特許 6832093 顕微鏡システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6832093

(24)【登録日】2021年2月3日

(45)【発行日】2021年2月24日

(54)【発明の名称】顕微鏡システム

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/06 20060101AFI20210215BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20210215BHJP

   G02B 21/24 20060101ALI20210215BHJP

   G02B 26/10 20060101ALI20210215BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/06

   G02B21/36

   G02B21/24

   G02B26/10 C

【請求項の数】12

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-153304(P2016-153304)

(22)【出願日】2016年8月4日

(65)【公開番号】特開2018-22047(P2018-22047A)

(43)【公開日】2018年2月8日

【審査請求日】2019年8月2日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000376

【氏名又は名称】オリンパス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100118913

【弁理士】

【氏名又は名称】上田 邦生

(74)【代理人】

【識別番号】100142789

【弁理士】

【氏名又は名称】柳 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100163050

【弁理士】

【氏名又は名称】小栗 眞由美

(74)【代理人】

【識別番号】100201466

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 邦彦

(72)【発明者】

【氏名】服部 敏征

【審査官】 堀井 康司

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−１４５６８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２３２８４３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−０８５８５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−３６１０８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０３１００８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ １９／００−２１／００

Ｇ０２Ｂ ２１／０６−２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプル上でレーザ光を走査させる走査光学系と、
該走査光学系により前記レーザ光が走査された前記サンプルの画像を取得する観察光学系と、
該観察光学系により取得された前記画像において前記サンプル上の注目する注目領域を関心領域として設定する関心領域設定部と、
前記注目領域の前記観察光学系の観察光軸回りの回転に伴う前記画像上の前記関心領域の前記観察光軸回りの回転量を算出する回転量算出部と、
前記注目領域の前記観察光軸回りの向きに対する前記レーザ光の走査方向が一定になるよう前記走査光学系を制御する制御部とを備え、
該制御部が、前記回転量算出部により算出される前記関心領域の前記観察光軸回りの回転量に基づき、前記注目領域の前記観察光軸回りの回転に合わせて前記レーザ光の走査方向を前記観察光軸回りに回転させる顕微鏡システム。

【請求項2】

前記レーザ光の焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動可能な焦点位置移動部と、
前記注目領域の前記観察光軸に沿う方向の移動に伴う前記画像上の前記関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量を算出する第１移動量算出部とを備え、
前記制御部が、記第１移動量算出部により算出された前記関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量に基づき、前記焦点位置移動部により前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させる請求項１に記載の顕微鏡システム。

【請求項3】

前記回転量算出部が、前記注目領域の前記観察光軸に交差する交差軸回りの回転に伴う前記画像上の前記関心領域の前記交差軸回りの回転量を算出し、
前記制御部が、前記回転量算出部により算出された前記関心領域の前記交差軸回りの回転量に基づき、前記走査光学系による前記レーザ光の走査と同期して、前記焦点位置移動部により前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させる請求項２に記載の顕微鏡システム。

【請求項4】

前記注目領域の前記観察光軸に沿う方向の移動に伴う前記画像上の前記関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量を算出する第１移動量算出部を備え、
前記制御部が、前記第１移動量算出部により算出された前記関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量に基づき、前記走査光学系により前記レーザ光の焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させる請求項１に記載の顕微鏡システム。

【請求項5】

前記回転量算出部が、前記注目領域の前記観察光軸に交差する交差軸回りの回転に伴う前記画像上の前記関心領域の前記交差軸回りの回転量を算出し、
前記制御部が、前記回転量算出部により算出された前記関心領域の前記交差軸回りの回転量に基づき、前記走査光学系により前記レーザ光を前記観察光軸に交差する方向に前記レーザ光を走査させつつ前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させる請求項４に記載の顕微鏡システム。

【請求項6】

前記走査光学系による前記レーザ光の走査範囲を前記観察光軸に交差する２次元的な方向に移動可能な走査範囲移動部と、
前記注目領域の前記２次元的な方向の移動に伴う前記画像上の前記関心領域の前記２次元的な方向の移動量を算出する第２移動量算出部とを備え、
前記制御部が、前記第２移動量算出部により算出された前記関心領域の前記２次元的な方向の移動量に基づき、前記走査範囲移動部により前記レーザ光の走査範囲を前記２次元的な方向に移動させる請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡システム。

【請求項7】

サンプル上でレーザ光を走査させる他の走査光学系を備え、
前記関心領域設定部が、前記画像において前記サンプル上の注目する他の注目領域を他の関心領域として設定し、
前記回転量算出部が、前記他の注目領域の前記観察光軸回りの回転に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記観察光軸回りの回転量を算出し、
前記制御部が、前記他の注目領域の前記観察光軸回りの向きに対する前記レーザ光の走査方向が一定になるよう前記他の走査光学系を制御し、前記回転量算出部により算出された前記他の関心領域の前記観察光軸回りの回転量に基づき、前記他の注目領域の前記観察光軸回りの回転に合わせて前記レーザ光の走査方向を前記観察光軸回りに回転させる請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡システム。

【請求項8】

前記レーザ光の焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動可能な他の焦点位置移動部と、
前記他の注目領域の前記観察光軸に沿う方向の移動に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量を算出する他の第１移動量算出部とを備え、
前記制御部が、前記他の第１移動量算出部により算出された前記他の関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量に基づき、前記他の焦点位置移動部により前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させる請求項７に記載の顕微鏡システム。

【請求項9】

前記回転量算出部が、前記他の注目領域の前記観察光軸に交差する交差軸回りの回転に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記交差軸回りの回転量を算出し、
前記制御部が、前記回転量算出部により算出された前記他の関心領域の前記交差軸回りの回転量に基づき、前記他の走査光学系による前記レーザ光の走査と同期して、前記他の焦点位置移動部により前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させる請求項８に記載の顕微鏡システム。

【請求項10】

前記他の注目領域の前記観察光軸に沿う方向の移動に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量を算出する他の第１移動量算出部を備え、
前記制御部が、前記他の第１移動量算出部により算出された前記他の関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量に基づき、前記他の走査光学系により前記レーザ光の焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させる請求項７に記載の顕微鏡システム。

【請求項11】

前記回転量算出部が、前記他の注目領域の前記観察光軸に交差する交差軸回りの回転に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記交差軸回りの回転量を算出し、
前記制御部が、前記回転量算出部により算出された前記他の関心領域の前記交差軸回りの回転量に基づき、前記他の走査光学系により前記レーザ光を前記観察光軸に交差する方向に走査させつつ前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させる請求項１０に記載の顕微鏡システム。

【請求項12】

前記他の走査光学系による前記レーザ光の走査範囲を前記観察光軸に交差する２次元的な方向に移動可能な他の走査範囲移動部と、
前記他の注目領域の前記２次元的な方向の移動に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記２次元的な方向の移動量を算出する他の第２移動量算出部とを備え、
前記制御部が、前記他の第２移動量算出部により算出された前記他の関心領域の前記２次元的な方向の移動量に基づき、前記他の走査範囲移動部により前記レーザ光の走査範囲を前記２次元的な方向に移動させる請求項７から請求項１１のいずれかに記載の顕微鏡システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、顕微鏡システムに関するものである。

【背景技術】

【0002】

従来、動きのあるサンプルに対して画像上で注目するＲＯＩ（関心領域）を設定して、サンプルを追跡しながら観察する顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１に記載のレーザ顕微鏡は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向の３次元的なサンプルの移動に合わせてＲＯＩをその都度設定し直すことにより、動きのあるサンプルを追跡している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】米国特許第７６７６０７１号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、例えば、線虫のようなサンプルは、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向の移動以外に、観察光軸回りに回転運動することがある。そのため、特許文献１に記載のレーザ顕微鏡により、このようなサンプルを経時的に撮像して得られた複数の画像を時系列に並べると、画像毎に観察光軸回りのサンプルの向きが異なり、サンプルの経時変化を観察し難いという問題がある。また、経時的に得られたこのような複数の画像を時系列に並べながら画像処理によって画像上のサンプルの見た目の向きを事後的に統一していく方法もあるが、このような方法ではリアルタイム性に欠け観察に手間がかかるという問題がある。

【0005】

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、動きのあるサンプルに対して、画像上の見た目の向きをリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して観察することができる顕微鏡システムを提供することを目的としている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、サンプル上でレーザ光を走査させる走査光学系と、該走査光学系により前記レーザ光が走査された前記サンプルの画像を取得する観察光学系と、該観察光学系により取得された前記画像において前記サンプル上の注目する注目領域を関心領域として設定する関心領域設定部と、前記注目領域の前記観察光学系の観察光軸回りの回転に伴う前記画像上の前記関心領域の前記観察光軸回りの回転量を算出する回転量算出部と、前記注目領域の前記観察光軸回りの向きに対する前記レーザ光の走査方向が一定になるよう前記走査光学系を制御する制御部とを備え、該制御部が、前記回転量算出部により算出される前記関心領域の前記観察光軸回りの回転量に基づき、前記注目領域の前記観察光軸回りの回転に合わせて前記レーザ光の走査方向を前記観察光軸回りに回転させる顕微鏡システムである。

【0007】

本態様によれば、走査光学系によりレーザ光が走査されて観察光学系によりサンプルの画像が取得されると、関心領域設定部によりその画像においてサンプル上の注目領域が関心領域として設定される。この場合において、関心領域が設定されたサンプルの注目領域が観察光軸回りに回転すると、画像上でその注目領域の回転に伴って関心領域が回転する。

【0008】

したがって、回転量算出部により算出される関心領域の観察光軸回りの回転量に基づいて、制御部により走査光学系を制御することで、サンプルの注目領域におけるレーザ光の走査方向を一定にすることができる。これにより、動きのあるサンプルに対して、画像処理によって画像上の関心領域の見た目の向きを事後的に統一しなくても、画像上の関心領域の見た目の向きをリアルタイムで一定に維持しながらサンプルを追跡して観察することができる。

【0009】

上記態様においては、前記レーザ光の焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動可能な焦点位置移動部と、前記注目領域の前記観察光軸に沿う方向の移動に伴う前記画像上の前記関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量を算出する第１移動量算出部とを備え、前記制御部が、前記第１移動量算出部により算出された前記関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量に基づき、前記焦点位置移動部により前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。

【0010】

このように構成することで、焦点位置移動部によってサンプルに対して観察光軸に沿う方向にレーザ光の焦点位置を移動させることにより、観察光学系によってサンプルの３次元的な画像を取得することができる。この場合において、関心領域が設定されたサンプルの注目領域が観察光軸回りに回転するとともに観察光軸に沿う方向に移動すると、画像上でその注目領域の回転および移動に伴って関心領域が回転および移動する。

【0011】

したがって、第１移動量算出部により算出される関心領域の観察光軸に沿う方向の移動量に基づいて、制御部が焦点位置移動部によりレーザ光の焦点位置を観察光軸に沿う方向に移動させることで、動きのあるサンプルに対して、３次元的な画像上の関心領域の見た目の向きおよび観察光軸に沿う方向の位置をリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して観察することができる。

【0012】

上記態様においては、前記回転量算出部が、前記注目領域の前記観察光軸に交差する交差軸回りの回転に伴う前記画像上の前記関心領域の前記交差軸回りの回転量を算出し、前記制御部が、前記回転量算出部により算出された前記関心領域の前記交差軸回りの回転量に基づき、前記走査光学系による前記レーザ光の走査と同期して、前記焦点位置移動部により前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。

【0013】

このように構成することで、サンプルの注目領域が観察光軸に交差する交差軸回りに回転した場合に、注目領域の交差軸回りの傾きに応じてレーザ光の走査面を傾けることができる。これにより、動きのあるサンプルに対して、３次元的な画像上の関心領域の見た目の向きおよび交差軸回りの傾きをリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して観察することができる。

【0014】

上記態様においては、前記注目領域の前記観察光軸に沿う方向の移動に伴う前記画像上の前記関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量を算出する第１移動量算出部を備え、前記制御部が、前記第１移動量算出部により算出された前記関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量に基づき、前記走査光学系により前記レーザ光の焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。

【0015】

このように構成することで、走査光学系によってサンプルに対して観察光軸に交差する方向に走査しながらレーザ光の焦点位置を観察光軸に沿う方向に移動させていくことにより、観察光学系によってサンプルの３次元的な画像を取得することができる。この場合において、関心領域が設定されたサンプルの注目領域が観察光軸回りに回転するとともに観察光軸に沿う方向に移動すると、画像上でその注目領域の回転および移動に伴って関心領域が回転および移動する。

【0016】

したがって、第１移動量算出部により算出される関心領域の観察光軸に沿う方向の移動量に基づいて、制御部が走査光学系によりレーザ光の焦点位置を観察光軸に沿う方向に移動させることで、動きのあるサンプルに対して、３次元的な画像上の関心領域の見た目の向きおよび観察光軸に沿う方向の位置をリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して観察することができる。

【0017】

上記態様においては、前記回転量算出部が、前記注目領域の前記観察光軸に交差する交差軸回りの回転に伴う前記画像上の前記関心領域の前記交差軸回りの回転量を算出し、
前記制御部が、前記回転量算出部により算出された前記関心領域の前記交差軸回りの回転量に基づき、前記走査光学系により前記レーザ光を前記観察光軸に交差する方向に走査させつつ前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。

【0018】

このように構成することで、サンプルの注目領域が観察光軸に交差する交差軸回りに回転した場合に、注目領域の交差軸回りの傾きに応じてレーザ光の走査面を傾けて、３次元的な画像上の関心領域の見た目の向きおよび交差軸回りの傾きをリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して観察することができる。

【0019】

上記態様においては、前記走査光学系による前記レーザ光の走査範囲を前記観察光軸に交差する２次元的な方向に移動可能な走査範囲移動部と、前記注目領域の前記２次元的な方向の移動に伴う前記画像上の前記関心領域の前記２次元的な方向の移動量を算出する第２移動量算出部とを備え、前記制御部が、前記第２移動量算出部により算出された前記関心領域の前記２次元的な方向の移動量に基づき、前記走査範囲移動部により前記レーザ光の走査範囲を前記２次元的な方向に移動させることとしてもよい。

【0020】

このように構成することで、走査範囲移動部により、観察光軸に交差する２次元的な方向の異なる範囲を観察することができる。この場合において、関心領域が設定されたサンプルの注目領域が観察光軸に交差する２次元的な方向に移動すると、画像上でその注目領域の移動に伴って関心領域が移動する。

【0021】

したがって、第２移動量算出部により算出される関心領域の観察光軸に交差する２次元的な方向の移動量に基づいて、制御部が走査範囲移動部によりレーザ光の走査範囲を観察光軸に交差する２次元的な方向に移動させることで、動きのあるサンプルに対して、画像上の関心領域の観察光軸に交差する２次元的な方向の位置もリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して観察することができる。

【0022】

上記態様においては、サンプル上でレーザ光を走査させる他の走査光学系を備え、前記関心領域設定部が、前記画像において前記サンプル上の注目する他の注目領域を他の関心領域として設定し、前記回転量算出部が、前記他の注目領域の前記観察光軸回りの回転に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記観察光軸回りの回転量を算出し、前記制御部が、前記他の注目領域の前記観察光軸回りの向きに対する前記レーザ光の走査方向が一定になるよう前記他の走査光学系を制御し、前記回転量算出部により算出された前記他の関心領域の前記観察光軸回りの回転量に基づき、前記他の注目領域の前記観察光軸回りの回転に合わせて前記レーザ光の走査方向を前記観察光軸回りに回転させることとしてもよい。

【0023】

このように構成することで、他の走査光学系によってサンプル上でレーザ光を走査させることにより、サンプルに光刺激を与えることができる。これにより、光刺激が与えられたサンプルの反応を観察光学系により取得される画像によって観察することができる。この場合において、他の関心領域が設定されたサンプルの他の注目領域が観察光軸回りに回転すると、画像上で他の注目領域の回転に伴って他の関心領域が回転する。

【0024】

したがって、回転量算出部により算出される他の関心領域の前記観察光軸回りの回転量に基づいて、制御部により他の走査光学系を制御することで、サンプルの他の注目領域におけるレーザ光の走査方向を一定にすることができる。これにより、動きのあるサンプルに対して、画像上の他の関心領域の見た目の向きをリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して光刺激を与えることができる。

【0025】

上記態様においては、前記レーザ光の焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動可能な他の焦点位置移動部と、前記他の注目領域の前記観察光軸に沿う方向の移動に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量を算出する他の第１移動量算出部とを備え、前記制御部が、前記他の第１移動量算出部により算出された前記他の関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量に基づき、前記他の焦点位置移動部により前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。

【0026】

このように構成することで、他の焦点位置移動部によってサンプルに対して観察光軸に沿う方向にレーザ光の焦点位置を移動させることにより、サンプルの３次元的な位置に光刺激を与えることができる。この場合において、他の関心領域が設定されたサンプルの他の注目領域が観察光軸回りに回転するとともに観察光軸に沿う方向に移動すると、画像上で他の注目領域の回転および移動に伴って他の関心領域が回転および移動する。

【0027】

したがって、他の第１移動量算出部により算出される他の関心領域の移動量に基づいて、制御部が他の焦点位置移動部により焦点位置を観察光軸に沿う方向に移動させることで、動きのあるサンプルに対して、３次元的な画像上の他の関心領域の見た目の向きおよび観察光軸に沿う方向の位置をリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して光刺激を与えることができる。

【0028】

上記態様においては、前記回転量算出部が、前記他の注目領域の前記観察光軸に交差する交差軸回りの回転に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記交差軸回りの回転量を算出し、前記制御部が、前記回転量算出部により算出された前記他の関心領域の前記交差軸回りの回転量に基づき、前記他の走査光学系による前記レーザ光の走査と同期して、前記他の焦点位置移動部により前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。

【0029】

このように構成することで、サンプルの他の注目領域が観察光軸に交差する交差軸回りに回転した場合に、他の注目領域の交差軸回りの傾きに応じてレーザ光の走査面を傾けることができる。これにより、動きのあるサンプルに対して、３次元的な画像上の他の関心領域の見た目の向きおよび交差軸回りの傾きをリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して光刺激を与えることができる。

【0030】

上記態様においては、前記他の注目領域の前記観察光軸に沿う方向の移動に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量を算出する他の第１移動量算出部を備え、前記制御部が、前記他の第１移動量算出部により算出された前記他の関心領域の前記観察光軸に沿う方向の移動量に基づき、前記他の走査光学系により前記レーザ光の焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。

【0031】

このように構成することで、他の走査光学系によってサンプルに対して観察光軸に交差する方向に走査しながらレーザ光の焦点位置を観察光軸に沿う方向に移動させていくことにより、サンプルの３次元的な位置に光刺激を与えることができる。この場合において、他の関心領域が設定されたサンプルの他の注目領域が観察光軸回りに回転するとともに観察光軸に沿う方向に移動すると、画像上で他の注目領域の回転および移動に伴って他の関心領域が回転および移動する。

【0032】

したがって、他の第１移動量算出部により算出される他の関心領域の観察光軸に沿う方向の移動量に基づいて、制御部が他の走査光学系によりレーザ光の焦点位置を観察光軸に沿う方向に移動させることで、動きのあるサンプルに対して、３次元的な画像上の他の関心領域の見た目の向きおよび観察光軸に沿う方向の位置をリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して光刺激を与えることができる。

【0033】

上記態様においては、前記回転量算出部が、前記他の注目領域の前記観察光軸に交差する交差軸回りの回転に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記交差軸回りの回転量を算出し、前記制御部が、前記回転量算出部により算出された前記他の関心領域の前記交差軸回りの回転量に基づき、前記他の走査光学系により前記レーザ光を前記観察光軸に交差する方向に走査させつつ前記焦点位置を前記観察光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。

【0034】

このように構成することで、サンプルの他の注目領域が観察光軸に交差する交差軸回りに回転した場合に、他の注目領域の交差軸回りの傾きに応じてレーザ光の走査面を傾けて、３次元的な画像上の他の関心領域の見た目の向きおよび交差軸回りの傾きをリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して光刺激を与えることができる。

【0035】

上記態様においては、前記他の走査光学系による前記レーザ光の走査範囲を前記観察光軸に交差する２次元的な方向に移動可能な他の走査範囲移動部と、前記他の注目領域の前記２次元的な方向の移動に伴う前記画像上の前記他の関心領域の前記２次元的な方向の移動量を算出する他の第２移動量算出部とを備え、前記制御部が、前記他の第２移動量算出部により算出された前記他の関心領域の前記２次元的な方向の移動量に基づき、前記他の走査範囲移動部により前記レーザ光の走査範囲を前記２次元的な方向に移動させることとしてもよい。

【0036】

このように構成することで、他の走査範囲移動部により、観察光軸に交差する２次元的な方向の異なる範囲を光刺激することができる。この場合において、他の関心領域が設定されたサンプルの他の注目領域が観察光軸に交差する２次元的な方向に移動すると、画像上で他の注目領域の移動に伴って他の関心領域が移動する。

【0037】

したがって、他の第２移動量算出部により算出される他の関心領域の観察光軸に交差する２次元的な方向の移動量に基づいて、制御部が他の走査範囲移動部によりレーザ光の走査範囲を観察光軸に交差する２次元的な方向に移動させることで、動きのあるサンプルに対して、画像上の他の関心領域の観察光軸に交差する２次元的な方向の位置もリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して光刺激を与えることができる。

【発明の効果】

【0038】

本発明によれば、動きのあるサンプルに対して、画像上の見た目の向きをリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルを追跡して観察することができるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムを示すブロック図である。

【図2】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。

【図3】サンプルに設定された観察ＲＯＩの一例を示す平面図である。

【図4】サンプルの注目領域がＺ軸回りに回転する様子を示す平面図である。

【図5】参考例としての従来の顕微鏡システムを用いた場合の画像上のサンプルの観察ＲＯＩの動きの一例を示す平面図である。

【図6】図１，２の顕微鏡システムを用いた場合の画像上のサンプルの観察ＲＯＩの動きの一例を示す平面図である。

【図7】（ａ）はサンプルの注目領域の一例を示す投影図であり、（ｂ）は（ａ）の注目領域がＸ，Ｙ，Ｚ軸回りに回転する様子の一例を示す投影図である。

【図8】本発明の第２実施形態に係る顕微鏡システムを示すブロック図である。

【図9】（ａ）は画像上のサンプルの刺激ＲＯＩの一例を示す投影図であり、（ｂ）はサンプルの刺激領域がＺ軸回りに回転する様子の一例を示す投影図である。

【図10】（ａ）はサンプルの刺激領域の一例を示す投影図であり、（ｂ）は（ａ）の刺激領域がＸ，Ｙ，Ｚ軸回りに回転する様子の一例を示す投影図である。

【図11】本発明の第１，第２実施形態の第２変形例に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。

【図12】図１１のＡＯＤの配置の一例を示す図である。

【図13】本発明の第１，第２実施形態の第３変形例に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。

【発明を実施するための形態】

【0040】

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムについて図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、図１に示すように、サンプルを観察する顕微鏡３と、顕微鏡３を制御する制御装置５と、ユーザからの指示を制御装置５に入力するユーザインターフェース部７とを備えている。また、顕微鏡システム１には、ユーザに指示を入力させるマウスやキーボード等の入力部（図示略）が接続されている。

【0041】

顕微鏡３は、図１および図２に示すように、サンプルＳが載置される電動ステージ（走査範囲移動部）９と、レーザ光を発生する光源１１と、光源１１からのレーザ光をサンプルＳ上で走査させるガルバノスキャナ（走査光学系）１３と、ガルバノスキャナ１３によりレーザ光が走査されたサンプルＳの画像を取得する観察光学系１５とを備えている。
サンプルＳとしては、例えば、３次元的に移動したり、観察光学系１５の光軸回りに回転したりする線虫のようなものを例示して説明する。

【0042】

電動ステージ９は、例えば、２個のモータ（図示略）を備えており、制御装置５の制御により、観察光学系１５の光軸に直交するＸ方向およびＹ方向の各移動軸に沿って、Ｘ方向およびＹ方向に水平移動することができるようになっている。これにより、ガルバノスキャナ１３によるレーザ光の走査範囲をＸ，Ｙ方向に移動させることができる。以下、レーザ光の走査範囲のＸ，Ｙ方向の位置をＸＹ位置という。

【0043】

ガルバノスキャナ１３は、２枚のガルバノミラーであり、制御装置５の制御により、互いに直交する揺動軸回りに揺動可能に設けられている。このガルバノスキャナ１３は、揺動角度に応じてレーザ光を偏向することにより、サンプルＳ上でレーザ光をＸ，Ｙ方向に２次元的に走査させることができるようになっている。また、これら２枚のガルバノミラーは、それぞれの振り角の変化のパターンを同期して変化させることで、レーザ光の走査方向を変更することができるようになっている。

【0044】

観察光学系１５は、図２に示すように、ガルバノスキャナ１３により走査されたレーザ光をサンプルＳに照射する一方、サンプルＳにおいて発生する蛍光を集光する互いに倍率が異なる複数の対物レンズ１７と、観察光学系１５の焦点距離を変更可能なＥＴＬ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｌｅｎｓ、焦点位置移動部）１９と、ＥＴＬ１９を透過した蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー２１と、ダイクロイックミラー２１により分岐された蛍光の通過を制限するピンホール２３と、ピンホール２３を通過した蛍光を検出する光電子増倍管のような検出器２５とを備えている。

【0045】

ＥＴＬ１９は、制御装置５の制御により、レーザ光の焦点位置を観察光学系１５の光軸に沿う方向、すなわちＺ方向に移動することができるようになっている。以下、レーザ光のＺ方向の焦点位置をＺ位置という。

【0046】

ダイクロイックミラー２１は、ガルバノスキャナ１３からのレーザ光を対物レンズ１７に向けて反射する一方、対物レンズ１７から蛍光をピンホール２３に向けて透過させるようになっている。
ピンホール２３は、サンプルＳにおける対物レンズ１７の焦点位置において発生した蛍光のみを通過させることができるようになっている。

【0047】

ユーザインターフェース部７は、例えば、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）上のＧＵＩ（Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｕｓｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）である。このユーザインターフェース部７は、図１に示すように、顕微鏡３により取得された画像においてサンプルＳ上の注目する注目領域を観察ＲＯＩ（関心領域）として設定するＲＯＩ設定部（関心領域設定部）２７を備えている。観察ＲＯＩは、サンプルＳの全領域に設定することとしてもよいし、サンプルＳの一部の領域に設定することとしてもよい。以下、図３に示すように、サンプルＳの注目領域を符号Ｗとし、観察ＲＯＩを符号３０とする。

【0048】

制御装置５は、ＰＣ（図示略）と、各種プログラムを記憶するメモリ（図示略）と、メモリに記憶されている各種プログラムを読み込んで各プログラムを実行し、ガルバノスキャナ１３、ＥＴＬ１９、電動ステージ９および検出器２５等を制御する制御部（演算処理装置）２９とを備えている。

【0049】

ＰＣは、検出器２５により検出された蛍光の輝度情報に基づいてサンプルＳの画像を生成するようになっている。また、ＰＣは、サンプルＳにおける焦点位置が異なる複数の２次元的な画像を合成して３次元的な画像を生成することができるようになっている。
以下、図１において、メモリに記憶されている画像解析プログラムを回転量算出部３１および移動量算出部（第１移動量算出部、第２移動量算出部）３３として示す。

【0050】

回転量算出部３１は、サンプルＳの注目領域Ｗが観察光学系１５の光軸回り、すなわちＺ軸回りに回転した場合に、画像上でその注目領域Ｗの回転に伴って回転する観察ＲＯＩ３０のＺ軸回りの回転量を２次元的な画像または３次元的な画像の処理により算出するようになっている。

【0051】

移動量算出部３３は、サンプルＳの注目領域Ｗが観察光学系１５の光軸に沿う方向、すなわちＺ方向に移動した場合に、画像上でその注目領域Ｗの移動に伴ってＺ方向に移動する観察ＲＯＩ３０の移動量を２次元的な画像上または３次元的な画像の処理により算出するようになっている。また、移動量算出部３３は、サンプルＳの注目領域ＷがＺ軸に交差するＸ，Ｙ方向に移動した場合に、画像上でその注目領域Ｗの移動に伴ってＸ，Ｙ方向に移動する観察ＲＯＩ３０の移動量を２次元的な画像上または３次元的な画像の処理により算出するようになっている。

【0052】

制御部２９は、回転量算出部３１により算出された観察ＲＯＩ３０のＺ軸回りの回転量を読み込み、サンプルＳの注目領域Ｗにおけるレーザ光の走査方向が一定になるよう、その回転量に関する情報をガルバノスキャナ１３にフィードバックして、２枚のガルバノミラーのそれぞれの駆動波形を変更することで、これらガルバノミラーの振り角の変化のパターンを同期して調整するようになっている。

【0053】

また、制御部２９は、サンプルＳの注目領域ＷがＺ方向に移動すると、移動量算出部３３により算出された観察ＲＯＩ３０のＺ方向の移動量を読み込み、そのＺ方向の移動量に関する情報をＥＴＬ１９にフィードバックして、レーザ光のＺ方向の焦点位置を調整するようになっている。この制御部２９は、ガルバノスキャナ１３の制御とＥＴＬ１９の制御とを同期して行うことができるようになっている。

【0054】

また、制御部２９は、サンプルＳの注目領域ＷがＸ，Ｙ方向に移動すると、移動量算出部３３により算出された観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ方向の移動量を読み込み、そのＸ，Ｙ方向の移動量に関する情報を電動ステージ９にフィードバックして、電動ステージ９のＸ，Ｙ方向の位置を調整するようになっている。

【0055】

このように構成された顕微鏡システム１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１によりサンプルＳの所望の注目領域を観察する場合は、まず、電動ステージ９にサンプルＳを載置し、光源１１からレーザ光を発生させる。光源１１から発せられたレーザ光は、ガルバノスキャナ１３によりＸ，Ｙ方向に２次元的に走査されてダイクロイックミラー２１により反射され、ＥＴＬ１９を介して対物レンズ１７によりサンプルＳに照射される。

【0056】

レーザ光が照射されることによりサンプルＳにおいて発生した蛍光は、対物レンズ１７により集光されてＥＴＬ１９を介してレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー２１によりレーザ光の光路から分岐される。そして、レーザ光の光路から分岐された蛍光の内、対物レンズ１７の焦点位置において発生した蛍光のみがピンホール２３を通過して検出器２５により検出される。これにより、制御装置５のＰＣにおいて、検出器２５によって検出された蛍光の輝度情報に基づいて、サンプルＳの２次元的な画像（スライス画像）が生成される。

【0057】

次いで、制御部２９によりＥＴＬ１９が制御され、ガルバノスキャナ１３によるレーザ光の走査位置がＺ方向に微動する。そして、観察光学系１５により移動後のＺ位置でレーザ光が走査されて、サンプルＳのスライス画像が取得される。このようにして、同一のＸＹ位置において、Ｚ位置が一定のステップ量で段階的にずらされて、各Ｚ位置のスライス画像が取得される。そして、各Ｚ位置のスライス画像が取得されると、制御装置５のＰＣによりそれらのスライス画像が合成されて、サンプルＳの３次元的な画像が生成される。

【0058】

次に、ユーザは、生成したサンプルＳの３次元的な画像において、サンプルＳ上の観察したい所望の注目領域Ｗを入力部により指定する。サンプルＳの注目領域Ｗが指定されると、ＲＯＩ設定部２７により、図３に示すように、画像上で注目領域Ｗが観察ＲＯＩ３０として設定される。

【0059】

ユーザは、より高倍の対物レンズ１７に切り替え、観察ＲＯＩ３０が設定されたサンプルＳの注目領域Ｗをタイムラプス観察することで、サンプルＳの注目領域Ｗについて経時的な変化を詳細に観察することができる。

【0060】

ここで、例えば、図４に示すように、サンプルＳの注目領域ＷがＺ軸回りに回転すると、従来の顕微鏡システムでは、図５に示すように、サンプルＳの画像上で、その注目領域Ｗの回転に伴って観察ＲＯＩ３０も回転することとなる。例えば、タイムラプス観察中に、サンプルＳの注目領域ＷがＺ軸回りに回転し続けた場合は、取得されるスライス画像毎に観察ＲＯＩ３０のＺ軸回りの向きが変化することとなる。

【0061】

これに対し、本実施形態に係る顕微鏡システム１においては、回転量算出部３１により、観察光学系１５によって取得される回転後のサンプルＳの画像が処理され、画像上でその注目領域Ｗの回転に伴って回転する観察ＲＯＩ３０のＺ軸回りの回転量（θ）が算出される。

【0062】

そして、算出された観察ＲＯＩ３０の回転量（θ）に基づいて、制御部２９により、サンプルＳの注目領域Ｗにおけるレーザ光の走査方向が一定になるよう、その回転量に関する情報がガルバノスキャナ１３にフィードバックされて、２枚のガルバノミラーのそれぞれの振り角の変化のパターンが同期して回転量θの分だけ調整される。これにより、図６に示すように、画像上のサンプルＳにおける観察ＲＯＩ３０の見た目の向きをリアルタイムで一定に維持することができる。

【0063】

また、この顕微鏡システム１においては、サンプルＳの注目領域ＷがＺ方向に移動すると、移動量算出部３３により、観察光学系１５によって取得される移動後のサンプルＳの画像が処理され、画像上でその注目領域Ｗの移動に伴って移動する観察ＲＯＩ３０のＺ方向の移動量が算出される。

【0064】

そして、制御部２９により、観察ＲＯＩ３０のＺ方向の移動量に関する情報がＥＴＬ１９にフィードバックされて、レーザ光のＺ方向の焦点位置が調整される。これにより、画像上のサンプルＳにおける観察ＲＯＩ３０のＺ方向の位置もリアルタイムで一定に維持することができる。

【0065】

また、サンプルＳの注目領域ＷがＸ，Ｙ方向に移動すると、移動量算出部３３により、観察光学系１５によって取得される移動後のサンプルＳの画像が処理され、画像上でその注目領域Ｗの移動に伴って移動する観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ方向の移動量が算出される。

【0066】

そして、制御部２９により、観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ方向の移動量に関する情報が電動ステージ９にフィードバックされて、電動ステージ９のＸ，Ｙ方向の位置が調整される。これにより、画像上のサンプルＳにおける観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ方向の位置もリアルタイムで一定に維持することができる。

【0067】

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、動きのあるサンプルＳに対して、全ての画像を取得した後に画像処理によって画像上の観察ＲＯＩ３０の見た目の向きを事後的に統一しなくても、画像上の観察ＲＯＩ３０の見た目の向きおよびＸ，Ｙ，Ｚ方向の位置をリアルタイムで一定に維持しながらサンプルＳの注目領域Ｗを追跡して観察することができる。

【0068】

また、サンプルＳの注目領域Ｗにおけるレーザ光の走査方向を一定にするとともに、Ｘ，Ｙ方向の走査位置やＺ方向の焦点位置を調整することにより、サンプルＳ全体が同じ動きをする場合だけでなく、サンプルＳの注目領域Ｗが他の領域と異なる動きをする場合においても、画像上のサンプルＳにおける観察ＲＯＩ３０の見た目の向きや位置を固定して、その注目領域Ｗの経時変化を観察することができる。

【0069】

本実施形態においては、例えば、図７（ａ），（ｂ）に示すように、サンプルＳの注目領域ＷがＸ軸、Ｙ軸およびＺ軸回りに回転した場合に、サンプルＳの注目領域Ｗを３次元的に追跡することとしてもよい。
この場合、まず、観察光学系１５により、サンプルＳにおける平面状の注目領域Ｗの法線ベクトルに対して、複数枚のスライス画像を取得する。

【0070】

そして、移動量算出部３３により、取得した複数枚のスライス画像を処理して、画像上でその注目領域Ｗの移動に伴って移動する観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動量を算出するとともに、回転量算出部３１により、取得した複数枚のスライス画像を処理して、画像上でその注目領域Ｗの回転に伴って回転する観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ，Ｚ軸回りの回転量（θ）を算出することとすればよい。

【0071】

そして、算出された観察ＲＯＩ３０のＺ軸回りの回転量に基づいて、制御部２９により、サンプルＳの注目領域Ｗにおけるレーザ光の走査方向が一定になるよう、そのＺ軸回りの回転量に関する情報をガルバノスキャナ１３にフィードバックして、２枚のガルバノミラーのそれぞれの振り角の変化のパターンを同期して調整することとすればよい。

【0072】

また、算出された観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ軸回りの回転量に基づいて、制御部２９により、そのＸ，Ｙ軸回りの回転量に関する情報をＥＴＬ１９にフィードバックし、ガルバノスキャナ１３によるレーザ光の走査と同期して、レーザ光の焦点位置をＺ方向に移動させることとすればよい。サンプルＳの注目領域ＷがＸ，Ｙ軸回りに回転した場合に、ガルバノスキャナ１３によるレーザ光のＸ，Ｙ方向の走査と同期してＥＴＬ１９によりレーザ光の焦点位置をＺ方向に移動させることで、注目領域ＷのＸ，Ｙ軸回りの傾きに応じてレーザ光の走査面を傾けることができる。

【0073】

サンプルＳの注目領域ＷがＸ，Ｙ方向に移動した場合は、制御部２９により、画像上の観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ方向の移動量に関する情報を電動ステージ９にフィードバックして、電動ステージ９のＸ，Ｙ方向の位置を調整することとすればよい。

【0074】

このようにすることで、サンプルＳの注目領域ＷがＸ，Ｙ，Ｚ方向のいずれかの方向に移動したりＸ，Ｙ，Ｚ軸のいずれかの軸回りに回転したりした場合でも、画像上のサンプルＳにおける観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ，Ｚ方向の位置およびＸ，Ｙ，Ｚ軸回りの見た目の向きもリアルタイムで一定に維持することができる。

【0075】

画像処理は、例えば、テンプレートマッチング等を行うこととしてもよい。この場合、追跡したい注目領域Ｗを図示しないメモリにテンプレートとして予め保存しておき、回転量算出部３１および移動量算出部３３により、撮影ごとにテンプレートが３次元空間のどの位置にあるかを探索して、観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動量およびＸ，Ｙ，Ｚ軸回りの回転量を算出することとしてもよい。なお、画像処理は他の処理方法を採用することとしてもよい。

【0076】

また、本実施形態においては、サンプルＳの注目領域Ｗを観察ＲＯＩ３０として設定し、画像上の観察ＲＯＩ３０の見た目の向きおよびＸ，Ｙ，Ｚ方向の位置をリアルタイムで一定に維持することとした。これに代えて、サンプルＳ上の刺激を与える刺激領域（注目領域）を刺激ＲＯＩとして設定し、観察ＲＯＩ３０の追跡と同様にして、刺激領域のＺ軸回りの向きおよびＸ，Ｙ，Ｚ方向の位置をリアルタイムで一定に維持することとしてもよい。この場合、観察光学系１５として、例えば、サンプルＳの画像を取得するカメラを採用することとしてもよい。

【0077】

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡システムについて説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム４１は、図８に示すように、観察用のガルバノスキャナ１３の他に、刺激用のガルバノスキャナ（他の走査光学系）４３を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡システム１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

【0078】

本実施形態に係る顕微鏡システム４１は、観察用のレーザ光とは異なる波長の刺激用のレーザ光が刺激用のガルバノスキャナ４３により走査されて、観察光学系１５の対物レンズ１７によりサンプルＳに照射されるようになっている。

【0079】

刺激用のガルバノスキャナ４３は、例えば、観察用のガルバノスキャナ１３と同じく２枚のガルバノミラーであり、刺激用の光源からのレーザ光をサンプルＳ上でＸ，Ｙ方向に走査させることができるようになっている。また、これら２枚のガルバノミラーは、それぞれの振り角の変化のパターンを同期して変化させることで、レーザ光の走査方向を変更することができるようになっている。

【0080】

ＲＯＩ設定部２７は、観察光学系１５により取得されたサンプルＳの画像において、図９（ａ）に示すように、サンプルＳ上の刺激する刺激領域（他の注目領域）Ｚを刺激ＲＯＩ（他の関心領域）４０として設定するようになっている。

【0081】

回転量算出部３１は、サンプルＳの刺激領域ＺがＺ軸回りに回転した場合に、画像上でその刺激領域Ｚの回転に伴って回転する刺激ＲＯＩ４０のＺ軸回りの回転量を２次元的な画像上または３次元的な画像の処理より算出するようになっている。回転量算出部３１による刺激ＲＯＩ４０の回転量の算出は、観察ＲＯＩ３０の回転量の算出とは別個に独立して行われるようになっている。

【0082】

移動量算出部３３(第１移動量算出部、第２移動量算出部、他の第１移動量算出部、他の第２移動量算出部）は、サンプルＳの刺激領域ＺがＺ方向に移動した場合に、画像上でその刺激領域Ｚの移動に伴ってＺ方向に移動する刺激ＲＯＩ４０の移動量を２次元的な画像上または３次元的な画像の処理より算出するようになっている。

【0083】

また、移動量算出部３３は、サンプルＳの刺激領域ＺがＸ，Ｙ方向に移動した場合に、画像上でその刺激領域Ｚの移動に伴ってＸ，Ｙ方向に移動する刺激ＲＯＩ４０の移動量を２次元的な画像上または３次元的な画像の処理より算出するようになっている。移動量算出部３３によるこれら刺激ＲＯＩ４０の移動量の算出は、観察ＲＯＩ３０の移動量の算出とは別個に独立して行われるようになっている。

【0084】

制御部２９は、回転量算出部３１により算出された刺激ＲＯＩ４０のＺ軸回りの回転量を読み込み、サンプルＳの刺激領域Ｚにおけるレーザ光の走査方向が一定になるよう、その回転量に関する情報を刺激用のガルバノスキャナ４３にフィードバックして、２枚のガルバノミラーのそれぞれの駆動波形を変更することで、これらガルバノミラーの振り角の変化のパターンを同期して調整するようになっている。

【0085】

また、制御部２９は、サンプルＳの刺激領域ＺがＺ方向に移動すると、移動量算出部３３により算出された刺激ＲＯＩ４０のＺ方向の移動量を読み込み、そのＺ方向の移動量に関する情報をＥＴＬ(焦点位置移動部、他の焦点位置移動部）１９にフィードバックして、レーザ光のＺ方向の焦点位置を調整するようになっている。この制御部２９は、刺激用のガルバノスキャナ４３の制御とＥＴＬ１９の制御とを同期して行うことができるようになっている。

【0086】

また、制御部２９は、サンプルＳの刺激領域ＺがＸ，Ｙ方向に移動すると、移動量算出部３３により算出された刺激ＲＯＩ４０のＸ，Ｙ方向の移動量を読み込み、そのＸ，Ｙ方向の移動量に関する情報を電動ステージ９にフィードバックして、電動ステージ(走査範囲移動部、他の走査範囲移動部）９のＸ，Ｙ方向の位置を調整するようになっている。

【0087】

このように構成された顕微鏡システム４１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム４１によりサンプルＳの光刺激による反応を観察する場合は、まず、第１実施形態と同様の方法でサンプルＳの３次元的な画像を取得し、観察ＲＯＩ３０を設定する。

【0088】

次に、ユーザは、生成したサンプルＳの３次元的な画像において、サンプルＳ上の刺激したい所望の刺激領域Ｚを入力部により指定する。サンプルＳの刺激領域Ｚが指定されると、ＲＯＩ設定部２７により、画像上で刺激領域Ｚが刺激ＲＯＩ４０として設定される。

【0089】

ユーザは、刺激用のガルバノスキャナ４３により刺激領域Ｚに刺激用のレーザ光を照射し、観察光学系１５により注目領域Ｗに観察用のレーザ光を照射してその注目領域Ｗの画像を取得することで、光刺激によるサンプルＳの注目領域Ｗの反応を観察することができる。

【0090】

ここで、例えば、図９（ｂ）に示すように、サンプルＳの刺激領域ＺがＺ軸回りに回転すると、回転量算出部３１により、観察光学系１５によって取得される回転後のサンプルＳの画像が処理され、画像上でその刺激領域Ｚの回転に伴って回転する刺激ＲＯＩ４０のＺ軸回りの回転量（θ´）が算出される。

【0091】

そして、算出された刺激ＲＯＩ４０の回転量（θ´）に基づいて、制御部２９により、サンプルＳの刺激領域Ｚにおけるレーザ光の走査方向が一定になるよう、その回転量に関する情報が刺激用のガルバノスキャナ４３にフィードバックされて、２枚のガルバノミラーのそれぞれの振り角の変化のパターンが同期して回転量（θ´）の分だけ調整される。これにより、画像上のサンプルＳにおける刺激ＲＯＩ４０の見た目の向きをリアルタイムで一定に維持することができる。

【0092】

また、サンプルＳの刺激領域ＺがＺ方向に移動すると、移動量算出部３３により、観察光学系１５によって取得される移動後のサンプルＳの画像が処理され、画像上でその刺激領域Ｚの移動に伴って移動する刺激ＲＯＩ４０のＺ方向の移動量が算出される。

【0093】

そして、制御部２９により、刺激ＲＯＩ４０のＺ方向の移動量に関する情報がＥＴＬ１９にフィードバックされて、レーザ光のＺ方向の焦点位置が調整される。これにより、画像上のサンプルＳにおける刺激ＲＯＩ４０のＺ方向の位置もリアルタイムで一定に維持することができる。

【0094】

また、サンプルＳの刺激領域ＺがＸ，Ｙ方向に移動すると、移動量算出部３３により、観察光学系１５によって取得される移動後のサンプルＳの画像が処理され、画像上でその刺激領域Ｚの移動に伴って移動する刺激ＲＯＩ４０のＸ，Ｙ方向の移動量が算出される。

【0095】

そして、制御部２９により、刺激ＲＯＩ４０のＸ，Ｙ方向の移動量に関する情報が電動ステージ９にフィードバックされて、電動ステージ９のＸ，Ｙ方向の位置が調整される。これにより、画像上のサンプルＳにおける刺激ＲＯＩ４０のＸ，Ｙ方向の位置もリアルタイムで一定に維持することができる。

【0096】

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡システム４１によれば、動きのあるサンプルＳに対して、画像上の刺激ＲＯＩ４０の見た目の向きおよびＸ，Ｙ，Ｚ方向の位置をリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルＳを追跡して光刺激による反応を観察することができる。また、サンプルＳの刺激領域Ｚにおけるレーザ光の走査方向を一定にするとともに、Ｘ，Ｙ方向の走査位置やＺ方向の焦点位置を調整することにより、サンプルＳの刺激領域Ｚが他の領域と異なる動きをする場合においても、サンプルＳの刺激ＲＯＩ４０の向きや位置を固定して、その刺激領域Ｚに光刺激を与えることができる。

【0097】

本実施形態においても、例えば、図１０（ａ），（ｂ）に示すように、サンプルＳの刺激領域ＺがＸ，Ｙ，Ｚ軸回りに回転した場合に、サンプルＳの刺激領域Ｚを３次元的に追跡することとしてもよい。
この場合、注目領域Ｗの場合と同様に、観察光学系１５により、サンプルＳにおける平面状の刺激領域Ｚの法線ベクトルに対して複数枚のスライス画像を取得し、移動量算出部３３および回転量算出部３１により、取得した複数枚のスライス画像を処理して刺激ＲＯＩ４０のＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動量およびＸ，Ｙ，Ｚ軸回りの回転量（θ）を算出することとすればよい。

【0098】

そして、算出された刺激ＲＯＩ４０のＺ軸回りの回転量に基づいて、制御部２９により、サンプルＳの刺激領域Ｚにおけるレーザ光の走査方向が一定になるよう、そのＺ軸回りの回転量に関する情報を他のガルバノスキャナ４３にフィードバックして、２枚のガルバノミラーのそれぞれの振り角の変化のパターンを同期して調整することとすればよい。

【0099】

また、算出された観察ＲＯＩ３０のＸ，Ｙ軸回りの回転量に基づいて、制御部２９により、そのＸ，Ｙ軸回りの回転量に関する情報をＥＴＬ１９にフィードバックし、他のガルバノスキャナ４３によるレーザ光の走査と同期して、レーザ光の焦点位置をＺ方向に移動させることとすればよい。サンプルＳの刺激領域ＺがＸ，Ｙ軸回りに回転した場合に、他のガルバノスキャナ４３によるレーザ光のＸ，Ｙ方向の走査と同期してＥＴＬ１９によりレーザ光の焦点位置をＺ方向に移動させることで、刺激領域ＺのＸ，Ｙ軸回りの傾きに応じてレーザ光の走査面を傾けることができる。

【0100】

サンプルＳの刺激領域ＺがＸ，Ｙ方向に移動した場合は、制御部２９により、画像上の刺激ＲＯＩ４０のＸ，Ｙ方向の移動量に関する情報を電動ステージ９にフィードバックして、電動ステージ９のＸ，Ｙ方向の位置を調整することとすればよい。

【0101】

このようにすることで、サンプルＳの刺激領域ＺがＸ，Ｙ，Ｚ方向のいずれかの方向に移動したりＸ，Ｙ，Ｚ軸のいずれかの軸回りに回転したりした場合でも、画像上のサンプルＳにおける刺激ＲＯＩ４０のＸ，Ｙ，Ｚ方向の位置およびＸ，Ｙ，Ｚ軸回りの見た目の向きもリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルＳを追跡して光刺激による反応を観察することができる。

【0102】

上記各実施形態は以下のように変形することができる。
上記各実施形態においては、走査光学系および他の走査光学系としてそれぞれガルバノスキャナ１３，４３を例示して説明したが、第１変形例としては、例えば、走査光学系および他の走査光学系としてそれぞれ２つのＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｏ―Ｏｐｔｉｃ Ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ、図示略））を採用することとしてもよい。ＡＯＤは、結晶内に超音波を伝搬させてレーザ光を回折させることで走査することができる。

【0103】

この場合、それぞれ２つのＡＯＤを互いに直交するように配置し、制御部２９により各ＡＯＤを制御して、サンプルＳ上でレーザ光をＸ，Ｙ方向に２次元的に走査させることとすればよい。また、制御部２９により、回転量算出部３１により算出された観察ＲＯＩ３０および刺激ＲＯＩ４０の回転量に基づいて、サンプルＳの注目領域Ｗおよび刺激領域Ｚにおけるレーザ光の走査方向が一定になるよう、各ＡＯＤにフィードバックしてレーザ光を走査させる向きを調整することとすればよい。

【0104】

また、上記各実施形態においては、焦点位置移動部としてＥＴＬ１９を採用したが、第２変形例としては、例えば、図１１に示すように、走査光学系および焦点位置移動部として、４個のＡＯＤ４５を採用することとしてもよい。

【0105】

この場合、例えば、図１２に示すように、制御部２９により、１対２個のＡＯＤ４５に互いに対向する方向のチャープ信号を入力してＸＺ走査を行うこととすればよい。また、これら１対２個のＡＯＤ４５どうしを直交配置し、制御部２９により、回転量算出部３１によって算出された観察ＲＯＩ３０の回転量に基づいて、サンプルＳの注目領域Ｗにおけるレーザ光の走査方向が一定になるよう、各ＡＯＤ４５にフィードバックしてレーザ光を走査させる向きを調整することとすればよい。

【0106】

また、制御部２９により、移動量算出部３３によって算出された観察ＲＯＩ３０のＺ方向の移動量を読み込んで、各ＡＯＤ４５にフィードバックして、レーザ光のＺ方向の焦点位置を調整することとすればよい。
本変形例においては、走査光学系および焦点位置移動部と同様に、他の走査光学系および他の焦点位置移動部として４個のＡＯＤを採用することとしてもよい。

【0107】

この場合、例えば、サンプルＳの注目領域Ｗおよび刺激領域ＺがＸ，Ｙ軸回りに回転した場合は、回転量算出部３１により、注目領域Ｗおよび刺激領域ＺのＸ，Ｙ軸回りの回転に伴う観察ＲＯＩ３０および刺激ＲＯＩ４０のＸ，Ｙ軸回りの回転量を算出することとすればよい。そして、算出された観察ＲＯＩ３０および刺激ＲＯＩ４０のＸ，Ｙ軸回りの回転量に基づいて、制御部２９により、そのＸ，Ｙ軸回りの回転量に関する情報をＡＯＤにフィードバックし、ＡＯＤによりレーザ光をＸ，Ｙ方向に走査させつつレーザ光の焦点位置をＺ方向に移動させることとすればよい。

【0108】

このようにすることで、サンプルＳの注目領域Ｗおよび刺激領域ＺのＸ，Ｙ軸回りの傾きに応じてレーザ光の走査面を傾けて、３次元的な画像上の観察ＲＯＩ３０および刺激ＲＯＩ４０の見た目の向きとＸ，Ｙ軸回りの傾きをリアルタイムで一定に維持しながら、サンプルＳを追跡して観察および刺激することができる。

【0109】

また、上記各実施形態においては、ガルバノスキャナ１３の２枚のガルバノミラーのそれぞれの振り角の変化のパターンを同期して調整することとしたが、第３変形例としては、例えば、図１３に示すように、ガルバノスキャナ１３とダイクロイックミラー２１との間の光路上にイメージロータ４７を配置し、このイメージロータ４７によりレーザ光の走査方向を変更することとしてもよい。この場合、本変形例においては、走査光学系として、ガルバノスキャナ１３に代えて、例えば、ローテーションスキャンができないレゾナントスキャナを採用することとしてもよい。

【0110】

本変形例においては、ガルバノスキャナ１３と同様に、他のガルバノスキャナ４３によるレーザ光の走査方向を変更するイメージロータを採用することとしてもよい。この場合、他のガルバノスキャナ４３に代えて、レゾナントスキャナを採用することとしてもよい。

【0111】

また、上記各実施形態においては、焦点位置移動部および他の焦点位置移動部としてＥＴＬ１９を例示して説明したが、これに代えて、対物レンズ１７をＺ方向に微動可能なレボルバを採用することとしてもよい。この場合、制御部２９の制御により、レボルバにより保持している対物レンズ１７をＺ方向に微動させることで、観察光学系１５によるレーザ光の走査位置をＺ方向に移動させることとすればよい。

【0112】

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。また、第１移動量算出部、第２移動量算出部、他の第１移動量算出部、他の第２移動量算出部として１つの移動量算出部３３を例示して説明したが、それぞれ独立した別個の移動量算出部を採用することとしてもよい。

【0113】

また、上記各実施形態においては、サンプルＳを３次元的に観察する場合において、３次元的な画像上での観察ＲＯＩ３０や刺激ＲＯＩ４０のＺ軸回りの向きやＸ，Ｙ，Ｚ方向の位置等を一定に維持する例を説明したが、Ｚ方向への移動やＸ，Ｙ軸回りの回転が生じないサンプルＳを２次元的に観察したり刺激したりする場合は、回転量算出のために複数の焦点位置で観察画像を取得する必要はなく、回転量算出部３１は観察面に対応する１つの焦点位置で取得した２次元的な画像を用いて観察ＲＯＩ３０や刺激ＲＯＩ４０のＺ軸回りの向きを算出することとすればよい。

【符号の説明】

【0114】

１，４１ 顕微鏡システム
９ 電動ステージ（走査範囲移動部、他の走査範囲移動部）
１３ ガルバノスキャナ（走査光学系）
１５ 観察光学系
１９ ＥＴＬ（焦点位置移動部）
２７ ＲＯＩ設定部（関心領域設定部）
２９ 制御部
３０ 観察ＲＯＩ(関心領域）
３１ 回転量算出部
３３ 移動量算出部（第１移動量算出部、第２移動量算出部、他の第１移動量算出部、他の第２移動量算出部）
４０ 刺激ＲＯＩ(他の関心領域）
４３ 刺激用のガルバノスキャナ（他の走査光学系）
Ｓ サンプル
Ｗ 注目領域
Ｚ 刺激領域（他の注目領域）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】