特許 6832707 ＴＮＦαに対する結合メンバー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6832707

(24)【登録日】2021年2月4日

(45)【発行日】2021年2月24日

(54)【発明の名称】ＴＮＦαに対する結合メンバー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20210215BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20210215BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210215BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210215BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210215BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210215BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20210215BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20210215BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210215BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20210215BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20210215BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20210215BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20210215BHJP

   A61K 8/73 20060101ALI20210215BHJP

   A61K 8/98 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 27/00 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 19/06 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20210215BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20210215BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20210215BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20210215BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C07K16/24

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/08

   A61K38/16

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K39/395 Y

   A61K31/7088

   A61K35/76

   A61K35/12

   A61K8/64

   A61K8/73

   A61K8/98

   A61P43/00 105

   A61P27/00

   A61P3/10

   A61P9/10

   A61P19/06

   A61P19/02

   A61P19/00

   A61P17/00

   A61P9/00

   A61P29/00

   A61P25/00

   A61P37/02

   A61P11/00

   A61P27/02

   A61P17/06

   A61P1/04

   A61Q19/00

   G01N33/53 D

【請求項の数】33

【全頁数】62

(21)【出願番号】特願2016-558349(P2016-558349)

(86)(22)【出願日】2015年3月26日

(65)【公表番号】特表2017-515457(P2017-515457A)

(43)【公表日】2017年6月15日

(86)【国際出願番号】EP2015056646

(87)【国際公開番号】WO2015144852

(87)【国際公開日】20151001

【審査請求日】2018年3月5日

(31)【優先権主張番号】14001123.0

(32)【優先日】2014年3月26日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】510213255

【氏名又は名称】セル メディカ スイッツァランド アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(74)【代理人】

【識別番号】100137811

【弁理士】

【氏名又は名称】原 秀貢人

(72)【発明者】

【氏名】シャムシーブ アディジャパー

(72)【発明者】

【氏名】クレッチュマー タイタス

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５３９７７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２５３５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５４５４３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２６１４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／００２２６５９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０８４７１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／００２４３０８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５２４０７１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／２４

Ｃ１２Ｎ １５／１３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＮＦαに対する結合特異性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号６、７および８に記載の可変重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列；および
（ｉｉ）配列番号３、４および５に記載の可変軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３配列；
を含む、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

請求項１の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＮＦαのＩＣ_５０が５０ｐＭ未満であり、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、場合により、ｓｃＦｖのような一価の結合メンバーである、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

請求項１または２の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ヒト化された、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

請求項１から３のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ｉ）配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖；および／または
（ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖、
を含む、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
リンカー配列をさらに含み、
前記リンカー配列は、配列番号１０に示される配列である、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

請求項５の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
配列番号９を含む、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記の可変重鎖は、少なくとも１つの以下の残基：
（ｉ）重鎖アミノ酸１２位（ＡＨｏナンバリングによる）のセリン（Ｓ）；
（ｉｉ）重鎖アミノ酸１０３位（ＡＨｏナンバリングによる）のセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；および／または
（ｉｉｉ）重鎖アミノ酸１４４位（ＡＨｏナンバリングによる）のセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）
をさらに含む、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

請求項１から７のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ｉ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’_２、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨまたは最小認識単位などの抗体フラグメント；
（ｉｉ）免疫グロブリン分子の全長；および／または、
（ｉｉｉ）アフィボディ、アフィリン分子、ＡｄＮｅｃｔｉｎ、リポカリンムテイン、ＤＡＲＰｉｎ、ノッチン、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、アビマー、テトラネクチンまたはトランス−ボディなどの、非−免疫グロブリン足場、
である、または含む、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

請求項１から８のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
一価または多価であり、
ここで、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、場合により二重特異性、好ましくはダイアボディ、単鎖ダイアボディ、またはタンデムｓｃＦｖである、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＢＳ（ｐＨ７．２）において３７℃で１週間のインキュベーション後、少なくとも９３％が単量体のままである、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
化学的または生物学的に改変された、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項12】

請求項１１の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
グリコシル化、ペグ化またはＨＥＳ化された、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項13】

請求項１から１２のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む、
単離された核酸分子。

【請求項14】

請求項１３に記載の核酸分子の配列を含む、
ベクター。

【請求項15】

請求項１３の核酸分子または請求項１４のベクターを含む、
宿主細胞。

【請求項16】

請求項１から１２のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物であって；
さらに、適切な担体、希釈剤または賦形剤を含む、
組成物。

【請求項17】

請求項１３の核酸分子、請求項１４のベクター、または請求項１５の宿主細胞を含む組成物であって；
さらに、適切な担体、希釈剤または賦形剤を含む、
組成物。

【請求項18】

請求項１６の組成物であって、
医薬組成物であり、
前記担体は、薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤である、
組成物。

【請求項19】

請求項１８の組成物であって、
非経口、経口、直腸、全身性、泌尿生殖器、局所、硝子体内、眼球内、耳、鼻腔内、真皮、舌下、または口腔投与に適切な形態である、
組成物。

【請求項20】

非ヒト対象におけるＴＮＦαが介在する疾患を治療する方法であって、
前記方法は、それを必要とする対象に、請求項１８から１９のいずれか一項の医薬組成物を投与するステップを含む、
方法。

【請求項21】

請求項２０の方法であって、
前記のＴＮＦαが介在する疾患は、増殖性糖尿病性網膜症、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎および慢性痛風性関節炎、シュニッツラー症候群、全身性若年性特発性関節炎、関節リウマチ、じんましん、血管炎、１型糖尿病、２型糖尿病、再発性多巣性骨髄炎、再発性多発性軟骨炎、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）、ベーチェット病、家族性地中海熱、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性多発筋痛症、ＮＡＬＰ３−突然変異、壊疽性膿皮症、慢性特発性じんましん、変形性関節症、湿潤性加齢黄斑変性、ドライアイ症候群、乾癬、滑膜炎−座瘡−膿疱症−骨化過剰症−骨炎症候群、マクロファージ活性化症候群、周期熱、腺炎、咽頭炎、アフタ性潰瘍症候群、成人発症スチル病、メバロン酸キナーゼ欠損症、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）、強直性脊椎炎、汗腺膿瘍、乾癬、および尋常性座蒼の少なくとも１つである、
方法。

【請求項22】

請求項１から１２のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ＴＮＦαが介在する疾患の治療、予防または進行遅延での使用のための、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項23】

請求項２２の使用のための、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記のＴＮＦαが介在する疾患は、増殖性糖尿病性網膜症、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎および慢性痛風性関節炎、シュニッツラー症候群、全身性若年性特発性関節炎、関節リウマチ、じんましん、血管炎、１型糖尿病、２型糖尿病、再発性多巣性骨髄炎、再発性多発性軟骨炎、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）、ベーチェット病、家族性地中海熱、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性多発筋痛症、ＮＡＬＰ３−突然変異、壊疽性膿皮症、慢性特発性じんましん、変形性関節症、湿潤性加齢黄斑変性、ドライアイ症候群、乾癬、滑膜炎−座瘡−膿疱症−骨化過剰症−骨炎症候群、マクロファージ活性化症候群、周期熱、腺炎、咽頭炎、アフタ性潰瘍症候群、成人発症スチル病、メバロン酸キナーゼ欠損症、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）、強直性脊椎炎、汗腺膿瘍、乾癬および／または尋常性座蒼である、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項24】

請求項１から１２のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ｉ）特にＴＮＦαが介在する疾患の治療のための、薬物としての使用のため；
（ｉｉ）診断での使用のため；
（ｉｉｉ）化粧品での使用のため；および／または
（ｉｖ）検出目的のための、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項25】

請求項１から１２のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、
前記方法は：
（ｉ）請求項１５の宿主細胞を培養し、それにより、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるステップ；
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するステップ；および
（ｉｉｉ）場合により、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを精製するステップ、
を含む、
方法。

【請求項26】

請求項１から１２のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、
前記方法は：
（ａ）無細胞発現系を核酸産物テンプレートと接触させるステップ（前記核酸産物テンプレートは、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする）；
（ｂ）前記核酸産物テンプレートの転写および翻訳を生じさせ、それにより、反応混合物を形成させるステップ；
（ｃ）前記反応混合物から前記抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するステップ；および
（ｄ）場合により、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを精製するステップ、
を含む、
方法。

【請求項27】

請求項１から１２の抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントを生産するステップは、化学合成のステップを含む、
方法。

【請求項28】

請求項２５または２６の方法であって、
前記方法は、化学合成のステップを含む、
方法。

【請求項29】

生物学的サンプル中のＴＮＦαの存在を検出するインビトロ方法であって、
前記方法は：
（ｉ）ＴＮＦαへの抗体またはその抗原結合フラグメントの特異的な結合を許容する条件下で、前記生物学的サンプルを、請求項１から１２のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させるステップ、および
（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントとＴＮＦαとの間の複合体が形成されたかどうか検出するステップ、
を含む、
方法。

【請求項30】

請求項２９の方法であって、
前記生物学的サンプルが、ヒト起源である、
方法。

【請求項31】

請求項２９から３０のいずれか一項の方法であって、
前記生物学的サンプルは、血液サンプル、尿サンプル、脳脊髄液サンプル、バイオプシーサンプル、およびリンパ液サンプルの少なくとも１つである、
方法。

【請求項32】

請求項２９から３１のいずれか一項の方法であって、
前記方法は、請求項１から１２のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた治療に適任の対象を選択するための方法である、
方法。

【請求項33】

生物学的サンプル中のＴＮＦαの存在を検出するためのキットであって、
請求項１から１２のいずれか一項の抗体またはその抗原結合フラグメントを、説明書と試薬のパッケージ化された組み合わせと一緒に含む、
キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年３月２６日に欧州特許庁で出願された欧州特許出願ＥＰ １４ ００１ １２３の優先権および利益を主張する。欧州特許出願ＥＰ １４ ００１ １２３の内容は、全ての表、図面、および特許請求の範囲を含む−ならびに、本明細書に含まれない任意の要素または明細書、特許請求の範囲または図面の部分の援用を含むその全体で、ＰＣＴ規則４．１８に従ったＰＣＴ規則２０．５（ａ）を参照して、全ての目的のために参照により本明細書中に援用される。
［配列リストの参照］
本出願は、配列リストを含む。
［本発明の分野］
ＴＮＦαに対する結合メンバー、例えばヒト化結合分子、具体的には一価の、非常に強力で安定した抗−ＴＮＦα試薬、例えば、治療および診断用途に適用可能な抗体フラグメントが提供される。結合メンバーは、一部の実施態様では、免疫グロブリン、そのフラグメント、または、ＴＮＦαに特異的な免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子である。また、そのような結合メンバーをコードする核酸分子、それぞれの核酸分子の配列を含むベクター、それぞれの核酸分子のベクターまたは核酸配列を含む宿主細胞、結合メンバーまたは核酸分子を含む製剤および診断組成物、ならびに、それらの使用も提供される。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景に関する以下の議論は、読者が本発明を理解するのを助けるために提供されるだけであり、本発明に対する従来技術を説明または構成することは認められない。

【0003】

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αは、免疫応答および炎症性疾患において中心的な役割を果たす強力な炎症促進性サイトカインである。それは、炎症性、免疫学的および病態生理学的反応の主要なメディエータ―として説明されている。主に、単球および活性化マクロファージから分泌されるが、ＴＮＦαは、線維芽細胞、好中球、好酸球および上皮細胞を含む非常に多くの他の細胞型によっても生産される。

【0004】

カケクチンとも呼ばれるＴＮＦαは、２つの生物学的に活性の形態：膜貫通型および可溶型で存在する。ＴＮＦαの可溶型は、タンパク質分解の切断により、膜貫通型ＴＮＦα（ｔｍＴＮＦα）から放出される。両方のＴＮＦα型は、生物学的に活性の三量体であり、ＴＮＦ受容体に結合し、様々な生物学的機能を与えて宿主防御に寄与する。さらに、膜貫通型および可溶型ＴＮＦαの両方とも、炎症性および自己免疫性疾患の病因に関与する。

【0005】

多面的なＴＮＦα効果を仲介する、ＴＮＦαに関する２つの受容体が同定された（ＴＮＦ−Ｒ１および−Ｒ２）。前記受容体は、様々な細胞上に、主に単球およびマクロファージ上に発現される。受容体活性化は、ＩＬ−１、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８などの炎症促進性サイトカイン生産；ケモカイン生産；好中球活性化；内皮層の透過性の増大；および接着分子の発現を含む様々な生物学的効果を引き起こす。したがって、数多くの疾患は、上方制御されたＴＮＦαレベルと関連し、その結果として、ＴＮＦα阻害剤は、薬物療法における広い用途が見いだされている。増え続けている数のＴＮＦα阻害剤の重要なサブクラスは、生物学的薬剤である。いくつかのＴＮＦαの生物学的阻害剤は、規制上の承認を受け、市販されている。そのような生物学的阻害剤の１つのグループは、免疫グロブリン全長である。例えば、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））は、約１５０ｋＤａのキメラＩｇＧであり、クローン病、関節リウマチ、乾癬性、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、乾癬、およびベーチェット病の治療において承認されている。アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））は、約１５０ｋＤａのＩｇＧ１であり、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、クローン病、乾癬性、乾癬、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎およびベーチェット病に関して承認されている。最後に、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））は、約１５０ｋＤａ分子量のヒトＩｇＧ１であり、関節リウマチ、乾癬性、強直性脊椎炎、および潰瘍性大腸炎において承認されている。

【0006】

未だ、一部の承認された生物学的ＴＮＦα阻害剤は、免疫グロブリン構造全長から外れる。例えば、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））は、１５０ｋＤａの分子量を有する、ＴＮＦ−受容体２細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であり、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性、乾癬および強直性脊椎炎の治療に関して承認されている。さらに、セルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））は、約９０ｋＤａのヒト化Ｆａｂ−ＰＥＧコンジュゲートであり、クローン病および関節リウマチの治療において承認され、広く用いられる。

【0007】

当該分野での進歩にもかかわらず、最適な組み合わせの生物物理学的特性を有する生物製剤に対する必要性が残っている。例えば、皮膚疾患の局所治療、すなわち、皮膚への局所的なＴＮＦα阻害剤の適用は、全身性治療の副作用を避けることができるので、非常に好ましい適用経路である。しかしながら、とりわけ、現在承認されている免疫療法は大きすぎて皮膚角質層を横断することができないので、および／または、薬剤生産費用のため、現在までにそのような治療は実行可能でない。

【0008】

乾癬および乾癬性におけるＴＮＦαの重要な役割は、十分確立されている（例えば、ＣＯＲＤＯＲＯ，ＫＭ ａｎｄ ＦＬＥＤＭＡＮ ＳＲ．ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｓｋｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｌｅｔｔｅｒ ２００７，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．４−６を参照）。乾癬は、２〜３％の流行で頻出する疾患である。より軽症型は、グルココルチコイドおよび／またはビタミンＤ３−類似体で局所的に治療することができるが、より重症型は、シクロスポリン、メトトレキサート、または最終的には生物製剤を含む、全身性治療を必要とする（Ｐｒｉｅｔｏ−Ｐｅｒｅｚ Ｒ．ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１４（１３）：１６２３−１６３４）。ＴＮＦαなどをターゲットとするモノクローナル抗体（アダリムマブ、エタネルセプトおよびインフリキシマブ）の使用を含む、重度の乾癬の全身性治療のための生物学的治療の導入は、重症型の乾癬を患っている患者の医療的ニーズを実質的に対処している。一方で、非常に効果的なこれらの薬剤は、いくつかの潜在的に重度で重大な有害事象と関連する。したがって、これらの薬剤の利益／リスクのプロファイルは、軽度〜中度の型の乾癬を示している乾癬患者の大多数を除外する。副作用は、例えば、生物学的薬剤の局所的適用、すなわち局所投与を通して減らすことができる。しかしながら、抗体全長は、それらの大きいサイズに起因して、そのような投与経路に適切でない。

【0009】

反対型座瘡（ａｃｎｅ ｉｎｖｅｒｓａ）とも呼ばれる汗腺膿瘍は、別のＴＮＦα関連疾患である。前記の炎症性慢性疾患は、腋窩、内太腿、鼠径部および臀部などの、アポクリン腺を有する皮膚における膿瘍の塊により特徴付けられる（ＳＣＨＥＩＮＦＥＬＤ， Ｎ．Ｈｉｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖａ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｏｖｅｒ ３５０ ｈｉｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｏｎｌｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１３， ｖｏｌ １９，ｐ．１）。ＴＮＦα阻害剤は、前記の奇病の治療に成功的に用いられている（Ｂｒｕｎａｓｓｏ ＡＭ，Ｍａｓｓｏｎｅ Ｃ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖａ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ．Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２０１１，ｖｏｌ．９１（１），ｐｐ．７０；Ｓｏｔｉｒｉｏｕ Ｅ．ｅｔ ｌａ，Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖａ，Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２００９，ｖｏｌ．８９（１），ｐｐ．８２−３）。ＴＮＦαに対して向けられる抗体は、別の皮膚奇病である壊疽性膿皮症の治療においても効果的であった（Ｒｅｄｄｉｃｋ ＣＬ ｅｔ ａｌ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｐｙｏｄｅｒｍａ ｇａｎｇｒｅｎｏｓｕｍ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖａ ｗｉｔｈ ａｄａｌｉｍｕｍａｂ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｏｎｌｉｎｅ Ｊ．２０１０，ｖｏｌ．１６（８），ｐｐ．１５）。現在までに、そのような奇病の治療に承認されている生物学的薬剤は存在しないが、市販の生物製剤はオフラベルで用いられている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

第１の態様では、ＴＮＦαに関する結合メンバーが提供される。一部の実施態様では、結合メンバーはヒト化され、可溶型ＴＮＦαの活性を中和する。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子である。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な免疫グロブリンである。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な抗体フラグメントである。一部の実施態様では、結合メンバーは、哺乳類の免疫グロブリンまたはそのフラグメントである。一部の実施態様では、結合メンバーは、ヒト化免疫グロブリンまたはそのフラグメントである。一部の実施態様では、結合メンバーは、ヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメントである。

【0011】

一実施態様では、可溶型ヒトＴＮＦαの生物学的作用の阻害に関して半数−最大阻害濃度ＩＣ_５０を測定することにより判定して、５０ピコモル（ｐＭ）未満の効能で可溶型ＴＮＦαを阻害する、一価結合メンバーが提供される。

【0012】

ヒト化されるかされないかに関わらず、ｐＭの範囲での効能値を有する結合メンバー、具体的には抗体フラグメントは、特異的であり、日常的に得られないものである。このことは、１つの可変軽鎖および重鎖のみを含み、そのため２つの軽鎖および２つの重鎖を含む二価抗体のいかなる結合力効果も欠く一価抗体フラグメントに関して、特に言えることである。

【0013】

さらに、抗体全長を、より小さなフラグメントに変換する場合、その効能は通常小さくなる。このことは、結合価の付随する変化に起因するだけでなく（例えば、抗体フラグメントは一価のみであり、一方で、免疫グロブリン全長は二価または多価である）、立体的理由にも起因し得る。

【0014】

一部の実施態様では、第１の態様に係る結合メンバーは、配列番号３〜８により定義されるＣＤＲ配列を含む。結合メンバーは、一部の実施態様では、配列番号３〜８からなる群の２以上、好ましくは全てのＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号３により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号３に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号３に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号４により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号４に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号５により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号５に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号５に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号５に対して少なくとも９３％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号６により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号６に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号６に対して少なくとも８８％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号７により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号７に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号７に対して少なくとも９４％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号８に対して少なくともの８０％アミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号８に対して少なくとも９２％のアミノ酸同一性を有する配列により定義されるＣＤＲ配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号３〜８からなる群の３以上の配列を含む。

【0015】

一部の実施態様では、本明細書に開示される結合メンバーは、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖フレームワーク配列；および、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖フレームワーク配列を含む。一部の実施態様では、本明細書に開示される結合メンバーは、配列番号１に対して少なくとも９７％の同一性を有する可変軽鎖フレームワーク配列；および、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖フレームワーク配列を含む。一部の実施態様では、本明細書に開示される結合メンバーは、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖フレームワーク配列；および、配列番号２に対して少なくとも９６％の同一性を有する可変重鎖フレームワーク配列を含む。

【0016】

好ましい実施態様では、結合メンバーは、配列番号９の配列を含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。結合メンバーは、配列番号９の配列から本質的になる単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であってよい。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号９の配列からなる。

【0017】

本明細書において提供される結合メンバーは、非常に安定性であり、すなわち、それらは、単量体のままであり、長期間、機能的に活性である。このことは、抗体フラグメントに特に当てはまり、本明細書に開示されるｓｃＦｖにより特に当てはまる。安定性パラメーターは、実行可能な薬剤を提供するための極めて重要な因子である。薬剤が安定であればあるほど、保管半減期の時間は長い。不安定の抗体は、ダイマー化またはオリゴマー化する傾向があり、さらに沈殿もして、それにより保管寿命が短くなり、最終的には、例えば免疫原性の増大のせいで、医薬用途により適切でなくなる。また、それぞれの結合メンバーは、高濃度で単量体のままであり、より少ない容量の投与の利点がある。

【0018】

特定の治療指標に関して、抗体フラグメントは、免疫グロブリン全長と比較した場合に利点を提供し、それは、より小さなそのサイズおよび免疫グロブリンの定常領域Ｆｃの欠如に起因し得る。例えば、ｓｃＦｖは、その小さなサイズに起因して、組織により効率的に浸透することが可能である。さらに、それは、ＦｃＲｎなどのＦｃ受容体に対する結合が可能でないので体循環中での保持の低減を示し、最終的に、より高い腎クリアランス率に導く。組織での後のさらなる分配、および、ｓｃＦｖのような小さな抗体フラグメントの体循環からの迅速な除去を有する良好な組織透過性のこれらの特徴は、慢性局所的／局部的ならびに急性全身性の疾患の両方に、特に有利である。しかしながら、この実用的な有用性は、ｓｃＦｖの低い安定性および低い生物学的効能により、これまでに厳しく制限されている。

【0019】

本明細書において提供される結合メンバーは、ヒトＴＮＦαに関して、非常に高い阻害能を発揮する。生物学的に非常に強力な結合メンバーは、例えば、患者に少量の薬剤を投与することを可能にし、それにより治療の全体的費用を下げるため、特に有用である。加えて、疾患の分子標的のより完全な中和が実行可能にされる。

【0020】

さらに、動物モデルならびにヒト治療における異なる新規の適用経路を、最も高い効能の結合メンバーを適用する場合に想定することができる。例えば、（皮膚などに）局所的に適用される薬剤については、角質層および／または他の生物学的構造のバリア機能のせいで送達有効性は制限され得るが、治療の有効性は、それ以外では制限される量の薬剤分子の、そのような生理学的バリアを通過する強い効能により取り戻される。

【0021】

しばしば、より強力な薬剤と同様の薬力学的効果を達成するために投与する必要のある、大量のより強力でない薬剤が、より高い静脈内または皮下適用量へ転換する。そのようなより高い適用量は、動物およびヒトでの治療的使用に関して、２つの理由により不利である：第１に、大量の薬剤で患者を治療することに非実際性、そして第２に、抗体分子のような生物製剤は、質量単位当たり高価である。

【0022】

治療に必要なより少ない量の薬剤は、より低い薬剤生産費用へ転換する。具体的には、例えば、細菌または酵母培養系の使用は、一般に、典型的に免疫グロブリン分子全長の生産に用いられる哺乳類の発現系と比較した場合、より低い費用をもたらすので、抗体フラグメントは、低い生産費用に適している。より少量の投与される薬剤と、より安価な製造プロセスとの組み合わせは、患者当たり、より費用効果的な医薬の可能性を切り開く。したがって、より多くの数の患者が、そのような薬剤からの恩恵を受け得る。

【0023】

第２の態様では、核酸分子が提供される。核酸分子は、第１の態様に係る結合メンバーをコードする。核酸分子は、一般に、第１の態様に係る結合メンバーをコードする配列を含む。一部の実施態様では、核酸分子は、第１の態様に係る結合メンバーをコードする配列から本質的になる。一部の実施態様では、核酸分子は、第１の態様に係る結合メンバーをコードする配列からなる。結合メンバーをコードする配列は、一部の実施態様では、プロモーターのような調節領域に作動可能に連結される。結合メンバーをコードする配列は、一部の実施態様では、発現カセット内に含まれる。一部の実施態様では、核酸分子は、単離された核酸分子である。一部の実施態様では、核酸分子は、ベクター内に含まれる。

【0024】

第３の態様では、ベクターが提供される。ベクターは、第１の態様に係る結合メンバーをコードする配列を含む。ベクターは、第２の態様に係る配列を含んでよい。

【0025】

第４の態様では、宿主細胞が提供される。宿主細胞は、第２の態様に係る核酸分子を含む。一部の実施態様では、宿主細胞は、第３の態様に係るベクターを含む。

【0026】

第５の態様では、組成物が提供される。それぞれの組成物は、第１の態様に係る結合メンバー、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター、または第４の態様に係る宿主細胞を含んでよい。そのような組成物は、適切な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む。そのような組成物は、化粧、製剤または（ｏｆ）診断用途のために処方され得る。

【0027】

第６の態様では、ＴＮＦαが介在する疾患を治療する方法が提供される。当該方法は、第１の態様に係る結合メンバーを、それを必要とする対象に投与するステップを含む。当該方法は、一般に、第５の態様に係る医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。典型的に、有効量の結合メンバーがある期間にわたって投与される。有効量の結合メンバーは、したがって、繰り返し対象に投与され得る。有効量の結合メンバーは、したがって、複数回の投与量で対象に投与され得る。複数回の投与量が投与される場合、用量は、治療全体を通じて一定であってよい。一部の実施態様では、用量は、治療の間、増加または減少のように変化してよい。一部の実施態様では、有効量の結合メンバーは、単回投与の形態で投与される。一部の実施態様では、有効量の結合メンバーは、１回のみ対象に投与される。

【0028】

一部の実施態様では、第６の態様に係る方法は、第１の態様に係る結合メンバーの投与を中断するステップを含む。そのような実施態様では、第６の態様に係る方法は、生物学的サンプルを、第１の態様に係る結合メンバーと接触させるステップを含んでよい。生物学的サンプルは、体液サンプルであってよい。また、生物学的サンプルは、バイオプシーサンプルであってもよい。生物学的サンプルを結合メンバーと接触させるステップは、ＴＮＦαへの結合メンバーの特異的な結合を許容する条件下で行なわれる。当該方法は、結合メンバーとＴＮＦαとの間の複合体が形成されたかどうかを検出するステップをさらに含んでよい。一部の実施態様では、当該方法は、結合メンバーとＴＮＦαとの間に形成される複合体の量を測定するステップを含んでよい。当該方法は、結合メンバーとＴＮＦαとの間に形成される複合体の量を定量するステップを含んでよい。

【0029】

一部の実施態様では、結合メンバーとＴＮＦαとの間に形成される複合体の量は、閾値と比較される。第６の態様に係る方法は、閾値より低い結合メンバーとＴＮＦαとの間の複合体の量が検出された場合に、結合メンバー、および医薬組成物の投与を、それぞれ中断するステップを含んでよい。一部の実施態様では、第６の態様に係る方法は、結合メンバーとＴＮＦαとの間に形成される複合体の量を監視するステップを含む。

【0030】

第６の態様に係る方法は、閾値以上である結合メンバーとＴＮＦαとの間の複合体の量が検出された場合に、結合メンバー、および医薬組成物の投与を、それぞれ中断するステップを含んでよい。

【0031】

本明細書に記載の結合メンバーは、例えば、薬物として用いることができる。それぞれの結合メンバーは、例えば、ＴＮＦαが介在する疾患の治療での使用のためのものであってよい。一部の実施態様では、本明細書に記載の結合メンバーは、診断において用いられる。本明細書に記載の結合メンバーは、化粧品において使用することもできる。一部の実施態様では、本明細書に記載の結合メンバーは、検出目的のために使用される。本明細書に記載の結合メンバーは、例えば、結合アッセイにおいて使用され得る。

【0032】

したがって、一部の実施態様では、結合メンバーは、医療用途である。言い換えれば、結合メンバーは、治療剤としての使用のためのものであってよい。この点について、薬物の製造における第１の態様に係る結合剤の使用も提供される。一部の実施態様では、使用は、ＴＮＦαが介在する疾患の治療のための薬物の製造における、第１の態様に係る結合剤の使用である。この点について、ＴＮＦαが介在する疾患の治療のための医薬組成物も提供される。また、ＴＮＦαが介在する疾患の治療のための薬剤も提供される。当該薬剤は、第１の態様に係る結合メンバーを含む。当該薬剤は、第１の態様に係る結合メンバーから本質的になってよい。

【0033】

さらに、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター、または第４の態様に係る宿主細胞は、薬物として用いられ得る。第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター、または第４の態様に係る宿主細胞は、一部の実施態様では、ＴＮＦαが介在する疾患の治療での使用のためのものであってよい。一部の実施態様では、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター、または第４の態様に係る宿主細胞は、診断において用いることができる。第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター、または第４の態様に係る宿主細胞は、化粧品において使用することもできる。一部の実施態様では、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター、または第４の態様に係る宿主細胞は、検出目的のために用いられる。それ故に、本明細書に開示される結合メンバー−または、それをコードする核酸分子、対応するベクターまたは宿主細胞−は、ＴＮＦαが介在する疾患の治療において有用な薬物の生産において使用され得る。

【0034】

第７の態様では、ＴＮＦαおよびＴＮＦ−Ｒ１および／またはＴＮＦ−Ｒ２の間の相互作用を阻害する方法が提供される。当該方法は、ＴＮＦαおよびＴＮＦ−Ｒ１および／またはＴＮＦ−Ｒ２を提供するステップを含む。当該方法は、ＴＮＦαを、第１の態様に係る結合メンバーと接触させるステップをさらに含む。

【0035】

第８の態様では、ＴＮＦα生物学的活性を阻害する方法が提供される。当該方法は、ＴＮＦαを提供するステップを含む。また、当該方法は、ＴＮＦαを、第１の態様に係る結合メンバーと接触させるステップも含む。

【0036】

第９の態様では、本明細書に開示される結合メンバーを生産する方法が提供される。当該方法は、第４の態様に係る宿主細胞を培養するステップを含む。当該方法は、したがって、結合メンバーを発現させるステップを含む。それにより、反応混合物が形成され得る。また、当該方法は、例えば、形成されたそれぞれの反応混合物から、結合メンバーを回収するステップも含む。一部の実施態様では、当該方法は、結合メンバーを精製するステップを含む。

【0037】

一部の実施態様では、第９に係る方法は、少なくとも１ステップの化学合成をさらに含んでよい。化学合成のステップは、例えば、結合メンバーを、それが得られた時点で修飾するステップであってよい。例示的な例は、グリコシル化またはペグ化のような翻訳後の修飾である。ペグ化は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数の分子の共有結合である。一部の実施態様では、化学合成のステップは、共有結合を介して脂質部分を導入する。一部の実施態様では、化学合成のステップは、共有結合を介して糖質部分を導入する。一部の実施態様では、化学合成のステップは、放射標識のような検出可能部分を導入する。また、検出可能な標識は、共有結合を介して導入されてもよい。

【0038】

第１０の態様では、本明細書に開示される結合メンバーを生産する方法が提供される。当該方法は、無細胞発現系を、核酸産物テンプレートと接触させるステップを含む。核酸産物テンプレートは、第１の態様に係る結合メンバーをコードする。一部の実施態様では、当該方法は、無細胞系を提供するステップを含む。また、当該方法は、核酸産物テンプレートを提供するステップも含んでよい。また、当該方法は、核酸産物テンプレートの転写および翻訳を生じさせるステップも含む。結果として、当該方法は、反応混合物を形成させるステップを含む。さらに、当該方法は、反応混合物から結合メンバーを回収するステップを含む。

【0039】

一部の実施態様では、第１０の態様に係る方法は、結合メンバーを濃縮するステップを含む。一部の実施態様では、第１０の態様に係る方法は、結合メンバーを精製するステップを含む。一部の実施態様では、第１０の態様に係る方法は、結合メンバーを単離するステップを含む。一部の実施態様では、当該方法は、少なくとも１つの化学合成のステップを含む。したがって、結合メンバーを生産するステップは、化学合成のステップを含んでよい。

【0040】

第１１の態様では、生物学的サンプル中のＴＮＦαの存在を検出する方法が提供される。当該方法は、インビボ方法またはインビトロ方法であってよい。当該方法は、生物学的サンプルを第１の態様に係る結合メンバーと接触させるステップを含む。一部の実施態様では、当該方法は、第１の態様に係る結合メンバーを提供するステップを含む。生物学的サンプルを第１の態様に係る結合メンバーと接触させるステップは、ＴＮＦαへの結合メンバーの特異的な結合を許容する条件下で行なわれる。当該方法は、結合メンバーとＴＮＦαとの間の複合体が形成されたかどうかを検出するステップをさらに含む。

【0041】

一部の実施態様では、第１１の態様に係る方法は、結合メンバーとＴＮＦαとの間に形成される複合体の量を評価するステップを含んでよい。当該方法は、結合メンバーとＴＮＦαとの間に形成される複合体の量を定量するステップを含んでよい。

【0042】

第１１の態様に係る方法では、生物学的サンプルは、一般に対象由来のサンプルである。一部の実施態様では、生物学的サンプルは、対象由来の体液サンプルである。一部の実施態様では、生物学的サンプルはバイオプシーサンプルである。体液サンプルは、一部の実施態様では、血液サンプルである。一部の実施態様では、体液サンプルは尿サンプルである。一部の実施態様では、体液サンプルは脳脊髄液サンプルである。一部の実施態様では、体液サンプルは滑液サンプルである。体液サンプルは、一部の実施態様では、リンパ液サンプルである。

【0043】

一部の実施態様では、第１１の態様に係る方法は、ＴＮＦαが介在する疾患の治療のために対象を階層化する方法である。当該方法は、対象が、本明細書に開示される結合メンバーを用いた、ＴＮＦαが介在する疾患の治療に反応するかどうかを判定する方法であると捉えることができる。当該方法は、結合メンバーとＴＮＦαとの間に形成される複合体の量を閾値と比較するステップを含んでよい。閾値以上である、結合メンバーとＴＮＦαとの間に形成される複合体の量は、対象が、結合メンバーを用いた、ＴＮＦαが介在する疾患の治療に反応することを示す。閾値未満の、結合メンバーとＴＮＦαとの間に形成される複合体の量は、対象が、結合メンバーを用いた、ＴＮＦαが介在する疾患の治療に反応しないことを示す。

【0044】

第１２の態様によれば、第１の態様に係る結合メンバーおよび既知濃度のＴＮＦα溶液の組み合わせが提供される。そのようなＴＮＦα溶液は、例えば較正目的のための参照溶液の取得において役割を果たし得る。結合メンバーおよびＴＮＦα溶液の組み合わせは、キットに含まれてよい。結合メンバーおよびＴＮＦα溶液の組み合わせは、キットを定義してよい。キットは、２つの容器を含んでよく、第一の容器は結合メンバーを含み、第二の容器はＴＮＦα溶液を含む。また、キットは、結合メンバーを含む第一の容器およびＴＮＦα溶液を含む第二の容器から本質的になってもよい。一実施態様では、キットは、第一の容器、第二の容器、および使用のための説明書からなる。

【0045】

第１３の態様によれば、第１の態様に係る結合メンバーおよび検出試薬の組み合わせが提供される。キットは、２つの容器を含んでよく、第一の容器は結合メンバーを含み、第二の容器は検出試薬を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、酵素のような検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、試薬の存在を必要としてよい。例示的な例として、酵素基質が必要とされてよく、その転換は酵素により触媒される。酵素基質は、例えば、検出可能な産物を産生してよい。酵素基質などのそれぞれの試薬は、第二の容器に含まれてよい。

【0046】

第１４の態様によれば、製品が提供され、それは例えば、キットであってよい。そのような製品は、説明書と試薬のパッケージ化された組み合わせと一緒に、第１の態様に係る結合メンバーを含んでよい。製品は、結合メンバーおよび説明書と試薬のパッケージ化された組み合わせから本質的になってよい。一実施態様では、製品は、結合メンバーおよび説明書と試薬のパッケージ化された組み合わせからなる。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1A】ＥＬＩＳＡにおける、組み換えヒト（ｒｈ）ＴＮＦαへのｓｃＦｖの特異的な結合の結果を示すグラフである。ｓｃＦｖ１（白抜きの丸○）、またはポジティブコントロールとしての役割を果たすｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５（白抜きの四角）を、様々な濃度で固定化ｒｈＴＮＦαに添加された。結合したｓｃＦｖを、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ−ＨＲＰを用いて検出した。異なる、したがって無関係である特異性のｓｃＦｖ（ＤＬＸ１０８４）を、ネガティブコントロールとして用いた（塗られた三角▲）。

【図1B】ＥＬＩＳＡプレートに固定化された全てのｓｃＦｖが正しくリフォールディングされ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ−ＨＲＰにより認識可能であったことを示す。

【図2】低いピコモル濃度でのｓｃＦｖにより、ｒｈＴＮＦα−が介在するＰＫ−１５細胞の細胞毒性の阻害を示すグラフである。ｓｃＦｖ１（白抜きの丸○）またはポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５（白抜きの四角□）の段階希釈を、可溶型ＴＮＦαとともに事前インキュベートして、その後に、ＰＫ−１５細胞とともにインキュベーションした。

【図3】ｓｃＦｖ１抗体フラグメントによる、可溶型ＴＮＦαが介在するＰＫ−１５細胞の細胞毒性の、他の市販されるＩｇＧ型のＴＮＦα拮抗薬と比較して優れた阻害を示すグラフである。ｓｃＦｖ１（白抜きの丸○）、ゴリムマブ（塗りつぶされた三角▲）、アダリムマブ（塗りつぶされた四角■）またはインフリキシマブ（塗りつぶされた丸●）の段階希釈を、可溶型ＴＮＦαとともに事前インキュベートし、その後に、ＰＫ−１５細胞とともにインキュベーションした。

【図4】ｓｃＦｖ１が、ＴＮＦαの膜貫通型（ｔｍ）の形態に結合して中和することを示すグラフである。図４Ａは、ｔｍＴＮＦα−発現ＣＨＯ細胞を用いた、ｓｃＦｖ１（プレーンの線）およびネガティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０８４（塗りつぶされたヒストグラム）の、フローサイトメトリー分析を示す。図４Ｂは、ｔｍＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞とともにインキュベートされ、その後にＨＥＫ−Ｄｕａｌ ＴＮＦα−感受性細胞を加えた、ｓｃＦｖ１（白抜きの三角）、ポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５（白抜きの四角）、およびネガティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０８４（塗りつぶされた三角）の段階希釈での細胞生存を示す。

【発明を実施するための形態】

【0048】

本明細書に開示される結合メンバー、核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、方法および使用についての説明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。

【0049】

定義
別段の定めがない限り、明細書、図面および特許請求の範囲において用いられる全ての他の科学的および技術的用語は、当業者の一人によって一般に理解されるそれらの通常の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本明細書に開示される結合メンバー、核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、方法および使用の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照は、それらの全体で参照により援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書を優先する。材料、方法、および実施例は、例示目的のみであり、限定されることを意図しない。

【0050】

本明細書において用いられる単語「約」は、当業者の一人により決定される、特定の値に関する許容可能な誤差範囲内の値を指し、その値がどのようにして測定または決定されたか、すなわち測定系の制限に一部依存する。例えば、「約」は、当該分野における実施あたり、１または１より多い標準偏差内を意味することができる。また、用語「約」は、問題になっている量または値が、指定された値またはおよそ同じである一部の他の値であり得ることを示すためにも用いられる。その語句は、同様の値が、本発明に係る同等の結果または効果を促進することを伝えることを意図する。この文脈において、「約」は、１０％までの上および／または下の範囲を指し得る。単語「約」は、一部の実施態様では、その値の上下５％まで、例えば２％まで、１％まで、または０．５％までである、特定の値の上下の範囲を指す。一実施態様では、「約」は、所定の値の上下０．１％までの範囲を指す。

【0051】

本明細書において用いられる用語「投与」は、化合物などの物、例えば医薬化合物、または抗原などの他の薬剤を、対象へ移行、送達、導入、または輸送する任意のモードを指す。投与モードは、経口投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、または皮下投与を含む（以下参照）。１つまたは複数の治療剤のようなさらなる物「と組み合わせた」投与は、同時（同時的）および任意の順序での連続的な投与を含む。

【0052】

本書類で用いられる単語「アッセイ」は、生物学的検体において生じる物の、触媒活性などの特性、存在、形状または量を分析するために、一般に当該分野で知られている方法を指す。そのような物は、生体内で生じ得て、または、数個の例を挙げれば、タンパク質、核酸、脂質、細胞、ウイルス、糖、多糖、ビタミンまたはイオンのような生体を表わす。単語「アッセイ」は、特定の手順または一連の手順が後に続き、それらはそれぞれのアッセイを表わすと捉えてよいことを強調する。アッセイは、生物学的物質の存在、不存在、量または活性を評価するための、定量化された試薬および確立されたプロトコルを含んでよい。

【0053】

用語「結合アッセイ」は、一般に、物の相互作用を判定する方法を指す。それ故に、結合アッセイの一部の実施態様を用いて、物質のような物が、他の物、例えばタンパク質、核酸または任意の他の物質に結合する能力を、定性的または定量的に判定することができる。結合アッセイの一部の実施態様を用いて、方法／アッセイにおいて用いられる結合パートナーなどの試薬に対する、物の結合に基づいて、物の存在および／または量を分析することができる。例示的な例として、ＴＮＦα結合アッセイは、ＴＮＦαに特異的に結合する、本明細書に開示される結合メンバーなどの結合パートナーの使用を含んでよい。結合アッセイが、結合パートナーとして免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子の使用に基づく場合、そのような方法／手順は、「免疫測定法」とも呼ばれ得る。この点について、免疫測定法から得られるシグナルは、１つまたは複数の免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子と、結合パートナー（単数または複数）が結合する必須エピトープ（単数または複数）を含む対応する分析物（ＴＮＦαなど）との間に形成される、複合体の直接的な結果であることが理解される。そのようなアッセイは分析物全長を検出し得て、アッセイ結果は目的のバイオマーカーの濃度として表され得るが、アッセイからのシグナルは、実際、サンプル中に存在する全てのそのような「免疫反応性」分子の結果である。分析物の量および／または存在は、ドットブロット、ウエスタンブロット、クロマトグラフィー法、質量分析などのタンパク質測定、およびｍＲＮＡ定量化などの核酸測定を含む、免疫測定法以外の方法によっても判定され得る。

【0054】

本明細書において用いられる用語「保存的改変」および「保存的置換」は、それぞれ、対応する参照に関する特性を、物理的、生物学的、化学的、または機能的に維持する改変および置換を指す。保存的置換を有する配列を含む分子は、例えば、共有結合または水素結合を形成する同等の能力および／または同等の極性を含む同様のサイズ、形状、電荷、化学的特性を有する。そのような保存的改変は、限定されないが、１つまたは複数の核酸塩基およびアミノ酸の置換、付加および欠失を含む。

【0055】

例えば、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、似た側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものを含む。例えば、抗原への結合に関して非必須であるアミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することができ、例えば、セリンはトレオニンに関して置換され得る。アミノ酸残基は、通常、共通の似た側鎖特性に基づいて、以下のようなファミリーに分類される：
１．非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）、
２．無電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、プロリン、システイン、トリプトファン）、
３．塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン）、
４．酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、
５．β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および
６．芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。

【0056】

この分類は、さらに分割することができる。さらなる方向付けとして、以下の８個の群は、それぞれ、互いに関する保存的置換を定義すると典型的に捉えることができるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）；
２）アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；
３）アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；
４）アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）；
５）イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；
６）フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）；
７）セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）；および
８）システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）。

【0057】

保存的置換は、上記の６グループの１つの中の最初のアミノ酸の、６グループの同一グループの中のさらなるアミノ酸による置換であると捉えることができる。

【0058】

保存的置換は一般に、突然変異されるアミノ酸に従ってリスト化された以下の置換であり、それぞれ、保存的であると捉えることのできる１つまたは複数の置換（単数または複数）が後に続く：Ａｌａ→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ；Ａｒｇ→Ｌｙｓ；Ａｓｎ→Ｇｌｎ、Ｈｉｓ；Ａｓｐ→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ→Ｓｅｒ；Ｇｌｎ→Ａｓｎ；Ｇｌｕ→Ａｓｐ；Ｇｌｙ→Ａｌａ；Ｈｉｓ→Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｉｌｅ→Ｌｅｕ、Ｖａｌ；Ｌｅｕ→Ｉｌｅ、Ｖａｌ；Ｌｙｓ→Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ；Ｍｅｔ→Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ；Ｐｈｅ→Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ；Ｓｅｒ→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ→Ｔｒｐ、Ｐｈｅ；Ｖａｌ→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ。他の置換もまた許容され、経験的に、または、他の公知の保存的または非保存的置換により、決定することができる。また、保存的置換は、非天然アミノ酸の使用を伴ってもよい。

【0059】

非保存的置換、すなわち、あるファミリーのメンバーを、別のファミリーのメンバーに対して交換することは、例えば、結合メンバーの電荷、双極子モーメント、サイズ、親水性、疎水性または構造に関して実質的な変化をもたらし得て、それは、特に、標的分子への結合に必須のアミノ酸が影響を受けた場合に、結合活性の有意な下降をもたらし得る。また、非保存的置換は、非天然アミノ酸の使用を伴ってもよい。

【0060】

保存的および非保存的改変は、当該分野で知られている様々な標準的技術、例えば、コンビナトリアルケミストリー、部位特異的ＤＮＡ突然変異誘発、ＰＣＲ−仲介および／またはカセット突然変異誘発、ペプチド／タンパク質化学合成、親の結合メンバー内の反応基を特異的に改変する化学反応により、親の結合メンバーへ導入することができる。変異は、それらの化学的、生物学的、生物物理学的および／または生化学的特性に関して、常法により試験することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、親配列の機能的および一般に構造的な特徴も実質的に変更しない。したがって、保存的置換を含む結合メンバーの結合特性は、少なくとも本質的に変更されない。さらに、保存的アミノ酸置換は、一般に、親配列の二次構造を実質的に改変または破壊しない。

【0061】

用語「検出可能な標識」は、本明細書において、直接的または間接的のいずれかの、物理的または化学的手段によるその検出または測定が、サンプルにおける選択された標的の生物学的物質の存在を示す、任意の物質を指すために用いられる。有用な検出可能な標識の代表的な例は、限定されないが、吸光、蛍光、反射、光散乱、リン光、または発光特性に基づいて直接的または間接的に検出可能な分子またはイオン、それらの放射能特性により検出可能な分子またはイオン、または、それらの核磁気共鳴または常磁性特性により検出可能な分子またはイオンを含む。検出可能な標識は、一部の実施態様では、吸光または蛍光に基づいて間接的に検出することのできる分子、例えば、適切な基質を、例えば、非吸光分子から吸光分子に、または非蛍光分子から蛍光分子に変換させる様々な酵素であってよい。

【0062】

本明細書に開示される結合メンバーを含む、化合物のようなものの「有効量」または「治療的有効量」は、−単回投与として、または一連の投与量の一部としてのいずれか−の量であり、用いられた投与計画で、所望の治療的効果を生じ、すなわち、特定の治療ゴールに到達する。治療的有効量は、一般に、関連のある病状の治療または管理において治療的利益を提供するために、または、症状の存在と関連する１つまたは複数の症状を遅延または最小化するために、十分な量である。用量は、患者および臨床因子（例えば、患者の年令、体重、性別、病歴、疾患の重症度および／または治療に対する応答）、治療される疾患の性質、投与される特定の組成物、投与経路、および他の因子を含む、様々な因子に依存する。

【0063】

「エピトープ」は抗原性であり、したがって、エピトープは、「抗原性構造」または「抗原性決定因子」を定義するとも捉えられ得る。したがって、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子の結合ドメインは、「抗原−相互作用−部位」である。用語「抗原−相互作用−部位」は、本明細書によれば、特異的な抗原または特異的な抗原群、例えば、異なる種のＴＮＦαと、特異的に相互作用することが可能な、ポリペプチドのモチーフを定義する。この結合／相互作用は、「特異的認識」を定義するとも理解される。エピトープは、通常、ポリペプチド鎖または単−または多糖類などの１つまたは複数の化学物質の部分の空間的に接近可能な表面分類からなる。エピトープを定義する表面分類は、例えば、アミノ酸または糖側鎖の分類であってよい。エピトープは、通常、特異的な三次元構造特性、ならびに、特異的な荷電特性を有する。立体構造的および非立体構造的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが後者は失われないという点で区別される。

【0064】

また、用語「エピトープ」は、ＴＮＦαなどの抗原上の部位を指し、それと、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、または免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子が複合体を形成する。一部の実施態様では、エピトープは、分子上の部位であり、それに対して、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子が産生され、および／または、抗体が結合する。例えば、エピトープは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子によって認識され得る。エピトープは、「線状エピトープ」であってよく、それは、アミノ酸一次配列が、認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、典型的に、唯一の配列内に少なくとも３個、通常はそれより多く、少なくとも５個のアミノ酸を含む。線状エピトープは、例えば、唯一の配列内に約８〜約１０個のアミノ酸を含み得る。また、エピトープは、「立体構造的エピトープ」であってもよく、それは、線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを定義する唯一の構成要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が、エピトープを定義する抗体により必ずしも認識されないエピトープ）である。典型的に、立体構造的エピトープは、線状エピトープよりも多くの数のアミノ酸を含む。立体構造的エピトープの認識に関して、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子は、ペプチドまたはタンパク質、または、ペプチドまたはタンパク質のフラグメントなどの抗原の三次元構造を認識する。例示的な例として、タンパク質分子を折り畳んで三次元構造を形成する場合、特定のアミノ酸、および／または、立体構造的エピトープを形成するポリペプチド主鎖の全部または一部は並置され、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの構造を決定する方法は、限定されないが、Ｘ線結晶解析、二次元核磁気共鳴分光法、部位特異的スピン標識、および電子常磁体共鳴分光分析を含む。

【0065】

ポリペプチド、核酸または細胞に対する言及における用語「濃縮」の使用により、細胞集団を含む特定のアミノ酸／ヌクレオチド配列または細胞が、サンプルが得られた天然源よりも有意に高い画分（２〜５倍）の、目的サンプル中に存在する全アミノ酸配列または核酸配列を構成することを意味する。ポリペプチド、核酸または細胞は、正常または病気の生物よりも、または、正常または病気の細胞、または配列が取得された細胞よりも、有意に高い画分を構成してもよい。このことは、存在する他のアミノ酸／ヌクレオチド配列または細胞の量の選択的低減により、または、特定のアミノ酸／ヌクレオチド配列または目的細胞の量の選択的増大により、または、その２つの組み合わせにより、引き起こされ得る。しかしながら、濃縮は、他のアミノ酸配列、ヌクレオチド配列または細胞が存在しないことを暗示しないことに注意すべきである。その用語は、目的配列の相対量が有意に増大されたことを定義するだけである。ここでの用語「有意」は、増大レベルが、そのような増大を達成する者にとって有用であることを示すために用いられ、一般に、他のアミノ酸または核酸配列と比較して、少なくとも約２倍、例えば少なくとも約５〜１０倍、またはそれよりもさらに多い増大を意味する。その用語は、所望のアミノ酸配列、ヌクレオチド配列または細胞の割合を増大するために人が介在した状況のみをカバーすることを意味する。

【0066】

用語「から本質的になる」は、サンプルまたは組成物の特性に影響を及ぼさないサンプルまたは組成物中のさらなる構成要素の存在を許すと理解される。例示的な例として、医薬組成物は、活性成分から本質的になる場合、賦形剤を含んでよい。

【0067】

バイオマーカーに関する用語「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）」および「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、当該分野において使用される通常の意味において理解されることが意図される。ペプチド／タンパク質は、ｍＲＮＡへの核酸の転写を介して細胞により発現され、ポリペプチドへの翻訳が続き、それは折り畳まれ、場合によりさらにプロセッシングされる。それ故に、細胞がペプチド／タンパク質を発現しているという記述は、ペプチド／タンパク質が、それぞれの細胞の発現機構によって合成されていることを暗示する。

【0068】

用語「発現カセット」は、場合により１つまたは複数の制御配列と組み合わせた、コード配列およびプロモーターを指す。酵素に関する発現カセットは、例えば、制限されずに、翻訳開始制御配列を含む。

【0069】

用語「制御配列」は、コード配列の転写を調節する遺伝子または発現カセット内の核酸配列を指し、したがって、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、および翻訳開始配列を含む。

【0070】

それぞれの生物学的プロセス自体に関して、用語「発現」、「遺伝子発現」または「発現する」は、遺伝子の核酸配列にコードされる情報をまずメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に変換し、それからタンパク質へ変換する、調節経路全体を指す。したがって、遺伝子の発現は、一次ｈｎＲＮＡへのその転写、成熟ＲＮＡへのこのｈｎＲＮＡのプロセッシング、および、タンパク質の対応するアミノ酸配列へのｍＲＮＡ配列の翻訳を含む。また、この文脈において、用語「遺伝子産物」は、例えば、その遺伝子によりコードされる最終タンパク質（そのスプライス変異を含む）および、適切な場合はそれぞれの前駆体タンパク質を含むタンパク質だけでなく、遺伝子発現の過程中の「最初の遺伝子産物」と見なされ得るそれぞれのｍＲＮＡも指すことにも注意すべきである。

【0071】

本開示の範囲内で、用語「抗体」は、免疫グロブリン全長ならびにそのフラグメントを指す。そのような免疫グロブリン全長は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、ベニア化またはヒト抗体であってよい。本明細書に開示される抗体は、一部の実施態様では、グリコシル化であってよい。一部の実施態様では、本明細書に開示される抗体は、グリコシル化ではないものであってよい。

【0072】

免疫グロブリンまたはタンパク性結合分子などのポリペプチドに対する言及における「フラグメント」は、−所望の標的、例えば抗原（ＴＮＦαなど）に特異的に結合する免疫グロブリンの場合、全長配列よりも短い限り、および、タンパク質の目的の機能を行なうことが可能である限り、対応するポリペプチドに存在する任意のアミノ酸配列を意味する。用語「抗体フラグメント」は、特定の標的、典型的には分子に関して特異的な結合親和性を示す、免疫グロブリンの部分、たいていは超可変領域および周りの重鎖および軽鎖の部分を指す。超可変領域は、ポリペプチド標的に物理的に結合する免疫グロブリンの部分である。したがって、抗体フラグメントは、免疫グロブリンの標的特異性を保持する免疫グロブリン全長の１つまたは複数の部分を含む、またはからなる。そのような抗体フラグメントは、例えば、免疫グロブリン全長の定常領域（Ｆｃ領域）を少なくとも部分的に欠失してよい。一部の実施態様では、抗体フラグメントは、免疫グロブリン全長の消化により生産される。また、抗体フラグメントは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖の１つまたは複数の部分を含む合成または組み換え構築物であってもよい（例えばＨＯＬＬＩＧＥＲ，Ｐ．ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，ｖｏｌ．２３，ｎｏ．９，ｐ．１１２６−１１３６を参照）。抗体フラグメントの例は、限定されないが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ナノボディ、Ｖ（ＮＡＲ）またはいわゆる最小認識単位を含む。

【0073】

「単鎖可変フラグメント」または「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、抗体フラグメントのタイプの例である。ｓｃＦｖは、リンカーにより連結された免疫グロブリンのＶＨおよびＶＬドメインを含む融合タンパク質である。したがって、それは、免疫グロブリン全長に存在する定常Ｆｃ領域を欠く。

【0074】

本明細書において用いられる「結合メンバー」は、免疫グロブリン全長、抗体フラグメント、タンパク性の非−免疫グロブリン足場、および／または、免疫グロブリン様の機能を有する他の結合化合物を指す。典型的に、結合メンバーは、タンパク性の結合分子である。そのような結合メンバーは、一価または多価であってよく、すなわち、１つまたは複数の抗原結合部位を有する。一価結合メンバーの非限定の例は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ＤＡＲＰｉｎ、アフィリンおよびナノボディを含む。多価結合メンバーは、２、３、４またはそれより多くの抗原結合部位を有することができ、それにより、１つまたは複数の異なる抗原を認識することができる。免疫グロブリン全長、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ビス−ｓｃＦｖ（またはタンデムｓｃＦｖ）およびダイアボディは、多価結合メンバーの非限定の例であり；例示的な多価結合メンバーでは、２つの結合部位が存在し、すなわち、結合メンバーは二価である。

【0075】

一部の実施態様では、多価結合メンバーは二重特異性であり、すなわち、結合メンバーは、２つの異なる標的または１つの標的分子上の２つの異なる標的部位に対して向けられる。二重特異性抗体は、例えば、ＭＵＬＬＥＲ，Ｄ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＤＵＢＥＬ，Ｓ．Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００７．ＩＳＢＮ ３５２７３１４５３９．ｐ．３４５−３７８にレビューされている。一部の実施態様では、多価結合メンバーは、２個よりも多い、例えば、３または４個の異なる抗原に関するそれぞれ３または４個の異なる結合部位を含む。そのような結合メンバーは、多価および多重特異性であり、具体的にはそれぞれ、トリ−またはテトラ−特異性である。

【0076】

「非−抗体足場」は、例えば、ＦＩＥＬＤＥＲ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＤＵＢＥＬ，Ｓ．Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００７．ＩＳＢＮ ３５２７３１４５３９．ｐ．４６７−５００；または、ＧＩＬＢＲＥＴＨ，Ｒ．Ｎ．ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ２０１２，ｖｏｌ．２２，ｐ．４１３−４２０に記載される抗原−結合ポリペプチドである。非限定の例は、アフィボディ、アフィリン分子、ＡｄＮｅｃｔｉｎ、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標））、ＤＡＲＰｉｎ、ノッチン、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、アビマー、テトラネクチンおよびトランス−ボディを含む。アビマーは、いくつかの細胞表面受容体において一連の多数のドメインとして生じるいわゆるＡ−ドメインを含む（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，１５５６−１５６１）。テトラネクチンは、それぞれのヒトのホモ三量体タンパク質から得られ、同様に、所望の結合のために改変することのできるＣ型レクチンドメイン内のループ領域を含む（同文献）。

【0077】

「結合化合物」は、標的に結合する、および、上記で定義した免疫グロブリン全長、抗体フラグメントおよび非−抗体足場のクラスに属さない、化学的または生物学的分子である。結合化合物の例は、制限されずに、マクロライド（ＧＵＮＤＬＵＲＵ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ ａｎａｌｏｇ ｓｃａｆｆｏｌｄ．Ｍｅｄｃｈｅｍｃｏｍｍ．２０１１，ｖｏｌ．２，ｐ．９０４−９０８；Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ ｈｙｂｒｉｄｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｉｃｔｙｏｓｔａｔｉｎ，ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ ａｎｄ ｔａｘｏｌ．Ｃｈｅｍ Ａｓｉａｎ Ｊ．２０１１，ｖｏｌ．６，ｐ．４５９−４７３；Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｌｋａｌｏｉｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｂｙ ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．ＰＮＡＳ ２０１１，ｖｏｌ．１０８，ｐ．１３５０４−１３５０９）、分子インプリントポリマー（ＨＯＳＨＩＮＯ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｍｉｃｅ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ａ ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２０１０，ｖｏｌ．１９，ｐ．６６４−６６４５）、アプタマー（ＳＴＲＥＨＬＩＴＺ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ａｐｔａｍｅｒｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｔｉｃｓ．Ｂｉｏａｎａｌ Ｒｅｖ ２０１２，ｖｏｌ．４，ｐ．１−３０；ＹＥ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｂｙ Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０１２，ｖｏｌ．１３，ｐ．３３４１−３３５３）、シュピーゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）（例えば、ＭＡＡＳＣＨ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−Ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ ｏｆ Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ ＮＯＸ−Ａ５０ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１（ＨＭＧＡ１）ｒｅｄｕｃｅ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ．ＪＢＣ ２０１０，ｖｏｌ．２８５，ｐ．４００１２−４００１８を参照）、またはペプチド（ｃｙｃｌｉｃ ｏｒ ｌｉｎｅａｒ；ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，ＧＯＵＬＤ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｙｃｌｏｔｉｄｅｓ，ａ ｎｏｖｅｌ ｕｌｔｒａｓｔａｂｌｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２０１１，ｖｏｌ．１７，ｐ．４２９４−４３０７）を含む。タンパク質リガンドとして作用することができるペプトイドは、側鎖がα炭素原子ではなくアミド窒素に連結している点でペプチドとは異なる、オリゴ（Ｎ−アルキル）グリシンである。ペプトイドは典型的に、プロテアーゼおよび他の修飾酵素に抵抗性であり、ペプチドよりもさらに高い細胞透過性を有し得る（例えば、Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ．，ａｎｄ Ｋｏｄａｄｅｋ，Ｔ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９，１５０８−１５０９を参照）。

【0078】

本明細書に開示される結合メンバーは、必要に応じて、ペグ化または超グリコシル化され得る（以下も参照）。一部の実施態様では、結合メンバーは、上記の例示的なタンパク性結合分子のうちの１つ、および、アルブミン−結合ドメイン、例えば、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン−結合ドメインの、融合タンパク質である。一部の実施態様では、結合メンバーは、免疫グロブリンフラグメント、例えば、単鎖ダイアボディ、および、免疫グロブリン結合ドメイン、例えば、細菌性免疫グロブリン結合ドメインの、融合タンパク質である。例示的な例として、単鎖ダイアボディは、Ｕｎｖｅｒｄｏｒｂｅｎら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ［２０１２］２５，８１−８８）により記載されるように、ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢに融合され得る。

【0079】

「ＩＣ_５０」または「半数−最大阻害濃度」は、拮抗薬の効能の測定であり、化合物が生物学的または生化学的機能を阻害する有効性を定量的に説明する。したがって、この値は、どれくらいの結合メンバーなどの特定のものが、特定の生物学的または生化学的プロセスまたは機能を５０％阻害するために必要なのかを示す。結合力の直接的な指標ではないが、ＩＣ_５０およびＫ_ｉの値は相関し、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式により決定することができる（ＣＨＥＮＧ Ｙ．ａｎｄ Ｐｒｕｓｏｆｆ Ｗ．Ｈ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ（Ｋｉ）ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｈｉｃｈ ｃａｕｓｅｓ ５０ ｐｅｒ ｃｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（ＩＣ５０）ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９７３，ｖｏｌ．２２，ｐ．３０９９−３１０８；ＲＡＭＭＥＳ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｏｍａｉｎ ｗｈｉｃｈ ａｆｆｅｃｔｓ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｃｌｏｚａｐｉｎｅ ａｔ ５−ＨＴ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＰＬＯＳ ｏｎｅ ２００９，ｖｏｌ．４，ｐ．１−１４；ＺＨＥＮ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ ｉｎ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄｓ：［^３Ｈ］ｓｐｉｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｄ_２ ａｎｄ Ｄ_３ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１０，ｖｏｌ．１８８，ｐ．３２−３８）。

【0080】

用語「フレームワーク」（ＦＲ）は、可変軽鎖（ＶＬ）または可変重鎖（ＶＨ）のいずれかの、それぞれのＣＤＲを埋め込んだ可変免疫グロブリンドメインの足場を指す。ＶＬおよび／またはＶＨフレームワークは、典型的に、ＣＤＲ領域の横の、４つのフレームワーク部分、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む。したがって、当該分野で知られているように、ＶＬは、一般構造：（ＦＲ−Ｌ１）−（ＣＤＲ−Ｌ１）−（ＦＲ−Ｌ２）−（ＣＤＲ−Ｌ２）−（ＦＲ−Ｌ３）−（ＣＤＲ−Ｌ３）−（ＦＲ−Ｌ４）を有し、一方で、ＶＨは、一般構造：（ＦＲ−Ｈ１）−（ＣＤＲ−Ｈ１）−（ＦＲ−Ｈ２）−（ＣＤＲ−Ｈ２）−（ＦＲ−Ｈ３）−（ＣＤＲ−Ｈ３）−（ＦＲ−Ｈ４）を有する。

【0081】

用語「ＣＤＲ」は、抗体の超可変領域を指し、それは主に抗原結合に寄与する。典型的に、抗原結合部位は、フレームワーク足場に埋め込まれた６個のＣＤＲを含む。ここで、ＶＬのＣＤＲは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と呼ばれ、一方で、ＶＨのＣＤＲは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と呼ばれる。これらは、ＫＡＢＡＴ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｕ．Ｓ．ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ ＡＮＤ ＨＵＭＡＮ ＳＥＲＶＩＣＥＳ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９１．ｐ．９１−３２４２に説明されるように同定することができる。しかしながら、本明細書において用いられるＣＤＲ−Ｈ１は、２７位で始まって３６位より前で終わるという点で、Ｋａｂａｔ定義とは異なる。（説明に関して図５を参照）。

【0082】

本明細書において用いられるように、抗体のＶＨおよびＶＬにおけるアミノ酸残基の位置を特定するためのナンバリングシステムは、ＨＯＮＥＧＧＥＲ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：Ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ．ＪＭＢ ２００１，ｖｏｌ．３０９，ｐ．６５７−６７０により説明される「ＡＨｏ」−システムに相当する。その刊行物は、ＡＨｏおよびＫａｂａｔシステムの間の変換表をさらに提供する（ＫＡＢＡＴ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ５^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｕ．Ｓ．ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ ＡＮＤ ＨＵＭＡＮ ＳＥＲＶＩＣＥＳ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９１．ｐ．９１−３２４２）。

【0083】

「ヒト化」抗体は、非−ヒト親抗体の６個のＣＤＲ領域またはそれらの変異、または合成ＣＤＲの１つまたは複数、典型的には全てを含む抗体を指し、そのフレームワークは、例えば、（ｉ）非−ヒト親抗体の１つまたは複数のフレームワーク残基を潜在的に含む、ヒトフレームワーク、または、（ｉｉ）天然に生産されるヒトフレームワークに対する類似性が増大するように改変された非−ヒト抗体由来のフレームワークである。抗体をヒト化する方法は当該分野で知られていて、例えばＬＥＧＥＲ，Ｏ．ａｎｄ Ｓａｌｄａｎｈａ，Ｊ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＷＯＯＤ，Ｃ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ，２０１１．ＩＳＢＮ １８４８１６６２８１．ｐ．１−２３を参照。

【0084】

用語「免疫化する（ｉｍｍｕｎｉｚｅ）」、「免疫化」、または「免疫化する（ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）」は、以下により詳細に説明するように、動物の免疫系を、抗原またはそのエピトープに曝露することを指す。抗原は、所望の投与経路、例えば、注射、吸入または摂取を用いて、動物へ導入され得る。同一抗原への２回目の曝露の際に、適応性の免疫応答、具体的にはＴ細胞およびＢ細胞応答が高められる。

【0085】

用語「単離される」は、ペプチドまたは核酸分子のような物が、その正常の生理学的環境、例えば天然源から取り除かれていること、または、ペプチドまたは核酸が合成されることを示す。用語「単離される」の使用は、天然起源の配列が、その正常の細胞（すなわち染色体）環境から取り除かれていることを示す。したがって、その配列は、無細胞溶液中にあり得て、または異なる細胞環境中に置かれ得る。ポリペプチドまたは核酸分子に対する言及での「単離される」は、互いに連結されたアミノ酸（２個以上のアミノ酸）またはヌクレオチドのポリマーを意味し、天然源から単離される、または合成される、ポリペプチドまたは核酸分子を含む。用語「単離される」は、その配列が、存在する唯一のアミノ酸鎖またはヌクレオチド鎖であることを暗示しないが、例えば、天然にそれと関連する非−アミノ酸材料および／または非−核酸材料がそれぞれ本質的にフリーで、例えば約９０〜９５％の純度またはそれよりも高いことを暗示する。

【0086】

本明細書において用いられる用語「同一性」は、２つのタンパク質または核酸間の配列マッチを指す。比較されるタンパク質または核酸配列は、例えばＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（対でのアライメント；ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋで利用可能）などの生物情報学ツールを用いて、最大の同一性を与えるように並べられる。比較される配列内の同一の位置が、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基により占められる場合は、それぞれの分子は、まさにその位置で同一である。したがって、「同一性の割合」は、マッチする位置の数を、比較される位置の数で割って１００％をかけた関数である。例えば、１０個の配列位置のうちの６個が同一であるならば、同一性は６０％である。２つのタンパク質配列間の同一性の割合は、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＮＥＥＤＬＥＭＡＮ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＪＭＢ １９７０，ｖｏｌ．４８，ｐ．４４３−４５３）を用いて、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、「ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）」１０、「ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ）」０．５、偽性「終了ギャップペナルティ（ｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）」、「終了ギャップ開始ペナルティ（ｅｎｄ ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）」１０、および、「終了ギャップ伸長ペナルティ（ｅｎｄ ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ）」０．５を用いて決定することができる。同一の一次アミノ酸または核酸配列を有する２つの分子は、いかなる化学的および／または生物学的修飾にも関係なく、同一である。例えば、同一の一次アミノ酸配列であるが異なるグリコシル化パターンを有する２つの抗体は、この定義によれば同一である。核酸の場合は、例えば、同一の配列だがリン酸の代わりにチオリン酸のような異なる結合成分を有する２つの分子は、この定義によれば同一である。

【0087】

本明細書において用いられる用語「核酸分子」は、任意のあり得る立体配置、例えば一本鎖、二本鎖またはそれらの組み合わせでの、任意の核酸を指す。核酸の例は、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ヌクレオチド類似体または核酸化学を用いて生産されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、ロックド核酸分子（ＬＮＡ）、タンパク質核酸分子（ＰＮＡ）、アルキルホスホネートおよびアルキルホスホトリエステル核酸分子およびｔｅｃｔｏ−ＲＮＡ分子を含む（例えば、Ｌｉｕ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００４）１２６，４０７６−４０７７）。ＬＮＡは、Ｃ４’およびＯ２’の間にメチレン橋を有する修飾ＲＮＡ主鎖を有し、それぞれの分子に、より高い二重鎖安定性およびヌクレアーゼ抵抗性を与える。アルキルホスホネートおよびアルキルホスホトリエステル核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子として見ることができ、核酸主鎖内のリン酸基のＰ−ＯＨ基を、アルキル基およびアルコキシ基にそれぞれ交換することにより、核酸主鎖のリン酸基が中和されている。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノム起源または合成起源であってよく、一本鎖または二本鎖であってよい。そのような核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ合成ＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの共重合体、オリゴヌクレオチドなどであってよい。それぞれの核酸は、非−天然ヌクレオチド類似体をさらに含んでよく、および／または、親和性タグまたは標識に連結されてよい。

【0088】

多くのヌクレオチド類似体が公知であり、本明細書に開示される方法において用いられる核酸において用いることができる。ヌクレオチド類似体は、例えば、塩基、糖、またはリン酸部分に修飾を含むヌクレオチドである。例示的な例として、ｓｉＲＮＡの２’−ＯＨ残基を、２’Ｆ、２’Ｏ−Ｍｅまたは２’Ｈ残基で置換することは、それぞれのＲＮＡのインビボ安定性を改善することが知られている。塩基部分での修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、異なるプリンまたはピリミジン塩基の天然または合成の修飾、例えば、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル、および２−アミノアデニン−９−イル、ならびに、非−プリンまたは非−ピリミジンヌクレオチド塩基であってよい。他のヌクレオチド類似体は、ユニバーサル塩基としての役割を果たす。ユニバーサル塩基の例は、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールを含む。ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と塩基対を形成することが可能である。塩基修飾は、しばしば、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルのような糖修飾などと組み合わせて、増大した二重鎖安定性などの独特の特性を獲得することができる。

【0089】

本書類で用いられる表現「薬学的に許容できる」は、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わずに、人間および動物の組織と接触させた使用に適切であり、合理的な利益／リスク比に見合う、健全な医学的判断の範囲内である活性の化合物、材料、組成物、担体、および／または剤形を指す。

【0090】

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、特定の最低限の長さの産物に限定されない。両方の用語が同時に使用される場合、この二重の命名は、当該分野において、協調して両方の用語の使用を構成する。

【0091】

医学的／生理学的な文脈における、すなわち生理学的状態の文脈における、用語「予防」は、生物が異常な症状に罹る、または発症する、可能性を低減することを指す。

【0092】

用語「精製される」は、結合メンバーの元の環境と比較した相対的な指標であると理解され、それにより、結合メンバーが、天然の環境内よりも相対的に純粋であることの指標を表わす。したがって、それは、他の、免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子、免疫グロブリンまたは抗体フラグメントからの絶対的な純度の意味での絶対的な値のみを指すものではないが含む。元のレベルと比較して、結合メンバーを精製した後のレベルは、一般に、少なくとも２〜５倍さらに高い（例えば、ｍｇ／ｍｌの観点から）。少なくとも１オーダーのマグニチュード、例えば約２または３オーダーの精製（例えば約４または５オーダーのマグニチュードを含む）は、明示的に考慮される。少なくとも本質的に汚染のない、具体的には他のタンパク性の物がない、結合メンバーを、機能的に有意なレベル、例えば約９０％、約９５％、または９９％の純度で得ることが望ましくあり得る。他の物、例えば、核酸分子、ペプチドまたはタンパク質、または細胞に関して上記は準用される。

【0093】

「類似」のタンパク質配列は、並べた場合に、類似のアミノ酸残基を、強制的ではないがほとんどの場合は同一のアミノ酸残基を、比較される配列の同一の位置に共有するものである。類似のアミノ酸残基は、側鎖の化学的特徴により、ファミリーにグループ化される。これらのファミリーは、「保存的アミノ酸置換」に関して以下に説明される。配列間の「類似性の割合」は、比較される配列の同一の配列位置に同一または類似の残基を含む位置の数を、比較される位置の総数で割って１００％をかけたものである。例えば、１０個の配列位置のうち６個が同一のアミノ酸残基を有し、１０個の位置のうち２個が類似の残基を含むならば、その配列は、８０％の類似性を有する。２つの配列間の類似性は、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いて決定することができる。

【0094】

本書類で用いられる用語「特異的」は、結合メンバーが、ＴＮＦαなどの所定の標的に対して向けられる、結合する、または反応することを示すと理解される。したがって、向けられる、結合する、または反応することは、結合メンバーが、ＴＮＦαと特異的に結合することを含む。この文脈での用語「特異的」は、結合メンバーが、ＴＮＦα、または／およびその部分と反応するが、別のタンパク質とは少なくとも本質的に反応しないことを意味する。用語「別のタンパク質」は、例えば、結合メンバーが向けられるＴＮＦαと近縁または相同のタンパク質を含む、任意のタンパク質を含む。用語「本質的に結合しない」は、結合メンバーが、別のタンパク質に対して特定の親和性を有さないこと、すなわち、ＴＮＦαに対する親和性と比較した場合に、約３０％未満の交差反応性を示すことを意味する。一部の実施態様では、結合メンバーは、約２０％未満、例えば、約１０％未満の交差反応性を示す。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに対する親和性と比較した場合に、約９、８、または７％未満の交差反応性を示す。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに対する親和性と比較した場合に、約６％未満、例えば、約５％未満の交差反応性を示す。結合メンバーが本明細書において上記に定義したように特異的に反応するかどうかは、とりわけ、ＴＮＦαとのそれぞれの結合メンバーの反応と、他のタンパク質（単数または複数）との結合メンバーの反応とを比較することにより、容易に試験することができる。用語「特異的に認識する」は、用語「向けられる」または「反応する」と相互交換可能に用いることができ、本開示の文脈において、特定の分子、一般には免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、または免疫グロブリン様の機能を有するタンパク性結合分子が、本明細書において定義されるエピトープの少なくとも２個のアミノ酸（少なくとも３個、例えば少なくとも４個またはさらにより多くを含む）と、特異的に相互作用および／または結合することが可能であることを意味する。したがって、一般に、免疫グロブリンまたはタンパク性結合分子は、ＴＮＦαなどのそれぞれのエピトープと複合体を形成することができる。そのような結合は、「鍵と鍵穴の原理」の特異性により例示され得る。また、「特異的な結合」は、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ−テスト、ＦＡＣＳ、ＩＨＣおよびペプチドスキャンによって判定することもできる。

【0095】

本明細書において用いられる用語「階層化する（ｓｔｒａｔｉｆｙｉｎｇ）」および「階層化」は、本明細書に開示される結合メンバーに対する反応の対応する可能性のような、それぞれのグループにマッチする特徴に従って、特定のグループに個々が割り当てられることを示す。グループは、例えば、結合メンバーを、試験する、処方する、一時中断する、中止するためであり得る。したがって、本発明に係る方法または使用の一部の実施態様では、対象は、治療の臨床試験のサブグループに階層化され得る。

【0096】

また、本明細書において用いられる用語「対象」は、個体としても扱われ、ヒトまたは非−ヒト動物、一般に哺乳類を指す。対象は、哺乳類の種、例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、類人猿またはヒトであってよい。したがって、本書類に記載の方法、使用および組成物は、ヒトおよび獣医学の疾患の両方に適用可能である。以下により詳細に説明されるように、サンプルは、対象から得られている。したがって、サンプルでの発現レベルから引き出される結論およびそれに基づく決定は、サンプルを取得した対象（誰／何）に関係することが理解される。さらに、対象は典型的に生体である一方で、本書類に記載の方法または使用は、死後分析で用いてもよい。対象が、疾患または症状のための医療ケアを受けている、生きているヒトである場合は、「患者」としても扱われる。

【0097】

本明細書において用いられる用語「治療」および「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療的効果を有する予防的または防止的手段を指し、対象生物における異常な（病理学的を含む）状態を、防止する、減速する（減少させる）、または少なくとも部分的に緩和または解消する。本開示に係る治療は、本明細書に記載の薬学的に有効量の分子、すなわち、とりわけ、本明細書に開示される結合メンバー（抗体など）、核酸、ベクターまたは宿主細胞を、それらを必要とする対象に投与して、ＴＮＦα−が介在する疾患の１つまたは複数の症状を、防止する、治す、発症および／または進行を遅らせる、重症度を低下させる、安定化する、調節する、治す、または改善することを含む。典型的に、結合メンバー、核酸、ベクターまたは宿主細胞は、本明細書に記載されるものを含む医薬組成物において提供される。治療を必要とする者は、すでに疾患を有する者、ならびに、疾患を有する傾向がある者、または、疾患が防止（予防）されるべき者を含む。一般に、治療は、疾患または病状の進行および／または存在と関連する症状の進行を、低減させ、安定化し、または阻害する。用語「投与」は、化合物を、対象の細胞、体液または組織へ取り込む方法に関する。用語「治療的効果」は、異常な状態を引き起こす、またはそれに寄与する因子の阻害または活性化を指す。治療的効果は、異常な状態または疾患の１つまたは複数の症状を、ある程度緩和する。用語「異常な状態」は、その生物におけるそれらの正常な機能から外れた、生物の細胞または組織における機能を指す。

【0098】

本明細書において用いられる用語「ＴＮＦα特異的な結合」は、結合メンバーが、抗−ＴＮＦα結合メンバーが結合するＴＮＦαエピトープを含まない構造的に異なる抗原よりも高い親和性で、ＴＮＦαに結合することを指す。特異的な結合は、１マイクロモルよりも低い解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）により示される。この定数は、例えば、Ａｔｔａｎａ機器でのＱｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ（ＱＣＭ）、または、ＢＩＡＣＯＲＥ機器での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて、決定することができる。

【0099】

本明細書において用いられる「ｈＴＮＦα」は、ヒトＴＮＦαを指し、天然のｈＴＮＦαおよびｒｈＴＮＦαを含む。「ｒＴＮＦα」は、組み換えＴＮＦαを指す。組み換えＴＮＦαは、それが調製される方法に応じて、アミノ末端メチオニン残基を有してよく、または有さなくてよい。「ｒｈＴＮＦα」βは、組み換えヒトＴＮＦαを指す。ｒｈＴＮＦαは、例えば、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ，カタログ番号３００−０１Ａから得てよい。また、ＴＮＦαは、ヒトまたは非−ヒト起源の生物学的サンプルからの単離により得てもよい。

【0100】

「変異」は、本明細書に開示される親配列の少なくとも１つの所望の活性を保持しながら、１つまたは複数のアミノ酸残基または核酸塩基の付加（挿入を含む）、欠失および／または置換により親配列とは異なるアミノ酸または核酸配列を指す。抗体の場合、そのような所望の活性は、特異的な抗原結合を含んでよい。同様に、変異の核酸配列は、親配列と比較した場合に、１つまたは複数の核酸塩基の付加、欠失および／または置換により改変されてよいが、コードされる抗体は、上述のように所望の活性を保持する。変異は、自然発生、例えば、対立遺伝子変異またはスプライス変異であってよく、または人為的に構築されてよい。

【0101】

核酸ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリンジェンシーの条件下で行なうことができる。「ストリンジェントな条件」は、広く知られていて、当該分野において公表されている。典型的に、ハイブリダイゼーション反応の間、ＳＳＣベースのバッファーを用いることができ、ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭシトレートバッファー（ｐＨ７．０）である。バッファー濃度の増大および変性剤の存在は、ハイブリダイゼーションステップのストリンジェンシーを増大させる。例えば、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、（ｉ）５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸（４２℃）、４２℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で洗浄；（ｉｉ）５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド、含む、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、含む、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム（４２℃）、または（ｉｉｉ）１０％デキストラン硫酸、２×ＳＳＣ、および５０％ホルムアミド（５５℃）の使用を伴うことができ、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄（５５℃）を続ける。追加的または代替的に、低イオン強度および高温の洗浄溶液を用いた、１、２またはそれより多くの洗浄ステップを、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（５０℃）を用いて、ハイブリダイゼーションプロトコルに含めることができる。

【0102】

用語の任意の使用の範囲および意味は、用語が用いられる特定の文脈から明らかであろう。本書類全体を通じて用いられる選択された用語に関する特定のさらなる定義は、該当する場合は、詳細な説明の適切な文脈において与えられる。

【0103】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、広くまたはオープンエンドに、限定せずに読むべきである。「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」のような単数形は、文脈が明らかにそれ以外を示さない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」との言及は、単一のベクター、ならびに、同一（例えば同一オペロン）または異なるかのいずれかの複数のベクターを含む。同様に、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」との言及は、単一の細胞ならびに複数の細胞を含む。別段の指示がない限り、一連の要素の前の用語「少なくとも」は、一連の要素全てを指すと理解される。用語「少なくとも１つ」および「少なくとも１つの」は、例えば、１、２、３、４、または５、またはそれよりも多くの要素を含む。述べられた範囲よりも上および下のわずかな変動を用いて、その範囲内の値と実質的に同一の結果を得ることができることが、さらに理解される。また、別段の指示がない限り、範囲の開示は、最小値と最大値の間の全ての値を含む、連続的な範囲として意図される。

【0104】

用語の任意の使用の範囲および意味は、用語が用いられる特定の文脈から明らかであろう。本書類全体を通じて用いられる選択された用語に関する特定のさらなる定義は、該当する場合は、詳細な説明の適切な文脈において与えられる。

【0105】

本開示の様々な態様を、以下のサブセクションにさらに詳細に記載する。様々な実施態様、選好および範囲は、自由自在に組み合わせてよいことが理解される。さらに、特定の実施態様によっては、選択された定義、実施態様または範囲は適用しなくてよい。

【0106】

結合メンバー／抗体特性化
本明細書において提供される結合メンバーは、一部の実施態様では、ＴＮＦαに特異的なタンパク性結合分子である。タンパク性結合分子は、一般に、免疫グロブリン様の機能を有する。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的なタンパク性結合分子から本質的になる。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的なタンパク性結合分子を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な抗体フラグメントである。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な抗体フラグメントから本質的になる。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な抗体フラグメントを含む。結合メンバーは、一部の実施態様では、ＴＮＦαに特異的な免疫グロブリン分子の全長である。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な免疫グロブリン分子の全長から本質的になる。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な免疫グロブリン分子の全長を含む。結合メンバーは、一部の実施態様では、ＴＮＦαに特異的な、非−免疫グロブリン足場である。非−免疫グロブリン足場は、一般に、免疫グロブリン様の機能を有する。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な非−免疫グロブリン足場から本質的になる。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的な非−免疫グロブリン足場を含む。

【0107】

結合メンバーは、ＴＮＦαに対する結合特異性を有し、すなわち、それはＴＮＦαに特異的に結合する。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的に結合するだけで、いかなる追加の標的にも結合しない。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的に結合し、２つの異なるエピトープに結合するという点で、二重特異性である。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＴＮＦαに特異的に結合し、また加えてさらなる標的にも結合するという点で、二重特異性である。一部の実施態様では、結合メンバーは、多重特異性であり、すなわち、ＴＮＦαに特異的に結合し、また加えて１つを超えるさらなる標的にも結合する。結合メンバーは、一部の実施態様では、ＴＮＦαに対する一価結合メンバーである。結合メンバーは、免疫グロブリン様の様式でＴＮＦαに結合する。一部の実施態様では、結合メンバーは、免疫グロブリンまたはそのフラグメントである。ＴＮＦαに対して特異的に向けられる結合メンバーは、一般に、単一の分子により定義される。そのような分子は、典型的にタンパク性である。結合メンバーは、１、２またはそれより多くの鎖を有してよい。複数の鎖が結合メンバーに含まれる場合、２以上のそのような鎖は、互いに共有結合または非共有結合してよい。

【0108】

一価結合メンバーのような結合メンバーは、可溶型ヒトＴＮＦαの生物学的効果を、５０ｐＭ未満のＩＣ_５０で阻害する。一部の実施態様では、ＩＣ_５０は、約４０ｐＭ未満である。ＩＣ_５０は、一部の実施態様では、約３０ｐＭ未満の値である。

【0109】

一部の実施態様では、一価結合メンバーは、抗体フラグメントである。それぞれの抗体フラグメントは、一般に、約６０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施態様では、抗体フラグメントは、約５５ｋＤａ未満の分子量を有する。抗体フラグメントの分子量は、一部の実施態様では、約５０ｋＤａ未満である。一部の実施態様では、抗体フラグメントは、約４５ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施態様では、分子量は、約４０ｋＤａまたは約３５ｋＤａまたはそれよりも小さい。抗体フラグメントの分子量は、一部の実施態様では、約３０ｋＤａまたは２５ｋＤａである。一部の実施態様では、抗体フラグメントは、３０ｋＤａ未満、または２５ｋＤａ未満の分子量を有する。抗体フラグメントの分子量は、一部の実施態様では、約２３ｋＤａ未満、または約２４ｋＤａ未満である。一部の実施態様では、抗体フラグメントは、約２５ｋＤａ未満、または約２６ｋＤａ未満の分子量を有する。抗体フラグメントの分子量は、一部の実施態様では、２７ｋＤａ未満である。

【0110】

一態様では、ＴＮＦαに対して向けられる結合メンバーが提供される。結合メンバーの結合特異性は、当該分野でよく知られている技術を用いて検証してよい。複数の従来のディスプレイ技術を、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントまたはタンパク性結合分子のような結合メンバーの結合特性を測定するために利用することができる。Ｌｉら（Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６），４，３４２０−３４２６）は、例えば、選択されたＤＮＡアダプターと複合体を形成することが可能な単鎖Ｆｖフラグメントを、ファージディスプレイを用いてどのように得ることができるのかを説明している。ディスプレイ技術は、例えば、選択された標的分子に関して高い親和性を有するリガンドおよび改変された免疫グロブリンの生産を可能にする。したがって、典型的に遺伝子工学によってわずかにだけ異なる、ペプチドまたはタンパク質のアレイをディスプレイすることも可能である。それにより、相互作用および生物物理学的パラメーターの特性の観点から、タンパク質またはペプチドをスクリーニングし、続いて進化させることが可能である。反復回数の突然変異および選択を、インビトロ基準で適用することができる。

【0111】

ペプチドおよびタンパク質の選択のためのインビトロディスプレイ技術は、ペプチドまたはタンパク質およびそれをコードする核酸の間の物理的結合に依存する。大パネルの技術がこの目的のために確立されていて、最も一般に用いられるものは、ファージ／ウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、細胞−表面ディスプレイ、「プラスミド上のペプチド」、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、および、マイクロビーズディスプレイを含むインビトロ区画化である（レビューには、例えば、Ｒｏｔｈｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢＪ．（２００６）２０，１５９９−１６１０；Ｓｅｒｇｅｅｖａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ （２００６）５８，１６２２−１６５４を参照）。

【0112】

また、タンパク質を含むペプチド、および核酸を、物理的に結合する異なる手段も利用可能である。細胞表面分子を用いた細胞における発現、ウイルス／ファージコートタンパク質との融合ポリペプチドとしての発現、安定化されたＲＮＡ分子のインビトロ複合体、ピューロマイシン分子またはマイクロビーズを介してインビトロで共有結合するリボソームおよびそれぞれのポリペプチドは、現在当該分野で用いられている、タンパク質／ペプチドおよび核酸を結合する方法の例である。さらなるディスプレイ技術は、油中水エマルションに依存する。水滴は、区画としての役割を果たし、そのそれぞれにおいて、単一の遺伝子が転写および翻訳される（Ｔａｗｆｉｋ，Ｄ．Ｓ．，＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９８）１６，６５２−６５６，ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００７／０１０５１１７）。タンパク質を含むペプチド、および核酸（それをコードする）の間のこの物理的結合は、選択されたペプチド／タンパク質をコードする核酸を回収する可能性を提供する。したがって、免疫沈降のような技術と比較して、ディスプレイ技術では、選択された標的分子の結合パートナーを同定または選択することができるだけでなく、この結合パートナーの核酸も回収することができ、さらなる処理に用いることができる。したがって、このディスプレイ技術は、例えば、標的を発見し、発見を導き、および最適化を導くための手段を提供する。ペプチドまたはタンパク質、例えば抗体の膨大なライブラリーは、潜在的に、大スケールでスクリーニングすることができる。

【0113】

結合メンバーが特異的に結合するＴＮＦαは、サイトカインであり、とりわけ免疫細胞の調節に関与する。ＴＮＦαは、自己免疫疾患および免疫が介在する疾患を含む、生物の免疫系に関する疾患に関与する。ＴＮＦαは、一部の実施態様ではヒトＴＮＦαであり、可溶型として、および膜型として存在する。膜型は、細胞内ドメイン、膜貫通型ドメインおよび細胞外ドメインを有する。可溶型は、膜型の２３３アミノ酸のうちのアミノ酸７７位〜２３３位に相当する。ヒトＴＮＦαの膜型は、Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ０１３７５を有する（２０１５年３月４日のバージョン２０２）。

【0114】

他の種由来のＴＮＦαは、可溶型分子および膜貫通タンパク質の形態で同様に存在する。例えば、イヌ科のＴＮＦαは、２３３アミノ酸の長さを有し、そのうち、細胞外ドメインがアミノ酸５７〜２３３に及ぶ。可溶型は、アミノ酸７７位〜２３３位に及ぶ（Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ５１７４２、２０１５年３月４日のバージョン１１２を参照。一部の実施態様では、結合メンバーが特異的に結合するＴＮＦαは、ミューリンＴＮＦαであり、Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ０６８０４を有する（２０１５年３月４日のバージョン１６７）。一部の実施態様では、結合メンバーが特異的に結合するＴＮＦαは、ネコ科のＴＮＦαであり、Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ１９１０１を有する（２０１５年１月７日のバージョン１１０）。結合メンバーが特異的に結合するＴＮＦαは、一部の実施態様では、ウシ属のＴＮＦαであり、Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＱ０６５９９を有する（２０１５年３月４日のバージョン１２９）。一部の実施態様では、ＴＮＦαは、モルモットＴＮＦαであり、Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ５１４３５を有する（２０１５年３月４日のバージョン１０６）。ＴＮＦαは、一部の実施態様では、イヌＴＮＦαであり、Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ５１７４２を有する（２０１５年３月４日のバージョン１１２）。一部の実施態様では、結合メンバーが特異的に結合するＴＮＦαは、アカゲザルＴＮＦαであり、Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ４８０９４を有する（２０１５年３月４日のバージョン１０８）。

【0115】

本明細書に開示される結合メンバーは、少なくとも１つのＶＨ ＣＤＲ配列（配列番号６、７および８にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）またはそれらの変異を含んでよい。一部の実施態様では、結合メンバーは、１つよりも多いＶＨ ＣＤＲ配列（配列番号６、７および８にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）またはそれらの変異を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、全てのＶＨ ＣＤＲ配列（配列番号６、７および８にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）またはそれらの変異を含む。また、結合メンバーは、少なくとも１つのＶＬ ＣＤＲ配列（配列番号３、４および５にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）またはそれらの変異を含んでもよい。一部の実施態様では、結合メンバーは、１つよりも多いＶＬ ＣＤＲ配列（配列番号３、４および５にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）またはそれらの変異を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、全てのＶＬ ＣＤＲ配列（配列番号３、４および５にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）またはそれらの変異を含む。

【0116】

一部の実施態様では、結合メンバーは、少なくとも１つのＶＨ ＣＤＲ配列（配列番号６、７および８にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）またはそれらの変異を含むが、ＶＬ ＣＤＲ配列（配列番号３、４および５にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）またはそれらの変異はどれも含まない。一部の実施態様では、結合メンバーは、少なくとも１つのＶＨ ＣＤＲ配列（配列番号６、７および８にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）またはそれらの変異、および、少なくとも１つのＶＬ ＣＤＲ配列（配列番号３、４および５にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）またはそれらの変異を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、全てのＶＨ ＣＤＲ配列（配列番号６、７および８にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）またはそれらの変異、および、少なくとも１つのＶＬ ＣＤＲ配列（配列番号３、４および５にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）またはそれらの変異を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、少なくとも１つのＶＨ ＣＤＲ配列（配列番号６、７および８にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）またはそれらの変異、および、全てのＶＬ ＣＤＲ配列（配列番号３、４および５にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）またはそれらの変異を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、全てのＶＨ ＣＤＲ配列（配列番号６、７および８にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）またはそれらの変異、および、全てのＶＬ ＣＤＲ配列（配列番号３、４および５にそれぞれ記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）またはそれらの変異を含む。

【0117】

そのような結合メンバーは、５０ｐＭ未満のＩＣ_５０で可溶型ヒトＴＮＦαを中和することが可能である。一部の実施態様では、結合メンバーは、約４０ｐＭ未満のＩＣ_５０で可溶型ヒトＴＮＦαを中和することが可能である。一部の実施態様では、結合メンバーは、約３０ｐＭ未満、またはそれよりも低いＩＣ_５０で可溶型ヒトＴＮＦαを中和することが可能である。

【0118】

ＩＣ_５０は、例えば、細胞に基づく効能アッセイを用いて決定することができる。一部の実施態様では、上記のＩＣ_５０値は、ＰＫ−１５細胞において、１．４ｐＭのｒｈＴＮＦαの存在下で、ＴＮＦαが誘導する細胞毒性を阻害することにより決定される。典型的な実施態様では、約１０’０００細胞が用いられ、結合メンバーは、３７℃で滴定される。細胞は典型的に、結合メンバーおよび可溶型ＴＮＦαの混合物とともに１２〜１６時間インキュベートされ、一部の実施態様では１６時間インキュベートされる。好ましくは、ＩＣ_５０値は、そのようなアッセイの少なくとも３つの非依存性の反復で得られた平均値である。一実施態様では、そのようなアッセイは、実施例３に記載のＰＫ−１５アッセイである。

【0119】

また、結合メンバーは、約１００ｎＭ未満のＩＣ_５０で膜貫通型（ｔｍ）ヒトＴＮＦαを中和することも可能であり得る。一部の実施態様では、このＩＣ_５０は、約８０ｎＭよりも、または約７５ｎＭよりも、低くてよい。一部の実施態様では、結合メンバーは、約７０ｎＭ未満のＩＣ_５０でｔｍヒトＴＮＦαを中和することが可能であり得る。また、結合メンバーは、約６５ｎＭよりも、または約６０ｎＭよりも低いＩＣ_５０でｔｍヒトＴＮＦαを中和することも可能であり得る。一部の実施態様では、ＩＣ_５０は、約５０ｎＭ未満であってよい。一部の実施態様では、結合メンバーは、約１０ｎＭ未満のＩＣ_５０でｔｍヒトＴＮＦαを中和することが可能であり得る。

【0120】

ｔｍＴＮＦαのＩＣ_５０は、例えば、ｔｍＴＮＦα発現ＣＨＯ細胞により刺激されたＨＥＫ−Ｄｕａｌ ＴＮＦα感受性細胞を用いたアッセイで測定され得る。例えば、そのようなアッセイは、実施例３に詳細に記載される。典型的な例では、結合メンバーとともに事前インキュベートされた１０’０００ ＣＨＯ細胞／ウェル、および、２０’０００ ＨＥＫ−Ｄｕａｌ ＴＮＦα感受性細胞／ウェルを用いて、３７℃で２４時間培養する。

【0121】

したがって、一部の実施態様では、ヒト膜貫通型ＴＮＦαよりも良好な程度に可溶型ヒトＴＮＦαを中和することが可能である結合メンバーが提供され、可溶型ヒトＴＮＦαのＩＣ_５０値は、ヒト膜貫通型ＴＮＦαのＩＣ_５０値よりも少なくとも１００倍良好である。言い換えれば、可溶型ヒトＴＮＦαのそれぞれの結合メンバーのＩＣ_５０値は、ヒト膜貫通型ＴＮＦαの同一の結合メンバーのＩＣ_５０値と比較した場合に、１００倍またはそれよりも低い。それ故に、結合メンバーは、ヒト膜貫通型ＴＮＦαの中和よりも、可溶型ヒトＴＮＦαの中和において、さらに効果的である。

【0122】

本明細書に記載の結合メンバーは、例えば、抗体（例えば免疫グロブリン全長）または抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨまたは最小認識単位）または非−抗体足場であってよい。

【0123】

典型的な実施態様では、結合メンバーおよび具体的には上述の一価結合メンバーは、ｓｃＦｖである。ＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＬ−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−リンカー−ＶＬのいずれかの方向で、可動性リンカーにより連結することができる。好ましい実施態様では、方向はＶＬ−リンカー−ＶＨであり、すなわち、重鎖可変領域がポリペプチドのＣ−末端にあり、軽鎖可変領域がＮ−末端にある。

【0124】

結合メンバーは、一部の実施態様では、ヒト化結合メンバーである、一部の実施態様では、結合メンバーは、ヒト化抗体またはヒト化抗体フラグメントである。

【0125】

一部の実施態様では、本明細書に開示される抗体および具体的には抗体フラグメントは、サブタイプＶＨ３の可変重鎖領域を含む。一部の実施態様では、本明細書において開示される抗体および具体的には抗体フラグメントは、サブタイプＶｋａｐｐａ１の可変軽鎖領域を含む。一部の実施態様では、本明細書において開示される抗体および抗体フラグメントは、サブタイプＶＨ３の可変重鎖領域およびサブタイプＶｋａｐｐａ１の可変軽鎖領域の両方を含む。一部の実施態様では、本明細書において開示される抗体および抗体フラグメントは、サブタイプＶＨ３の可変重鎖領域のみを含み、サブタイプＶｋａｐｐａ１の可変軽鎖領域を含まない。一部の実施態様では、本明細書において開示される抗体および抗体フラグメントは、サブタイプＶｋａｐｐａ１の可変軽鎖領域のみを含み、サブタイプＶＨ３の可変重鎖領域を含まない。

【0126】

また、本明細書において開示される配列の変異も提供される。一部の実施態様では、ＶＨ配列は、配列番号２の変異であり、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、ＶＨ配列は配列番号２の変異であり、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、ＶＨ配列は配列番号２の変異であり、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、ＶＨ配列は配列番号２の変異であり、配列番号２に対して少なくとも９１％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、ＶＨ配列は配列番号２の変異であり、配列番号２に対して少なくとも９２％または９３％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、配列番号２のそれぞれの変異は、配列番号２に対して少なくとも９３％または９４％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、ＶＨ配列は配列番号２の変異であり、配列番号２に対して、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、ＶＨ配列は配列番号２の変異であり、配列番号２に対して１００％の配列同一性を有する。

【0127】

追加的または代替的に、本明細書に開示される結合メンバーは、配列番号１のＶＬ配列の変異を含む抗体であり、配列番号１の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、抗体または変異は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む可変軽鎖を含む。一部の実施態様では、抗体または変異は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列から本質的になる可変軽鎖を含む。一部の実施態様では、抗体または変異は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなる可変軽鎖を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号１のＶＬ配列の変異を含む抗体であり、配列番号１に対して９１％以上（９２％以上を含む）の配列同一性を有する。結合メンバーは、一部の実施態様では、配列番号１の配列に対して９３％以上（９４％以上を含む）の配列同一性を有する配列を有する配列番号１のＶＬ配列の変異を含む抗体である。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号１に対して９５％以上（９６％以上を含む）の配列同一性を有する配列番号１のＶＬ配列の変異を含む抗体である。一部の実施態様では、ＶＬ配列は配列番号１の変異であり、配列番号１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、ＶＬ配列は配列番号１の変異であり、配列番号１に対して９７％以上（９８％以上を含む）の配列同一性を有する。結合メンバーは、一部の実施態様では、配列番号１のＶＬ配列の変異を含む抗体であり、配列番号１の配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施態様では、ＶＬ配列は配列番号１の変異であり、配列番号１に対して１００％の配列同一性を有する。

【0128】

一実施態様では、そのような抗体は、配列番号２に対して８５％以上、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い、好ましくは１００％の配列類似性を有するＶＨ配列を含む。追加的または代替的に、抗体は、配列番号１に対して８５％以上、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い、好ましくは１００％の配列類似性を有するＶＬ配列を含む。

【0129】

好ましい実施態様では、抗体は、配列番号１に記載のＶＨおよび配列番号２に記載のＶＬまたはそれらの変異を含む。配列番号１および２のフレームワーク配列は、ＷＯ ０３／０９７６９７ Ａ（ＥＳＢＡＴｅｃｈ ＡＧ）に記載のヒト免疫グロブリンから得られる。そのＶＨおよびＶＬフレームワーク配列は、ウサギ抗体のヒト化および安定化のために改変されている。例えば、ＷＯ ２００９／１５５７２６ Ａ（ＥＳＢＡＴｅｃｈ，ＡＮ ＡＬＣＯＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＵＮＩＴ ＬＬＣ）；ＢＯＲＲＡＳ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＪＢＣ ２０１０，ｖｏｌ．２８５，ｎｏ．１２，ｐ．９０５４−９０６６を参照。配列番号１、２、１１または１２の変異は、ｓｃＦｖの形式で安定のままであるべきであり、すなわち、それらは、長期のインキュベーション後に、高度に単量体のままである。例えば、本明細書において用いられる「長期のインキュベーション後に、高度に単量体のまま」とは、例えば、ｐＨ７．２のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中１０ｍｇ／ｍＬで、４℃、２２℃または３７℃で、２週間のインキュベーション後に、少なくとも８０％の単量体含有量を指す。

【0130】

結合メンバーは、特にｓｃＦｖの場合、リンカー配列を含んでよい。そのようなリンカー配列は、典型的に１０〜約２５アミノ酸を有する。通常、そのようなリンカーペプチドは、グリシンが豊富であり、セリンおよび／またはトレオニンが溶解度を改善するのと同じように、柔軟性を与える。好ましい実施態様では、（ＧＧＧＧＳ）_４リンカー（配列番号１０）またはそれらの変異を用いる。３〜５回の繰り返しを有するこのモチーフの変型を用いてもよい。さらに適切なリンカーは、例えば、ＡＬＦＴＨＡＮ，Ｋ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｎｋｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ １９９５，ｖｏｌ．８，ｎｏ．７，ｐ．７２５−７３１に記載される。

【0131】

したがって、一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号９を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、結合メンバーは、配列番号９から本質的になるアミノ酸配列を有する。一実施態様では、結合メンバーは、配列番号９からなるアミノ酸配列を有する。

【0132】

特定の実施態様では、本明細書において提供される結合メンバーの変異体が検討される。例えば、抗原結合、抗体依存性−細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体−依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を改善して、タンパク質分解に対する感受性および／または酸化に対する感受性を低減させること、安定性または溶解度を増大させること、免疫原性を低減させること、および／または、結合メンバーの他の生物学的、生化学的または生物物理学的特性を変えることが、望ましくあり得る。一部の実施態様では、変異体は、親結合メンバーに対していかなる改善も示さない。変異体は、一部の実施態様では、そのアミノ酸配列の１、２またはそれよりも多くの位置が、所定の結合メンバーとは異なるタンパク性分子であってよい。典型的に、所定の結合メンバーとの違いは置換である。一部の実施態様では、所定の結合メンバーとの違いは欠失である。変異体は、ムテイン、すなわち、部位特異的突然変異誘発により変更された遺伝子配列の発現から得られたペプチド／タンパク質であってよい。

【0133】

本明細書において提供される結合メンバーの変異体は、結合メンバーをコードする核酸配列に適切な改変を導入するタンパク質および／または化学工学により、または、タンパク質／ペプチド合成により、調製してよい。変異体は、適切な方法を用いてスクリーニングすることのできる所望の特徴を、生産される結合メンバーが保有しているという条件で、フレームワークまたはＣＤＲへの１つまたは複数の欠失、置換、付加および挿入の任意の組み合わせ（単数または複数）により得てよい。一部の実施態様では、結合メンバーの変異体は、１または２個の置換により、本明細書に定義される結合メンバーの特定の配列と異なる。一部の実施態様では、結合メンバーの変異体は、５個までの置換により、本明細書に定義される結合メンバーの特定の配列と異なる。結合メンバーのアミノ酸配列における置換は、上述の保存的置換であってよい。保存的置換の例は以下を含む：

【0134】

１．アラニン（Ａ）をバリン（Ｖ）により置換する；
２．アルギニン（Ｒ）をリジン（Ｋ）により置換する；
３．アスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）により置換する；
４．アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）により置換する；
５．システイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）により置換する；
６．グルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）により置換する；
７．グリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）により置換する；
８．ヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）により置換する；
９．イソロイシン（Ｉ）をロイシン（Ｌ）により置換する；
１０．メチオニン（Ｍ）をロイシン（Ｌ）により置換する；
１１．フェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）により置換する；
１２．プロリン（Ｐ）をアラニン（Ａ）により置換する；
１３．セリン（Ｓ）をトレオニン（Ｔ）により置換する；
１４．トリプトファン（Ｗ）をチロシン（Ｙ）により置換する；
１５．フェニルアラニン（Ｆ）をトリプトファン（Ｗ）により置換する；
および／または
１６．バリン（Ｖ）をロイシン（Ｌ）により置換する、
および逆もまた同様である。

【0135】

本明細書に記載の配列は、１つまたは複数の、例えば２または３個のそのような保存的置換を含んでよい。一部の実施態様では、本明細書に開示される結合メンバーは、本明細書に開示される配列と比較して、４個以上の保存的置換を有する配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、５個以上の保存的置換を有する配列を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、本明細書に開示される配列と比較して、６個以上、例えば７個以上の保存的置換を含む。一部の実施態様では、結合メンバーは、８、９、１０、１１、１２またはそれより多くのそのような保存的置換を含んでよい。

【0136】

非−保存的置換は、例えば、ポリペプチドの電荷、双極子モーメント、サイズ、親水性、疎水性または構造に関して、より実質的な変化をもたらし得る。一実施態様では、結合メンバーは、１つまたは複数の、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれより多くのそのような非−保存的置換を含む。

【0137】

改変は、ＣＤＲまたはフレームワーク配列内に存在してよい。例えば、本明細書で提供されるＣＤＲは、１、２、３、４、５個またはさらにそれよりも多くの改変を含んでよい。例えば、全体として捉えられるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３配列は、本明細書で提供されるＣＤＲと、具体的には（ｉ）配列番号３、４、および５と、７５％以上、例えば７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、および、好ましくは９９％以上同一である。追加的または代替的に、全体として捉えられるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列は、本明細書で提供されるＣＤＲと、具体的には（ｉ）配列番号６、７および８と、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、９５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、好ましくは９９％同一である。

【0138】

一実施態様では、全体として捉えられるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３は、本明細書で提供されるＣＤＲと、少なくとも８５％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、好ましくは９９％類似である。追加的または代替的に、全体として捉えられるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３は、本明細書で提供されるＣＤＲと、少なくとも８５％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、好ましくは９９％類似である。

【0139】

追加的または代替的に、変異は、配列番号１〜１０のいずれか１つの配列内に、１つまたは２つの置換を含んでよい。一部の実施態様では、変異は、配列番号１〜１０のいずれか１つの配列内に、３つの置換を含む。一部の実施態様では、変異は、配列番号１〜１０のいずれか１つの配列内に、４つの置換を含む。

【0140】

好ましいタイプの変異は、ＣＤＲ全体の１つまたは複数が置換されているものである。典型的に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は、抗原結合に最も重大に寄与する。例えば、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｈ１および／またはＣＤＲ−Ｈ２の全体を、天然または人工起源の異なるＣＤＲにより置換してよい。一部の実施態様では、１つまたは複数のＣＤＲは、アラニン−カセットにより置換される。

【0141】

追加的または代替的に、抗体のＶＨは、溶解度を高める点突然変異を１つまたは複数含んでよい。ＷＯ２００９／１５５７２５（ＥＳＢＡＴｅｃｈ，ａ Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）は、抗体の全体的な溶解度を増大させることが示されたモチーフを記載する。残基は、抗体の可変ドメインおよび定常ドメインの界面に位置する場所に置かれ、特に、定常ドメインを欠くｓｃＦｖのような抗体フラグメントを安定化する。具体的には、以下の残基の１または２つが存在する：

【0142】

（ｉ）重鎖アミノ酸１２位（ＡＨｏナンバリングによる）のセリン（Ｓ）；
（ｉｉ）重鎖アミノ酸１０３位（ＡＨｏナンバリングによる）のセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；および／または
（ｉｉｉ）重鎖アミノ酸１４４位（ＡＨｏナンバリングによる）のセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）。

【0143】

一部の実施態様では、これらの残基の３つ全てが存在する。

【0144】

一部の実施態様では、抗体は、ＶＨ１２位にセリン；ＶＨ１０３位にセリン；およびＶＨ１４４位にトレオニンを有する（全てＡＨｏナンバリング）。

【0145】

一部の実施態様では、本明細書に開示される結合メンバーの変異体は、結合メンバーと比較した場合、ＴＮＦαへの特異的な結合を保持する。変異体は、例えば、ヒトＴＮＦαへの特異的な結合を保持し得る。一部の実施態様では、本明細書に開示される変異体の結合メンバーは、可溶型ヒトＴＮＦαの生物学的効果を約５００ｐＭ未満阻害する効能（ＩＣ_５０）を有する。一部の実施態様では、可溶型ヒトＴＮＦαの生物学的効果を阻害する変異体の効能は、約４００ｐＭ未満である。変異体のＩＣ_５０は、結合メンバーと比べた場合、一部の実施態様では、約３００ｐＭ（約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭを含む）よりも低くてよい。一実施態様では、結合メンバーの変異体は、結合メンバーと比較して、可溶型ヒトＴＮＦαの生物学的効果を阻害する効能（ＩＣ_５０）が約４０ｐＭ未満である。

【0146】

結合メンバーの変異体は、一部の実施態様では、膜貫通型ＴＮＦαを、約１００ｎＭよりも低い、好ましくは約８０ｎＭ未満の効能（ＩＣ_５０）で阻害することが可能である。一部の実施態様では、変異体は、約７５ｎＭ未満の効能（ＩＣ_５０）で膜貫通型ＴＮＦαを阻害することが可能である。一部の実施態様では、変異体は、約７０ｎＭ未満、例えば約６５ｎＭ未満の効能（ＩＣ_５０）で、膜貫通型ＴＮＦαを阻害することが可能である。一部の実施態様では、変異体は、約６０ｎＭ未満の効能（ＩＣ_５０）で、膜貫通型ＴＮＦαを阻害することが可能である。

【0147】

結合メンバーの変異体は、一部の実施態様では、ヒトおよび非−ヒトＴＮＦαと交差反応性である。結合メンバーの変異体は、一部の実施態様では、（親）結合メンバーが、例えば、カニクイザル、イヌ科、ネコ科および／またはアカゲザルＴＮＦαに結合するのと同一のＴＮＦα種に結合することが可能である。一部の実施態様では、結合メンバーの変異体は、本明細書に開示される結合メンバーと、ＴＮＦαに対する結合に関して競合する。変異体は、例えば、本明細書に開示される結合メンバーと、ヒトＴＮＦαに対する結合に関して競合してよい。一部の実施態様では、変異体は、結合メンバーが結合することが可能な同一の非−ヒトＴＮＦαに対する結合に関して、本明細書に開示される結合メンバーと競合することが可能である。

【0148】

一部の実施態様では、本明細書に開示される変異体の結合メンバーは、ＴＮＦαへの特異的な結合を保持し；可溶型ヒトＴＮＦαの生物学的効果を阻害する効能（ＩＣ_５０）が約５００ｐＭ未満、例えば、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ未満、好ましくは４０ｐＭ未満であり；膜貫通型ＴＮＦαを、１００ｎＭ未満、好ましくは約８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭまたは６０ｎＭ未満の効能ＩＣ_５０で阻害し；ヒトおよび非−ヒトＴＮＦαと交差反応性であり、および、親結合メンバーが、例えば、カニクイザル、イヌ科、ネコ科および／またはアカゲザルＴＮＦαに結合するのと同一のＴＮＦα種に結合し；および、ヒトＴＮＦαなどのＴＮＦα、および好ましくは、結合メンバーが結合する同一の非−ヒトＴＮＦαへの結合に関して、本明細書に開示される結合メンバーと競合する。

【0149】

また、変異体は、軽鎖および重鎖の鎖シャフリングによって調製してもよい。単一軽鎖を重鎖のライブラリーと組み合わせて、変異体のライブラリーを生じさせることができる。一実施態様では、単一軽鎖は、上記に挙げたＶＬ配列の群から選択され、および／または、重鎖のライブラリーは、上記に挙げたＶＨ配列の１つまたは複数を含む。同様に、単一重鎖は、軽鎖のライブラリーと組み合わせることができる。一部の実施態様では、単一重鎖は、上記に挙げたＶＨ配列の群から選択され、および／または、軽鎖のライブラリーは、上記に挙げたＶＬ配列の１つまたは複数を含む。

【0150】

結合メンバーは、上述のＶＬおよび／またはＶＨ配列のいずれかを含むことができる。単一ドメインの形式を有する結合メンバー、例えばナノボディ、またはＶＨＨは、上述のＶＬまたはＶＨ配列のいずれか１つのみ、好ましくはＶＨ配列を含み、一価である。多価結合メンバー、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ビス−ｓｃＦｖ（タンデムｓｃＦｖとしても知られる）またはダイアボディ、具体的には二重特異性結合メンバーは、１つまたは複数の上述のＶＬ配列および／または１つまたは複数の上述のＶＨ配列を含んでよい。多価結合メンバーは、ＴＮＦαとは異なる抗原を標的化するＶＨおよび／またはＶＬ配列を含んでよい。

【0151】

本明細書に開示される結合メンバーは、特に安定である。具体的には、本明細書に開示される一価抗体フラグメントおよび本明細書に開示されるｓｃＦｖは、特に安定である。本明細書において用いられる用語「安定」は、ポリペプチドが、長期のインキュベーションおよび／または上昇した温度でのインキュベーション後の溶液中で単量体のままである生物物理学的特性を指す。不安定なポリペプチドは、ダイマー化またはオリゴマー化する傾向があり、沈殿さえもして、それにより、保管寿命が低減し、医薬用途により適切でなくなる。

【0152】

本明細書において提供される結合メンバー、具体的には上記の一価抗体フラグメントは、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、３７℃で１週間インキュベートされた後、少なくとも７５％まで、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％まで、および、最も好ましくは９７％まで単量体のままである。追加的または代替的に、本明細書において提供される結合メンバーおよび具体的には上記の一価抗体フラグメントは、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、４℃または２２℃で１週間後、９０％以上まで単量体のままである。一部の実施態様では、本明細書に開示される結合メンバーは、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、４℃または２２℃で１週間後、９２％以上、例えば９４％以上まで単量体のままである。一部の実施態様では、結合メンバーは、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、４℃または２２℃で１週間後、９５％以上、例えば９６％以上、または９７％以上まで単量体のままである。一実施態様では、結合メンバーは、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、４℃または２２℃で１週間後、９９％以上まで単量体のままである。

【0153】

単量体の画分は、例えば、ＳＥ−ＨＰＬＣ（サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー）により判定することができる。そのような試験のための適切な移動相は、例えば、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）である。単量体の含有量は、タンパク質クロマトグラフィーの間に測定されるＵＶ２８０シグナルのピーク積分により定量することができる。適切なシステムは、例えば、後のクロマトグラム分析およびピーク定量化も可能にする、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（登録商標）６．５ソフトウェアにより制御されるＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳ ＨＰＬＣである。

【0154】

ｓｃＦｖを含む、一価抗体フラグメントのような結合メンバーは、５〜１０、好ましくは７〜９の範囲内の理論上の等電点（ｐＩ）を有し得る。理論上のｐＩは、例えば、ＥｘＰＡＳｙサーバ上のＰｒｏｔＰａｒａｍツールを用いることにより計算することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／で利用可能であり；ＧＡＳＴＥＩＧＥＲ Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｓｅｒｖｅｒ．（Ｉｎ）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＷＡＬＫＥＲ Ｊ．Ｍ．Ｔｏｔｏｗａ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，２００５．ＩＳＢＮ ９７８１５８８２９５９３４．ｐ．５７１−６０７も参照）。

【0155】

結合メンバー、例えばｓｃＦｖは、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で、３５ｍｇ／ｍｌよりも高い、好ましくは４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、４７ｍｇ／ｍｌ、４８ｍｇ／ｍｌ、４９ｍｇ／ｍｌよりも高い、最も好ましくは５０ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度まで濃縮することができる。結合メンバーを高く濃縮できればできるほど、結合メンバーの溶解度は高い。

【0156】

結合メンバーは、非−ヒト種由来のＴＮＦα、例えば、制限されずに、ネコ科のＴＮＦα、アカゲザルＴＮＦα、イヌ科のＴＮＦαと交差反応性であり得る。このことは特に、前臨床試験の目的、例えば、動物試験に有用である。好ましくは、結合メンバーは、ヒトリンホトキシンα２／β１、ヒトリンホトキシンα１／β２、ヒトＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５および／またはヒトＴＮＦβ／ＴＮＦＳＦ１と、交差反応性でない。

【0157】

本明細書に開示される抗体と競合する結合メンバーも提供され、結合メンバーは、ヒトＴＮＦαへの結合のためのものである。例えば、そのような競合する（または相互阻害する）結合メンバーは、中和し得る。典型的な実施態様では、そのような結合メンバーは、ＰＫ−１５細胞において、可溶型の１．４ｐＭ ｒｈＴＮＦαが誘導する細胞毒性を阻害する場合に、５０ｐＭ未満の効能ＩＣ_５０を有する。

【0158】

本明細書において用いられる用語「競合する」は、同一の標的に対する結合に関する結合メンバー間の競合を指す。競合は、共通の抗原（ここでは、ｈＴＮＦαまたはそのフラグメント）に対する本明細書に開示される結合メンバーの特異的な結合を、目的の結合メンバーが防止する、または阻害する、または低減させる競合結合アッセイにより判定することができる。そのような競合結合アッセイは当該分野で知られており、制限されずに、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を含む。典型的に、そのようなアッセイは、固体表面に結合した精製された抗原、試験される結合メンバーおよび本明細書に記載の参照結合メンバーの使用を含む。競合阻害は、（ｉ）試験される結合メンバーの存在下で固体表面に結合した参照結合メンバー、または（ｉｉ）参照結合メンバーの存在下で固体表面に結合した試験される結合メンバーの、いずれかの量を決定することにより測定される。競合結合メンバーは、（ｉ）参照結合メンバーと同一のエピトープに対して、（ｉｉ）オーバーラップするエピトープに対して、または（ｉｉｉ）その標的に対する参照結合メンバーの結合を立体的に妨げるが同一の標的分子上の異なるエピトープに対して、結合し得る。

【0159】

通常、競合結合メンバーが過剰に存在する場合、本明細書に記載の結合メンバーのＴＮＦαに対する特異的な結合を低減させ、すなわち、結合を４０〜４５％以上相互阻害する。過剰に存在する場合、競合結合メンバーは、一部の実施態様では、結合メンバーのＴＮＦαに対する特異的な結合を、４５〜５０％以上、例えば５０〜５５％以上、または５５〜６０％以上低減させる。一部の実施態様では、競合結合メンバーの存在下での結合メンバーの結合は、６０〜６５％以上、６５〜７０％以上、７０〜７５％以上、または７５％以上低減される。好ましくは、競合結合メンバーの存在下での本明細書に記載の結合メンバーの結合は、８０〜８５％以上低減される。一部の実施態様では、競合結合メンバーの存在下での結合メンバーの結合は、８５〜９０％以上（９０〜９５％以上を含む）低減される。一部の実施態様では、競合結合メンバーの存在下での結合メンバーの結合は、９５〜９７％以上低減される。一部の実施態様では、競合結合メンバーの存在下での結合メンバーの結合は、９７％以上低減される。

【0160】

一部の実施態様では、競合結合メンバーは、約１ｐＭ以上の親和力Ｋ_ＤでｈＴＮＦαに結合する。一部の実施態様では、競合結合メンバーは、約１０ｐＭ以上のＫ_ＤでｈＴＮＦαに結合する。一部の実施態様では、競合結合メンバーは、約１００ｐＭ以上、例えば５００ｐＭ以上の結合力Ｋ_ＤでｈＴＮＦαに結合する。競合結合メンバーは、一部の実施態様では、約１ｎＭ以上のＫ_ＤでｈＴＮＦαに結合する。一部の実施態様では、競合結合メンバーは、約１０ｎＭ以上のＫ_ＤでｈＴＮＦαに結合する。

【0161】

したがって、一態様では、
（ｉ）可溶型および膜貫通型ＴＮＦαに結合することができ；
（ｉｉ）ＰＫ−１５細胞において１．４ｐＭのｒｈＴＮＦαにより誘導される細胞毒性を阻害することにより測定して、約３０±６ｐＭのＩＣ_５０で可溶型ＴＮＦαを中和し、；
（ｉｉｉ）ｔｍ発現ＣＨＯ細胞で刺激されたＨＥＫ−Ｄｕａｌ ＴＮＦα感受性細胞において測定した場合に、約５０ｎＭのＩＣ_５０でｔｍＴＮＦαを中和し、；および／または
（ｉｖ）可溶型ヒト、アカゲザル、カニクイザル、イヌ科およびネコ科のＴＮＦαと交差反応性である、結合メンバーが提供される。一実施態様では、結合メンバーは、少なくとも１つの、例えば、少なくともＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ３、好ましくは配列番号３〜８に記載の全てのＣＤＲを含む。一実施態様では、結合メンバーは、配列番号９を含むｓｃＦｖであり、さらなる１つまたは複数の以下の特徴を有する。
（ｖ）ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、濃度１０ｍｇ／ｍＬおよび４℃で、６ヶ月間、少なくとも９０％まで安定である；
（ｖｉ）ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度および４℃で、２週間、少なくとも９５％まで安定である；
（ｖｉｉ）７６℃のＴｍを有する；および／または
（ｖｉｉｉ）８．２７のｐＩを有する。

【0162】

一実施態様では、本明細書に開示される結合メンバーは、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントのように一価である。別の実施態様では、結合メンバーは多価である。そのような多価分子は、二価（例えば、免疫グロブリン全長またはＦ（ａｂ’）_２フラグメント）であることができ、または、少なくとも３つの標的結合部位を含む。

【0163】

多価結合メンバーは、ダイアボディ、単鎖ダイアボディまたはタンデムｓｃＦｖのような二重特異性抗体であることができる（例えば、ＫＯＮＴＥＲＭＡＮＮ，Ｒ．Ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＬＯ，Ｂ．Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４．ＩＳＢＮ １５８８２９０９２１．ｐ．２２７−２４２を参照）。それぞれの二重特異性抗体は、ｓｃＦｖに関して上述したものよりも短いリンカーをおそらく使い得て、すなわち、配列番号１４の基本モチーフの１〜３回の繰り返しのみ有する（例えば、ＨＯＬＬＩＧＥＲ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ：ｓｍａｌｌ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＰＮＡＳ １９９３，ｖｏｌ．９０，ｎｏ．１４，ｐ．６４４４−６４４８を参照）。別の実施態様では、多価結合メンバーは、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、ミニボディまたはテトラボディである。

【0164】

また、本明細書に開示される抗体を含むＴ−ボディも提供される。Ｔ−ボディは、抗体の抗原認識を、Ｔ−細胞受容体複合体のシグナルおよびエフェクター特性と結び付ける免疫グロブリンＴ−細胞受容体（ｃＩｇＴＣＲ）である。そのような構築物では、抗体は、一部の実施態様では、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−Ｆｃである。一実施態様では、抗体はｓｃＦｖである。Ｔ−ボディの全般的なデザインおよびそれらの適用のさらなる議論については、例えば、ＳＣＨＩＲＲＭＡＮＮ，Ｔ．ａｎｄ Ｐｅｃｈｅｒ，Ｇ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＤＵＢＥＬ，Ｓ．Ｗｅｉｎｈｅｉｍ： Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００９．ＩＳＢＮ ３５２７３１４５３９．ｐ．５３３−５６１を参照。

【0165】

本開示に係る結合メンバーは、一部の実施態様では、ストレプトアビジン結合タグなどの捕捉部分、例えば、米国特許出願ＵＳ２００３／００８３４７４、米国特許第５，５０６，１２１号または第６，１０３，４９３号に記載のＳＴＲＥＰ−ＴＡＧＳ（登録商標）を含んでよい。捕捉部分のさらなる例は、限定されないが、マルトース−結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ−ペプチド（例えば、配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）、Ｔ７エピトープ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄの配列Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｐのＨＳＶエピトープ、配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓの水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エピトープ、配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａのヘマグルニチン（ＨＡ）エピトープ、および、配列Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕの転写因子ｃ−ｍｙｃの「ｍｙｃ」エピトープを含む。

【0166】

捕捉部分のさらなる例は、金属イオンを結合することが可能な金属キレート剤である。それぞれの捕捉部分は、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ニトリロ三酢酸、ＮＴＡとも呼ばれる）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール（ジメルカプロール）、ポルフィンまたはヘムであってよい。当該分野で用いられる固定化金属親和性クロマトグラフィーの標準的な方法に即して、例えば、オリゴヒスチジンタグは、例えば、キレート剤ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を用いたクロマトグラフィー目的のために提供され得る銅（Ｃｕ^２＋）、ニッケル（Ｎｉ^２＋）、コバルト（Ｃｏ^２＋）、または亜鉛（Ｚｎ^２＋）イオンと、複合体を形成することが可能である。

【0167】

核酸、ベクター、宿主細胞および生産方法
本明細書に記載の結合メンバーは、単一の核酸配列により、または複数の核酸配列により、コードされ得る。複数の核酸配列の場合は、各配列は１つの可変領域をコードしてよい。一部の実施態様では、核酸配列は、２以上の可変領域をコードしてよい。一般に、複数の核酸配列は、結合メンバーの可変領域をコードする。典型的に、各可変領域は、１つの別個の核酸配列によりコードされる。可変領域をコードするそれぞれの核酸配列は、単一の核酸分子内に含まれてよい。一部の実施態様では、可変領域をコードする２以上の核酸配列は、単一の核酸分子内に含まれる。一部の実施態様では、可変領域をコードする各核酸配列は、単一の別個の核酸分子内に含まれる。したがって、複数の核酸分子を、結合メンバーの生産において用いてよく、例えば、それぞれ少なくとも１つの可変領域をコードする。それぞれの核酸分子は、一部の実施態様では、発現カセットを定義してよい。上記に示したように、発現カセットは、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現に向かうことが可能な核酸分子である。

【0168】

発現カセットは、目的のヌクレオチド配列に動作可能に結合しているプロモーターを含み、それは１つまたは複数の終結シグナルに動作可能に結合している。それはまた、ヌクレオチド配列の正しい翻訳に必要な配列も含んでよい。コード領域は、目的のポリペプチドをコードすることができ、また、制限されないが、センスまたはアンチセンスの方向のアンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡを含む、目的の機能性ＲＮＡをコードすることもできる。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであることができ、それの構成要素の少なくとも１つが、それの他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。また、発現カセットは、天然起源であるが異種発現に有用な組み換え型で得られたものであることもできる。しかしながら、一部の実施態様では、発現カセットは、宿主に対して異種であり；すなわち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞において天然に生じない（宿主細胞または宿主細胞の祖先に、形質転換イベントにより導入された）。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がある特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下であり得る。植物または動物のような多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織、器官、または発達段階に特異的であってもよい。

【0169】

結合メンバーまたはその部分の配列が分かれば、当該分野でよく知られている方法により、例えば遺伝子合成により、ポリペプチド配列をコードするｃＤＮＡを生産することができる。これらのｃＤＮＡは、標準的なクローニングおよび突然変異誘発技術により、発現ベクターまたはクローニングベクターなどの適切なベクターにクローン化することができる。場合により、可変軽鎖は、抗体の可変重鎖とは別の核酸によりコードされる。さらに、追加の配列、例えば、タグ（例えば、ヒス−タグ）、Ｆａｂまたは免疫グロブリン全長の生産のための定常ドメイン、リンカー、第二の結合特異性のコード配列、または、酵素などの別の機能性ポリペプチド（融合構築物または二重特異性分子を生産する）が、遺伝子構築物に含まれ得る。

【0170】

選択されたクローニング戦略に基づき、遺伝子構築物は、Ｎ−末端またはＣ−末端に１つまたは複数のさらなる残基を有する結合メンバーを産生し得る。例えば、開始コドンに由来するＮ−末端メチオニンまたはさらなるアラニンは、翻訳後に切り取られていない限り、発現されたポリペプチドに存在し得る。したがって、本明細書に開示される抗体は、開示される配列からなるのではなく、それらを含むことが理解される。したがって、一実施態様では、結合メンバーは、配列番号９または１９の配列を有する。

【0171】

標準的なクローニング、突然変異誘発および分子生物学技術の基本的なプロトコルは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＧＲＥＥＮ，Ｍ．ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２０１２．ＩＳＢＮ １９３６１１３４２２．）に記載されている。

【0172】

遺伝子構築物の発現のための適切な宿主細胞は、原核生物または真核生物であることができる。適切な原核生物宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｒｗｉｎｉｎａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓファミリーの種を含む。一部の実施態様では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、カタログ番号Ｃ６０００−０３）およびＯｒｉｇａｍｉ（商標）２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１３４５）の１つまたは複数である。

【0173】

グリコシル化またはリン酸化のような翻訳後の修飾が所望の場合は、真核生物宿主細胞を用いることが有利であり得る。例えば、一般に用いられるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株などの真核生物微生物は、宿主細胞としての役割を果たし得る。また、宿主細胞の適切な例は、植物または動物細胞、具体的には、昆虫または哺乳類の細胞も含む。適切な哺乳類の細胞は、制限されずに、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、またはＮＳ０骨髄腫細胞を含む。

【0174】

結合メンバーは、適切な宿主細胞における発現により生産することができる。例えば、上述の発現ベクターは、エレクトロポレーションまたは化学的形質転換などの標準的な技術により、宿主細胞に導入される。形質転換された細胞は、それから、組み換えタンパク質発現に適切な条件下で、典型的には、場合により、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または、目的のコード配列の増幅のために改変された適切な栄養培地において、培養される。結合メンバーは、培養物から回収され、場合により、当該分野において標準的な技術を用いて精製される。組み換えタンパク質の収率は、培地および温度または酸素供給などの培養条件を最適化することにより改善され得る。原核生物では、結合メンバーは、封入体として細胞内でペリプラズムにおいて生産され得て、または、培地中に分泌される。回収の際に、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用、混合モードクロマトグラフィーおよび／またはアフィニティクロマトグラフィーなどの、その分野でよく知られる方法を用いて、タンパク質を精製することができる。

【0175】

一実施態様では、結合メンバーは、無細胞系において生産される。これは、典型的に、本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸産物テンプレート、例えば、プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ産物テンプレートのインビトロ転写の後にインビトロ翻訳を含む。例えば、増殖細胞由来のクルード溶解物が用いられ、必要な酵素ならびに細胞のタンパク質合成機構を提供する。必要なビルディングブロック、例えばアミノ酸または核酸塩基、ならびに、エネルギー送達分子およびその他は、外因的に供給することができる。無細胞発現系は、例えば、溶解ウサギ網状赤血球（例えば、Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｌ４５４０）、ＨｅＬａ細胞（例えば、１−Ｓｔｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号８８８８１）、昆虫細胞（例えば、ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｋｉｔ ＩＩ，Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号３２５６１）、小麦胚芽（例えば、Ｗｈｅａｔ ＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｌ４３８０）、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞（例えば、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ，ＮＥＢ，カタログ番号Ｅ６８００Ｓ）に基づくことができる。また、改善されたジスルフィド結合の生成のための最適化された無細胞抗体発現系を、生産に用いることができる。市販のキットは、昆虫細胞溶解物（例えば、ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｉｎｓｅｃｔ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号３２５８２）またはＥ．ｃｏｌｉ細胞溶解物（例えば、ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号３２５７２）を含む。無細胞タンパク質合成は、早くて、高い産物収率を達成し、反応条件の簡単な改変を可能にし、副産物の形成の程度が低いか、またはむしろ無い、などの利点を有する。無細胞タンパク質合成は、純粋に生物学的または化学的な生産系では行なうことのできない生物学的および／または化学的ステップを伴い得る。例えば、非天然または化学的に改変されたアミノ酸が、所望の位置でタンパク質内に取り込まれ得る。無細胞系で、ＳｃＦｖ−毒素融合タンパク質の生産が成功している（ＮＩＣＨＯＬＬＳ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓＦｖ）−ｔｏｘｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ．ＪＢＣ １９９３，ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．５３０２−５３０８）。したがって、一実施態様では、本明細書に記載の結合メンバーまたは上記のＴ−ボディを生産する方法が提供され、それは、（ａ）無細胞系を提供するステップ、（ｂ）上記の結合メンバーまたは上記のＴ−ボディをコードする核酸産物テンプレートを提供するステップ、（ｃ）核酸産物テンプレートの転写および翻訳を可能にするステップ；（ｄ）回収するステップ；および場合により（ｅ）結合メンバーまたはＴ−ボディをそれぞれ精製するステップ、を含む。
追加的または代替的に、本明細書に記載の結合メンバーを生産する方法は、少なくとも１ステップの化学合成を含む。例えば、当該方法は、完全に化学的であってよい。別の実施態様では、細胞に基づく、または上述の無細胞の生産系は、そのような少なくとも１ステップの化学合成を含む。

【0176】

一部の実施態様では、本明細書に記載の結合メンバーは、Ｅ．ｃｏｌｉでの細胞内発現のための発現ベクターを用いた、細胞に基づく系で生産される。発現の際に、ポリペプチドは、宿主細胞内で封入体として生産され、さらなる細胞粒子から隔離され、その後、塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）などの変性剤で可溶化され、当業者によく知られた再生手順によりリフォールディングされる。

【0177】

また、所望の結合メンバーは、トランスジェニック動物において生産され得る。適切なトランスジェニック動物は、例えば、（ｉ）例えば、結合メンバーのコード配列ならびに適切なコントロール配列を含むＤＮＡ構築物を、卵にマイクロインジェクトすることにより、トランスジェニック胚を作製するステップ；（ｉｉ）卵を偽妊娠のレシピエント雌へ移すステップ；（ｉｉｉ）懐胎または妊娠を監視するステップ；および（ｉｖ）所望の抗体を発現している子孫を選択するステップ、を含む、標準的な方法により得てよい。

【0178】

上述の核酸、ベクター、宿主細胞および生産方法は、本明細書に記載のＴ−ボディおよび／または結合メンバー（タンパク質である限りにおいて）にも当てはまることが理解されるべきである。

【0179】

化学的および／または生物学的修飾
一態様では、本明細書に開示される結合メンバーは、化学的および／または生物学的に修飾される。そのような修飾は、制限されないが、グリコシル化、ペグ化、ＨＥＳ化、アルブミン融合技術、ＰＡＳ化、色素および／または放射性同位体による標識化、酵素および／または毒素によるコンジュゲート、リン酸化、ヒドロキシル化および／または硫酸化を含んでよい。同様に、上述の任意の結合メンバー、核酸配列、ベクターおよび／または宿主細胞をそれに応じて修飾することができる。

【0180】

化学的および／または生物学的修飾は、タンパク質の薬力学または水溶性を最適化するために、または、その副作用を低下させるために、行なわれ得る。例えば、ペグ化、ＰＡＳ化および／またはＨＥＳ化を適用して、腎クリアランスを遅くさせ、それにより結合メンバーの血漿半減期の時間を増大させ得る。追加的または代替的に、修飾は、タンパク質に、異なる機能、例えば、癌細胞とより効率的に闘う毒素、または診断目的のための検出分子を加え得る。

【0181】

グリコシル化は、炭水化物をタンパク質に付加するプロセスを指す。生体系では、このプロセスは、同時翻訳および／または翻訳後の修飾の形態として細胞内で酵素的に行われる。タンパク質は、ここでは、抗体のような結合メンバーであり、化学的にグリコシル化することもできる。典型的に、制限されないが、グリコシル化は、（ｉ）アスパラギンまたはアルギニン側鎖の窒素にＮ結合される；（ｉｉ）セリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキシリジン、またはヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシ酸素にＯ結合される；（ｉｉｉ）キシロース、フコース、マンノース、およびＮ−アセチルグルコサミンの、ホスホ−セリンに対する付着を含む；または（ｉｖ）Ｃ−マンノシル化の形態であり、ここで、マンノース糖は、特異的な認識配列に見られるトリプトファン残基に付加される。グリコシル化パターンは、例えば、適切な細胞株、培養培地、タンパク質工学製造モデルおよびプロセスストラテジー（ＨＯＳＳＬＥＲ，Ｐ．Ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｄ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００９，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．９，ｐ．９３６−９４９）を選択することにより制御することができる。

【0182】

グリコシル化パターンを制御または変更するためのタンパク質工学は、１つまたは複数のグリコシル化部位の欠失および／または付加を伴ってよい。グリコシル化部位の作製は、対応する酵素的認識配列を結合メンバーのアミノ酸配列へ導入することにより、または、上記に列挙したアミノ酸残基の１つまたは複数を付加または置換することにより、好適に達成することができる。

【0183】

結合メンバーをペグ化することが望ましくあり得る。ペグ化は、タンパク質の薬力学的および薬物動態的特性を変更し得る。適切な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、タンパク質主鎖に共有結合する（例えば、ＰＡＳＵＴ，Ｇ．ａｎｄ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｇｒｅａｔ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ ａｃｈｉｅｖｅｄ ａｆｔｅｒ ｆｏｒｔｙ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１２，ｖｏｌ．１６１，ｎｏ．２，ｐ．４６１−４７２を参照）。ペグ化は、ペグ化タンパク質を免疫系から守ることにより免疫原性をさらに低減させ得て、および／または、例えば、結合メンバーのインビボ安定性を増大させ、タンパク質分解性の分解から保護し、その半減期の時間を延長させることにより、および、その生体分布を変更させることにより、その薬物動態を変更し得る。

【0184】

同様の効果は、ペグ模倣物、例えば、抗体のＨＥＳ化またはＰＡＳ化により達成され得る。ＨＥＳ化は、ヒドロキシエチルスターチ（「ＨＥＳ」）誘導体を利用し、一方でＰＡＳ化の間、抗体は、アミノ酸プロリン、アラニンおよびセリンからなる立体構造的に乱れたポリペプチド配列に結合するようになる。これらのペグ模倣物および関連する化合物は、例えば、ＢＩＮＤＥＲ，Ｕ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＰＥＧ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ， ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｔｈｅｉｒ Ｐｌａｓｍａ Ｈａｌｆ−Ｌｉｖｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＫＯＮＴＥＲＭＡＮＮ，Ｒ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２０１２．ＩＳＢＮ：９７８３５２７３２８４９９．ｐ．６３−８１に記載される。

【0185】

結合メンバーは、サルベージ受容体結合エピトープのようなエピトープを含んでよい。そのようなサルベージ受容体結合エピトープは、典型的に、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指し、分子のインビボ半減期を増大する効果を有する。

【0186】

追加的または代替的に、結合メンバーは、標的結合の後の補助的な機能に帰する第二の部分により標識され、またはコンジュゲートされる。第二の部分は、例えば、追加の免疫学的エフェクター機能を有してよく、薬物ターゲッティングに効果的であってよく、または、検出に有用であってよいが、それらに限定されない。第二の部分は、例えば、当該分野で公知の方法を用いて、結合メンバーに対して化学的に結合または遺伝学的に融合することができる。

【0187】

第二の部分としての役割を果たし得る分子は、制限されずに、放射性核種（放射性同位体とも呼ばれる）、アポ酵素、酵素、コファクター、ペプチド部分、例えばヒス−タグ、タンパク質、炭水化物、例えばマンノース−６−リン酸タグ、フルオロフォア、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン、緑／青／赤または他の蛍光タンパク質、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、発色団、ビタミン、例えばビオチン、キレート剤、代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート、リポソーム、毒素、例えば細胞毒性剤、または放射性毒素を含む。放射性核種の例示的な例は、^３５Ｓ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、および^１２５Ｉである。適切な酵素の例は、限定されないが、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアンギオジェニンを含む。適切なタンパク質の例示的な例は、レクチンである。適切な細胞毒性剤の例は、限定されないが、タキソール、グラミシジンＤおよびコルヒチンを含む。

【0188】

標識化結合メンバーは、インビトロおよびインビボ検出または診断目的に特に有用である。例えば、適切な放射性同位体、酵素、フルオロフォアまたは発色団により標識された結合メンバーは、それぞれ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはフローサイトメトリーに基づく単一細胞分析（例えば、ＦＡＣＳ分析）により検出することができる。同様に、本明細書に開示される核酸および／またはベクターを、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてプローブとしてそれらの標識化フラグメントを用いることにより、検出または診断目的のために用いることができる。標識化プロトコルは、例えば、ＪＯＨＮＳＯＮ，Ｉ．ａｎｄ Ｓｐｅｎｃｅ，Ｍ．Ｔ．Ｚ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０１０．ＩＳＢＮ：０９８２９２７９１６に見られ得る。

【0189】

上記概説はＴ−ボディにも当てはまることが理解されるべきである。

【0190】

組成物
本明細書に開示される結合メンバー、核酸配列および／またはベクターは、適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む組成物において提供され得る。典型的な実施態様では、それぞれの組成物は、本明細書に記載の抗体を含む。

【0191】

そのような組成物は、例えば、診断、化粧または医薬組成物であることができる。治療または化粧用の目的については、組成物は、医薬用の担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物であり、すなわち、用いられる濃度および用量で毒性でない。

【0192】

適切な「担体」、「賦形剤」または「希釈剤」は、制限されずに：（ｉ）バッファー、例えばリン酸、クエン酸または他の有機酸；（ｉｉ）抗酸化、例えばアスコルビン酸およびトコフェロール；（ｉｉｉ）防腐剤、例えば３−ペンタノール、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、カテコール、またはシクロヘキサノール；（ｉｖ）アミノ酸、例えばヒスチジン、アルギニン；（ｖ）好ましくは１０残基までのペプチド、例えばポリリジン；（ｖｉ）タンパク質、例えば、ウシまたはヒト血清アルブミン；（ｖｉｉ）親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；（ｖｉｉｉ）グルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、アミノデキストランまたはポリアミドアミンを含む、単糖類、二糖類、多糖類および／または他の炭水化物；（ｉｘ）キレート剤、例えばＥＤＴＡ；（ｘ）塩形成イオン、例えばナトリウム；（ｘｉ）金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／または（ｘｉｉ）イオン性および非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

【0193】

例示的な化合物の多くは異なる機能を有し、例えば、担体および希釈剤として作用し得る。また、組成物は、担体、希釈剤または賦形剤のそれぞれを１つよりも多く含み得ることも理解される。

【0194】

結合メンバー、核酸配列またはベクターは、ビーズおよび微粒子のような固体支持体材料上に提供され得る。典型的に、結合メンバー分子は、共有結合（場合によりリンカーを含む）、非共有結合、または両方を介して、そのような担体に連結される。ビーズおよび微粒子は、例えば、スターチ、セルロース、ポリアクリレート、ポリラセテートポリグリコレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ラテックス、またはデキストランを含むことができる。

【0195】

一実施態様では、上述の結合メンバー、核酸配列またはベクターを含む医薬組成物が提供される。組成物は、１つまたは複数の追加の治療的に活性の化合物を治療的有効量でさらに含んでよい。追加の治療的に活性の化合物は、一部の実施態様では、ＴＮＦが介在する疾患に対して活性の化合物である。

【0196】

治療的適用
本明細書に記載の分子、具体的には、結合メンバー（抗体など）、核酸分子、またはベクターは、薬物として有用である。典型的に、そのような薬物は、治療的有効量の本明細書において提供される分子を含む。したがって、それぞれの分子は、ＴＮＦαが関連する疾患の１つまたは複数の治療に有用な薬物の生産のために用いることができる。

【0197】

一態様では、ＴＮＦαが関連する疾患を治療する方法が提供される。当該方法は、薬学的に有効量の本明細書に記載の分子（具体的には抗体）を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。一実施態様では、そのような薬学的に有効量の結合メンバー（抗体など）を含む上述の医薬組成物が、対象に投与される。上記に言及の薬物は、対象に投与され得る。

【0198】

治療を必要とする対象は、ヒトまたは非−ヒト動物であることができる。典型的に、対象は、哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、サル、類人猿、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、モルモットまたはブタである。典型的な実施態様では、対象は、ＴＮＦαが関連する疾患と診断され、または、そのような疾患を獲得し得る。動物モデルの場合、動物は、ＴＮＦαが関連する疾患を発症するように遺伝学的に操作してよい。動物モデルでは、動物は、ＴＮＦαが介在する疾患の特徴を示すような方法で遺伝学的に操作してもよい。

【0199】

様々なＴＮＦαが関連する疾患が知られていて、ＴＮＦαの拮抗薬が治療的効果を示している。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、増殖性糖尿病性網膜症である（ＬＩＭＢ ＧＡ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９９６ Ｆｅｂ；８０（２）：１６８−７３）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎および慢性痛風性関節炎の少なくとも１つである（ＴＡＵＳＣＨＥ ＡＫ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｖｅｒｅ ｇｏｕｔｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ：ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｓ ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｔｉｏｎ．Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ．２００４ Ｏｃｔ；６３（１０）：１３５１−２）。ＴＮＦαが関連する疾患は、一部の実施態様では、シュニッツラー症候群である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、全身性若年性特発性関節炎である（ＫＯＴＡＮＩＥＭＩ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄａｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｕｖｅｉｔｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１１；５：１４２５−９，Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｏｃｔ ３）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、関節リウマチである（ＰＡＲＡＭＥＳＷＡＲＡＮ，Ｎ．ａｎｄ ＰＡＩＡＬ Ｓ．Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−ａ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．２０１０；ｖｏｌ．２０（２），ｐｐ．８７−１０３）。また、ＴＮＦαが関連する疾患は、じんましんであってもよい（ＳＡＮＤ ＦＬ ａｎｄ ＴＨＯＭＳＥＮ ＳＦ．ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｕｒｔｉｃａｒｉａ：Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｉｎ ２０ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ（Ｃａｉｒｏ）．２０１３；２０１３：１３０９０５．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｓｅｐ １８）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、血管炎である（ＣＨＵＮＧ ＳＡ ａｎｄ ＳＥＯ Ｐ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００９ Ｊａｎ；２１（１）：３−９）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、１型糖尿病または２型糖尿病である。ＴＮＦαが関連する疾患は、一部の実施態様では、再発性多巣性骨髄炎である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、再発性多発性軟骨炎である（ＣＡＲＴＥＲ ＪＤ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｐｏｌｙｃｈｏｎｄｒｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ａ ＴＮＦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００５ Ｊｕｌ；３２（７）：１４１３）。ＴＮＦαが関連する疾患は、一部の実施態様では、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、ベーチェット病である（ＰＥＲＲＡ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｉｎ １９ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）．２０１２ Ｏｃｔ；５１（１０）：１８２５−３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊｕｎ ２０）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、家族性地中海熱である。また、ＴＮＦαが関連する疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）であってもよい。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、リウマチ性多発筋痛症である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＡＬＰ３）の１つまたは複数の突然変異に基づく。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、壊疽性膿皮症である（ＰＡＴＥＬ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｙｏｄｅｒｍａ Ｇａｎｇｒｅｎｏｓｕｍ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗ．Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２０１４ Ｎｏｖ １２）。ＴＮＦαが関連する疾患は、一部の実施態様では、慢性特発性じんましんである。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、乾癬である（例えば、ＣＯＲＤＯＲＯ，ＫＭ ａｎｄ ＦＬＥＤＭＡＮ ＳＲ．ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｓｋｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｌｅｔｔｅｒ ２００７，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．４−６を参照）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、変形性関節症である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、湿潤性加齢黄斑変性である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、ドライアイ症候群である。ＴＮＦαが関連する疾患は、一部の実施態様では、滑膜炎−座瘡−膿疱症−骨化過剰症−骨炎症候群である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、マクロファージ活性化症候群である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、周期熱である（Ｄｉ Ｇａｎｇｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄａｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｄ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｆｅｖｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｉｓｒ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ Ｊ．２０１４ Ｏｃｔ；１６（１０）：６０５−７）。ＴＮＦαが関連する疾患は、一部の実施態様では腺炎である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、咽頭炎、またはアフタ性潰瘍症候群である。ＴＮＦαが関連する疾患は、一部の実施態様では、成人発症スチル病である。また、ＴＮＦαが関連する疾患は、メバロン酸キナーゼ欠損症であってもよい。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、ブドウ膜炎である（ＫＯＴＡＮＩＥＭＩ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄａｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｕｖｅｉｔｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１１；５：１４２５−９．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｏｃｔ ３）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、炎症性腸疾患である（ＰＡＲＡＭＥＳＷＡＲＡＮ，Ｎ．ａｎｄ ＰＡＩＡＬ Ｓ．Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−ａ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．２０１０；ｖｏｌ．２０（２），ｐｐ．８７−１０３）。ＴＮＦαが関連する疾患は、一部の実施態様では、アテローム性動脈硬化症である（ＰＡＲＡＭＥＳＷＡＲＡＮ，Ｎ．ａｎｄ ＰＡＩＡＬ Ｓ．Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−ａ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．２０１０；ｖｏｌ．２０（２），ｐｐ．８７−１０３）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）である。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、強直性脊椎炎である（ＰＡＲＡＭＥＳＷＡＲＡＮ， Ｎ．ａｎｄ ＰＡＩＡＬ Ｓ．Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−ａ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．２０１０；ｖｏｌ．２０（２），ｐｐ．８７−１０３）。また、ＴＮＦαが関連する疾患は、汗腺膿瘍であってもよい（Ｂｒｕｎａｓｓｏ ＡＭ，Ｍａｓｓｏｎｅ Ｃ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖａ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ．Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２０１１，ｖｏｌ．９１（１），ｐｐ．７０；Ｓｏｔｉｒｉｏｕ Ｅ．ｅｔ ｌａ，Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖａ，Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２００９，ｖｏｌ．８９（１），ｐｐ．８２−８３）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、乾癬である（ＰＡＲＡＭＥＳＷＡＲＡＮ，Ｎ．ａｎｄ ＰＡＩＡＬ Ｓ． Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−ａ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．２０１０；ｖｏｌ．２０（２），ｐｐ．８７−１０３）。一部の実施態様では、ＴＮＦαが関連する疾患は、尋常性座蒼である。

【0200】

用語「ＣＡＰＳ」またはクリオピリン関連周期症候群は、家族性低温自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、マックル−ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、および、慢性乳児神経皮膚関節炎（ＣＩＮＣＡ）症候群としても知られる新生児期発症多臓器性炎症性疾患のそれぞれを含むことが理解されるべきである。

【0201】

医薬組成物は、１つまたは複数の様々な適切な投与経路により適用され得る。投与は、例えば、非経口的に行うことができる。一部の実施態様では、投与は、筋肉内に行なわれる。一部の実施態様では、投与は、ボーラスとして、または連続的な注入により、静脈内に行なわれる。投与は、一部の実施態様では、関節内に行なわれる。一部の実施態様では、投与は、関節滑液嚢内にされる。投与は、一部の実施態様では皮下であってよい。一部の実施態様では、投与は、局所的に、例えば、皮膚または眼に行なわれる。投与は、一部の実施態様では直腸に行なわれる。一部の実施態様では、投与は、皮膚、例えば、皮内、皮下または経皮的にされる。投与は、一部の実施態様では、局所的に行うことができる。投与のさらなる適切なモデルは、限定されないが、脳内、脳脊髄内、髄腔内、硬膜外、または腹腔内；経口；泌尿生殖器；硝子体内；全身性；静脈内；眼球内；耳内；鼻腔内；吸入により；舌下；口腔などを含む。局部、直腸、局所、鼻腔内、静脈内および／または皮内の投与経路が好ましい。

【0202】

本明細書に開示される結合メンバー、本明細書に開示される核酸配列、ベクターまたは宿主細胞は、１つまたは複数のさらなる治療的に効果的な化合物と組み合わせることができる。そのような化合物は、一部の実施態様では、ＴＮＦ−α受容体を介したシグナル伝達を妨害することが可能であり得る。それぞれの化合物は、一部の実施態様では、例えば炎症性反応の他のメディエータ―のような１つまたは複数の追加の標的を阻害することが可能であり得る。そのような化合物（単数または複数）は、同時に、または、連続して投与することができる。

【0203】

治療的適用のために、結合メンバーは、放射標識されてもよく、または毒素に連結されてもよく、または上述の別のエフェクター機能に連結されてもよい。

【0204】

上記に概説されるものは、Ｔ−ボディにも当てはまることが理解されるべきである。

【0205】

診断的適用および／または検出目的
本明細書に開示される結合メンバーは、インビボおよび／またはインビトロでの検出または診断目的のために用いてよい。例えば、特定の細胞または組織での発現を検出するための抗体を含む幅広い範囲の免疫測定法が、当業者に公知である。同様に、先行する文章に記載の任意の結合メンバー、核酸配列、ベクターおよび／または宿主細胞を、本セクションに詳述のとおりに用いることができる。

【0206】

そのような適用のために、結合メンバー、例えば、本明細書に開示される抗体、核酸配列、ベクターまたは宿主細胞は、検出可能な標識を含んでよい。一部の実施態様では、本明細書に開示される結合メンバー、核酸配列、ベクターまたは宿主細胞は、検出可能な標識を含まない。例示的な例としては、未標識抗体を用いられ得て、本明細書に記載の結合メンバー（例えば抗体）上のエピトープに特異的に結合する二次抗体により検出され得る。

【0207】

一部の実施態様では、結合メンバー、核酸配列、ベクターおよび／または宿主細胞は、デテクター物質により認識することのできる１つまたは複数の物質に結合される。例としては、結合メンバーは、ストレプトアビジンに対するその結合能により検出することのできるビオチンに共有結合され得る。同様に、本明細書に開示される核酸および／またはベクターは、例えば、ハイブリダイゼーション分析においてプローブとしてその標識フラグメントを用いることにより、検出または診断目的のために用いることができる。

【0208】

特定の実施態様では、本明細書において提供される任意の分子、具体的には抗体は、サンプル（好ましくは生物学的起源のサンプル）中のＴＮＦαの存在を検出するのに有用である。本文脈で用いられる用語「ＴＮＦα」は、全長ＴＮＦα、そのフラグメントおよび／またはその前駆体、すなわち膜貫通型ＴＮＦαおよび可溶型ＴＮＦαを含む。用語「検出する」は、定量的および／または定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的サンプルは、ヒト患者由来の細胞または組織を含む。生物学的サンプルの非限定の例は、血液、尿、脳脊髄液、バイオプシー、リンパ液および／または非血液組織を含む。

【0209】

特定の実施態様では、当該方法は、生物学的サンプルを、本明細書に記載のＴＮＦαに対する結合メンバー（抗−ＴＮＦα抗体など）と、存在する場合はその標的ＴＮＦαへの阻害剤の結合および阻害剤−標的複合体の検出を許容する条件下で、接触させるステップを含む。そのような方法は、インビトロまたはインビボ方法であってよい。一実施態様では、そのような結合メンバーは、例えば、ＴＮＦαが患者の選択のためのバイオマーカーである場合に、本明細書に記載の結合メンバーを用いた治療に適任の対象を選択するために用いられる。同様に、結合メンバーの代わりに、そのような方法は、本明細書に記載のＴ−ボディの使用を伴ってよい。

【0210】

別の態様では、結合メンバー、例えば抗体は、化粧適用において、例えば、皮膚の審美的外観を改善するために用いられる。

【0211】

同様に、上述のＴ−ボディ、核酸配列、ベクターおよび／または宿主細胞は、上記に詳述したとおりに用いることができる。

【0212】

製品
さらなる態様では、製品（すなわち、キット）が提供される。製品は、（ｉ）ＴＮＦαが関連する疾患の治療、予防、または（ｏｆ）、進行遅延；（ｉｉ）診断または（ｏｆ）（ｉｉｉ）化粧目的、に有用な物（材料など）を含む。製品は、使用のための説明書および１つまたは複数の容器を含んでよい。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、カートリッジ、プレートおよび試験管を含み、様々な材料のようなガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から作られてよい。少なくとも１つの容器は、本明細書に開示される結合メンバーを含む組成物を保持する。容器は、滅菌アクセスポートを有してよい。それぞれの容器は、典型的にラベルされる。

【0213】

試薬は、典型的に、所定量の乾燥粉末で提供され、通常は凍結乾燥され、溶解後に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む。他の添加剤、例えば安定剤および／またはバッファーを含んでもよい。結合メンバーが酵素により標識される場合、キットは典型的に、準じた（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ）基質および補助因子を含む。

【0214】

使用のための説明書は、組成物が、選択された疾患の治療、予防および／または進行遅延のために用いられる指示；または、検出または診断アッセイを行なうための教示を提供し得る。教示は、ラベルにおよび／または添付文書上に提供され得る。

【0215】

参照配列
本明細書に開示される配列は：
配列番号１−ｓｃＦｖ１のＶＬ
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＳＹＹＹＴＳＮＮＳＤＧＦＷＡＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ
配列番号２−ｓｃＦｖ１のＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＩＤＦＳＮＳＧＩＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＹＩＹＰＧＦＧＩＲＮＹＡＮＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＩＹＡＳＳＳＧＹＡＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３−ｓｃＦｖ１のＣＤＲ−Ｌ１
ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ
配列番号４−ｓｃＦｖ１のＣＤＲ−Ｌ２
ＷＡＳＴＬＡＳ
配列番号５−ｓｃＦｖ１のＣＤＲ−Ｌ３
ＱＳＹＹＹＴＳＮＮＳＤＧＦＷＡ
配列番号６−ｓｃＦｖ１のＣＤＲ−Ｈ１
ＩＤＦＳＮＳＧＩＴ
配列番号７−ｓｃＦｖ１のＣＤＲ−Ｈ２
ＹＩＹＰＧＦＧＩＲＮＹＡＮＳＶＲＧ
配列番号８−ｓｃＦｖ１のＣＤＲ−Ｈ３
ＤＰＩＹＡＳＳＳＧＹＡＤＩ
配列番号９−ｓｃＦｖ１
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＳＹＹＹＴＳＮＮＳＤＧＦＷＡＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＩＤＦＳＮＳＧＩＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＹＩＹＰＧＦＧＩＲＮＹＡＮＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＩＹＡＳＳＳＧＹＡＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１０−リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１１−ＤＬＸ１０５
ＭＡＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＬＴＣＴＡＳＱＳＶＳＮＤＶＶＷＹＱＱＲＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＦＮＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＲＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＤＹＮＳＰＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＶＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＴＡＳＧＹＴＦＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＫＦＫＤＲＦＴＦＳＬＥＴＳＡＳＴＶＹＭＥＬＴＳＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＧＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0216】

以下は例であり、本明細書に開示される方法および組成物を例示する。上記に提供される概要を考慮に入れれば、様々な他の実施態様が実施され得ることが理解されよう。

【実施例】

【0217】

実施例１−ＴＮＦα中和ｓｃＦｖの同定
ウサギの免疫化：ウサギを、組み換えヒト（ｒｈ）ＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ、カタログ番号３００−０１Ａ）で免疫化した。最終ブースト後にリンパ節を抽出し、細胞を凍結保存した。

【0218】

ウサギＢ細胞のフローサイトメトリーソーティングおよび培養：ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＴＮＦα−特異的なメモリーＢ細胞を、９６ウェルマイクロプレートに単一細胞としてソーティングした。フィーダー細胞および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有馴化培地の存在下で、単一Ｂ細胞クローンを培養した。

【0219】

合計で、３１５０個の単一Ｂ細胞クローンをソーティングし、培養し、そして、抗−ＴＮＦα−特異的なＩｇＧの存在について、細胞培養上清をＥＬＩＳＡにより分析した。手短には、ｒｈＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，カタログ番号３００−０１Ａ）を、２ｍｃｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一晩、ＰＢＳ中、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート上にコーティングした。５％脱脂粉乳でブロック後、細胞培養上清を添加した。ＴＮＦα−特異的なＩｇＧを、抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，カタログ番号４０５０−０５）により検出した。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＥＬＩＳＡを展開した。合わせて５６６個の、選択されたＴＮＦα−特異的なＩｇＧ産生Ｂ細胞クローンが同定され、ＰＫ−１５細胞アッセイにおいて、ＩｇＧ抗体をそれらの中和能についてさらに分析した。２００個の、ＩｇＧ−産生Ｂ細胞クローンが、ｒｈＴＮＦαの細胞毒性活性を中和することが見いだされた。

【0220】

ＴＮＦα−中和ＩｇＧのシーケンシング：中和抗−ＴＮＦα ＩｇＧ抗体を産生する全てのウサギＢ細胞クローンを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号７４１０６）を用いてｍＲＮＡ単離に供した。製造元のプロトコル（ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号２１０２１２）に従って、逆転写のテンプレートとしてｍＲＮＡを用いた。続いて、ウサギＩｇＧ重鎖および軽鎖をコードする配列を特異的に増幅するための、オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応を行なった（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ Ｔ３）。重鎖および軽鎖ＰＣＲフラグメントを、独立にシーケンスして（ＡＢＩ，Ｓａｎｇｅｒ ３７３０ｘｌ；Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、得られたヌクレオチド配列を、ＥＭＢＯＳＳ Ｔｒａｎｓｅｑ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／）を用いてアミノ酸配列に翻訳し、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）を用いて並べた。

【0221】

抗−ＴＮＦα ｓｃＦｖ遺伝子の構築およびｓｃＦｖタンパク質発現：上記に定義した可変軽鎖および可変重鎖のウサギＩｇＧ ＣＤＲ領域を同定して、ヒト軽鎖および重鎖アクセプターフレームワークへ移植した。一部では、点突然変異が導入された。配列番号１０の配列によりＣ末可変重鎖に連結したＮ末可変軽鎖を有するｓｃＦｖタンパク質をコードする細菌性発現ベクターが生産された。ＳｃＦｖタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）；Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ、カタログ番号６９４５０−３）内で封入体として発現され、精製され、可溶化され、そして、タンパク質はリフォールディングされた。リフォールディングされたｓｃＦｖを、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製して、およそ２６ｋＤａに相当する単量体ピーク画分を回収した。精製されたｓｃＦｖを、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦα結合に関して分析した。ＳｃＦｖをさらに評価して、ＰＫ−１５細胞アッセイにおいてＴＮＦα中和能を決定した。この手順により、７２個の試験されたｓｃＦｖのうち、５個のＴＮＦα−特異的ｓｃＦｖが、ヒトＴＮＦαの強力な阻害剤として同定された。

【0222】

実施例２−ヒト可溶型および膜貫通型ＴＮＦαの結合
まず、ＴＮＦαの特異的認識をＥＬＩＳＡにより確認した（図１）。手短には、ｒｈＴＮＦαを、２ｍｃｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳ中で、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート上に４℃で一晩コーティングした。５％脱脂粉乳でブロッキングした後、増加する濃度の全ての５個の事前選択されたｓｃＦｖ（１０〜３０００ｎｇ／ｍＬ）を加えて、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ｐ３２２６）によりｓｃＦｖを検出した。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＥＬＩＳＡを展開した。ＴＮＦα−特異的ｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５を、ポジティブコントロールとして用いた。しかしながら、ＣＤＲは同じである。ＤＬＸ１０８４（特異性が無関係のｓｃＦｖ）を、ネガティブコントロールとして用いた。図１Ａは、ｓｃＦｖ１が、ｒｈＴＮＦαに特異的に結合することを示す。全てのｓｃＦｖは、マイクロプレート上に直接固定化した場合、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ−ＨＲＰにより認識された（図１Ｂ）。このことは、（ｉ）ｓｃＦｖが正しくリフォールディングされたこと、（ｉｉ）コントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０８４は、ｒｈＴＮＦαに結合しなかったことを示し、および、（ｉｉｉ）同定されたｓｃＦｖ１は、ｒｈＴＮＦαに特異的であることを証明する。

【0223】

天然に生産されるヒトＴＮＦαの認識を、サンドウィッチＥＬＩＳＡにより評価した。ヒトＴＮＦαの天然型は、ヒトＴＨＰ−１単球細胞株（ＤＳＭＺ Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号ＡＣＣ １６）から得た。ＴＨＰ−１細胞を６ウェル組織培養プレートで培養し、１０ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ１５８５）を用いて６時間刺激し、続いて、１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｌ４３９１）を用いて３７℃で１６時間刺激した。細胞上清を回収して、ヒトＴＮＦα／ＴＮＦＳＦ１Ａ ＥＬＩＳＡ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ２１０）を用いて、分泌されたＴＮＦαを定量した。ｓｃＦｖサンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、５ｍｃｇ／ｍＬで９６ウェルマイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）上に固定化した。ブロッキングおよび洗浄後、ヒトＴＮＦαの天然型または組み換えで発現したヒトＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，カタログ番号３００−０１Ａ）を、５ｎｇ／ｍＬの終濃度でアプライした。ビオチン化ポリクローナル抗−ＴＮＦα抗体およびストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カタログ番号５５４０６０）を用いて、結合したＴＮＦαを検出した。全ての５個の選択されたｓｃＦｖは、ｒｈＴＮＦαおよび天然型ヒトＴＮＦαの両方に等しく良好に結合する。

【0224】

膜貫通型ＴＮＦαの認識：膜に結合したままの、ヒトＴＮＦαのΔ１−１２変異体を発現するＣＨＯ細胞を、５個の選択したｓｃＦｖまたはコントロールｓｃＦｖで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。細胞を、増加する量のｓｃＦｖとともにインキュベートし、結合したｓｃＦｖを、ビオチン化タンパク質Ｌを用いて、その後にＰＥ−標識ストレプトアビジンで染色して、検出した。ｓｃＦｖ１を含む全ての５個のｓｃＦｖサンプルは、ｔｍＴＮＦαに効率的に結合し、一方で、ネガティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０８４は、ｔｍＴＮＦαに結合しなかった。ｓｃＦｖ１およびネガティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０８４に関するフローサイトメトリーヒストグラムを図４Ａに示す。

【0225】

実施例３−可溶型および膜貫通ヒトＴＮＦαの中和
抗体全長およびｓｃＦｖを、ＰＫ−１５細胞アッセイにおいて、それらのＴＮＦα中和能について試験した（ブタ腎臓上皮細胞、ＤＳＭＺ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号ＡＣＣ６４０）。ポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５ならびに市販の抗体（インフリキシマブ、ゴリムマブおよびアダリムマブ）を比較に用いた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いて、ＴＮＦα−特異的ｓｃＦｖに関するＩＣ_５０値を決定した。このアッセイでは、発光シグナルの発生は、存在するＡＴＰ量に比例し、それは、培養中に存在する生細胞の数に直接比例する。手短には、ｒｈＴＮＦαの可溶型（１．４ｐＭ）を、増加する濃度のｓｃＦｖ（２００ｐｇ／ｍＬ〜３ｍｃｇ／ｍＬ）とともに事前インキュベートし、ＰＫ−１５細胞に添加した（１０．０００／ウェル）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ７５７２）を、製造元の指示に従って用いた。発光を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）９６ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ上で測定した。阻害曲線をプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア、バージョン６．０４を用いてＩＣ_５０値を計算した。ｓｃＦｖ１は、３０±６ｐＭのＩＣ_５０でｒｈＴＮＦαの細胞毒性を効率的にブロックし、一方で、一価ポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５（２６０±３４ｐＭ）に関するＩＣ_５０値は、有意により高かった（図２、表１）。ＳｃＦｖ２〜５は、２５ｐＭ〜４０ｐＭの範囲のＩＣ_５０値でｒｈＴＮＦαの細胞毒性活性を強く阻害した。全ての５個の一価ｓｃＦｖに関するＩＣ_５０値は、市販の二価抗体インフリキシマブ、アダリムマブおよびゴリムマブのものと同程度であった（図３）。

【0226】

実施例２では、全ての選択されたｓｃＦｖが、ＴＮＦαの膜貫通型に結合することが示されている。ｓｃＦｖがｔｍＴＮＦαの生物学的活性を中和するかどうかを調べるために、ＨＥＫ−Ｄｕａｌ ＴＮＦα−感受性細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，カタログ番号ｈｋｄ−ｔｎｆａ）に対するｔｍＴＮＦαの細胞毒性作用を利用した。ＨＥＫ−Ｄｕａｌ ＴＮＦα−感受性細胞は、ＮＦ−ｋＢ活性化を評価することによってＴＮＦαの生物活性をモニターするように設計した。細胞を、２つのＮＦ−ｋＢ−誘導性レポーター構築物の安定した共トランスフェクションにより、ヒト胚腎臓２９３細胞から取得した。結果として、ＨＥＫ−Ｄｕａｌ ＴＮＦα−感受性細胞は、ＴＮＦαにより誘導されるＮＦ−ｋＢ活性化に応答して、ルシフェラーゼおよび胚アルカリフォスファターゼを分泌する。両方のレポーター遺伝子産物は、Ｑｕａｎｔｉ−Ｌｕｃ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，カタログ番号ｒｅｐ−ｑｌｃ１）およびＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，カタログ番号ｒｅｐ−ｑｂ１）を用いて、細胞培養上清において測定される。ｔｍＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞を、５％のＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩ １６４０中、９６ウェルの平底マイクロプレートに１０’０００細胞／ウェルでプレーティングした。ｓｃＦｖ１、ポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５またはネガティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０８４の段階希釈（１０〜３００ｎＭ）を、３７℃で２０分間、ｔｍＴＮＦα−発現ＣＨＯ細胞とともにインキュベートした。それから、ＨＥＫ−ｄｕａｌ細胞を２０’０００細胞／ウェルで加えて、３７℃で２４時間、共インキュベートした。生じた細胞培養上清を用いて、ルシフェラーゼおよび分泌された胚アルカリフォスファターゼの活性を測定した。阻害曲線をプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア、バージョン６．０４を用いてＩＣ_５０値を計算した。５個の選択されたｓｃＦｖは、１０ｎＭ〜５０ｎＭの範囲のＩＣ_５０値で膜貫通型ＴＮＦαの活性を阻害し、ｓｃＦｖ５が最も高いＩＣ_５０値であった。ｓｃＦｖ１およびポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５は、ｔｍＴＮＦαの活性を、それぞれ５０ｎＭおよび３２ｎＭのＩＣ_５０で阻害した（図４Ｂ、表１）。同様の結果が、Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅを用いてアルカリフォスファターゼ活性を測定した場合に得られた。したがって、これらの実験的条件下では、４００ｎＭのｓｃＦｖ１は、ｔｍＴＮＦα活性の５０％を阻害した。

【0227】

【表1】

【0228】

実施例４−ｓｃＦｖの種およびＴＮＦαファミリー交差反応性
人類以外の種のＴＮＦαホモログに対する５個の選択されたｓｃＦｖの交差反応性プロファイルを、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。以下の組み換えで発現されたＴＮＦαタンパク質を調べた：アカゲザル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ，カタログ番号１０７０−ＲＭ−０２５／ＣＦ）、カニクイザル（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号９００１８ ＣＮＡＥ）、イヌ科（Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ，カタログ番号ＲＰ０２６１Ｄ−０２５）およびネコ科（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号、２５８６ＦＴＣＦ）、ウサギ（Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号ＲＰ０４２９Ｕ）、ラット（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，カタログ番号４００−１４）ミューリン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，カタログ番号３１５−０１Ａ）、モルモット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号５０３５−ＴＧ−０２５／ＣＦ）、ブタ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号６９０−ＰＴ−０２５／ＣＦ）。手短には、タンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート上で、４℃で一晩、２ｍｃｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。５％脱脂粉乳でのブロッキング後、増加する濃度のｓｃＦｖ（０．１、０．３および１．０ｍｃｇ／ｍＬ）をウェルに加えた。全てのタンパク質の成功したコーティングを、ＴＮＦα−特異的コントロール抗体を用いて個々に確認した。ｓｃＦｖ１はＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ，カタログ番号Ｐ３２２６）により検出され、一方で、全長ＩｇＧコントロール抗体は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡ，カタログ番号５５４０６０）、または、ＨＲＰで標識された他の適任の二次抗体のいずれによって検出された。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＥＬＩＳＡを展開し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。ｓｃＦｖ１〜５の交差反応性を、ｓｃＦｖ ＤＬＸ２４８１と比較した。ＤＬＸ２４８１は、ＷＯ２００９／１５５７２３に記載されるＥＰ−３４ ｓｃＦｖの変異であり（ＥＳＢＡＴｅｃｈ，Ａｌｃｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｎｉｔ ＬＬＣ）、いくつかの点突然変異をフレームワーク領域内に含む。ｓｃＦｖ１、ｓｃＦｖ３およびｓｃＦｖ４は、ＴＮＦαの５種のオルソログ、すなわち、ヒト、アカゲザル、カニクイザル、ネコ科およびイヌ科のＴＮＦαタンパク質を特異的に認識した。ｓｃＦｖ２は、ｒｈＴＮＦαを特異的に認識したが、他の試験された種のいずれとも相互反応しなかった。ｓｃＦｖ ＤＬＸ２４８１は、組み換えヒトＴＮＦαのみを認識した。さらに、ＴＮＦファミリーメンバーに対するｓｃＦｖ１の交差反応性を、コーティングした組み換えヒトリンホトキシンα２／β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ，カタログ番号６７９−ＴＸ−０１０／ＣＦ）、組み換えヒトリンホトキシンα１／β２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号６７８−ＬＹ−０１０／ＣＦ）、組み換えヒトＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号６４２０−ＣＬ−０２５／ＣＦ）および組み換えヒトＴＮＦβ／ＴＮＦＳＦ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号２１１−ＴＢ−０１０／ＣＦ）を用いて、直接ＥＬＩＳＡにより測定した。ｓｃＦｖ１は、４０ｎＭの濃度まで、これらのＴＮＦファミリータンパク質と相互作用しなかった。

【0229】

実施例５−ｓｃＦｖの安定性
ｓｃＦｖの安定性に影響し得る２つの異なるプロセスを見ることができる。第一に、ｓｃＦｖは、ダイマー化する傾向があり得て、オリゴマー化およびさらなる凝集および沈殿が続くことが多い。第二に、より小さなフラグメントへ導くｓｃＦｖ分解が経時的に生じ得る。

【0230】

ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に処方された５個の選択されたｓｃＦｖの、異なる温度条件で保管した際の安定性を調べた。ｓｃＦｖを、１．５ｍＬポリプロピレンチューブ中、４℃、２２℃、３７℃および−２０℃で、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で保管した。所定の時点で、各サンプルを目視検証し、タンパク質濃度を２８０ｎｍで測定した。ｓｃＦｖ３および４は、４℃および３７℃で、１週間のインキュベーション後、より低い安定性を示したが、目に見えるタンパク質沈殿および有意なタンパク質損失は、ｓｃＦｖ１に関して観察されなかった。サンプルをＳＥ−ＨＰＬＣにより分析して、合計ピーク面積に関してモノマー、ダイマーおよび高分子量オリゴマーのレベル（％）を決定した：ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＷＸＬカラム、相ジオール、Ｌ×Ｉ．Ｄ．３０ｃｍ×７．８ｍｍ、５μｍ粒子サイズ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号０８５４０）を用いた。５μＬのｓｃＦｖ１（１ｍｇ／ｍＬ）をロードした。移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）を選択した。

【0231】

ＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、上述の実験条件において、検出可能な低分子量分解産物を示さなかった。４℃、２２℃および−２０℃で４週間保管した際、ｓｃＦｖ１の有意なダイマー化は見られなかった。ｓｃＦｖ１は、３７℃での１、２、３または４週の保管後に、それぞれ、２．６１％、６．０９％、８．７５％および１１．０２％までのダイマーを形成し（表２）、３７℃で３および４週間保管の際に、高分子量分子はほんの少量のみ見られた。

【0232】

【表2】

【0233】

安定性測定は、ｓｃＦｖ１に関して６ヶ月まで延長された。４℃で６ヶ月後、ｓｃＦｖ１調製物は９１．１７％のモノマーを含んでいた。

【0234】

また、ｓｃＦｖ１の熱安定性を示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）により評価した。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に処方された０．５４ｍｇ／ｍＬでのｓｃＦｖ１は、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２０×ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ｓ５６９２，５０００ｘ）の存在下で、リアルタイムＰＣＲデバイス（Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ）において、１℃／５秒の走査速度で３０℃から９５℃に加熱された。グラジエントのランの間、蛍光値を測定した（励起波長４７０ｎｍ；発光波長５５５ｎｍ）。Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ６０００ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １．７．を用いて計算したｓｃＦｖ１の融解温度（Ｔｍ）の中間点は、ｓｃＦｖ１に関して７６．０℃であった。

【0235】

タンパク性の生物製剤は、製造、保管および輸送の間、凍結／解凍ストレスに曝されるようになり得て、それは、凝集および分解を生じさせ得る。凍結／解凍サイクルの間のｓｃＦｖ１の安定性を評価するために、１．５ｍＬポリプロピレンチューブ内に、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１０ｍｇ／ｍＬで処方した。バイアルを液体窒素中に５分間沈めた。解凍のために、それらを室温で１０分間、水浴中でインキュベートした。１、３、５、７または１０回の凍結／解凍サイクルを行なって、上述のようにＳＥ−ＨＰＬＣによりサンプルを分析した。実質的に１００％のｓｃＦｖ１が、１０回の凍結／解凍サイクル後に単量体のままであり、タンパク質損失または沈殿は見られなかった。

【0236】

さらなる特性化のために、ｓｃＦｖ１を、その極めて優れた安定性パラメーター、その高い能力およびその幅広い交差反応性スペクトルに起因して、５個の事前選択されたｓｃＦｖのプールから選択した。

【0237】

実施例６−９０％ヒト血清における安定性
５個のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１〜５）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。ｓｃＦｖのアリコートをヒト血清（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｈ４５２２）に添加して、９０％ｖ／ｖヒト血清中１０ｍｃｇ／ｍＬの終濃度を与えた。並行して、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）中にｓｃＦｖを希釈した。サンプルを、４℃および３７℃で、１、４および２０時間インキュベートした。サンプルのＴＮＦα結合能を、実施例２に記載の固定化ＴＮＦαを用いた直接ＥＬＩＳＡにより測定した。血清曝露ｓｃＦｖ１を、増加する濃度（２０〜５００ｎｇ／ｍＬ）で試験して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ−ＨＲＰにより検出した。結果は、３７℃でのヒト血清に対する２０時間曝露が、ｓｃＦｖ１、およびｓｃＦｖ２〜５の、ＴＮＦα結合能を有意に変えなかったことを示す。

【0238】

実施例７−ｓｃＦｖの溶解度
５個の選択されたｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１〜５）を精製して、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）（リン酸緩衝生理食塩水１×、Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ，カタログ番号２００１２）中に保管した。ｓｃＦｖ１を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０遠心分離濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ，カタログ番号ＶＳ２００１）を用いて室温で５０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、目視および分析的ＨＰＬＣ（カラムＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ ＳＷＸＬ，カタログ番号０８５４０）により分析した。ｓｃＦｖ１の生じた溶液は透明であり、いかなる沈殿物もなく、タンパク質の１００％が単量体であった。したがって、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中のｓｃＦｖ１の溶解度は≧５０ｍｇ／ｍＬである。

【0239】

実施例８−アカゲザル、カニクイザルおよびイヌ科ＴＮＦαの中和
ＳｃＦｖ１を、上述のＰＫ−１５細胞に対する、アカゲザル、カニクイザルおよびイヌ科ＴＮＦαタンパク質の細胞毒性活性の阻害に関して評価した。ｓｃＦｖ１の段階希釈を、５０ｐｇ／ｍＬの組み換えアカゲザル、カニクイザルまたはイヌ科のＴＮＦαタンパク質とともに事前インキュベートした。混合物をＰＫ−１５細胞に加え、さらにインキュベートして、実施例３に記載のとおりに分析した。ＳｃＦｖ１は、アカゲザル、カニクイザルおよびイヌ科ＴＮＦαタンパク質を非常に強く中和した。

【0240】

実施例９−インビボの効能
ｓｃＦｖ１がインビボでヒトＴＮＦαの生物学的活性を阻害する能力を、Ｔｇ１２７８ＴＮＦ−ｋｏマウス（隣接領域を有する完全なヒトＴＮＦα遺伝子をコードする導入遺伝子を含むマウス株）を使って示した。これらのマウスは、マウスＴＮＦαの不存在下では正常に調節されたヒトＴＮＦαを発現し、見かけ上の病理がなく正常な発達を示す。

【0241】

グラム陰性細菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）に対するマウスの感受性は、ＬＰＳの致死効果に対する感受性を１００’０００倍増加させる肝毒性物質であるＤ−ガラクトサミン（Ｄ−ｇａｌ）を用いた処置によって増大する。Ｄ−ｇａｌの効果は、もっぱら肝細胞に制限され、そこで、ＲＮＡおよびタンパク質の生合成不全をもたらすウラシルヌクレオチドの枯渇を生じさせる。マウスにおけるＬＰＳ／Ｄ−ｇａｌ投与は、主にＴＮＦ受容体１を介したＴＮＦαシグナル伝達から生じる肝細胞の蔓延したアポトーシス死により特徴付けられる劇症肝損傷に起因して、４８時間内に観察される一貫した死亡率を導く。中和抗−ＴＮＦα抗体を用いたマウスの処置は、ＬＰＳ／Ｄ−ｇａｌ肝臓毒性の致死効果からそれらを保護する。

【0242】

ＳｃＦｖ１およびポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５を、１０．０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、８〜９週齢ｈＴＮＦαトランスジェニックマウスに、ＬＰＳ／Ｄ−Ｇａｌ（１０ｎｇ／投与量のＬＰＳ、２０ｍｇ／投与量のＤ−ｇａｌ）を用いたｉ．ｐ．チャレンジの１時間前および１時間後に、２回腹腔内投与した。ＬＰＳ／Ｄ−ｇａｌチャレンジの２時間後、血液サンプルを採取し、マウスＩＬ−６の血清レベルを、製造元の指示に従ってＭｏｕｓｅ ＩＬ−６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＤＹ４０６）を用いて測定した。ネガティブコントロール群は、特異性が無関係のｓｃＦｖ（ネガティブコントロールｓｃＦｖ）を用いて、１０ｍｇ／ｋｇ投与量で、２回腹腔内に処置した。ｓｃＦｖ１およびポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５は、ＬＰＳ／Ｄ−ｇａｌ−チャレンジマウスを効率的に保護し、一方で、ネガティブコントロールｓｃＦｖは保護しなかった（表４）。したがって、マウス血清ＩＬ−６レベルは、ｓｃＦｖ１およびポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５によって有意に阻害され、一方で、ネガティブコントロールｓｃＦｖは、マウス血清ＩＬ−６を阻害しなかった（表４）。

【0243】

表４は、ｓｃＦｖ１、ポジティブコントロールｓｃＦｖ ＤＬＸ１０５およびネガティブコントロールｓｃＦｖの保護効果を示す。マウスの生存率（％）、およびマウスＩＬ−６の血清レベルを、平均値（ｐｇ／ｍＬ）（標準偏差を含む）として示す。

【0244】

【表3】

【0245】

本発明の現在のところ好ましい実施態様が示され説明されているが、本発明は、それに制限されないが、以下の特許請求の範囲内で、他の方法でさまざまに具現化され実施され得ることが理解されるべきである。本発明の非常に多くの改変および代替の実施態様が当業者に容易に明らかであるので、この説明は、例示のみであると解釈されるべきであり、本発明を実施するためのベストモードを当業者に教示する目的のためである。したがって、全ての適切な改変および同等物は、以下の特許請求の範囲内であると考えられ得る。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]