特許 6826105 ５−アミノレブリン酸がコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6826105

(24)【登録日】2021年1月18日

(45)【発行日】2021年2月3日

(54)【発明の名称】５−アミノレブリン酸がコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/197 20060101AFI20210121BHJP

   C09K 11/08 20060101ALI20210121BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20210121BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20210121BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20210121BHJP

   A61K 41/00 20200101ALI20210121BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210121BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210121BHJP

   A61K 31/221 20060101ALI20210121BHJP

   A61K 31/341 20060101ALI20210121BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20210121BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/197

   C09K11/08 GZNM

   A61K47/02

   A61K47/18

   A61K47/62

   A61K41/00

   A61P35/00

   A61P43/00 123

   A61K31/221

   A61K31/341

   A61K49/00

【請求項の数】9

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2018-508735(P2018-508735)

(86)(22)【出願日】2016年8月17日

(65)【公表番号】特表2018-525401(P2018-525401A)

(43)【公表日】2018年9月6日

(86)【国際出願番号】GB2016052548

(87)【国際公開番号】WO2017029501

(87)【国際公開日】20170223

【審査請求日】2018年4月16日

(31)【優先権主張番号】62/205,998

(32)【優先日】2015年8月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509295262

【氏名又は名称】ナノコ テクノロジーズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001438

【氏名又は名称】特許業務法人 丸山国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ナーサニ，イマド

【審査官】 飯濱 翔太郎

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／１０１７７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００７０４４３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１２７２２４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／００４４７９１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０２３０９９４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１８３５０４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０２２０１４３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 NANOMEDICINE，２００８年１１月２４日，Vol.3, No.6，抄録,DOI:10.2217/17435889.3.6.777

【文献】 RCS Adv.，２０１６年，Vol.6，pp.55568-55576

【文献】 The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，２００６年，Vol.38，pp.1530-1539

【文献】 Gastroenterology，２０１３年 ５月，Vol.144, Issue5, Supplement 1，p.S-516，Su1948

【文献】 PROCEEDINGS OF SPIE，２０１４年 ８月２７日，Vol.9166，916612-1〜916612-18，DOI:10.1117/12.2060342

【文献】 PROGRESS IN BIOMEDICAL OPTICS AND IMAGING，２０１５年 ２月 ９日，Vol.9338，p.933813-1〜933813-5，DOI:10.1117/12.2084821

【文献】 Chem.Commun.，２０１３年，Vol.49，pp.8934-8936

【文献】 Phys.Chem.Chem.Phys.，２０１５年 ２月２８日，Vol.17，pp.5973-5981

【文献】 Photodiagnosis and Photodynamic Therapy，２０１３年，Vol.10，pp.382-388

【文献】 Photodiagnosis and Photodynamic Therapy，２０１１年，Vol.8，pp.14-29

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ４１／００−４１／１７

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

Ａ６１Ｐ ３５／００−３５／７６８

Ｃ０９Ｋ １１／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数の官能化量子ドットナノ粒子であって、
各々が、分子クラスター化合物と、半導体材料と、外側有機コロナ層と、を含む量子ドットナノ粒子と、
前記外側有機コロナ層に結合された標的リガンドと、
前記標的リガンドにコンジュゲートされた複数のアルキル連結基と、
アミド結合又はエステル結合を介して、前記複数のアルキル連結基に共有結合された、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）、５−ＡＬＡ誘導体、又はこれらの塩類と、を含み、
前記５−ＡＬＡ誘導体が、５−ＡＬＡメチルエステル（アミノレブリン酸メチル）、５−ＡＬＡエチルエステル、５−ＡＬＡプロピルエステル、５−ＡＬＡブチルエステル、５−ＡＬＡペンチルエステル、５−ＡＬＡヘキシルエステル（アミノレブリン酸ヘキシル）、５−ＡＬＡオクチルエステル、５−ＡＬＡ（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラニルエステル、及び５−ＡＬＡポリエチレングリコールからなる群の１つ又は２つ以上から選択される、複数の官能化量子ドットナノ粒子。

【請求項2】

前記官能化量子ドットナノ粒子が、コア−シェルナノ粒子、合金化ナノ粒子又はそれらの組合せである、請求項１の複数の官能化量子ドットナノ粒子。

【請求項3】

前記標的リガンドは、癌細胞への結合に特異的な組織特異性リガンドである、請求項１の複数の官能化量子ドットナノ粒子。

【請求項4】

前記標的リガンドは、ＰＬＺ４である、請求項１の複数の官能化量子ドットナノ粒子。

【請求項5】

前記官能化量子ドットナノ粒子は、カドミウムを実質的に含まない、請求項１の複数の官能化量子ドットナノ粒子。

【請求項6】

官能化量子ドットを調製する方法であって、
量子ドットを準備するステップであって、各量子ドットが、分子クラスター化合物と、コア半導体材料と、１又は複数のカルボキシル基を含む外層とを含む量子ドットである、量子ドットを準備するステップと、
カップリング剤を準備するステップと、
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）、５−ＡＬＡ誘導体又はこれらの塩類を準備し、前記準備した量子ドット及びカップリング剤と共にインキュベートして、アミド結合又はエステル結合を介して、前記５−ＡＬＡ、前記５−ＡＬＡ誘導体、又はこれらの塩類を前記量子ドットに外部的に共有結合することにより、粗製５−ＡＬＡ−量子ドットコンジュゲートを生成するステップと、
前記粗製５−ＡＬＡ−量子ドットコンジュゲートを精製するステップと、
精製された５−ＡＬＡ−量子ドットコンジュゲートを分離するステップと、
癌細胞結合リガンドを前記精製された５−ＡＬＡ−量子ドットコンジュゲートにさらに接合して、官能化量子ドットを調製するステップであって、前記官能化量子ドットが、外部的に結合された癌細胞結合リガンドと、５−ＡＬＡ、５−ＡＬＡ誘導体、又はこれらの塩類と、を有する量子ドットから本質的に構成される、官能化量子ドットを調製するステップと、を含み、
前記５−ＡＬＡ誘導体が、５−ＡＬＡメチルエステル（アミノレブリン酸メチル）、５−ＡＬＡエチルエステル、５−ＡＬＡプロピルエステル、５−ＡＬＡブチルエステル、５−ＡＬＡペンチルエステル、５−ＡＬＡヘキシルエステル（アミノレブリン酸ヘキシル）、５−ＡＬＡオクチルエステル、５−ＡＬＡ（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラニルエステル、及び５−ＡＬＡポリエチレングリコールからなる群の１つ又は２つ以上から選択される、方法。

【請求項7】

前記カップリング剤は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩である、請求項６の方法。

【請求項8】

癌細胞を殺滅及び検出するための組成物であって、アミド結合又はエステル結合を介して、外部的に結合された癌細胞標的リガンドと５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）又は５−ＡＬＡ誘導体又はこれらの塩類とにコンジュゲートされた量子ドットから本質的に構成される官能化量子ドットコンジュゲートを含み、患者に投与後、前記癌細胞標的リガンドが、前記官能化量子ドットコンジュゲートの癌細胞への接合及び取込みを導き、前記取込みの後、前記５−ＡＬＡ又は前記５−ＡＬＡ誘導体又はこれらの塩類が前記官能化量子ドットから分離し、前記５−ＡＬＡ又は前記５−ＡＬＡ誘導体又はこれらの塩類がＰｐＩＸを内部的に生成し、前記ＰｐＩＸは、前記官能化量子ドットが励起されると蛍光を発して、３７５〜４７５ｎｍの青色光を生成し、これによって、癌細胞の殺滅と画像化の両方を達成することができ、前記５−ＡＬＡ誘導体が、５−ＡＬＡメチルエステル（アミノレブリン酸メチル）、５−ＡＬＡエチルエステル、５−ＡＬＡプロピルエステル、５−ＡＬＡブチルエステル、５−ＡＬＡペンチルエステル、５−ＡＬＡヘキシルエステル（アミノレブリン酸ヘキシル）、５−ＡＬＡオクチルエステル、５−ＡＬＡ（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラニルエステル、及び５−ＡＬＡポリエチレングリコールからなる群の１つ又は２つ以上から選択される、組成物。

【請求項9】

前記癌細胞標的リガンドは、癌細胞への結合に特異性であって、ＰＬＺ４及び癌細胞特異性の抗体から選択される、請求項８の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１５年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／２０５，９９８号の利益を主張する。

【0002】

本発明は、量子ドットナノ粒子にコンジュゲートされた(conjugated)５−アミノレブリン酸及びその誘導体、並びに、量子ドットナノ粒子にコンジュゲートされた５−アミノレブリン酸及びその誘導体を製造する方法に関する。本発明はまた、光線力学療法において、蛍光標識と光増感剤の両方の前駆体として、量子ドットナノ粒子にコンジュゲートされた５−アミノレブリン酸及びその誘導体を投与することによって癌を治療する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

光線力学療法（ＰＤＴ）は、癌細胞を消滅させるための光と共に、光増感剤(photosensitive)（ＰＳ）と呼ばれる光感受性薬剤を使用して行われる治療である。この薬剤は、光によって活性化された後にのみ作用する。適当な光を照射すると、光増感剤は新生物組織を破壊するための活性酸素種(reactive oxygen species)（ＲＯＳ）を生成する。

【0004】

５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）は、ＰＤＴに対して認可されたＰＳであり、広く用いられている。５−ＡＬＡの誘導体(derivatives)及び類似体(analogs)もまた、ＰＤＴ用のＰＳとして提案されている。具体的には、ＷＯ２００２／００９６９０号に開示された５−ＡＬＡのエステル誘導体があり、この公報はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。５−ＡＬＡ及びその誘導体及び類似体はプロドラッグであり、一旦腫瘍細胞の中に取り込まれると、天然光増感剤プロトポルフィリン(protoporphyrin)ＩＸ（ＰｐＩＸ）に変換される。ＰＨＯＴＯＦＲＩＮ（登録商標）（ポルフィマーナトリウム）［CONCORDIA LABORATORIES INC. ST. MICHAEL BARBADOS BB11005］などの外因性投与されるＰＳとは異なり、光線力学的に不活性で非選択的かつ非毒性の５−ＡＬＡは、細胞内で代謝されて、光線力学的に活性で蛍光性のＰｐＩＸになる。その後で、光、例えば青色光を腫瘍部位に照射すると、ＰｐＩＸが活性化され、酸化的損傷を引き起こし、細胞傷害を誘発する。

【0005】

しかしながら、５−ＡＬＡは極性分子である。５−ＡＬＡの双性イオン特性及び親水性は、無傷の皮膚、結節性皮膚損傷などの組織や細胞膜へのその浸透を大きく制限するため、細胞の取込みを遅らせ、腫瘍細胞におけるＰｐＩＸの蓄積にばらつきを生じさせる。それゆえ、５−ＡＬＡが、細胞膜を貫通できるようにすること、及び標的の腫瘍細胞に送達できるようにすることが、ＰＤＴの有効性及び特異性(specificity)を改善する際の課題である。

【0006】

さらに、５−ＡＬＡは、神経膠腫及び黒色腫などの癌の蛍光ガイド下手術におけるマーカーでもあり得る。この用途に対しても、上記の制限は、５−ＡＬＡの標識剤としての能力を不十分なものにする。

【発明の概要】

【0007】

光線療法、ディスプレイ、照明、太陽エネルギー及びバイオイメージングにおいては、化合物半導体としての量子ドットとしばしば称される２〜１００ｎｍの範囲の粒子について、その調製及び特徴付けに大きな関心が寄せられている。

【0008】

米国特許第７，５８８，８２８号（２００７年９月１０日出願、２００９年９月１５日発行）、米国特許第７，８０３，４２３号（２００５年４月２７日出願、２０１０年９月２８日発行）、米国特許第７，８６７，５５６号、米国特許米国特許第７，９８５，４４６号（２０１０年８月１１日出願、２０１１年７月２６日発行）、米国特許第８，０６２，７０３号（２０１０年８月１０日出願、２０１１年１１月２２日発行）、出願人の共同所有に係る米国特許出願第１４／２０７，０８４号、出願人の共同所有に係る米国特許出願第１４／２１２，７０２号、及び出願人の共同所有に係る米国特許出願第１４／２０８，３１１号は、高品質の単分散ＱＤを大量生産する方法を記載しており、それらの全内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。ＱＤ前駆体は、分子クラスターの存在を条件として配備され、これによって、分子クラスターの完全性が維持され、予め作製されたシード又はテンプレートとして作用して、核生成の中心となって化学前駆体と反応し、工業的用途として十分大きな規模で高品質のナノ粒子を生成する。

【0009】

ＱＤ粒子は、さらなる化学的操作のために、有機末端基で官能化されることができる。
一例は不動態化層である。ＱＤを調製するプロセスでは、どんなナノ粒子でも最終無機表面原子の周りの配位が不完全であり、粒子の表面に、配位が不完全な高度に反応性の原子「ダングリングボンド」が生じ、これが粒子の凝集をもたらすことがある。この問題を解消するために、有機不動態化層を用いて、露出面の原子を保護有機基で覆うことができるが、不動態化層は有機官能基を具えるため、該官能基を通じて、他の材料への化学的結合が起こり得る。

【0010】

本発明は、ナノ粒子コンジュゲートにコンジュゲートされた５−ＡＬＡ、その誘導体及びその類似体を含むコンジュゲート(conjugate)を提供する。本発明の一態様では、５−アミノレブリン酸にコンジュゲートされた官能化量子ドットナノ粒子が提供される。一実施形態において、５−ＡＬＡはナノ粒子に結合される。量子ドットナノ粒子は、コア−シェルナノ粒子であってよい。５−ＡＬＡは、ナノ粒子と、共有結合、物理的結合、イオンペアリングにより、又はファンデルワールス相互作用によりコンジュゲートされる。結合は、アミド、エステル、チオエステル、又はチオールアンカー基により、量子ドットナノ粒子の無機表面上に直接形成されてもよいし、又はナノ粒子を水溶性及び生体適合性にするために使用される有機コロナ層上に形成されてもよい。

【0011】

一実施形態において、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートは、分子クラスター化合物、コア半導体材料、及び外層を含み、前記外層はＲを含み、Ｒは次のとおりである。

【化1】

【0012】

別の実施形態では、ナノ粒子は合金化された量子ドットである。コア−シェル構造のナノ粒子とは異なり、合金化ナノ粒子は、コア−シェルの形態を有さず、段階的な(graded)バンドギャップを有する。

【0013】

官能化された量子ドットナノ粒子は、癌細胞を標的とすることができるリガンドを含むことができる。リガンドはＰＬＺ４であってよい。ナノ粒子は、カドミウムを実質的に含まないものでよい。

【0014】

実施形態はまた、上記した５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを調製する方法であって、１）カルボキシル基を有する外層を含むナノ粒子を５−ＡＬＡと結合させて粗製(crude)５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを作製するステップと、２）粗製５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを精製するステップと、３）５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを分離するステップと、を含む。５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを調製する方法は、分子クラスター化合物、コア半導体材料及び外層を含むナノ粒子を準備すること、カップリング剤を準備すること、５−ＡＬＡ、５−ＡＬＡ誘導体又は５−ＡＬＡ類似体を準備すること、混合物をインキュベートして粗製５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを生成すること、粗製ナノ粒子コンジュゲートを精製すること、及び５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを分離することを含む。カップリング剤は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩であってよい。この方法はまた、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲート、癌細胞を標的にすることができるリガンドにコンジュゲートすることを含むことができる。

【0015】

実施形態は、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを含む蛍光標識剤及び光増感剤のためのシステムを提供するもので、前記コンジュゲートは、外側層を有する量子ドットを含み、前記量子ドットは、Ｒを含み、前記Ｒは次の通りである。

【化2】

【0016】

実施形態は、癌を治療する方法を提供するもので、光線力学療法において５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを蛍光標識及び光増感剤の両方の前駆体として投与するステップと、続いて光増感剤を照射するステップと、を含む。

【0017】

実施形態は、細胞アポトーシスを誘導する方法を提供するもので、光線力学療法において５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを蛍光標識及び光増感剤の両方の前駆体として投与するステップと、続いて光増感剤を照射するステップと、を含む。細胞のアポトーシスを誘導する方法は、複数の５−アミノレブリン酸にコンジュゲートされた官能化ナノ粒子を細胞に投与するステップと、５−アミノレブリン酸に代謝産物を生成させるステップと、生成された代謝産物を照射するステップと、を含むことができる。細胞は哺乳動物であってよい。複数の５−アミノレブリン酸にコンジュゲートされた官能化ナノ粒子は、それを必要とする哺乳動物に投与されることができる。代謝産物はプロトポルフィリンＩＸであってよい。照射するステップは、ナノ粒子によって行われることができる。ナノ粒子は、３７５〜４７５ｎｍの範囲の光を発することができる。照射するステップは、活性酸素種を生成するのに十分であり得る。官能化されたナノ粒子は、癌細胞を標的にすることができるリガンドをさらに含むことができる。前記方法は、リガンドを癌細胞に結合するステップをさらに含むことができる。

【0018】

実施形態は、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを、組織特異性リガンド、例えば５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを取り込むために特異組織を標的にすることができるペプチドなどとさらにコンジュゲートする。そのようなペプチドの例として、癌性細胞及び新生物組織（腫瘍を含む）を標的にすることができる抗体がある。標的にされる癌の例として、前立腺、乳房、結腸、皮膚、子宮頸部、膀胱、肺及び胃の癌が挙げられる。特異組織を標的にすることができるペプチドは、共有結合、物理的結合、イオンペアリングにより、又はファンデルワールス相互作用により、ナノ粒子とコンジュゲートされることができる。結合は、アミド、エステル、チオエステル、又はチオールアンカー基により、量子ドットナノ粒子の無機表面上に直接形成されることができるし、又はナノ粒子を水溶性及び生体適合性にするために使用される有機コロナ層上に形成されることもできる。

【0019】

実施形態は、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを、皮下、静脈内、筋肉内、局所的、及び経口的に投与することを含む。実施例として、ボーラス注入又は静脈内注射が挙げられる。

【0020】

実施形態はまた、癌を診断する方法を含み、光線力学診断において５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを蛍光標識及び光増感剤の両方の前駆体として投与するステップと、５−ＡＬＡをナノ粒子から分離してＰｐＩＸを生成するステップと、分離されたナノ粒子を励起して３７５〜４７５ｎｍの青色光を発するステップと、ＰｐＩＸの蛍光特性を活性化するステップと、蛍光を画像化して癌を検出するステップと、を含む。

【0021】

実施形態はまた、腫瘍細胞の外科的切除する方法を含み、光線力学診断において５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを蛍光標識及び光増感剤の両方の前駆体として投与するステップと、５−ＡＬＡをナノ粒子から分離してＰｐＩＸを生成するステップと、分離されたナノ粒子を励起して３７５〜４７５ｎｍの青色光を発するステップと、ＰｐＩＸの蛍光特性を活性化するステップと、を含み、これらステップによって、腫瘍細胞の検出と除去を可能にする。

【0022】

実施形態はまた、癌細胞を検出する方法を含み、光線力学診断において５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを蛍光標識及び光増感剤の両方の前駆体として投与するステップと、５−ＡＬＡをナノ粒子から分離するステップと、５−ＡＬＡがＰｐＩＸを生成するステップと、分離されたナノ粒子を励起して３７５〜４７５ｎｍの青色光を発するステップと、ＰｐＩＸの蛍光特性を活性化するステップと、蛍光を画像化するステップと、を含む。投与するステップは、注射によって行なわれることができる。注射は、静脈内に行うことができる。ナノ粒子は、合金化された量子ドットであってよい。

【0023】

なお、添付の特許請求の範囲に規定される開示の範囲から逸脱することなく、本開示の上記実施形態に対して多くの変更を為し得ることは理解されるであろう。さらに、上記した好ましい実施形態の任意の１又は複数の実施形態は、特定の用途に適合させるために、１又は複数の他の好ましい実施形態と組み合わせることができる。

【0024】

任意選択的な特徴及び／又は好ましい特徴は、本明細書に記載されたものを超えて他の組合せに用いられることができるし、本開示の一態様に関連して記載された任意選択的な特徴及び／又は好ましい特徴は、必要に応じて、本開示の他の態様に存在してもよい。

【0025】

説明され例示された態様は、その性質上、例示的なものであって限定的なものと考えるべきでなく、好ましい態様のみが示され、記載されていること、及び特許請求の範囲に記載された開示の範囲内の全ての変更及び変形は保護されることが望ましいことは理解される。この明細書において、「好ましい」、「好ましくは」、「望ましい」又は「より好ましい」などの用語の使用は、そのように記載された特徴が望ましいことを示唆するかもしれないが、必ずしも必要でないこともあり、そのような特徴を欠いていることは、添付の特許請求の範囲に規定される本開示の範囲内であることを意図するものである。特許請求の範囲に関しては、「ａ」、「ａｎ」又は「少なくとも１つ」のような単語は特徴を最初に記載するために用いられるもので、特許請求の範囲中に特に記載がない限り、そのような特徴の１つのみに限定することを意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを調製するプロセスの概略図である。

【0027】

【図2】図２は、表面結合されたリガンドが付着したナノ粒子（黒丸で示す）について５−ＡＬＡとの共役化を示す。この代表的な例では、Ｘ＝表面結合リガンド（チオール、アミン、ホスフィン、ホスフィンオキシド、カルボン酸など）であり、Ｙ＝連結基（アルキル、アルケニル、アルキニルの１又は２以上を含む炭化水素鎖；ＰＥＧ、ＰＰＯ、ＰＥＯ、シリコーンゴム、ポリエチレン、アクリル樹脂、ポリウレタン、ポリプロピレン、及びポリメチルメタクリレートなどのポリマー；コポリマー；ブロックコポリマーなど）であり、Ｚ＝カルボン酸、エステル、塩化アシル、酸無水物又はアルデヒドである。

【0028】

【図3】図３は、図２の５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートから光増感剤プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ又はＰＲＯＴＯ）への代謝経路を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

図１において、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートは、ナノ粒子を５−ＡＬＡと反応させることによって得られる。一実施例として、ナノ粒子は、分子クラスター化合物、コア半導体材料、及び外層を含む。外層は、カルボキシル基を含み、５−ＡＬＡがカルボキシル基と反応してリンケージを形成する。５−ＡＬＡの誘導体及び類似体は、単独又は組合せで使用されることは理解されるべきである。また、合金化されたナノ粒子を使用できることも理解されるべきである。さらに、コア−シェルナノ粒子と合金化ナノ粒子との組合せを使用されることもできる。

【0030】

５−ＡＬＡの誘導体には、以下のものを挙げられるが、これらに限定されない：
＜５−ＡＬＡ ｎ−アルキルエステル＞
５−ＡＬＡメチルエステル（メチルアミノレブリン酸、商品名ＭＥＴＶＩＶ（登録商標））
５−ＡＬＡエチルエステル
５−ＡＬＡプロピルエステル
５−ＡＬＡブチルエステル
５−ＡＬＡペンチルエステル
５−ＡＬＡヘキシルエステル（ヘキシルアミノレブリン酸、商品名ＨＥＸＶＩＸ）
５−ＡＬＡオクチルエステル
同様に、
５−ＡＬＡ（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラニルエステル；及び
５−ＡＬＡポリエチレングリコール誘導体
さらに、５−ＡＬＡ・ＨＣｌなどの塩類

【0031】

コア−シェルナノ粒子の種類には、以下の種類を含むコア材料が含まれるが、これらに限定されない：

【0032】

周期律表の第２族の第１元素と周期律表の第１６族の第２元素とからなり、三元材料、四元材料及びドープされた材料を含むＩＩＡ−ＶＩＢ（２−１６）材料。ナノ粒子材料は、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅを含むが、これらに限定されない。

【0033】

周期律表の第１２族の第１元素と周期律表の第１６族の第２元素とからなり、三元材料、四元材料及びドープされた材料を含むＩＩＢ−ＶＩＢ（１２−１６）材料。ナノ粒子材料は、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅを含むが、これらに限定されない。

【0034】

周期律表の第１２族の第１元素と周期律表の第１５族の第２元素とからなり、三元材料、四元材料及びドープされた材料を含むＩＩ−Ｖ材料。ナノ粒子材料は、Ｚｎ_３Ｐ_２、Ｚｎ_３Ａｓ_２、Ｃｄ_３Ｐ_２、Ｃｄ_３Ａｓ_２、Ｃｄ_３Ｎ_２、Ｚｎ_３Ｎ_２を含むが、これらに限定されない。

【0035】

周期律表の第１３族の第１元素と周期律表の第１５族の第２元素とから成り、三元材料、四元材料及びドープされた材料を含むＩＩＩ−Ｖ族材料。ナノ粒子材料は、ＢＰ、ＡｌＰ、ＡｌＡ、ＡｌＳｂ；ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ；ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＮ、ＢＮを含むが、これらに限定されない。

【0036】

周期律表の第１３族の第１元素と周期律表の第１４族の第２元素とから成り、三元材料、四元材料及びドープされた材料を含むＩＩＩ−ＩＶ材料。ナノ粒子材料は、Ｂ_４Ｃ、Ａｌ_４Ｃ_３、Ｇａ_４Ｃを含むが、これらに限定されない。

【0037】

周期律表の第１３族の第１元素と周期律表の第１６族の第２元素とからなり、三元材料及び四元材料を含むＩＩＩ−ＶＩ族材料。ナノ粒子材料は、Ａｌ_２Ｓ_３、Ａｌ_２Ｓｅ_３、Ａｌ_２Ｔｅ_３、Ｇａ_２Ｓ_３、Ｇａ_２Ｓｅ_３、ＧｅＴｅ；Ｉｎ_２Ｓ_３、Ｉｎ_２Ｓｅ_３、Ｇａ_２Ｔｅ_３、Ｉｎ_２Ｔｅ_３、ＩｎＴｅを含むが、これらに限定されない。

【0038】

周期律表の第１４族の第１元素と周期律表の第１６族の第２元素とからなり、三元材料、四元材料及びドープされた材料を含むＩＶ−ＶＩ材料。ナノ粒子材料は、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＰｂＴｅ、Ｓｂ_２Ｔｅ_３、ＳｎＳ、ＳｎＳｅ、ＳｎＴｅを含むが、これらに限定されない。

【0039】

周期律表の遷移金属のいずれかのグループの第１の元素と、周期律表のｄ−ブロック元素のいずれかのグループの第２の元素とからなり、三元材料、四元材料及びドープされた材料を含むナノ粒子材料。ナノ粒子材料は、ＮｉＳ、ＣｒＳ、ＣｕＩｎＳ_２を含むが、これらに限定されない。

【0040】

本明細書及び特許請求の範囲において、ドープされたナノ粒子」という用語は、上記のナノ粒子及び１又は２以上の主たる族又は希土類元素を含むドーパントのことを意味する。これについて、最も多いのは、遷移金属又は希土類元素であり、例えば、Ｍｎ^＋でドープされたＺｎＳナノ粒子などのマンガンを含む硫化亜鉛があるが、これに限定されない。

【0041】

一実施形態では、カドミウムを含まないナノ粒子が好ましい。

【0042】

一実施形態において、ナノ粒子は、ナノ粒子コア上に設けられた第１の半導体材料を含む第１の層を含む。前記第１の層には、第２の半導体材料を含む第２の層を設けられることができる。

【0043】

標準的なコンジュゲーション化学がコンジュゲーションに用いられることができる。例えば、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを調製する方法は、ナノ粒子を準備するステップ、カップリング剤を準備するステップ、５−ＡＬＡ、５−ＡＬＡ誘導体（例えば、そのエステル誘導体など）、５−ＡＬＡ類似体を準備するステップ、これらの混合物をインキュベートして、粗製５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを形成するステップを含む。粗製５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートは、次に、精製され、分離されて、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートを得ることができる。

【0044】

インキュベーション条件は、アミド又はエステルのいずれかを形成できるように選択されることができる。他の結合（例えば、共有結合及び非共有結合の両方）が形成されてもよいことが理解されるべきである。一実施形態においては、５−ＡＬＡはナノ粒子に結合される。５−ＡＬＡは、共有結合、物理的、イオンペアリングか、又はファンデルワールス相互作用のいずれかによりナノ粒子とコンジュゲートされることができる。結合は、アミド、エステル、チオエステル、又はチオールアンカー基により、量子ドットナノ粒子の無機表面の上、又はナノ粒子を水溶性及び生体適合性にするために用いられる有機コロナ層の上に直接形成されることができる。

【0045】

カップリング(coupling)のための標準的なインキュベーション条件を用いられることができる。例えば、カップリング条件は、０．５〜４時間の範囲の溶液であってよい。カップリング条件の温度範囲は、１００℃〜２００℃の範囲であってよい。カップリング条件は、反応中に一定であっても変化してもよい。例えば、反応条件は１３０℃で１時間、次に１４０℃に昇温して３時間とすることができる。

【0046】

リンカー(linker)を使用して、ナノ粒子上のカルボキシル官能基と、５−ＡＬＡ上のカルボキシル又はアミン末端基のいずれかとの間にアミド又はエステル基を形成することができる。リンカー又はカップリング剤として、ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）並びにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミドが挙げられる。ＥＤＣは、アミドカップリング剤として使用するのに好ましいカルボジイミドである。

【0047】

一実施例において、カルボキシル末端基及び５−ＡＬＡを有する量子ドットナノ粒子を溶媒中で混合する。ＥＤＣなどのカップリング剤を混合物に添加する。反応混合物はインキュベートされることができる。粗製５−ＡＬＡ−ＱＤナノ粒子コンジュゲートを精製して、５−ＡＬＡ−ＱＤナノ粒子コンジュゲートが得られる。

【0048】

標準的な固相精製(solid state purification)方法を用いることができる。過剰の未反応５−ＡＬＡ及びＥＤＣを除去するには、適当な溶媒で数回の濾過及び洗浄が必要である。

【0049】

別の実施形態において、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートは、癌細胞を標的にすることができるリガンドをさらに含むことができる。例えば、化学的化合物又はペプチド、例えば抗体などが５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートにコンジュゲートされて、光検出又は光線療法のいずれかのために、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートの細胞取込みをさらに行うことができる。ペプチドの例として、ＰＬＺ４（ＱＤＧＲＭＧＦ）があり、これは、膀胱癌細胞に選択的に結合することができるペプチドである。ペプチドは、それらのアミン又はカルボン酸基によって官能化されたナノ粒子とアミド又はエステル結合を形成することができる。

【0050】

癌細胞に選択的に結合されると、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートは細胞に取り込まれる。内部に取り込まれると、５−ＡＬＡは、天然光増感剤プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）に変換される。次いで、例えば３７５〜４７５ｎｍの範囲の青色光などの光により腫瘍部位を照射すると、ＰｐＩＸを活性化し、活性酸素種（ＲＯＳ）の放出により酸化的損傷を引き起こし、細胞毒性又はアポトーシスを誘導する。

【0051】

したがって、本明細書に開示される実施形態は、例えば哺乳動物細胞などの細胞のアポトーシスを誘導する方法に用いられることができ、該方法は、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートをそれを必要とする哺乳類に投与するステップ、５−ＡＬＡによりＰｐＩＸなどの代謝産物を生成させるステップ、及び代謝産物に照射するステップを含む。照射するステップは、解離されたナノ粒子などのナノ粒子の励起によって行うことができる。

【0052】

実施形態は、哺乳動物を画像化することによって癌細胞を検出する方法も含む。

【0053】

５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートの投与は、経腸、すなわち非経口であってよい。例えば、５−ＡＬＡ−ナノ粒子コンジュゲートは、皮下、静脈内、筋肉内、局所的、及び経口的に投与することができる。実施例として、ボーラス注入又はＩＶ注入が含まれる。

【0054】

本発明の５−ＡＬＡ−ＱＤナノ粒子コンジュゲートは、遊離(free)５−ＡＬＡに対して以下の利点を有する。

【0055】

第１に、５−ＡＬＡ−ＱＤナノ粒子コンジュゲートは、高い細胞透過性を有し、癌細胞、特に非常に活性な癌幹細胞によってより効率的に取り込まれることができる。概して、ナノ粒子は、正常細胞よりも癌細胞に多く蓄積する。ＱＤナノ粒子は、ベクトル化された輸送システム(delivery system)として作用する。

【0056】

第２に、ＱＤ放射は、ＰｐＩＸ吸収と重なるように調整されることができる。ＱＤ−５ＡＬＡ粒子が癌細胞に取り込まれると、５−ＡＬＡが放出され、数時間以内にＰｐＩＸに形質転換される。ＱＤは、次いで、光又はＦＲＥＴドナーとして用いられ、生成されたＰｐＩＸの励起を高めることができる。ＱＤナノ粒子は、ＰｐＩＸのような小分子色素と比較して、１０〜１００倍高い分子減衰係数を有するため、より多くの光が吸収され、より強いシグナルが生成され、シグナル対ノイズ検出比が向上する。

【0057】

第３に、高い光吸収強度により、光線力学的治療（ＰＤＴ）用薬剤として一重項酸素を生成する際に、ＰｐＩＸの有効性を増加させることができる。

【0058】

第４に、ＱＤナノ粒子の同調性及び多光子励起（２光子励起を含む）により、より深い組織検出及びより深いＰＤＴが可能であり、これは、僅か数ミリメートル程度の組織深さにしかアクセスすることができない５−ＡＬＡ単独とは異なる。

【0059】

第５に、二光子励起又は多光子励起は、７００ｎｍよりも大きな励起波長のための手段となり、ＰＤＴが高度に局在化された光量を有することができる。

【0060】

本発明のこれら及び他の利点は、当業者であれば、前述の明細書から明らかであろう。したがって、本発明の広範な発明の概念から逸脱することなく、上述の実施形態に変更又は修正を加えることができることを、当業者は認識されるべきである。本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲及び精神内にあるすべての変更及び修正を含むことが意図されることを理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】