特許 6824881 ナノ細孔ＲＮＡを特徴付けるための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6824881

(24)【登録日】2021年1月15日

(45)【発行日】2021年2月3日

(54)【発明の名称】ナノ細孔ＲＮＡを特徴付けるための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6834 20180101AFI20210121BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20210121BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALI20210121BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20210121BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20210121BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6834 Z

   C12N15/55ZNA

   C12Q1/34

   G01N33/483 C

   G01N33/483 E

   G01N33/50 P

【請求項の数】11

【全頁数】93

(21)【出願番号】特願2017-520492(P2017-520492)

(86)(22)【出願日】2015年10月19日

(65)【公表番号】特表2017-532962(P2017-532962A)

(43)【公表日】2017年11月9日

(86)【国際出願番号】GB2015053097

(87)【国際公開番号】WO2016059436

(87)【国際公開日】20160421

【審査請求日】2018年10月18日

(31)【優先権主張番号】1418459.2

(32)【優先日】2014年10月17日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1508270.4

(32)【優先日】2015年5月14日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1517634.0

(32)【優先日】2015年10月6日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】PCT/GB2015/052916

(32)【優先日】2015年10月6日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】511252899

【氏名又は名称】オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ガラルド，ダニエル ライアン

(72)【発明者】

【氏名】ヘロン，アンドリュー ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ジャヤシンゲ，ラクマル

(72)【発明者】

【氏名】ターナー，ダニエル ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ホワイト，ジェームズ

【審査官】 佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５０６５７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／０１３２６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０１４４５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Biological Chemistry，２００６年，vol. 281, no. 37，p. 26914-26921

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるための方法であって、
ａ）（ｉ）ＤＮＡヘリカーゼ結合部位を含むＤＮＡリーダー配列を含むように修飾されているＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉ）ＤＮＡヘリカーゼ酵素を用意するステップ；
ｂ）ａ）において用意された前記ＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡヘリカーゼ酵素を膜貫通細孔と接触させて、前記ＤＮＡヘリカーゼが前記膜貫通細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するステップ；
ｃ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドが膜貫通細孔に対して移動する間に１つ以上の測定値を得るステップであって、前記測定値は、前記ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示し、それによって前記標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるステップを含む方法。

【請求項2】

前記リーダー配列が優先的に前記細孔に入り込む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ｉ）前記ＤＮＡリーダー配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチドと前記ＤＮＡリーダー配列のそれぞれの少なくとも１つの反応性基の間に形成される共有結合によって前記ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され、（ｉｉ）前記ＤＮＡリーダー配列が、化学的または酵素的ライゲーションによって前記ＲＮＡポリヌクレオチドにライゲーションされ、または、（ｉｉｉ）前記ＤＮＡリーダー配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記１つ以上の特徴が、（ｉ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの素性、（ｉｉｉ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドが修飾されているかどうか、場合により、メチル化による、酸化による、損傷による修飾、１つ以上のタンパク質もしくは類似塩基を用いた標識、または１つ以上の標識、タグもしくはスペーサーを用いた修飾がされているかどうかから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴が、電気的測定および／または光学的測定によって測定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ステップｃ）が、前記ＲＮＡポリヌクレオチドが膜貫通細孔に対して移動する間に膜貫通細孔を通過する電流を測定するステップであって、前記電流は、前記ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示し、それによって前記ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、１つ以上のアンカーを用いて前記膜にカップリングされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＤＮＡヘリカーゼが、ポリヌクレオチド結合ドメインの開口部のサイズを減少させるための修飾を含み、前記開口部を通って、少なくとも１つの立体配座状態で、ＲＮＡポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離することができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記１つ以上のヘリカーゼが、ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはＤｄａヘリカーゼ；（ｂ）（ａ）のヘリカーゼのいずれかに由来するヘリカーゼ；または（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）のヘリカーゼのいずれかの組み合わせである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ヘリカーゼに由来し、前記ポリヌクレオチドに結合するが、ヘリカーゼとして機能しないように修飾されている１つ以上の分子ブレーキをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記膜貫通細孔が、タンパク質細孔であって、場合により溶血素、ロイコシジン、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、ＣｓｇＧ、リセニン、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来である、または前記膜貫通細孔が固体状態細孔である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的ＲＮＡポリヌクレオチドが膜貫通細孔に対して移動する間、１つ以上の測定値を得ることによって、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるための新規な方法に関する。膜貫通細孔に対する標的ＲＮＡポリヌクレオチドの移動は、ＤＮＡヘリカーゼ酵素によって制御され、ＲＮＡポリヌクレオチドは、それに結合するＤＮＡヘリカーゼを増加させるように修飾されている。本発明はまた、ＲＮＡポリヌクレオチドが、それに結合するＤＮＡヘリカーゼを増加させるように修飾されている、修飾されたＲＮＡ構築物に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
現在、広範な用途にわたって迅速におよび安価にポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を配列決定および同定する技術が必要とされている。既存の技術は、主に、大量のポリヌクレオチドを生成するために増幅技術に依存し、シグナル検出用に多量の専用の蛍光化学物質を必要とするため、時間がかかり、費用が嵩む。

【0003】

膜貫通細孔（ナノ細孔）は、ポリマーおよび様々な小分子に対する直接的であり、電気的なバイオセンサーとしての潜在性が大きい。特に、最近の焦点は、潜在的なＤＮＡ配列決定技術としてのナノ細孔にあてられてきた。

【0004】

ナノ細孔全体に電位が印加されるときに、ヌクレオチドなどの分析物がある一定時間、一時的にこのバレル内に存在する際、電流の流れが変化する。ヌクレオチドのナノ細孔検出は、既知のシグネチャーおよび継続時間の電流変化を生じる。鎖配列決定法において、単一のポリヌクレオチド鎖が細孔を通過し、ヌクレオチドの素性が導かれる。鎖配列決定は、細孔を通るポリヌクレオチドの移動を制御するために、ポリヌクレオチド結合タンパク質の使用を伴ってもよい。

【0005】

メッセンジャーＲＮＡは、生物の動的状態の外観を与え、直接的なＲＮＡ配列決定の利点および応用は広範囲であり、これは健康スクリーニングにおける使用を含み、例えば、特定の癌における転位の進行および心臓病が挙げられる。直接的なＲＮＡ配列決定はまた、作物における病害抵抗性の調査、ストレス、例えば、干ばつ、ＵＶおよび塩に対する応答の判定、ならびに胚形成中の細胞分化および決定に有用性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＲＮＡ、特に５００ヌクレオチド以上のＲＮＡの直接的な配列決定において生じる課題は、膜貫通細孔を通るＲＮＡの移行を制御し得る適切な分子モーターを見出すことである。今日まで、ＲＮＡに関与し、一貫した移動を与える分子モーターは示されていない。ポリヌクレオチドの特徴付けまたは配列決定のために、ＲＮＡポリマーの一貫した移動およびポリマーの長いセグメントを読み取る能力が望ましい。

【0007】

国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５３１２１号（国際公開第２０１５／０５６０２８号パンフレット）は、相補的ポリヌクレオチドを形成することを伴う標的リボ核酸（ＲＮＡ）を特徴付け、次に、膜貫通細孔を用いて相補的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法を報告している。このような間接的なＲＮＡの特徴付けはエラーを起こしやすく、結果として、例えば、ＲＮＡのメチル化状態に関する重要な情報が失われる可能性がある。また、他の重要な修飾は、ＲＮＡからｃＤＮＡへの変換に際して見えなくなってしまう場合がある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、驚くべきことに、標的ＲＮＡポリヌクレオチドがＤＮＡヘリカーゼ酵素の制御下で膜貫通細孔に対して移動する間、１つ以上の測定値を得ることによって標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けることができることを実証した。したがって、一実施形態において、細孔を通じて配列決定されるＲＮＡの能力または効率を増加させるための方法が提供される。別の実施形態において、修飾されていない形態のＲＮＡよりも高い効率で細孔を通じて配列決定することができる修飾されたＲＮＡを生成する方法もまた提供される。したがって、本発明は、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるための方法であって、
ａ）（ｉ）非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むように修飾されているＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉ）ＤＮＡヘリカーゼ酵素を用意するステップ；
ｂ）ａ）において用意されたＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡヘリカーゼ酵素を膜貫通細孔と接触させて、ＤＮＡヘリカーゼが膜貫通細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するステップ；
ｃ）標的ＲＮＡポリヌクレオチドが膜貫通細孔に対して移動する間に１つ以上の測定値を得るステップであって、測定値は、ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示し、それによって標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるステップ
を含む方法を提供する。

【0009】

非ＲＮＡポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド領域または配列または構築物など）を含むようなＲＮＡポリヌクレオチドの修飾は、それに結合するＤＮＡヘリカーゼの増加をもたらす。本明細書で定義される「非ＲＮＡポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドがリボヌクレオチドではない、すなわちＲＮＡ由来ではないポリヌクレオチドである。したがって、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つのリボヌクレオチド（またはＲＮＡヌクレオチド）を含んでもよいが、非ＲＮＡヌクレオチドまたは配列、すなわちＲＮＡではないヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列をさらに備えていなければならずまたは含まなければならない。本発明の好ましい実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチド（少なくとも１つのリボヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドを含んでもよくまたは含まなくてもよい）は、ＤＮＡまたはＤＮＡ類似体、好ましくはＤＮＡヘリカーゼ結合部位またはＤＮＡアダプターを含む。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、細孔に優先的に入り込むリーダー配列を含む。したがって、非ＲＮＡポリヌクレオチドが最初に読み取られ、続いて、特徴付けられるべき標的ＲＮＡ配列が読み取られる。

【0010】

本発明は、（ｉ）ＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉ）非ＲＮＡポリヌクレオチドを含む「ハイブリッド」ポリヌクレオチドである構築物を提供する。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡポリヌクレオチドを含み、ここで、ＤＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡヘリカーゼ結合部位を含む、またはそれだけを含む。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ナノ細孔に優先的に入り込むリーダー配列をさらに含む。より好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖上のバーコード部分をさらに含む。バーコード部分は、好ましくは、リーダー配列とＤＮＡヘリカーゼ結合部位の間に位置される。バーコード部分は、分析物の明白な同定を可能にし、すなわち、いくつかの試料のうちのどれを配列決定しているかをユーザに知らせる。

【0011】

非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むような標的ＲＮＡポリヌクレオチドの修飾は、本明細書に記載されている１つ以上の結合方法を含む、任意の適切な結合方法を用いて、非ＲＮＡポリヌクレオチド（おそらくは、ＲＮＡ配列または少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む）の標的ＲＮＡポリヌクレオチドへの結合を伴う場合がある。本明細書に記載されているように、非ＲＮＡポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの結合は、標的ＲＮＡの非ＲＮＡポリヌクレオチドへの結合と同義である。非ＲＮＡポリヌクレオチドがリボヌクレオチドまたはＲＮＡ配列を含む場合、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡポリヌクレオチド内に含まれるリボヌクレオチドまたはＲＮＡを介して標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。

【0012】

非ＲＮＡポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドと非ＲＮＡポリヌクレオチドのそれぞれの少なくとも１つの反応性基の間に形成される共有結合によって、標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドに化学的または酵素的にライゲーションすることができる。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、追加的にまたは代替的に、ハイブリダイゼーションによっておよび／または１つ以上のトポイソメラーゼを用いることによって、ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。好ましくは、本方法によって決定されるべき１つ以上の特徴は、（ｉ）ＲＮＡポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ＲＮＡポリヌクレオチドの素性、（ｉｉｉ）ＲＮＡポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ＲＮＡポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ＲＮＡポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴は、電気的測定および／または光学的測定によって測定することができる。好ましくは、ステップｃ）は、ＲＮＡポリヌクレオチドが膜貫通細孔に対して移動する間、膜貫通細孔を通過する電流を測定するステップであって、電流は、ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示し、それによってＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるステップを含む。

【0013】

特徴付けられるべき標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つ以上のタンパク質を用いてまたは１つ以上の標識、タグもしくはスペーサーを用いて、追加的にまたはさらに修飾されてもよい。標的ＲＮＡは、塩基類似体を含有してもよい。ＲＮＡポリヌクレオチドは、１つ以上のアンカーを用いて膜にカップリングさせることができる。

【0014】

好ましくは、ＤＮＡヘリカーゼは、ポリヌクレオチド結合ドメインの開口部のサイズを減少させるための修飾を含み、この開口部を通って、少なくとも１つの立体配座状態で、ＲＮＡポリヌクレオチドはヘリカーゼから解離することができる。本発明の一実施形態において、移動は、一連の１つ以上のＤＮＡヘリカーゼによって制御される。１つ以上のヘリカーゼは、ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはＤｄａヘリカーゼ；（ｂ）（ａ）のヘリカーゼのいずれかに由来するヘリカーゼ；または（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）のヘリカーゼのいずれかの組み合わせである。本方法は、ヘリカーゼに由来し、ポリヌクレオチドに結合するが、ヘリカーゼとしては機能しないように修飾されている１つ以上の分子ブレーキの使用をさらに含んでもよい。

【0015】

膜貫通細孔は、タンパク質細孔または固体状態細孔であり得る。好ましくは、膜貫通タンパク質細孔はタンパク質細孔であり、溶血素、ロイコシジン、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、リセニン、ＣｓｇＧ、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来である。

【0016】

本発明はまた、移動がＤＮＡヘリカーゼ酵素によって制御されるとき、膜貫通細孔に対して標的ＲＮＡポリヌクレオチドを移動させる方法であって、
ａ）（ｉ）非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むように修飾されているＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉ）ＤＮＡヘリカーゼ酵素を用意するステップ；
ｂ）ａ）において用意されたＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡヘリカーゼ酵素を膜貫通細孔と接触させて、ＤＮＡヘリカーゼが膜貫通細孔に対してＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するステップ
を含む方法を提供する。

【0017】

非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むようなＲＮＡポリヌクレオチドの修飾は、結果として、それに結合するＤＮＡヘリカーゼを増加させる。本発明の一実施形態において、本方法は、接触ステップの前に、修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドにＤＮＡヘリカーゼを予め結合させることを含む。

【0018】

本発明の方法は、膜貫通細孔に対するＲＮＡポリヌクレオチドのより一貫した移動を提供する。本発明はまた、（ｉ）ＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉ）非ＲＮＡポリヌクレオチドを含む「ハイブリッド」ポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡポリヌクレオチドを含み、ここで、ＤＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡヘリカーゼ結合部位を含むまたはそれだけを含む。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ナノ細孔に優先的に入り込むリーダー配列をさらに含む。より好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖上のバーコード部分をさらに含む。バーコード部分は、好ましくは、リーダー配列とＤＮＡヘリカーゼ結合部位の間に位置される。バーコード部分は、分析物の明白な同定を可能にし、すなわち、いくつかの試料のうちのどれを配列決定しているかをユーザに知らせる。

【0019】

本発明はまた、ＲＮＡポリヌクレオチドの一部が、ＤＮＡヘリカーゼと相互作用するまたはそれに結合するように修飾されている、標的ＲＮＡポリヌクレオチドとＤＮＡヘリカーゼの組み合わせを提供する。好ましくは、ＲＮＡは非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むように修飾され、最も好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＤＮＡ類似体である。

【0020】

本発明はまた、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットを提供する。好ましくは、キットは、特徴付けられるべき標的ＲＮＡへの結合に適合した非ＲＮＡポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、試料中の標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるための装置を提供する。

【0021】

本明細書に記載されている修飾されたＲＮＡ構築物は、ＤＮＡヘリカーゼ酵素に対する結合部位を提供する。ＤＮＡヘリカーゼは、ＲＮＡポリヌクレオチドの読み取るように実質的に「騙される」：一度、ＤＮＡヘリカーゼが非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合すると、それはＲＮＡポリヌクレオチドに沿って転位することができる。ヘリカーゼは、溶液中のＲＮＡに沿って転位することができる。ヘリカーゼは、ＲＮＡポリヌクレオチドに沿ったヘリカーゼの移動を促進するためにナノ細孔の存在を必要とすることがある。ＲＮＡに沿ったヘリカーゼの移動は、ナノ細孔によって、およびナノ細孔を横切る印加された場の適用を介して促進され得る。

【0022】

ＤＮＡヘリカーゼの制御下でナノ細孔を通してＲＮＡ構築物全体を移行させることができると、その配列などのＲＮＡポリヌクレオチドの特徴が、公知の方法よりも改善された正確さおよび速度で推定されることが可能となる：本発明の方法は、従来技術の方法と比較して、ＰＣＲバイアスから免れる。ＲＮＡにおける修飾を検出することができ、非コード化アイソフォームおよびスプライスバリアントを正確に同定することができる。ＲＮＡ塩基類似体は、ナノ細孔において直接的に検出され得る。本明細書に記載されている構築物は、５００ヌクレオチド以上、例えば、１０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、２００００ヌクレオチド、５００００ヌクレオチド、１０００００ヌクレオチドまたはそれらを超える標的ＲＮＡの移行を達成するのに特に効果的である。

【0023】

本発明の方法において、ＤＮＡヘリカーゼは、非ＲＮＡリーダー配列の存在により、標的ＲＮＡ配列の読み取るように実質的に「騙される」。一度、ＤＮＡヘリカーゼの移動が非ＲＮＡポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＤＮＡ類似体を含み得る）によって開始されると、それはＲＮＡに沿って移動し続けることができる。本発明の方法はまた、たとえＲＮＡおよびＤＮＡ配列が同じであったとしても、平均振幅および範囲の関数として、ＲＮＡおよびＤＮＡを互いに区別するための手段を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】真核生物のＲＮＡ鎖（点線で示される）をＤＮＡ鎖（実線で示される）に結合させる方法の略画を示す図である。真核生物のＲＮＡは、５’末端に７−メチルグアノシンキャップを有する（星型として示され、Ａと表示される）。反応ステップ１は、７−メチルグアノシンキャップを適所に残し、真核生物のＲＮＡの５’末端に反応基（Ｂと表示され、正方形として示される）を加える。反応性基は、ハイパーメチラーゼ酵素、例えば、修飾されたＳ−アデノシルメチアミン（SAdenosyl Methiamine）を有するトリメチルグアノシン合成酵素を用いて付加される。ステップ２は、化学反応ステップを示し、ここで、ＤＮＡ鎖は、結合され、Ｃと表示され、円形として示された反応性基もまた有し、他の反応性基（Ｂ）と反応して共有結合を形成する。ステップ３は、タバコ酸ホスファターゼを用いて７−メチルグアノシンキャップを除去し、Ｄと表示されたＲＮＡ鎖を生じさせる。次に、（７−メチルグアノシンキャップが除去され、Ｄと表示された）ＲＮＡを多数の異なる方法で処理して、ＤＮＡ鎖に結合したＲＮＡ鎖を生成することができる（ステップ４、６、７、８または１１）。ステップ４において、反応基（Ｂと表示され、正方形として示される）をＲＮＡ鎖Ｄの５’末端に付加する。ステップ５は、化学反応ステップを示し、ここで、結合され、Ｃと表示された反応基もまた有し、反応基が円形として示されているＤＮＡ鎖は、他の反応基（Ｂ）と反応して共有結合を形成する。ステップ６および７は、例えば、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼ２、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼなどを用いて、ＤＮＡ鎖（Ｅと表示される）をＲＮＡに直接ライゲーションすることができることを示す。ステップ７において、酵素（Ｇと表示される）は、ＤＮＡに予め結合されているが、ステップ６において、酵素は予め結合されていない。ステップ８および１１は、リーダー（Ｆと表示される）を有するＤＮＡプライマーのＲＮＡ鎖Ｄへのハイブリダイゼーションを示す。ステップ１１において、酵素（Ｇと表示される）は、ＤＮＡプライマーに予め結合されているが、ステップ８において、酵素は予め結合されていない。ステップ９および１２は、ＲＮＡ鎖Ｄの逆転写を示し、３つのＣの３’オーバーハングをもたらす。ステップ１０および１３は、ＤＮＡヘアピン（Ｈと表示される）の二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ（Ｉと表示される）へのライゲーションを示す。

【図2】ＤＮＡ鎖（実線で示される）に原核生物のＲＮＡ鎖（点線で示される）を結合させる方法の略画を示す図である。反応ステップ１は、例えば、ＰｏｌｙＡポリメラーゼ酵素を用いて、ＲＮＡ鎖の３’末端にポリ（ｄＡ）尾部（Ａと表示される）を付加して鎖Ｂを生じさせる。ステップ２および５は、リーダー（Ｃと表示される）を有するＤＮＡプライマーのポリ（ｄＡ）領域（Ａと表示される）へのハイブリダイゼーションを示す。ステップ５において、酵素（Ｄと表示される）は、ＤＮＡプライマーに予め結合されているが、ステップ２において、酵素を予め結合されていない。ステップ３および６は、ＲＮＡ鎖Ｂの逆転写を示し、１〜３個のＣの３’オーバーハングをもたらす。ステップ４および７は、ＤＮＡヘアピン（Ｅと表示される）の二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ（Ｆと表示される）へのライゲーションを示す。反応ステップ８、１０および１１は、ポリ（ｄＡ）領域をＲＮＡに付加することによりというよりはむしろ、原核生物のＲＮＡ上で直接起こる。ステップ８において、反応基（Ｇと表示され、正方形として示される）をＲＮＡ鎖の５’末端に付加する。ステップ９は、結合された反応基（Ｈと表示され、反応基は円形として示される）も有するＤＮＡ鎖を他の反応基（Ｇ）と反応させて、共有結合を形成する化学反応ステップを示す。ステップ１０および１１は、例えば、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼ２、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼなどを用いて、ＤＮＡ鎖（Ｉと表示される）をＲＮＡに直接ライゲーションできることを示す。ステップ１１において、酵素（Ｄと表示される）は、ＤＮＡに予め結合されているが、ステップ１０において、酵素は予め結合されていない。

【図3】実施例１において、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有し、次に（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４））を用いて、ＭｓｐＡナノ細孔を通して移行させたＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の略画を示す図である。領域Ａは、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｂと表示される）が結合する４０ヌクレオチドのポリ（ｄＴ）リーダー（配列番号１６）に対応する。領域Ａは、４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｘとして示され、Ｃと表示される）に結合される。領域Ｄは、合成ＲＮＡ領域（配列番号１７）に対応する。領域Ｅは可変長ポリ（Ｕ）に対応する。領域Ｆは、領域ＤにハイブリダイズされるＤＮＡ（配列番号１８）である。ＤＮＡ（配列番号１８）には、６つのｉＳｐ１８スペーサー（Ｙとして示され、Ｇと表示される）、２つのチミン（Ｔとして示され、Ｈと表示される）および３’コレステロールＴＥＧ（Ｉと表示される）が結合される。

【図4】ＲＮＡポリ（Ｕ）ポリメラーゼ伸長ステップ（実施例１のステップ１．１）の後、５％ＰＡＧＥ ＴＢＥ ＢｉｏＲａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｇｅｌ（１４０Ｖで４０分間作動する）を示す。レーン１は、１００ｂｐのＴｒｉＤｙｅラダーを示す。レーン２は、重合前の合成ＤＮＡ／ＲＮＡ１（その３’末端で４つのｉＳｐＣ３スペーサーに結合した配列番号１６であって、４つのｉＳｐＣ３スペーサーは反対側の末端で配列番号１７の５’末端に結合している、配列番号１６）を示す。レーン３は、ポリ（Ｕ）重合混合物を示す。レーン４は、ポリ（Ｕ）伸長されたＤＮＡ／ＲＮＡ２を含有する精製された試料１を示す。矢印Ｘは、伸長されていないＤＮＡ／ＲＮＡ１に対応し、矢印Ｙは、ポリ（Ｕ）伸長されたＤＮＡ／ＲＮＡ２に対応する。

【図5】ヘリカーゼ制御されたＤＮＡ移動の例示的な追跡を示し（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））、ここで、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、次に（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）は、ＤＮＡ／ＲＮＡ２の移動を制御した（図３に示される略画）。領域１は、ポリ（ｄＴ）リーダー（配列番号１６）に対応し、領域２は、ｉＳｐＣ３スペーサー（スペーサーはＤＮＡまたはＲＮＡ領域よりも多くの量の電流がナノ細孔を通じて流れることを可能にする）に対応し、領域３は、ＲＮＡ配列（配列番号１７）に対応し、領域４は、実施例１のステップ１．１において付加された可変長ポリ（Ｕ）ＲＮＡ領域に対応する。

【図6】トポイソメラーゼを用いてｄｓＤＮＡをＲＮＡ鎖に結合させる可能な方法を示す図である。この略画において、ｄｓＤＮＡは、その５’末端に遊離ヒドロキシルを有するＲＮＡ鎖に結合される（真核生物のＲＮＡの５’末端に存在する７−メチルグアノシンキャップおよび５’−リン酸は、例えば、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼまたはアルカリホスファターゼなどのホスファターゼを用いて除去する必要がある）。ワクシニアトポイソメラーゼは、示された配列でｄｓＤＮＡに結合する（ステップ１）。赤い矢印は、２番目のチミンと反対側にあるｄｓＤＮＡの下側の鎖にニックがあることを強調している。トポイソメラーゼが結合すると、それは第二のチミンの後でＤＮＡの上側の鎖を切断し、ｄｓＤＮＡに結合させた状態とする（ステップ２）。次に、ｄｓＤＮＡに結合したトポイソメラーゼは、遊離５’−ヒドロキシルを有するＲＮＡとともにインキュベートされた（ステップ３）。その後、トポイソメラーゼはＲＮＡをｄｓＤＮＡに接続させる。

【図7】トポイソメラーゼを用いてｄｓＤＮＡをＲＮＡ鎖に結合させる別の可能な方法を示す図である。この略画において、ＤＮＡの一本鎖領域を用いてｄｓＤＮＡをＲＮＡ鎖に結合させ、ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ結合を支援する。ワクシニアトポイソメラーゼは、示された配列でｄｓＤＮＡに結合する（ステップ１）。ＤＮＡの下側の鎖にはニックがない。トポイソメラーゼが結合すると、それは第二のチミンの後でＤＮＡの上側の鎖のみを切断し、ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡに結合させた状態とする（ステップ２）。次に、ｄｓＤＮＡに結合したトポイソメラーゼは、遊離５’−ヒドロキシルを有するＲＮＡとともにインキュベートされた（ステップ３）。続いて、トポイソメラーゼはＲＮＡをｄｓＤＮＡに接続させる。ｓｓＤＮＡ領域は、相補的ＲＮＡ配列をＤＮＡへの結合点に引き付けるのを支援する。

【図8】実施例２からの試料を含む、１４０Ｖで６０分間作動させた１０％ＰＡＧＥ ＴＢＥ−尿素変性基準ゲルを示す図である。レーン１は、１００ｂｐのＴｒｉＤｙｅラダーを示す。レーン２は、ＤＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号２１）、ＲＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号１９）およびＤＮＡスプリント（０．５×濃度、配列番号２０）を示す。先立って、これらは、実施例２に記載されるライゲーション反応をＴ４ ＤＮＡリガーゼの不存在下で受けた。レーン３は、ＤＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号２１）、ＲＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号１９）およびＤＮＡスプリント（４×濃度、配列番号２０）を示す。先立って、これらは、実施例２に記載されるライゲーション反応をＴ４ ＤＮＡリガーゼの不存在下で受けた。レーン４は、未反応ＤＮＡオリゴ１（配列番号２１）およびＤＮＡスプリント（配列番号２０）を対照として一緒に混合したものを示す。レーン５は、ＤＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号２１）、ＲＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号１９）およびＤＮＡスプリント（０．５×濃度、配列番号２０）を示す。先立って、これらは、実施例２に記載されるライゲーション反応をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で受けた。レーン６は、ＤＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号２１）、ＲＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号１９）およびＤＮＡスプリント（１×濃度、配列番号２０）を示す。先立って、これらは、実施例２に記載されるライゲーション反応をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で受けた。レーン７は、ＤＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号２１）、ＲＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号１９）およびＤＮＡスプリント（２×濃度、配列番号２０）を示す。先立って、これらは、実施例２に記載されるライゲーション反応をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で受けた。レーン８は、ＤＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号２１）、ＲＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号１９）およびＤＮＡスプリント（４×濃度、配列番号２０）を示す。先立って、これらは、実施例２に記載されるライゲーション反応をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で受けた。レーン９は、ＤＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号２１）、ＲＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号１９）およびＤＮＡスプリント（０．５×濃度、配列番号２０）を示す。先立って、これらは、実施例２に記載されるライゲーション反応をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で受け、ライゲーションステップ後にさらなるＤＮＡスプリント（配列番号２０の４．５×濃度）とともにインキュベートされる。レーン１０は、ＤＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号２１）、ＲＮＡオリゴ１（１×濃度、配列番号１９）およびＤＮＡスプリント（１×濃度、配列番号２０）を示す。先立って、これらは、実施例２に記載されるライゲーション反応をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で受け、さらに熱処理され、ＥｘｏＩに曝露される。レーン１１は、対照としてＤＮＡオリゴ１（配列番号２１）を示す。レーン１２は、対照としてのＲＮＡオリゴ１を示す。レーン１３は、対照として一緒に混合された未反応ＲＮＡオリゴ１（配列番号１９）およびＤＮＡスプリント（配列番号２０）を示す。１と表示されたバンドは、ＲＮＡオリゴ１（配列番号１９）に対応する。２と表示されたバンドは、スプリント（配列番号２０）にハイブリダイズしたＲＮＡオリゴ１（配列番号１９）に対応する。３と表示されたバンドは、スプリント（配列番号２０）に対応する。４と表示されたバンドは、ＤＮＡオリゴ１（配列番号２１）に対応する。５と表示されたバンドは、スプリント（配列番号２０）にハイブリダイズしたＤＮＡオリゴ１（配列番号２１）に対応する。Ａと表示された領域は、スプリント（スプリントにハイブリダイズした、ＲＮＡオリゴ１にライゲーションされたＤＮＡオリゴ１）の存在下でライゲーションされた基質に対応する。Ｂと表示された領域は、スプリント（ＲＮＡオリゴ１にライゲーションされたＤＮＡオリゴ１）の不存在下でライゲーションされた基質に対応する。

【図9】実施例３からの試料を含む、（Ａ）ＳＹＢＲ染色前、および（Ｂ）ＳＹＢＲ染色後に１４０ｍＶで６０分間流した、５％ＰＡＧＥ ＴＢＥ ＢｉｏＲａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｇｅｌを示す図である。レーン１および７は、ＴｒｉＤｙｅ １ｋＢラダーを示す。レーン２および８は、実施例３Ａから生成された生成物を示す（その３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合した配列番号２２であって、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号２３の５’末端と結合し、配列番号２３は３’末端に３アジドＮが結合している、配列番号２２）は、ＤＮＡスプリントＸ１（配列番号２４）の存在下で、５’−ヘキシニル−Ｇを有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）と反応した）。レーン３および９は、実施例３Ｂから生成された生成物を示す（ＤＮＡ Ｘ２（５’末端に結合したＣＹ３を有し、３’末端に結合した３アジドＮを有した配列番号２５）は、ＤＮＡスプリントＸ１（配列番号２４）の存在下で、５’−ヘキシニル−Ｇを有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）と反応した）。レーン４および１０は、５’−ヘキシニル−Ｇを有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＲＮＡＸ１、最も５’末端のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）と混合したＤＮＡ Ｘ２（５’末端に結合したＣＹ２を有し、３’末端に結合した３アジドＮを有した配列番号２５）を示す。レーン５および１１は、ＤＮＡ Ｘ１（その３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合した配列番号２２であって、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号２３の５’末端と結合し、配列番号２３は、３’末端に３アジドＮが結合している、配列番号２２）を示す。レーン６および１２は、５’−ヘキシニル−Ｇを有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）を示す。１と表示されたバンドは、結合したＤＮＡを有するおよび有しないＲＮＡ Ｘ１に対応する。バンド２は、未反応ＤＮＡ Ｘ１（その３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合した配列番号２２であって、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号２３の５’末端と結合し、配列番号２３は、３’末端に３アジドＮが結合している、配列番号２２）に対応する。バンド３は、未反応ＤＮＡ Ｘ２（５’末端に結合したＣＹ３を有し、３’末端に結合した３アジドＮを有した配列番号２５）に対応する。ＣＹ３標識を含有するＤＮＡのみが非ＳＹＢＲ染色ゲル上に視認された。

【図10】ＤＮＡヘリカーゼ（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有し、次に（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４））を用いて、ＭｓｐＡナノ細孔を通して移行された、実施例３Ａにおいて生成されたＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の略画を示す図である。領域Ａは、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｂと表示される）が結合するＤＮＡリーダー（配列番号２２）に対応する。領域Ａは、４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｘとして示され、Ｃと表示される）に結合される。領域Ｄは、第二のＤＮＡ配列（配列番号２３）に対応する。領域Ｅは、５’−ヘキシニル−Ｇ領域を有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）に対応する。領域ＤおよびＥは、クリック化学によって結合される。反応したアジドおよびヘキシニル基は、ボックス（Ｆと表示される）で表される。領域Ｇは、領域ＤにハイブリダイズされるＤＮＡ（配列番号１８）である。ＤＮＡ（配列番号１８）には、６つのｉＳｐ１８スペーサー（Ｙとして示され、Ｈと表示される）、２つのチミン（Ｔとして示され、Ｉと表示される）および３’コレステロールＴＥＧ（Ｊと表示される）が結合される。

【図11】図１１は、ヘリカーゼ制御されたＤＮＡ移動の例示的な追跡を示し（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））、ここで、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、次に（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）は、実施例３Ａにおいて生成されたＤＮＡ／ＲＮＡ生成物の移動を制御した（図３に示される略画）。領域１は、ＲＮＡ（ＤＮＡ Ｘ１）上にライゲーションされていないＤＮＡリーダーに対応し、領域２は、４つのｉＳｐ１８スペーサー（スペーサーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ領域よりも大量の電流がナノ細孔を通じて流れるようにする）に結合した配列番号２２に対応し、領域３は、ＤＮＡ配列（配列番号２３）に対応し、領域４は、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ領域（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）に対応する。^＊で表示された電流のピークは、ＤＮＡおよびＲＮＡが接続したときに作られるクリック連結の移行に対応する。

【図12】真核生物のＲＮＡ鎖（点線で示される）をＤＮＡ鎖（実線で示される）に結合させる方法の略画を示す図である。真核生物のＲＮＡは、ＲＮＡ鎖の残り（すなわち、５’末端は逆転した塩基を含み、星形として示され、Ａと表示される）とは反対の方向に走る７−メチルグアノシンキャップを有する。真核生物ＲＮＡは、逆転したＤＮＡ塩基の領域（ｎのランダム配列として示され、Ｃと表示される）を含むＤＮＡ鎖（Ｂと表示される）にライゲーションされる。逆転した塩基の領域において、塩基はまた反対の方向に走る。これは、ＲＮＡおよびＤＮＡ上の逆転した塩基の２つの領域が一緒にライゲーションされ得ることを示す。

【図13】実施例４において生成されたＲＮＡ／ｃＤＮＡ構築物の略画を示す図である。領域Ｂは、配列番号３０に対応する。領域Ｃは、配列番号３０の最後の３つのアデニンに対応する。領域Ｄは、３Ｔと１０Ｔのヘアピンの両方において配列番号２９に対応する。領域Ｅは、４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｘとして示される）に対応する。領域Ｆは、３Ｔヘアピンにおける配列番号２７および１０Ｔヘアピンにおける配列番号２８に対応する。領域Ｇは、配列番号２７または２８の最後の３つのチミンに対応する。領域Ｈは、配列番号３０のＲＮＡ鎖の逆転写中に生成されたｃＤＮＡに対応する。

【図14】ヘアピンライゲーションおよび逆転写の前後の、実施例４からの種々の試料を示す１０％ＰＡＧＥ ＴＢＥ−尿素変性ゲル（１４０Ｖで６０分間作動）を示す図である。レーン１は、ＴｒｉＤｙｅラダーを示す。レーン２は、ライゲーションまたは逆転写の前の実施例４において使用されたＲＮＡ鎖（配列番号３０）を示す。レーン３は、ライゲーションまたは逆転写の前の１０Ｔヘアピン対照（その５’末端でリン酸基に結合し、その３’末端で４つのｉＳｐＣ３スペーサーに結合している配列番号２９であって、４つのｉＳｐＣ３スペーサーは反対側の末端で配列番号２８の５’末端と結合している、配列番号２９）を示す。レーン４は、プライマーを用いた逆転写後のＲＮＡ鎖（配列番号３０）を示す。レーン５は、３Ｔヘアピン（その５’末端でリン酸基に結合し、その３’末端で４つのｉＳｐＣ３スペーサーに結合している配列番号２９であって、４つのｉＳｐＣ３スペーサーは反対側の末端で配列番号２７の５’末端と結合している、配列番号２９）へのライゲーション後のＲＮＡ鎖（配列番号３０）を示す。レーン６は、３Ｔヘアピン（その５’末端でリン酸基に結合し、その３’末端で４つのｉＳｐＣ３スペーサーに結合している配列番号２９であって、４つのｉＳｐＣ３スペーサーは反対側の末端で配列番号２７の５’末端と結合している、配列番号２９）へのライゲーション、続く逆転写後のＲＮＡ鎖（配列番号３０）を示す。レーン７は、１０Ｔヘアピン（その５’末端でリン酸基に結合し、その３’末端で４つのｉＳｐＣ３スペーサーに結合している配列番号２９であって、４つのｉＳｐＣ３スペーサーは反対側の末端で配列番号２８の５’末端と結合している、配列番号２９）へのライゲーション後のＲＮＡ鎖（配列番号３０）を示す。レーン８は、１０Ｔヘアピン（その５’末端でリン酸基に結合し、その３’末端で４つのｉＳｐＣ３スペーサーに結合している配列番号２９であって、４つのｉＳｐＣ３スペーサーは反対側の末端で配列番号２８の５’末端と結合している、配列番号２９）へのライゲーション、続く逆転写後のＲＮＡ鎖（配列番号３０）を示す。レーン９は、ＲＮＡ鎖および１０Ｔヘアピンをリガーゼの不存在下で一緒にインキュベートした対照実験を示す。矢印Ａは、実施例４において使用されたＲＮＡ鎖（配列番号３０）に対応する。

【図15】ＤＮＡヘリカーゼ（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）を使用してＭｓｐＡナノ細孔を通して移行させた、実施例５において生成されたＤＮＡ／ＲＮＡ／ｃＤＮＡ鎖の略画を示す図である。領域Ａは、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｂと表示される）が結合するＤＮＡリーダー（配列番号２２）に対応する。領域Ａは、４つのｉＳｐ１８スペーサー（Ｘとして示され、Ｃと表示される）に結合される。領域Ｄは、第２のＤＮＡ配列（配列番号２３）に対応する。領域Ｅは、５’−ヘキシニル−Ｇ領域を有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）に対応する。領域ＤおよびＥは、クリック化学によって結合される。反応したアジドおよびヘキシニル基は、ボックス（Ｆと表示される）で表される。領域Ｇは、領域ＤにハイブリダイズされるＤＮＡ（配列番号１８）である。ＤＮＡ（配列番号１８）には、６つのｉＳｐ１８スペーサー（Ｙとして示され、Ｈと表示される）、２つのチミン（Ｔとして示され、Ｉと表示される）および３’コレステロールＴＥＧ（Ｊと表示される）が結合される。領域Ｋは、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）の最後の３つのアデニンに対応する。領域Ｌは、１０Ｔヘアピンの配列番号２９に対応する。領域Ｍは、４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｘとして示される）に対応する。領域Ｎは、１０Ｔヘアピンの配列番号２８に対応する。領域Ｏは、配列番号２８の最後の３つのチミンに対応する。領域Ｐは、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡであるＲＮＡ鎖ＲＮＡ Ｘ１の逆転写中に生成されたｃＤＮＡに対応する。

【図16】ヘリカーゼ制御されたＤＮＡ移動の例示的な追跡を示し（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））、ここで、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、次に（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）は、実施例５によって生成されたＤＮＡ／ＲＮＡ生成物の移動を制御した（図１５に示される略画）。領域１はＤＮＡリーダー（ＤＮＡ Ｘ１）に対応し、領域２は、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ領域（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）に対応し、領域３は、４つのｉＳｐＣ３スペーサーに対応し、領域４は、１０ＴヘアピンのポリＴ領域に対応し、領域５は、ｍＲＮＡの逆転写によって生成されたｃＤＮＡに対応する。

【図17】５％ＰＡＧＥ ＴＢＥ−尿素変性ゲル（１４０Ｖで６０分間作動）を示し、デキャッピングおよびライゲーションの前後の、実施例５からの様々な試料を示す。レーン１は、ＴｒｉＤｙｅラダーを示す。レーン２は、キャッピングされたＲＮＡ鎖（５’から５’への三リン酸結合によって鎖の５’末端に連結された７−メチルグアノシンキャップを有する配列番号３０）を示す。レーン３は、非ＲＮＡポリヌクレオチド（配列番号３１の５’末端に結合した３０ＳｐＣ３スペーサーであって、配列番号３１はその３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合し、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号３２の５’末端と結合し、配列番号３２は３’末端で４つの５−ニトロインドールに結合し、４つの５−ニトロインドールは反対側の末端でＲＮＡ配列ＣＡＡＧＧＧと結合している、３０ＳｐＣ３スペーサー）を示す。レーン４は、非ＲＮＡポリヌクレオチド（配列番号３１の５’末端に結合した３０ＳｐＣ３スペーサーであって、配列番号３１はその３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合し、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号３２の５’末端と結合し、配列番号３２は３’末端で４つの５−ニトロインドールに結合し、４つの５−ニトロインドールは反対側の末端でＲＮＡ配列ＣＡＡＧＧＧと結合している、３０ＳｐＣ３スペーサー）へのライゲーション後のＲＮＡ鎖（配列番号３０）を示す。矢印Ａは、ＲＮＡ鎖（配列番号３０）に対応する。矢印Ｂは、非ＲＮＡポリヌクレオチドに対応する。矢印Ｃは、ＲＮＡ鎖が非ＲＮＡポリヌクレオチドにライゲーションされたライゲーション生成物に対応する。

【図18】修飾された塩基を有するおよび有しないＲＮＡからのコンセンサス電流レベルを示す図である。この図は、修飾された塩基がいくつかの連続した電流レベルに影響を及ぼすことを示す。

【図19】ＤＮＡヘリカーゼにより制御されてＲＮＡ−ＤＮＡ ２Ｄ鎖（ＲＮＡセンスおよびＤＮＡアンチセンス）がナノ細孔を通り移行することを示す図である。図１９は、ＲＮＡ対ＤＮＡについて観察された異なる平均振幅および範囲を示す。

【図20】ヘリカーゼ制御されたＤＮＡ移動の例示的な追跡を示し（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））、ここで、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ（突然変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号８）は、実施例８によって生成されたＤＮＡ／ＲＮＡ生成物の移動を制御した。

【図21】リセニン変異体を通る、ヘリカーゼ制御されたＤＮＡ移動の例示的な追跡を示し（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））、ここで、ＤＮＡヘリカーゼ（およびＴ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（０．３６μｌ、３．８μＭ）、突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、次に（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）は、実施例３によって生成されたＤＮＡ／ＲＮＡ生成物の移動を制御した。

【図22】ＣｓｇＧ変異体細孔（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）９（ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４５であり、Ｃ末端で結合される、突然変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有する配列番号４４）を通るヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示し（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））、ここで、ＤＮＡリガーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ（突然変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号８）は、実施例５によって生成されたＤＮＡ／ＲＮＡ生成物の移動を制御した。

【発明を実施するための形態】

【0025】

配列表の説明
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１変異体ＭｓｐＡモノマーをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド配列を示す。この変異体はシグナル配列を欠損し、以下の変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。

【0026】

配列番号２は、ＭｓｐＡモノマーのＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この変異体はシグナル配列を欠損し、以下の変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。

【0027】

配列番号３は、α−溶血素−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α-HL-NN; Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707）の１つのモノマーをコードするポリヌクレオチド配列を示す。

【0028】

配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つのモノマーのアミノ酸配列を示す。

【0029】

配列番号５〜７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。

【0030】

配列番号８は、Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。

【0031】

配列番号９は、Ｈｅｌ３０８ Ｃｓｙのアミノ酸配列を示す。

【0032】

配列番号１０は、Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａのアミノ酸配列を示す。

【0033】

配列番号１１は、Ｈｅｌ３０８ Ｍｈｕのアミノ酸配列を示す。

【0034】

配列番号１２は、ＴｒａＩ Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。

【0035】

配列番号１３は、ＸＰＤ Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。

【0036】

配列番号１４は、Ｄｄａ １９９３のアミノ酸配列を示す。

【0037】

配列番号１５は、Ｔｒｗｃ Ｃｂａのアミノ酸配列を示す。

【0038】

配列番号１６は、実施例１において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0039】

配列番号１７は、実施例１において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0040】

配列番号１８は、実施例１および３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0041】

配列番号１９は、実施例２において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、５’リン酸基を有する。

【0042】

配列番号２０は、実施例２において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0043】

配列番号２１は、実施例２において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、５’ＣＹ３基を有する。

【0044】

配列番号２２は、実施例３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0045】

配列番号２３は、実施例３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、３’アジドＮ基を有する。

【0046】

配列番号２４は、実施例３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0047】

配列番号２５は、実施例３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、３’アジドＮ基および５’ＣＹ３基を有する。

【0048】

配列番号２６は、実施例３および５において使用されるポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームを示す。この配列は、配列中の最初のＧに結合した５’−ヘキシニル基を有する。

【0049】

配列番号２７は、実施例４および５において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0050】

配列番号２８は、実施例４において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0051】

配列番号２９は、実施例４および５において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0052】

配列番号３０は、実施例４および６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0053】

配列番号３１は、実施例６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0054】

配列番号３２は、実施例６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0055】

配列番号３３は、ホモポリマー読み取りを説明するために使用される配列を示す。

【0056】

配列番号３４は、ホモポリマー読み取りを説明するために使用される配列を示す。

【0057】

配列番号３５は、実施例８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0058】

配列番号３６は、実施例８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0059】

配列番号３７は、実施例８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0060】

配列番号３８は、実施例８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0061】

配列番号３９は、実施例８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0062】

配列番号４０は、実施例８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

【0063】

配列番号４１は、リセニンモノマーをコードするポリヌクレオチド配列を示す。

【0064】

配列番号４２は、リセニンモノマーのアミノ酸配列を示す。

【0065】

配列番号４３は、大腸菌（Escherchia coli）Ｓｔｒ．Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＣ４１００由来の野生型ＣｓｇＧモノマーをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド配列を示す。このモノマーは、シグナル配列を欠損している。

【0066】

配列番号４４は、大腸菌（Escherchia coli）Ｓｔｒ．Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＣ４１００由来の野生型ＣｓｇＧモノマーの成熟形態のアミノ酸配列を示す。このモノマーは、シグナル配列を欠損している。ＣｓｇＧについて使用される略称＝ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ。

【0067】

配列番号４５は、ステップＩＩ（Ｃ）のアミノ酸配列を示す。

【0068】

配列番号４６〜６４は、明細書に記載されているポリヌクレオチド配列である。

【0069】

配列番号６５および６６は、実施例において使用されるポリヌクレオチド配列である。

【0070】

発明の詳細な説明
開示された生成物および方法の様々な用途は、当該技術分野における特定のニーズに合わせて調整され得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。

【0071】

さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの（ａ）ポリヌクレオチド」とは２つ以上のポリヌクレオチドを含むことを意味し、「１つの（ａ）ポリヌクレオチド結合タンパク質」とは２つ以上のこのようなタンパク質を含むことを意味し、「１つの（ａ）ヘリカーゼ」とは２つの以上のヘリカーゼを含むことを意味し、「１つの（ａ）モノマー」とは２つ以上のモノマーを意味し、「１つの（ａ）細孔」とは２つ以上の細孔を含むことを意味するなどである。

【0072】

本明細書に引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、上記または下記のいずれであっても、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0073】

標的ＲＮＡポリヌクレオチドの特徴付け
本発明の方法は、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けることを伴う。ＲＮＡポリヌクレオチドは膜貫通細孔に送達され、細孔はＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるために使用される。本発明は、標的リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドが、ＤＮＡヘリカーゼ酵素の制御下で膜貫通細孔に対して移動する間に、１つ以上の測定値を得ることによって、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付ける方法を提供する。

【0074】

膜貫通細孔は標的ポリヌクレオチドの単一分子を検出することができるため、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを増幅する必要はない。この方法は、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含まない。これは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるために必要なワークフローの量を顕著に減少させる。また、ＰＣＲによって導入されるいずれものバイアスおよびアーチファクトを回避する。

【0075】

本発明の方法は、ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を決定または測定することに関する場合がある。この方法は、ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ以上またはそれらを超える特徴を決定または測定することを伴う場合がある。１つ以上の特徴は、好ましくは、（ｉ）ＲＮＡポリヌクレオチドの長さまたはサイズ、（ｉｉ）ＲＮＡポリヌクレオチドの素性、（ｉｉｉ）ＲＮＡポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ＲＮＡポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ＲＮＡポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。（ｉ）〜（ｖ）の任意の組み合わせは、本発明にしたがって測定され得、例えば、｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ｝、｛ｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉ、ｖ｝、｛ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉｖ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝または｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝が挙げられる。（ｉ）〜（ｖ）の様々な組み合わせが測定され得、上記で列挙された組み合わせのいずれも含む。本発明の方法は、好ましくは、ＲＮＡポリヌクレオチドの配列を推定し、または配列決定することを含む。

【0076】

（ｉ）に関して、ＲＮＡポリヌクレオチドの長さは、例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドと細孔の間の相互作用の数、またはＲＮＡポリヌクレオチドと細孔の間の相互作用の持続時間を決定することによって測定されてもよい。

【0077】

（ｉｉ）に関して、ＲＮＡポリヌクレオチドの素性は、多数の方法で測定することができる。ＲＮＡポリヌクレオチドの素性は、ＲＮＡポリヌクレオチドの配列の測定と組み合わせて、またはＲＮＡポリヌクレオチドの配列を測定することなしに測定することができる。前者は容易である；ＲＮＡポリヌクレオチドを配列決定し、それにより同定する。後者は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド中の特定のモチーフの存在は、（ＲＮＡポリヌクレオチドの残りの配列を測定することなしに）測定することができる。あるいは、この方法における特定の電気的シグナルおよび／または光学的シグナルの測定は、ＲＮＡポリヌクレオチドを特定の供給源に由来するもののとして同定することができる。

【0078】

（ｉｉｉ）に関して、ＲＮＡポリヌクレオチドの配列は、先に記載したように決定することができる。適切な配列決定方法、特に電気的測定を用いる配列決定方法は、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72および国際出願第２０００／２８３１２号パンフレットに記載されている。

【0079】

（ｉｖ）に関して、二次構造を様々な方法で測定することができる。例えば、この方法は電気的測定を伴う場合、滞留時間の変化または細孔を通じて流れる電流の変化を用いて二次構造を測定することができる。これにより、一本鎖および二本鎖のＲＮＡポリヌクレオチドの領域を区別することが可能になる。

【0080】

（ｖ）に関して、いずれかの修飾の有無を測定することができる。この方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つ以上のタンパク質または１つ以上の標識、タグまたはスペーサーを用いて修飾されるかどうかを決定することを含む。特定の修飾は、以下に記載される方法を用いて測定することができる細孔との特異的な相互作用をもたらす。例えば、メチルシトシンは、各々のリボヌクレオチドとの相互作用中に細孔を通じて流れる電流に基づいてシトシンと区別することができる。本発明の方法は、単一の試料でさえ、ＲＮＡとＤＮＡを区別するために用いることができる：ＲＮＡおよびＤＮＡは、ＲＮＡおよびＤＮＡ配列が同一である場合でさえも平均振幅および範囲の関数として互いに区別することができる。

【0081】

本方法は、細孔が膜内に存在する膜／細孔系の調査に適している任意の装置を使用して行ってもよい。本方法は、膜貫通細孔検知に適している任意の装置を使用して行ってもよい。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバー、およびチャンバーを２つのセクションに分ける遮断壁を備えている。遮断壁は、典型的には、細孔を含有する膜を形成する開口部を有する。あるいは、遮断壁は、細孔が存在する膜を形成する。

【0082】

本方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（国際公開第２００８／１０２１２０号パンフレット）に記載されている装置を使用して行ってもよい。

【0083】

本方法は、ＲＮＡポリヌクレオチドが細孔に対して移動するとき、細孔を通過する電流を測定するステップを伴うことができる。したがって、装置はまた、電位を印加することができ、膜および細孔を横切る電気シグナルを測定することができる電気回路も含んでもよい。本方法をパッチクランプまたは電圧クランプを用いて行ってもよい。本方法は、好ましくは、電圧クランプの使用を伴う。

【0084】

本発明の方法は、ＲＮＡポリヌクレオチドが細孔に対して移動するとき、細孔を通過する電流を測定するステップを伴うことができる。ポリヌクレオチドが細孔に対して移動するときに細孔を通過する電流は、標的ＲＮＡポリヌクレオチドの配列を決定するために使用される。これは鎖配列決定である。膜貫通タンパク質細孔を通るイオン電流の測定に適した条件は、当該技術分野において公知であり、実施例において開示される。本方法は、典型的には、電圧を膜および細孔を横切って印加して行われる。使用される電圧は、典型的には、＋５Ｖ〜−５Ｖ、例えば、＋４Ｖ〜−４Ｖ、＋３Ｖ〜−３Ｖ、または＋２Ｖ〜−２Ｖである。使用される電圧は、典型的には、−６００ｍＶ〜＋６００ｍＶまたは−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限と＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲である。使用される電圧は、より好ましくは、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、最も好ましくは１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲である。増加した印加電位を使用することによって、細孔による異なるヌクレオチド間の区別を増すことが可能である。

【0085】

本方法は、典型的には、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン化物塩、例えば塩化物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの、任意の電荷担体の存在下で行われる。電荷担体としては、イオン性液体または有機塩、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウムまたは塩化１−エチル−３−メチルイミダゾリウムを挙げることができる。上記で検討した例示的な装置において、塩は、チャンバー内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムの混合物が、典型的には使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムの混合物が好ましい。電荷担体は、膜を横切って非対称であってもよい。例えば、電荷担体のタイプおよび／または濃度は、膜の各側で異なってもよい。

【0086】

塩濃度は、飽和時のものであり得る。塩濃度は、３Ｍ以下であり得るが、典型的には、０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ〜１Ｍである。本方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、または少なくとも３．０Ｍの塩濃度を用いて行われる。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、リボヌクレオチドの存在を示す電流を、正常電流変動のバックグラウンドに対して同定することを可能にする。

【0087】

本方法は、典型的には、緩衝液の存在下で行われる。上記で検討した例示的な装置において、緩衝液は、チャンバー内の水溶液中に存在する。任意の緩衝液を本発明の方法において使用することができる。典型的には、緩衝液はリン酸緩衝液である。他の適切な緩衝液は、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。本方法は、４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７、または７．０〜８．８、または７．５〜８．５のｐＨで行われる。使用されるｐＨは、好ましくは約７．５である。

【0088】

本方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０℃、１９℃〜７０℃、または２０℃〜６０℃で行われてもよい。本方法は、典型的には室温で行われる。本方法は、場合により、酵素機能を支援する温度、例えば、約３７℃で行われる。

【0089】

本方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体および／またはヘリカーゼもしくは構築物の作用を助長する酵素補因子の存在下で行われてもよい。本方法はまた、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体の不存在下で、および酵素補因子の不存在下で実施され得る。遊離ヌクレオチドは、上記で検討した個々のヌクレオチドのいずれか１つ以上であってもよい。遊離ヌクレオチドには、限定されないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が含まれる。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ヘリカーゼまたは構築物を機能させる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃａ^２＋またはＣｏ^２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ^２＋である。

【0090】

標的ＲＮＡ
ＲＮＡは、２つ以上のリボヌクレオチドを含む巨大分子である。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、真核生物または原核生物のＲＮＡであり得る。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、任意のリボヌクレオチドの任意の組み合わせを含んでもよい。リボヌクレオチドは、天然に存在していてもよくまたは人工的であってもよい。標的ＲＮＡポリヌクレオチド中の１つ以上のリボヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。標的ＲＮＡ中の１つ以上のリボヌクレオチドが損傷を受ける場合がある。例えば、標的ＲＮＡは、ウラシル二量体などのピリミジン二量体を含んでもよい。このような二量体は通常、紫外光による損傷に付随し、皮膚黒色腫の主要な原因である。標的ＲＮＡポリヌクレオチド中の１つ以上のリボヌクレオチドを、例えば標識またはタグにより修飾してもよい。適切な標識は、以下に記述する。標的は、１つ以上のスペーサーを含んでもよい。

【0091】

リボヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、リボース糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は、典型的には複素環式である。核酸塩基としては、限定されないが、プリンおよびピリミジン、より具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンが挙げられる。ヌクレオチドは、典型的には、モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートを含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’側または３’側に結合することができる。

【0092】

リボヌクレオチドとしては、限定されないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−メチルシチジン二リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、および５−ヒドロキシメチルシチジン三リン酸が挙げられる。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰおよびＵＭＰから選択される。

【0093】

リボヌクレオチドは無塩基であってもよい（すなわち、核酸塩基を欠損している）。リボヌクレオチドはまた、核酸塩基および糖を欠損していてもよい（すなわち、Ｃ３スペーサーである）。

【0094】

標的ＲＮＡポリヌクレオチド中のリボヌクレオチドは、任意の様式で互いに結合され得る。リボヌクレオチドは、典型的には、核酸におけるようにそれらの糖およびリン酸基によって結合される。リボヌクレオチドは、ピリミジン二量体の場合のようにそれらの核酸塩基を介して連結され得る。

【0095】

ＲＮＡは非常に多様な分子である。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、任意の天然に存在するまたは合成リボヌクレオチドであってもよく、例えば、例えば、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、トランスファーメッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、シグナル認識粒子（ＳＲＰ ＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ、低分子カザール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、スプライスされたリーダー（ＳＬ ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、ロング非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ＰｉＷｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、反復関連ｓｉＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、Ｙ ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは染色体ＲＮＡが挙げられ、これらの全ては、適切な場合には、一本鎖、二本鎖または三本鎖であり得る。

【0096】

標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。標的ｍＲＮＡは、代替スプライス改変体であり得る。ｍＲＮＡおよび／または代替ｍＲＮＡスプライス改変体の変化した量（またはレベル）は、疾患または状態に関連し得る。

【0097】

あるいは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）である。低濃度で検出することが困難な一群のＲＮＡは、マイクロリボ核酸（マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）である。ｍｉＲＮＡは、高度に安定したＲＮＡオリゴマーであり、転写後にタンパク質生成を制御することができる。それらは２つのメカニズムのうちの１つによって作用する。植物において、ｍｉＲＮＡは、主に、メッセンジャーＲＮＡの切断を指示することによって作用することが示されているが、動物において、ｍｉＲＮＡによる遺伝子制御は、典型的には、翻訳を妨げるメッセンジャーＲＮＡの３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションを伴う（Lee et al., Cell 75, 843-54 (1993); Wightman et al., Cell 75, 855-62 (1993)；およびEsquela-Kerscher et al., Cancer 6, 259-69 (2006)）。ｍｉＲＮＡは、多くの場合、不完全な相補性でそれらの標的に結合する。それらは、２００個程度またはそれを超える遺伝子標的にそれぞれ結合し、全ヒト遺伝子の３分の１を超えて制御すると予測されている（Lewis et al., Cell 120, 15-20 (2005)）。

【0098】

本発明における使用に適したｍｉＲＮＡは、当該技術分野において周知である。例えば、適切なｍｉＲＮＡは、公的に利用可能なデータベースに保存されている（Jiang Q., Wang Y., Hao Y., Juan L., Teng M., Zhang X., Li M., Wang G., Liu Y., (2009) miR2Disease: a manually curated database for microRNA deregulation in human disease. Nucleic Acids Res.）。特定のマイクロＲＮＡの発現レベルは、腫瘍において変化することが知られ、様々な腫瘍タイプに特徴的なマイクロＲＮＡ発現パターンを与える（Rosenfeld, N. et al., Nature Biotechnology 26, 462-9 (2008)）。さらに、ｍｉＲＮＡプロファイルは、メッセンジャーＲＮＡプロファイルよりも正確に腫瘍発生の段階を明らかにすることができることが示されている（Lu et al., Nature 435, 834-8 (2005) およびBarshack et al., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 42, 1355-62 (2010)）。これらの知見は、ｍｉＲＮＡの高い安定性、ならびに血清および血漿中の循環ｍｉＲＮＡを検出する能力（Wang et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 394, 184-8 (2010); Gilad et al., PloS One 3, e3148 (2008); およびKeller et al., Nature Methods 8, 841-3 (2011)）は、癌のバイオマーカーとしてのマイクロＲＮＡの潜在的使用にかなりの関心を集めている。治療が効果的であるためには、癌を正確に分類し、別に治療する必要があるが、多くの異なるタイプの癌が形態学的特徴を共有するという事実によって、分類の手段としての腫瘍形態評価の有効性は損なわれる。ｍｉＲＮＡは、潜在的に、より信頼性が高く、侵襲性の低いソリューションを提供する。

【0099】

疾患または状態を診断または予後診断するためのｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用については、以下でより詳細に検討する。

【0100】

任意の数のＲＮＡを調べることができる。例えば、本発明の方法は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、５０個、１００個またはそれらを超えるＲＮＡ分子の存在、非存在または１つ以上の特徴を決定することに関するものであり得る。

【0101】

ポリヌクレオチドは、天然に存在してもよくまたは人工的であってもよい。例えば、この方法は、２つ以上の製造されたオリゴヌクレオチドの配列を確認するために使用することができる。これらの方法は、典型的には、インビトロで行われる。

【0102】

標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、任意の長さであってもよい。例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドは、長さが少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、または少なくとも５００個のリボヌクレオチドであり得る。標的ＲＮＡは、長さが１０００個以上のリボヌクレオチド、５０００個以上のリボヌクレオチドまたは１０００００個以上のリボヌクレオチドであってもよい。標的ＲＮＡの全体または一部のみは、この方法を用いて特徴付けることができる。配列決定しようとしているＲＮＡの一部は、好ましくは、標的分子の全てを含むが、例えば、分子全体より少なくてもよく、例えば、４塩基から１ｋｂの間、例えば、４から１００塩基である。

【0103】

標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、典型的には、任意の適切な試料中に存在するまたはそれに由来する。本発明は、典型的には、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを含有することが知られているまたは含有することが疑われる試料において実施される。あるいは、本発明は、試料中に存在することが知られているまたは期待される１つ以上の標的ＲＮＡの同定を確認するために試料について実施することができる。

【0104】

試料は生物学的試料であってもよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたまたはそれから抽出された試料について、インビトロで実施することができる。生物または微生物は、典型的には、古細菌、原核生物または真核生物であり、典型的には、５つの界：植物界、動物界、菌界、モネラ界および原生生物界のうちの１つに属する。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、真核細胞に由来してもよく、または真核細胞の転写機構を用いてウイルスに由来してもよい。本発明は、任意のウイルスから得られたまたはそれから抽出された試料についてインビトロで実施することができる。

【0105】

試料は、好ましくは流体試料である。試料は、典型的には患者の体液を含む。試料は、尿、リンパ、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には、試料は、ヒト由来であるが、ウマ、ウシ、ヒツジもしくはブタなどの商業的に飼育された動物などの別の哺乳動物由来であってもよく、またはネコもしくはイヌなどのペットであってもよい。あるいは、植物起源の試料は、典型的には、穀物、マメ科植物、果物または野菜からなどの商業的作物、例えば、コムギ、オオムギ、オートムギ、キャノーラ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、豆、レンズ豆、サトウキビ、ココアまたは綿から得られる。

【0106】

試料は、非生物学的試料であってもよい。非生物学的試料は、好ましくは流体試料である。非生物学的試料の例には、手術用液体、飲料水、海水または河川水などの水、および実験室試験用の試薬が含まれる。

【0107】

試料は、典型的には、例えば、遠心分離によって、または望ましくない分子もしくは赤血球など細胞を濾過する膜を通過させることによって、アッセイされる前に処理される。試料は、採取直後に測定することができる。試料はまた、典型的には、アッセイ前に、好ましくは−７０℃以下で保存することができる。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、典型的には、本発明の方法において使用される前に試料から抽出される。ＲＮＡ抽出キットは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から市販されている。

【0108】

標的ＲＮＡの修飾
ＲＮＡポリヌクレオチドへの修飾は、ＤＮＡヘリカーゼの結合を促進するおよび／または修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドへのＤＮＡヘリカーゼの結合を増加させる効果を引き起こすもしくはその効果を有する任意の修飾であり得る。本明細書で使用される用語「結合」とは、ＤＮＡヘリカーゼおよび基質ポリヌクレオチドが任意の所与の時間に結合される親和性または確率を意味する。生化学的には、この親和性の増加は、「オンレート（ｏｎ ｒａｔｅ）」もしくは結合速度の増加、または「オフレート（ｏｆｆ ｒａｔｅ）」もしくは解離の減少、または「オンレート」の増加と「オフレート」の減少の両方によって引き起こされ得る。

【0109】

ＲＮＡポリヌクレオチドの修飾は、修飾されたＲＮＡに対するＤＮＡヘリカーゼの親和性を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％増加させ得る。最も好ましくは、ＲＮＡポリヌクレオチドの修飾は、ＤＮＡヘリカーゼの親和性を９５％以上増加させる。修飾されたＲＮＡの促進されたＤＮＡヘリカーゼ結合は、ＤＮＡヘリカーゼが、修飾されていないまたは非修飾のＲＮＡポリヌクレオチドと比較して、修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドにより容易に結合する状況として定義される。修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドへのＤＮＡヘリカーゼ結合の増加は、修飾されていないまたは非修飾のＲＮＡポリヌクレオチド、すなわち、本発明の修飾方法に従って修飾されていないＲＮＡ、について観察されるＤＮＡヘリカーゼ結合の量またはレベルよりも大きいまたはそれより多いＤＮＡヘリカーゼ結合の量またはレベルとして定義される。標的ＲＮＡポリヌクレオチドへのＤＮＡヘリカーゼ結合のレベルは、知られている日常的な方法および当業者に日常的な方法を用いて容易に試験することができる。

【0110】

標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド領域または配列または構築物を含むように修飾される。非ＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドはＲＮＡではない。したがって、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドを含んでもよいが、非ＲＮＡヌクレオチドまたは配列、すなわちＲＮＡではないヌクレオチドまたは配列も含んでいなければならない。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡポリヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドを含んでもよくまたは含まなくてもよい）への標的ＲＮＡの付加または結合によって修飾されて、本発明の構築物を形成する。ＲＮＡポリヌクレオチドへの非ＲＮＡポリヌクレオチドの付加または結合とは、ＤＮＡヘリカーゼと修飾されたＲＮＡ構築物の間の相互作用が、すなわち、結合された非ＲＮＡポリヌクレオチドなしに、ＤＮＡヘリカーゼと修飾されていない形態のＲＮＡポリヌクレオチドの間で生じる相互作用と比較して増加することを意味する。さらにまたはあるいは、ＲＮＡポリヌクレオチドへの非ＲＮＡポリヌクレオチドの付加または結合は、修飾されたＲＮＡ構築物に対するＤＮＡヘリカーゼの特異性が、すなわち、結合した非修飾ＲＮＡポリヌクレオチドになしに、非修飾形態のＲＮＡポリヌクレオチドに対するＤＮＡヘリカーゼの特異性と比較して増加することを意味する。さらにまたはあるいは、ＲＮＡポリヌクレオチドへの非ＲＮＡポリヌクレオチドの付加または結合は、修飾されたＲＮＡ構築物へのＤＮＡヘリカーゼ結合は促進され、および／または修飾されたＲＮＡ構築物へのＤＮＡヘリカーゼは、すなわち、結合した非修飾ＲＮＡポリヌクレオチドになしに、ＤＮＡヘリカーゼと非修飾形態のＲＮＡポリヌクレオチドの間で生じる結合と比較して増加することを意味する。さらにまたはあるいは、ＲＮＡポリヌクレオチドへの非ＲＮＡポリヌクレオチドの付加または結合は、ＤＮＡヘリカーゼが修飾されたＲＮＡ構築物により効率的またはより強く結合し、すなわち、結合した非修飾ＲＮＡポリヌクレオチドになしに、ＤＮＡヘリカーゼと非修飾形態のＲＮＡポリヌクレオチドの間で生じる結合と比較して、修飾された構築物から解離する可能性がより低いことを意味する。好ましくは、ＲＮＡポリヌクレオチドの修飾は、ＲＮＡポリヌクレオチドからＤＮＡヘリカーゼの解離を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％減少させる。最も好ましくは、ＲＮＡポリヌクレオチドの修飾は、ＲＮＡポリヌクレオチドからのＤＮＡヘリカーゼの解離を９５％減少させる。

【0111】

非ＲＮＡポリヌクレオチド
標的ＲＮＡポリヌクレオチド配列は、非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むように修飾される。標的ＲＮＡは、非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合される。標的ＲＮＡは、好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドに共有結合する。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドではない、すなわちＲＮＡ由来ではない少なくとも１つのヌクレオチドを含まなければならない。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはＲＮＡをさらに含んでもよいが、少なくとも１つの非ＲＮＡヌクレオチド、すなわちＲＮＡではないヌクレオチドも含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）または含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）必要がある。典型的には、ＲＮＡを含む非ＲＮＡポリヌクレオチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個または１９個などの２０個未満のＲＮＡヌクレオチドを含む。したがって、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ、およびＤＮＡまたはＤＮＡ類似体などの別のポリヌクレオチドを含む「ハイブリッド」ポリヌクレオチドであってもよい。非ＲＮＡはまた、ＤＮＡスペーサーなどを含み得る。当業者は、本発明の修飾されたＲＮＡ構築物を作製するために適切であると記載された結合方法のいずれも、非ＲＮＡポリヌクレオチドの作製に等しく適切であり、ここで、２つ以上のタイプの核酸配列を組み合わせることができることを認識する。

【0112】

好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはリーダー配列を含む。リーダー配列は優先的に細孔内に入り込む。

【0113】

好ましくは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡリーダー配列のＲＮＡへの結合によって修飾される。リーダー配列は、本発明の特徴付け方法を促進する。リーダー配列は、優先的に細孔に入り込むように設計され、それにより、細孔を通るポリヌクレオチドの移動を促進する。リーダー配列はまた、以下に検討するように、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを１つ以上のアンカーに連結するために使用され得る。リーダー配列は、標的ＲＮＡポリヌクレオチドに連結されてもよい。

【0114】

リーダー配列は、典型的にはポリマー領域を含む。ポリマー領域は、好ましくは負に帯電している。ポリマーは、好ましくは、ＤＮＡ、修飾ポリヌクレオチド（無塩基ＤＮＡなど）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリペプチドなどのポリヌクレオチドである。リーダー配列は、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチドを含む。

【0115】

一本鎖リーダー配列は、ＤＮＡの一本鎖、ｉＳｐＣ３、ポリｄＴ部分またはポリｄＣ部分を含んでもよい。リーダー配列は、好ましくは１つ以上のスペーサーを含む。リーダー配列は、好ましくは、以下に定義されるＹアダプターの一部である。

【0116】

リーダー配列は、任意の長さであってもよいが、典型的には、長さは１０〜２００ヌクレオチドである。本発明の一実施形態において、非ＲＮＡリーダー配列はｉＳｐＣ３を含む。最も好ましくは、非ＲＮＡリーダー配列は、長さが約４０ヌクレオチドであるｉＳｐＣ３またはＣおよびＡの反復配列（例えば、４×（９Ｃおよび１Ａ））である。リーダーの長さは、典型的には、この方法において使用される膜貫通細孔に依存する。

【0117】

好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＤＮＡヘリカーゼが結合することができる領域（ＤＮＡヘリカーゼ結合部位）またはＤＮＡアダプターを含む。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、膜貫通細孔を通る標的ＲＮＡの移動を制御するＤＮＡヘリカーゼのＤＮＡ結合部位を含むように修飾することができる。本明細書で使用されるとき、用語「ＤＮＡヘリカーゼ結合部位」は、１つ以上のＤＮＡヘリカーゼがそれに結合することを可能にするのに十分なサイズ／長さのＤＮＡまたはＤＮＡ類似体配列を含む。結合部位の長さは、それに結合するべきヘリカーゼの数に依存する。ＤＮＡヘリカーゼが結合することができる領域は、好ましくは、ＤＮＡ、修飾されたポリヌクレオチド（例えば、無塩基ＤＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリヌクレオチドである。好ましくは、ＤＮＡヘリカーゼ結合部位は、一本鎖のハイブリダイズされない領域である。領域は、リーダー配列に対応し得る。あるいは、領域は、リーダー配列と区別されてもよい。ＤＮＡヘリカーゼは、以下により詳細に検討するように、細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するのを助けることができる。

【0118】

好ましくは、１つ以上のヘリカーゼが移動される反対の末端で、ＤＮＡ結合部位に隣接してまたは近接して位置し得るブロッキング部位またはブロッキング分子を有する非ＲＮＡポリヌクレオチドがさらに提供される。ブロッキング分子は、ヘリカーゼの後方移動を防ぎ、それが構築物から滑り落ちるのを防ぐ。

【0119】

標的ＲＮＡ配列に結合するための非ＲＮＡポリヌクレオチド構築物は、好ましくは以下を含む：部分（ｉ）好ましくは細孔による標的ポリヌクレオチドの捕捉を提供する５つ以上の荷電単位のポリマー；および／または（ｉｉ）長さが約２０個のヌクレオチドのブロッキング鎖ハイブリダイゼーション部位；および／または（ｉｉｉ）１つ以上の非ＲＮＡヌクレオチド、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個もしくは５０個の非ＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡヘリカーゼ部位；および／または（ｉｖ）参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３５８３８号パンフレットに記載されているＳｐ１８などの１つ以上の単位、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれらを超える単位の失速（stalling）化学；および／または部分（ｖ）長さが約３０ヌクレオチドのテザーハイブリダイゼーション部位；および／または部分（ｖｉ）ＲＮＡポリヌクレオチドへの非ＲＮＡポリヌクレオチドのライゲーションを促進する配列。したがって、標的ＲＮＡ配列への結合のための非ＲＮＡポリヌクレオチドの全長は、約５０〜２００ヌクレオチドを含み得る。

【0120】

例えば、一実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、（ｉ）５つ以上の荷電単位のポリマー；（ｉｉ）長さが約２０ヌクレオチドのブロッキング鎖ハイブリダイゼーション部位；（ｉｉｉ）１つ以上の非ＲＮＡヌクレオチド、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個のヌクレオチドのＤＮＡヘリカーゼ結合部位；（ｉｖ）参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３５８３８号パンフレットに記載されているＳｐ１８などの１つ以上の単位、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれらを超える単位の失速化学；（ｖ）長さが約３０ヌクレオチドのテザーハイブリダイゼーション部位；および／または（ｖｉ）上記のセクションにおいて記載されるように、非ＲＮＡポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチドへのライゲーションを促進にする配列、のうちの少なくても１つを含み得る。

【0121】

（ｉ）〜（ｖｉ）の各々について、以下により詳細に検討される。

【0122】

部分（ｉ）
非ＲＮＡポリヌクレオチドの部分（ｉ）は、好ましくは、正味の負電荷を有するポリマーである。ポリマーは、リーダー配列に関して上記で検討されたもののいずれかであり得る。好ましくは、ポリマーは、核酸塩基を欠損しているまたはヌクレオシドを欠損している。ポリマーは、以下に検討するスペーサーのいずれかであり得る。これらの基準を満たす配列の代表例は、以下の通りである。
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１６）
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡ（配列番号４６）
６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６６
７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７７
８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８８
ここで、６＝１，２−デオキシヌクレオチド一リン酸
ここで、７＝ｎ−プロピレンリン酸（スペーサー３群）
ここで、８＝ＰＥＧ３リン酸（スペーサー９群）

【0123】

部分（ｉｉ）
非ＲＮＡポリヌクレオチドの部分（ｉｉ）は、ブロッキング鎖のハイブリダイゼーションを可能にする任意のポリヌクレオチド配列であり、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡもしくはモルホリノなどのＤＮＡもしくはＲＮＡまたは類似体を含み得る。これらの基準を満たす配列の代表例は、以下の通りである。
ＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＴＣ（配列番号４７）
ｒＡｒＣｒＵｒＣｒＧｒＣｒＡｒＧｒＡｒＵｒＣｒＡｒＵｒＵｒＡｒＣｒＧＡｒＵｒＣ（配列番号４８）
配列番号４７の配列を有するＰＮＡ
配列番号４７の配列を有するＢＮＡ
ＣＧＡＴＴＧＡＣＴＡＡＧＣＴＡＴＡＣＧＣ（配列番号４９）
ｒＣｒＧｒＡｒＵｒＵｒＧｒＡｒＣｒＵｒＡｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＣ（配列番号５０）
配列番号４９の配列を有するＰＮＡ
配列番号４９の配列を有するＢＮＡ

【0124】

部分（ｉｉｉ）
非ＲＮＡポリヌクレオチドの部分（ｉｉｉ）は、使用する特定のＤＮＡヘリカーゼの結合を可能にするのに十分な長さのものでなければならず、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡまたはモルホリノなどの類似体を含む非ＲＮＡヌクレオチドから構成されるべきである。本発明の好ましい実施形態において、部分（ｉｉｉ）はＤＮＡである。これらの基準を満たす配列の代表例は、以下の通りである。
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号５１）
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号５２）
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡ（配列番号３１）
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡ（配列番号５３）
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（ここで、Ｘは、独立してＡ、Ｔ、ＧまたはＣから選択される）

【0125】

部分（ｉｖ）
非ＲＮＡポリヌクレオチドの部分（ｉｖ）は、細孔の力を伴わずにＤＮＡヘリカーゼのＡＴＰ媒介移行を妨げるまたは遅延させるべきである。これらの基準を満たす配列の代表例は、以下の通りである。
ｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡ（配列番号５４）
ｒＵｒＣｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＡ（配列番号５５）
９９９９
ここで、９＝ＰＥＧ６リン酸（スペーサー９（ｉＳｐ９）群）

【0126】

部分（ｖ）
非ＲＮＡポリヌクレオチドの部分（ｖ）は、安定なハイブリッドを形成するのに十分に高いＴＭを有するテザリングオリゴのハイブリダイゼーションを可能にするべきである。これらの基準を満たす配列の代表例は、以下の通りである。
ＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡ（配列番号５６）
ＡＧＣＴＴＡＡＣＡＴＡＣＧＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＣＴＡＡＣＣＡ（配列番号５７）
ｒＡｒＡｒＣｒＵｒＡｒＣｒＵｒＡｒＧｒＧｒＡｒＵｒＣｒＡｒＵｒＣｒＧｒＡｒＵｒＧｒＵｒＡｒＵｒＣｒＵｒＧｒＣｒＵｒＣｒＡ（配列番号５８）
ｒＡｒＧｒＣｒＵｒＵｒＡｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＡｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＵｒＵｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＡｒＣｒＣｒＡ（配列番号５７）
配列番号５６の配列を有するＰＮＡ
配列番号５７の配列を有するＰＮＡ

【0127】

部分（ｖｉ）
非ＲＮＡポリヌクレオチドの部分（ｖｉ）は、非ＲＮＡポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチドへのライゲーションを促進する必要がある。これらの基準を満たす配列の代表例は、以下の通りである：
ＡＣＴＣＴＧＡＡＣＣ（配列番号６０）
ＡＣＴＣＴｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣ（配列番号６１）
ＧＣＡＣＡＡＴＧＡＴ（配列番号６２）
ＧＣＡＣＡｒＡｒＴｒＧｒＡｒＴ（配列番号６３）

【0128】

本発明に従って、（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを行うことができる：好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ｝、｛ｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｖ｝、｛ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝と組み合わせた（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。

【0129】

部分（ｉ）〜（ｖｉ）の各々について上記で与えられた異なる代表例のいずれかは、交換可能に使用され、標的ＲＮＡ配列への結合のための非ＲＮＡポリヌクレオチドを形成することができる。

【0130】

非ＲＮＡポリヌクレオチドのいつくかの異なる代表例は以下の通りである。

【0131】

構築物１：（４０×ＳｐＣ３）（ＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＴＣ）（１０×ｄＴ）（４×Ｓｐ１８）（ＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡ）（ＡＣＴＣＴＧＡＡＣＣ）
すなわち（４０×ＳｐＣ３）（配列番号４７）（配列番号５１）（４×Ｓｐ１８）（配列番号５６）（配列番号６０）

【0132】

構築物２：（４０×ＳｐＣ３）（ＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＴＣ）（２０×ｄＴ）（４×Ｓｐ１８）（ＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡ）（ＡＣＴＣＴＧＡＡＣＣ）
すなわち（４０×ＳｐＣ３）（配列番号４７）（配列番号５２）（４×Ｓｐ１８）（配列番号５６）（配列番号６０）

【0133】

構築物３：（４０×ｒＵ）（ＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＴＣ）（１０×ｄＴ）（４×Ｓｐ１８）（ＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡ）（ＡＣＴＣＴＧＡＡＣＣ）
すなわち（４０×ｒＵ）（配列番号４７）（配列番号５１）（４×Ｓｐ１８）（配列番号５６）（配列番号６０）

【0134】

構築物４：（４０×ＳｐＣ３）（ＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＴＣ）（１０×ｄＴ）（４×Ｓｐ１８）（ＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡ）（ＡＣＴＣＴｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣ）
すなわち（４０×ＳｐＣ３）（配列番号４７）（配列番号５１）（４×Ｓｐ１８）（配列番号５６）（配列番号６１）

【0135】

構築物５：（４０×ＳｐＣ３）（ＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＴＣ）（１０×ｄＴ）（ｒＡｒＡｒＡｒＣｒＵｒＡｒＣｒＧｒＣｒＵ）（ＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡ）（ＡＣＴＣＴＧＡＡＣＣ）
すなわち（４０×ＳｐＣ３）（配列番号４７）（配列番号５１）（配列番号６４）（配列番号５６）（配列番号６０）

【0136】

構築物６：（４０×ＳｐＣ３）（ＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＴＣ）（１０×ｄＴ）（４×Ｓｐ１８）（ＡＧＣＴＴＡＡＣＡＴＡＣＧＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＣＴＡＡＣＣＡ）（ＡＣＴＣＴＧＡＡＣＣ）
すなわち（４０×ＳｐＣ３）（配列番号４７）（配列番号５１）（４×Ｓｐ１８）（配列番号５７）（配列番号６０）

【0137】

構築物７：（４０×ＳｐＣ３）（配列番号４７の配列を有するＰＮＡ）（１０×ｄＴ）（４×Ｓｐ１８）（ＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡ）（ＡＣＴＣＴＧＡＡＣＣ）
すなわち（４０×ＳｐＣ３）（配列番号４７の配列を有するＰＮＡ）（配列番号５１）（４×Ｓｐ１８）（配列番号５６）（配列番号６０）

【0138】

結合
標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合し、および／または非ＲＮＡポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合して、修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドを形成する。非ＲＮＡポリヌクレオチドがリボヌクレオチドまたはＲＮＡ配列を含む場合、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡポリヌクレオチド内に含まれるリボヌクレオチドまたはＲＮＡ配列を介して標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。

【0139】

本方法は、ステップ（ａ）において、修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡヘリカーゼ酵素を用意するステップを含む。本方法は、ステップ（ａ）の前に、ＲＮＡポリヌクレオチドを非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させるステップ、および／または非ＲＮＡポリヌクレオチドをＲＮＡポリヌクレオチドに結合させて、修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドを形成するステップをさらに含み得る。

【0140】

標的ＲＮＡポリヌクレオチドおよび非ＲＮＡポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＤＮＡ類似体であり得る）は、当該技術分野において公知の任意の方法（単数または複数）を用いて、任意の様式で互いに結合させることができる。好ましくは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドおよび非ＲＮＡポリヌクレオチドは、以下に記載される１つ以上の様々な方法を用いて結合される。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、例えば共有結合によって、非ＲＮＡポリヌクレオチドに化学的に結合され得る。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、化学的または酵素的ライゲーションによって非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションおよび／または合成方法によって非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。ＲＮＡポリヌクレオチドは、トポイソメラーゼを用いて非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。ＲＮＡポリヌクレオチドは、１つより多い、例えば２つまたは３つの点で、非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。結合の方法は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを声得る超える様々な結合方法を伴うことができる。以下に記載される結合方法の任意の組合せが、本発明に従って使用され得る。

【0141】

ＲＮＡポリヌクレオチドおよび非ＲＮＡポリヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはＲＮＡを含んでもよくまたは含まなくてもよい）は、別々に生成され、次に一緒に結合され得る。２つの成分は、任意の配置において結合することができる。例えば、それらは、それらの末端（すなわち、５’または３’末端）を介して結合され得る。適切な配置には、限定されないが、ＲＮＡポリヌクレオチドの５’末端が非ＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端に結合されることを含み、その逆も含まれる。あるいは、２つの成分は、それらの配列内のヌクレオチドを介して結合され得る。

【0142】

ポリヌクレオチドは、それらの天然に存在するヌクレオチドを介して結合され得る。天然に存在するヌクレオチドは、結合を送信するために修飾されてもよい。例えば、天然に存在する核酸は、例えば、ｍＲＮＡキャップのためのトリメチルグアノシン合成酵素によって修飾され得る。他の適切な修飾は、当該技術分野において公知である。修飾は、置換によって導入することができる。ＲＮＡポリヌクレオチドは、リンカー分子を介して非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合することができる。ＲＮＡポリヌクレオチドは、１つ以上、例えば２つまたは３つのリンカーを用いて非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。リンカーは、必要とされる距離を横切って伸びる任意の分子を含むことができる。リンカーは、１つの炭素（ホスゲン型リンカー）から多数のオングストロームまでの長さが変化し得る。リンカーとしての使用に適した直鎖状分子の例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチド、多糖類、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和および不飽和炭化水素、ポリアミドである。これらのリンカーは、不活性であってもよくまたは反応性であってもよい。特に、それらは、規定された位置で化学的に切断可能であり得、またはフルオロフォアもしくはリガンドで修飾されてもよい。リンカーは、好ましくは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）に耐性である。好ましい可撓性ペプチドリンカーは、２〜２０個、例えば、４個、６個、８個、１０個または１６個のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可撓性リンカーは、（ＳＧ）_１、（ＳＧ）_２、（ＳＧ）_３、（ＳＧ）_４、（ＳＧ）_５、（ＳＧ）_８、（ＳＧ）_１０、（ＳＧ）_１５または（ＳＧ）_２０を含み、ここで、Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛性リンカーは、２〜３０個、例えば、４個、６個、８個、１６個または２４個のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい剛性リンカーは（Ｐ）_１２を含み、ここで、Ｐはプロリンである。

【0143】

ＲＮＡポリヌクレオチドは、１つ以上の化学的架橋剤または１つ以上のペプチドリンカーを用いて非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合され得る。適切な化学的架橋剤は、当該技術分野において周知である。適切な化学的架橋剤には、限定されないが、以下の官能基を含むものが挙げられる：マレイミド、活性エステル、スクシンイミド、アジド、アルキン（例えば、ジベンゾシクロオクチオール（ＤＩＢＯまたはＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロアルキンおよび直鎖状アルキン）、ホスフィン（例えば、痕跡なし（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）および非痕跡なしのシュタウディンガーライゲーション）、ハロアセチル（例えば、ヨードアセトアミド）、ホスゲン型試薬、塩化スルホニル試薬、イソチオシアネート、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ジスルフィド、ビニルスルホン、アジリジンおよび光反応性試薬（例えば、アリールアジド、ジアジリジン）。

【0144】

ＲＮＡポリヌクレオチドと非ＲＮＡポリヌクレオチドの間の反応は、システイン／マレイミドなどのように自発的であり得、またはアジドと直鎖状アルキンを連結するためのＣｕ（Ｉ）などのように外部試薬を必要とする場合がある。

【0145】

好ましい架橋剤には、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタノアート、ジマレイミドＰＥＧ １ｋ、ジマレイミドＰＥＧ ３．４ｋ、ジマレイミドＰＥＧ ５ｋ、ジマレイミドＰＥＧ １０ｋ、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４−ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ＢＭ［ＰＥＯ］２（１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール）、ＢＭ［ＰＥＯ］３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、ＤＴＭＥジチオビスマレイミドエタン、ビス−マレイミドＰＥＧ３、ビス−マレイミドＰＥＧ１１、ＤＢＣＯ−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ ２．８ｋＤａ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ ４．０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−１５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−２６原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−３５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチンおよびＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ１１−ビオチンが含まれる。最も好ましい架橋剤は、スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）−マレイミド（α、ω−ビス−マレイミド ポリ（エチレングリコール））である。

【0146】

リンカーは標識されてもよい。適切な標識には、限定されないが、蛍光分子（例えば、Ｃｙ３またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５）、放射性同位体、例えば、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、およびリガンド、例えばビオチンが含まれる。このような標識は、リンカーの量を定量化することを可能にする。標識はまた、ビオチンなどの切断可能な精製タグ、または識別方法で現れる特定の配列であってもよい。

【0147】

ＲＮＡポリヌクレオチドまたは非ＲＮＡポリヌクレオチドのそれらへの架橋は、膨大なＲＮＡポリヌクレオチドおよび／または非ＲＮＡポリヌクレオチド中にリンカーの濃度を維持することによって防止することができる。あるいは、２つのリンカーが使用される「ロックおよびキー」配置を使用することができる。各リンカーの一方の末端だけが一緒に反応して、より長いリンカーを形成し、リンカーの他方の末端は、各々、構築物の異なる部分（すなわち、ＲＮＡポリヌクレオチドまたは非ＲＮＡポリヌクレオチド）と反応する。

【0148】

ＲＮＡポリヌクレオチドの非ＲＮＡポリヌクレオチドへの結合は、永久的であってもよく、安定であってもよい（すなわち、ＲＮＡポリヌクレオチドは、本発明の方法において非ＲＮＡポリヌクレオチドから脱離されない）。好ましい永久または安定な結合は、共有結合である。

【0149】

あるいは、結合は一過性であり、すなわち、ＲＮＡポリヌクレオチドは非ＲＮＡポリヌクレオチドから脱離することができる。本明細書に記載される方法のいずれかは、非ＲＮＡポリヌクレオチドを標的ＲＮＡに結合させるために等しく適しており、また、上記されるように、２つ以上の種類の核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ、のハイブリッドであってもよい、非ＲＮＡポリヌクレオチド自体を構築するのにも等しく適していることは、当業者に理解される。

【0150】

クリック化学
標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡポリヌクレオチドに共有結合することができる。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、予め結合したＤＮＡヘリカーゼ酵素を含んでもよくまたは含まなくてもよい。好ましい実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドと非ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばＤＮＡリーダー配列の間の共有結合は、銅不含クリック化学または銅触媒クリック化学を用いて作製することができる。クリック化学は、多様な構成要素間の共有結合を形成するための望ましい特性と範囲のために、これらの用途に使用されている。例えば、それは速く、クリーンであって、有毒ではなく、無害な副産物だけを生成する。クリック化学は、Ｋｏｌｂら（２００１年）が最初に導入した用語であり、小規模利用と大規模利用の両方において確実に作用する、強力であり、選択的なモジュラー構成要素のセットを記述している（Kolb HC, Finn, MG, Sharpless KB, Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions, Angew. Chem. Int. Ed. 40 (2001) 2004-2021）。彼らは、以下のようにクリック化学の厳しい基準のセットを定義している：「反応は、モジュラーであって、範囲が広く、非常に高い収率が得られ、非クロマトグラフィー法で除去することができる無害な副産物だけを生成し、立体特異的でなければならない（しかし、必ずしもエナンチオ選択的である必要はない）。要求されるプロセス特徴には、単純な反応条件（理想的には、プロセスは酸素および水に対して無反応性でなければならない）、容易に入手可能な出発物質および試薬、溶媒の不使用、または良溶媒（水など）であり、または容易に除去される溶媒の使用、および簡単な生成物分離が挙げられる。必要であれば、精製は、結晶化または蒸留などの非クロマトグラフィー法によるものでなければならず、生成物は、生理学的条件下で安定でなければならない」。

【0151】

クリック化学の適切な例には、限定されないが、以下が含まれる：
（ａ）アジドが、例えばシクロオクタン環に、歪みを受けているアルキンと反応する、１，３双極性環化付加反応の銅不含改変体；
（ｂ）一方のリンカー上の酸素求核剤と他方のエポキシドまたはアジリジン反応性部分との反応；および
（ｃ）アルキン部分をアリールホスフィンで置換することができ、アジドとの特異的反応をもたらして、アミド結合を与えるシュタウディンガーライゲーション。

【0152】

好ましくは、クリック化学反応は、アルキンとアジドの間のＣｕ（Ｉ）触媒１，３双極性環化付加反応である。好ましい実施形態において、第一の基はアジド基であり、第二の基はアルキン基である。核酸塩基は、好ましい位置にアジド基およびアルキン基を組み込んで既に合成されている（例えば、Kocalka P, El-Sagheer AH, Brown T, Rapid and efficient DNA strand cross-linking by click chemistry, Chembiochem. 2008. 9(8):1280-5）。アルキン基は、Ｂｅｒｒｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）から市販されており、アジド基はＡＴＤＢｉｏまたはＩＤＴ ｂｉｏによって合成されている。

【0153】

リンカーの核酸酸領域内のヌクレオチドが共有結合を形成することができる基を含むように修飾されている場合、修飾されたヌクレオチドは、好ましくは、連結を達成するために１つのヌクレオチドにより互いにオフセットされる。これは、Ｔｏｍ Ｂｒｏｗｎ（Kocalka et al. (2008) ChemBiochem 9 8 1280-1285）の刊行物に続く。

【0154】

ＲＮＡ転写物が形成されると、クリック反応性塩基が標的ＲＮＡポリヌクレオチドに付加され得る。あるいは、クリック基は、（キャップされたｍＲＮＡについて）ハイパーメチラーゼ酵素によって標的ＲＮＡポリヌクレオチドに付加され得る。

【0155】

好ましくは、反応性基は、アジドおよびヘキシニル基、例えば、３アジドＮおよび５’−ヘキシニル−Ｇである。好ましくは、アジド基は、好ましくはＤＮＡである非ＲＮＡポリヌクレオチド（およびリボヌクレオチドもしくはＲＮＡ配列を含んでもよくまたは含まなくてもよい）に結合され、ヘキシニル基は標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合される。

【0156】

実施例３および５は、非ＲＮＡポリヌクレオチド（例えばＤＮＡを含む）を標的ＲＮＡポリヌクレオチドに接続するためのクリック反応の使用を示す。さらに、実施例５は、２次元（２Ｄ）ＲＮＡ−ｃＤＮＡ構築物を得るための架橋部分の使用を記載する。図１５に示される実施例５の構築物は、架橋部分を含まない実施例３の構築物（図１０に示される１Ｄ構築物）と比較することができる。

【0157】

ライゲーション
標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡポリヌクレオチド（このＲＮＡポリヌクレオチドはリボヌクレオチドまたはＲＮＡ配列を含んでもよくまたは含まなくてもよい）にライゲーションされ得る。ライゲーションは、最も一般的には、酵素の作用を介したまたは化学的手段による、２つの核酸断片の結合である。ＲＮＡおよびＤＮＡの断片の末端は、一方のＲＮＡまたはＤＮＡ末端の３’−ヒドロキシルと他方の５’−ホスホリルの間のホスホジエステル結合の形成によって一緒に接続される。補因子は、一般的には反応に関与し、これは、通常、ＡＴＰまたはＮＡＤ^＋である。ＲＮＡまたは非ＲＮＡポリヌクレオチドのスプリント、例えば、ＤＮＡ、ＰＮＡ、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）は、ライゲーション反応において使用され、スプリントとのハイブリダイゼーションによって互いに隣接してＲＮＡポリヌクレオチドおよび非ＲＮＡポリヌクレオチドを保持することによりライゲーションを促進することができる。ＲＮＡポリヌクレオチドに結合される非ＲＮＡポリヌクレオチドは、予め結合したＤＮＡヘリカーゼ酵素を含んでもよくまたは含まなくてもよい。

【0158】

非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドのいずれかの末端、すなわち５’または３’末端にライゲーションされ得る。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドの両端にライゲーションされ得る。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドの５’末端にライゲーションされる。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知である任意の方法を用いてＲＮＡポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。１つ以上の非ＲＮＡポリヌクレオチドは、リガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E.coli）ＤＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡリガーゼ、９^ｏＮ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリメラーゼＩ、Ｔ４ポリメラーゼ２、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、スプリントＲ、ｃｉｒｃリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いてライゲーションされ得る。１つ以上の非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＡＴＰの不存在下で、またはＡＴＰの代わりにγ−Ｓ−ＡＴＰ（ＡＴＰγＳ）を用いて、ＲＮＡポリヌクレオチド（またはその反対）にライゲーションされ得る。

【0159】

本方法は、好ましくは、方法条件からリガーゼを除くことをさらに含む。

【0160】

実施例２は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いたＲＮＡポリヌクレオチドのＤＮＡへのライゲーションを示す。

【0161】

合成法
オリゴヌクレオチドまたはプライマーを用いて、標的ＲＮＡポリヌクレオチドの任意の領域にハイブリダイズさせ、ＤＮＡ合成の出発点として作用させることができる。オリゴヌクレオチドまたはプライマーは、予め結合したＤＮＡヘリカーゼ酵素を含んでもよくまたは含まなくてもよい。

【0162】

真核生物のＲＮＡは、典型的には、ポリＡテール、すなわち、連続したアデノシン一リン酸のストレッチを含む。ポリＡテールは、典型的にはＲＮＡの３’末端にある。ポリＡポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼ酵素は、必要に応じて、原核生物のＲＮＡ鎖の３’末端にポリ（ｄＡ）テールを付加するために利用することができる。プライマーは、標的ＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズされ、合成のための出発点として使用され得る。プライマーは、好ましくは、ポリＴ領域、すなわち、チミンに基づくヌクレオチドのみを含有する含む領域、またはポリＵ領域、すなわち、ウラシルに基づくヌクレオチドのみを含有する領域を含む。ポリＵ領域は、ＵＭＰまたはｄＵＭＰを含有し得る。ポリＵ領域は、任意の長さ、例えば、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個またはそれらを超える長さであり得る。

【0163】

本発明の一実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリ（ｄＡ）領域でＲＮＡ鎖にハイブリダイズするリーダー配列を有するＤＮＡプライマーを含む。１つ以上のＤＮＡヘリカーゼ酵素は、ＲＮＡ鎖にハイブリダイズされるべきＤＮＡプライマーに予め結合されてもよい。あるいは、ＲＮＡにハイブリダイズされるべきＤＮＡプライマーは、予め結合したＤＮＡヘリカーゼ酵素を含有するまたは含まない。ＤＮＡプライマーからのＲＮＡ鎖の逆転写を生じさせることができ、次に、ＤＮＡヘアピンなどの架橋部分を二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡにライゲーションすることができる。このような架橋部分、例えばヘアピンループアダプターは、本発明の任意の二本鎖標的ＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡ）または修飾された構築物に付加することができる。架橋部分は、一本鎖への連結によって、鋳型鎖と相補鎖の両方の連続した配列決定を可能にする。好ましくは、リーダー配列を含有するアダプター（例えば、Ｙアダプター）がＲＮＡの一端に結合され、架橋部分アダプターが他端に結合される。リーダー配列は、ナノ細孔に優先的に入り込み、２つの鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡであってもよい）を連結する架橋部分は、ポリヌクレオチドが開くため、両鎖を特徴付けることができ、両鎖（架橋部分を介して連結される）を、細孔を通して移動させることができる。これは、二本鎖ポリヌクレオチドから得られる情報量を倍増させるため、有利である。さらに、２つの鎖の配列は相補的であるため、２つの鎖からの情報は、情報科学的に組み合わせることができる。このメカニズムは、信頼性の高い観測を提供するプルーフリーディング能力を提供する。

【0164】

あるいは、以下でより詳細に検討するように、架橋部分は、相補体の合成前に標的ＲＮＡポリヌクレオチドに付加され、相補体合成のためのプライマーとして使用することができる。

【0165】

本発明の一実施形態において、二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖（例えば、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ）の鎖は、架橋部分を用いて連結される。次に、本発明による標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるための方法は、好ましくは、（ｉ）ＲＮＡポリヌクレオチドが非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むように修飾された標的ＲＮＡポリヌクレオチドを含む連結構築物と、（ｉｉ）標的ＲＮＡが細孔を通り移動するように膜貫通細孔を有するＤＮＡヘリカーゼ酵素とを接触させることを含む。この方法は、好ましくは、標的ＲＮＡが細孔に対して移動する間に１つ以上の測定値を得るステップであって、測定値は、相補的ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはｃＤＮＡ）および標的ＲＮＡの１つ以上の特徴を示し、それにより標的二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付けるステップを含む。

【0166】

標的ｄｓＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の両鎖をこのように連結して調べることにより、特徴付けの効率および正確さが増加する。

【0167】

架橋部分は、標的ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の２つの鎖を連結することができる。架橋部分は、典型的には、標的ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の２つの鎖を共有結合する。架橋部分が膜貫通細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を妨害しないという条件で、架橋部分は、標的部分のｄｓＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の２つの鎖を連結することができるいずれのものであり得る。

【0168】

架橋部分は、当該技術分野において公知である任意の適切な手段によって標的ポリヌクレオチドに連結され得る。架橋部分は、別々に合成され、ＲＮＡ標的ポリヌクレオチドに化学的に結合されるまたは酵素的に連結され得る。あるいは、架橋部分は、標的ポリヌクレオチドのプロセシングにおいて生成され得る。

【0169】

架橋部分は、標的ポリヌクレオチドの一端またはその近くで標的ポリヌクレオチドに連結される。架橋部分は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドの末端の１０ヌクレオチド以内で標的ポリヌクレオチドに連結される

【0170】

適切な架橋部分としては、限定されないが、ポリマーリンカー、化学リンカー、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが挙げられる。好ましくは、架橋部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（無塩基ＤＮＡなど）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＰＥＧを含む。架橋部分は、より好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。

【0171】

架橋部分は、最も好ましくは、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターである。適切なヘアピンアダプターは、当該技術分野において公知である方法を用いて設計することができる。ヘアピンループは任意の長さであってよい。ヘアピンループは、典型的には、長さが１１０個以下のヌクレオチド、例えば、１００個以下のヌクレオチド、９０個以下のヌクレオチド、８０個以下のヌクレオチド、７０個以下のヌクレオチド、６０個以下のヌクレオチド、５０個以下のヌクレオチド、４０個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチド、２０個以下のヌクレオチド、または１０個以下のヌクレオチドである。ヘアピンループは、好ましくは、長さが約１〜１１０個、２〜１００個、５〜８０個または６〜５０個のヌクレオチドである。ループがアダプターの異なる選択安定性に関与する場合、より長い長さのヘアピンループ、例えば５０〜１１０個のヌクレオチドが好ましい。同様に、ループが選択可能な結合に関与しない場合、より短い長さのヘアピンループ、例えば１〜５個のヌクレオチドが好ましい。

【0172】

ヘアピンアダプターは、標的ポリヌクレオチドのいずれかの末端、すなわち５’末端または３’末端にライゲーションすることができる。ヘアピンアダプターは、当該技術分野において公知の任意の方法を用いてライゲーションされ得る。ヘアピンアダプターは、リガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E.coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡリガーゼおよび９^ｏＮ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションすることができる。

【0173】

相補的ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはｃＤＮＡ）および標的ＲＮＡは、連結された構築物が本発明に従って細孔と接触する後または前に分離されてもよい。それらは、細孔を通るポリヌクレオチド移動がポリヌクレオチド結合タンパク質、例えば、ヘリカーゼまたは分子ブレーキによって制御されるため、分離され得る。

【0174】

相補的ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはｃＤＮＡ）および標的ＲＮＡは、当該技術分野において公知である任意の方法を用いて分離され得る。例えば、それらは、ポリヌクレオチド結合タンパク質によって、または脱ハイブリダイゼーションを促進する条件（脱ハイブリダイゼーションを促進する条件の例には、限定されないが、高温、高ｐＨ、および水素結合または塩基対を破壊し得る薬剤、例えばホルムアミドおよび尿素の添加が含まれる）を用いて分離することができる。

【0175】

ヘアピンアダプターは、好ましくは選択可能な結合部分を含む。これにより、連結された構築物を精製または単離することが可能になる。選択可能な結合部分は、その結合特性に基づいて選択され得る部分である。したがって、選択可能な結合部分は、好ましくは、表面に特異的に結合する部分である。選択可能な結合部分は、本発明において使用される任意の他の部分よりもはるかに大きな程度で表面に結合する場合、表面に特異的に結合する。好ましい実施形態において、この部分は、本発明において使用される他の部分が結合していない表面に結合する。

【0176】

適切な選択的な結合部分は、当該技術分野において公知である。好ましい選択的な結合部分としては、限定されないが、ビオチン、ポリヌクレオチド配列、抗体、ＦａｂおよびＳｃＳｖなどの抗体断片、抗原、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヒスチジンテールおよびＧＳＴタグが挙げられる。最も好ましい選択的な結合部分は、ビオチンおよび選択可能なポリヌクレオチド配列である。ビオチンは、アビジンで被覆された表面に特異的に結合する。選択可能なポリヌクレオチド配列は、ホモログ配列で被覆された表面に特異的に結合する（すなわち、ハイブリッドする）。あるいは、選択可能なポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド結合タンパク質で被覆された表面に特異的に結合する。

【0177】

ヘアピンアダプターおよび／または選択可能な結合部分は、切断され、ニックを入れられ、開裂されまたは加水分解され得る領域を含み得る。このような領域は、相補的なポリヌクレオチドおよび／または標的ＲＮＡが、それが精製または単離後に結合される表面から除去されることを可能にするように設計することができる。適切な領域は、当該技術分野において公知である。適切な領域には、限定されないが、ＲＮＡ領域、デスチオビオチンおよびストレプトアビジンを含む領域、ジスルフィド結合および光開裂可能領域が含まれる。

【0178】

連結構築物は、好ましくは、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターなどの架橋部分と反対側の末端でリーダー配列を含む。

【0179】

本発明の一実施形態において、ヘアピン形成オリゴヌクレオチドなどの架橋部分は、標的ＲＮＡ鎖に結合される。架橋部分の結合前に、標的ＲＮＡ鎖は、非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むように修飾されていてもよい。例えば、標的ＲＮＡ鎖は、化学結合を用いて、例えば共有結合によって、クリック化学、化学的もしくは酵素的ライゲーションを用いて、ハイブリダイゼーションおよび／または合成法によって非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合されていてもよい。ＲＮＡポリヌクレオチドは、トポイソメラーゼを用いて非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合されていてもよい。あるいは、非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むようにＲＮＡ鎖を修飾する前に、架橋部分は、標的ＲＮＡ鎖に結合されてもよい。同様に、ヘアピン形成オリゴヌクレオチドなどの架橋部分は、本明細書に記載されている結合方法のいずれかによって標的ＲＮＡ鎖に結合され得る。好ましくは、架橋部分は、ライゲーションによって標的ＲＮＡ鎖に結合される。上述した任意の適切なリガーゼは、標的ＲＮＡ鎖に架橋部分をライゲーションさせるために使用されてもよく、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E.coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡリガーゼ、９^ｏＮ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリメラーゼＩ、Ｔ４ポリメラーゼ２、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、スプリントＲ、ｃｉｒｃリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２が挙げられる。

【0180】

好ましくは、架橋部分は、標的ＲＮＡ鎖の３’または５’末端に結合され、最も好ましくは、架橋部分は、標的ＲＮＡ鎖の３’末端に結合される。ヘアピン形成オリゴヌクレオチドなどの架橋部分からの逆転写は、ヘアピンによって接続されるＲＮＡ−ｃＤＮＡ構築物の形成をもたらす。この実施形態において、架橋部分は、逆転写のためのプライマーとして作用する：ヘアピン形成オリゴヌクレオチドなどの架橋部分はそれ自体、逆転写のためのプライマーとして使用されて、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ構築物を生成し、２Ｄ読み取りを可能にする。好ましくは、逆転写は、架橋部分の３’末端で開始される。架橋部分上のポリＴオーバーハングは、ＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズする。ＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、長さが５０〜３００ヌクレオチドである。好ましくは、架橋部分のポリＴオーバーハングは、１００個未満のヌクレオチドを含み、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、または９９個のヌクレオチドである。好ましくは、ポリＴオーバーハングは、架橋部分の３’末端上にある。本発明のこの実施形態において、架橋部分が標的ＲＮＡ（標的ＲＮＡが、非ＲＮＡポリヌクレオチド；好ましくはＤＮＡポリヌクレオチドを含むようにすでに修飾されているまたはこれから修飾される）に結合している場合、架橋部分は逆転写のためのプライマーとして機能する、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｃＤＮＡ構築物が作製される（実施例５および図１５を参照されたい）。この構築物は、標的ＲＮＡとその相補的ＤＮＡ配列（逆転写によって形成される）の両方が、架橋部分の存在のために膜貫通細孔によって配列決定され得る２Ｄ読み取りを可能にする。この方法は、単一の二本鎖標的ポリヌクレオチド構築物から得られる情報量を倍増するため有利である。さらに、相補的（ｃＤＮＡ）鎖の配列は、必然的に鋳型ＲＮＡ鎖の配列とオルソゴナルであるため、２つの鎖からの情報を情報科学的に組み合わせることができる。したがって、このメカニズムは、信頼性の高い観測を提供するオルソゴナルなプルーフリーディング能力を提供する。

【0181】

さらに、本発明の方法の他の主要な利点は以下の通りである：
１）読み逃したヌクレオチドの担保：この方法は、いずれかのヌクレオチドまたはヌクレオチド群が読み逃される問題（例えば、細孔をすり抜けるＲＮＡ鎖などの移動問題に起因する）を実質的に最小にする。これは、１つの鎖において欠落している可能性があるいずれもの状態が、その相補領域から得られるオルソゴナル情報によって担保される可能性があるためである。
２）問題のある配列モチーフの担保：配列モチーフに困難なものは、相補鎖中のオルソゴナルおよび反対の情報によって担保される。相補鎖は異なる配列を有するので、同じ配列依存性の問題を有しないからである。例えば、これは、電流のわずかな変化しか生じない、または同様の電流レベルを有する配列モチーフに関連し、すなわち、ナノ細孔を通り移動したときに同じ電流ブロックを生じさせる連続したベースモチーフに関連し、したがって、電流のステップ変化はないものとしては観測されない。１つの配列モチーフからの任意の同様の電流レベルは、相補鎖におけるそのオルソゴナル配列から得られる、全く異なる電流レベルによって担保される。

【0182】

上記で検討した利点に加えて、二本鎖ポリヌクレオチドの両鎖を読み取るという概念を利用して、更なる利点を提供することができる多数の特別な場合がある：
１．エピジェネティックな情報
エピジェネティックな情報（５−メチルシトシンまたは５−ヒドロキシメンチルシトシンヌクレオチドなど）または天然のＲＮＡ鎖内の損傷した塩基を同定できることは、広範囲の用途において望ましい。本発明の方法を使用すると、この情報は化学的処理または増幅なしで得られ、両方とも誤差を導入する可能性がある。ナノ細孔配列決定中に、ヌクレオチドがナノ細孔を通過する際に、電流レベルの変化が測定される。電流レベルは、単一のヌクレオチドというよりはむしろ、いくつかの塩基によって指示される。修飾されたヌクレオチドがナノ細孔を通過するとき、それはいくつかの連続したレベルに影響を及ぼす：これは、本発明者らはその検出において有する信頼性を増加させる（図１８を参照されたい）。

【0183】

ナノ細孔配列決定はまた、単一分子配列決定技術であり、したがって、増幅を必要としないで行うことができる。ナノ細孔は、標準的な４つのＲＮＡヌクレオチドに対する修飾を検出することができることが示されている。ポリヌクレオチドの両鎖を読み取ることは、修飾された塩基が別の塩基と同様に作用する（同様の電流シグナルを生成する）状況において、ＲＮＡ修飾の検出に有用であり得る。例えば、メチルシトシン（ｍＣ）がウラシルと同様に作用する場合、ｍＣをＵに割り当てることに関連した誤差がある。鋳型鎖においては、塩基がｍＣまたはＵと呼ばれる可能性がある。しかしながら、相補鎖において、対応する塩基は高い確率でＧとして現れ得る。したがって、相補鎖を「プルーフリーディング」することにより、鋳型鎖中の塩基は、ＵというよりはむしろｍＣであった可能性が高い。

【0184】

鋳型および相補鎖の読み取りは、増幅および複製を必要とせずに行うことができる。しかしながら、増幅または複製は、エピジェネティックな情報の検出を支援ために、試料調製の一部として加えられてもよい。

【0185】

標的ＲＮＡポリヌクレオチドを含む連結鎖は、配列決定が実施される前の任意の段階で、必要に応じて何度でも分離され、複製され得る。例えば、上述される第一のＲＮＡ／ｃＤＮＡポリヌクレオチド構築物の２つの連結鎖を分離した後、得られた一本鎖ポリヌクレオチドに対する相補鎖を生成して、別の二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる。次に、この二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖は、架橋部分を用いて連結されて、第二の構築物を形成することができる。これは、本明細書において「ＤＵＯ」法と呼ぶことができる。その後、この構築物を本発明において使用することができる。このような実施形態において、得られた構築物中の二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖は、架橋部分によって連結された元の標的二本鎖ポリヌクレオチド（第一の構築物中）の両鎖を含む。元の標的二本鎖ポリヌクレオチドまたは相補鎖の配列を推定または決定することができる。この複製プロセスは、必要に応じて何度でも繰り返すことができ、標的ポリヌクレオチドが効果的に複数回読み取られるため、追加のプルーフリーディングを提供する。

【0186】

ヌクレオチド鎖を構築することができ、ここで、以下の情報が、以下：鋳型ＲＮＡ（元の）、相補性ｃＤＮＡ（元の）、−架橋部分−、鋳型ＲＮＡ（相補体）、相補性ｃＤＮＡ（相補体）の順番で、細孔を通じて読み取られる。

【0187】

このスキームにおいて、メチル化された塩基に関する情報が４回得られる。エピジェネティックな塩基が元の鋳型鎖（この場合は、ｍＣ）にある場合、以下の情報：鋳型（元の）−ｍＣ、相補性（元の）−Ｇ、鋳型（相補体）−Ｃ、および相補性（相補体）−Ｇが高い確率で得られる。元の鋳型の読み取りおよび複製された鋳型の読み取りは異なる結果を与えるが、両方の相補性の読み取りは、同じ塩基判定（base call）が得られることは明らかである。この情報は、元の鋳型鎖中のエピジェネティックな塩基の位置を示すために使用することができる。

【0188】

２．ホモポリマー読み取り
ホモポリマー読み取りは、単一分子ナノ細孔配列決定に対して問題であり得る。ホモポリマー領域が細孔の読み取り部分より長い場合、ホモポリマー部分の長さを決定することは困難である。

【0189】

ホモポリマー読み取りの問題を克服するために、ｃＤＮＡ鎖は、元のｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰと組み合わせて、異なる／修飾塩基を付加して合成することができる。これは、イノシン（Ｉ）などの天然の塩基類似体であり得る。塩基は、正しい天然の塩基と比較して組み込む機会がランダムであり、挿入率は、三リン酸種の濃度を変えることによって制御することができる。

【0190】

代替塩基の付加を通じて、ホモポリマー領域の逆相補体に別の塩基が挿入される可能性がある。この結果は、ホモポリマーの走行が、ナノ細孔の読み取りセクションによって読み取られ得る点までの長さが減少されることである。例えば、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３３）のホモポリマー基は、代替塩基のランダムな挿入を有し、ＴＴＴＩＴＴＩＩＴＴＴＩ（配列番号３４）（ここで、Ｉはイノシンである）を与え得る。

【0191】

ホモポリマーストレッチは、個々のヌクレオチドまたはヌクレオチド群が推定または決定されることを可能にするために減少される。鋳型鎖は、天然のＲＮＡ鎖であり、相補性／ｃＤＮＡ鎖は、天然の塩基と塩基類似体の混合物を含有する。鋳型からのデータと相補的な読み取りの組み合わせを用いて、元のＲＮＡ部分におけるホモポリマー走行の長さを推定することができる。

【0192】

トポイソメラーゼ
トポイソメラーゼは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡのいずれかに結合し、ＤＮＡのリン酸骨格を切断する。この中間切断は、ＤＮＡを解きほぐしまたは巻き戻すことを可能にし、これらのプロセスの最後に、ＤＮＡ骨格を再び封鎖する。適切なトポイソメラーゼ結合戦略を図６および７に示す。

【0193】

他の方法
ＲＮＡ標的ポリヌクレオチドを非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させる別の方法は、反対配向に７メチルグアノシンキャップを付加することによって修飾される真核生物のＲＮＡの５’末端を利用することを含む。したがって、真核生物のＲＮＡの５’末端は、逆塩基を含有するまたは含み、すなわち、ＲＮＡ鎖の５’末端で、個々の塩基は５’末端とは反対に３’末端を有しない。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡポリヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはＲＮＡ配列を含んでもよくまたは含まなくてもよい）にライゲーションすることができ、これはまた、図１２に示されように逆方向に走るように逆塩基を有する領域を有する。ここで、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡである。あるいは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、一方の末端で逆塩基を有するＲＮＡ部分を有してもよい。逆ＲＮＡ塩基のこの部分は、ライゲーションによって真核生物のＲＮＡの５’末端の逆塩基に結合することができる。

【0194】

非ＲＮＡポリヌクレオチドは、予め結合したＤＮＡヘリカーゼ酵素を含んでもよくまたは含まなくてもよい。

【0195】

真核生物のＲＮＡ
真核生物において、核内で生成された一次ＲＮＡ転写物は、翻訳機構をプログラムするためにそれが使用される細胞質への輸送前に、いくつかの方法でプロセシングされる。第一に、三リン酸結合によって転写物の５’末端に連結された７−メチルグアノシン残基からなるキャップは、転写（キャッピング）中に付加される。キャッピングは、５’−５’三リン酸結合を伴う。キャップは翻訳機構によって認識され、ヌクレアーゼによる分解からＲＮＡ鎖の成長を保護する。次に、アデノシン残基のストレッチが３’末端で付加される（ポリアデニル化）。これらのポリＡテールは、１５０〜２００残基の長さである。これらの修飾後、ＲＮＡスプライシングは、介在配列（すなわち、イントロン）を除去する。

【0196】

本発明の一実施形態において、５’キャップを適所に残し、少なくとも１つの化学的反応基を標的ＲＮＡポリヌクレオチドの５’末端に付加する。ａ）化学反応がＲＮＡまたはＤＮＡ構造に損傷を与えず、およびｂ）生成される反応性連結が、ＤＮＡヘリカーゼ酵素がそれに沿って移動できないまたはそれを通過できないほどに大きくない、限りにおいて、化学的結合の任意の方法を本発明の方法に使用することができる。少なくとも１つの反応性基は、ハイパーメチラーゼ酵素を用いて標的ＲＮＡポリヌクレオチドに付加され得る。本発明の一実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基はクリック反応性基であるが、これは必須ではない。ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基は、代替的には、チオールなどの任意の適切な反応性基であってもよい。少なくとも１つの反応性基は、非ＲＮＡポリヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはＲＮＡ配列を含んでもよくまたは含まなくてもよい）の末端に結合される。好ましくは、少なくとも１つの反応性基は、非ＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端に結合される。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡ鎖である。非ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基は、ハイパーメチラーゼ酵素を用いて付加されてもよい。本発明の一実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基はクリック反応性基であるが、これは必須ではない。次に、ＲＮＡポリヌクレオチドおよび非ＲＮＡポリヌクレオチドのそれぞれにある１つ以上の反応性基は、適切な条件下で接触されて、共有結合を形成する。ＡＴＰγＳおよび酵素を用いて、チオホスフェートをＤＮＡに付加し、次に、マレイミドが結合したＲＮＡに結合させることができる。

【0197】

本発明の別の実施形態において、７−メチルグアノシンキャップを除去し、好ましくはタバコ酸ピロホスファターゼを用いてデキャッピングされたＲＮＡ鎖を形成する。次に、デキャッピングされた標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合されたＲＮＡポリヌクレオチドの鎖を生成するために、多数の異なる方法で処理することができる。一実施形態において、少なくとも１つの反応性基は、デキャッピングされたＲＮＡポリヌクレオチドの５’末端に付加することができる。少なくとも１つの反応性基は、ハイパーメチラーゼ酵素を用いてＲＮＡポリヌクレオチドに付加され得る。本発明の一実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基はクリック反応性基であるが、これは必須ではない。ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される反応性基は、代替的に、チオールなどの任意の適切な反応性基であってもよい。少なくとも１つの反応基はまた、非ＲＮＡポリヌクレオチドの末端に結合される。好ましくは、少なくとも１つの反応性基は、非ＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端に結合される。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡ鎖である。非ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基は、ハイパーメチラーゼ酵素を用いて付加され得る。本発明の一実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基はクリック反応性基であるが、これは必須ではない。次に、ＲＮＡポリヌクレオチドおよび非ＲＮＡポリヌクレオチドのそれぞれにおける１つ以上の反応性基は、適切な条件下で接触させて、共有結合を形成させる。

【0198】

あるいは、非ＲＮＡポリヌクレオチドの鎖は、リガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E.coli）ＤＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡリガーゼ、９^ｏＮ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリメラーゼＩ、Ｔ４ポリメラーゼ２、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、スプリントＲ、ｃｉｒｃリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いて、標的ＲＮＡポリヌクレオチドに直接ライゲーションされ得る。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡ鎖である。本発明の一実施形態において、１つ以上の酵素は、ＲＮＡにライゲーションされるべき非ＲＮＡポリヌクレオチドに予め結合させてもよい。非ＲＮＡポリヌクレオチド上に酵素を予め装填することは、試料調製プロセスをスピードアップさせ、使用されるチューブがより少なくなることを意味する。あるいは、ＲＮＡポリヌクレオチドにライゲーションされるべき非ＲＮＡポリヌクレオチドは、予め結合した酵素を含有せずおよび含まない。

【0199】

本発明の別の実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズする、リーダー配列を有するＤＮＡプライマーである。１つ以上の酵素は、ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされるべきＤＮＡプライマーに予め結合され得る。あるいは、ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされるべきＤＮＡプライマーは、予め結合した酵素を含有しないおよび含まない。ＤＮＡプライマーからのＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写は、使用される逆転写酵素に依存して、１〜３個のＣの３’オーバーハングをもたらす。次に、ＤＮＡヘアピンは二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡにライゲーションすることができる。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当該技術分野において周知である（例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995)）。ハイブリダイゼーションは、３７℃で低ストリンジェンシー条件下で、例えば、３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌおよび１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液の存在下で３７℃にて行われ、続いて１×（０．１６５０ＭのＮａ^＋）から２×（０．３３ＭのＮａ^＋）ＳＳＣ（標準のクエン酸ナトリウム）における５０℃での洗浄により行われ得る。ハイブリダイゼーションは、中程度のストリンジェンシー条件下で、例えば、４０〜４５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌおよび１％ＳＤＳの緩衝液の存在下で３７℃にて行われ、続いて０．５×（０．０８２５ＭのＮａ^＋）から１×（０．１６５０ＭのＮａ^＋）ＳＳＣにおける５５℃での洗浄により行われ得る。ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件下で、例えば、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液の存在下で３７℃にて行われ、続いて０．１×（０．０１６５ＭのＮａ^＋）ＳＳＣで６０℃での洗浄により行われ得る。特に、条件は、好ましくは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７中の１０μＭオリゴマーであり、９８℃に加熱し、その後、１８℃まで毎分２℃で冷却する。

【0200】

真核生物のＲＮＡは、典型的には、ポリＡテール、すなわち、連続したアデノシン一リン酸のストレッチを含む。ポリＡテールは、典型的には、ＲＮＡの３’末端にある。このような実施形態において、プライマーは、標的ＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズすることができる。プライマーは、好ましくはポリＵ領域、すなわち、ウラシルに基づくヌクレオチドのみを含有する領域を含む。ポリＵ領域は、ＵＭＰまたはｄＵＭＰを含有し得る。ポリＵ領域は、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個またはそれらを超えるなどの任意の長さであってもよい。あるいは、プライマーはポリＴ領域を含む。ポリＴ領域は、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個またはそれらを超えるなどの任意の長さであってもよい。真核生物のＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に結合させる方法を図１に示す。

【0201】

本発明の代替の態様において、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、トポイソメラーゼベースの戦略（参照により本明細書に組み込まれるCheng and Shuman, 2000, Nucleic Acids Research, Vol. 28, No. 9 1893-1898）を用いて標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させることができる。ＤＮＡトポイソメラーゼは、二重鎖ＤＮＡに結合し、特定の標的部位で一本鎖のホスホジエステル骨格を切断する。二重鎖ＤＮＡの他方の鎖は、対応する位置で配列中にニックまたは切断を含む。トポイソメラーゼがＤＮＡの上側の鎖に結合し、切断すると、それはｄｓＤＮＡに結合した状態となる。ｄｓＤＮＡに結合されるトポイソメラーゼは、次に、遊離５’ヒドロキシルを有するＲＮＡとインキュベートした場合に、５’ＯＨ末端化されたＲＮＡ鎖にＤＮＡ鎖を転移して、タンデムＤＮＡ−ＲＮＡコポリマーを形成することができる。標的ＲＮＡは遊離５’ヒドロキシルを有しなければならない：真核生物のＲＮＡは、遊離５’ヒドロキシルを有するＲＮＡを生成するために脱カップリングされる必要があるが、マイクロＲＮＡは遊離５’ヒドロキシル基を有する（図６を参照されたい）。

【0202】

代替のトポイソメラーゼベースの戦略において、ｄｓＤＮＡは、ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ結合を支援するために、ＤＮＡの一本鎖領域を用いてＲＮＡ鎖に結合する（参照により本明細書に組み込まれるSekiguchi et al., 1997, The Journal of Biological Chemistry, Vol 272, No. 25, 15721-15728）。トポイソメラーゼは、特定の標的配列でｄｓＤＮＡに結合する。ＤＮＡの下側の鎖にはニックがない。トポイソメラーゼが結合すると、それはＤＮＡの上側の鎖のみを切断し、ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡハイブリッドに結合した状態となる。次に、ｄｓＤＮＡに結合されるトポイソメラーゼは、遊離５’ヒドロキシルを有するＲＮＡとともにインキュベートされ、ＲＮＡをｄｓＤＮＡに接続させる。ｓｓＤＮＡ領域は、相補性ＲＮＡ配列をＤＮＡへの結合点に結合させるのを支援する（図７を参照されたい）。

【0203】

ＲＮＡポリヌクレオチドを非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させる別の方法は、逆配向に走る７−メチルグアノシンキャップの付加によって修飾された真核生物のＲＮＡの５’末端を利用することを含む。したがって、真核生物のＲＮＡの５’末端は、逆転されたグアニン塩基を含有するまたは含み、すなわち、それはＲＮＡ鎖の５’末端にあるが、個々の塩基は５’末端とは反対に３’末端を有しない。標的ＲＮＡは、それが反対方向に走るように逆塩基を有する領域も有するＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列にライゲーションすることができる（図１２を参照されたい）。

【0204】

原核生物ＲＮＡ
ポリＡポリメラーゼ酵素を利用して、ＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端にポリ（ｄＡ）テールを付加することができる。本発明の一実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするリーダー配列を有するＤＮＡプライマーである。リーダー配列を有するＤＮＡプライマーは、ポリ（ｄＡ）領域にハイブリダイズすることができる。１つ以上の酵素は、ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされるべきＤＮＡプライマーに予め結合されてもよい。あるいは、ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされるべきＤＮＡプライマーは、予め結合された酵素を含有しないおよび含まない。ＤＮＡプライマーからのＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写は、使用される逆転写酵素に依存して１〜３つＣの３’オーバーハングをもたらす（スーパースクリプトＩＩ（ＭＭＬＶ）については３〜４つ）（p1192 Biotechniques Vol 29 No 6 (200を参照されたい）。次に、ＤＮＡヘアピンは、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡにライゲーションすることができる。

【0205】

本発明の代替の実施形態において、ポリ（ｄＡ）領域はＲＮＡポリヌクレオチドに付加されず、原核生物のＲＮＡポリヌクレオチドは反応ステップにおいて直接使用される。反応性基は、ＲＮＡポリヌクレオチドの５’または３’末端に付加され得る。好ましくは、少なくとも１つの反応性基は、ＲＮＡポリヌクレオチドの５’末端に付加される。ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基はクリック反応性基であってもよいが、これは必須ではない。ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基は、代替的には、チオールなどの任意の適切な反応性基であってもよい。また、少なくとも１つの反応基は、非ＲＮＡポリヌクレオチドの末端に結合される。好ましくは、少なくとも１つの反応性基は、非ＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端に結合される。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡ鎖を含む。非ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基は、ハイパーメチラーゼ酵素を用いて付加され得る。本発明の一実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチドに付加される少なくとも１つの反応性基はクリック反応性基であるが、これは必須ではない。次に、ＲＮＡおよび非ＲＮＡポリヌクレオチドのそれぞれにおける１つ以上の反応性基を適切な条件下で接触させて、共有結合を形成させる。

【0206】

本発明の代替の実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチド鎖は、リガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E.coli）ＤＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡリガーゼ、９^ｏＮ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリメラーゼＩ、Ｔ４ポリメラーゼ２、熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、スプリントＲ、ｃｉｒｃリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いて、標的ＲＮＡポリヌクレオチドに直接ライゲーションされ得る。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡ鎖を含む。本発明の一実施形態において、１つ以上の酵素は、ＲＮＡポリヌクレオチドにライゲーションされるべき非ＲＮＡポリヌクレオチドに予め結合させてもよい。あるいは、ＲＮＡポリヌクレオチドにライゲーションされるべき非ＲＮＡポリヌクレオチドは、予め結合された酵素を含有しないおよび含まない。原核生物のＲＮＡポリヌクレオチドを非ＲＮＡ（例えば、ＤＮＡ）ポリヌクレオチドに結合させる方法を図２に示す。

【0207】

本発明の代替の態様において、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、トポイソメラーゼベースの戦略（参照により本明細書に組み込まれるCheng and Shuman, 2000, Nucleic Acids Research, Vol. 28, No. 9 1893-1898）を用いて標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させることができる。ＤＮＡトポイソメラーゼは、二重鎖ＤＮＡに結合し、特定の標的部位で一本鎖のホスホジエステル骨格を切断する。二重鎖ＤＮＡの他方の鎖は、対応する位置で配列中にニックまたは切断を含む。トポイソメラーゼがＤＮＡの上側の鎖に結合し、切断すると、それはｄｓＤＮＡに結合した状態となる。ｄｓＤＮＡに結合されるトポイソメラーゼは、次に、遊離５’ヒドロキシルを有するＲＮＡとインキュベートした場合に、５’ＯＨ末端化されたＲＮＡ鎖にＤＮＡ鎖を転移して、タンデムＤＮＡ−ＲＮＡコポリマーを形成することができる。標的ＲＮＡは遊離５’ヒドロキシルを有しなければならない。代替のトポイソメラーゼベースの戦略において、ｄｓＤＮＡは、ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ結合を支援するために、ＤＮＡの一本鎖領域を用いてＲＮＡ鎖に結合する（参照により本明細書に組み込まれるSekiguchi et al., 1997, The Journal of Biological Chemistry, Vol 272, No. 25, 15721-15728）。トポイソメラーゼは、特定の標的配列でｄｓＤＮＡに結合する。ＤＮＡの下側の鎖にはニックがない。トポイソメラーゼが結合すると、それはＤＮＡの上側の鎖のみを切断し、ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡハイブリッドに結合した状態となる。次に、ｄｓＤＮＡに結合されるトポイソメラーゼは、遊離５’ヒドロキシルを有するＲＮＡとともにインキュベートされ、ＲＮＡをｄｓＤＮＡに接続させる。ｓｓＤＮＡ領域は、相補性ＲＮＡ配列をＤＮＡへの結合点に結合させるのを支援する（図７を参照されたい）。

【0208】

増幅なし
標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、典型的には、本発明の方法において増幅されない。本方法は、典型的には、標的ＲＮＡの複数コピーを作製することを含まない。

【0209】

本方法は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含まない。

【0210】

上記で検討したように、本発明の一実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＤＮＡプライマーおよび逆転写酵素を用いて生成されたＤＮＡ相補体を含む。架橋部分を用いたＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の連結は、２Ｄ読み取りを可能にする。

【0211】

本発明の別の実施形態において、ヘアピン形成オリゴヌクレオチドはそれ自体で、逆転写のためのプライマーとして使用され、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ構築物を生成し、二次元読み取り（すなわち、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ鎖）を可能にする。

【0212】

ＤＮＡヘリカーゼ（単数または複数）および分子ブレーキ（単数または複数）
ＤＮＡヘリカーゼは、細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するために使用される。ＤＮＡヘリカーゼ酵素は、標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合し、細孔を通るその移動を制御することができる限り、酵素活性を示す必要はない。例えば、酵素は、その酵素活性を除去するために修飾されてもよく、または酵素として作用することを防止する条件下で使用されてもよい。

【0213】

ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、例えば、ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはＤｄａヘリカーゼあってもよく、またはそれ由来であってもよい。ＤＮＡヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕ（配列番号８）、Ｈｅｌ３０８ Ｃｓｙ（配列番号９）、Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａ（配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８ Ｍｈｕ（配列番号１１）、ＴｒａＩ Ｅｃｏ（配列番号１２）、ＸＰＤ Ｍｂｕ（配列番号１３）、Ｄｄａ １９９３（配列番号１４）またはその改変体由来であってもよい。

【0214】

ヘリカーゼは、国際出願番号第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（国際公開第２０１３／０５７４９５号パンフレットとして公開されている）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（同第２０１３／０９８５６２号パンフレットとして公開されている）；同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（同第２０１３／０９８５６１号パンフレットとして公開されている）；同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（同第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開されている）；同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（同第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開されている）；同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（同第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開されている）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号に開示されているＤＮＡヘリカーゼ、修飾されたＤＮＡヘリカーゼまたはＤＮＡヘリカーゼ構築物のいずれかであり得る。

【0215】

ヘリカーゼは、細孔に関して２つの様式で作用することができる。第一に、本方法は、好ましくは、ＤＮＡヘリカーゼが、印加電圧に起因する場を有する細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するように、ＤＮＡヘリカーゼを使用して実施される。この様式において、ＲＮＡポリヌクレオチドの５’末端は最初に細孔に捕捉され、酵素は、ＲＮＡポリヌクレオチドが、最終的に膜のトランス側まで移行するまで、場を有する細孔を通過するように、ＲＮＡポリヌクレオチドの細孔への移動を制御する。あるいは、本方法は、好ましくは、ＤＮＡヘリカーゼ酵素が、適用電圧に起因する場に逆らって、細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するように実施される。この様式において、ＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端は、最初に細孔内に捕捉され、酵素は、ＲＮＡポリヌクレオチドが、膜のシス側に戻って最終的には放出されるまで印加場に対して細孔から引き出されるように、細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御する。

【0216】

ＤＮＡヘリカーゼは、好ましくは、配列番号１５（Ｔｒｗｃ Ｃｂａ）に示される配列もしくはその改変体、配列番号８に示される配列（Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕ）もしくはその改変体、または配列番号１４に示される配列（Ｄｄａ）もしくはその改変体を含む。改変体は、膜貫通細孔について以下に検討するやり方のいずれかにおいて、天然配列と異なってもよい。配列番号１４の好ましい改変体は、（ａ）Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ、または（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ、Ｃ１０９ＡおよびＣ１３６Ａ、ならびに場合により（ΔＭ１）Ｇ１（すなわち、Ｍ１の欠失およびその後のＧ１の付加）を含む。

【0217】

任意の数のＲＮＡが、本発明に従って使用されてもよい。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれらを超えるヘリカーゼを使用することができる。いくつかの実施形態において、様々な数のヘリカーゼを使用することができる。本発明の一実施形態において、ＤＮＡヘリカーゼは、非ＲＮＡポリヌクレオチドに予め結合される。

【0218】

本発明の方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドを２つ以上のヘリカーゼと接触させることを含む。２つ以上のヘリカーゼは、典型的には同じヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは異なるヘリカーゼであってもよい。

【0219】

２つ以上のヘリカーゼは、上記のヘリカーゼの任意の組み合わせであってもよい。２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであってもよい。２つ以上のヘリカーゼは、１つ以上のＤｄａヘリカーゼおよび１つ以上のＴｒｗＣヘリカーゼであってもよい。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なる改変体であってもよい。

【0220】

２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは互いに結合される。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは互いに共有結合される。ヘリカーゼは、任意の順番で、任意の方法を用いて結合させてもよい。本発明において使用するための好ましいヘリカーゼは、国際出願番号第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開されている）；同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（同第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開されている）；同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（同第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開されている）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号に記載されている。

【0221】

配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の改変体は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５とは異なるアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持する酵素である。これは、当該技術分野にいて公知である任意の方法を用いて測定することができる。例えば、改変体は、ポリヌクレオチドと接触させることができ、ポリヌクレオチドに結合し、それに沿って移動するその能力を測定することができる。改変体は、ポリヌクレオチドの結合を促進し、ならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含んでもよい。改変体は、ポリヌクレオチドに結合する（すなわち、ポリヌクレオチド結合活性を保持する）が、ヘリカーゼとして機能しない（すなわち、移動を促進するために必要なすべての成分、例えば、ＡＴＰおよびＭｇ^２＋とともに提供される場合、ポリヌクレオチドに沿って移動しない）ように修飾される。このような修飾は、当該技術分野において公知である。例えば、ヘリカーゼにおけるＭｇ^２＋結合ドメインの修飾は、典型的には、ヘリカーゼとして機能しない改変体をもたらす。これらの種類の改変体は、分子ブレーキとして作用し得る（下記を参照されたい）。

【0222】

配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸配列の全長にわたって、改変体は、好ましくは、アミノ酸類似性または同一性に基づいて、その配列と少なくとも５０％相同である。より好ましくは、改変体ポリペプチドは、配列の全長で配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸配列に対するアミノ酸類似性または同一性に基づいて、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％相同であり得、より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。２００個以上、例えば、２３０個、２５０個、２７０個、２８０個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個もしくは１０００個またはそれらを超える連続したアミノ酸のストレッチに対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％のアミノ酸類似性または同一性があり得る（「高い相同性（hard homology）」）。相同性は、上記されるように決定される。改変体は、上記の配列番号２および４を参照して、上記で検討したやり型のいずれかにおいて野生型配列と異なってもよい。酵素は、細孔に共有結合してもよい。任意の方法を用いて、酵素を細孔に共有結合させることができる。

【0223】

好ましい実施形態において、本方法は、
（ａ）非ＲＮＡポリヌクレオチドを含み、それへのＤＮＡヘリカーゼ結合を増加させるように修飾されているＲＮＡポリヌクレオチドを１つ以上のＤＮＡヘリカーゼおよび１つ以上の分子ブレーキとともに用意するステップ；
（ｂ）ＲＮＡポリヌクレオチドを膜貫通細孔に接触させ、１つ以上のＤＮＡヘリカーゼおよび１つ以上の分子ブレーキが１つにまとまり、細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動をともに制御するように、細孔を横切って電位を印加するステップ；
（ｃ）ＲＮＡポリヌクレオチドが細孔に対して移動する間、ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す１つ以上の測定値を得、それによりＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるステップ
を含む。

【0224】

このタイプの方法は、英国特許出願第１４０６１５１．９号明細書に詳細に検討されている。好ましい分子ブレーキは、ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ５９４Ａ（突然変異Ｑ５９４Ａを有する配列番号１５）である。この改変体は、ヘリカーゼとして機能しない（すなわち、ポリヌクレオチドに結合するが、移動を促進するために必要なすべての成分、例えば、ＡＴＰおよびＭｇ^２＋とともに提供される場合、それらに沿って移動しない）。

【0225】

１つ以上のヘリカーゼは、上記で検討したもののいずれかであり得る。１つ以上の分子ブレーキは、ＲＮＡポリヌクレオチドに結合し、細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を遅らせる任意の化合物または分子であってもよい。１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、ＲＮＡポリヌクレオチドに結合する１つ以上の化合物を含む。１つ以上の化合物は、好ましくは１つ以上の大環状化合物である。適切な大環状化合物には、限定されないが、シクロデキストリン、カリックスアレーン、環状ペプチド、クラウンエーテル、ククルビツリル、ピララレン、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれる。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088に開示されているもののいずれかであり得る。この薬剤は、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ_７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ_１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ_７−βＣＤ）である。

【0226】

１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、１つ以上の一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）ではない。１つ以上の分子ブレーキは、より好ましくは、正味の負電荷を有さないカルボキシ末端（Ｃ末端）領域を含む一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）ではなく、および（ｉｉ）Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる、Ｃ末端領域の１つ以上の修飾を含む修飾されたＳＳＢではない。１つ以上の分子ブレーキは、最も好ましくは、国際出願番号第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開されている）に開示されたＳＳＢのいずれでもない。

【0227】

１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、１つ以上のポリヌクレオチド結合タンパク質である。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ＲＮＡポリヌクレオチドに結合し、細孔を通るその動きを制御することができる任意のタンパク質であってもよい。タンパク質がポリヌクレオチドに結合するか否かを決定することは、当該技術分野においては造作ない。このタンパク質は、典型的には、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性と相互作用し、修飾する。このタンパク質は、ポリヌクレオチドを切断して、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの個々のヌクレオチドまたはより短い鎖を形成することによってポリヌクレオチドを修飾することができる。部分は、ポリヌクレオチドを配向させるまたは特定の位置に移動させ、すなわちその移動を制御することによって、ポリヌクレオチドを修飾することができる。

【0228】

ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、ポリヌクレオチド処理酵素由来である。１つ以上の分子ブレーキは、上記で検討したポリヌクレオチド処理酵素のいずれかに由来してもよい。分子ブレーキとして作用するＰｈｉ２９ポリメラーゼ（配列番号８）の修飾バージョンは、米国特許第５，５７６，２０４号明細書に開示されている。１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、ヘリカーゼに由来する。

【0229】

ヘリカーゼ由来の任意の数の分子ブレーキを使用することができる。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれらを超えるヘリカーゼを分子ブレーキとして使用することができる。２つ以上のヘリカーゼが分子ブレーキとして使用される場合、２つ以上のヘリカーゼは、典型的には同じヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、異なるヘリカーゼであってもよい。

【0230】

２つ以上のヘリカーゼは、上述したヘリカーゼの任意の組み合わせであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであってもよい。２つ以上のヘリカーゼは、１つ以上のＤｄａヘリカーゼおよび１つ以上のＴｒｗＣヘリカーゼであり得る。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なる改変体であってもよい。

【0231】

２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは互いに結合される。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは互いに共有結合される。ヘリカーゼは、任意の順番で、任意の方法を用いて結合させてもよい。ヘリカーゼ由来の１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、少なくとも１つの立体配座状態で、ポリヌクレオチドがヘリカーゼから離れることができる、ポリヌクレオチド結合ドメインの開口のサイズを減少させるように修飾される。これは、国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットに開示されている。

【0232】

本発明において使用するための好ましいヘリカーゼ構築物は、国際出願番号第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開されている）；同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（同第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開されている）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（同第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開されている）；および２０１３年１０月１８日に出願された英国特許出願第１３１８４６４．３号明細書に記載されている。

【0233】

１つ以上のヘリカーゼが活性様式で使用される場合（すなわち、１つ以上のヘリカーゼが、移動を促進するために必要なすべての成分、例えば、ＡＴＰおよびＭｇ^２＋とともに提供される場合）、１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、（ａ）不活性様式で使用され（すなわち、移動を促進するために必要なすべての成分の不存在下で使用されるまたは能動移動をすることができない）、（ｂ）１つ以上の分子ブレーキが１つ以上のヘリカーゼに対して反対方向に移動する活性様式で使用され、または（ｃ）１つ以上の分子ブレーキが１つ以上のヘリカーゼと同じ方向に移動し、１つ以上のヘリカーゼよりもゆっくりと移動する活性様式で使用される。

【0234】

１つ以上のヘリカーゼが不活性様式で使用される場合（すなわち、１つ以上のヘリカーゼが、移動を促進するために必要なすべての成分、例えば、ＡＴＰおよびＭｇ^２＋とともに提供されないまたは能動移動をすることができない場合）、１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、（ａ）不活性様式で使用され（すなわち、移動を促進するために必要なすべての成分の不存在下で使用されるまたは能動移動をすることができない）、または（ｂ）１つ以上の分子ブレーキが、ポリヌクレオチドが細孔に通るのと同じ方向でポリヌクレオチドに沿って移動する活性様式で使用される。

【0235】

１つ以上のヘリカーゼおよび１つ以上の分子ブレーキは、それらが一緒にされ、両方が細孔を通るＲＮＡの移動を制御するように、任意の位置でＲＮＡに結合されてもよい。１つ以上のヘリカーゼおよび１つ以上の分子ブレーキは、少なくとも１ヌクレオチド離れ、例えば、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも５０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００以上、少なくとも５０，０００ヌクレオチドまたはそれを超えて離れている。この方法が、一方の末端にＹアダプターおよび他端にヘアピンループアダプターを備えた二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けることに関する場合、１つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、Ｙアダプターに結合され、１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、ヘアピンループアダプターに結合される。この実施形態において、１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、それらがＲＮＡポリヌクレオチドに結合するが、ヘリカーゼとして機能しないように修飾される１つ以上のヘリカーゼである。Ｙアダプターに結合される１つ以上のＤＮＡヘリカーゼは、以下により詳細に検討するように、好ましくはスペーサーで失速される。ヘアピンループアダプターに結合された１つ以上の分子ブレーキは、好ましくはスペーサーで失速されない。１つ以上のＤＮＡヘリカーゼおよび１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、１つ以上のＤＮＡヘリカーゼがヘアピンループに到達するときに一緒にされる。１つ以上のＤＮＡヘリカーゼは、Ｙアダプターがポリヌクレオチドに結合される前にまたはＹアダプターがポリヌクレオチドに結合された後に、Ｙアダプターに結合され得る。１つ以上の分子ブレーキは、ヘアピンループアダプターがポリヌクレオチドに結合される前に、またはヘアピンループアダプターがポリヌクレオチドに結合された後に、ヘアピンループアダプターに結合されてもよい。

【0236】

１つ以上のヘリカーゼおよび１つ以上の分子ブレーキは、好ましくは、互いに結合されない。１つ以上のヘリカーゼおよび１つ以上の分子ブレーキは、より好ましくは、互いに共有結合されない。１つ以上のヘリカーゼおよび１つ以上の分子ブレーキは、国際出願番号第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開されている）；同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（同第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開されている）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（同第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開されている）；および２０１３年１０月１８日に出願された英国特許出願第１３１８４６４．３号明細書に記載され、好ましくは結合されない。

【0237】

スペーサー（単数または複数）
１つ以上のスペーサーを本発明の構築物に含めることができる。ＲＮＡポリヌクレオチドの一部が細孔に入り、印加電位から生じる場に沿って細孔を通り移動する間、ＲＮＡポリヌクレオチドが細孔を通り移動するにつれ、１つ以上のヘリカーゼは細孔により、スペーサーを通過するように移動される。これは、ＲＮＡポリヌクレオチド（１つ以上のスペーサーを含む）が細孔を通って移動し、１つ以上のヘリカーゼが細孔の上部に留まるためである。１つ以上のＤＮＡヘリカーゼは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５０１７５号（国際公開第２０１４／１３５８３８号パンフレットとして公開されている）に検討されているように、１つ以上のスペーサーで失速することがある。その国際出願に開示されている１つ以上のヘリカーゼおよび１つ以上のスペーサーの任意の構成を本発明に使用することができる。

【0238】

１つ以上のスペーサーは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドの一部であり得、例えば、それ／それらはポリヌクレオチド配列に干渉する。１つ以上のスペーサーは、好ましくは、標的ＲＮＡにハイブリダイズした、スピードバンプなどの１つ以上の遮断分子の一部ではない。１つ以上のスペーサーは、非ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）の一部であり得、例えば、それ／それらはポリヌクレオチド配列に干渉する。１つ以上のスペーサーは、ＲＮＡポリヌクレオチドの一部であってもよい。１つ以上のスペーサーは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドおよび／または非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させ得る。１つ以上のスペーサーを末端に配置してもよく、あるいはＲＮＡポリヌクレオチドもしくは非ＲＮＡポリヌクレオチドおよび／または１つ以上のスペーサーをＲＮＡポリヌクレオチドまたは非ＲＮＡポリヌクレオチド内に配置してもよい。

【0239】

１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれらを超えるスペーサーなどの任意の数のスペーサーが標的ＲＮＡポリヌクレオチドまたは非ＲＮＡポリヌクレオチドに存在してもよい。好ましくは、本発明の構築物に２つ、４つまたは６つのスペーサーが存在する。リーダー配列のスペーサーおよびヘアピンループのスペーサーなどの構築物の異なる領域に１つ以上のスペーサーが存在してもよい。

【0240】

１つ以上のスペーサーの各々は、１つ以上のヘリカーゼが能動的な様式でさえ克服することができないエネルギー障壁を提供する。１つ以上のスペーサーは、ヘリカーゼのけん引を低下させることによって（例えば、標的ＲＮＡポリヌクレオチドもしくは非ＲＮＡポリヌクレオチド中のヌクレオチドから塩基を除去することによって）、または１つ以上のヘリカーゼの移動を物理的に遮断することによって（例えば、嵩高い化学基を使用して）、１つ以上のヘリカーゼを失速させてもよい。

【0241】

１つ以上のスペーサーは、１つ以上のヘリカーゼを失速させる任意の分子または分子の組み合わせを含み得る。１つ以上のスペーサーは、１つ以上のヘリカーゼが標的ＲＮＡポリヌクレオチドに沿って移動することを防止する任意の分子または分子の組み合わせを含み得る。１つ以上のヘリカーゼが、膜貫通細孔および印加電位の不存在下、１つ以上のスペーサーで失速されるか否かを決定することは直接的である。例えば、スペーサーを通過して移動するヘリカーゼの能力は、ＰＡＧＥによって測定することができる。

【0242】

１つ以上のスペーサーは、典型的には、ポリマーなどの直線状分子を含む。１つ以上のスペーサーは、典型的には、標的ＲＮＡポリヌクレオチドまたは非ＲＮＡポリヌクレオチドとは異なる構造を有する。例えば、１つ以上のスペーサーは、典型的にＲＮＡではない。特に、１つ以上のスペーサーは、好ましくは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含む。１つ以上のスペーサーは、ポリヌクレオチドと反対方向に１つ以上のヌクレオチドを含み得る。例えば、ポリヌクレオチドが５’から３’方向である場合、１つ以上のスペーサーは、３’から５’方向に１つ以上のヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、上記で検討したもののいずれかであってもよい。

【0243】

１つ以上のスペーサーは、好ましくは、１つ以上のニトロインドールを含み、例えば、１つ以上の５−ニトロインドール、１つ以上のイノシン、１つ以上のアクリジン、１つ以上の２−アミノプリン、１つ以上の２，６−ジアミノプリン、１つ以上の５−ブロモ−デオキシウリジン、１つ以上の逆方向チミジン（逆方向ｄＴ）、１つ以上の逆方向ジデオキシ−チミジン（ｄｄＴ）、１つ以上のジデオキシ−シチジン（ｄｄＣ）、１つ以上の５−メチルシチジン、１つ以上の５−ヒドロキシメチルシチジン、１つ以上の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、１つ以上のイソ−デオキシシチジン（Ｉｓｏ−ｄＣ）、１つ以上のイソ−デオキシグアノシン（Ｉｓｏ−ｄＧ）、１つ以上のｉＳｐＣ３基（すなわち、糖および塩基を欠損しているヌクレオチド）、１つ以上の光切断可能な（ＰＣ）基、１つ以上のヘキサンジオール基、１つ以上のスペーサー９（ｉＳｐ９）基、１つ以上のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）基、ポリマーまたは１つ以上のチオール連結が挙げられる。１つ以上のスペーサーは、これらの基のいずれかの組み合わせを含んでもよい。これらの基の多くは、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））から市販されている。

【0244】

１つ以上のスペーサーは、任意の数のこれらの基を含有することができる。例えば、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、逆方向ｄＴ、ｄｄＴ、ｄｄＣ、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ−ｄＣ、イソ−ｄＧｓ、ｉＳｐＣ３基、ＰＣ基、ヘキサンジオール基およびチオール連結について、１つ以上のスペーサーは、好ましくは２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれを超えて含む。１つ以上のスペーサーは、好ましくは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個またはそれらを超えるｉＳｐ９基を含む。１つ以上のスペーサーは、好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つまたはそれらを超えるｉＳｐ１８基を含む。最も好ましいスペーサーは、４つのｉＳｐＣ３基である。

【0245】

ポリマーは、好ましくはポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリペプチドは、好ましくは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれらを超えるアミノ酸を含む。ＰＥＧは、好ましくは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれらを超えるモノマー単位を含む。

【0246】

１つ以上のスペーサーは、好ましくは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれらを超える無塩基ヌクレオチドなどの１つ以上の無塩基ヌクレオチド（すなわち、核酸塩基を欠くヌクレオチド）を含む。核酸塩基は、無塩基ヌクレオチド中の−Ｈ（ｉｄＳｐ）または−ＯＨによって置換することができる。無塩基スペーサーは、核酸塩基を１つ以上の隣接するヌクレオチドから除去することによって標的ポリヌクレオチドに挿入することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、１，Ｎ６−エテノアデニンイノシンまたはヒポキサンチンを含むように修飾することができ、核酸塩基は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）を用いてこれらのヌクレオチドから除去することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ウラシルを含むように修飾することができ、ヌクレオ塩基は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で除去することができる。一実施形態において、１つ以上のスペーサーは、無塩基ヌクレオチドを含まない。

【0247】

１つ以上のＤＮＡヘリカーゼは、各直鎖分子スペーサーによって（すなわち、その前に）、または各直鎖分子スペーサー上で失速され得る。直線状分子スペーサーを使用する場合、１つ以上のヘリカーゼを通過して移動されるべき各スペーサーの末端に隣接するポリヌクレオチドの二本鎖領域を有する構築物が、好ましくは提供される。二本鎖領域は、典型的には、隣接するスペーサー上の１つ以上のヘリカーゼを失速させるのに役立つ。この方法が約１００ｍＭ以下の塩濃度で実施される場合、二本鎖領域（単数または複数）の存在が特に好ましい。各二本鎖領域は、典型的に、長さが少なくとも１０ヌクレオチド、例えばｍ少なくとも１２ヌクレオチドである。本発明に用いられる標的ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、より短いポリヌクレオチドをスペーサーに隣接する領域にハイブリダイズさせることにより二本鎖領域を形成することができる。より短いポリヌクレオチドは、典型的には、標的ポリヌクレオチドと同じヌクレオチドから形成されるが、異なるヌクレオチドから形成されてもよい。例えば、より短いポリヌクレオチドは、ＬＮＡから形成され得る。

【0248】

直線状分子スペーサーが使用される場合、好ましくは、１つ以上のヘリカーゼが通過して移動されるべき末端と反対側の各スペーサーの末端で遮断分子を有する構築物が提供される。これは、１つ以上のヘリカーゼが各スペーサー上で失速した状態であることを確実にするのに役立ち得る。また、１つ以上のヘリカーゼが溶液中に分散する場合において、それ／それらを構築物上に保持するのに役立つ。遮断分子は、１つ以上のヘリカーゼを物理的に失速させる、以下に検討する化学基のいずれかであってもよい。遮断分子は、ポリヌクレオチドの二本鎖領域であってもよい。

【0249】

１つ以上のスペーサーは、好ましくは、１つ以上のヘリカーゼを物理的に失速させる１つ以上の化学基を含む。１つ以上の化学基は、好ましくは、１つ以上のペンダント化学基である。１つ以上の化学基は、標的ポリヌクレオチド中の１つ以上の核酸塩基に結合され得る。１つ以上の化学基は、標的ポリヌクレオチド骨格に結合され得る。２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれらを超えるなどの任意の数のこれらの化学基が存在してもよい。適切な基には、限定されないが、フルオロフォア、ストレプトアビジンおよび／またはビオチン、コレステロール、メチレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニンおよび／または抗ジゴキシゲニン、ならびにジベンジルシクロオクチン基が含まれる。

【0250】

標的ポリヌクレオチド中の異なるスペーサーは、異なる失速分子を含み得る。例えば、１つのスペーサーは、上記で検討した直線状分子の１つを含むことができ、別のスペーサーは、１つ以上のヘリカーゼを物理的に失速させる１つ以上の化学基を含むことができる。スペーサーは、上記で検討した直線状分子のいずれか、ならびに物理的に１つ以上のヘリカーゼを失速させる１つ以上の化学基、例えば、１つ以上の脱塩基剤およびフルオロフォアを含んでもよい。

【0251】

適切なスペーサーは、標的ポリヌクレオチドのタイプ、および本発明の方法が実施される条件に応じて設計することができる。ほとんどのヘリカーゼはＤＮＡに結合し、それに沿って移動するため、ＤＮＡでないいずれのものを使って失速させてもよい。適切な分子は、上記で検討されている。

【0252】

本発明の方法は、好ましくは、遊離ヌクレオチドの存在下および／またはヘリカーゼ補因子の存在下で実施される。これについては以下に詳細に検討する。膜貫通細孔および印加電位がない場合、１つ以上のスペーサーは、好ましくは、遊離ヌクレオチドおよび／またはヘリカーゼ補因子の存在下で、１つ以上のヘリカーゼを失速させることができる。

【0253】

本発明の方法が、以下に検討するように遊離ヌクレオチドおよびヘリカーゼ補因子の存在下で（より多くのヘリカーゼのうちの１つが活性様式であるように）実施される場合、１つ以上のより長いスペーサーは、典型的には、１つ以上のヘリカーゼが膜貫通細孔と接触して、電位が印加される前に、標的ポリヌクレオチド上で失速されることを確認するために使用される。１つ以上のより短いスペーサーは、遊離ヌクレオチドおよびヘリカーゼ補因子の非存在下で（１つ以上のヘリカーゼが不活性様式であるように）使用することができる。

【0254】

また、塩濃度は、１つ以上のスペーサーが１つ以上のヘリカーゼを失速させる能力に影響を及ぼす。膜貫通細孔および印加電位がない場合、１つ以上のスペーサーは、好ましくは、約１００ｍＭ以下の塩濃度で１つ以上のヘリカーゼを失速させることができる。本発明の方法に使用される塩濃度が高いほど、典型的に使用される１つ以上のスペーサーは短くなり、その逆も同様である。

【0255】

特徴の好ましい組み合わせを以下の表１に示す。

【0256】

【表1】

【0257】

本方法は、スペーサーを通過して２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関するものであってもよい。このような場合、スペーサーの長さは、典型的には、細孔および適用電位の不存在下で、スペーサーを通過して、後続のヘリカーゼが先頭のヘリカーゼを押すことを防止するために増加される。本方法が１つ以上のスペーサーを通過して２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関するものである場合、上記で検討されたスペーサーの長さは、少なくとも１．５倍、例えば、２倍、２．５倍または３倍に増やすことができる。例えば、本方法が１つ以上のスペーサーを通過して２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関するものである場合、上記の表４の第３列にあるスペーサーの長さは、１．５倍、２倍、２．５倍または３倍に増やすことができる。

【0258】

膜貫通細孔
膜貫通細孔は、ある程度まで膜を横切る構造である。それは、印加電位によって駆動された水和イオンが膜を横切ってまたは膜内に流れることを可能にする。膜貫通細孔は、典型的には、膜全体を横切り、そのため、水和イオンが膜の一方側から膜の他方側に流れることができる。しかしながら、膜貫通細孔は膜を交差する必要はない。それは一方の端で閉じていてもよい。例えば、細孔は、水和イオンが膜に沿って流入するまたは膜内流入する膜のウェル、ギャップ、チャネル、トレンチまたはスリットであってもよい。

【0259】

任意の膜貫通細孔を本発明に使用することができる。細孔は、生物学的または人工的であってもよい。適切な細孔としては、限定されないが、タンパク質細孔、ポリヌクレオチド細孔および固体細孔が挙げられる。細孔は、ＤＮＡ折り紙細孔であってもよい（Langecker et al., Science, 2012; 338: 932-936）。

【0260】

膜貫通細孔は、好ましくは膜貫通タンパク質細孔である。膜貫通タンパク質細孔は、分析物などの水和イオンが膜の一方側から膜の他方側に流れることを可能にするポリペプチドまたはポリペプチドの集合体である。本発明において、膜貫通タンパク質細孔は、印加電位によって、水和イオンを膜の一方側から他方側に駆動されることを可能にする細孔を形成することができる。膜貫通タンパク質細孔は、好ましくは、ヌクレオチドなどの分析物が脂質二重層などの膜の一方側から他方側に流れることを可能にする。膜貫通タンパク質細孔は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたは核酸が細孔を通り移動することを可能にする。

【0261】

膜貫通タンパク質細孔は、モノマーまたはオリゴマーであってもよい。細孔は、好ましくは、６、７、８または９サブユニットなどのいくつかの反復サブユニットで構成されている。細孔は、好ましくは、六量体、七重体、八量体または九量体の細孔である。

【0262】

膜貫通タンパク質細孔は、典型的には、イオンが流れることができるバレルまたはチャネルを含む。細孔のサブユニットは、典型的には、中心軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通α−ヘリックスバンドルもしくはチャネルに鎖を与える。

【0263】

膜貫通タンパク質細孔のバレルまたはチャネルは、典型的には、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸のような分析物との相互作用を促進するアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、好ましくは、バレルまたはチャネルの狭窄部の近くに位置する。膜貫通タンパク質細孔は、典型的には、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つ以上の正に荷電したアミノ酸、またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、典型的には、細孔とヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸の間の相互作用を促進する。

【0264】

本発明に従って使用される膜貫通タンパク質細孔は、βバレル細孔またはα−ヘリックスバンドル細孔に由来し得る。βバレル細孔は、β鎖から形成されるバレルまたはチャンネルを含む。適切なβバレル細孔には、限定されないが、α−ヘモリシンなどのβ−毒素、炭疽菌毒素およびロイコシジン、ならびにマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）ポリン（Ｍｓｐ）、例えば、ＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣもしくはＭｓｐＤ、ＣｓｇＧ、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリアオートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリンが含まれる。α−ヘリックスバンドル細孔は、α−ヘリックスから形成されるバレルまたはチャンネルを含む。適切なα−ヘリックスバンドル細孔には、限定されないが、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒素などの内膜タンパク質およびα外膜タンパク質が含まれる。膜貫通細孔は、Ｍｓｐまたはα−ヘモリシン（α−ＨＬ）に由来し得る。

【0265】

膜貫通タンパク質細孔は、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する。このような細孔は、オリゴマーであり、典型的には、Ｍｓｐに由来する７個、８個、９個または１０個のモノマーを含む。細孔は、同一のモノマーを含むＭｓｐに由来するホモオリゴマー細孔であり得る。あるいは、細孔は、他と異なる少なくとも１つのモノマーを含むＭｓｐに由来するヘテロオリゴマー細孔であり得る。好ましくは、細孔は、ＭｓｐＡまたはその類似体もしくはパラログに由来する。

【0266】

Ｍｓｐに由来するモノマーは、配列番号２またはその改変体に示される配列を含む。配列番号２は、ＭｓｐＡモノマーのＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。それは、以下の突然変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の改変体は、配列番号２と異なるアミノ酸配列を有し、細孔を形成するその能力を保持しているポリペプチドである。細孔を形成する改変体の能力は、当該技術分野において公知である任意の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、改変体を他の適切なサブユニットとともに両親媒性層に挿入することができ、オリゴマー化して細孔を形成するその能力を測定することができる。サブユニットを両親媒性層などの膜に挿入する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、サブユニットは、脂質二重層に拡散し、結合により脂質二重層に挿入され、機能状態に集合するように、脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁させることができる。あるいは、サブユニットは、M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開されている）に記載されている「ピックアンドプレイス」法を用いて膜に直接挿入することができる。

【0267】

配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって、改変体は、好ましくは、アミノ酸の類似性または同一性に基づいて、その配列と少なくとも５０％相同である。より好ましくは、改変体は、全配列にわたって配列番号２のアミノ酸配列とアミノ酸の類似性または同一性に基づいて、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。一続きの１００個以上、例えば、１２５個、１５０個、１７５個もしくは２００個またはそれらを超える連続したアミノ酸にわたって少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸の類似性または同一性（「高い相同性」）が存在し得る。

【0268】

当該技術分野における標準的な方法を用いて、相同性を決定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、例えば、そのデフォルト設定で用いられる、相同性を計算するために用いることができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されるように、相同性を計算するためにまたは配列を整列させるために（等価残基または対応する配列を同定することなど（典型的には、それらのデフォルト設定で））用いることができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して公的に入手できる。

【0269】

類似性は、ペアワイズ同一性を用いて、またはＢＬＯＳＵＭ６２などのスコアリングマトリックスを適用し、同等の同一性に変換することによって測定することができる。それらは進化した変化というよりはむしろ機能的なものであるため、相同性を決定する場合に、意図的に突然変異させた位置がマスクされる。類似性は、タンパク質配列の包括的データベース上の、例えばＰＳＩＢＬＡＳＴを用いた位置特異的スコアリングマトリックスの適用によってより感度良く決定され得る。進化的時間尺度（例えば、電荷）にわたる置換の頻度というよりはむしろ、アミノ酸の化学−物理的特性を反映する異なるスコアリングマトリックスを使用することができる。

【0270】

配列番号２は、ＭｓｐＡモノマーのＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。改変体は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤモノマーにおける突然変異のいずれかを含み得る。ＭｓｐＢ、ＣまたはＤの成熟形態は、配列番号５〜７に示される。特に、改変体は、ＭｓｐＢに存在する以下の置換：Ａ１３８Ｐの置換を含み得る。改変体は、ＭｓｐＣに存在する以下の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの置換の１つ以上を含み得る。改変体は、ＭｓｐＤに存在する以下の変異：Ｇ１、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの欠失の１つ以上を含み得る。改変体は、ＭｓｐＢ、ＣまたはＤの変異および置換の１つ以上の組合せを含み得る。改変体は、好ましくは、変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の改変体は、ＭＳ−（Ｂ１）８の変異のすべてに加えて変異Ｌ８８Ｎを有し、それはＭＳ−（Ｂ２）８と呼ばれる。本発明において使用される細孔は、好ましくは、ＭＳ−（Ｂ２）８である。さらに好ましい改変体は、変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む。配列番号２の改変体は、ＭＳ−（Ｂ１）８のすべての変異に加えて変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有し、ＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８と呼ばれる。本発明において使用される細孔は、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８である。

【0271】

Ｍｓｐ由来のモノマーは、当該技術分野において公知である標準的な方法を用いて生成することができる。Ｍｓｐ由来のモノマーは、合成的にまたは組換え手段によって作製されてもよい。例えば、細孔は、インビトロ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。細孔を生成するのに適した方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（国際公開第２０１０／００４２７３号パンフレットとして公開されている）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（同第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開されている）または同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（同第２０１０／０８６６０３号パンフレット）において検討されている。細孔を膜に挿入する方法もまたその中で検討されている。

【0272】

膜貫通タンパク質細孔はまた、好ましくは、α−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である。野生型α−ＨＬ細孔は、７個の同一モノマーまたはサブユニットから形成される（すなわち七量体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個のモノマーまたはサブユニットの配列は配列番号４に示されている。膜貫通タンパク質細孔は、好ましくは、配列番号４に示される配列またはその改変体をそれぞれ含む７個のモノマーを含む。配列番号４のアミノ酸１、７〜２１、３１〜３４、４５〜５１、６３〜６６、７２、９２〜９７、１０４〜１１１、１２４〜１３６、１４９〜１５３、１６０〜１６４、１７３〜２０６、２１０〜２１３、２１７、２１８、２２３〜２２８、２３６〜２４２、２６２〜２６５、２７２〜２７４、２８７〜２９０および２９４は、ループ領域を形成する。配列番号４の残基１１３および１４７は、α−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。

【0273】

このような実施形態において、配列番号４に示される配列またはその改変体をそれぞれ含む７個のタンパク質またはモノマーを含む細孔は、好ましくは、本発明の方法において用いられる。７個のタンパク質は、同一であってもよく（ホモ七量体）または異なってもよい（ヘテロ七量体）。

【0274】

改変体は、ヘリカーゼまたは構築物への共有結合または相互作用を促進する修飾を含み得る。改変体は、好ましくは、ヘリカーゼまたは構築物への結合を促進する１つ以上の反応性システイン残基を含む。例えば、改変体は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１つ以上でシステインを含み得る。好ましい改変体は、配列番号４の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインによる置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。改変体は、好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（国際公開第２０１０／００４２７３号パンフレットとして公開されている）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（同第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開されている）、または同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（同第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開されている）に記載されている改変体のいずれか１つである。

【0275】

改変体はまた、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾を含み得る。

【0276】

改変体は、生物、例えば、細菌ブドウ球菌（Staphylococcus）によって天然で発現される天然に存在する改変体であってよい。あるいは、改変体は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によってインビトロでまたは組換え的に発現されてもよい。改変体はまた、組換え技術によって生成される天然に存在しない改変体を含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたって、改変体は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは、改変体ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸配列に対するアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってもよい。少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００個以上の、例えば２３０個、２５０個、２７０個もしくは２８０個またはそれらを超える、一連の連続したアミノ酸にわたって存在する場合がある（「高い相同性」）。相同性は上記で検討した通りに決定され得る。

【0277】

アミノ酸置換は、上記で考察したものに加えて、配列番号４のアミノ酸配列に作出され得、例えば、最大１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換である。保存的置換が作出されてもよい。

【0278】

配列番号４のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基は、上述したポリペプチドから追加的に欠失され得る。最大１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基またはそれらを超える残基が欠失され得る。

【0279】

改変体は、配列番号４の断片を含み得る。このような断片は細孔形成活性を保持する。断片は、長さが少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は、好ましくは、配列番号４の細孔形成ドメインを好ましくは含む。断片は、典型的には、配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。

【0280】

１つ以上のアミノ酸は、上述したポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加され得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその改変体もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えることができる。伸長は極めて短くてもよく、例えば、長さが１〜１０アミノ酸であってもよい。あるいは、伸長はより長くてもよく、例えば、最大５０または１００アミノ酸であってもよい。担体タンパク質は、細孔または改変体に融合されてもよい。

【0281】

上記で検討した通り、配列番号４の改変体は、配列番号４のものから変更され、細孔を形成するその能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。改変体は、典型的には、細孔形成に関与する配列番号４の領域を含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬの細孔形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の改変体は、典型的には、β鎖を形成する配列番号４の領域を含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸は、上記で検討されている。１つ以上の修飾は、得られる改変体が細孔を形成する能力を保持する限り、β鎖を形成する配列番号４の領域に作出され得る。配列番号４のβ鎖領域に作出され得る特定の修飾は、上記で検討されている。

【0282】

配列番号４の改変体は、好ましくは、置換、付加または欠失などの１つ以上の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上記で検討されている。

【0283】

改変体は、上記で検討した通り、その同定または精製を支援するように修飾されてもよい。

【0284】

α−ＨＬ由来の細孔は、Ｍｓｐ由来の細孔に関連して上記で検討した通りに作出され得る。

【0285】

膜
任意の膜が本発明に従って用いられ得る。好適な膜は、当該技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１つの親水性部分と少なくとも１つの親油性部分または疎水性部分の両方を有する、リン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は、合成または天然に存在するものであってよい。天然に存在しない両親媒性物質、および単層を形成する両親媒性物質は、当該技術分野において公知であり、例えば、ブロックコポリマーが挙げられる（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450）。ブロックコポリマーは、１本のポリマー鎖を作出するように２つ以上のモノマーサブユニットｔが共に重合されるポリマー材料である。ブロックコポリマーは、典型的には、各モノマーサブユニットによって寄与される特性を有する。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されたポリマーが保有しない独特の特性を有する場合がある。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）であるが、他のサブユニット（単数または複数）が水性媒体中で親水性であるように操作され得る。この場合において、ブロックコポリマーは、両親媒特性を保有する場合があり、生物学的膜を模倣する構造を形成する場合がある。ブロックコポリマーは、ジブロック（２個のモノマーサブユニットからなる）であってもよいが、両親媒性物質として振る舞う、さらに、より複雑な配置を形成するように２つを超えるモノマーサブユニットから構築されてもよい。コポリマーは、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロックコポリマーであってもよい。

【0286】

両親媒性層は、単層または二重層であってよい。両親媒性層は、典型的には、平面脂質二重層または支持された二重層である。

【0287】

両親媒性層は、典型的には脂質二重層である。脂質二重層は、細胞膜のモデルであり、様々な実験研究のための優れたプラットホームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のインビトロでの調査のために用いられ得る。あるいは、脂質二重層は、様々な物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、限定されないが、平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二重層は、好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（国際公開第２００８／１０２１２１号パンフレットとして公開されている）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（同第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開されている）、および同第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（同第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開されている）に開示されている。

【0288】

脂質二重層を形成するための方法は、当該技術分野において公知である。好適な方法は、実施例に開示される。脂質二重層は、一般的には、脂質単層が水性溶液／空気界面上に置かれ、その界面に垂直である開口部の両側を越えて運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1972;69:3561-3566）によって形成される。

【0289】

モンタルおよびミューラーの方法は、それがタンパク質細孔挿入のために適している良質な脂質二重層を形成する対費用効果が高くて、比較的簡単な方法であることから一般的である。二重層形成の他の一般的方法は、チップ−ディッピング、ペインティング二重層およびリポソーム二重層のパッチクランピングを含む。

【0290】

好ましい実施形態において、脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開されている）に記載の通り形成される。

【0291】

別の好ましい実施形態において、膜は、固体状態層である。固体状態層は、生物由来ではない。換言すると、固体状態層は、生物または細胞などの生物学的環境由来でなくまたはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造されたバージョンでもない。固体状態層は、限定されないが、ミクロ電子材料、Ｓｉ_３Ｎ_４、Ａｌ_２Ｏ_３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチック、または２成分添加の硬化シリコンゴムなどのエラストマー、ならびにガラスを含む、有機材料と無機材料の両方から形成され得る。固体状態層は、グラフェンなどの単原子層、またはほんの数原子の厚さである層から形成され得る。好適なグラフェン層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（国際公開第２００９／０３５６４７号パンフレットとして公開されている）に開示されている。

【0292】

この方法は、典型的には、（ｉ）細孔を含む人工の両親媒性層、（ｉｉ）細孔を含む単離された天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）細孔が挿入された細胞を用いて実施される。この方法は、典型的には、人工脂質二重層などの人工両親媒性層を用いて実施される。層は、他の膜貫通および／または膜内タンパク質、ならびに細孔に加えて他の分子を含んでもよい。適切な装置および条件を以下に検討する。本発明の方法は、典型的にはインビトロで実施される。

【0293】

カップリング
標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは、膜貫通細孔を含む膜にカップリングされる。これは、任意の公知の方法を用いて行うことができる。本方法は、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを膜貫通細孔を含む膜にカップリングさせることを含み得る。ＲＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは、１つ以上のアンカーを用いて膜にカップリングされる。ＲＮＡポリヌクレオチドは、任意の公知の方法を用いて膜にカップリングさせてもよい。

【0294】

各アンカーは、ＲＮＡポリヌクレオチドにカップリングする（または結合する）基、および膜にカップリングする（または結合する）基を含む。各アンカーは、ＲＮＡポリヌクレオチドおよび／または膜に共有的にカップリング（または結合）することができる。Ｙアダプターおよび／またはヘアピンループアダプターが使用される場合、ＲＮＡは、好ましくは、アダプター（単数または複数）を用いて膜にカップリングされる。

【0295】

ＲＮＡポリヌクレオチドは、２つ、３つ、４つまたはそれらを超えるアンカーなどの任意の数のアンカーを用いて膜にカップリングされてもよい。例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドは、各々が、ＲＮＡポリヌクレオチドと膜の両方に別々にカップリング（または結合する）２つのアンカーを用いて膜にカップリングされ得る。

【0296】

１つ以上のアンカーは、上記で検討した１つ以上のＤＮＡヘリカーゼおよび／または１つ以上の分子ブレーキを含んでもよい。

【0297】

膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合（詳細については上記で検討されている）、ＲＮＡは、好ましくは、膜に存在するポリペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカーを介して膜にカップリングされる。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である。

【0298】

ＲＮＡポリヌクレオチドは、膜に直接カップリングされてもよい。ＲＮＡポリヌクレオチドは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１１９１号（国際公開第２０１２／１６４２７０号パンフレットとして公開されている）に開示されている方法のいずれかを用いて膜にカップリングさせることができる。ＲＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは、リンカーを介して膜にカップリングされる。好ましいリンカーとしては、限定されないが、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマーが挙げられる。ＲＮＡが膜に直接カップリングされている場合、膜と細孔および／またはポリヌクレオチド結合タンパク質の間の距離に起因して、特徴付けの実施がＲＮＡの終端まで続けることができないため、いくつかのデータは失われる。リンカーが使用される場合、ＲＮＡは完了のために処理され得る。リンカーが使用される場合、リンカーは任意の位置でＲＮＡに結合され得る。リンカーは、典型的には、テールポリマーとしてＲＮＡに結合される。

【0299】

カップリングは、安定していてもよくまたは一時的であってもよい。特定の用途については、カップリングの一時的な特性が好ましい。安定なカップリング分子が、ＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかに直接結合された場合、膜と細孔および／またはポリヌクレオチド結合タンパク質の間の距離に起因して、相補的なポリヌクレオチドの終端まで特徴付けの実施を続けることができないため、いくつかのデータは失われる。カップリングが一時的である場合、カップリングされた末端がランダムに膜を含まなくなると、ＲＮＡポリヌクレオチドは完了のために処理され得る。膜と安定または一時的な連結を形成する化学基は、以下でより詳細に検討される。ＲＮＡポリヌクレオチドは、コレステロールまたは脂肪アシル鎖を用いて脂質二重層などの両親媒性層に一時的にカップリングされてもよい。ヘキサデカン酸などの、長さが６〜３０個の炭素原子を有する脂肪アシル鎖を使用してもよい。

【0300】

合成脂質二重層へのポリヌクレオチドのカップリングは、以前は様々な異なるテザリング戦略によって行われてきた。これらを以下の表２に要約する。

【0301】

【表2】

【0302】

合成ポリヌクレオチドは、チオール、コレステロール、脂質およびビオチン基などの適切なアンカー基の付加に対して容易に適合する合成反応において修飾されたホスホラミダイトを用いて官能化することができる。これらの様々な結合化学は、ポリヌクレオチドへの結合のために一連の選択肢を与える。各々の異なる修飾基は、ポリヌクレオチドをわずかに異なる方法でカップリングし、カップリングは、常に永久的であるとは限らず、そのため、膜に対してポリヌクレオチドの様々な滞留時間を与える。一過性のカップリングの利点は、上記で検討されている。

【0303】

ＲＮＡポリヌクレオチドのカップリングはまた、反応性基をＲＮＡポリヌクレオチドに付加することができるという条件で、多数の他の手段によって達成することができる。

【0304】

あるいは、反応性基は、既に膜にカップリングしているものと相補的なＲＮＡポリヌクレオチド中の短い領域であると考えられ、そのため、ハイブリダイゼーションを介して、結合が達成され得る。この領域は、ＲＮＡポリヌクレオチドの一部であり得て、またはそれにライゲーションされ得る。ｓｓＤＮＡの短い小片のライゲーションは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている（Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Williams, et al. (1992). "Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5）。

【0305】

最も好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはそれに結合した非ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするコレステロールタグ化されたポリヌクレオチドを用いて膜にカップリングされる。

【0306】

疾患もしくは状態の診断または予後診断
ｍＲＮＡは、好ましくは、疾患もしくは状態を診断または予後診断するために本発明において使用される。いくつかの疾患または状態は、ｍＲＮＡの変化した量（またはレベル）と関連付けられる。ｍＲＮＡは、正常または野生型ｍＲＮＡであってもよく、すなわち選択的にスプライスされていなくてもよい。ｍＲＮＡの量（またはレベル）は、疾患および状態のない患者における量（またはレベル）と比較して、疾患もしくは状態で増加または減少させることができる。このような疾患または状態は、本発明の方法を用いて、患者由来の試料中のｍＲＮＡの量を決定することによって診断または予後診断され得る。

【0307】

多数の遺伝的疾患または状態は、ｍＲＮＡスプライシング欠損などの選択的ｍＲＮＡスプライシングを引き起こす突然変異によって引き起こされる。多数の疾患または状態は、明白な突然変異に起因しない別のｍＲＮＡスプライシングに関連する。選択的スプライシングの有無は、本発明の方法を用いて患者からの試料中に選択的スプライシングされたｍＲＮＡの存在または不存在を決定することによって同定することができる。いくつかの例において、選択的ｍＲＮＡスプライシングは、細胞の正常な機能であり得る。このような場合、正常な量（すなわち、疾患および状態のない患者における量）と比較して、選択的にスプライスされたｍＲＮＡの量（またはレベル）の増加または減少を用いて、疾患もしくは状態を診断または予後診断することができる。

【0308】

本発明は、患者におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の変化した量および／または選択的スプライシングに関連する疾患または状態を診断または予後診断する方法を提供する。本発明は、患者がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の変化した量および／または選択的スプライシングに関連する疾患または状態を有するまたは発症する危険性があるか否かを決定するための方法を提供する。各々の場合において、本方法は、本発明の方法を用いて、患者由来の試料中のｍＲＮＡの量および／または素性を決定することを含む。疾患または状態は、以下に検討されるもののいずれかであってもよい。疾患または状態は、好ましくは、嚢胞性線維症、家族性自律神経障害、前頭側頭葉性痴呆、筋萎縮性側索硬化症、ハッチンソン・ギルフォード・プロゲリア症候群、中鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）欠損症、筋緊張性ジストロフィー、プラダー・ウィリ症候群、脊髄性筋萎縮症、タウオパチー、高コレステロール血症または癌である。これらの疾患、それらの原因および可能な治療法は、Tazi et al. (Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, Volume 1792, Issue 1, January 2009, Pages 14-26)において検討されている。

【0309】

患者由来の試料中のｍＲＮＡの変化した（すなわち増加または減少した）量（またはレベル）の存在は、典型的には、疾患または状態を診断または予後診断し、すなわち、患者が疾患もしくは状態を有するまたはその発症の危険性があることを示す。患者由来の試料中のｍＲＮＡの変化した（すなわち増加または減少した）量（またはレベル）の不存在は、典型的には、患者が疾患もしくは状態ではないまたは発症する危険性がないことを示す。ｍＲＮＡの量は、上記で検討したように決定することができる。

【0310】

患者由来の試料中に選択的スプライスされたｍＲＮＡの存在は、典型的には、疾患または状態を診断または予後診断し、すなわち、患者が疾患または状態を有するまたはそれを発症する危険性があることを示す。患者由来の試料中に選択的スプライシングされたｍＲＮＡの不存在は、典型的には、患者は疾患もしくは状態がないまたはそれを発症する危険性がないことを示す。選択的スプライシングされたｍＲＮＡの存在または不存在は、上記で検討されたに試料中のＲＮＡを同定することによって決定することができる。

【0311】

患者由来の試料中の選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの量（もしくはレベル）の増加または減少は、典型的には、疾患または状態を診断または予後診断し、すなわち、患者が疾患もしくは状態を有するまたはそれを発症する危険性があることを示す。患者由来の試料中の選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの量の変化（疾患および状態がない患者の量またはレベルと比較して）は、典型的には、患者が疾患もしくは状態を有しないおよびそれを発症する危険性がないことを示す。選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの量は、上記で検討したように決定することができる。

【0312】

ｍｉＲＮＡは、好ましくは、疾患もしくは状態を診断または予後診断するために本発明において使用される。本発明は、ｍｉＲＮＡに関連する疾患または状態を診断または予後診断する方法を提供する。本発明は、患者がｍｉＲＮＡに関連付けられる疾患もしくは状態を有するまたはそれを発症する危険性があるかどうかを決定する方法を提供する。この方法は、本発明の方法を用いて患者由来の試料中のｍｉＲＮＡの存在または不存在を決定することを含む。疾患または状態は、以下に検討されるもののいずれかであり得る。

【0313】

患者由来の試料中のｍｉＲＮＡの存在は、典型的には、患者が疾患もしくは状態を有するまたはそれを発症する危険性があることを示す。患者由来の試料中のｍｉＲＮＡの不存在は、典型的には、患者が疾患もしくは状態を有しないまたはそれを発症する危険性がないことを示す。ｍｉＲＮＡの存在または不存在は、上記で検討したように試料中の任意のｍｉＲＮＡを同定することによって決定することができる。

【0314】

疾患または状態は、好ましくは、癌、冠状動脈性心疾患、心臓血管疾患または敗血症である。疾患または状態は、より好ましくは、腹部大動脈瘤、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性心筋梗塞、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、腺腫、副腎皮質癌、アルコール性肝疾患、アルツハイマー病、未分化甲状腺癌腫（ＡＴＣ）、不安障害、喘息、星状細胞腫、アトピー性皮膚炎、自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、心肥大、心筋症、心血管疾患、小脳神経変性、子宮頸癌、胆管癌、真性胸腺腫、絨毛癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性膵炎、結腸癌腫、結腸直腸癌、先天性心疾患、冠状動脈疾患、カウデン症候群、皮膚筋炎（ＤＭ）、糖尿病性腎症、下痢の主な過敏性腸症候群、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、拡張型心筋症、ダウン症候群（ＤＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、子宮内膜癌、子宮内膜性子宮内膜腺癌、子宮内膜症、上皮性卵巣癌、食道癌、食道扁平上皮癌、本態性血小板血症（ＥＴ）、顔面肩甲上腕筋肉ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、濾胞性甲状腺癌腫（ＦＴＣ）、前頭側頭型痴呆、胃癌（gastric cancer）（胃癌（stomach cancer））、膠芽細胞腫、多形性グリア芽腫（ＧＢＭ）、神経膠腫、糸球体疾患、糸球体硬化症、過誤麻痺、ＨＢＶ関連の肝硬変、ＨＣＶ感染、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、難聴、心臓病、心不全、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）、ヒラール胆管癌、ホジキンリンパ腫、ホモ接合性鎌状赤血球症（ＨｂＳＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、高血圧、下咽頭癌、封入体筋炎（ＩＢＭ）、インスリノーマ、肝臓内胆管癌（ＩＣＣ）、腎臓癌、腎臓病、喉頭がん、後期不眠症（睡眠病）、肺の平滑筋腫、白血病、四肢筋ジストロフィー２Ａ型（ＬＧＭＤ２Ａ）、脂肪腫、肺腺癌腫、肺癌、リンパ増殖性疾患、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫（ＭＭ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）髄芽細胞腫、メラノーマ、髄膜腫、代謝性疾患、ミヨシミオパチー（ＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、多発性硬化症、ＭＹＣ再編成リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、心筋梗塞、心筋傷害、筋腫、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、ネマリンミオパチー（ＮＭ）、腎炎、神経芽細胞腫（ＮＢ）、好中球減少症、ニーマン・ピック・タイプＣ（ＮＰＣ）病、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肥満、口腔癌肉腫卵巣癌（ＯＣ）、膵臓癌、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、膵臓新生物、パニック病、乳頭状甲状腺癌（ＰＴＣ）、パーキンソン病、ＰＦＶ−１感染、咽頭疾患、下垂体腺腫、多発性嚢胞腎疾患、多嚢胞性肝疾患、真性赤血球増加症（ＰＶ）、多発性筋炎（ＰＭ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性骨髄線維症、プリオン病、前立腺癌、乾癬性関節炎、乾癬、肺高血圧症、再発性卵巣癌、腎細胞癌、腎細胞癌、網膜色素変性（ＲＰ）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、リウマチ性心疾患および心房細動、関節リウマチ、肉腫、統合失調症、敗血症、漿液性卵巣癌、セザリー症候群、皮膚疾患、小細胞肺癌、脊髄小脳失調、扁平上皮癌、Ｔ細胞白血病、奇形癌、精巣胚細胞腫瘍、サラセミア、甲状腺癌、舌扁平上皮癌腫、トウレット症候群、２型糖尿病、子宮平滑筋腫（ＵＬＭ）、ブドウ状黒色腫、血管疾患、水疱性口内炎またはヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）である。

【0315】

患者は、上記で検討した哺乳動物のいずれかであってもよい。患者は、好ましくはヒトである。患者は個体である。

【0316】

試料は、上記で検討されたもののいずれかであってもよい。試料は、典型的には、任意の組織または体液由来である。試料は、典型的には、患者の体液および／または細胞を含み、例えば、口腔スワブなどのスワブを用いて得ることができる。試料は、血液、尿、唾液、皮膚、頬の細胞もしくは毛根の試料であってもよく、またはそれらに由来してもよい。標的ＲＮＡは、典型的には、本発明の方法において使用される前に、試料から抽出される。

【0317】

本方法は、患者における疾患または状態の診断、すなわち、患者が疾患または状態を有するか否かを決定することに関する。患者は症状があってもよい。

【0318】

本方法は、患者における疾患または状態を予後診断すること、すなわち、患者が疾患または状態を発症する可能性があるのか否かを決定することに関する。患者は症状がなくてもよい。患者は、疾患または状態に対する遺伝的素因を有してもよい。患者は、疾患または状態の一人以上の家族（単数または複数）を有してもよい。

【0319】

ＲＮＡポリヌクレオチドの移動を改善する方法
本発明はまた、ＤＮＡヘリカーゼ酵素によってその動きが制御されるとき、膜貫通孔に関して標的ＲＮＡポリヌクレオチドを移動させる方法であって、
ａ）（ｉ）ＲＮＡが非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むように修飾されているＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉ）ＤＮＡヘリカーゼ酵素を用意するステップ；
ｂ）ａ）において用意されたＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡヘリカーゼ酵素を膜貫通細孔と接触させて、ＤＮＡヘリカーゼが膜貫通細孔に対してＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するステップ
を含む方法を提供する。

【0320】

ＲＮＡポリヌクレオチドの修飾は、それに結合するＤＮＡヘリカーゼの増加をもたらす。修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドに結合するＤＮＡヘリカーゼの増加は、修飾されていないまたは非修飾のＲＮＡポリヌクレオチド、すなわち本発明の修飾方法に従って修飾されていないＲＮＡ、について観察されるＤＮＡヘリカーゼ結合の量またはレベルよりも大きく、またはそれより多いＤＮＡヘリカーゼ結合の量またはレベルとして定義される。ＤＮＡヘリカーゼの標的ＲＮＡポリヌクレオチドへの結合のレベルは、当業者に公知であり、慣習的である方法を用いて容易に試験することができる。

【0321】

好ましくは、ＤＮＡヘリカーゼ酵素は、非ＲＮＡポリヌクレオチドに予め結合される。また、上述される実施形態のいずれもこの方法に適用する。例えば、一実施形態において、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、（ｉ）５個以上の荷電単位のポリマー；（ｉｉ）長さが約２０ヌクレオチドのブロッキング鎖ハイブリダイゼーション部位；（ｉｉｉ）１つ以上の非ＲＮＡヌクレオチド、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、または５０個のヌクレオチドのＤＮＡ−ヘリカーゼ結合部位；（ｉｖ）参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３５８３８号パンフレットに記載されているＳｐ１８などの１個以上の単位、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上の単位の失速化学；（ｖ）長さが約３０ヌクレオチドのテザーハイブリダイゼーション部位；および／または（ｖｉ）前のセクションで説明したように、非ＲＮＡポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチドへのライゲーションを促進する配列、のうちの少なくとも１つを含んでもよい。

【0322】

実施例は、ナノ細孔を通るＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の移動を制御するためのＤＮＡヘリカーゼの使用をさらに示す。したがって、一実施形態において、細孔を通じて配列決定されるＲＮＡの能力または効率を増加させるための方法が本明細書に提供される。

【0323】

本発明の構築物を生成する方法
構築物を生成する方法は、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させることを含む。非ＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドはリボヌクレオチドではなく、すなわちＲＮＡ由来ではない。したがって、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つのリボヌクレオチド（またはＲＮＡヌクレオチド）を含み得るが、非ＲＮＡヌクレオチドまたは配列、すなわちＲＮＡではないヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列を追加的に含まなければならない（comprise）または含まなければならない（include）。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、上述される実施形態のいずれかを含んでもよい。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＤＮＡヘリカーゼ結合部位またはＤＮＡアダプターを含む。より好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはリーダー配列を含む。

【0324】

上記で検討したように、結合の部位および結合方法が選択される。好ましくは、結合方法は、化学的結合、共有結合、酵素的結合、ハイブリダイゼーション、合成法、またはトポイソメラーゼの使用から選択することができる。ＲＮＡポリヌクレオチドは、１つより多い、例えば２つまたは３つの点で非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合されてもよい。結合の方法は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれらを超える異なる結合方法を含むことができる。上述される結合方法の任意の組み合わせは、本発明に従って使用することができる。

【0325】

本方法は、構築物が、ＤＮＡヘリカーゼの制御下で、ナノ細孔を通り、制御された形で移動することができるか否かを決定することをさらに含んでもよい。これを試験するためのアッセイは、当業者に公知である。ナノ細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動が制御され得る場合、本発明の構築物が生成されている。ＲＮＡポリヌクレオチドの移動が制御できない場合、本発明の構築物は生成されていない。

【0326】

本発明の一実施形態において、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させることを含む、構築物を生成する方法は、接触ステップ（ｂ）の前に行う。別の実施形態において、非修飾形態のＲＮＡよりも高い効率で細孔を通じて配列決定され得る修飾されたＲＮＡを生成する方法が本明細書に提供される。

【0327】

本発明の修飾方法
本発明は、配列決定ためなどの特徴付けのために標的ＲＮＡポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドは、本発明に従って特徴付けられまたは配列決定される。これは、上記でより詳細に検討されている。

【0328】

この方法は、記載された方法の１つ以上を用いた、１つ以上の修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドの形成を伴う。１つ以上の修飾されたポリヌクレオチドは、特に鎖配列決定を使用して、非修飾ポリヌクレオチドよりも特徴付けが容易である。

【0329】

本発明の生成物／構築物
本発明はまた、本発明の修飾方法を用いて修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。標的ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドを非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させることにより修飾されて、本発明の構築物を形成する。標的ＲＮＡの改変は、すなわち、結合された非ＲＮＡポリヌクレオチドを伴わずに、ＤＮＡヘリカーゼと非修飾形態のＲＮＡポリヌクレオチドの間に生じる相互作用と比較すると、ＤＮＡヘリカーゼと修飾されたＲＮＡ構築物の間の相互作用の増加を必然的にもたらす。追加的にまたは代替的に、非ＲＮＡポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチドへの付加または結合は、すなわち、結合された非ＲＮＡポリヌクレオチドを伴わずに、非修飾形態のＲＮＡポリヌクレオチドに対するＤＮＡヘリカーゼの特異性と比較すると、修飾されたＲＮＡ構築物に対するＤＮＡヘリカーゼの特異性が増加することを意味する。追加的にまたは代替的に、すなわち、結合された非ＲＮＡポリヌクレオチドを伴わずに、ＤＮＡヘリカーゼと非修飾形態のＲＮＡポリヌクレオチドの間に生じる結合と比較して、非ＲＮＡポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチドへの付加または結合は促進され、および／または修飾されたＲＮＡ構築物に結合するＤＮＡヘリカーゼが増加することを意味する。追加的にまたは代替的に、非ＲＮＡポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチドの付加または結合は、すなわち、結合された非ＲＮＡポリヌクレオチドを伴わずに、ヘリカーゼと非修飾形態のＲＮＡポリヌクレオチドの間に生じる結合と比較して、修飾されたＲＮＡ構築物により効率的にまたはより強力に結合し、修飾された構築物から離れる可能性がより小さいことを意味する。

【0330】

非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡではない任意のポリヌクレオチドであり得る。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含んでもよいが、また、非ＲＮＡヌクレオチドまたは配列、すなわちＲＮＡではないヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列を追加的に含む必要がある。上記で検討したように、結合部位および結合方法が選択される。非ＲＮＡポリヌクレオチドは、予め結合されたＤＮＡヘリカーゼを含んでもよくまたは含まなくてもよい。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＤＮＡヘリカーゼが結合することができる領域（ＤＮＡヘリカーゼ結合部位）、またはＤＮＡアダプターを含む。より好ましくは、ＤＮＡヘリカーゼ結合部位またはＤＮＡアダプターは、優先的にナノ細孔に入り込むリーダー配列を含む。リーダー配列はまた、上記で検討したように標的ＲＮＡを１つ以上のアンカーに連結するために使用され得る。リーダー配列は、標的ＲＮＡポリヌクレオチドに連結されてもよい。

【0331】

本発明の構築物は、好ましくは、ＤＮＡヘリカーゼを使用してＭｓｐＡナノ細孔を通して移行させ得るＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖である。

【0332】

構築物は、ポリヌクレオチド鎖上のバーコード部分をさらに含み得る。ポリヌクレオチドのバーコードは当該技術分野において周知である（Kozarewa, I. et al., (2011), Methods Mol. Biol. 733, p279-298）。バーコードは、特定の公知の様式で細孔を流れる電流に影響を及ぼすポリヌクレオチドの特定の配列である。バーコード部分は、分析物の明白な同定を可能にする。好ましくは、バーコード部分は、リーダー配列とＤＮＡヘリカーゼ結合部位の間に位置される。

【0333】

アンカー、例えばＤＮＡアンカーは、上述されるＲＮＡポリヌクレオチドまたは非ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。ＤＮＡアンカーは、スペーサーおよびコレステロールをさらに含むことができる。

【0334】

ＲＮＡポリヌクレオチドは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを用いてさらに伸長させることができる。これは、ＲＮＡの全長が読み取られるのを確実にする。

【0335】

修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドは、本発明のどの修飾方法（単数または複数）が使用されるかに依存して種々の形態になり得る。可能な形態には、限定されないが、以下の１つ以上が含まれる：
−例えば、クリック化学を用いて、非ＲＮＡポリヌクレオチドに化学的に結合されたＲＮＡポリヌクレオチド
−非ＲＮＡポリヌクレオチドにライゲーションされたＲＮＡポリヌクレオチド
−架橋部分を有するまたは有しない非ＲＮＡリーダー配列にハイブリダイズしたＲＮＡポリヌクレオチド
−架橋部分を有するかまたは有しないｃＤＮＡ配列にハイブリダイズしたＲＮＡポリヌクレオチド
−トポイソメラーゼを用いて非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合されたＲＮＡポリヌクレオチド
−非ＲＮＡポリヌクレオチドの残りと反対方向に動くように、逆塩基を含む領域を有する非ＲＮＡポリヌクレオチドにライゲーションされたＲＮＡポリヌクレオチド。好ましくは、非ＲＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡポリヌクレオチドである。

【0336】

キット
本発明はまた、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットを提供する。このキットは、特徴付けのために任意の標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合するように適合されている非ＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

【0337】

好ましくは、特徴付けのために任意の標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合するように適合されている非ＲＮＡポリヌクレオチドは、結合した反応基、例えばクリック反応基を有する。結合した反応基を有する非ＲＮＡポリヌクレオチドは、最終的には、選択された任意の標的ＲＮＡポリヌクレオチドと反応して共有結合を形成するために、エンドユーザーによって使用され得る。好ましくは、標的ＲＮＡポリヌクレオチドはまた、結合した反応基、例えば、非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合した反応基と反応して共有結合を形成するクリック反応基を有する。

【0338】

あるいは、特徴付けのために任意の標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合するように適合されている非ＲＮＡポリヌクレオチドは、リガーゼとともに提供され、または選択された標的ＲＮＡポリヌクレオチドの任意の領域にハイブリダイズさせるためにエンドユーザーによって使用され得、ｃＤＮＡ合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドまたはプライマーである。

【0339】

あるいは、特徴付けのために任意の標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合するように適合されている非ＲＮＡポリヌクレオチドは、特定のＤＮＡポリヌクレオチドに結合したトポイソメラーゼを含む。トポイソメラーゼを結合させたＤＮＡは、最終的には、非ＲＮＡ（ＤＮＡ）ポリヌクレオチドを、選択された任意の標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合させるために、エンドユーザーによって使用され得る。エンドユーザーは、遊離５’ヒドロキシルを有するＲＮＡとともに、トポイソメラーゼを結合させたＤＮＡをインキュベートすることができる。次に、トポイソメラーゼは、ＲＮＡをＤＮＡに接続させる。

【0340】

あるいは、特徴付けのために任意の標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合するように適合されている非ＲＮＡポリヌクレオチドは、逆塩基を有する領域（例えば、逆塩基のＤＮＡ領域）を含む。この逆転領域は、逆配向に動く７−メチルグアノシンキャップの付加によって修飾された真核生物のＲＮＡの５’末端に結合することができる。

【0341】

本発明の方法を参照して上記で検討した実施形態のいずれも、キットに等しく適用される。本キットは、非ＲＮＡポリヌクレオチドに予め結合され得るＤＮＡヘリカーゼ結合タンパク質をさらに含み得る。キットは、脂質二重層などの両親媒性層を形成するのに必要とされるリン脂質などの細孔および膜の成分をさらに含むことができる。

【0342】

本発明のキットは、上記の実施形態のいずれかを実施することを可能にする１つ以上の他の試薬または器具を追加的に含んでもよい。このような試薬または器具は、以下の１つ以上を含む：適切な緩衝液（単数もしくは複数）（水溶液）、対象から試料を得るための手段（例えば、容器および針を含む器具）、上記で定義される膜、または電圧もしくはパッチクランプ装置。試薬は、流体試料が試薬を再懸濁するように、乾燥状態でキット中に存在し得る。キットはまた、場合により、本発明の方法においてキットを使用することができるようにするための説明書、またはどの患者が本方法を使用することができるかに関する詳細を含むことができる。キットは、典型的にはヌクレオチドを含む。キットは、好ましくは、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＣＭＰを含む。キットは、好ましくは、ポリヌクレオチドを増幅および／または発現する手段を含まない。

【0343】

以下の実施例は、本発明を例証する。

【実施例1】

【0344】

この実施例は、１）ＲＮＡ／ＤＮＡ鎖のＲＮＡ領域を伸長させ、２）アンカーをアニーリングさせ、３）酵素を結合させ、次に４）得られた鎖を電気生理学的実験において試験する、試料調製手法を示す。本実施例は、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖（ＲＮＡ鎖に結合させたＤＮＡリーダー、図３に示される）がＭｓｐＡナノ細孔を通り移動することを制御するために、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有し、次に（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）を使用することが可能であることを例証した。

【0345】

材料および方法
１．１ ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを用いたＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の３’末端の伸長
以下の表３に列挙される試薬を混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、この混合物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを１μＬの試料あたり１．８μＬのＳＰＲＩビーズの比で用いて精製された。この試料を試料１（ＤＮＡ／ＲＮＡ２）として示した。図４は、図中のＹと表示された広帯域が、可変的に伸長されたＤＮＡ／ＲＮＡ１に対応しているため、ポリメラーゼ伸長反応が成功したことを示す。

【0346】

【表3】

【0347】

１．２ アンカーアニーリング
以下の表４に列挙された試薬を混合し、６５℃でインキュベートし、次に０．１℃／秒の速度で４℃に冷却した。この試料を試料２として示した。

【0348】

【表4】

【0349】

１．３ ＤＮＡヘリカーゼを結合させる
試料２（０．２８μＬ）を緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＴ４Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（０．３６μＬ、３．８μＭ、突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、続いて（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）とともに室温で１時間インキュベートした。この試料を試料３として示した。

【0350】

１．４ 電気生理学
試料３を緩衝液（６００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、４６３ｍＭグリセロールの１２２１μＬ）に希釈した。ＭｇＣｌ_２（１３μＬ、１Ｍ）およびＡＴＰ（６５μＬ、１００ｍＭ）を試料３の緩衝液混合物に添加して、総容量１３００μＬとした。

【0351】

電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム ｐＨ 約８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一のＭｓｐＡナノ細孔から得られた。ブロックコポリマーに挿入された単一の細孔を達成した後、過剰のＭｓｐＡナノ細孔を除去するために、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０）をシステムに流した。

【0352】

過剰のＫＣｌ緩衝液（６００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ 約８、４６３ｍＭグリセロール）をシステムに流し、このＫＣｌ緩衝液を電極緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０）からアガロース架橋により分離した。

【0353】

実験を−１２０ｍＶで行い、ヘリカーゼによって制御されたＤＮＡの移動をモニターした。

【0354】

結果
試料３（ＤＮＡ／ＲＮＡ２の略画を図３に示す）をナノ細孔システムに添加したときに、ヘリカーゼによって制御されたＤＮＡの移動が観察された。試料３についてのヘリカーゼによって制御されたＤＮＡの移動の例を図５に示す。合成鎖の種々の領域は、鎖がナノ細孔を通り移行する間に同定された（領域１＝ポリ（ｄＴ）リーダー（配列番号１６）、領域２＝ｉＳｐＣ３スペーサー、領域３＝ＲＮＡ配列（配列番号１７）および領域４＝可変長ポリ（Ｕ）ＲＮＡ）。この実施例は、ＭｓｐＡナノ細孔を通るＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の移動（図３に示される略画）を制御するためにＤＮＡヘリカーゼを使用することが可能であることを示した。ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ伸長ステップは、ＲＮＡの全長が読み取られたことを確認した。

【実施例2】

【0355】

この実施例は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いたＤＮＡ鎖（配列番号２１）のＲＮＡ鎖（配列番号１９）へのライゲーションを示す。

【0356】

材料および方法
２．１ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いたＤＮＡ鎖のＲＮＡ鎖へのライゲーション
以下の表５に列挙された試薬を混合し、サーモサイクラー上に置いた。サーモサイクラーを以下の表６にあるプログラムに設定した。次に、試料を１４０Ｖで６０分間泳動させた、１０％ＰＡＧＥ ＴＢＥ−尿素変性ＢｉｏＲａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルを用いて分析した。

【0357】

【表5】

【0358】

【表6】

【0359】

結果
ＴＢＥ−尿素変性ゲルを用いて、ＣＹ３ ＤＮＡ（配列番号２１）のＲＮＡ（配列番号１９）へのライゲーションを分析した。図８のレーン２〜３は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの不存在下でＤＮＡスプリント（配列番号２０）の濃度を増加させたライゲーションステップの対照反応を示した。これらの対照反応について、領域ＡおよびＢのバンドは観察されず、これは、これらの条件下ではライゲーション反応が起こらなかったことを示した。レーン５〜８は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡスプリント（配列番号２０）の濃度を増加させたライゲーションステップを示した。レーン５〜８の全てについて、ハイブリダイズされたＤＮＡスプリントを含むライゲーションされた基質（Ａ）とハイブリダイズされたＤＮＡスプリントを含まないライゲーションされた基質（Ｂ）に対応する領域Ａと領域Ｂの両方にバンドを視認することができた。スプリントの濃度が増加するにつれて、バンドＡの強度もまた増加した。２つのさらなる対照反応を行い、レーン９および１０に示した。レーン９は、レーン５に示されたのと同じ試料に対応し、これは、ライゲーションステップ後に追加のＤＮＡスプリント（４．５×）を添加してさらに処理された。これは、レーン５と比較した場合、上側のバンド（スプリントをハイブリダイズさせたライゲーション生成物に対応する）の予測された強度の増加、および下側のバンドＢ（スプリントをハイブリダイズさせていないライゲーション生成物に対応する）の強度の減少を示した。レーン１０は、レーン６に示したものと同じ試料に対応し、これは、３７℃で３０分間、ＥｘｏＩでさらに処理された。ＥｘｏＩ処理中の加熱により、ライゲーションされた鎖とＤＮＡスプリントの分離が生じた。ＤＮＡスプライントは、３’ＤＮＡ末端を有するため、ＥｘｏＩによって優先的に消化された。これは、ＤＮＡスプライントがＥｘｏＩによって消化されたため、ＤＮＡスプライントにハイブリダイズしたライゲーション生成物に対応する領域Ａのバンドの消失をもたらした。領域Ｂのバンドは、ＥｘｏＩによる消化後、なおも視認された。これは、ＤＮＡがＲＮＡにライゲーションされていない場合、ライゲーションされていないＤＮＡがＥｘｏＩによって消化され、バンドが領域Ｂに視認されていないため、ライゲーションステップが成功したことを意味する。したがって、この実施例は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡをＲＮＡにライゲーションすることが可能であることを示した。

【実施例3】

【0360】

この実施例は、クリック化学を用いて、ＤＮＡ鎖をＲＮＡ鎖上に化学的に結合させる試料調製手法を示す。これは２つの異なる試料について行われ、その１つは、ゲル電気泳動を用いて化学的結合ステップを確認するために、ＤＮＡに結合された蛍光基を有した。次に、蛍光基が結合していないＤＮＡ／ＲＮＡ鎖を電気生理学実験において試験した。この実施例は、銅を介したクリック化学（構築物の略画を図１０に示す）により非ＲＮＡポリヌクレオチドに結合されたＲＮＡ鎖が、ＭｓｐＡまたはリセニンのナノ細孔を通り移動することを制御するために、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、続いて（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）を使用することが可能であることを例証した。

【0361】

材料および方法
３Ａ．１ ＲＮＡ Ｘ１へのＤＮＡ Ｘ１のクリック反応
ＲＮＡ Ｘ１、ＤＮＡ Ｘ１およびスプリントＸ１（以下の表７に列挙される）を緩衝液（ＴＲＩＳ−ＮａＣｌ（５００ｍＭ−２．５Ｍ）ｐＨ８）中で混合した。ＤＮＡ Ｘ１、ＲＮＡ Ｘ１およびスプリントＸ１をＰＣＲ装置でアニーリングした（５５℃に加熱し、４℃に０．１℃／秒で冷却するというプロトコル）。次に、ＣｕＳＯ_４、Ｔｒｉｓ（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチルアミン）およびアスコルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａ４０３４）をＤＮＡ Ｘ１／ＲＮＡ Ｘ１／スプリントＸ１混合物に添加し、次に、試料をサーモサイクラー上に置いた。サーモサイクラーを以下の表８にあるプログラムに設定した。その後、試料を１μＬの試料あたり１．８μｌのＳＰＲＩビーズの比でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを用いて精製した。この試料を試料３Ａ（ＤＮＡ／ＲＮＡ ３Ａ）として示した。次に、この試料を５％ＰＡＧＥ ＴＢＥ ＢｉｏＲａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル上でおよび以下の３．３に記載されるような電気生理学において分析した。

【0362】

【表7】

【0363】

【表8】

【0364】

３Ｂ．１ ＲＮＡ Ｘ１へのＤＮＡ Ｘ２のクリック反応
ＲＮＡ Ｘ１、ＤＮＡ Ｘ２およびスプリントＸ１（以下の表９に列挙される）を緩衝液（ＴＲＩＳまたはＭＯＰＳ（５００ｍＭ−２．５Ｍ）、ｐＨ６．８−７）中で混合した。ＤＮＡ Ｘ２、ＲＮＡ Ｘ１およびスプリントＸ１をＰＣＲ装置でアニーリングした（５５℃に加熱し、４℃に０．１℃／秒で冷却するというプロトコル）。次に、ＣｕＳＯ_４、Ｔｒｉｓ（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチルアミン）およびアスコルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａ４０３４）をＤＮＡ Ｘ２／ＲＮＡ Ｘ１／スプリントＸ１混合物に添加し、次に、試料をサーモサイクラー上に置いた。サーモサイクラーを以下の表１０にあるプログラムに設定した。その後、試料を１μＬの試料あたり１．８μｌのＳＰＲＩビーズの比でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを用いて精製した。この試料を試料３Ｂ（ＤＮＡ／ＲＮＡ ３Ｂ）として示した。次に、この試料を５％ＰＡＧＥ ＴＢＥ ＢｉｏＲａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル上で分析した。

【0365】

【表9】

【0366】

【表10】

【0367】

３．３ 電気生理学
実施例１に記載されるように、テザーを試料３Ａに対してアニーリングした（セクション１．２参照）。試料３Ａ（０．２８μｌ）およびＴ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（０．３６μＭ、３．８μＭ、突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、続く（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）を緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０の１２２１μＬ）に希釈した。ＭｇＣｌ_２（１３μＬ、１Ｍ）およびＡＴＰ（６５μＬ、１００ｍＭ）を試料３Ａの緩衝液混合物に添加して、総容量１３００μＬとした。

【0368】

電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム ｐＨ 約８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一のＭｓｐＡまたはリセニンナノ細孔から得られた。ブロックコポリマーに挿入された単一の細孔を達成した後、過剰のＭｓｐＡまたはリセニンナノ細孔を除去するために、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０）をシステムに流した。

【0369】

試料を添加する前に、過剰の緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム ｐＨ８．０）をシステムに流した。続いて、最後に、試料３Ａに結合したＴ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃをナノ細孔システムに添加し、実験を−１２０ｍＶで行い、ヘリカーゼによって制御されたＤＮＡ移動をモニターした。

【0370】

結果
ＴＢＥ−尿素変性ゲルを用いて、ＲＮＡ Ｘ１へのＤＮＡ（ＤＮＡ Ｘ１（その３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合した配列番号２２であって、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号２３の５’末端と結合し、配列番号２３は、３’末端に３アジドＮが結合している、配列番号２２）またはＤＮＡ Ｘ２（実施例３Ｂ、５’末端に結合したＣＹ３を有し、３’末端に結合した３アジドＮを有する配列番号２５））のクリック反応を分析した。実施例３Ｂにおいて使用されたＤＮＡは、結合されたＣｙ３基のためにＳＹＢＲ染色の前に視認された。図９のレーン３およびレーン９は、実施例３Ｂのクリック反応後に生成された試料を示した。レーン３の上部の蛍光バンド（図９において白いボックスで強調される）は、Ｃｙ３標識を有するＤＮＡがｍＲＮＡに結合していることを示した（ＤＮＡのみの蛍光バンドは矢印３であり、ｍＲＮＡに結合したＤＮＡは矢印１であった）。レーン２および８は、実施例３Ａ（ＤＮＡ上に蛍光基なし）におけるクリック反応後に生成された試料を示した。レーン１１のバンドは未反応ＤＮＡ（矢印２）に対応し、ｍＲＮＡに結合したＤＮＡは矢印１であった。したがって、このゲルは、クリック反応がｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｘ１）へのＤＮＡ（蛍光標識あり（Ｘ１）または蛍光標識なし（Ｘ２））の接続に成功したことを示した。

【0371】

試料３Ａ（ＤＮＡ／ＲＮＡ ３Ａの略画を図１０に示す）をナノ細孔システムに添加したときに、ヘリカーゼによって制御されたＲＮＡの移動が観察された。ＭｓｐＡを通る、ヘリカーゼによって制御されたＲＮＡ移動の例を図１１（領域２、３および４）に示し、リセニン変異体を通る移動を図２１に示す。図１１の鎖の種々の領域は、鎖がナノ細孔を通り移行する間に同定された。まとめると、領域２、３および４は、クリック反応によって標的ＲＮＡに反応したＤＮＡリーダーを表す（領域２＝４つのｉＳｐ１８スペーサーに接続された配列番号２２；領域３＝配列番号２３；領域４＝オープンリーディングフレームを有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ、配列番号２６、および^＊が付された矢印はクリック反応によって形成された連結を強調する）。領域１は、ＲＮＡ（配列番号２３に接続された４つのｉＳｐ１８スペーサーに接続された配列番号２２）と反応させなかったＤＮＡリーダーの別個のナノ細孔移行を示す。同様の特徴が、図２１のリセニン追跡について同定され得る。この実施例は、ＭｓｐＡまたはリセニンナノ細孔を通して、長いｍＲＮＡ鎖（図１０に示される略画）に非ＲＮＡポリヌクレオチド（配列番号２３に接続された４つのｉＳｐ１８スペーサーに接続された配列番号２２）を連結させることにより、長いｍＲＮＡがナノ細孔を通り移動することを制御するためにＤＮＡヘリカーゼを使用することができることを示した。

【実施例4】

【0372】

この実施例は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、続く、ヘアピン形成オリゴの３’末端からの逆転写を用いて、ＲＮＡ鎖（配列番号３０）の３’末端へのヘアピン形成オリゴ（３Ｔヘアピン＝その５’末端でリン酸基に結合し、その３’末端で４つのｉＳｐＣ３スペーサーに結合した配列番号２９であって、４つのｉＳｐＣ３スペーサーは反対側の末端で配列番号２７の５’末端と結合している、配列番号２９、または１０Ｔヘアピン＝その５’末端でリン酸基に結合し、その３’末端で４つのｉＳｐＣ３スペーサーに結合した配列番号２９であって、４つのｉＳｐＣ３スペーサーは反対側の末端で配列番号２８の５’末端と結合している、配列番号２９）のライゲーションを示す。このライゲーションおよび逆転写は、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ構築物を構成する方法を実証した（図１３を参照されたい）。

【0373】

ヘアピン形成オリゴ（３Ｔまたは１０Ｔヘアピンのいずれか）の３’末端でのポリＴオーバーハングは、ｍＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズし、効率的なＤＮＡによるＲＮＡライゲーションのためのスプリントとして働く。ヘアピンは、その後の逆転写のためのプライマーとして作用することができる。

【0374】

材料および方法
以下の表１１に列挙される試薬を混合し、サーモサイクラー上に置いた。サーモサイクラーを以下の表１２にあるプログラムに設定した。次に、この混合物は、１μＬの試料あたり１．８μＬのＳＰＲＩビーズの比でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを用いて精製された。精製後、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓスーパースクリプトＩＩを用いて逆転写を行った：表１３の試薬を製造業者のプロトコルに従って混合し、表１４にあるプログラムに設定されたサーモサイクラー上に置いた。続いて、試料を１４０Ｖで６０分間泳動させた、１０％ＰＡＧＥ ＴＢＥ−尿素変性ＢｉｏＲａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルを用いて分析した。

【0375】

【表11】

【0376】

【表12】

【0377】

【表13】

【0378】

【表14】

【0379】

結果
ＴＢＥ尿素変性ゲル（図１４参照）を使用して、３Ｔおよび１０Ｔヘアピンライゲーションおよび逆転写を分析した。レーン５において、３Ｔ−ヘアピンの部分ライゲーションは、ＲＮＡ鎖バンドの上方シフトの形態で視認された（配列番号３０、ＲＮＡ鎖は図１４のバンドＡとして表示される）。逆転写後（レーン６）、ＲＮＡ／ｃＤＮＡの二本鎖構築物（図１３に示される）が一本鎖ＲＮＡ（図１４においてバンドＡとして示される配列番号３０）よりも早く移動するという事実に起因して、バンドはＲＮＡ鎖（配列番号３０、図１４におけるバンドＡ）のレベル下回ってシフトした。レーン７において、１０Ｔヘアピンのライゲーションはほぼ１００％の効率で生じ、一本鎖ＲＮＡ鎖（図１４においてバンドＡとして示された配列番号３０）のレベルを上回って単一バンドとして視認された。レーン８は、逆転写後、１０Ｔヘアピンによりプライミングされた試料を示し、ここで、ライゲーションされた、逆転写された生成物は、一本鎖ＲＮＡバンド（図１４においてバンドＡとして示された配列番号３０）を下回って下方にシフトした。レーン９（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを含まない反応混合物）のハイブリダイゼーション対照試料は、一本鎖ＲＮＡ（図１４においてバンドＡとして示された配列番号３０）のレベルで視認され、結合された生成物についてのみシフトが観察されたことを示した。

【実施例5】

【0380】

この実施例は、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ構築物が電気生理学実験においてどのように分析されたかを示す。ＲＮＡ／ｃＤＮＡ構築物を得るために、１０Ｔヘアピン（その５’末端でリン酸基に結合し、その３’末端で４つのｉＳｐＣ３スペーサーに結合した配列番号２９であって、４つのｉＳｐＣ３スペーサーは反対側の末端で配列番号２８の５’末端と結合している、配列番号２９）は、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）の３’末端にライゲーションされた。ライゲーション前に、クリック化学を使用して、実施例３に記載されるように、アジドを有するＤＮＡ（その３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合した配列番号２２であって、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号２３の５’末端と結合し、配列番号２３は、３’末端に３アジドＮが結合している、配列番号２２）を５’−ヘキシニル−Ｇを有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＲＮＡ Ｘ１、最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）の５’末端に結合させた。ヘアピンライゲーション後、逆転写を行った。

【0381】

材料および方法
クリック反応
５’−ヘキシニル−Ｇを有するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（最も５’のヌクレオチドとして５’−ヘキシニル−Ｇを有し、３’ポリＡテールを有する配列番号２６のオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ）のＲＮＡは、実施例３Ｂのクリック反応に記載されるように、アジドを有するＤＮＡ（ＤＮＡ Ｘ１、その３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合した配列番号２２であって、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号２３の５’末端と結合し、配列番号２３は、３’末端に３アジドＮが結合している、配列番号２２）にライゲーションされた。この試料を試料３Ｂとして示した。

【0382】

ヘアピンライゲーションおよびＲＴ
次に、実施例４に記載されるように、試料３Ｂ（ＤＮＡ／ＲＮＡ ３Ｂ）を１０Ｔヘアピンにライゲーションし、逆転写した。試薬の体積および量を以下の表１５および１７に示し、熱サイクル条件を表１６および表１８に示す。ライゲーション／逆転写後に生成された試料を試料５Ｂとして示した。試料構築物の略画を図１５に示す。

【0383】

【表15】

【0384】

【表16】

【0385】

【表17】

【0386】

【表18】

【0387】

電気生理学
１に記載されるように、テザーを試料５Ｂに対してアニーリングした（セクション１．２参照）。試料５Ｂ（４μｌ）およびＴ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（０．３６μｌ、３．８μＭ、突然変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、続く（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号１４）を緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０の１２２１μＬ）に希釈した。ＭｇＣｌ_２（１３μＬ、１Ｍ）およびＡＴＰ（６５μＬ、１００ｍＭ）を試料５Ｂ（ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｃＤＮＡ ５Ｂ）の緩衝液混合物に添加して、総容量１３００μＬとした。

【0388】

電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム ｐＨ 約８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一のＭｓｐＡまたはＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）９（突然変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有する配列番号４４、ここで、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）は配列番号４５であり、Ｃ末端で結合される）ナノ細孔から得られたブロックコポリマーに挿入された単一の細孔を達成した後、次に、過剰のＭｓｐＡまたはＣｓｇＧナノ細孔を除去するために、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０）をシステムに流した。

【0389】

過剰の緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ８．０）を試料の添加前にシステム内に流した。次に、最後に、試料５Ｂ（ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｃＤＮＡ ５Ｂ）に結合したＴ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃをナノ細孔システムに添加し、実験を−１４０ｍＶで行い、ヘリカーゼによって制御されたＤＮＡ移動をモニターした。

【0390】

結果
試料５Ｂをナノ細孔システムに添加すると、ヘリカーゼによって制御されたＤＮＡ／ＲＮＡ／ｃＤＮＡ移動が観察された。ヘリカーゼによって制御されたＤＮＡ／ＲＮＡ／ｃＤＮＡの移動事象の一例をＭｓｐＡについては図１６（領域１〜５）に、またはＣｓｇＧについては図２２に示す。図１６中の鎖の種々の領域は、鎖がナノ細孔を通り移行する間に同定された；領域１は、クリック反応によって標的ＲＮＡに反応した非ＲＮＡポリヌクレオチドを表す；領域２＝ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ；領域３＝ｍＲＮＡにライゲーションされた１０Ｔヘアピンに存在するｉＳｐＣ３スペーサー；領域４＝ｍＲＮＡにライゲーションされた１０ＴヘアピンのポリＴ領域；領域５＝ｍＲＮＡの逆転写によって生成されたｃＤＮＡ。類似の特徴は、図２２のＣｓｇＧ追跡において同定することができる。この実施例は、ＭｓｐＡまたはＣｓｇＧナノ細孔を通る、鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｃＤＮＡ（ＤＮＡ鎖をｍＲＮＡ鎖にライゲーションし、ヘアピンをそのｍＲＮＡ鎖にライゲーションし、ヘアピンを用いて、ｍＲＮＡを逆転写することによって形成される）（図１５に示される略画）の移動を制御するためにＤＮＡヘリカーゼを使用することが可能であることを示した。

【実施例6】

【0391】

この実施例は、非ＲＮＡポリヌクレオチドが、ライゲーション前にキャップを除去することによって、５’メチルグアノシンキャップ（いくつかの天然の細胞性ｍＲＮＡに相同である）を有するＲＮＡ鎖にどのように結合され得るかを示す。この場合において、キャップされたＲＮＡ鎖（５’から５’への三リン酸結合によって鎖の５’末端にライゲーションされた７−メチルグアノシンキャップを有する配列番号３０）を使用し、次に、ＲＮＡ５’ピロホスホヒドラーゼ（ＲｐｐＨ）を用いてデカップリングし、その後、非ＲＮＡポリヌクレオチド（配列番号３１の５’末端に結合した３０ＳｐＣ３スペーサーであって、配列番号３１はその３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合し、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号３２の５’末端と結合し、配列番号３２は３’末端で４つの５−ニトロインドールに結合し、４つの５−ニトロインドールは反対側の末端でＲＮＡ配列ＣＡＡＧＧＧと結合している、３０ＳｐＣ３スペーサー）にライゲーションされた。

【0392】

材料および方法
キャップされたＲＮＡ鎖（５’から５’への三リン酸結合によって鎖の５’末端に連結された７−メチルグアノシンキャップを有する配列番号３０）の５’末端に非ＲＮＡポリヌクレオチドをライゲーションするために、デキャッピング酵素としてＲｐｐＨを用いて、ｍＲＮＡを最初にデキャッピングした。表１９に列挙された試薬を混合し、次に、反応混合物を表２０にあるプログラムに設定したサーモサイクラー上に置いた。その後、得られた反応混合物は、１μＬの試料あたり１．８μＬＳＰＲＩビーズの比でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを用いて生成された。続いて、非ＲＮＡポリヌクレオチド（配列番号３１の５’末端に結合した３０ＳｐＣ３スペーサーであって、配列番号３１はその３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合し、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号３２の５’末端と結合し、配列番号３２は３’末端で４つの５−ニトロインドールに結合し、４つの５−ニトロインドールは反対側の末端でＲＮＡ配列ＣＡＡＧＧＧと結合している、３０ＳｐＣ３スペーサー）は、表２１に列挙された試薬を混合し、表２２にあるプログラムに設定されたサーモサイクラー上に混合物を置くことによってＲＮＡにライゲーションされた。次に、試料混合物を１４０Ｖで６０分間泳動させた、５％ＰＡＧＥ ＴＢＥ−尿素変性ＢｉｏＲａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルを用いて分析した。

【0393】

【表19】

【0394】

【表20】

【0395】

【表21】

【0396】

【表22】

【0397】

結果
ＴＢＥ−尿素変性ゲル（図１７参照）を使用して、ＲＮＡ鎖（配列番号３０）のデキャッピング、その後の非ＲＮＡポリヌクレオチド（配列番号３１の５’末端に結合した３０ＳｐＣ３スペーサーであって、配列番号３１はその３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合し、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号３２の５’末端と結合し、配列番号３２は３’末端で４つの５−ニトロインドールに結合し、４つの５−ニトロインドールは反対側の末端でＲＮＡ配列ＣＡＡＧＧＧと結合している、３０ＳｐＣ３スペーサー）とのライゲーションの成功を分析した。図１７のレーン４は、ＲＮＡ鎖（配列番号３０、レーン２に示され、Ａと表示された対照）のレベルより上に観察された追加のバンド（Ｃと表示される）を示し、これは、非ＲＮＡポリヌクレオチド（配列番号３１の５’末端に結合した３０ＳｐＣ３スペーサーであって、配列番号３１はその３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合し、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号３２の５’末端と結合し、配列番号３２は３’末端で４つの５−ニトロインドールに結合し、４つの５−ニトロインドールは反対側の末端でＲＮＡ配列ＣＡＡＧＧＧと結合している、３０ＳｐＣ３スペーサー）の成功したライゲーションが、約４０％の効率で生じたことを示した。

【実施例7】

【0398】

この実施例は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から抽出された細胞性ｍＲＮＡからどのように２Ｄ（ＲＮＡセンスおよびＤＮＡアンチセンス）ライブラリーを調製して、ナノ細孔を通る、天然サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のｍＲＮＡ鎖の、ＤＮＡヘリカーゼによって制御された移動を可能にするのかを示す。

【0399】

材料および方法
２Ｄ（ＲＮＡセンスおよびＤＮＡアンチセンス）ライブラリーは、ｍＲＮＡの３’末端にヘアピンをライゲーションし、ｍＲＮＡの５’末端をデキャッピングし、逆転写してＤＮＡ相補体を作出し、ｍＲＮＡの５’末端に非ＲＮＡポリヌクレオチドをライゲーションさせることによって、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から抽出された細胞性ｍＲＮＡから調製された。

【0400】

３’ヘアピンをライゲーションする
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のポリＡ＋ｍＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ｍＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズするヘアピンは、以下の表２３に示される試薬を混合し、下記の表２４に示されるプログラムを具備するサーモサイクラーに混合物を入れることによってｍＲＮＡにライゲーションされた。次に、１μＬの試料あたり１．８μＬのＳＰＲＩビーズの比でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを用いて混合物を精製し、１６μｌのＮＦ Ｈ_２Ｏ中に溶出させた。

【0401】

【表23】

【0402】

【表24】

【0403】

デキャッピング
５’から５’への三リン酸結合を介して５’末端に連結された７−メチルグアノシンキャップを有するＲＮＡ鎖（配列番号３０）の５’末端に非ＲＮＡポリヌクレオチドをライゲーションさせる前に、ＲＮＡ−５’−ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）によってキャップを酵素的に除去した。デキャッピングは、以下の表２５の試薬を混合し、以下の表２６にあるプログラムに設定されたサーモサイクラーに混合物を入れることによって達成された。次に、得られた反応混合物は、１μＬの試料あたり１．８μＬのＳＰＲＩビーズの比でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを用いて精製され、１２μｌのＮＦ Ｈ_２Ｏに溶出させた。

【0404】

【表25】

【0405】

【表26】

【0406】

ＲＴ
デキャッピング後、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓスーパースクリプトＩＩを用いて逆転写を行った。以下の表２７の試薬を製造業者のプロトコルに従って混合し、表２８のプログラムに設定したサーモサイクラー上に置いた。

【0407】

【表27】

【0408】

【表28】

【0409】

次に、この混合物は、１μＬの試料あたり１．８μＬのＳＰＲＩビーズの比でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを用いて精製され、１０μｌのＮＦ Ｈ_２Ｏに溶出させた。

【0410】

非ＲＮＡポリヌクレオチドライゲーション
非ＲＮＡポリヌクレオチド（配列番号３１の５’末端に結合した３０ＳｐＣ３スペーサーであって、配列番号３１はその３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合し、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号３２の５’末端と結合し、配列番号３２は３’末端で４つの５−ニトロインドールに結合し、４つの５−ニトロインドールは反対側の末端でＲＮＡ配列ＣＡＡＧＧＧと結合している、３０ＳｐＣ３スペーサー）は、表２９に列挙された試薬を混合し、表３０にあるプログラムに設定されたサーモサイクラー上に混合物を置くことによって、逆転写されたｍＲＮＡにライゲーションされた。非ＲＮＡポリヌクレオチドライゲーション後に生成された試料を試料７Ａとして示した。

【0411】

５’リーダーを以下によってライゲーションした。

【0412】

【表29】

【0413】

【表30】

【0414】

ヘアピン精製
試料ＥＸは、配列特異的テザーおよびＬｉｆｅｔｅｃｈ ＭｙＯｎｅ Ｃ１ストレプトアビジンビーズを介して、リガーゼおよび未反応成分から精製された。

【0415】

試料７Ａは、１．２５μｌの１００μＭテザーを３０μｌの試料７Ａおよび８．７５μｌのＮＦ Ｈ_２Ｏと混合し、１５分間室温で混合物をインキュベートすることによって、テザー（／５ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ／ＴＴ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／（配列番号６５）／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＴＴ／３ ＣｈｏｌＴＥＧ／）にハイブリダイズさせた。

【0416】

磁気ラックを使用して、２０μｌのＭｙＯｎｅ Ｃ１ストレプトアビジンビーズを２００μｌの１×結合および洗浄緩衝液（Ｂ＆Ｗ緩衝液）を用いて、製造者によって明記されるように洗浄し、次に４０μｌの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液に再懸濁した。

【0417】

Ｌｉｆｅｔｅｃｈにより明記された２×Ｂ＆Ｗ緩衝液
１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ
２Ｍ ＮａＣｌ

【0418】

４０μｌのテザード試料７Ａを４０μｌのストレプトアビジンビーズに添加し、ローラー上で１５分間インキュベートした。次に、この溶液を磁気ラック上に置き、製造者の指示に従って１×Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄した。

【0419】

ビーズにＨ_２Ｏ中の１３３μＭビオチンの１５μＬを添加し、３７℃で１０分間加熱することにより、試料をストレプトアビジンビーズから溶出させた。チューブを直ちに磁気ラック上に置き、上清をビーズから除去した。この生成物は精製試料であり、試料７Ｂとして示された。

【0420】

電気生理学
試料７Ｂ（９μｌ）は、３μｌの（１μＭテザリングオリゴ（配列番号６６／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＴＴ／３ＣｈｏｌＴＥＧ／）、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７、および５ｍＭ ＥＤＴＡ）を混合し、混合物を室温で２０分間インキュベートすることによりテザリングオリゴにハイブリダイズした。

【0421】

次に、このテザード試料７Ｂを２μｌの１７．４μＭ Ｔ４ Ｄｄａ（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ、続いて（ΔＭ）Ｇ１を有する配列番号８））とともに１５分間インキュベートした。次に、２．１μｌの８００μＭ ＴＭＡＤは、インキュベートされた混合物に添加され、室温で１０分間維持された。その後、この試料を緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０の２８２μＬ）に希釈し、２μｌの（７０μＭ ＡＴＰおよび７５μＭ ＭｇＣｌ_２）と混合した。

【0422】

電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム ｐＨ 約８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一のＭｓｐＡナノ細孔から得られた。ブロックコポリマーに挿入された単一の細孔を達成した後、次に、いずれもの過剰のＭｓｐＡナノ細孔を除去するために、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０）をシステムに流した。

【0423】

試料の添加前に、過剰の緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０）をシステムに流した。次に、最後に、試料３Ａに結合したＴ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃをナノ細孔システムに添加し、実験を−１２０ｍＶで行い、ヘリカーゼによって制御されたＤＮＡ移動をモニターした。

【0424】

結果
図１９は、試料７Ｂを添加した場合の単一のナノ細孔からのイオン電流記録を示す。電気生理学実験は、様々な長さの２Ｄ鎖（異なる天然の細胞性ｍＲＮＡ転写物の長さに対応する）を用いて、良好なスループットを示した。図１９はまた、ＲＮＡがＤＮＡに対して異なる平均振幅および範囲を有することを実証する。したがって、ＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列が同じ場合でさえ、平均振幅および範囲の関数として、ＲＮＡおよびＤＮＡを互いに区別することができる。

【実施例8】

【0425】

本実施例は、ＤＮＡヘリカーゼ、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ（突然変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号８）がロードされ、続いて、ヘリカーゼにより制御されてＲＮＡが細孔を通り移動することを促進にするために、ＤＮＡ含有リーダーがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にどのように結合されるのかを示す。１．９ｋｂのｍＲＮＡをＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。ＤＮＡ含有リーダーをｍＲＮＡの３’末端にライゲーションした。次に、Ｈｅｌ３０８は、リーダー中のＤＮＡ結合部位にロードされ、基質は細孔によって分析された。

【0426】

材料および方法
いくつかのオリゴと予めアニーリングされたＤＮＡ含有リーダー（その３’末端で４つのｉＳｐ１８スペーサーに結合した配列番号３５（５’リン酸を有する）であって、４つのｉＳｐ１８スペーサーは反対側の末端で配列番号３６の５’末端と結合し、配列番号３６はその５’末端で３０個のｉＳｐＣ３スペーサーに結合している、配列番号３５は、配列番号３７、３８および３９（３’コレステロールＴＥＧを有する）とアニーリングされた）は、表３１に列挙された試薬と混合し、表３２におけるプログラムに設定されたサーモサイクラー上に混合物を置くことによって、ｍＲＡＮにライゲーションされた。

【0427】

【表31】

【0428】

【表32】

【0429】

次に、この混合物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを、１μＬの試料あたり１．８μＬのＳＰＲＩビーズの比で精製された。

【0430】

逆転写
スーパースクリプトＩＩキットを用いて、表３３に列記された試薬を混合し、表３４のプログラムに設定されたサーモサイクラーに混合物を置くことにより、試料を逆転写した。

【0431】

【表33】

【0432】

【表34】

【0433】

次に、この混合物は、１μＬの試料あたり１．８μＬのＳＰＲＩビーズの比でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズを用いて精製された。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ（突然変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号８）は、７ｋｄａ Ｚｅｂａカラムを用いて、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１００ｍＭ ＫＡｃに緩衝液交換した。逆転写されたＲＮＡ試料は、等容量の１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８、２００ｍＭ ＫＡｃと混合し、次に、１：１００のモル比でＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃと混合し、１００ｍＭ ＫＰｈｏｓ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴＷＥＥＮに緩衝液交換された。ＤＭＦに溶解させた２０ｍＭ ＢＭＯＥは、１００ｍＭ ＫＰｈｏｓ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴＷＥＥＮに５ｍＭの濃度になるように添加された。この５ｍＭのＢＭＯＥ溶液は、ＲＮＡとＨｅｌ３０８の混合物に添加して、最終濃度４０μＭ ＢＭＯＥとした。この溶液を室温で２時間インキュベートした。次に、溶液を試料１μＬあたり１．８μＬ ＳＰＲＩビーズの比でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩビーズに結合させた。ＥｔＯＨ混合物でＳＰＲＩビーズを洗浄する代わりに、２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓの修飾された洗浄緩衝液による一回洗浄を使用した。試料を３０μｌの５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８中で溶出させた。これは、試料６として知られた。

【0434】

電気生理学
試料６（４μｌ）を緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム ｐＨ８、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２９５μｌ）と混合した。

【0435】

電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ 約８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一のＭｓｐＡナノ細孔から得られた。ブロックコポリマーに挿入された単一の細孔を達成した後、次に、過剰のＭｓｐＡナノ細孔を除去するために、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０）をシステムに流した。

【0436】

試料６を添加する前に、過剰の緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム ｐＨ８．０）をシステムに流した。最後に、試料６を細孔システムに添加し、実験を−１４０ｍＶで行い、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動をモニターした。

【0437】

結果
この実施例は、ＤＮＡヘリカーゼ、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ（突然変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号８）がロードされることを容易にするためにＤＮＡ含有リーダーがどのようにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合され、次に、ＲＮＡのヘリカーゼ制御の移動がどのように観察されたのかを示す。ヘリカーゼ制御されたＲＮＡ移動の例を図２０に示す。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるための方法であって、
ａ）（ｉ）非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むように修飾されているＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉ）ＤＮＡヘリカーゼ酵素を用意するステップ；
ｂ）ａ）において用意された前記ＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡヘリカーゼ酵素を膜貫通細孔と接触させて、前記ＤＮＡヘリカーゼが前記膜貫通細孔を通るＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するステップ；
ｃ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドが膜貫通細孔に対して移動する間に１つ以上の測定値を得るステップであって、前記測定値は、前記ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示し、それによって前記標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるステップ
を含む方法。
２．前記非ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＤＮＡヘリカーゼ結合部位またはＤＮＡアダプターを含む、上記１に記載の方法。
３．前記ＤＮＡヘリカーゼ結合部位または前記ＤＮＡアダプターがリーダー配列を含む、上記２に記載の方法。
４．前記リーダー配列が優先的に前記細孔に入り込む、上記３に記載の方法。
５．前記非ＲＮＡポリヌクレオチドが、前記ＲＮＡポリヌクレオチドと前記非ＲＮＡポリヌクレオチドのそれぞれの少なくとも１つの反応性基の間に形成される共有結合によって前記ＲＮＡポリヌクレオチドに結合される、上記１〜４のいずれかに記載の方法。
６．前記非ＲＮＡポリヌクレオチドが、化学的または酵素的ライゲーションによって前記ＲＮＡポリヌクレオチドにライゲーションされる、上記１〜４のいずれかに記載の方法。
７．前記非ＲＮＡポリヌクレオチドが前記ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされる、上記１〜４のいずれかに記載の方法。
８．前記１つ以上の特徴が、（ｉ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの素性、（ｉｉｉ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）前記ＲＮＡポリヌクレオチドが修飾されているかどうか、から選択される、上記１〜７のいずれかに記載の方法。
９．前記ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴が、電気的測定および／または光学的測定によって測定される、上記１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．ステップｃ）が、前記ＲＮＡポリヌクレオチドが膜貫通細孔に対して移動する間に膜貫通細孔を通過する電流を測定するステップであって、前記電流は、前記ＲＮＡポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示し、それによって前記ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるステップを含む、上記１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、メチル化による、酸化による、損傷による、１つ以上のタンパク質を用いたまたは１つ以上の標識、タグもしくはスペーサーを用いた修飾を含む、上記１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、１つ以上のアンカーを用いて前記膜にカップリングされる、上記１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１３．前記ＤＮＡヘリカーゼが、ポリヌクレオチド結合ドメインの開口部のサイズを減少させるための修飾を含み、前記開口部を通って、少なくとも１つの立体配座状態で、ＲＮＡポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離することができる、上記１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．前記移動が、一連の１つ以上のＤＮＡヘリカーゼによって制御される、上記１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記１つ以上のヘリカーゼが、ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはＤｄａヘリカーゼ；（ｂ）（ａ）のヘリカーゼのいずれかに由来するヘリカーゼ；ならびに（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）のヘリカーゼのいずれかの組み合わせである、上記１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．ヘリカーゼに由来し、前記ポリヌクレオチドに結合するが、ヘリカーゼとして機能しないように修飾されている１つ以上の分子ブレーキをさらに含む、上記１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記膜貫通細孔がタンパク質細孔または固体状態細孔である、上記１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．前記膜貫通タンパク質細孔がタンパク質細孔であり、溶血素、ロイコシジン、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、ＣｓｇＧ、リセニン、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来である、上記１７に記載の方法。
１９．移動がＤＮＡヘリカーゼ酵素によって制御されるとき、膜貫通細孔に対して標的ＲＮＡポリヌクレオチドを移動させる方法であって、
ａ）（ｉ）非ＲＮＡポリヌクレオチドを含むように修飾されているＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｉ）ＤＮＡヘリカーゼ酵素を用意するステップ；
ｂ）ａ）において用意された前記ＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡヘリカーゼ酵素を膜貫通細孔と接触させて、前記ＤＮＡヘリカーゼが前記膜貫通細孔に対して前記ＲＮＡポリヌクレオチドの移動を制御するステップ
を含む方法。
２０．ステップ（ｂ）の前に、前記ＤＮＡヘリカーゼ酵素を、前記修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドに結合させるステップを含む、上記１９に記載の方法。
２１．前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ＤＮＡヘリカーゼ結合部位またはＤＮＡアダプターを含むように修飾されている、上記１９または２０に記載の方法。
２２．前記膜貫通細孔に対する前記ＲＮＡポリヌクレオチドのより一貫した移動を提供する、上記１９〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．ＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、前記ＤＮＡポリヌクレオチドがＤＮＡヘリカーゼ結合部位を含むまたはそれだけを含む、ポリヌクレオチド。
２４．ナノ細孔に優先的に入り込むリーダー配列をさらに含む、上記２３に記載のポリヌクレオチド。
２５．ポリヌクレオチド鎖上にバーコード部分をさらに含む、上記２３または２４に記載のポリヌクレオチド。
２６．バーコード部分が、前記リーダー配列と前記ＤＮＡヘリカーゼ結合部位の間に位置される、上記２５に記載のポリヌクレオチド。
２７．ＲＮＡポリヌクレオチドとＤＮＡヘリカーゼの組み合わせであって、前記ＲＮＡポリヌクレオチドの一部が、非ＲＮＡポリヌクレオチドを含み、前記ＤＮＡヘリカーゼと相互作用するように修飾されている、組み合わせ。
２８．特徴付けのために任意の標的ＲＮＡポリヌクレオチドに結合するように適合されている非ＲＮＡポリヌクレオチドを含む、標的ＲＮＡポリヌクレオチドを特徴付けるためのキット。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]