特許 6830891 真菌宿主株、ＤＮＡ構築物および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6830891

(24)【登録日】2021年1月29日

(45)【発行日】2021年2月17日

(54)【発明の名称】真菌宿主株、ＤＮＡ構築物および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20210208BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20210208BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20210208BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C12P21/02 C

   !C12N1/15

【請求項の数】20

【全頁数】62

(21)【出願番号】特願2017-529343(P2017-529343)

(86)(22)【出願日】2015年12月1日

(65)【公表番号】特表2018-500893(P2018-500893A)

(43)【公表日】2018年1月18日

(86)【国際出願番号】US2015063095

(87)【国際公開番号】WO2016089815

(87)【国際公開日】20160609

【審査請求日】2018年11月15日

(31)【優先権主張番号】62/085,834

(32)【優先日】2014年12月1日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】509240479

【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100071010

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 行造

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(72)【発明者】

【氏名】アレントショースト、マーク

(72)【発明者】

【氏名】バレンズ、シャリエフ

(72)【発明者】

【氏名】クルイトフ、ポーリーン

(72)【発明者】

【氏名】ニコラエフ、イゴール

(72)【発明者】

【氏名】ウエドラオゴ、ジャン・ポール

(72)【発明者】

【氏名】ラム、アーサー・エフ、ジェイ、

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０３０６０２０８（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５１８７８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５１１０５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５１６４７６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を構築する方法であって、
ａ）線状化もしくは環状ＤＮＡと複数の制限酵素との混合物を使用してトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程であって、前記制限酵素は、前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の前記染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成でき、かつ、少なくとも８塩基対の制限部位を認識する、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＰｍｅＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｒｆＩ、およびＳｇｆＩから選択される、工程；および
ｂ）ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を選択する工程であって、前記制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の百分率は、前記制限酵素の処理を用いずに入手できる前記安定性形質転換体の百分率より少なくとも２０％高い工程を含む方法。

【請求項2】

前記制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の前記百分率は、前記制限酵素の処理を用いない安定性形質転換体の前記百分率より少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％高い、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の前記百分率は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくは８０％である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記制限酵素の処理を用いた形質転換効率は、制限酵素の処理を用いない形質転換効率より少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％高い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記制限酵素は、形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の前記染色体ＤＮＡ内で適合する付着端を生成できる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞は、線状化ＤＮＡを用いて形質転換させられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞は、環状ＤＮＡを用いて形質転換
させられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記線状化もしくは環状ＤＮＡは、１つ以上の関心対象の遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記関心対象の遺伝子は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの２つ以上の混合物をコードする、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記関心対象の遺伝子は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの２つ以上の混合物をコードする、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記線状化もしくは環状ＤＮＡは、選択マーカーをさらに含む、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記選択マーカーは、ａｌｓ１、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチシジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子またはチミジンキナーゼマーカーである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記方法は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を使用する工程を含まない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記方法は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を使用する工程を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記方法は、前記制限酵素によって切断される部位で相同性組換えによって前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属染色体ＤＮＡと再結合するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同性であるＤＮＡ配列を使用する工程を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）菌株である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

線状化もしくは環状ＤＮＡと複数の制限酵素との混合物を使用してトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体の安定性を改良する方法であって、
前記制限酵素は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の前記染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することができ、かつ、少なくとも８塩基対の制限部位を認識する、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＰｍｅＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｒｆＩ、およびＳｇｆＩから選択され、
前記制限酵素の処理を用いて生じた安定性形質転換体の前記百分率が前記制限酵素の処理を用いずに入手できる安定性形質転換体の前記百分率より少なくとも２０％高い方法。

【請求項18】

遺伝的に安定性のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体を選択する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

関心対象のタンパク質を発現させる方法であって、
ａ）請求項１に記載の方法を用いて形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を構築して、該菌株を使用する工程であって、前記関心対象の遺伝子は前記関心対象のタンパク質をコードする工程；および
ｂ）前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株から前記関心対象のタンパク質を生成する工程
を含む方法。

【請求項20】

前記関心対象のタンパク質は、分泌タンパク質である、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月１日に出願され、その内容が参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６２／０８５８３４号に対する優先権を主張する。

【0002】

配列表
連邦規則法典第３７巻規則１．５２（ｅ）を順守してＥＦＳを介して提出された配列表は、これにより本明細書に組み込まれる。ＥＦＳを介して提出された配列表テキストファイルは、サイズが１３．４キロバイトである、２０１５年１０月１１日に作成されたファイル「２０１５−５８０＿４０６７６−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」を含有する。

【0003】

本開示は、真菌宿主株およびそれらを作成および使用するための組換えＤＮＡ構築物に関する。真菌宿主株は、信頼できるもしくは低い可変性方法で関心対象のタンパク質を発現させるために特に安定性および有用である。本開示はさらに、そのように構築されたそのような真菌宿主株、関心対象のタンパク質およびそのような改良された真菌宿主株の発酵により調製されたそのような関心対象のタンパク質を含む組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0004】

関心対象のタンパク質のための生成宿主としての真菌株の使用は、長年にわたり経済的に実行可能であると見なされ、これまでの期間は商業的環境において広範に使用されてきた。そこでこれらのタンパク質は、任意選択的に精製後に、様々な工業用途、学術用途または他の用途において使用することができる。しかし、分子学技術を使用して、たとえ存在しても、構築された形質転換体の極めて少数しか実際に関心対象の酵素を生成しないことは希ではない。そのような少数の形質転換体しか成功しなかった１つの理由は、単純に形質転換が低効率である可能性があり、全体として少数の形質転換体しか生じさせない。また別の理由は、タンパク質、酵素または他の分子であってよい発現生成物の生成を許容するために十分に安定性である形質転換体の百分率が低いことにある可能性がある。

【0005】

異種遺伝子（例えば、非天然遺伝子または天然形とは異なる形態で存在する天然遺伝子）の発現における可変性は、遺伝子の核酸および／またはアミノ酸配列と関連していない因子の結果として発生する可能性がある。例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムは、大多数の真菌を含む多細胞真核生物において優勢である。そこで、発現ベクターはランダムな場所でゲノム内に組み込まれ、様々な形質転換体間の発現レベルに位置効果を生じさせる可能性がある。さらに、不安定性形質転換体は、関心対象の遺伝子の発現が確証された後でさえ生成される可能性があり、安定性形質転換体を得るための形質転換体の詳細なスクリーニングを必要にする。可変性はさらに、糸状菌の多核性質がこれらの生物内での標的遺伝子組込みを妨害するために、多核プロトプラストの形質転換の結果としてのヘテロカリオンの生成によって発生する可能性がある。このため、低下した可変性を備える関心対象のタンパク質を発現させるために、遺伝的に安定性の形質転換真菌株を生成する信頼できる手段は、明白な長所を提供する。

【0006】

そのような明白な長所の非限定的な例は、真菌によって発現したＤＮＡライブラリー内での関心対象の遺伝子もしくは変異体の機能性スクリーンにある。発現効率および／またはレベルにおける可変性は、所定の変異体の特徴をまた別の変異体の特徴と比較することを困難にさせる。このため、特別な長所は、関心対象の遺伝子もしくは変異体を特定の宿主細胞によって確実に発現させることができれば、およびそれらの特徴をより容易に評価および比較できるように可変性レベルがより低ければ、明白に存在する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本開示は、真菌宿主株およびそれらを作成および使用するための組換えＤＮＡ構築物に関する。真菌宿主株は、当分野において公知の他の発現方法と比較して、これらの宿主内での発現レベルのより高い信頼性および／またはより低い可変性を備える関心対象の遺伝子もしくは変異体の発現を提供するために使用できる。真菌宿主株は、特定の実施形態では、信頼できるもしくは低い可変性方法で関心対象の遺伝子を発現させるための遺伝子組込みを効率的に標的とするために有用である。

【課題を解決するための手段】

【0008】

第１態様では、本開示は、遺伝的に安定性の形質転換真菌株を構築する方法であって、ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を含む方法を提供する。

【0009】

所定の実施形態では、制限酵素は、形質転換染色体ＤＮＡを線状化できる、および／または染色体ＤＮＡ内で適合する付着端を生成できる。

【0010】

一部の実施形態では、線状化ＤＮＡは、１つ以上の関心対象の遺伝子を含む。好適には、関心対象の遺伝子は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼまたは所定の他の有用な酵素の内の１つをコードする。一部の場合には、線状化ＤＮＡは、２つ以上の関心対象の遺伝子を含むことができるので、したがって形質転換真菌株は２つ以上の酵素もしくは関心対象のタンパク質をコードする遺伝子の産物の混合物を発現する。所定の特定の実施形態では、好適な形質転換真菌株は、タンパク質混合物を発現する。一部の実施形態では、関心対象の遺伝子は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原またはそのような遺伝子産物のいずれかの断片をコードすることができる。

【0011】

一部の実施形態では、線状化ＤＮＡは、さらに少なくとも１つの選択マーカーを含む。選択マーカーは、好適には、ａｌｓ１、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチシジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子、チミジンキナーゼマーカーまたは本発明の形質転換真菌株を作製するために使用できることが当業者には公知である、もしくは当業者に公知になるであろう任意の他のマーカーである。

【0012】

一部の実施形態では、真菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株であってよい。

【0013】

一部の実施形態では、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株は、好適には糸状菌株であってよい。例えば、糸状菌株は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属もしくはエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属である。所定の実施形態では、糸状菌株は、好適にはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（Ｔ．リーゼイ（ｒｅｅｓｅｉ））である。代替実施形態では、糸状菌株は、好適にはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である。

【0014】

第２態様では、本開示は、下記の：ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を含む方法を使用して得られた、遺伝的に安定性の形質転換真菌宿主株を提供する。

【0015】

一部の実施形態では、１つ以上の関心対象の遺伝子を含むこの態様の遺伝的に安定性の形質転換真菌株。例えば、関心対象の遺伝子は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼまたは他の有用な酵素をコードする遺伝子であってよい。一部の場合には、この態様の形質転換真菌株は、２つ以上の関心対象の遺伝子を含むので、したがって、形質転換真菌株は、関心対象の遺伝子の産物である物質の混合物を生成することができる。その意味で、この態様の形質転換真菌株を使用すると、関心対象の遺伝子の産物を含む混合物もしくは組成物を生成することができる。所定の実施形態では、関心対象の遺伝子は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原またはそのような物質のいずれか１つの断片をコードする遺伝子であってよい。

【0016】

一部の実施形態では、この態様の形質転換真菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株である。所定の特定の実施形態では、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株は、好適には糸状菌株であってよい。例えば、糸状菌株は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属もしくはエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属由来の菌株であってよい。所定の特定の実施形態では、形質転換糸状菌株は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）であってよい。また別の特定の実施形態では、形質転換糸状菌株は、好適には、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）であってよい。

【0017】

第３態様では、本開示は、真菌形質転換体の安定性を改良する方法であって、線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌株の細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程を含む方法を提供する。

【0018】

一部の実施形態では、真菌形質転換体の安定性を改良する方法の制限酵素は、形質転換染色体ＤＮＡを線状化できる、および／または染色体ＤＮＡ内で適合する付着を生成できる。

【0019】

一部の実施形態では、真菌形質転換体の安定性を改良する方法において使用される線状化ＤＮＡは、１つ以上の関心対象の遺伝子を含む。関心対象の遺伝子は、好適には、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼなどをコードする遺伝子である。所定の実施形態では、本方法において使用される線状化ＤＮＡは、２つ以上の関心対象の遺伝子を含むので、したがって、本方法は、２つ以上の関心対象の遺伝子によってコードされる産物である、そのような酵素の混合物を生成するために使用できる。その意味において、本方法は、改良された安定性を備える真菌形質転換体によって生成される酵素、またはそのような真菌形質転換体によって生成される酵素もしくはタンパク質混合物を含む組成物を生成するために使用できる。一部のまた別の実施形態では、関心対象の遺伝子は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原またはそのような物質の断片をコードする遺伝子であってよい。

【0020】

一部の実施形態では、本態様の本方法の線状化ＤＮＡは、さらに少なくとも１つの選択マーカーを含む。例えば、選択マーカーは、好適には、ａｌｓ１、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチシジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子およびチミジンキナーゼマーカーであってよい。

【0021】

一部の実施形態では、この態様の真菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株である。例えば、好適な子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株は、糸状菌株であってよい。糸状菌株は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属もしくはエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属菌株の菌株であってよい。一部の特定の実施形態では、糸状菌株は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）菌株である。所定の他の実施形態では、糸状菌株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）菌株である。

【0022】

また別の態様では、本開示は、形質転換真菌株を好適な培地中で発酵させる方法であって、その菌株が下記の：ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を使用して得られる方法を提供する。所定の実施形態では、真菌株は、関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下で発酵させられる。

【0023】

一部の実施形態では、本態様の方法を使用して発酵させた真菌株によって発現した関心対象の遺伝子は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼまたは本明細書に列挙した酵素の１つ以上の混合物をコードする。一部の他の実施形態では、真菌株によって発現した関心対象の遺伝子は、さらにペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原およびそのような分子の１つ以上の断片または混合物をコードする遺伝子であってよい。

【0024】

所定の関連態様では、本発明はさらに、形質転換真菌株によって発現する関心対象の遺伝子の産物を含む本態様の発酵ブロスの終点である組成物に関する。

【0025】

さらにまた別の態様では、本開示は、関心対象の遺伝子を発現させる方法であって、前記関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下の好適な培地中で形質転換真菌株を増殖および発酵させる工程を含み、それによって形質転換真菌株が下記の：ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を使用して得られる方法を提供する。

【0026】

一部の実施形態では、本態様の方法は、さらに前記関心対象の遺伝子の発現のレベルをアッセイする工程を含む。関心対象の遺伝子は、好適には、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびこれらの酵素の１つ以上の混合物をコードすることができる。または、関心対象の遺伝子は、好適にはペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原および断片またはこれらの材料の２つ以上の混合物をコードすることができる。

【0027】

また別の態様では、本開示は、形質転換真菌細胞内で関心対象の遺伝子を発現させる方法によって生成される関心対象の遺伝子によってコードされた関心対象のタンパク質を提供するが、このとき真菌細胞は、下記の：ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程にしたがうことによって得られる。

【0028】

また別の態様では、本開示は、関心対象の遺伝子によってコードされた関心対象のタンパク質を含むタンパク質性組成物を提供するが、このとき形質転換真菌細胞は、下記の：ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程にしたがって得られる。

【0029】

さらにまた別の態様では、本開示は、本明細書の様々な態様の方法のいずれかおよび／または本開示の形質転換真菌株を、バイオマス加水分解、クリーニング用途、穀物加工処理、動物栄養、食品組成物、織物処理などにおいて使用することによって生成されるタンパク質性組成物を使用する方法を提供する。

【0030】

さらにまた別の態様では、本開示は、ａ）染色体ＤＮＡ内に少なくとも１つの制限酵素部位を含有する真菌宿主細胞；およびｂ）関心対象の遺伝子を発現させるために操作できる配列、選択マーカーおよび前記染色体制限酵素部位の側面に位置する配列と実質的に相同性を備える配列を含有する核酸分子であって；実質的相同性を備える前記配列は、関心対象の遺伝子の発現を生じさせる相同性組換え事象を誘発する核酸分子を含む真菌発現系を提供する。

【0031】

所定の実施形態では、真菌発現系は、真菌宿主細胞の染色体ＤＮＡ内で好適な制限酵素部位を生成できる制限酵素を発現する発現カセットをさらに含む。

【0032】

関心対象の遺伝子は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびこれらの酵素の２つ以上の混合物をコードする遺伝子であってよい。または、関心対象の遺伝子は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、断片またはこれらの分子の２つ以上の混合物をコードすることができる。

【0033】

一部の実施形態では、選択マーカーは、好適には、ａｌｓ１、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチシジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子またはチミジンキナーゼマーカーであってよい。

【0034】

一部の実施形態では、真菌宿主株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌宿主株である。例えば、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株は、好適には糸状菌株である。一部の実施形態では、真菌宿主株は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属もしくはエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属宿主株である。特定の例では、糸状菌宿主株は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）宿主株である。また別の特定の例では、糸状菌宿主株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）宿主株である。

【0035】

関連態様では、本開示は、本明細書に記載した真菌発現系を使用する方法であって、その真菌発現系は、ａ）染色体ＤＮＡ内に少なくとも１つの制限酵素部位を含有する真菌宿主細胞；およびｂ）関心対象の遺伝子を発現させるために操作できる配列、選択マーカーおよび前記染色体制限酵素部位の側面に位置する配列と実質的に相同性を備える配列を含有する核酸分子を含む方法を提供する。実質的相同性を備える配列は、相同性組換え事象を誘発し、これは結果として関心対象の遺伝子の発現を生じさせる。ｂ）の核酸分子は、染色体制限酵素部位を生成できる制限酵素の存在下で真菌宿主細胞内に形質転換させられる。

【0036】

一部の実施形態では、制限酵素は、同様に真菌宿主細胞内に位置する発現カセットによって生成される。

【0037】

また別の関連態様では、本開示は、本明細書に記載した真菌発現系を使用する方法によって得られる形質転換もしくは誘導真菌株を提供する。さらに、本開示は、下記の：ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程にしたがうことによって得られる、形質転換もしくは誘導真菌株を発酵させる方法をさらに提供する。

【0038】

さらにまた別の態様では、本開示は、関心対象の遺伝子を発現させる方法であって、前記関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下の好適な培地中で形質転換もしくは誘導真菌株を増殖および発酵させる工程を含む方法を提供する。これに関連して、本開示はさらに、関心対象の遺伝子によってコードされた関心対象のタンパク質を提供する。さらに、本開示は、関心対象のタンパク質を含むタンパク質性組成物を提供する。本開示はさらに、バイオマス加水分解、クリーニング用途、穀物加工処理、動物栄養、食品組成物、織物処理などにおいてそのようなタンパク質性組成物を使用する方法を提供する。

【0039】

また別の態様では、本開示は：
ａ）染色体ＤＮＡ内の少なくとも１つの制限酵素部位を含む真菌宿主細胞を入手する工程；および
ｂ）関心対象の１つ以上の遺伝子を発現させるために操作可能である配列、少なくとも１つの選択マーカーおよび前記染色体制限酵素部位の側面に位置する配列との実質的相同性を備える配列を含有する核酸分子を入手する工程であって、前記相同配列は相同性組換え事象を誘発して前記関心対象の遺伝子の発現を生じさせる工程；
ならびにｂ）の核酸分子をａ）の真菌宿主細胞に染色体制限酵素部位を生成できる制限酵素の存在下で形質転換させる工程、を含む標的遺伝子組込み法を提供する。

【0040】

一部の実施形態では、真菌宿主細胞は、さらに真菌宿主細胞内で制限酵素を生成するために使用される発現カセットをさらに含む。

【0041】

関心対象の遺伝子は、好適には、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼまたはこれらの酵素の２つ以上の混合物をコードする。または、関心対象の遺伝子は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、これらの分子の断片またはこれらの分子の１つ以上の混合物をコードする。

【0042】

選択マーカーは、好適には、ａｌｓ１、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチシジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子またはチミジンキナーゼマーカーであってよい。

【0043】

一部の実施形態では、真菌宿主株は、好適には、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株である。例えば、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株は、糸状菌株であってよい。一部の実施形態では、糸状菌株は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属もしくはエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属真菌株である。所定の特定の実施形態では、糸状菌株は、好適には、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）菌株である。所定の他の特定の実施形態では、糸状菌株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）菌株である。

【0044】

１つの態様では、本開示は、遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を構築する方法であって、ａ）線状化（「線状」とも呼ぶ）もしくは環状ＤＮＡと制限酵素（制限酵素の「処理を用いて」とも呼ぶ）との混合物を使用してトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる工程；およびｂ）ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を選択する工程であって、制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の処理を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い工程を含む方法を提供する。

【0045】

また別の態様では、本開示は、遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を構築する方法であって、ａ）線状化もしくは環状ＤＮＡを用いてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程であって、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞は制限酵素を生成するように誘導され、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる工程；およびｂ）ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を選択する工程であって、制限酵素の誘導を用いた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の誘導を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い工程を含む方法を提供する。

【0046】

また別の態様では、本開示は、線状化もしくは環状ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用してトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体の安定性を改良する方法であって、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することができ、制限酵素の処理を用いて生じた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の処理を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い方法を提供する。

【0047】

さらにまた別の態様では、本開示は、線状化もしくは環状ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用してトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体の安定性を改良する方法であって、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる制限酵素を生成するように誘導され、制限酵素の誘導を用いて生じた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の誘導を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い方法を提供する。

【0048】

段落［００４７］に記載した方法の一部の実施形態では、本方法は、さらにトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞内に、形質転換工程前または工程中の誘導後に制限酵素を生成できる構築物を導入する工程をさらに含む。

【0049】

段落［００４６］〜［００４８］のいずれか１つに記載した方法の一部の実施形態では、本方法は、遺伝的に安定性のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体を選択する工程をさらに含む。

【0050】

段落［００４４］〜［００４９］のいずれか１つに記載した方法の一部の実施形態では、本方法は、同一の線状化もしくは環状ＤＮＡを用いて、しかし制限酵素の処理もしくは制限酵素の誘導を用いずにトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の同一前形質転換菌株を形質転換させる工程をさらに含む。

【0051】

段落［００４４］〜［００５０］のいずれか１つに記載した方法の所定の実施形態では、制限酵素の処理もしくは誘導を用いた安定性形質転換体の百分率および制限酵素の処理もしくは誘導を用いない安定性形質転換体の百分率は、同一条件下で同一形質転換法を用いて、および所定の実施形態では、ほぼ同一数の細胞および同一量の線状化もしくは環状ＤＮＡを使用して得られる。

【0052】

段落［００４４］〜［００５１］のいずれか１つに記載した方法の所定の実施形態では、制限酵素の処理もしくは誘導を用いた安定性形質転換体の百分率は、制限酵素の処理もしくは誘導を用いない安定性形質転換体の百分率より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％高い。特定の実施形態では、制限酵素の処理もしくは誘導を用いた安定性形質転換体の百分率は、制限酵素の処理もしくは誘導を用いない安定性形質転換体の百分率の少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍もしくは６倍高い。

【0053】

段落［００４４］〜［００５２］のいずれか１つに記載した方法の特定の実施形態では、制限酵素の処理もしくは誘導を用いた安定性形質転換体の百分率は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％である。特定の実施形態では、制限酵素の処理もしくは誘導を用いた安定性形質転換体の百分率は、試験した全形質転換体の中で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％である。

【0054】

段落［００４４］〜［００５３］のいずれか１つに記載した方法の一部の実施形態では、制限酵素の処理もしくは誘導を用いた形質転換効率は、制限酵素の処理もしくは誘導を用いない形質転換効率より少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％高い。特定の実施形態では、制限酵素の処理もしくは誘導を用いた形質転換効率は、制限酵素の処理もしくは誘導を用いない形質転換効率の少なくとも１倍、２倍、３倍もしくは４倍高い。

【0055】

段落［０００８］〜［００１３］、［００２２］、［００２３］、［００２５］、［００２６］、［００３５］、［００３６］、［００３８］〜［００４０］および［００４４］〜［００５４］のいずれか１つに記載した方法の一部の実施形態では、制限酵素は、少なくとも６塩基対の制限部位を認識する。一部の実施形態では、制限酵素は、少なくとも８塩基対の制限部位を認識する。特定の実施形態では、制限酵素は、少なくとも１０塩基対の制限部位を認識する。特定の実施形態では、制限酵素は、少なくとも１２塩基対の制限部位を認識する。特定の実施形態では、本方法においては、少なくとも２つの異なる制限酵素が使用される。

【0056】

段落［０００８］〜［００１３］、［００２２］、［００２３］、［００２５］、［００２６］、［００３５］、［００３６］、［００３８］〜［００４０］および［００４４］〜［００５５］のいずれか１つに記載した方法の所定の実施形態では、制限酵素は、メガヌクレアーゼである。所定の実施形態では、制限酵素は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングメガヌクレアーゼである。特定の実施形態では、制限酵素は、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＤｍｉＩおよびＰＩ−ＰｆｕＩからなる群から選択される。

【0057】

［０００８］〜［００１３］、［００２２］、［００２３］、［００２５］、［００２６］、［００３５］、［００３６］、［００３８］〜［００４０］および［００４４］〜［００５５］のいずれか１つに記載した方法の一部の他の実施形態では、制限酵素は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。

【0058】

段落［０００８］〜［００１３］、［００２２］、［００２３］、［００２５］、［００２６］、［００３５］、［００３６］、［００３８］〜［００４０］および［００４４］〜［００５７］のいずれか１つに記載した方法の所定の実施形態では、制限酵素は、形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で適合する付着端を生成することができる。

【0059】

段落［００４４］〜［００５８］のいずれか１つに記載した方法の一部の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞は、線状化ＤＮＡを用いて形質転換される。一部の他の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞は、環状ＤＮＡを用いて形質転換される。

【0060】

段落［００４４］〜［００５９］のいずれか１つに記載した方法の一部の実施形態では、線状化もしくは環状ＤＮＡは、１つ以上の関心対象の遺伝子を含む。所定の実施形態では、関心対象の遺伝子は、１つの酵素をコードする。特定の実施形態では、関心対象の遺伝子は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの２つ以上の混合物をコードする。さらに他の特定の実施形態では、関心対象の遺伝子は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの２つ以上の混合物をコードする。

【0061】

段落［００４４］〜［００６０］のいずれか１つに記載した方法の所定の実施形態では、線状化もしくは環状ＤＮＡは、選択マーカーを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、好適には、ａｌｓ１、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチシジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子またはチミジンキナーゼマーカーである。

【0062】

段落［００４４］〜［００６１］のいずれか１つに記載した方法の一部の実施形態では、本方法は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を使用する工程を含まない。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも約２０、３０、４０、５０、１００、１５０または２００ヌクレオチド長であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を使用する工程を含まない。所定の実施形態では、本方法は、少なくとも１５０または２００ヌクレオチド長であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡ配列を使用する工程を含まない。所定の実施形態では、本方法は、少なくとも約２０、３０、４０または５０ヌクレオチド長であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＲＮＡ配列を使用する工程を含まない。

【0063】

段落［００４４］〜［００６１］のいずれか１つに記載した方法の一部の実施形態では、本方法は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を使用する工程を含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも約１５０、２００、３００または４００ヌクレオチド長であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡ配列を使用する工程を含む。特定の実施形態では、本方法は、少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ヌクレオチド長であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡ配列を使用する工程を含む。本方法は、少なくとも約２０、３０、４０または５０ヌクレオチド長であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＲＮＡ配列を使用する工程を含む。所定の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、相同領域の少なくとも２０、３０、４０、５０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１，０００ヌクレオチドの全長にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一（またはＲＮＡの場合は同等）である。

【0064】

段落［００４４］〜［００６１］および［００６３］のいずれか１つに記載した方法の一部の実施形態では、本方法は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡ配列を使用する工程を含み、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ゲノム配列と相同であるＤＮＡ配列は、制限酵素によって切断された部位で相同組換えによってトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属染色体ＤＮＡと再結合する。

【0065】

段落［００４４］〜［００６４］のいずれか１つに記載した方法の所定の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ビレンス（Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ）、Ｔ．アスペレウム（Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）、Ｔ．ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、Ｔ．コニンギイ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、Ｔ．ロンギブラキアタム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）またはＴ．アトロビリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）菌株である。特定の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株である。

【0066】

また別の態様では、本開示は、段落［００４４］〜［００６５］のいずれか１つに記載した方法を使用して得られた遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を提供する。

【0067】

段落［００６６］に記載のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株の一部の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株は、１つ以上の関心対象の遺伝子を含む。所定の実施形態では、関心対象の遺伝子は、１つの酵素をコードする。特定の実施形態では、関心対象の遺伝子は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの２つ以上の混合物をコードする。さらに他の特定の実施形態では、関心対象の遺伝子は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの２つ以上の混合物をコードする。

【0068】

段落［００６６］〜［００６７］のいずれか１つに記載したトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株の所定の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ビレンス（Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ）、Ｔ．アスペレウム（Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）、Ｔ．ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、Ｔ．コニンギイ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、Ｔ．ロンギブラキアタム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）またはＴ．アトロビリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）菌株である。特定の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株である。

【0069】

さらにまた別の態様では、本開示は、関心対象のタンパク質を発現させる方法であって、ａ）段落［００６７］〜［００６８］のいずれか１つに記載したトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を使用する工程であって、関心対象の遺伝子は関心対象のタンパク質をコードする工程；およびｂ）トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株から関心対象のタンパク質を生成する工程を含む方法を提供する。所定の実施形態では、関心対象のタンパク質は、分泌タンパク質である。

【0070】

また別の態様では、本開示は、段落［００４４］〜［００６５］および［００６９］のいずれか１つに記載した方法を適用することによって生成された関心対象のタンパク質を提供する。

【0071】

さらにまた別の態様では、本開示は、段落［００７０］に記載した関心対象のタンパク質を含む組成物を提供する。

【0072】

また別の態様では、本開示は、リグノセルロース系バイオマス基質の加水分解、クリーニング用途、穀粒およびデンプン加工処理、動物栄養、食品組成物または織物処理における段落［００７１］に記載した組成物の使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0073】

【図1】ＡｃｌＡｍｙ１発現プラスミドであるｐＴｒｅｘ３ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１のベクターＮＴＩマップを示す図である。このベクターは、実施例１に記載したように、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ１）プロモーターおよびターミネーターによって駆動されるゲノムＡｃｌＡｍｙ１遺伝子からのＡｃｌＡｍｙ１発現を支持した。このベクターは、形質転換体が単独窒素源としてのアセトアミド上で増殖することを許容するａｍｄＳ選択マーカーを運んだ。

【図2】ｐＥＮＴＲＹ−ＡｃｌＡｍｙ１のベクターＮＴＩマップを示す図である。このベクターは、実施例１に記載したように遺伝子組換えされている。このベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ反応のための「ドナー」プラスミドとして機能する。

【図3】ＡｃｌＡｍｙｌ発現のためのＡｃｌＡｍｙ１発現プラスミドであるｐＴｒｅｘ８ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１のベクターＮＴＩマップを示す図である。このベクターは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ１）プロモーターおよびターミネーターによって駆動されるゲノムＡｃｌＡｍｙ１遺伝子からのＡｃｌＡｍｙ１発現を支持する。このベクターは、形質転換体が補給されたウリジンの非存在下で増殖することを許容するｐｙｒ２選択マーカーを運ぶ。

【図4A-4E】ｐＴｒｅｘ８ｇＭＡｃｌＡｍｙ１（図４Ａ）、ＰａｃＩの存在下のｐＴｒｅｘ８ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１（図４Ｂ）、図Ｂと同一であるがＰａｃＩを除去するカラム精製後（図４Ｃ）、鋳型としてｐＴｒｅｘ８ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１を使用したＰＣＲ増幅発現構築物（図４Ｄ）またはＰａｃＩを添加した図４Ｄと同一（図４Ｅ）のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の形質転換を示す図である。

【図5】安定性トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体のα−アミラーゼ活性を示す図である。

【図6】Ｉ−ＳｃｅＩ制限部位を備えるｐＢＪＰ６の構築を示す図である。約１．５ｋｂの５‘ＵＴＲ ｃｂｈ２、ＰｃｂｈＩおよびＴｃｂｈ２は、７．３ｋｂのｐＢＪＰ４プラスミドを生成するために、個別にＰＣＲ増幅させ、融合ＰＣＲによって一緒に融合させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＸｂａＩおよびＫｐｎＩ部位内にクローン化した。切断ＧＦＰ反復の合成配列をｐＢＪＰ４のＮｄｅＩ制限部位内に挿入し、ＧＦＰ反復の正確な幾何学的配置を備えるプラスミドを選択し、ｐＢＪＰ５（８．６Ｋｂ）と指名した。Ｉ−ＳｃｅＩ制限部位を備える最終の１０ｋｂのｐＢＪＰ６プラスミドは、２つのＩ−ＳｃｅＩ制限部位に取り囲まれた、ＰＣＲ増幅Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧマーカーをｐＢＪＰ５の単一ＰｍｅＩ部位内にクローン化することによって得られる。

【図7】ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉ−ＳｃｅＩ活性アッセイセットアップの論拠を示す図である。星印（^＊）は切断ＧＦＰ配列を表し、反復ＧＦＰ配列は、密度の高い斜線の箱を用いて示されている。

【図8】Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｐ３７ｄｅｌｔａ ｃｂｈＩｐｙｒＧ−２６のゲノム内へのＩ−ＳｃｅＩ制限部位の導入を示す図である。（Ａ）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム内のＩ−ＳｃｅＩ制限部位カセットの図。下記の（Ｂ）〜（Ｄ）のサウザンブロットを実施するために使用される制限酵素は、垂直の矢印を用いて示した。パネルＡの下部の棒によって表される３種の異なるプローブ（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）は、完全構築物の存在およびコピー数を確証するために使用されている。図には予想制限消化断片／サウザンブロットバンドのサイズを示した。（Ｂ）〜（Ｄ）９つの形質転換体（レーン１〜９）および親菌株（レーン１０）のサウザンブロット分析。レーン１〜１０におけるサンプルについての菌株名は、パネルＤの右側に示した。（Ｂ）これらの菌株のゲノムＤＮＡはＸｂａＩを用いて消化し、次にプローブ１とハイブリダイズさせた。５．４Ｋｂのバンドは、ゲノム内に存在する場合のＩ−ＳｃｅＩ制限カセットを表す。左側の数は、正確なバンドのサイズを示す。（Ｃ）ゲノムＤＮＡはＰｓｔＩを用いて消化し、次にプローブ２とハイブリダイズさせた。６．３Ｋｂは、組込みＩ−ＳｃｅＩ制限部位カセットの予想バンドサイズである。（Ｄ）ゲノムＤＮＡはＸｈｏＩを用いて消化し、次にプローブ３とハイブリダイズさせた。プローブ３を用いて予想されるバンドサイズは、２．３Ｋｂである。

【図9】Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉ−ＳｃｅＩ活性試験を示す図である。Ｉ−ＳｃｅＩの誘導は、ウリジン栄養要求性表現型をもたらすであろうＤＳＢを作成すると予測される。菌株は、３０℃で４日間にわたり炭素源としてのグルコースもしくはラクトースを含む最小培地±ウリジン上に点接種した。Ｉ−ＳｃｅＩの発現は、ラクトースベースの培地上で、ｐｙｒＧマーカーのループアウトおよびその後に菌株のウリジンを伴わない培地上での増殖の不能力をもたらすＤＳＢを誘導する。矢印は、増殖が見られない領域を示す。

【図10】ＧＦＰを使用したＩｎ ｖｉｖｏ Ｉ−ＳｃｅＩ活性試験を示す図である。Ｉ−ＳｃｅＩ発現の誘導は、緑色蛍光菌糸によって示される、ｐｙｒＧマーカーの切除およびＧＦＰの修復を生じさせる。菌株は、ｐｙｒＧマーカーを誘導する、および消失各々を許容するためにラクトースおよびウリジンを含有するｔｒＭＭ上で増殖させた。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞は、細胞外観については微分干渉顕微鏡（ＤＩＣ）または緑色蛍光タンパク質発現（ＧＦＰ）については蛍光顕微鏡によって観察した。

【図11】Ｉ−ＳｃｅＩによって媒介されるグルコアミラーゼ発現カセットの標的組込みアプローチについての論拠を示す図である。Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位でのグルコアミラーゼカセットの標的組込みは、ａｌＳ耐性、ウリジン栄養要求性およびグルコアミラーゼ産生をもたらすと予想される。

【図12】Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）においてＩ−ＳｃｅＩを発現することにより増加した形質転換頻度を示す図である。ラクトース／グルコースまたはグルコースプレート上のコントロール菌株（ＪＰ７．７）およびＩ−ＳｃｅＩ発現菌株ＪＰ７．７．１２（ＪＰ７．７＋ｐＴＴＴ−Ｉ−ＳｃｅＩ）。ラクトースを介してのＩ−ＳｃｅＩの誘導は形質転換頻度を増加させる。

【図13】Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位でのグルコアミラーゼカセットの標的組込みのための分泌形質転換体のサウザンブロット分析を示す図である。（Ｉ）ｐＪＰ８がＩ−ＳｃｅＩランディング部位（ｃｂｈ２遺伝子座）で組み込まれている、またはされていない（依然としてｃｂｈ２遺伝子座にｐＢＪＰ６が存在する）場合の予想ブロットサイズを示すサウザンブロットを示す図。サウザンブロットを実施するために使用される制限酵素は、棒によって示した。２つの異なるプローブ（ＰｃｂｈＩおよびＴｃｂｈ２）はそれぞれ５’側および３’側での組込みを確証するために使用した。予想バンドのサイズは図の中に示した。（ＩＩ）１２の形質転換体のサウザンブロット分析（レーン１〜１２）。（ＩＩ−Ａ）これらの形質転換体のゲノムＤＮＡはＳｐｅＩを用いて消化し、次にプローブＰｃｈＩとハイブリダイズさせた。５．５Ｋｂのバンドは、５’側でのｐＪＰ８カセットの相同性組込みを表し、３．６Ｋｂは、Ｉ−ＳｃｅＩ制限部位カセット（ｐＢＪＰ６）が依然としてｃｂｈ２遺伝子座に存在する場合の予想サイズである。左側の数は、バンドのサイズを示す。（ＩＩ−Ｂ）ゲノムＤＮＡはＢａｍＨＩを用いて消化し、次にプローブＴｃｂｈ２とハイブリダイズさせた。６．８Ｋｂは、３’側で組み込まれたｐＪＰ８の予想バンドサイズであり、組み込まれなかった場合は３Ｋｂである。選択された形質転換体のｐｙｒＧ表現型および相対的グルコアミラーゼ活性は、ブロット図の隣の表に表示されている。

【図14】標的（ｐｙｒＧ−）と非標的形質転換体との間のグルコアミラーゼ活性の比較を示す図である。ｐｙｒＧ表現型（標的組込みを示す「ｐｙｒＧ−」および非標的組込みを示す「ｐｙｒＧ＋」）が各形質転換体について示されている。親菌株のグルコアミラーゼバックグラウンド活性は、左側の固体「Ｃ」棒によって表されている。白色棒は、Ｉ−ＳｃｅＩ誘導性条件からグルコアミラーゼを発現する形質転換体を表す。斜線棒はＩ−ＳｃｅＩ非誘導性条件からグルコアミラーゼを発現する形質転換体を表し、点状棒は、コントロール形質転換体を表す。２本の水平の棒（「１．３５」および「０．９」の隣）は、標的組込み形質転換体の相対的グルコアミラーゼ活性の境界を確定した。

【図15】Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位でのグルコアミラーゼカセットの標的および非組込み形質転換体についてのサウザンブロット分析を示す図である。サウザンブロットのセットアップは、図１３に記載したものと同一である。（Ａ）これらの形質転換体のゲノムＤＮＡはＳｐｅＩを用いて消化し、次にプローブＰｃｈＩとハイブリダイズさせた。ｐＪＰ８がＩ−ＳｃｅＩランディング部位の５’側で組み込まれた場合の予想される正確なサイズは、５．５Ｋｂである。（Ｂ）ゲノムＤＮＡはＢａｍＨＩを用いて消化し、次にプローブＴｃｂｈ２とハイブリダイズさせた。６．８Ｋｂは、Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位の３’側でのｐＪＰ８の正確な組込みの予想バンドサイズである。形質転換体１〜１０は、Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位で標的組込みされており（青色棒の制限）、グルコアミラーゼ発現における低い可変性を示している。形質転換体１１〜１６は、ランダム組込み形質転換体（赤色棒の制限）であり、Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位でのｐＪＰ８カセットの部分組込み（形質転換体１１〜１４）もしくはカセットの非組込み（形質転換体１２、１３および１５）またはカセットの複数コピーランダム組込み（形質転換体１６）を備えるグルコアミラーゼ発現における高可変性を有する。Ｐ３７ｄｅｌｔａ ｃｂｈＩｐｙｒＧ−２６菌株は、ブロットの最終線におけるコントロールとして使用されたが、予想されるように、ＰｃｂｈＩを使用した場合にこの菌株のハイブリダイゼーションが生じないと予想される（ブロットＡ）。プローブとしてＴｃｂｈ２を使用してコントロールを用いた予想ブロットサイズは、６．９Ｋｂである（ブロットＢ）。

【図16】発現プラスミドであるｐＴＴＴ−Ｉ−ＳｃｅＩのプラスミドマップを示す図である。これは、ｃｂｈＩプロモーターによって駆動され、ｃｂｈＩターミネーターを末端とする合成コドン最適化遺伝子からのＩ−ＳｃｅＩの発現を支持する。これは、真菌形質転換体が単独窒素源としてのアセトアミド上で増殖するためのａｍｄＳ選択マーカーを含有している。このプラスミドは、ベクター上のテロメア配列反復に起因して真菌細胞内で自律的に維持される。

【図17A-17B】多数の制限酵素を用いた処理による安定性Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の増加した百分率を示す形質転換プレートの写真を示す図である。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株は、いずれの制限酵素による処理も行われていない溶解性セルロースモノオキシゲナーゼ（ＥＧ４）コーディング配列を含むＰＣＲ断片を用いて形質転換させ（「ＰＣＲ」と標識した左側パネル）、２０単位のＡｓｉＳＩ（「ＰＣＲ＋ＡｓｉＳＩ」と標識した図１７Ａの中央パネルおよび「ＡｓｉＳＩ」と標識した図１７Ｂの中央パネル）で処理した、またはＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩおよびＳｗａＩ（「ＰＣＲ＋ＡｓｉＳＩ＋ＰａｃＩ＋ＳｗａＩ」と標識した図１７Ａの右側パネル）もしくはＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩ（「３つの酵素」と標識した図１７Ｂの右側パネル）のそれぞれ７単位で処理した。

【発明を実施するための形態】

【0074】

Ｉ．概説
本開示は、真菌宿主株およびそれらを作成および使用するための組換えＤＮＡ構築物に関する。真菌宿主株は、信頼できるもしくは低い可変性方法で関心対象のタンパク質を発現させるために特に安定性および有用である。本開示はさらに、そのように構築された真菌宿主株、関心対象のタンパク質およびそのような改良された真菌宿主株の発酵により調製されるそのような関心対象のタンパク質を含む組成物の使用に関する。

【0075】

本明細書に記載した方法は、改良された信頼性を備える関心対象のタンパク質または関心対象の変異体を発現する。そこで用語「改良された信頼性」は、（１）形質転換体の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％）は安定性形質転換体であること；または（２）形質転換体の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％）はバックグラウンド発現レベルを超えて意図されたように関心対象のタンパク質もしくは変異体を発現すること；または（３）関心対象のタンパク質もしくは変異体は、６０％未満（例えば、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満もしくは２％未満）で変動する発現レベルを備えて発現することを意味する。上記の（３）または本明細書の他の場所で言及された用語「発現レベル変動」は、最高および最低発現レベル間の差を、最高発現レベルとバックグラウンド発現レベルとの差である数値によって割ることによって定義もしくは決定されるが、このとき全決定は同一構築物および同一の関心対象の遺伝子もしくは変異体を用いて実施される。

【0076】

ＩＩ．定義
本特許の菌株、組成物および方法について記載する前に、下記の用語および語句について定義する。定義されていない用語は、当分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。

【0077】

ある範囲の数値が提供される場合、状況が明確に他のことを指示しない限り、その範囲の上限と下限の間にある下限値の単位の１０分の１までの各介在値、およびその範囲内の任意の他の記載された値もしくは介在値は、本発明の組成物および方法の範囲内に含まれると理解されている。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲内に含まれてよく、同様に上記の範囲内の任意の限度が特別に除外されることを前提として、本発明の組成物および方法内に含まれる。上記の範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限度のいずれかもしくは両方を排除する範囲もまた、本発明の組成物および方法の中に含まれる。

【0078】

所定の範囲は、用語「約」が先行する数値を用いて提示される。用語「約」は、本明細書では、それが先行する正確な数ならびにその用語が先行する数に近い、もしくは近似する数についての文字による支持を提供するために使用される。数が特別に挙げられた数に近い、もしくは近似するかどうかを決定する際には、近い、もしくは近似する挙げられていない数は、それが提示される状況において、特別に挙げられた数の実質的同等物を提供する数であってよい。例えば、数値と関連して、用語「約」は、その用語がその状況において他に特別に定義されない限り、数値の−１０％〜＋１０％の範囲を意味する。また別の例では、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が他に特別に定義されていない限り、５．４〜６．６のｐＨを意味する。

【0079】

本明細書に提供した見出しは、全体として本明細書を参照することによって得ることのできる本組成物および本方法の様々な態様もしくは実施形態を制限するものではない。したがって、直下に定義した用語は、全体として本明細書を参照することによってより十分に定義される。

【0080】

本文献は、読み易くするために多数のセクションで構成されている；しかし、読者には、１つのセクションに記載された記述が他のセクションにも適用できることを理解されるであろう。この方法で、本開示の様々なセクションのために使用された見出しは、制限するものと見なすべきではない。

【0081】

他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明の組成物および方法が属する分野の当業者であれば一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載したものと類似もしくは同等の任意の方法および材料は、さらに本発明の組成物および方法の実践もしくは試験においても使用することができ、以下では代表的な例示的方法および材料について説明する。

【0082】

本明細書で言及した全ての刊行物および特許は、それぞれ個別の刊行物もしくは特許が参照により組み込まれると特別および個別に指示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、それらの刊行物に言及されている方法および／または材料と関連付けて方法および／または材料を開示および記述するために参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物についての言及は、出願日前の開示のためであり、本発明の組成物および方法には先行発明によってそのような刊行物に先行する資格が与えられないとの承認であると見なすべきではない。さらに、提供した刊行日は、独立して確証される必要がある実際の刊行日とは異なる可能性がある。

【0083】

本発明の詳細な説明にしたがうと、下記の略語および定義が適用される。単数形「１つの」および「その」は、状況が明白に他のことを指示していない限り、複数形を含む。そこで、例えば「１つの酵素」との言及には複数のそのような酵素が含まれ、「用量」との言及には１つ以上の用量および当業者には知られているそれらの同等物などが含まれる。

【0084】

さらに、特許請求項はあらゆる任意選択的要素を排除するために作成できることに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求項の要素の言及と関連付けた「単独で」、「唯一の」などの排他的用語を使用するため、または「消極的」限定の使用のための優先的根拠として機能することが意図されている。

【0085】

用語「組換え」は、主題細胞、核酸、ポリペプチド／酵素またはベクターに関して使用した場合、主題がその自然状態から修飾されていることを示す。そこで、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形内で見いだされない遺伝子を発現する、または異なるレベルで、もしくは自然では見いだされる条件とは異なる条件下で天然遺伝子を発現する。組換え核酸は、天然配列とは１つ以上のヌクレオチドが相違する場合がある、および／または例えば異種プロモーターなどの異種配列、発現ベクター内で分泌などを許容するシグナル配列と機能的に連結している。組換えポリペプチド／酵素は、天然配列とは１つ以上のアミノ酸が異なる場合がある、および／または異種配列と融合している。関心対象のタンパク質をコードする核酸を含むベクターは、例えば、組換えベクターである。

【0086】

さらに、本明細書で使用する用語「から本質的になる」は、この用語の後の成分が、全組成物の３０重量％未満の総量にあってこの成分の作用もしくは活性に寄与しない、または妨害しない他の公知の成分の存在下で存在する組成物を意味することに留意されたい。

【0087】

さらに、本明細書で使用する用語「含んでいる」は、それには限定されないその用語の後の成分を「含んでいる」ことを含むことを意味する。用語「含んでいる」の後の成分は、必要とされる、または必須であるが、これらの成分を含んでいる組成物は、さらに他の非必須もしくは任意選択的成分を含むことができる。

【0088】

さらに、本明細書で使用する用語「からなる」は、その用語の後の成分「からなる」ことを含むことを意味し、それに限定される。用語「からなる」の後の成分は、このため必要とされる、または必須であり、本組成物中には他の成分が全く存在しない。

【0089】

当業者には本開示を読めば明白であるように、本明細書に記載および例示した個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載した本発明の組成物および方法の範囲もしくは精神から逸脱せずに他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴とは容易に分離することができる、または組み合わせることができる別個の成分および特徴を有する。任意の言及した方法は、言及した事象の順に、または論理的に可能である任意の他の順に実施することができる。

【0090】

本明細書で使用する用語「遺伝的に安定性の菌株」は、不安定菌株と比較してそれらのより迅速な増殖速度に関する。さらに、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの多数の糸状菌宿主を使用すると、固体培養培地上のギザギザの輪郭とは対照的に、平滑さを備える環状コロニーの形成を際立った特徴として使用できる。

【0091】

用語「関心対象のタンパク質」は、任意選択的に高レベルで、および商業化の目的で糸状菌内で発現させることが望ましいポリペプチドを意味する。そのようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造的タンパク質などであってよい。

【0092】

本明細書で使用する用語「関心対象の遺伝子」は、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子を意味する。

【0093】

本明細書で使用する用語「ベクター」は、異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物を意味する。「発現ベクター」は、異種細胞内に異種ＤＮＡ断片を組み込んで発現させる能力を有するベクターを意味する。多数の原核生物および真核生物発現ベクターは、市販で入手できる。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内に含まれる。

【0094】

したがって、「発現カセット」もしくは「発現ベクター」は、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定核酸要素を用いて、組換え的もしくは合成的に生成された核酸構築物である。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスもしくは核酸断片内に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列およびプロモーターが含まれる。

【0095】

本明細書で使用する用語「プラスミド」は、コーディングベクターとして使用される、および多数の細菌および一部の真核生物内の特別な染色体自己複製遺伝要素を形成する環状二本鎖ＤＮＡ構築物を意味する。

【0096】

本明細書で互換的に使用する用語「選択マーカー」もしくは「選択可能マーカー」は、その発現が自然に存在する、または対応する選択的作用物質の存在下、または対応する選択的増殖条件下で増殖する能力を細胞に付与する、細胞内に導入される遺伝子を意味する。本明細書で使用する用語「選択可能マーカーコーディングヌクレオチド配列」は、そのような選択マーカーもしくは選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列を意味する。

【0097】

本明細書で使用する用語「プロモーター」は、下流遺伝子の転写を指示するために機能する核酸配列を意味する。プロモーターは、一般に、その中で標的遺伝子が発現させられる宿主細胞にとって適切であろう。プロモーターは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ぶ）と一緒に、頻回に所定の遺伝子を発現させるために使用される。一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列ならびにエンハンサーもしくはアクチベーター配列が含まれるがそれらに限定されない。

【0098】

本明細書で使用する用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを意味するために互換的に使用される。本明細書では、アミノ酸残基についての慣習的な１文字もしくは３文字コードが使用される。ポリマーは、直鎖状もしくは分岐鎖状であってよく、改変アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって分断化されてよい。これらの用語は、さらに、自然に、または、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または例えば標識化成分との共役結合などの任意の他の操作もしくは修飾インターベンションによって改変されているアミノ酸ポリマーも含んでいる。さらにこの定義の範囲内に含まれるのは、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド、ならびに当分野において公知の他の修飾である。

【0099】

本明細書で使用する「真菌」は、例えば酵母および「カビ」などの微生物ならびに「キノコ」を含む大きな群の真核生物の任意のメンバーである。これらの生物は、植物、動物、原生生物および細菌とは別個の真菌界として分類される。１つの主要な相違は、真菌細胞が、セルロースを含有する植物および一部の原生生物の細胞壁とは異なり、および細菌の細胞壁とは異なり、キチンを含有する細胞壁を有することである。

【0100】

本明細書で使用する「子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の真菌株」は、真菌界内の子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）内の任意の生物を意味する。代表的な子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌細胞には、例えば、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）およびペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ）などのチャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）内の糸状菌が含まれるがそれらに限定されない。

【0101】

本明細書で使用する「糸状菌」は、真菌植物（Ｅｍｙｃｏｔａ）亜門および卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門の全ての糸状菌形を意味する。例えば、糸状菌には、制限なく、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオプトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種が含まれる。一部の実施形態では、糸状菌は、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス・オリザエ）であってよい。一部の実施形態では、糸状菌は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブチヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）もしくはフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）である。一部の実施形態では、糸状菌は、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シタリジウム・サーモフィラム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）もしくはチエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）である。一部の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、例えばＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０ （１９８４） ｐｐ．４６−５３；Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ Ｂ．Ｓ．，Ｃａｎ．，１−２０，１９８７），ＱＭ９４１４ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６９２１），ＮＲＲＬ １５７０９，ＡＴＣＣ １３６３１，５６７６４，５６４６６，５６７６７，またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、例えばＡＴＣＣ３２０９８および３２０６８である。一部の実施形態では、糸状菌は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションからトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ５６７６５として入手できるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ３０である。これに関連して、一部の実施形態では、本開示は本明細書に記載した糸状菌のいずれか１つの全細胞ブロス調製物を提供する。

【0102】

「異種」核酸構築物もしくは核酸配列は、その中で発現する細胞にとって天然形ではない、または天然形で存在しない配列の一部分を有する。制御配列に関して「異種」は、それの発現を現在調節している同一遺伝子を調節するために自然には機能しない制御配列（すなわち、プロモーターもしくはエンハンサー）に関する。一般に、異種核酸配列は、細胞またはそれらがその中に存在するゲノムの一部にとって内因性ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に加えられている。「異種」核酸構築物は、天然細胞内で見いだされる制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせと同一である、または異なる制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせを含有することができる。

【0103】

本明細書で使用する用語「宿主細胞」には、単細胞生物、多細胞生物に由来して組織培養中に配置された細胞または本発明による核酸構築物を用いた形質転換を受けやすい多細胞生物の一部として存在する細胞のいずれであろうと、任意の真菌が含まれる。例えば酵母および他の真菌細胞などのそのような宿主細胞は、ＤＮＡを複製して、本発明において使用するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを生成するために使用できる。好適な細胞は、一般に糸状菌もしくは酵母である。特に好ましいのは、糸状菌、好ましくは、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ツビンゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属である。他の好ましい生物には、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）およびＴ．ロンギブラキアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）のいずれか１つが含まれる。

【0104】

本明細書で使用する「形質転換（された）」は、細胞が組換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを意味する。形質転換は、典型的には細胞内への１つ以上のヌクレオチド配列の挿入によって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列であってよい、すなわち、例えば融合タンパク質などの形質転換されなければならない細胞にとって自然ではない配列である。

【0105】

用語「誘導」には、「に由来した」、「得られた」、「入手可能」および「作成された」が含まれ、一般には、１つの特定の材料がまた別の材料中にその起源が見いだされる、または他の特定の材料を参照して記載できる特徴を有する。

【0106】

本明細書で使用する用語「遺伝子」は、コーディング領域に先行する、もしくはコーディング領域の次に来る領域を含んでいても含んでいなくてもよい、ポリペプチドを生成する際に含まれるＤＮＡのセグメント、例えば５’未翻訳（５１ＵＴＲ）もしくは「リーダー」配列および３’ＵＴＲもしくは「トレーラー」配列ならびに個別コーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を意味する。他の実施形態では、遺伝子は商業的に重要な工業用タンパク質もしくはペプチド、例えば、プロテアーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼおよびリパーゼなどの酵素をコードする。関心対象の遺伝子は、天然型遺伝子、変異遺伝子または合成遺伝子であってよい。

【0107】

本明細書で互換的に使用する用語「制限酵素」、「制限エンドヌクレアーゼ」もしくは「部位特異的エンドヌクレアーゼ」は、制限部位として公知の特異的制限ヌクレオチド配列もしくはその近くでＤＮＡを切断する酵素である。制限酵素は、一般に、それらの構造が相違し、それらがそれらのＤＮＡ基質をそれらの認識部位で切断するかどうか、または認識および切断部位が相互に離れているかどうかで３つのタイプに分類される。タイプＩは、認識配列から約１，０００塩基対以上のランダム部位で切断できる。タイプＩＩの切断配列は、その認識配列と重複する。タイプＩＩＩは、認識配列から約２５塩基対でＤＮＡを切断する。さらに、制限酵素に分類されるのは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、例えばＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。メガヌクレアーゼは、ゲノム内では極めて希である約１２〜４０塩基対の大きな認識部位を認識する天然型制限酵素である。メガヌクレアーゼの例には、ホーミングメガヌクレアーゼ、例えばその例にはＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＤｍｉＩおよびＰＩ−ＰｆｕＩが含まれるＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーが含まれる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ由来の非特異的ＤＮＡ切断ドメインとジンクフィンガータンパク質との融合である。ＺＦＮ二量体は、ＤＮＡ損傷反応経路を刺激する標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。設計されたジンクフィンガードメインの結合特異性は、ＺＦＮを特異的ゲノム部位に方向付ける。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＦｏｋＩ切断ドメインとＴＡＬＥタンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインとの融合である。ＴＡＬＥは、それぞれが単一塩基対を認識する多数の３３〜３５アミノ酸反復ドメインを含有する。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ損傷反応経路を活性化してカスタム変化を可能にする標的ＤＳＢを誘導する。ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の一部である。ＣＲＩＳＰＲもしくはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｐｅａｔｓ（クラスター化された規則的に間隔が空いた短いパリンドローム反復）は、複数の短い直接反復を含有しており、細菌もしくは古細菌に獲得免疫を提供する遺伝子座である。ＣＲＩＳＰＲ系は、侵襲性異種ＤＮＡの配列特異的サイレンシングについてはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに依存する。３つのタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が存在する。タイプＩＩ系では、Ｃａｓ９はｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ標的認識後にＤＮＡを切断するＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能する。

【0108】

ＤＮＡを切断するために、全制限酵素は、１回ずつＤＮＡ二重らせんのそれぞれの糖リン酸塩骨格（すなわち、各ストランド）を通して２回切開する。３，０００種を超える制限酵素が詳細に研究されてきており、これらの内６００種超が市販で入手可能である。これらの酵素は、研究室でのＤＮＡ修飾のために日常的に使用されており、分子クローニングにおける重要なツールである。例えば、下記の制限酵素：ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＰｍｅＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｒｆＩおよびＳｇｆＩは、８塩基対の制限部位を認識し、市販で入手できる。本明細書で使用する制限酵素には、それらが糸状菌の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる限り、天然型制限酵素および合成、ハイブリッドもしくは突然変異制限酵素の両方が含まれる。

【0109】

本明細書で使用する用語「制限酵素部位」、「制限部位」もしくは「認識部位」は、様々な制限酵素によって認識されるヌクレオチドの特異的（長さが４〜８塩基対から１２〜４０塩基対）配列を含有するＤＮＡ分子上の場所である。これらは、パリンドローム配列（多数の制限酵素がホモダイマーとして結合するため）または非対称性（オーダーメイド設計ＴＡＬＥＮもしくはＺＮＦヌクレアーゼのため）のいずれかであってよく、特定制限酵素は、どこか近くで、または例えば１，０００ｂｐ超など離れた箇所でその認識部位内の２つのヌクレオチド間の配列を切断することができる。例えば、共通制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位は、パリンドローム配列であるＧＡＡＴＴＣを認識し、どちらも上部および底部ストランド両方の上のＧとＡとの間を切断し、各末端にＡＡＴＴのオーバーハングを残す。オーバーハングは、粘着性もしくは付着端としても公知である付着相補体を伴わないＤＮＡストランドの末端部分である。このオーバーハングは次に、適合する付着端（例えば、また別のＥｃｏＲＩ切断片）としても公知である相補的オーバーハングを備えるＤＮＡの一片に結紮するために使用できる（ＤＮＡリガーゼを参照されたい）。一部の制限酵素は、平滑末端と呼ばれる、制限部位にオーバーハングを残さない方法でＤＮＡを切断する。

【0110】

本明細書で使用する用語「同一性率（％）」は、用語「相同性率（％）」と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用して整列させた場合に、本発明のポリペプチドもしくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか１つをコードする核酸配列間の核酸配列もしくはアミノ酸配列の同一性のレベルを意味する。

【0111】

ＩＩＩ．真菌宿主株およびＤＮＡ構築物ならびにそれらの使用方法
本開示は、真菌宿主株およびそれらを作成および使用するための組換えＤＮＡ構築物に関する。真菌宿主株は、当分野において公知の他の発現方法と比較して、より高い信頼性および／または発現レベルにおけるより低い可変性を備える、これらの宿主内での関心対象の遺伝子もしくは変異体の発現を提供するために使用できる。真菌宿主株は、特定の実施形態では、信頼できるもしくは低い可変性方法で関心対象の遺伝子を発現させるための遺伝子組込みを効率的に標的とするために有用である。

【0112】

１．制限酵素媒介性組込み法（ＲＥＭＩ）を使用した遺伝的に安定性の形質転換真菌株の構築
第１態様では、本開示は、遺伝的に安定性の形質転換真菌宿主株を構築する方法であって、ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を含む方法を提供する。

【0113】

その第１態様では、本開示は、さらに遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を構築する方法であって、ａ）線状化（「線状」とも呼ぶ）もしくは環状ＤＮＡと制限酵素（制限酵素の「処理を用いて」とも呼ぶ）との混合物を使用してトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる工程；およびｂ）ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を選択する工程であって、制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の処理を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い工程を含む方法を提供する。

【0114】

その第１態様では、本開示は、さらに遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を構築する方法であって、ａ）線状化もしくは環状ＤＮＡを用いてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程であって、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞は制限酵素を生成するように誘導され、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することができる工程；およびｂ）ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を選択する工程であって、制限酵素の誘導を用いた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の誘導を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い工程を含む方法を提供する。

【0115】

第２態様では、本開示は、上記の第１態様に記載した方法を使用して得られた遺伝的に安定性の形質転換真菌株を提供する。

【0116】

第３態様では、本開示は、真菌形質転換体の安定性を改良する方法であって、線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程を含む方法を提供する。

【0117】

その第３態様では、本開示は、さらに線状化もしくは環状ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用してトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体の安定性を改良する方法であって、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することができ、制限酵素の処理を用いて生じた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の処理を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い方法を提供する。

【0118】

その第３態様では、本開示は、さらにトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体の安定性を改良する方法であって、線状化もしくは環状ＤＮＡを使用してトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程を含み、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる制限酵素を生成するように誘導され、制限酵素の処理を用いて生じた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の誘導を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い方法を提供する。

【0119】

ａ．伝統的な真菌株構築法
関心対象のタンパク質のための生成宿主としての真菌株の使用は、長年にわたり経済的に実行可能であると見なされてきて、これまでの期間は商業的環境において広範に使用されてきた。真菌に対する形質転換および菌株構築のために、ＰＥＧ／プロトプラスト形質転換（Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８）、電気的形質転換（Ｋａｒｕｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、バイオリスティクス（Ａｒｍａｌｅｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介性形質転換（ＡＴＭＴ） （ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８）およびＲＮＡ緩衝（ＲＮＡｉ）技術（Ａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）による標準方法を含む様々な遺伝子法が開発されてきた。

【0120】

所定の実施形態では、形質転換のためにアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）またはヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．）を調製するために、真菌の菌糸体由来のプロトプラストが調製される。例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６；１９８９を参照されたい。菌糸体は、発芽した栄養胞子から入手できる。菌糸体を細胞壁を消化する酵素を用いて処理すると、プロトプラストが生じる。プロトプラストは、次に、懸濁媒中の浸透安定剤の存在によって保護される。好適な安定剤には、例えば、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウムなどが含まれる。典型的には、安定剤の濃度は、約０．８Ｍ〜約１．２Ｍ（例えば、約０．９Ｍ〜約１．２Ｍ、約１．０Ｍ〜約１．２Ｍ、約１．１Ｍ〜約１．２Ｍなど）で変動する可能性がある。

【0121】

特定の実施形態では、懸濁媒中で約１．２Ｍのソルビトールが安定剤として使用される。宿主株（例えば、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）またはヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．）（トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．））内へのＤＮＡの取り込みは、頻回にカルシウムイオン濃度に依存する。一般に、約１０ｍＭのＣａＣｌ_２〜約５０ｍＭのＣａＣｌ_２（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）が取込み溶液に使用される。取込み溶液中にカルシウムイオンを含むことの他に、頻回に含まれる他の品目は、緩衝系、例えばＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）；１ｍＭのＥＤＴＡ）または１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ６．０）バッファー（モルホリンプロパンスルホン酸）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。このバッファー中のポリエチレングリコールは、細胞膜を融解させ、そこで培地の内容物が宿主株（例えば、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）またはヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．））の細胞質中に送達されることを許容し、プラスミドＤＮＡが核に運ばれると考えられている。所定の実施形態では、この融解工程は、宿主染色体内に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーを残す。

【0122】

通常、形質転換では、１０^５〜１０^６／ｍＬ、好ましくは２×１０^５／ｍＬの密度での透過性処理を受けているアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）プロトプラストもしくは細胞を含有する懸濁液が使用される。同様に、形質転換では、１０^８〜１０^９／ｍＬ、好ましくは２×１０^８／ｍＬの密度での透過性処理を受けているヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．（トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．））プロトプラストもしくは細胞を含有する懸濁液が使用される。適切な溶液（例えば、１．２Ｍのソルビトール；５０ｍＭのＣａＣｌ２）中の体積１００μＬのこれらのプロトプラストもしくは細胞を所望のＤＮＡと混合する。一部の実施形態では、実質的量のＰＥＧを取込み溶液に加える。例えば、プロトプラスト懸濁液には約０．１〜約１体積の２５％のＰＥＧ４０００を加えることができる。特定の例では、約０．２５体積の２５％のＰＥＧ４０００をプロトプラスト懸濁液に加える。例えば、ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウムなどの添加物もまた、取込み溶液に加えると形質転換を補助することができる。

【0123】

所定の実施形態では、この混合物を約０℃で約１０〜約３０分間の期間にわたりインキュベートする。所望の遺伝子もしくはＤＮＡ配列の取込みをさらに強化するために、追加のＰＥＧを混合物に加えることができる。所定の実施形態では、２５％のＰＥＧ４０００を形質転換混合物の体積の５〜１５倍の体積で加えることができる；しかし、これより多いおよび少ない体積もまた好適な可能性がある。例えば、２５％のＰＥＧ４０００は、一部の実施形態では、形質転換混合物の体積の１０倍で加えられる。ＰＥＧを加えた後、形質転換混合物は次に室温または氷温のいずれかでインキュベートし、その後にソルビトールおよびＣａＣｌ_２溶液を加える。次に増殖培地のアリコートを溶融させるためにプロトプラスト懸濁液がさらに加えられる。この増殖培地は、形質転換体の増殖を許容する。本開示の所望の形質転換体を増殖させるためには、多数の増殖培地を好適に使用することができる。所定の実施形態では、例えば、Ｐｙｒ＋形質転換体が選択される場合は、ウリジンを含有しない増殖培地を使用するのが好ましい。例えば、コロニーは、ウリジンを含まない増殖培地上に移動させられて精製される。

【0124】

この段階で、安定性形質転換体は、それらのより迅速な増殖速度によって不安定性形質転換体から識別することができる。さらに、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの多数の糸状菌宿主を使用すると、ウリジンが欠如する固体培養培地上のギザギザの輪郭とは対照的に、平滑さを備える環状コロニーの形成を際立った特徴として使用できる。一部の実施形態では、さらに、安定性の試験および選択は、固体非選択培地（例えば、ウリジンを含有する）上で形質転換体を増殖させる工程、この培養培地から胞子を収穫する工程およびこれらの胞子の百分率を決定する工程によって実施することができる。選択された胞子は、ウリジンが欠如する選択培地上で発芽させて増殖させられる。安定性形質転換体の百分率は、試験した全形質転換体の間で計算できる。

【0125】

上記の形質転換法を使用すると、安定性形質転換体の百分率は、５〜３０％の間で変動する可能性があり、これは最善の菌株を選択するためには極めて多数の形質転換体をスクリーニングしなければならないことを意味する。安定性頻度は、使用される、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株内の選択マーカーに依存する可能性がある。さらに、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のような一部の他の真菌と比較して、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属における不安定性形質転換体の頻度が極めて高い理由は依然として知られていない。この高レベルの不安定性形質転換体のために、生産菌株のスクリーニングおよび選択の工程は、極めて労力を要して時間を消費する傾向がある。このため、低下した可変性を備える、関心対象のタンパク質を発現させるために遺伝的に安定性の形質転換真菌株を生成する信頼できる手段は、明白な長所を提供する。

【0126】

外因性ＤＮＡが標的遺伝子置換として染色体内に組み込まれると、外因性ＤＮＡは、ＤＮＡ ＤＳＢ（二本鎖切断）の細胞修復機序を含んでいる。ＤＳＢは、２つの主要経路：相同配列に依存するＨＲ（相同性組換え）経路および配列相同性に依存しないＮＨＥＪ経路を通してゲノムの維持において極めて重要な役割を果たす（Ｋａｎａａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。これらの２つの修復機序は、独立して機能するが、機能における競合を明らかにすると考えられる（ｖａｎ Ｄｙｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。単細胞真核生物であるＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ＨＲがＤＳＢを修復する際に含まれる主要経路であるが、大多数の糸状菌におけるＨＲの低頻度（５％）は標的遺伝子置換に関する研究を妨害した（Ｗｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００６）。その結果として、糸状菌における高度に効率的な遺伝子ターゲティングを達成するためには、ＮＨＩＪ経路の排除を通してＨＲ経路を増加させる方法が必要とされる。ＮＨＩＪ欠損性菌株はＨＲの効率を改良するために開発されてきたが、それはこの遺伝子がＨＲを介してその内因性遺伝子座により容易に組み込まれるからである。ＮＨＩＪ欠損性菌株の形態は野生型と類似であったが、突然変異体は例えばフレオマイシン、ブレオマイシンおよびメタンスルホン酸メチル／エチルなどの数種の化学物質に対してより感受性であった。このため、関心対象の遺伝子を標的方法で真菌ゲノム内に組み込むことができるように他の方法、系もしくはテクノロジーを開発する必要がある。

【0127】

ｂ．制限酵素媒介性組込み（ＲＥＭＩ）を使用する真菌株の構築
ＰＥＧ−プロトプラスト系をベースとする制限酵素媒介性組込み（ＲＥＭＩ）は、最初にＳ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において確立され（Ｓｃｈｉｅｓｔ ａｎｄ Ｐｅｔｅｓ，１９９１）、例えばコクリオボルス・ヘテロストロフス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４）およびアルテルナリア・アルテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）などの数種の真菌植物病原体において上首尾で適用されてきた。今日、ＲＥＭＩ技術は、病原性遺伝子の同定ならびに他の遺伝子機能評価において有用な極めて多数もしくは高百分率の真菌突然変異体を生成することに成功してきた。例えば、線虫捕捉真菌であるアルトロボトリス・オリゴスポラ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）を最適化ＲＥＭＩ法を用いて処理すると、１μｇの線状プラスミドＤＮＡ当たり、および総数２，０００個超の形質転換体中で３４〜１７５個の形質転換体が生じた。さらに、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の突然変異体ライブラリー内でＲＥＭＩによってスクリーニングした１１個の興味深い突然変異体およびコムギ瘡痂病、ＣＢＬ１およびＭＳＹ１における菌力と関連するまた別の２つの遺伝子もまた同定された（Ｓｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）。さらに、病原性または植物防御化合物に対する耐性に関連する数種のタンパク質は、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からＲＥＭＩ技術によって同定された（Ｄｕｙｖｅｓｔｅｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｉｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｍａｄｒｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）。これらをまとめると、改良された突然変異体（形質転換体）頻度および単一コピー挿入率は、ＲＥＭＩによって確実に得ることができる。

【0128】

本開示は、これまでに認識されても適用されてもいない状況におけるＲＥＭＩの使用を提供するが、すなわち、ＲＥＭＩは、形質転換体の頻度とは対照的に、安定性トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体の百分率を有意に増加させるために使用された。実際に、形質転換体の頻度は、ＲＥＭＩをトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に適用した場合に、予想されたよりも少ないことが見いだされた。しかし、作成された形質転換体の中では、頻度が減少すると、安定性形質転換体の数は劇的に増加する。

【0129】

また別の観点からは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属が制限酵素の存在下でＤＮＡを用いて形質転換された場合は、不安定性形質転換体の数は劇的に低下し、そこで安定性コロニーの容易な選択が可能になると記載された（図４Ａ〜４Ｅ）。

【0130】

伝統的なＰＥＧ媒介性形質転換実験では、安定性形質転換体の百分率は、５〜３０％の間で変動する可能性がある。対照的に、ＲＥＭＩがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ＰＥＧ媒介性形質転換実験のために適用されると、安定性形質転換体の百分率は９０％まで増加する。結果として、最高菌株を選択するためにスクリーニングしなければならない形質転換体の数は、有意に減らすことができる。

【0131】

さらに、ＲＥＭＩが適用されると、より高い百分率の高産生性形質転換体が観察された。

【0132】

一部の実施形態では、本方法のために、または本明細書に記載した真菌宿主株とともに使用された制限酵素は、真菌宿主細胞内に配置された発現カセットによって生成される。発現カセットは、例えば、好適には、高レベル転写のために有用な選択マーカーおよび配列を含有する任意の発現ベクター内に挿入することができる。

【0133】

制限酵素またはその一部に対するコーディング領域は、そのような汎用発現ベクター内に挿入することができ、それが発現カセットプロモーターおよびターミネーター配列の転写制御下に配置する。そのような汎用発現ベクターの非限定的例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のｐＲＡＸである。関心対象の遺伝子もしくは変異遺伝子またはそれらの一部は、強力なｇｌａＡプロモーターの下流に挿入することができる。そのような汎用発現ベクターの非限定的例は、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属のｐＴｒｅｘ３ｇＭである。関心対象の遺伝子もしくは変異遺伝子またはそれらの一部は、強力なｃｂｈｌプロモーターの下流に挿入することができる。

【0134】

所定の実施形態では、ベクター内では、制限酵素もしくは関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、構造的遺伝子へのリーディングフレーム内で、転写および翻訳配列、例えば、好適なプロモーター配列およびシグナル配列に機能的に連結していてよい。プロモーターは、好適には、特定の宿主細胞内で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞にとって同種もしくは異種いずかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来してよい。任意選択的シグナルペプチドは、関心対象のタンパク質もしくは変異体の細胞外産生を提供することができる。シグナル配列をコードするＤＮＡは、好ましくは、発現すべき遺伝子に自然に関連しているＤＮＡである。しかし、任意の適切な起源由来、例えばエキソ−セロビオヒドロラーゼ由来またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属のエンドグルカナーゼ由来のシグナル配列は企図されている。

【0135】

制限酵素もしくは関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をプロモーターにライゲートする、および好適なベクター内へのそのような構築物の挿入のために使用できるプロトコルは、当分野において公知である。

【0136】

本明細書に記載したＤＮＡベクターもしくは構築物は、例えば、上記に記載した形質転換法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、マイクロポレーション法、バイオリスティクス照射法などの公知の技術にしたがって真菌宿主細胞内に導入することができる。

【0137】

本明細書に提供した本発明とともに好適に使用される真菌株は、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、特にトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（ロンギブラキアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ））由来の真菌株であってよい。しかし、関心対象の遺伝子は、さらに例えば、アブシディア種（Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｐ．）；アクレモニウム種（Ａｃｒｅｍｏｎｉυｍ ｓｐｐ．）；アガンカス種（Ａｇａｎｃｕｓ ｓｐｐ．）、アナエロミセス種（Ａｎａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）；Ａ．アウクレアタス（Ａ．ａｕｃｕｌｅａｔｕｓ）、Ａ．アワモン（Ａ．ａｗａｍｏｎ）、Ａ．フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、Ａ．フォエティダス（Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、Ａ．フマリカス（Ａ．ｆｕｍａｒｉｃｕｓ）、Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）およびＡ．バーシカラー（Ａ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）を含むアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）；オイロバシジウム種（Ａｅｕｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）；セファロスポラム種（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｕｍ ｓｐｐ．）；カエトミウム種（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐｐ．）；クリソスポリウム種）Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）；コプリヌス種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐｐ．）；ダクチルム種（Ｄａｃｔｙｌｌｕｍ ｓｐｐ．）；Ｆ．コングロメランス（Ｆ．ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、Ｆ．デセムセルラレ（Ｆ．ｄｅｃｅｍｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｆ．ジャバニカム（Ｆ．ｊａｖａｎｉｃｕｍ）、Ｆ．リム（Ｆ．ｌｉｍ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）およびＦ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）を含むフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．）；グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐｐ．）；Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）およびＨ．ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）を含むフミコラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ．）；ムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．）；Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびＮ．シトフィラ（Ｎ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ）を含むニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）；ネオカリマスティックス種（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ ｓｐｐ．）；オルピノミセス種（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）；ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）；ファネロケーテ種（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｐｐ．）；フレビア種（Ｐｈｌｅｂｉａ ｓｐｐ．）；ピロミセス種（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）；シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）；リゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．）；シゾフィラム種（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｐｐ．）；トラメテス種（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｓｐｐ．）；Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ（ロンギブラキアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ））およびＴ．ビンデ（Ｔ．ｖｉｎｄｅ）を含むトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）；およびジゴリンクス種（Ｚｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）などの真菌を含む任意の他の好適な微生物由来であってよい。同様に、関心対象の遺伝子もしくはそれがコードするタンパク質は、例えば、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、セルロモナス種（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）；クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、ミセリオフトラ種（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）；サーモモノスポラ種（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐｐｐ．）；ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、Ｓ．オリボクロモゲネス（Ｓ．ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）；フィブロバクター・スクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）などの細菌およびカンジダ・トレスン（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｏｒｒｅｓｎ、Ｃ．パラシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｌｌｏｓｉｓ）；Ｃ．サケ（Ｃ．ｓａｋｅ）；Ｃ．ゼイラノイデス（Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）；ロードトルーラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）；Ｒ．ムチラギノーザ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）およびスポロボロミセス・ロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｕｓ）を含む酵母の中に見いだすことができる。関心対象の遺伝子は、または例えば細菌などの他の起源に由来してよい。

【0138】

ｃ．真菌株中の標的遺伝子組込み系
１つの態様では、本開示は、第１部では、染色体ＤＮＡ内に少なくとも１つの制限酵素部位を含有する真菌宿主細胞；および第２部では、１つ以上の関心対象の遺伝子を発現させるために操作できる配列、選択マーカーおよび前記染色体制限酵素部位の側面に位置する配列と実質的に相同性を備える配列を含有する核酸分子を含む真菌発現系であって、このとき相同性配列は関心対象の遺伝子の発現を結果として生じる相同性組換え事象を誘発する真菌発現系を提供する。さらに、本開示は、上述の態様の真菌発現系を使用する方法であって、制限酵素部位を生成できる制限酵素の存在下で前記核酸分子を真菌宿主細胞内に形質転換させる工程を含む方法を提供する。

【0139】

さらに、本開示は、真菌発現系を使用する方法によって得られる形質転換もしくは誘導真菌株を提供する。

【0140】

なおさらに、本開示は、標的遺伝子組込み方法であって、最初に染色体ＤＮＡ内の少なくとも１つの制限酵素部位を含む真菌宿主細胞、および関心対象の１つ以上の遺伝子を発現させるために操作可能である配列、少なくとも１つの選択マーカーおよび前記染色体制限酵素部位の側面に位置する配列との実質的相同性を備える配列を含有する核酸分子を入手する工程であって、前記相同配列は相同性組換え事象を誘発して前記関心対象の遺伝子の発現を生じさせる工程；次に第１工程の核酸分子を第１工程の真菌宿主細胞に染色体制限酵素部位を生成できる制限酵素の存在下で形質転換させる工程を含む標的遺伝子組込み法を提供する。

【0141】

本開示は、遺伝子機能を解明するために開発された標的遺伝子組込み系であって、微生物および真核生物両方のゲノム内で相互作用するタンパク質パートナーを同定する工程を含む標的遺伝子組込み系を提供する。伝統的には、遺伝子機能を決定するための方法は、典型的には、生物の表現型を評価するために関心対象の遺伝子についてのヌル突然変異の作成、関心対象の遺伝子が非機能的にさせられる場合と関心対象の遺伝子が存在する場合とを比較する工程を含む。ヌル突然変異は、組換えＤＮＡ技術を使用して作成された遺伝子崩壊ベクターを使用する遺伝子崩壊（遺伝子ノックアウトもしくは遺伝子置換とも呼ぶ）によって生成される。関連生物内に形質転換されると、関心対象の崩壊遺伝子を備えるＤＮＡ構築物は、相同性組換えによってそのような生物のゲノム内の常在場所に組み込まれ、遺伝子の機能的コピーを置換するであろう。上述した伝統的な工程は、広範囲の生物における遺伝子の崩壊のためには良好に機能してきたが、いくつかの固有の限界を有する。例えば、大多数の真菌を含む多細胞真核生物において優勢である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、ゲノム内にランダムに組み込まれる発現ベクターを生じさせる。さらに、形質転換体間でさえ、典型的には大きな百分率の不安定性形質転換体が生成され、安定性形質転換体を得るためには形質転換体のさらなるスクリーニングを余儀なくさせる。

【0142】

さらに、真菌系、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を使用した高度に特異的活性を備えるタンパク質もしくは変異体を同定するためのハイスループット・スクリーニングは、標的組込み事象の低効率のために、難題であった。他方、長年にわたり、その後に真菌宿主生物によって発現もしくは精製することができ、さらに工業使用に供することのできるタンパク質／変異体／酵素の有意味なスクリーニングを提供するためには、関心対象のタンパク質／変異体／酵素が最終的に生成される真菌系、または相当に密接に関連している真菌系においてそのようなハイスループット・スクリーニングを実施することが極めて重要である。しかし、多数の当業者によって好まれる例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属系などの真菌系では、関心対象の突然変異遺伝子を含有する発現カセットのランダム組込みは、ほぼ必然的および頻回に発生し、２つの変量：１）発現レベル；および２）関心対象のタンパク質／変異体／酵素の活性を生じさせ、それらの相互作用は途方もなく大きな複雑性を導く。したがって、ゲノム内の規定の部位への関心対象の遺伝子の標的組込みを介する形質転換体のタンパク質発現における相同性を生じさせる、本明細書に記載したようなアプローチは、タンパク質活性を直接的に特徴的な突然変異と関連付けることができるので高度に望ましい。

【0143】

以前には、発現レベルの可変性を減少させるための努力が重ねられてきた。例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路（例えば、ｋｕ７０、ｋｕ８０もしくはｌｉｇ４）が不活性化されている突然変異真菌株は、相同性組込みの頻度の増加を提示することが見いだされてきた。残念なことに、このようにして得られた形質転換体の数は、極めて小さかった。さらに、工業用菌株におけるｋｕ７０内での突然変異は、それらが遺伝的不安定性を導く場合には望ましくないと報告されている（Ａｗ ａｎｄ Ｐｏｌｉｚｚｉ ２０１３）。

【0144】

本開示は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノム内の規定部位で二本鎖切断を作成するためにＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを使用することにより、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株内で無傷のＮＨＥＪ遺伝子を用いると標的組込み頻度が改良されたことを証明する。

【0145】

特定の例（実施例２）では、ｃｂｈ２遺伝子座にＩ−ＳｃｅＩ制限部位を存在させるために組換えＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）を構築し、Ｉ−ＳｃｅＩの存在下で組換えＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）を形質転換させるためにＩ−ＳｃｅＩ制限部位の側面に位置する配列を実質的に備えるグルコアミラーゼ発現カセットを使用すると、これはＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノム内の規定部位で二本鎖切断を作成した。二重交差を介しての所定の遺伝子座でのグルコアミラーゼ発現カセットの標的組込みが観察された（図１１）。さらに表３に示したように、誘導性Ｉ−ＳｃｅＩ構築物についてはたった４６％およびコントロール構築物については１６％であったのに比して、標的方法では６８％のグルコアミラーゼを発現する形質転換体（Ｉ−ＳｃｅＩ誘導）が組み込まれた。

【0146】

ｄ．真菌株の発酵
１つの態様では、本開示は、好適な培地中で、ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を含む方法を使用して得られている形質転換真菌株を発酵させる方法を提供する。

【0147】

この態様では、本開示は、さらにａ）線状化／線状もしくは環状ＤＮＡと制限酵素との混合物を用いてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる工程；およびｂ）ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を選択する工程であって、制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の処理を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い工程を含む方法を使用して得られている、形質転換真菌株を好適な培地中で発酵させる方法をさらに提供する。

【0148】

同一態様では、本開示は、ａ）線状化／線状もしくは環状ＤＮＡを用いてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程であって、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞は制限酵素を生成するように誘導され、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる工程；およびｂ）ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を選択する工程であって、制限酵素の誘導を用いた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の誘導を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い工程を含む方法を使用して得られている形質転換真菌株を好適な培地中で発酵させる方法をさらに提供する。

【0149】

また別の態様では、本開示は、関心対象の遺伝子を発現させる方法であって、例えば、上記の態様において記載された方法にしたがって、関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下の好適な培地中で得られている形質転換真菌株を増殖させて発酵させる工程を含む方法を提供する。

【0150】

また別の態様では、本開示は、好適な培地中で、それにより形質転換もしくは誘導真菌株が本明細書に記載した方法および真菌発現系を使用して得られる形質転換もしくは誘導真菌株を発酵させる方法を提供する。

【0151】

さらにまた別の態様では、本開示は、関心対象の遺伝子を発現させる方法であって、好適な培地中および前記関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下で本明細書に提供した形質転換もしくは誘導真菌株を増殖および発酵させる工程を含む方法を提供する。こうして得られた形質転換もしくは誘導真菌株は、好適には、一般に、好適な制限酵素部位を生成できる制限酵素の存在下で所定の核酸分子を真菌宿主細胞内に形質転換させる工程を含めて、本明細書に記載もしくは提供した真菌発現系を使用することができる。

【0152】

当分野において周知の発酵方法のいずれも、本明細書に提供した形質転換もしくは誘導真菌株を発酵させるために好適に使用することができる。一部の実施形態では、真菌細胞は、バッチもしくは連続発酵条件下で装飾させられる。

【0153】

伝統的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵中にその組成が変更されない閉鎖系である。発酵の開始時に、培地には所望の生物が接種される。言い換えると、全発酵工程は、全体を通して発酵系にいかなる成分の追加も行わずに行われる。

【0154】

または、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされる。さらに、発酵工程を通して例えばｐＨや酸素濃度などの因子を制御するための頻回な試みが実施される。典型的には、バッチ系の代謝産物およびバイオマス組成は、発酵が停止するまで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は静的誘導期を通って高増殖対数期へ進行し、および最終的には増殖率が減少もしくは停止する静止期に進む。未処理のまま放置すると、静止期にある細胞は最終的には死滅するであろう。一般に、対数期にある細胞は、生成物の大量生産の原因となる。

【0155】

標準バッチ系での好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。典型的なバッチ系のこの変形形態では、発酵の進行につれて基質が徐々に加えられる。フェドバッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を抑制することが公知である場合、および／または発酵培地中では限定量の基質を有することが所望である場合には有用である。フェドバッチ系内での実際の基質濃度の測定は困難であり、このため例えばｐＨ、溶存酸素およびＣＯ_２などの排気ガスの部分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェドバッチ発酵は、当分野において周知である。

【0156】

連続発酵は、また別の公知の発酵方法である。連続発酵は、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、等量の馴化培地から加工処理のために同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に、細胞が主として対数期増殖に維持される一定密度で培養を維持する。連続発酵は、細胞増殖および／または生成物濃度に影響を及ぼす１つ以上の因子の調節を許容する。例えば、炭素源もしくは窒素源などの制限的栄養分は、一定比率に維持することができ、他の全てのパラメーターは調節することが許容される。他の系では、培地濁度によって測定される細胞濃度が一定に維持される間に、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態増殖条件を維持しようと努力する。そこで、除去される培地に起因する細胞消失は、発酵中の細胞増殖率に対してバランスが取られなければならない。連続発酵工程のための栄養分および増殖因子を調節する方法ならびに生成物形成速度を最大化するための技術は、工業微生物学の分野において周知である。

【0157】

ｅ．真菌株によって生成される関心対象のタンパク質
１つの態様では、本開示は、関心対象の遺伝子によってコードされ、関心対象の遺伝子を発現させるによって生成された関心対象のタンパク質であって、その方法は、関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下の好適な培地中で形質転換真菌株を増殖および発酵させる工程を含み、その菌株は：ａ）線状化ＤＮＡと制限酵素との混合物を使用して真菌細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素は前記真菌株の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断を生成できる工程；およびｂ）工程ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換真菌株を選択する工程を使用して得られる関心対象のタンパク質を提供する。

【0158】

この態様では、本開示は、関心対象の遺伝子によってコードされ、関心対象の遺伝子を発現させるによって生成された関心対象のタンパク質であって、その方法は、関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下の好適な培地中で形質転換真菌株を増殖および発酵させる工程を含み、その菌株は、ａ）線状化／線状もしくは環状ＤＮＡと制限酵素との混合物を用いてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程であって、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる工程；およびｂ）ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を選択する工程であって、制限酵素の処理を用いた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の処理を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い工程を含む方法を使用して得られる関心対象のタンパク質をさらに提供する。

【0159】

同一態様では、本開示は、関心対象の遺伝子によってコードされ、関心対象の遺伝子を発現させるによって生成された関心対象のタンパク質であって、その方法は、関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下の好適な培地中で形質転換真菌株を増殖および発酵させる工程を含み、その菌株は、ａ）線状化／線状もしくは環状ＤＮＡを用いてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞を形質転換させる工程であって、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞は制限酵素を生成するために誘導され、制限酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属細胞の染色体ＤＮＡ内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できる工程；およびｂ）ａ）において生成された遺伝的に安定性の形質転換トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株を選択する工程であって、制限酵素の誘導を用いた安定性形質転換体の百分率が制限酵素の誘導を用いずに入手できる安定性形質転換体の百分率より高い工程を含む方法を使用して得られる関心対象のタンパク質をさらに提供する。

【0160】

また別の態様では、本開示は、関心対象の遺伝子によってコードされ、関心対象の遺伝子の発現を許容する条件下の好適な培地中で誘導真菌株内で関心対象の遺伝子を発現させる方法によって生成される関心対象のタンパク質であって、その菌株は、真菌発現系を使用する方法であって、第１部では、染色体ＤＮＡ内の少なくとも１つの制限酵素部位を含有する真菌宿主細胞；および第２部では１つ以上の関心対象の遺伝子を発現させるために操作可能である配列を含有する核酸分子、選択マーカーおよび前記染色体制限酵素部位の側面に位置する配列と実質的相同性を備える配列を含み、相同配列は結果として関心対象の遺伝子の発現を生じさせる相同性組換え事象を誘発し、それにより第１部の核酸分子は制限酵素部位を生成できる制限酵素の存在下で真菌宿主細胞内に形質転換される関心対象のタンパク質を提供する。

【0161】

関心対象のタンパク質は、好適には任意の内因性および異種タンパク質であってよい。関心対象のタンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有することができる、またはその機能的形態がモノマーもしくはマルチマーである、すなわち、タンパク質が四次構造を有し、複数の同一（同種）もしくは非同一（異種）サブユニットから構成されるタンパク質であってよいが、関心対象のタンパク質は、好ましくは関心対象の特性を備えるタンパク質である。

【0162】

関心対象のタンパク質は、関心対象の変異体であってよい。関心対象のタンパク質もしくは関心対象の変異体は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはそれらの変異体、またはこれらの酵素もしくは変異体の２つ以上の混合物であってよい。関心対象のタンパク質もしくは関心対象のタンパク質の変異体の非限定的例は、デンプン代謝に含まれるタンパク質もしくは酵素またはそれらの変異体、グリコゲン代謝に含まれるタンパク質もしくは酵素またはそれらの変異体、酵素、例えばアセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：０２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ１．１．３．５）、それらの変異体およびこれらの酵素もしくはそれらの変異体の２つ以上の組み合わせであってよい。

【0163】

関心対象のタンパク質もしくは関心対象の変異体は、さらに好適には、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ Ｅ７など）もしくはそれらの変異体もしくは断片、またはそのような物質、変異体もしくは断片の２つ以上の混合物であってよい。

【0164】

他のタイプの関心対象のタンパク質もしくは変異体は、食品または作物に栄養価を提供できるタンパク質もしくは変異体であってよい。非限定的例には、栄養分吸収阻止因子の形成を阻害できる植物性タンパク質およびより望ましいアミノ酸組成物（例えば、非トランスジェニック植物より高いリシン含量）を有する植物性タンパク質が含まれる。

【0165】

ｆ．このように生成されたタンパク質性組成物の使用
１つの態様では、本開示は、関心対象のタンパク質を含むタンパク質性組成物を提供する。タンパク質性組成物は、好適には、本明細書に提供した方法を使用して生成される。本組成物は、本明細書に記載した方法を使用して発現させた、関心対象の遺伝子によってコードされた関心対象のタンパク質を含む。本組成物は、例えばバイオマス加水分解、クリーニング用途、穀物加工処理、動物栄養、食品組成物、織物処理などの様々な有用な工業用途において使用することができる。

【0166】

例えば、このように生成されたタンパク質性組成物は、リグノセルロース系バイオマス加水分解において使用できる。世界最大の再生可能なバイオマス源であるリグノセルロースは、主として、リグニン、セルロースおよびその大部分がキシランであるヘミセルロースから構成される。リグノセルロース系供給原料からエタノールへの変換は、大量の供給原料の容易な入手可能性、材料の燃焼もしくは埋立処分を回避できるという望ましさおよびエタノール燃料の清浄度という長所を有する。木材、農業残留物、草本作物および都市固形廃棄物は、エタノール製造のための供給原料であると見なされてきた。リグノセルロースがいったん発酵性糖、例えばグルコースに転換されると、発酵性糖は、酵母によって容易にエタノールに発酵させられる。セルロースは、β−１，４−結合によって共有結合された単糖であるグルコースのポリマーである。多数の微生物は、β結合グルカンを加水分解する酵素を生成する。これらの酵素には、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼが含まれる。キシランは、１，４−β−グルコシド結合Ｄ−キシロピラノースから形成された多糖である。キシラン（例えば、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ３．２．１．８）は、キシラン内の内部β−１，４−キシロシド結合を加水分解して、より低分子量のキシロースおよびキシロ−オリゴマーを生成する。本開示は、工業用酵素、変異体およびそのようなリグノセルロース系バイオマス使用にとっての関心対象の混合物のプロデューサーとして好適および有利である、改良された形質転換体安定性を証明した形質転換真菌細胞を提供する。

【0167】

また別の例では、このように生成されたタンパク質性組成物は、クリーニング用途において使用できる。酵素的クリーニング成分は、それらが、さもなければ従来型の化学的洗剤によっては容易には除去されない汚れ、染みおよび他の砕片を破壊する能力のために人気が高い。クリーニングのために有用な周知の酵素には、例えば、それぞれが一連の様々な機能性を提供するリパーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、さらに所定のセルラーゼさえなどの他の酵素とともに、プロテアーゼおよびアミラーゼが含まれる。プロテアーゼは、タンパク質をベースとする染みに有効である；アミラーゼは炭水化物やデンプンに働く；およびリパーゼは、例えば、脂質もしくは脂肪を破壊する。本開示は、クリーニング用途にとっての工業用酵素、変異体および関心対象の混合物のプロデューサーとして好適および有利である、改良された形質転換体安定性を証明した形質転換真菌細胞を提供する。

【0168】

また別の例では、このように生成されたタンパク質性組成物は、穀粒加工処理において使用できる。デンプンは、植物自体ならびに微生物および高等生物によって使用される、植物における最も一般的な貯蔵炭水化物である。極めて様々な酵素は、デンプン加水分解を触媒することができる。全ての植物起源からのデンプンは穀物の形態で発生するが、植物起源の種に依存して、デンプンは顕著に様々なサイズおよび物理的特徴で存在する。デンプンの酸加水分解は以前には広範に使用されていたが、この工程は現在では、耐蝕性材料やその他の利点を必要とすることが少なく、加熱のために必要とするエネルギーが少なく、酸性工程よりも制御するのが相当に容易であることが知られている酵素的工程によって置換されている。本開示は、例えばデンプン分解および穀粒加工処理にとっての工業用酵素、変異体および関心対象の混合物のプロデューサーとして好適および有利である、改良された形質転換体安定性を証明した形質転換真菌細胞を提供する。

【0169】

また別の例では、このように生成されたタンパク質性組成物は、食品用途において使用できる。細菌、酵母およびカビによって生成された酵素は、何千年にもわたり例えばパン、チーズ、ビールおよびワインなどの食品を製造するために食品用途において使用されてきた。現在、酵素は、パン製造、チーズ製造、デンプン加工処理および果汁や他の飲料の製造において使用され、そのような改良された質感、外観および栄養価を提供し、所望の香味および芳香などを生成する。食品用酵素は、典型的には、動物および植物（例えば、デンプン消化酵素、アミラーゼは、発芽大麦種子から入手できる）ならびにある範囲の有益な微生物を起源とする。酵素は、多数の加工処理における合成化学物質に置換して、伝統的な化学物質に基づく技術にとっての実行可能で所望である代替品であると思われる。酵素は、エネルギー消費を減少させて、廃棄物もしくは副生成物の生分解性を改良する、食品製造加工処理の環境的性能を改良することに役立つことができる。酵素は、それらの作用において合成化学物質よりも特異的である傾向があり、したがって、酵素的加工処理はより少ない副反応および廃棄物もしくは副生成物を生じさせ、結果としてより高品質の生成物を生成して、汚染の可能性を減少させる傾向がある。酵素的加工処理は、頻回に唯一の可能な加工処理でもある。これの１つの例は、酵素であるペクチナーゼの使用に依存する透明リンゴ果汁濃縮液の製造にある。食品用酵素の大多数は、微生物、例えばバチラス（Ｂａｃｅｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属から生成される。本開示は、食品用途におけるなどの使用にとっての工業用酵素、変異体および関心対象の混合物のプロデューサーとして好適および有利である、改良された形質転換体安定性を証明した形質転換真菌細胞を提供する。

【0170】

また別の例では、このように生成されたタンパク質性組成物は、動物飼料用添加物において使用できる。セルラーゼ、キシラナーゼ、β−グルカナーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フィターゼおよび他の炭水化物は、動物試料工業において広範に使用されてきた。多数の植物をベースとする供給原料は動物の成長を低下させる栄養阻害因子を備える物質を含有するので、そのような供給原料に加えられる酵素は、繊維、タンパク質、デンプンおよびフィチン酸塩を分解し、それらを動物がより消化し易くし、肉、卵もしくはミルク生産性を最大化しながら、より安価で頻回に地元で製造される供給原料の使用を可能にすることによってこれらの栄養阻害因子の消化性を改良する。同時に、そのような供給原料に加えられる酵素は、さらに腸の健康および動物の性能強化を支持する利点を提供する。本開示は、動物飼料用途におけるなどの使用にとっての工業用酵素、変異体および関心対象の混合物のプロデューサーとして好適および有利である、改良された形質転換体安定性を証明した形質転換真菌細胞を提供する。

【0171】

さらにまた別の例では、このように生成されたタンパク質性組成物は、織物用途において使用できる。酵素は、織物加工処理の不可欠な部分になっている。織物工業においては、２つの明確に確立された酵素用途がある。第１に、例えばアミラーゼなどの酵素は、一般に湯通しのための予備仕上げ領域において使用される。第２に、例えばセルラーゼなどの酵素は、柔軟化、バイオストーン加工および綿製品のピリング傾向を低下させるための仕上げ領域で一般に使用される。例えば、ペクチナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼなどの他の酵素もまた織物加工処理において使用される。さらに、デニムや非デニムのフェーディング、バイオスカーリング、バイオポリッシング、ウール仕上げ、過酸化物除去、染料の脱色などに含まれた酵素を必要とする様々な用途がある（Ｃａｖａｃｏ−Ｐａｕｌｏ ａｎｄ Ｇｕｂｉｔｚ，２００３；Ｃｈｅｌｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｎａｌａｎｋｉｌｌｉ，１９９８；Ｓｈｅｎａｉ，１９９０）。本開示は、織物用途におけるなどの使用にとっての工業用酵素、変異体および関心対象の混合物のプロデューサーとして好適および有利である、改良された形質転換体安定性を証明した形質転換真菌細胞を提供する。

【実施例】

【0172】

本発明の菌株、組成物および方法の態様は、限定するものであると見なすべきではない下記の実施例を考慮に入れると、より詳細に理解することができる。材料および方法の修飾は、当業者には明白であろう。

【0173】

本開示において使用される一部の真菌（（トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属）菌株およびプラスミド（大部分は本試験において構築された）を下記の表１に示す。

【0174】

【表1】

【0175】

実施例１：ＲＥＭＩを使用するＡｃｌＡｍｙ１の発現
Ａ．ＡｃｌＡｍｙ１発現ベクターの構築
１）ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１
ここで関心対象のモデルタンパク質として使用する酵素ＡｃｌＡｍｙ１は、（配列番号１）（ボールド体およびイタリック体で記載したシグナル配列を備える）のアミノ酸配列を有するアスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）を起源とする酸性安定性真菌α−アミラーゼを意味する。

【化1】

【0176】

ＡｃｌＡｍｙ１遺伝子のヌクレオチド配列は、８個のイントロンを含み、その配列（配列番号２）は以下に提示する。

【化2】

【化3】

【0177】

このタンパク質は６７ｋＤａ（キロダルトン）の計算質量を有し、ＥＣ３．２．１．１．のクラスの他のタンパク質と同様に、大きなα結合多糖（例えば、デンプン）のα結合を加水分解することができる。最適ｐＨは、基質としてのＰＡＨＢＡＨ（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）上で測定して４．５であるが、他方高酵素活性は、３〜７の広範囲のｐＨで見いだされる。その酵素活性が最高である温度は、６６℃である。

【0178】

ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１ベクターは、強力なｃｂｈＩプロモーターの制御下に配置されたその天然コーディング配列からＡｃｌＡｍｙ１の発現を駆動するように設計された。ＡｃｌＡｍｙ１をコードするＡｃｌＡｍｙ１遺伝子は、以下のプライマーを用いるＰＣＲを使用してアスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）染色体から増幅させた。
プライマー１（５’−ｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｃｃＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣ−３’）（配列番号３）；および
プライマー２（５’−ｃｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔｔａＴＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＣ−３’）（配列番号４）．

【0179】

制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩを用いた消化後、ＰＣＲ産物を（米国公開公報特許第２０１１／０１３６１９７（Ａ１）号明細書に記載されたような）ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター内にクローン化し、同一制限酵素を用いて消化し、結果として生じたプラスミドをｐＴｒｅｘ３ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１と標識した。ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１のプラスミドマップは、図１に提供した。このプラスミドマップの機能エレメントの完全リストもまた、図１に提供した。

【0180】

ＡｃｌＡｍｙ１遺伝子の配列は、ＤＮＡシーケンシングによって確証した。

【0181】

２．ｐＥＮＴＲＹ−ＡｃｌＡｍｙ１
発現ベクターｐＴｒｅｘ８ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙｌ１を構築するために、Ａ．クラバタス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）Ａｍｙ１をコードする断片を最初に（上述のような）プラスミドｐＴｒｅｘ３ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１からｐＤｏｎｏｒ２２１ベクター内に供給業者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）の勧告にしたがってＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ反応を介して再クローン化した。生じたｐＥｎｔｒｙ−ＡｃｌＡｍｙ１プラスミドおよびその機能エレメントは、図２に示した。

【0182】

３．ｐＴｒｅｘ８ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１
Ａ．クラバタス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）α−アミラーゼをコードするＥＮＴＲＹベクターＤＮＡ断片をさらにＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ反応によってさらにｐＴＲＥＸ８ｇＭに移すと、結果としてプラスミドｐＴＲＥＸ８ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１が生じた（図３）。ｐＴＲＥＸ８ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１の機能エレメントは、図３に列挙した。

【0183】

クローンは、コーディング領域をシーケンシングすることによって実証された。

【0184】

Ｂ．異所性発現のための形質転換
１．プロトプラストの調製
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株の胞子は、５０ｍＬのＹＥＧ培養培地（５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのグルコース）中に接種し、５０ｍｍの動程を備える撹拌式インキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ−ＨＴ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内の２８℃で２５０ｍＬの撹拌フラスコ内で１８０ｒｐｍの速度で一晩増殖させた。一部の実験では、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２ａ遺伝子の欠失を伴うＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＲＬ−Ｐ３７の誘導体を使用し、一部の他の実験では、他のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株を使用した。任意の好適なトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌株は、本明細書に開示した実験のような実験のために機能するであろう。

【0185】

発芽した胞子は、１０分間の遠心分離（３，０００ｇ）によって収集し、１０ｍＬの１．２のＭｇＳＯ_４、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）を用いて２回洗浄した。ペレットは、１．２ｇの溶解酵素（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を補給した４０ｍＬの同一バッファー中に再懸濁させた。

【0186】

これは、プロトプラストが形成されるまで１００〜２００ｒｐｍの速度で振とうすることで、撹拌式インキュベーター内で２８℃でインキュベートした。

【0187】

懸濁液は、菌糸体を除去するためにＭｉｒａｃｌｏｔｈに通して濾過し、等量の０．６Ｍのソルビトール、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）をプロトプラスト溶液の上部に緩徐に加えた。これを１５分間にわたり、４，０００ｒｐｍで遠心した。

【0188】

プロトプラストは、中間期に見いだされ、これらを次に注意深く収集し、新規試験管に移した。この工程を必要なプロトプラストが収集されるまで必要に応じて繰り返した。等量の１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）をプロトプラストに加えた。これらのプロトプラストは、４℃で１５分間、４，０００ｒｐｍでペレット化し、１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で２回洗浄した。最後に、プロトプラストを同一バッファー中に１×１０^８／ｍＬのプロトプラストの濃度へ再懸濁させ、プロトプラスト２００μＬ当たり５０μＬの２５％のＰＥＧ６０００、５０ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えた。生じた材料は、次に−８０℃で貯蔵した。

【0189】

２．異所性発現のための形質転換
一部の実験では、プロトプラストを形質転換させるためにＰＣＲ産物を直接的に使用した。約５〜２０μｇのＤＮＡ（ＰＣＲ産物）は、２００μＬのプロトプラストに加え、氷上で２０分間インキュベートした。その後、形質転換混合物を室温に移し、２ｍＬの２５％のＰＥＧ６０００、ＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および４ｍＬの１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えた。

【0190】

制限酵素媒介性組込み（ＲＥＭＩ）をサンプルに適用したら、その後に２０単位の制限エンドヌクレアーゼをそのサンプルのＤＮＡに加えた。

【0191】

一部の他の実験では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属プロトプラストを形質転換させるためにプラスミドＤＮＡを使用し、一部の場合には、制限エンドヌクレアーゼを使用してプラスミドＤＮＡを線状化した。消化混合物をインキュベートした後、プラスミドＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼから精製しなかった。

【0192】

１つの実験では、ｃｂｈＩプロモーターからＡｃｌＡｍｙ１コーディング領域を通してプラスミドｐＴｒｅｘ８ｇＭ−ＡｃｌＡｍｙ１からのｐｙｒ２の３’部分までの領域を含むＰＣＲ断片は、以下のプライマーを使用して入手した。
プライマー１：５’ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧ（配列番号５）；ａｎｄ
プライマー２：３’ＣＧＡＴＡＣＡＣＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣ）（配列番号６）．

【0193】

ＰｃｂｈＩ−ＡｃｌＡｍｙ１−ｐｙｒ２のＰＣＲ産物は、任意の制限酵素を添加せずに、またはＰａｃＩ制限酵素を用いてのいずれかでＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロトプラストを形質転換させるために使用した。形質転換体は、１０ｍＭのＮＨ_４Ｃｌを補給したＡｍｄＳ培地上でのウリジン原栄養のために選択した。この培地を作成するために、２×のＡｍｄＳ溶液（３０ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ４、２０ｍＭのアセトアミド、１．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、１．２ｇ／ＬのＣａＣｌ_２^＊２Ｈ_２Ｏ、０．４８ｇ／Ｌのクエン酸^＊Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、４０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、８ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、３．５ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ、２ｍｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３（ホウ酸）、４０ｇ／Ｌのグルコース（ｐＨ４．５）を２Ｍのソルビトールを含有する等量の４％の寒天と混合した。

【0194】

トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換の例は、図４Ａ〜４Ｅに示した。図４Ａ、４Ｃおよび４Ｄは、ＲＥＭＩを含まない典型的な形質転換実験におけるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体の図および百分率を示している−−約１０〜２０％の形質転換体が形態学的に安定性である。図４Ｂおよび４Ｅは、ＲＥＭＩが適用された典型的な形質転換実験におけるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体の図および百分率を示している−−約８０〜９０％の形質転換体が形態学的に安定性である。

【0195】

３．形質転換体の選択
グルコース／ソホロース産生培地中で増殖させた後、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ＵＫ（「Ｃｅｒａｌｐｈａ法」）からのα−アミラーゼ活性キットを用いる活性アッセイを使用してＡ．クラバタス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）α−アミラーゼの発現レベルについて発酵サンプルを分析した。

【0196】

平行して、発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）によって確証した。

【0197】

Ｃ．トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属発酵およびアミラーゼ活性アッセイ
固体の多孔性マトリックスからラクトースを遊離させるように構成された２４ウエルプレート内に上述のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＲＬ−Ｐ３７の誘導体由来のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属形質転換体を接種した。各ウエルは、１．２５ｍＬのＮＲＥＬ培地（９ｇ／Ｌのカザミノ酸、５ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４．５ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ＬのＣａＣｌ_２^＊２Ｈ_２Ｏ、３３ｇ／ＬのＰＩＰＰＳバッファー（ｐＨ５．５）、０．２５％のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素（１００％：１７５ｇ／Ｌのクエン酸（無水）、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ、０．８ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３（ホウ酸）、１６ｇ／Ｌのグルコース）を含有していた。透明化懸濁液は、Ｃｅｒａｌｐｈａ法（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ＵＫ）を使用してα−アミラーゼ活性について分析した。

【0198】

Ｃｅｒａｌｐｈａは、穀類、真菌および細菌α−アミラーゼを測定するために、ブロックされたｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−マルトヘプタオシド＋過剰のα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼである。透明化懸濁液は、３６ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中で１００〜５００倍まで希釈した（これは予想α−アミラーゼ活性に依存するであろう）。

【0199】

または、透明化懸濁液は、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ_２、０．００５％のＴｗｅｅｎ ８０の溶液中に１００〜５００倍まで希釈した（これは予想α−アミラーゼ活性に依存するであろう）。４０μＬの希釈透明懸濁液は、等量のＣｅｒａｌｐｈａ基質と混合し、２８℃で１０分間インキュベートした。反応は１００μＬの２００ｍＭのホウ酸ナトリウム溶液（ｐＨ１０．２）を加えることによって終結させた。吸光度は４０５ｎＭで測定し、希釈計数のために収集し、１分間当たりのα−アミラーゼ活性として表示した。透明化懸濁液はさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）によって分析した。

【0200】

図５は、α−アミラーゼ産生レベルにおける差を示している。活性ＰａｃＩ酵素の存在下で得られた安定性トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属ｉＲＮＡｘｙｎ１，３形質転換体は、α−アミラーゼ活性のより高い絶対レベルおよびα−アミラーゼの上昇した発現を伴うより多数の安定性形質転換体の両方を示した。ＲＥＭＩは（不安定性形質転換体と比較して）安定性形質転換体の百分率を増加させ、安定性形質転換体はさらにより高い力価のα−アミラーゼも産生した。

【0201】

これらの結果は、制限酵素ＳｓｐＩの存在下でまた別のプラスミドｐＴｒｅｘ８ｇＭ ＡＧＬ２（α−ガラクトシダーゼを発現する）を使用してＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｉＲＮＡｘｙｎ１．３の形質転換実験を用いて確証した。

【0202】

制限酵素が加えられると直ちに、不安定性形質転換体のバックグラウンドは有意に減少し、安定性のα−ガラクトシダーゼ産生性形質転換体の百分率が増加した。

【0203】

実施例２：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）における標的組込みを改良するためのＩ−ＳｃｅＩの使用
Ａ．Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）におけるＩ−ＳｃｅＩ活性を測定するためのレポーター菌株の構築
１．Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位カセットの構築：方法
Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位を備えるプラスミドｐＢＪＰ６を設計し、下記および図６に示したように構築した。

【0204】

５’ＵＴＲのｃｂｈ２、Ｐｃｂｈ１およびＴｃｂｈ２は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株であるＱＭ６Ａ（制限なく、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｔａｘｏｎｏｍｙ／４３１２４１を含む様々な起源から公的に入手可能）のゲノムＤＮＡからプライマーＧＳＰ１およびＧＳＰ２、ＰＰ１およびＰＰ２、ＧＳＰ３およびＧＳＰ４それぞれならびに本明細書の下記の一覧を用いて増幅させた。ＰＣＲ断片はｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して溶解させ、プラスミドｐＢＪＰ４を生成するためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）のＸｂａＩおよびＫｐｎＩ制限部位にクローン化した（図６）。

【0205】

さらに、Ｃ末端切断型ＧＦＰ（ＧＦＰｎ^＊もしくはΔＮＧＦＰ）をコードするＤＮＡ断片（ＧＦＰｎ^＊−ＧＦＰｃ^＊構築物）および６００ｂｐ重複配列（斜線棒の領域）を備えるＧＦＰＮ末端切断型ＧＦＰ（ＧＦＰｎ^＊もしくはＧＦＰΔＣ）をコードするＤＮＡ断片を運ぶために、また別のプラスミドｐＧＦＰｒｅｐを構築した。ＧＦＰｎ^＊−ＧＦＰｃ^＊構築物は、ウミエラ（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）種のＧＦＰ配列に基づいて設計され、Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから合成的に注文された。ＧＦＰｎ^＊−ＧＦＰｃ^＊構築物を次にｐＢＪＰ４のＮｄｅＩ制限部位に、ｃｂｈＩプロモーターとｃｂｈＩターミネーターとの間にクローン化すると、プラスミドｐＢＪＰ５が生じた。最終ｐＢＪＰ６プラスミドは、２つのプライマー（ＦｗｐＧＡＮ−ＩＳｃｅＩＰｍｅＩおよびＲｅｖｐＧＡＮ−ＩＳｃｅＩＰｍｅＩ）を使用してアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｐｙｒＧマーカーをプラスミドから増幅させ、ｐＢＪＰ５のＰｍｅＩ部位（ＧＦＰｎ^＊−ＧＦＰｃ^＊構築物内の２本の６００ｂｐ重複ＧＦＰ配列の間）にクローン化することにより入手された。プライマーは、Ｉ−ＳｃｅＩ制限部位およびＰｍｅＩ部位をＰＣＲ増幅中にｐｙｒＧマーカーの下流および上流に組み込むために、２つのＩ−ＳｃｅＩ部位によって挟まれたｐｙｒＧマーカーを運ぶＰＣＲ増幅断片が生じるように設計された。結果として生じるプラスミドｐＢＪＰ６は、図６に示したように、５’ＵＴＲ ｃｂｈ２−Ｐｃｂｈ１−ＧＦＰｎ^＊−Ｉ−ＳｃｅＩ−ｐｙｒＧ−Ｉ−ＳｃｅＩ−ＧＦＰｃ^＊−Ｔｃｂｈ２構築物を含有する。ｐＢＪＰ６プラスミドの配列は、制限分析およびシーケンシングによって確証した。

【0206】

この実施例で使用したプライマー配列は、下記およびさらに表２に提示した。
ＧＳＰＬ（フォワード）５’−ＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣＡＴＴＴＣＣＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号７）
ＧＳＰ２（リバース）５’−ＴＧＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＡＣＣＴＧ−３’（配列番号８）
ＰＰ１（フォワード）
５’−ＣＡＧＧＴＴＴＧＴＴＧＣＣＧＴＡＡＣＣＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＣＴＧ−３’（配列番号９）
ＰＰ２（リバース）
５’−ＧＧＡＡＣＧＡＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＧＴＡＡＧＴＣＡＣＴＴＡＣＧＧＣＡＧＣ−３’（配列番号１０）
ＧＳＰ３（フォワード）５’−ＣＣＡＴＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＧＴＴＣＣ−３’（配列番号１１）
ＧＳＰ４（リバース）５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＡＴＧＴＧＡＧ−３’（配列番号１２）
ＦｗｐＧＡＮ−ＩＳｃｅＩＰｍｅｌ（フォワード）
５’−ＧＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣ−３’（配列番号１３）
ＲｅｖｐＧＡＮ−ＩＳＣＥＬＰｍｅｌ（リバース）
５’−ＧＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＡＣＴＡＧＴＧＣ−３’（配列番号１４）
ＧＳＰ５（フォワード）５’−ＧＣＧＡＴＣＧＣＡＣＧＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＧＴＴＣＣ−３’（配列番号１５）
ＧＰＳ６（リバース）５’−ＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＡＴＧＴＧＡＧ−３’（配列番号１６）

【0207】

【表2】

【0208】

２．Ｉ−ＳｃｅＩ活性を監視するためのマーカー切除法の設計：機序
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）内のメガヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの活性を監視するためにレポーター構築物ｐＢＪＰ６を使用し、アッセイ法については図８に描出した。

【0209】

図７の上部に略図により示したように、ｐＢＪＰ６は、５’ＵＴＲ ｃｂｈ２−Ｐｃｂｈ１−ＧＦＰｎ^＊−Ｉ−ＳｃｅＩ−ｐｙｒＧ−Ｉ−ＳｃｅＩ−ＧＦＰｃ^＊−Ｔｃｂｈ２構築物を含有する。５’ＵＴＲ ｃｂｈ２およびＴｃｂｈ２の包含は、宿主細胞内のｃｂｈ２遺伝子座での標的組込みのために使用する。選択マーカーｐｙｒＧを挟む２つのＩ−ＳｃｅＩ認識部位（上にハサミの絵が描かれたグレーの箱）を使用して、Ｉ−ＳｃｅＩの活性を監視する。

【0210】

この戦略の理論的根拠は、ＧＦＰｎ^＊−Ｉ−ＳｃｅＩ−ｐｙｒＧ−Ｉ−ＳｃｅＩ−ＧＦＰｃ^＊構築物を含有するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株中の活性Ｉ−ＳｃｅＩの発現およびＧＦＰ反復による二本鎖切断の修復（斜線の箱を伴って提示）を生じさせるであろうことであった。反復を介しての完全な修復は、ＧＦＰを発現するウリジン栄養素要求性菌株（ｐｙｒＧ−）を生じさせるであろう（図７に描出）。

【0211】

３．ｃｂｈ２遺伝子座にＩ−ＳｃｅＩ制限部位を存在させているＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株の構築：結果
ｐＢＪＰ６は、プライマーＧＳＰ１およびＧＳＰ４（プライマーの場所は図６に示した）を用いてＰＣＲ増幅させ、上述のようにＩ−ＳｃｅＩ活性を監視するための７．５ｋｂのＰＣＲ産物／カセット（５’ＵＴＲ ｃｂｈ２−Ｐｃｂｈ１−ＧＦＰｎ^＊−Ｉ−ＳｃｅＩ−ｐｙｒＧ−Ｉ−ＳｃｅＩ−ＧＦＰｃ^＊−Ｔｃｂｈ２構築物）は、ＰＥＧ媒介性プロトプラスト形質転換法によってＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株Ｐ３７ｄｅｌｔａ ｃｂｈＩｐｙｒＧ−２６に形質転換させる。

【0212】

ウリジン原栄養形質転換体を精製し、全カセットがｃｂｈ２遺伝子座で組み込まれた形質転換体についてサウザンブロットによって分析した。最初の診断的ＰＣＲ（結果は示していない）に基づいて、９つの形質転換体をサウザンブロット分析のために選択した。単一コピー形質転換体を選択し、ｃｂｈ２遺伝子座でのゲノム内への完全カセットの適正な組込みを確証するための３つの異なるプローブ。

【0213】

サウザンブロット分析は、ｃｂｈ２遺伝子座で完全Ｉ−ＳｃｅＩカセットの単一コピーを存在させている３つの形質転換体（ＪＰ７．７、ＪＰ７．９およびＪＰ７．１２）を解明した（図８）。

【0214】

残り６つの形質転換体中、５つは組み込まれたカセットの複数のコピーを有することが証明された（ＪＰ７．１０、ＪＰ７．１１、ＪＰ７．１３、ＪＰ７．１４、ＪＰ７．１５）、またはゲノム内に組み込まれた完全カセットを有していないと思われた（ＪＰ７．８）。

【0215】

その後の実験には、形質転換体ＪＰ７．７を使用した。

【0216】

Ｂ．Ｉ−ＳＣＥＩ発現構築物の構築
１．Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターの構築
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）における発現のために、Ｉ−ＳｃｅＩ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ５７５２９３．１）のコドン最適化合成遺伝子を作成した（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。合成Ｉ−ＳｃｅＩヌクレオチド配列（配列番号１７）は、下記に示した：

【化4】

【0217】

Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターを構築するために、Ｉ−ＳｃｅＩ遺伝子は、供給業者Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）の勧告にしたがってＧａｔｅｗａｙ組換え法により米国特許出願公開第２０１１００２０８９９号明細書において例示されたようにテロメアプラスミドｐＴＴＴ内にクローン化した。ｃｂｈＩ遺伝子のラクトース誘導性プロモーターを使用して、ｐＴＴＴプラスミド内でのＩ−ＳｃｅＩ遺伝子の発現を誘導した。さらに、ｐＴＴＴプラスミドはＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄＳ選択マーカーを運んだので、これは窒素源としてアセトアミドを使用するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）における形質転換および選択を許容した。

【0218】

結果として生じた発現カセットｐＴＴＴ−Ｉ−ＳｃｅＩ（図１６）では、ｃｂｈＩ遺伝子のラクトース誘導性プロモーターがＩ−ＳｃｅＩ遺伝子の発現を駆動する。さらに、ｐＴＴＴプラスミドはＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄＳ選択マーカーを運んだので、これは窒素源としてアセトアミドを使用するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）における形質転換および選択を可能にした。

【0219】

２．Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）におけるＩ−ＳｃｅＩ発現は標的染色体遺伝子座でＤＳＢを誘導する
ｐＴＴＴ−Ｉ−ＳｃｅＩ構築物を使用してＩ−ＳｃｅＩランディング部位を含有する菌株ならびにＩ−ＳｃｅＩランディング部位を含有していない陰性コントロール菌株を形質転換させた。形質転換後、ａｍｄＳ陽性形質転換体を最小培地上で精製し、グルコースおよび窒素源としてのアセトアミドを含有してプレーティングし、炭素源としての２％のグルコース（非誘導条件）もしくは２％のラクトース（誘導条件）を含有する９ｃｍのペトリ皿の中央に点接種した。形質転換結果は図９に示した。

【0220】

図９に示したように、Ｉ−ＳｃｅＩを発現してＩ−ＳｃｅＩカセットを含有する菌株内のラクトースによる誘導は、セクター形成を提示するコロニーを生じさせる。これらのセクターは、増殖を示さない領域を指す矢印で指示した。このセクタ−化は、ｐｙｒＧマーカーの消失をもたらすＧＦＰ反復を介して修復された二本鎖切断を生成するＩ−ＳｃｅＩ活性であると解釈された。

【0221】

ｐｙｒＧマーカーを消失した結果として、コロニーのこの部分は、このセクターを生じさせるウリジンを含まないプレート上ではもはや増殖しないであろう。図９に示したように、これらのセクターは炭素源としてラクトースが使用された場合に最も多く存在したが、グルコースプレート上でも観察され、これはグルコース上でさえ、一部のＩ−ＳｃｅＩが発現したことを示した。

【0222】

ラクトース上でのセクター化は、ｐＴＴＴ−ＩＳｃｅＩを発現する形質転換体上で観察されたが、コントロール菌株については観察されなかった（図９）。ウリジンがラクトースプレートに加えられると、もはやセクター化を視認することはできず、これはセクターがｐｙｒＧマーカーの消失によって誘発されることを示した（図９）。ラクトースプレート上での形質転換体のセクター化は、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｉ−ＳｃｅＩが発現させられ、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）において活性であることを証明した。

【0223】

組換えについては、液体培養中でも監視した。形質転換体はウリジンを含む最小培地中の液体培養中で増殖させ、Ｉ−ＳｃｅＩ発現はソホロースによって誘導された。結果として生じた形質転換体の顕微鏡観察所見は、図１０に示した。菌糸の蛍光顕微鏡写真は、ループアウトの結果としての機能的ＧＦＰの再構成を示すＧＦＰ蛍光を示した。ＧＦＰは誘導後にＩ−ＳｃｅＩ発現カセットを存在させる菌株（ＪＰ７．７．１２、ＪＰ７．７．１４およびＪＰ７．７．１６）内でのみ観察され、その結果はさらに、Ｉ−ＳｃｅＩが誘導後に活性的に発現したことを示している（図１０）。

【0224】

Ｃ．グルコアミラーゼの改良された形質転換および標的組込み効率
１．標的組込みのためのグルコアミラーゼ発現カセットの構築
米国特許第８１３８３２１号明細書に記載されている、ｃｂｈＩプロモーターの制御下でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の野生型グルコアミラーゼ遺伝子を運ぶプラスミドｐｔｒｅｘ６ｇＧＡ／ｗｔは、Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位で組み込むことのできるグルコアミラーゼ発現カセットを構築するための出発点として使用された。

【0225】

Ｉ−ＳｃｅＩランディング部位でのグルコアミラーゼカセットの相同性組込みを許容するために、ｃｂｈ２ターミネーター領域（Ｔｃｂｈ２）をｐｔｒｅｘ６ｇＧＡ／ｗｔ内にクローン化した（図１１）。Ｔｃｂｈ２は、プライマーＧＳＰ５およびＧＳＰ６（表２に提供した）および鋳型としてのＱＭ６ａのゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲによって得られた。

【0226】

ＰＣＲ産物はＡｓｉＳＩを用いて消化し、ｐｔｒｅｘ６ｇＧＡ／ｗｔの同一制限部位にクローン化すると、プラスミドｐＪＰ８が得られた。１０ｋｂのグルコアミラーゼ発現カセットは、ＰｓｉＩを用いてｐＪＰ８から切断し、形質転換のために使用した。形質転換体は、クロリムロンエチルに対する耐性を付与するａｌＳマーカーによって選択した。

【0227】

２．Ｉ−ＳｃｅＩ発現下での形質転換頻度、安定性および標的組込みの効率
Ｉ−ＳｃｅＩによって媒介されるＤＳＢ（二本鎖切断）がＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）における形質転換および組換え効率を増加させられるかどうかを決定するために、グルコアミラーゼ発現カセットを標的組込みのために線状断片としてＩ−ＳｃｅＩ制限部位およびＩ−ＳｃｅＩ発現カセット（ＪＰ７．７．１２）を運んでいる菌株内に形質転換させた。

【0228】

形質転換体は、（クロリムロンエチル基質を含有する）およびグルコースを含有する（Ｉ−ＳｃｅＩ非誘導条件）もしくはラクトースおよびグルコースの混合物を含有する（Ｉ−ＳｃｅＩ誘導条件）選択培地から沈着させられた。陰性コントロールとして、Ｉ−ＳｃｅＩ制限部位だけを運んでいてＩ−ＳｃｅＩカセット（ＪＰ７．７）を運んでいない菌株もまた、同一量の線状プラスミドを用いて形質転換させた。次に、各群の形質転換において得られた形質転換体の安定性を分析した。形質転換の結果および安定性分析の結果は、表３および図１２に示した。

【0229】

【表3】

【0230】

表３および図１２の結果は、Ｉ−ＳｃｅＩ誘導が非誘導条件およびコントロールと比較して、形質転換体の数をそれぞれ３倍および６倍超に増加させることを示した（表３）。さらに、Ｉ−ＳｃｅＩの誘導後のＪＰ７．７．１２形質転換体はほぼ全てが安定性であったが（９０％）、他方Ｉ−ＳｃｅＩの誘導を行わなかったＪＰ７．７．１２形質転換体は４４％しか安定性ではなく、陰性コントロール菌株ＪＰ７．７形質転換体（Ｉ−ＳｃｅＩ発現カセットを伴わない）については５３％もしくは５８％しか安定性ではなかった（表３）。これは、Ｉ−ＳｃｅＩの発現が形質転換効率を増加させ、さらに形質転換体の安定性も増加させることを証明している。

【0231】

各群からの約４０個の安定性形質転換体は、上記の実施例に記載したように多孔性マトリックスからラクトースを緩徐に遊離させた２４ウエルＭＴＰ中のＮＲＥＬ培地上で精製形質転換体を増殖させることによってグルコアミラーゼ産生についてスクリーニングした。Ｉ−ＳｃｅＩ誘導条件において、それぞれ非誘導Ｉ−ＳｃｅＩ条件およびコントロールについての３７％および３０％に比較して、約５５％の形質転換体がグルコアミラーゼを発現していた。

【0232】

グルコアミラーゼを発現する形質転換体は、引き続いてそれらのｐｙｒＧ表現型について分析した。二重交差を介しての所定の遺伝子座でのグルコアミラーゼ発現カセットの標的組込みは、クロリムロンエチル耐性（ａｌｓ＋）および結果としてウリジン栄養素要求性を生じさせるｐｙｒＧマーカーの消失を生じさせると予想された（図１１）。

【0233】

表３に示したように、Ｉ−ＳｃｅＩが誘導されると、グルコアミラーゼを発現する形質の６８％は標的方法で組み込まれたが、これに対して非誘導Ｉ−ＳｃｅＩ条件およびコントロールではそれぞれ４６％および１６％しか組み込まれなかった。

【0234】

グルコアミラーゼを発現する選択されたｐｙｒＧ−形質転換体のサウザンブロット分析は、それらが予想されたようにＩ−ＳｃｅＩランディング部位でＧｌａＡ発現カセットを含有することを証明した（図１３）。グルコアミラーゼを発現しない、またはグルコアミラーゼを発現するがｐｙｒＧ−ではない菌株は、変化した組込みパターンを示した（図１３）。

【0235】

３．標的組込み対非標的組込み間のグルコアミラーゼ発現の比較
標的組込みグルコアミラーゼ発現カセットを用いた形質転換体のグルコアミラーゼ活性の可変性をランダム組込みに由来するグルコアミラーゼ活性の可変性と比較するために、菌株をマイクロタイタープレート内で増殖させ、培地をグルコアミラーゼ活性について試験した。

【0236】

各形質転換体は個別に３つのマイクロタイタープレートウエル内で増殖させ、この生物学的三重サンプルの平均グルコアミラーゼ活性を決定すると、標準偏差が＜１０％である高い再現性の結果が得られた。

【0237】

図１４に示したように、グルコアミラーゼカセットの標的組込みを行った形質転換体は、グルコアミラーゼカセットの非標的組込みの発現に比較して、グルコアミラーゼ発現の低い可変性（０．９〜１．３５相対単位のグルコアミラーゼ活性）を示した（図１４）。明白に、発現カセットの非標的組込みは、形質転換体間のＧＡ活性レベルの有意な変動を生じさせた。

【0238】

結論として、このデータは、Ｉ−ＳｃｅＩにより作成された二本鎖切断は、関心対象の遺伝子を含有するカセットの標的組込みを刺激し、形質転換体間のタンパク質発現の同種性を増加させることを証明した。

【0239】

Ｄ．プロトプラスト混合物へのＩ−ＳｃｅＩの直接添加によりＤＳＢを作成した後のグルコアミラーゼ発現カセットの改良された形質転換および標的組込み
１．Ｉ−ＳｃｅＩ添加による標的組込み
Ｉ−ＳｃｅＩによって媒介される標的組込みは、さらにＩ−ＳｃｅＩ制限部位（ＪＰ７．７）を運んでいるプロトプラストと線状化グルコアミラーゼ標的組込みカセット（ｐＪＰ８）との混合物中にＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を直接的に添加することによって試験されている。

【0240】

手短には、２００μＬのＪＰ７．７プロトプラストに、異なる量のＩ−ＳｃｅＩ酵素＋線状化ｐＪＰ８カセットを加え、室温で１５分間インキュベートし、その後に氷上で２０分間インキュベーションした。Ｉ−ＳｃｅＩは、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。形質転換は、ＰＥＧ媒介性プロトプラスト法によって、酵素バッファーの１×の最終濃度にＩ−ＳｃｅＩおよびＤＮＡ混合物を加えることによって実施した（例えば、２７０μＬの総量のプロトプラスト、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＤＮＡ混合物とともに３０μＬの１０×の酵素バッファーを加える）。３５分間のインキュベーション後、プロトプラスト混合物は、１０μＭのウリジンおよび５μｇ／ｍＬのクロリムロンエチルを含有する形質転換プレート上でプレーティングした。結果は、表４に要約した。

【0241】

【表4】

【0242】

表４に示したように、Ｉ−ＳｃｅＩ酵素の直接的添加は、形質転換頻度および標的組込み形質転換体の数を増加させた。得られた形質転換体の数は、１００単位のＩ−ＳｃｅＩがプロトプラストに添加された場合には３倍まで増加した。

【0243】

有意な数の一次形質転換体は、Ｉ−ＳｃｅＩが添加された場合に安定性であることが見いだされた。

【0244】

形質転換体の数および安定性形質転換体の百分率は、Ｉ−ＳｃｅＩ濃度の増加に伴い増加した。約７５％の形質転換体はＩ−ＳｃｅＩの存在下ではＧｌａ発現カセットを含有していたが、Ｉ−ＳｃｅＩの非存在下では、たった約２５％の形質転換体しかグルコアミラーゼ活性を示さなかった。

【0245】

グルコアミラーゼを発現する形質転換体の大多数では、発現カセットは、相同性組換え事象によって組み込まれた（それぞれ５０単位および１００単位のＩ−ＳｃｅＩを添加した場合に分析された形質転換体の７８％および８５％）。コントロール形質転換（Ｉ−ＳｃｅＩを添加していない）からのグルコアミラーゼを発現する形質転換体は、全く標的組込みされなかった（表４）。

【0246】

Ｉ−ＳｃｅＩ添加を形質転換プレート内で０．８ｍｇ／ｍＬのＦＯＡと結合することにより、本発明者らは、標的組込み形質転換体を直接的に選択することができた（表４）。ＦＯＡ耐性形質転換体の精製後、試験した全安定性形質転換体はグルコアミラーゼを発現し、グルコアミラーゼ発現カセットは、相同性組換えによってｃｂｈ２遺伝子座で適正に組み込まれた（図９）。

【0247】

２．遺伝的特性解析およびＩ−ＳｃｅＩ発現を使用して標的対非標的組込みを比較したグルコアミラーゼ発現の比較
標的組込みグルコアミラーゼ発現カセットを用いた形質転換体のグルコアミラーゼ活性の可変性をランダム組込みに由来するグルコアミラーゼ活性の可変性と比較するために、菌株をマイクロタイタープレート内で増殖させ、培地をグルコアミラーゼ活性について試験した。

【0248】

図１５に示したように、Ｉ−ＳｃｅＩから得られたグルコアミラーゼカセットの標的組込みを用いた形質転換体は、ランダム形質転換体の発現と比較したグルコアミラーゼ発現において低い可変性を提示した。ＦＯＡ選択を使用することによって得られた形質転換体は、さらに類似の発現パターンを示したが、これはＦＯＡおよびＦＯＡの可能性のある突然変異効果の選択がグルコアミラーゼの発現レベルに影響を及ぼさなかったことを示している。

【0249】

実施例３：ＲＥＭＩを使用した他の安定性Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株の構築
Ａ．２つの異なるＤＮＡ断片を用いたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の形質転換
２つの異なる線状ＤＮＡ断片は、関心対象のまた別のタンパク質を発現させるために構築し、共形質転換によりＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）内に導入した。１つの断片は、選択マーカーとしてのｐｙｒ２遺伝子を有し、他の断片は選択マーカーとしてａｍｄＳ遺伝子を有していた。形質転換は、任意の制限酵素を用いずに、または制限酵素であるＳｗａＩもしくはＰａｃＩを用いて実施した。形質転換体は、両方のマーカーの存在について同時に選択した。制限酵素を全く加えていない場合に比較して、形質転換中の様々な量の様々な制限酵素を包含する効果を決定するために、数回の形質転換を実施した。下記は、得られた形質転換体の数および安定性であった百分率を示している結果の概要である。

【0250】

【表5】

【0251】

Ｂ．多数の制限酵素を用いて処理したＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の形質転換
形質転換効率および形質転換体の安定性に複数の制限酵素を使用することが及ぼす効果を見るために、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株は、溶解性セルロースモノオキシゲナーゼ（ＥＧ４）コーディング配列を含むＰＣＲ断片および任意の制限酵素を用いて処理していない、２０単位のＡｓｉＳＩだけで処理した、各７単位のＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩおよびＳｗａＩを用いて処理した、または各７単位のＡｓｉＳＩ、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩを用いて処理したｐｙｒ２選択マーカーを用いて形質転換させた。形質転換は、上記に記載したように標準ＰＥＧプロトコルにしたがって実施し、形質転換体は１Ｍのソルビトールを含む最小培地プレート上で増殖させた。結果は、図１７Ａおよび１７Ｂに示した。同一総量の制限酵素による消化を行うと、３種の異なる酵素を用いた消化は、１つだけの制限酵素（５０％）を用いた消化に比較して、安定性Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体（８０％まで）の百分率を増加させたが、これは形質転換効率を低下させると思われる。

【0252】

上記の組成物および方法をある程度詳細に、明確に理解されるために例示および実施例によって記載してきたが、当業者には、本明細書の教示に照らせば、添付の特許請求項の精神もしくは範囲から逸脱せずに所定の変化および修飾を加えられることは容易に明白である。

【0253】

したがって、先行する文は、本発明の組成物および方法の原理を単に例示するものである。当業者であれば、本明細書に明示的に記載も証明もしていないが、本発明の組成物および方法の原理を実現する、および本発明の精神および範囲の中に含まれる様々な配列を考案することができることは理解されるであろう。さらに、本明細書で言及した全ての実施例および条件に関する専門用語は、読者が当分野への拡大に本発明者らが寄与した本発明の組成物および方法ならびに概念の原理を理解することが意図されており、そのような詳細に言及された実施例および条件に関して制限するものではないと見なすべきである。さらに、本発明の組成物および方法ならびにそれらの特定の実施例の原理、態様および実施形態について言及している本明細書の全ての陳述は、それらの構造的および機能的両方の同等物を含むことが意図されている。さらに、そのような同等物には、現在公知の同等物および将来開発される同等物、つまり構造とは無関係に、同一機能を実施する、開発される任意の要素が含まれることが意図されている。このため、本発明の組成物および方法の範囲は、本明細書に示して記載した典型的な実施形態に限定されることは意図していない。

【0254】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4A-E】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A-17B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]