローセル２００と、光照射部３００と、集光部４００と、受光部５０１〜５０４と、を備える。フローセル２００には流路２１０が形成されており、流路２１０には、試料調製部１２０により調製された試料が流される。図６には、便宜上、互いに直交するＸＹＺ軸が図示されている。

【0068】

光照射部３００は、フローセル２００を流れる試料に含まれる細胞に光を照射して、図２に示す蛍光物質１１、１２から強度が異なる蛍光を生じさせる。また、光照射部３００は、細胞に光を照射して図２に示す蛍光物質１３から蛍光を生じさせ、さらに、明視野用の光を細胞に照射する。光照射部３００は、光源３０１〜３０４と、集光レンズ３１１〜３１４と、ダイクロイックミラー３２１、３２２と、を備える。

【0069】

光源３０１〜３０４は、半導体レーザ光源により構成される。光源３０１〜３０４から出射される光は、それぞれ、波長λ１〜λ４のレーザ光である。波長λ１〜λ４は、それぞれ、たとえば４８８ｎｍ、６４７ｎｍ、４０５ｎｍ、７８５ｎｍである。波長λ１〜λ３は、図２に示したように、蛍光物質１１〜１３から蛍光を励起させるための光である。集光レンズ３１１〜３１４は、それぞれ、光源３０１〜３０４から出射された光を集光する。ダイクロイックミラー３２１は、波長λ１の光を透過し、波長λ２の光を反射する。ダイクロイックミラー３２２は、波長λ１、λ２の光を透過し、波長λ３の光を反射する。

【0070】

こうして、光照射部３００は、光源３０１〜３０３から出射された波長λ１〜λ３の光を互いに重ねた状態で、流路２１０を流れる試料に含まれる細胞に照射する。また、光照射部３００は、波長λ１〜λ３が照射される流路２１０の位置に、波長λ４の光を照射する。フローセル２００を流れる試料に波長λ１〜λ３の光が照射されると、図２を参照して説明したように、蛍光物質１１〜１３から異なる波長帯域の蛍光が生じる。フローセル２００を流れる試料に波長λ４の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ４の光は、明視野画像の取得に用いられる。

【0071】

ここで、光源３０１は、波長λ１の光を高パワーで出射し、光源３０２は、波長λ２の光を低パワーで出射する。光源３０１、３０２の出射パワーは、図５に示す駆動部１４０により制御される。これにより、図２を参照して説明したように、蛍光物質１１から生じる蛍光は高強度となり、蛍光物質１２から生じる蛍光は低強度となる。なお、この実施形態１および後述する実施形態２、３では、光源３０１および３０２の出射パワーを調整しなくても良い。同一出射パワーであっても得られる蛍光強度に差がある蛍光標識を選択することにより、蛍光物質１１から生じる蛍光は高強度となり、蛍光物質１２から生じる蛍光は低強度となる。

【0072】

集光部４００は、波長λ１〜λ３の光の照射によりフローセル２００から生じた蛍光を集光する。集光部４００は、蛍光物質１１〜１３から生じた蛍光を、それぞれ、受光部５０１〜５０３に集光させる。また、集光部４００は、フローセル２００から生じた波長λ４の光を受光部５０４に集光させる。集光部４００は、集光レンズ４０１と、フィルタ部材４１１〜４１３、４２１〜４２４と、集光レンズ４３１〜４３４と、を備える。

【0073】

集光レンズ４０１は、フローセル２００を流れる試料から生じた蛍光と、フローセル２００を流れる試料を透過した波長λ４の光とを集光する。フィルタ部材４１１〜４１３は、ダイクロイックミラーにより構成される。

【0074】

フィルタ部材４１１は、集光レンズ４０１によって集光された光のうち、波長帯域Ｂ１の光を反射し、波長帯域Ｂ１以外の光を透過する。フィルタ部材４２１は、フィルタ部材４１１によって反射された光のうち、波長帯域Ｂ１の光のみを透過して、波長帯域Ｂ１以外の光を遮断する。このように、フィルタ部材４１１、４２１は、フローセル２００から生じた光のうち、波長帯域Ｂ１の蛍光のみを分離可能に構成される。同様に、フィルタ部材４１２、４２２は、フローセル２００から生じた光のうち、波長帯域Ｂ２の蛍光のみを分離可能に構成され、フィルタ部材４１３、４２３は、フローセル２００から生じた光のうち、波長帯域Ｂ３の蛍光のみを分離可能に構成される。フィルタ部材４２４は、フィルタ部材４１１〜４１３を透過した光のうち、波長λ４の光を透過し、波長λ４以外の光を遮断する。

【0075】

受光部５０１は、集光レンズ４３１によって集光された波長帯域Ｂ１の光を受光して、受光した光に基づく画像情報を撮像信号として出力する。受光部５０２は、集光レンズ４３２によって集光された波長帯域Ｂ２の光を受光して、受光した光に基づく画像情報を撮像信号として出力する。受光部５０３は、集光レンズ４３３によって集光された波長帯域Ｂ３の光を受光して、受光した光に基づく画像情報を撮像信号として出力する。受光部５０４は、集光レンズ４３４によって集光された波長λ４の光を受光して、受光した光に基づく画像情報を撮像信号として出力する。受光部５０１〜５０４は、たとえばカラーＣＣＤなどの撮像素子により構成される。

【0076】

集光部４００は、波長帯域Ｂ１〜Ｂ３の光と波長λ４の光を、それぞれ受光部５０１〜５０４に集光させたが、１つの受光部に結像しても良い。この場合、波長帯域Ｂ１〜Ｂ３の光と波長λ４の光が、受光部の受光面上で異なる領域に結像するよう光学検出部１３０が構成される。

【0077】

図６に示す構成では、波長帯域Ｂ１の光を分離するために複数のフィルタ部材が用いられたが、図７に示すように、フローセル２００から生じた光が、１つのフィルタ部材によって分離されても良い。図７に示すように、集光部４００は、集光レンズ４４１〜４４４と、フィルタ部材４５１〜４５４と、集光レンズ４６１〜４６４と、を備える。波長帯域Ｂ１〜Ｂ３の光は、それぞれ、フィルタ部材４５１〜４５３により分離され、波長λ４の光はフィルタ部材４５４により分離される。

【0078】

次に、図８のフローチャートを参照して、図１のステップＳ４の処理が細胞情報取得装置１００により行われる場合について説明する。

【0079】

図８に示すように、ステップＳ１１において、処理部１１０は、試料調製部１２０を駆動して、図１のステップＳ１と同様、細胞に含まれるＮＦ−κＢを蛍光物質１１、１２で標識し、細胞に含まれる核を蛍光物質１３で標識して、試料を調製する。ステップＳ１２において、処理部１１０は、フローセル２００に試料を流し、光源３０１〜３０４を駆動部１４０により駆動させ、フローセル２００を流れる細胞に光を照射する。ステップＳ１３において、処理部１１０は、受光部５０１〜５０３により波長帯域Ｂ１〜Ｂ３の蛍光を撮像し、受光部５０４により波長λ４の光を撮像する。そして、処理部１１０の取得部１１１は、受光部５０１〜５０４が出力する撮像信号に基づいて画像を取得する。

【0080】

ステップＳ１４において、処理部１１０の解析部１１２は、高強度と低強度の蛍光画像から、局在の判別ができる画像を選択する。具体的には、解析部１１２は、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像のうち、画像から取得される蛍光の強度、たとえば画像全体の輝度が、所定の範囲内にある画像を選択する。これにより、蛍光の強度が極端に大きい画像や、蛍光の強度が極端に小さい画像は、図３の画像３２や画像４１と同様、ＮＦ−κＢの局在を判別できないため、判別に用いる画像から除かれる。

【0081】

また、解析部１１２は、高強度と低強度の蛍光画像のうち、細胞の解析対象部位における蛍光強度と、解析対象部位以外の細胞における蛍光強度との差が、所定の閾値より大きい画像を選択する。実施形態１において、解析対象部位は核である。すなわち、核内の蛍光強度と核外の細胞の蛍光強度との差が、所定の閾値より大きい画像が選択される。これにより、核内と核外の蛍光強度の差が小さい画像は、図３の画像３２や画像４１と同様、ＮＦ−κＢの局在を判別できないため、判別に用いる画像から除かれる。

【0082】

次に、ステップＳ１５において、解析部１１２は、ステップＳ１４で選択した画像を用いて、細胞ごとに、細胞におけるＮＦ−κＢの局在を判別する。すなわち、解析部１１２は、細胞の解析対象部位におけるＮＦ−κＢの局在量の、細胞全体におけるＮＦ−κＢの量に対する割合を算出する。たとえば、解析部１１２は、ステップＳ１４で選択された画像において、核の領域における蛍光の強度を、細胞全体の領域における蛍光強度で除算する。解析部１１２は、除算結果が２以上である場合に、ＮＦ−κＢが核に局在していると判別し、除算結果が２より小さい場合に、ＮＦ−κＢが細胞質に局在していると判別する。除算結果を判定する値は２に限らず、他の値でも良い。

【0083】

なお、ステップＳ１４で２つの画像が選択された場合、ステップＳ１５では、両方の画像について、上記のように除算結果が取得され局在が判別される。また、ステップＳ１４で画像が選択されなかった場合、ステップＳ１５において、この細胞の局在は「判別不可能」とされる。

【0084】

ステップＳ１６において、解析部１１２は、処理を行った全ての細胞の判別結果に基づいて、上述した核局在数、細胞質局在数、核局在率、および細胞質局在率を算出する。ステップＳ１７において、処理部１１０は、ステップＳ１６で算出した数値と、細胞ごとに取得した画像と、細胞ごとの判別結果などを表示部１５０に表示する。具体的には、処理部１１０は、上記内容を含む画面１６１を表示部１５０に表示する。

【0085】

図９に示すように、画面１６１は、領域１６１ａ、１６１ｂを備える。領域１６１ａは、核局在数、細胞質局在数、核局在率、および細胞質局在率を表示する。領域１６１ｂは、画像と、ＮＦ−κＢの局在の判別結果とを表示する。領域１６１ｂにおいて、ステップＳ１５で局在の判別に用いられた画像は、局在判別に用いられたことが分かるように実線で囲まれている。

【0086】

ステップＳ１３で取得される蛍光情報は、時間とともに変化する蛍光強度を示す波形信号であっても良い。この場合、光学検出部１３０において、受光部５０１〜５０３として、それぞれ、フォトマルチプライヤなどの光検出器が配置される。３つの光検出器は、波長帯域Ｂ１の高強度の蛍光と、波長帯域Ｂ２の低強度の蛍光と、波長帯域Ｂ３の蛍光を受光し、それぞれ、各蛍光の強度を示す波形信号を出力する。

【0087】

図１０に示すように、解析部１１２は、光検出器が出力する波形信号に基づいて、ＮＦ−κＢの発現量が少ない細胞の場合、たとえばグラフ５１、５２を取得し、ＮＦ−κＢの発現量が多い細胞の場合、たとえばグラフ６１、６２を取得する。また、解析部１１２は、光検出器が出力する波形信号に基づいて、核に応じたグラフを取得する。解析部１１２は、グラフ５１、５２と同時に取得された核のグラフから、グラフ５１、５２において核に対応する波形の幅Ｗ１を設定し、グラフ６１、６２と同時に取得された核のグラフから、グラフ６１、６２において核に対応する波形の幅Ｗ２を設定する。

【0088】

グラフ５１によれば、蛍光のピーク値が閾値Ｓｈ１、Ｓｈ２の間にあり、核に対応する幅Ｗ１に波形のピークが存在するため、解析部１１２は、ＮＦ−κＢが核に局在すると判別できる。他方、グラフ５２によれば、蛍光のピーク値が閾値Ｓｈ１より小さいため、解析部１１２は、ＮＦ−κＢの局在を判別できない。グラフ６１によれば、蛍光のピーク値が閾値Ｓｈ２より大きいため、解析部１１２は、ＮＦ−κＢの局在を判別できない。他方、グラフ６２によれば、蛍光のピーク値が閾値Ｓｈ１、Ｓｈ２の間にあり、核に対応する幅Ｗ２に波形の窪みが存在するため、解析部１１２は、ＮＦ−κＢが細胞質に局在すると判別できる。したがって、この場合も、図３に示すように画像を用いる場合と同様、強度の異なる２つの蛍光により、ＮＦ−κＢの局在を精度良く判別できる。

【0089】

＜実施形態２＞
実施形態２では、２つの光を用いるのではなく、波長λ１の光のみを用いて互いに異なる強度の蛍光を取得する。実施形態２では、実施形態１と比較して、図１に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップＳ１、Ｓ２における一部の手順のみが異なる。以下、実施形態１とは異なる手順について説明する。

【0090】

ステップＳ１において、図１１に示すように、細胞に含まれるＮＦ−κＢが、互いに蛍光波長が異なる蛍光物質１４、１５で標識される。蛍光物質１４、１５は、蛍光色素である。蛍光物質１４は、波長λ１の光が照射されると、実施形態１の蛍光物質１１と同様の波長帯域の蛍光を励起する。蛍光物質１５は、波長λ１の光が照射されると、図２の蛍光物質１２と同様の波長帯域の蛍光を励起する。すなわち、蛍光物質１４、１５は、励起用の光の波長が実質的に同じである。

【0091】

ステップＳ２において、蛍光物質１４、１５、１３で標識された細胞を含む試料がフローセルに流され、フローセルを流れる細胞に波長λ１、λ３の光が照射され、蛍光物質１４、１５、１３から蛍光が生じさせられる。蛍光物質１４、１５から生じた蛍光は、それぞれフィルタ部材２１、２２に通されることにより、波長帯域Ｂ１、Ｂ２の蛍光となる。このとき、波長帯域Ｂ１の蛍光が高強度となり、波長帯域Ｂ２の蛍光が低強度となるよう、蛍光物質１４、１５が構成されている。

【0092】

実施形態２の装置構成では、実施形態１と比較して、図６に示す光学検出部１３０のうち、光源３０２と、集光レンズ３１２と、ダイクロイックミラー３２１が省略される。

【0093】

実施形態２においても、実施形態１と同様、波長帯域Ｂ１の高強度の蛍光と、波長帯域Ｂ２の低強度の蛍光とを生じさせ、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像を取得できる。したがって、実施形態１と同様、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像に基づいて、細胞における分布および量が多様なＮＦ−κＢを、精度良く解析できる。

【0094】

＜実施形態３＞
実施形態３では、２つの光と２つの蛍光物質を用いるのではなく、１つの波長λ１の光と１つの蛍光物質１１を用いて、互いに異なる強度の蛍光を取得する。実施形態３では、実施形態１と比較して、図１に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップＳ１、Ｓ２における一部の手順のみが異なる。以下、実施形態１とは異なる手順について説明する。

【0095】

ステップＳ１において、図１２に示すように、細胞に含まれるＮＦ−κＢが、実施形態１と同様の蛍光物質１１のみで標識される。このとき、蛍光物質１１は、１つの抗体を介してＮＦ−κＢに結合されても良い。ステップＳ２において、蛍光物質１１、１３で標識された細胞を含む試料がフローセルに流され、フローセルを流れる細胞に波長λ１、λ３の光が照射され、蛍光物質１１、１３から蛍光が生じさせられる。

【0096】

図１２に示すように、蛍光物質１１から生じた蛍光を２つに分割し、一方を実施形態１と同様のフィルタ部材２１に通し、他方を実施形態１と同様のフィルタ部材２２に通す。フィルタ部材２１は、波長帯域Ｂ１の光のみを透過させ、フィルタ部材２１は、波長帯域Ｂ４の光のみを透過させる。図１３に示すように、波長帯域Ｂ１は、たとえば、蛍光物質１１から生じる蛍光の強度がピークとなる波長を含む。波長帯域Ｂ４は、たとえば、波長帯域Ｂ１よりも大きい波長帯域に設定され、かつ、波長帯域Ｂ１に重ならない波長帯域に設定される。これにより、図１２に示すように、フィルタ部材２１を通過した波長帯域Ｂ１の蛍光は高強度となり、フィルタ部材２２を通過した波長帯域Ｂ４の蛍光は低強度となる。

【0097】

なお、波長帯域Ｂ１は、必ずしも蛍光物質１１から生じる蛍光の強度がピークとなる波長を含まなくても良い。波長帯域Ｂ４は、波長帯域Ｂ１よりも小さい波長帯域に設定されても良く、波長帯域Ｂ１と一部が重なっても良い。

【0098】

＜実施形態３の検証＞
次に、発明者が行った実施形態３の検証について説明する。

【0099】

１．準備
細胞として、ヒト心臓微小血管内皮細胞（HMVEC-C）（Lonza CatNo.CC-7030, Lot No.0000296500 (P4)）を用意した。一次抗体として、ＮＦ−κＢ p65 (D14E12) XP Rabbit mAb（Cell Signaling Technologies #8242S）を用意した。二次抗体として、Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate（Life technologies A-21245）を用意した。二次抗体には、蛍光色素として、Alexa Fluor 647が結合している。この他、EGM-2MV Medium（Lonza Cat No.CC-3202）、EGM-2MV SingleQuots Kit（Lonza Cat No. CC-3202）、PBS pH7.4（GIBCO Cat No.10010-023）、BSA（LAMPIRE Cat No. 7500805）、PFA（WAKO Cat No.160-16061）、TritonX100（ナカライテスク CatNo.35501-15）を用意した。

【0100】

２．試薬調製
５００ｍＬのEGM-2MV MediumにEGM-2MV SingleQuots Kitを添加し、培養培地を作製した。パラホルムアルデヒドを終濃度８％ w/vとなるようにｐＨ１２のPBSにて溶解した後に、ｐＨ７．４に調整した。PBSに１．５ｇのBSAを加えて溶解させ５０ｍＬにメスアップし、３％ BSA/PBSを調製した。PBSに０．５ｇのBSAを加えて溶解させ５０ｍＬにメスアップし、１％ BSA/PBSを調製した。TritonX100を終濃度０．１％ w/vとなるようにPBSにて調製した。

【0101】

３．手順
HMVEC-Cは、メーカー推奨プロトコルに準じてEGM-2MV培地にて培養した。購入後から継代回数６回以内の細胞を本検証に用いた。培養培地は開封後の使用期限を３週間とした。TNF-α刺激培養は、約７０％コンフルエントのHMVEC-C細胞の培養上清を除き、終濃度２５ｎｇ／ｍＬとなるようRecombinant Human TNF-alphaを添加したEGM-2MV培地を加え、３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内で１時間静置した。３ｍＬ程度残して電動ピペッターで培地を除去し、スクレーパーにて細胞を剥離した。回収した懸濁液と等量の８％ PFA/PBSを加え、室温で１５分反応させた。室温下、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞ペレットを１ｍＬのPBSで２回洗浄した。上清を除去し、０．１％ Triton X-100/PBSを１ｍＬ加えて、室温１５分反応させた。室温下、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。１ｍＬの１％ BSA/PBSで２回洗浄した。上清を除去し、３％ BSA/PBSを１ｍＬ加えて、室温で３０分静置した。３％ BSA/PBSで１／１６００とした４００μＬの一次抗体を添加した。室温で１時間反応させた。室温下、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。１ｍＬの１％ BSA/PBSで洗浄した。３％ BSA/PBSで１／１０００とした４００μＬの二次抗体を添加した。室温で３０分反応させた。１ｍＬの１％ BSA/PBSで２回洗浄した。上清を除去し、１％ BSA/PBSを５０μＬ添加した。

【0102】

４．フローサイトメータによる検出
蛍光画像を取得可能なフローサイトメータとして、ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer（Merck Millipore）を用いた。このフローサイトメータのフローセルに上記３に沿って調製した試料を流し、フローセルを流れる試料に、波長６４７ｎｍのレーザ光を照射した。波長６４７ｎｍのレーザ光は、図１２に示す波長λ１のレーザ光に対応する。波長６４７ｎｍのレーザ光の出射パワーは、１０ｍＷとした。波長６４７ｎｍのレーザ光がＮＦ−κＢを標識する蛍光色素に照射されることにより蛍光が生じた。

【0103】

上記フローサイトメータにおいて、波長６４７ｎｍのレーザ光により生じた蛍光は、透過波長帯域６４２ｎｍ〜７４０ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、高強度の蛍光画像が取得された。また、波長６４７ｎｍのレーザ光により生じた蛍光は、透過波長帯域７４０ｎｍ〜８００ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、低強度の蛍光画像が取得された。なお、上記フローサイトメータでは、対象となる波長帯域の光が適正に受光部に入射するよう、フィルタ部材等により不要な波長帯域の光が除去されている。

【0104】

図１４（ａ）、（ｂ）を参照して、上記検出により取得された画像について説明する。

【0105】

「高強度の蛍光」と「低強度の蛍光」は、それぞれ、ＮＦ−κＢを標識した蛍光色素から生じた高強度の蛍光に基づく画像と、ＮＦ−κＢを標識した蛍光色素から生じた低強度の蛍光に基づく画像である。図１４（ａ）、（ｂ）において、横に並ぶ２つの画像は、１つの細胞から取得された画像である。各画像は、便宜上、取得されたカラー画像をグレースケール化したものである。各画像において、白い部分は蛍光の強度が強いことを示す。

【0106】

図１４（ａ）に示す３つの細胞の場合、低強度の蛍光に基づく画像は強度が低すぎるため、ＮＦ−κＢの局在を判別するのは困難である。他方、高強度の蛍光に基づく画像は強度が適正であるため、ＮＦ−κＢが細胞質に局在していると判別できる。図１４（ｂ）に示す３つの細胞の場合、高強度の蛍光に基づく画像は強度が高すぎるため、ＮＦ−κＢの局在を判別するのは困難である。他方、低強度の蛍光に基づく画像は強度が適正であるため、ＮＦ−κＢが細胞質に局在していると判別できる。

【0107】

以上のように、本検証によれば、実施形態３のように強度の異なる２つの蛍光画像に基づいて局在を判別する場合においても、ＮＦ−κＢの局在を判別できることが分かる。このように、実施形態３によれば、１種類の蛍光色素から生じた蛍光を、異なる波長帯域の蛍光を通すフィルタ部材２１、２２に通して２つの蛍光画像を取得することにより、１つの細胞に対して一度の測定でＮＦ−κＢの局在を正しく取得できる。

【0108】

＜実施形態３の装置構成＞
図１５に示すように、実施形態３の装置構成では、実施形態１と比較して、図６に示す光学検出部１３０のうち、光源３０２と、集光レンズ３１２と、ダイクロイックミラー３２１が省略され、フィルタ部材４１２、４２２に代えて、それぞれフィルタ部材４１４、４２５が追加される。フィルタ部材４１４は、フィルタ部材４１１を透過した光のうち、波長帯域Ｂ４の光を反射し、波長帯域Ｂ４以外の光を透過する。フィルタ部材４２５は、フィルタ部材４１４によって反射された光のうち、波長帯域Ｂ４の光のみを透過し、波長帯域Ｂ４以外の光を遮断する。このように、フィルタ部材４１４、４２５は、フローセル２００から生じた光のうち、波長帯域Ｂ４の蛍光のみを分離可能に構成される。受光部５０２は、波長帯域Ｂ４の低強度の蛍光を撮像する。

【0109】

実施形態３においても、実施形態１と同様、高強度の蛍光と低強度の蛍光とを別々に生じさせ、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像を取得できる。したがって、実施形態１と同様、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像に基づいて、細胞における分布および量が多様なＮＦ−κＢを、精度良く解析できる。

【0110】

＜実施形態４＞
実施形態４では、実施形態１と比較して、図１に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップＳ１、Ｓ２における一部の手順のみが異なる。以下、実施形態１とは異なる手順について説明する。

【0111】

ステップＳ１において、図１６に示すように、細胞に含まれるＮＦ−κＢが、実施形態１と同様の蛍光物質１１のみで標識される。ステップＳ２において、蛍光物質１１、１３で標識された細胞を含む試料がフローセルに流され、フローセルを流れる細胞に波長λ１、λ３の光が照射され、蛍光物質１１、１３から蛍光が生じさせられる。このとき、波長λ１の光は、細胞に対して高パワーで照射されるため、フィルタ部材２１を透過する波長帯域Ｂ１の蛍光は、実施形態１と同様に高強度となる。さらに、この細胞をフローセル内で移動させ、移動した細胞に波長λ１の光を照射して、蛍光物質１１から蛍光を生じさせる。このとき、波長λ１の光は、細胞に対して低パワーで照射される。したがって、フィルタ部材２１を透過する波長帯域Ｂ１の蛍光は、低強度となる。

【0112】

実施形態４の装置構成では、実施形態１と比較して、図６に示す光学検出部１３０のうち、光源３０２と、集光レンズ３１２と、ダイクロイックミラー３２１と、フィルタ部材４１２、４２２と、集光レンズ４３２と、受光部５０２が省略される。また、図１７に示すように、実施形態３の装置構成では、実施形態１と比較して、光照射部３００に、光源３０５と集光レンズ３１５が追加され、集光部４００に、集光レンズ４７１と、フィルタ部材４７２と、集光レンズ４７３が追加される。また、実施形態３の装置構成では、実施形態１と比較して、受光部５０５が追加される。

【0113】

なお、図１７は、光学検出部１３０をＸＹ平面に平行な方向に見た図となっている。図１７では、便宜上、光照射部３００は、Ｙ軸正方向に見た状態が図示されており、集光部４００と受光部５０５は、Ｘ軸負方向に見た状態が図示されている。

【0114】

光源３０１から出射された波長λ１の光は、フローセル２００の流路２１０において、位置２１１に照射される。光源３０５は、光源３０１と同様に構成され、光源３０１よりも低パワーで光を出射する。集光レンズ３１５は、光源３０５から出射された光を、流路２１０において位置２１１のＺ軸正側に位置する位置２１２に集光する。集光レンズ４７１は、位置２１２から生じた蛍光を集光する。フィルタ部材４７２は、集光レンズ４７１によって集光された光のうち、波長帯域Ｂ１の光のみを透過する。受光部５０５は、集光レンズ４７３によって集光された波長帯域Ｂ１の低強度の光を受光して、受光した光に基づく画像情報を撮像信号として出力する。

【0115】

細胞が位置２１１から位置２１２に位置付けられるまでの時間Ｔは、あらかじめ取得される。これにより、ある細胞に基づく光が受光部５０１によって受光された後、時間Ｔが経過すると、同一の細胞に基づく光が受光部５０５によって受光されることになる。したがって、受光部５０１に基づいて取得される画像と、受光部５０５に基づいて取得される画像とを、同一の細胞から取得されたものとして対応付けることができる。

【0116】

実施形態４においても、実施形態１と同様、高強度の蛍光と低強度の蛍光とを別々に生じさせ、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像を取得できる。したがって、実施形態１と同様、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像に基づいて、細胞における分布および量が多様なＮＦ−κＢを、精度良く解析できる。

【0117】

＜実施形態５＞
実施形態５では、実施形態１と比較して、図１に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップＳ２における一部の手順のみが異なる。以下、実施形態１とは異なる手順について説明する。

【0118】

ステップＳ２において、図１８に示すように、蛍光物質１１〜１３で標識された細胞を含む試料がフローセルに流され、フローセルを流れる細胞に波長λ１〜λ３の光が照射され、蛍光物質１１〜１３から蛍光を生じさせられる。蛍光物質１１、１２から生じた蛍光は、合わせてフィルタ部材２４に入射する。フィルタ部材２４は、プリズムにより構成される。蛍光物質１１、１２から生じた蛍光は、波長帯域の違いからフィルタ部材２４によって、波長帯域Ｂ１の蛍光と波長帯域Ｂ２の蛍光に分けられる。ここで、実施形態１と同様、波長λ１の光は、細胞に対して高パワーで照射され、波長λの光は、細胞に対して低パワーで照射される。これにより、実施形態１と同様、フィルタ部材２１を透過する波長帯域Ｂ１の蛍光は、高強度となり、フィルタ部材２２を透過する波長帯域Ｂ２の蛍光は、低強度となる。

【0119】

なお、蛍光物質１１〜１３から生じた蛍光が、合わせてフィルタ部材２４に入射し、波長帯域の違いからフィルタ部材２４によって、それぞれ波長帯域Ｂ１〜Ｂ３の蛍光に分けられても良い。ここでは、実施形態１の構成に対して用いる例を示したが、フィルタ部材２４は、実施形態２〜４の構成において用いられても良い。

【0120】

図１９に示すように、実施形態５の装置構成では、実施形態１と比較して、図６に示す光学検出部１３０のうち、フィルタ部材４１１、４１２、４２１、４２２が省略され、集光部４００に、フィルタ部材４８１が追加される。フィルタ部材４８１は、プリズムにより構成される。

【0121】

フローセル２００を流れる試料から生じた蛍光は、フィルタ部材４８１に入射する。フィルタ部材４８１に入射した蛍光は、蛍光の波長に応じてフィルタ部材４８１から異なる角度で出射する。集光レンズ４３１と受光部５０１は、フィルタ部材４８１から出射する蛍光のうち、波長帯域Ｂ１の蛍光に対応した方向に配置されている。これにより、受光部５０１は、波長帯域Ｂ１の高強度の蛍光を撮像できる。集光レンズ４３２と受光部５０２は、フィルタ部材４８１から出射する蛍光のうち、波長帯域Ｂ２の蛍光に対応した方向に配置されている。これにより、受光部５０２は、波長帯域Ｂ２の低強度の蛍光を撮像できる。

【0122】

実施形態５においても、実施形態１と同様、高強度の蛍光と低強度の蛍光とを別々に生じさせ、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像を取得できる。したがって、実施形態１と同様、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像に基づいて、細胞における分布および量が多様なＮＦ−κＢを、精度良く解析できる。

【0123】

＜実施形態６＞
実施形態６では、細胞に含まれる被検物質に基質を接触させて蛍光物質を生じさせ、生じた蛍光物質に光を照射し、光の照射により蛍光物質から生じた蛍光に基づいて被検物質の局在状況を判別する。実施形態６では、被検物質は細胞質である。基質は、被検物質に触れると切断される切断部位を含み、切断部位が切断されると蛍光物質を生じる。より具体的には、基質は被検物質である細胞質に触れることで、細胞質中に存在する酵素により切断される。実施形態６では、細胞質を標識する蛍光物質からの蛍光に基づいて、細胞質の局在を判定する。なお、被検物質は、たとえば、細胞質中のタンパク質、細胞小器官、細胞膜等、細胞に含まれる細胞質以外の物質であってもよい。

【0124】

実施形態６では、実施形態３と比較して、図１に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップＳ１における一部の手順が異なる。以下、実施形態３とは異なる手順について説明する。

【0125】

ステップＳ１において、図２０に示すように、細胞と基質１６ａとが混合される。基質１６ａは、細胞質に含まれるエステラーゼで加水分解されると、蛍光物質１６ｂを生じる物質である。細胞と基質１６ａとが混合されると、細胞膜を透過した基質１６ａは、細胞質と接触することにより、細胞質に含まれるエステラーゼで加水分解され、蛍光物質１６ｂを生じる。こうして、細胞質が蛍光物質１６ｂにより標識される。

【0126】

続いて、実施形態３と同様、ステップＳ２以降の処理が行われる。すなわち、ステップＳ２において、蛍光物質１６ｂで標識された細胞を含む試料がフローセルに流され、図２０に示すように、フローセルを流れる細胞に波長λ１、λ３の光が照射され、それぞれ、蛍光物質１６ｂ、１３から蛍光が生じさせられる。そして、図２０に示すように、蛍光物質１６ｂから生じた蛍光を２つに分割し、一方をフィルタ部材２１に通し、他方をフィルタ部材２２に通す。これにより、実施形態３と同様、フィルタ部材２１を透過した波長帯域Ｂ１の蛍光は高強度となり、フィルタ部材２２を透過した波長帯域Ｂ４の蛍光は低強度となる。なお、実施形態６に基づく装置は、実施形態３と同様に構成される。

【0127】

実施形態６においても、実施形態３と同様、強度の異なる２つの蛍光を生じさせ、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像を取得できる。したがって、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像に基づいて、細胞質の局在を精度良く判別できる。このように、細胞質の局在を精度良く判別できると、細胞質の範囲を高精度に定義できるようになる。これにより、たとえば、細胞質の範囲を他の解析と組み合わせて、さらに詳細な解析を行うことができるようになる。また、たとえば、細胞質の範囲を、細胞等の研究に役立てることができるようになる。

【0128】

＜実施形態６の検証＞
次に、発明者が行った実施形態６の検証について説明する。

【0129】

１．準備
細胞として、ヒト心臓微小血管内皮細胞（HMVEC-C）（Lonza CatNo.CC-7030, Lot No.0000296500 (P4)）を用意した。細胞質標識試薬として、Cell Explorer Fixable Live Cell Tracking Kit *Green Fluorescence*（コスモバイオ 22621）を用意した。細胞質標識試薬は、図２０に示す基質１６ａに対応する物質を含む。細胞質標識試薬は、疎水性を有している。細胞質標識試薬は、細胞膜を通過し、細胞内エステラーゼで加水分解されることで蛍光物質を生じる。ここで生じる蛍光物質は、図２０に示す蛍光物質１６ｂに対応する。核染色色素として、Cellstain Hoechst 33342 solution（DOjinDO H342）を用意した。この他、EGM-2MV Medium（Lonza Cat No.CC-3202）、EGM-2MV SingleQuots Kit（Lonza Cat No. CC-3202）、PBS pH7.4（GIBCO Cat No.10010-023）、BSA（LAMPIRE Cat No. 7500805）、PFA（WAKO Cat No.160-16061）、TritonX100（ナカライテスク CatNo.35501-15）を用意した。

【0130】

２．試薬調製
５００ｍＬのEGM-2MV MediumにEGM-2MV SingleQuots Kitを添加し、培養培地を作製した。パラホルムアルデヒドを終濃度８％ w/vとなるようにｐＨ１２のPBSにて溶解した後に、ｐＨ７．４に調整した。PBSに１．５ｇのBSAを加えて溶解させ５０ｍＬにメスアップし、３％ BSA/PBSを調製した。PBSに０．５ｇのBSAを加えて溶解させ５０ｍＬにメスアップし、１％ BSA/PBSを調製した。TritonX100を終濃度０．１％ w/vとなるようにPBSにて調製した。Track kit Greenのバイアルに１００μＬのDMSOを添加し、１０００× Track kit Green stock solutionを作製し、Kit付属のAssay bufferに１／１０００量添加することで、Track kit working solutionを調整した。

【0131】

３．手順
HMVEC-Cは、メーカー推奨プロトコルに準じてEGM-2MV培地にて培養した。購入後から継代回数６回以内の細胞を本検証に用いた。培養培地は開封後の使用期限を３週間とした。細胞が７０％コンフルエントに培養された後に、３ｍＬ程度の培地を残して電動ピペッターで培地を除去し、スクレーパーにて細胞を剥離した。回収した３ｍＬの懸濁液に３μＬのTrack kit working solutionを加え、３７℃ ＣＯ_２インキュベーター内で３０分静置した。３０分静置後、室温下、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞ペレットを５ｍＬのPBSで３回洗浄した。上清を除去し、１％ BSA/PBSを５０μＬ添加した。

【0132】

４．フローサイトメータによる検出
蛍光画像を取得可能なフローサイトメータとして、ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer（Merck Millipore）を用いた。このフローサイトメータのフローセルに上記３に沿って調製した試料を流し、フローセルを流れる試料に、波長４８８ｎｍ、４０５ｎｍのレーザ光を照射した。波長４８８ｎｍ、４０５ｎｍのレーザ光は、図２０に示す波長λ１、λ３のレーザ光に対応する。波長４８８ｎｍ、４０５ｎｍのレーザ光の出射パワーは、それぞれ、５０ｍＷ、２０ｍＷとした。波長４８８ｎｍのレーザ光が細胞質を標識する蛍光色素に照射されることにより蛍光が生じた。波長４０５ｎｍのレーザ光が核染色色素に照射されることにより蛍光が生じた。

【0133】

上記フローサイトメータにおいて、波長４８８ｎｍのレーザ光により生じた蛍光は、透過波長帯域４８０ｎｍ〜５６０ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、高強度の蛍光画像が取得された。また、波長４８８ｎｍのレーザ光により生じた蛍光は、透過波長帯域５６０ｎｍ〜５９５ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、低強度の蛍光画像が取得された。波長４０５ｎｍのレーザ光により生じた蛍光は、透過波長帯域４２０ｎｍ〜５０５ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、核に対応する蛍光画像が取得された。また、フローセルを流れる試料に、波長が４２０ｎｍ〜４８０ｎｍの間に設定されたレーザ光を照射した。このレーザ光が細胞を透過した光は、透過波長帯域４２０ｎｍ〜４８０ｎｍのフィルタ部材を介して撮像され、明視野画像が取得された。なお、上記フローサイトメータでは、対象となる波長帯域の光が適正に受光部に入射するよう、フィルタ部材等により不要な波長帯域の光が除去されている。

【0134】

図２１を参照して、上記検出により取得された画像について説明する。

【0135】

「明視野」は、細胞の明視野画像を示す。「高強度の蛍光」と「低強度の蛍光」は、それぞれ、細胞質を標識した蛍光色素から生じた高強度の蛍光に基づく画像と、細胞質を標識した蛍光色素から生じた低強度の蛍光に基づく画像である。「核からの蛍光」は、核を染色した核染色用色素から生じた蛍光に基づく画像である。横に並ぶ４つの画像は、１つの細胞から取得された画像である。明視野画像以外の画像は、便宜上、取得されたカラー画像をグレースケール化したものである。明視野画像以外の画像において、白い部分は蛍光の強度が強いことを示す。

【0136】

最上段に示す細胞および最上段から１つ下に示す細胞の場合、低強度の蛍光に基づく画像は強度が低すぎるため、細胞質の局在は不明瞭である。他方、高強度の蛍光に基づく画像は強度が適正であるため、細胞質の局在を精度よく判別できる。最下段に示す細胞および最下段から１つ上に示す細胞の場合、高強度の蛍光に基づく画像は強度が高すぎるため、細胞質の局在を判別するのは困難である。他方、低強度の蛍光に基づく画像は強度が適正であるため、細胞質の局在を精度よく判別できる。

【0137】

以上のように、本検証によれば、実施形態６のように強度の異なる２つの蛍光画像に基づけば、細胞質の局在を判別できることが分かる。このように、実施形態６によれば、細胞質を標識する１種類の蛍光色素から生じた蛍光を、異なる波長帯域の蛍光を通すフィルタ部材２１、２２に通して２つの蛍光画像を取得することにより、１つの細胞に対して一度の測定で細胞質の局在を正しく取得できることが分かる。

【0138】

＜実施形態７＞
実施形態７では、細胞に含まれる被検物質に２種類の基質を接触させて２種類の蛍光物質を生じさせ、生じた２種類の蛍光物質に光を照射し、光の照射により２種類の蛍光物質から生じた蛍光に基づいて被検物質の局在状況を判別する。すなわち、実施形態７では、実施形態６のように１つの光を用いるのではなく、互いに異なる波長の光を用いて互いに異なる強度の蛍光を取得する。なお、被検物質に１種類の基質を接触させて２種類の蛍光物質を生じさせてもよい。

【0139】

実施形態７では、実施形態６と比較して、図１に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップＳ１、Ｓ２における一部の手順のみが異なる。以下、実施形態６とは異なる手順について説明する。

【0140】

ステップＳ１において、図２２に示すように、細胞と基質１７ａ、１８ａとが混合される。基質１７ａ、１８ａは、細胞質に含まれるエステラーゼで加水分解されると、それぞれ蛍光物質１７ｂ、１８ｂを生じる物質である。蛍光物質１７ｂ、１８ｂは、それぞれ、波長λ１、λ２の光が照射されると互いに異なる波長帯域の蛍光を励起するよう構成されている。細胞と基質１７ａ、１８ａとが混合されると、細胞膜を透過した基質１７ａ、１８ａは、細胞質と接触することにより、細胞質に含まれるエステラーゼで加水分解され、蛍光物質１７ｂ、１８ｂを生じる。こうして、細胞質が蛍光物質１７ｂ、１８ｂにより標識される。

【0141】

ステップＳ２において、蛍光物質１７ｂ、１８ｂで標識された細胞を含む試料がフローセルに流され、図２２に示すように、フローセルを流れる細胞に波長λ１、λ２、λ３の光が照射され、それぞれ、蛍光物質１７ｂ、１８ｂ、１３から蛍光が生じさせられる。このとき、波長λ１のレーザ光は高パワーで細胞に照射され、波長λ２のレーザ光は低パワーで細胞に照射される。蛍光物質１７ｂから生じた蛍光は、フィルタ部材２１に通されることにより、波長帯域Ｂ１の蛍光となる。蛍光物質１８ｂから生じた蛍光は、フィルタ部材２２に通されることにより、波長帯域Ｂ２の蛍光となる。こうして、フィルタ部材２１を通過した波長帯域Ｂ１の蛍光は高強度となり、フィルタ部材２２を通過した波長帯域Ｂ２の蛍光は低強度となる。なお、実施形態７に基づく装置は、実施形態１と同様に構成される。

【0142】

実施形態７においても、実施形態６と同様、強度の異なる２つの蛍光を生じさせ、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像を取得できる。したがって、実施形態６と同様、高強度の蛍光画像と低強度の蛍光画像に基づいて、細胞質の局在を精度良く判別できる。

【符号の説明】

【0143】

１１、１２ 蛍光物質
１６ａ、１７ａ、１８ａ 基質
１６ｂ、１７ｂ、１８ｂ 蛍光物質
２１、２２、２４ フィルタ部材
１００ 細胞情報取得装置
１１１ 取得部
１１２ 解析部
２００ フローセル
３００ 光照射部
３０１、３０２ 光源
４１１、４１２、４１４、４２１、４２２、４２５、４５１、４５２、４８１ フィルタ部材
５０１、５０２、５０５ 受光部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】