特許 6840189 ヒト免疫不全ウイルス阻害のための二重ベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6840189

(24)【登録日】2021年2月18日

(45)【発行日】2021年3月10日

(54)【発明の名称】ヒト免疫不全ウイルス阻害のための二重ベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20210301BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20210301BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20210301BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20210301BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20210301BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20210301BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20210301BHJP

   C12N 5/078 20100101ALN20210301BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/867 ZZNA

   A61K31/7088

   A61K35/17 Z

   A61K35/28

   A61K35/76

   A61K38/16

   A61K48/00

   A61P31/18

   C12N5/10

   C12N15/113 102Z

   !C12N5/078

【請求項の数】19

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2019-89588(P2019-89588)

(22)【出願日】2019年5月10日

(62)【分割の表示】特願2017-220978(P2017-220978)の分割

【原出願日】2010年5月26日

(65)【公開番号】特開2019-122413(P2019-122413A)

(43)【公開日】2019年7月25日

【審査請求日】2019年5月14日

(31)【優先権主張番号】61/225,687

(32)【優先日】2009年7月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/287,599

(32)【優先日】2009年12月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512010890

【氏名又は名称】シーエスエル ベーリング ジーン セラピー インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】チェン イルビン

(72)【発明者】

【氏名】アン ドン サン

(72)【発明者】

【氏名】ミリントン ミシェル

(72)【発明者】

【氏名】ボイド モーリーン

(72)【発明者】

【氏名】シモンズ ジェフリー ピー．

(72)【発明者】

【氏名】ブレトン ルイ ランドール

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 Genetic Vaccines and Therapy，２００９年 ６月１０日，Vol.7:8，pp.1-11，(Online published) <URL: http://www.gvt-journal.com/content/7/1/8>

【文献】 Molecular Therapy，２００８年，Vol.16, No.1，pp.46-51，(published online 23 October 2007)

【文献】 Molecular Therapy，２００５年，Vol.12, No.4，pp.687-696

【文献】 Molecular Therapy，２００５年，Vol.11，pp.S387, No.1001

【文献】 Gene Therapy，２００４年，Vol.11，pp.1627-1637

【文献】 Journal of Virology，２００１年，Vol.75, No.6，pp.3038-3042

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

レンチウイルス発現ベクターを造血細胞に形質導入することにより調製された宿主細胞であって、
該レンチウイルス発現ベクターが、ＨＩＶ ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４共受容体の発現を低減することができる阻害核酸をコードする第１の核酸配列と、ＨＩＶ融合阻害物質タンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含み、
前記第１の核酸配列が、第１のプロモーターと機能的に連結され、前記第２の核酸配列が、第２のプロモーターと機能的に連結され、かつ、
前記第１のプロモーターが、Ｈ１プロモーターである、
宿主細胞。

【請求項2】

前記第２のプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項１記載の宿主細胞。

【請求項3】

前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、ユビキチンＣ ｐｏｌ ＩＩプロモーターである、請求項２記載の宿主細胞。

【請求項4】

前記阻害核酸が、配列番号１の配列を有する、請求項１記載の宿主細胞。

【請求項5】

前記第２の核酸配列が、Ｃ４６をコードし、前記宿主細胞が、膜に固定されたＣ４６タンパク質を発現する、請求項１記載の宿主細胞。

【請求項6】

前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が、約２：１〜約１０：１の範囲の比率で発現される、請求項１記載の宿主細胞。

【請求項7】

前記比率が、約２：１〜約５：１の範囲である、請求項６記載の宿主細胞。

【請求項8】

ＨＩＶ複製の阻害剤をコードする第３の核酸配列をさらに含む、請求項１記載の宿主細胞。

【請求項9】

前記ＨＩＶ複製の阻害剤が、ヒトＴＲＩＭ５α、アカゲザルＴＲＩＭ５α、キメラＴＲＩＭ５α、ヒトＴＲＩＭ５-シクロフィリン融合タンパク質、シクロフィリン、Ｅ３ユビキチン、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、および骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ - ２）からなる群から選択される、請求項８記載の宿主細胞。

【請求項10】

前記第３の核酸配列が、第３のプロモーターに機能的に連結されている、請求項８記載の宿主細胞。

【請求項11】

前記造血細胞が、造血前駆細胞／幹細胞（ＨＰＳＣ）、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球、または単球／マクロファージである、請求項１記載の宿主細胞。

【請求項12】

ＨＩＶに感染した患者、またはＨＩＶ感染の危険性がある患者の治療に用いるための、請求項１〜１１のいずれか一項記載の宿主細胞。

【請求項13】

請求項１〜１１のいずれか一項記載の宿主細胞、および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む薬学的組成物。

【請求項14】

ＨＩＶに感染した患者、またはＨＩＶ感染の危険性がある患者の治療に用いるための、請求項１３記載の薬学的組成物。

【請求項15】

ＨＩＶ ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４共受容体の発現を低減することができる阻害核酸をコードする第１の核酸配列と、ＨＩＶ融合阻害物質タンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含むレンチウイルス発現ベクターであって、該第１の核酸配列が第１のプロモーターと機能的に連結され、該第２の核酸配列が第２のプロモーターと機能的に連結され、かつ、該第１のプロモーターがＨ１プロモーターである、レンチウイルス発現ベクター。

【請求項16】

前記融合阻害物質タンパク質が、Ｃ４６である、請求項１５記載のレンチウイルス発現ベクター。

【請求項17】

前記第２のプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項１５記載のレンチウイルス発現ベクター。

【請求項18】

請求項１５〜１７のいずれか一項記載のレンチウイルス発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。

【請求項19】

ＨＩＶに感染した患者、またはＨＩＶ感染の危険性がある患者の治療に用いるための、請求項１８記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／２８７，５９９号、および２００９年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／２２５，６８７号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらは両方とも、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子提出したテキストファイルの説明
本明細書に添えて電子提出したテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列リストのコンピュータ可読式複写（ファイル名：ＣＡＬＩ＿００４＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１０年５月２６日、ファイルサイズ９キロバイト）。

【0003】

発明の分野
本発明は、一般に分子生物学およびウイルス学の分野に関する。特に、本発明は、ＨＩＶ感染の治療および予防に有用な発現ベクターに関する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子であり、これは免疫不全および日和見感染に起因する致死率を上昇させる。ＨＩＶ感染は、世界保健機関により流行病として指定されていることからも明らかなように重大な国際健康問題である。ほとんどのＨＩＶ感染者は最終的にＡＩＤＳを発現し、毎年百万人を超える命が奪われている。

【0005】

ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質、プロテアーゼ阻害物質、および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害物質の組み合わせを含むＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス剤療法）などの抗レトロウイルス剤療法により、この療法が利用可能である世界の地域においてＨＩＶ／ＡＩＤＳ罹患率および致死率が劇的に低下している。しかしながら、ＨＡＡＲＴはＨＩＶ／ＡＩＤＳのすべての症状を治癒または完全に除去はしない。ＨＡＡＲＴは、いくつかの副作用ならびにレトロウイルス阻害物質耐性であるＨＩＶ株の出現も伴う。これらの理由ならびにＨＡＡＲＴの高額費および厳格な順守の必要性のため、かかる療法は大勢の患者に対しては比較的無効であり得る。したがって、ＨＩＶ感染の治療および予防のための改善された戦略の開発が当該技術分野で必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、ウイルス感染の２つの異なる段階を遺伝子療法により標的とする、ＨＩＶ感染の治療および／または予防のための新規治療アプローチを提供する。例えば、本発明は、宿主細胞内へのウイルス侵入の阻害物質およびウイルス融合阻害物質および／またはウイルス複製阻害物質をコードするベクターを提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列、ならびに標的細胞に対するＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む発現ベクターを提供し、前記第１の核酸配列は第１のプロモーターと機能的に連結されており、前記第２の核酸配列は第２のプロモーターと機能的に連結されている。発現ベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであることができる。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列は、単独プロモーターから転写される。特定の実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、第２の核酸配列の上流に存在する。

【0007】

ある実施形態では、発現ベクターは、ウイルス侵入、ウイルス融合、またはウイルス複製阻害物質をコードする第３の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の核酸は、第３のプロモーターと機能的に連結されている。他の実施形態では、３つの核酸配列のうちの２つは、単独プロモーターから転写される（すなわち第１の核酸配列と第２の核酸配列または第２の核酸配列と第３の核酸配列）。さらに他の実施形態では、全３つの核酸配列は、単独プロモーターから転写される。１つまたは複数のＩＲＥＳは、第２の核酸配列および／または第３の核酸配列の上流に存在し得る。

【0008】

本発明の一実施形態では、発現ベクターの第１の核酸配列は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどＨＩＶ共受容体を標的とする阻害核酸分子をコードする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＣＲ５と実質的に同一および相補的な配列を有する二重鎖領域を含む。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＸＣＲ４と実質的に同一および相補的な配列を有する二重鎖領域を含む。

【0009】

本発明の別の実施形態では、発現ベクターの第２の核酸配列は、標的細胞に対するＨＩＶ融合を阻害するタンパク質をコードする。ＨＩＶ融合阻害物質タンパク質はＣ４６タンパク質、または細胞表面へのＨＩＶ融合を阻害して細胞表面上に位置するように発現する導入遺伝子である他の類似タンパク質（例えば、Ｔ２０およびＴ２０関連タンパク質、エンフビルチド、ＣＰ_３２Ｍ、およびシフビルチド）であることができる。

【0010】

本発明のさらに別の実施形態では、発現ベクターの第２の核酸配列は、ＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする。例えば、いくつかの実施形態では、第２の核酸配列はＴＲＩＭ５αタンパク質またはその誘導体もしくは融合物をコードする。ある実施形態では、第２の核酸配列は、アミノ末端ドメインがヒトＴＲＩＭ５αタンパク質由来でありカルボキシ末端ＰＲＹＳＰＲＹドメインがアカゲザルＴＲＩＭ５αタンパク質由来であるキメラＴＲＩＭ５αをコードする。他の実施形態では、第２の核酸配列は、ＴＲＩＭ５−シクロフィリン融合タンパク質をコードする。

【0011】

本発明の一実施形態では、発現ベクターは第１、第２、および第３の核酸配列を含み、第１の核酸配列はＨＩＶ共受容体（例えば、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４に対するｓｈＲＮＡ）の阻害物質をコードし、第２の核酸配列は融合阻害物質（例えば、Ｃ４６）をコードし、第３の核酸配列はＨＩＶ複製阻害物質（例えば、ＴＲＩＭ５αタンパク質またはその誘導体もしくは融合物）をコードする。

【0012】

本発明のいくつかの実施形態では、ＨＩＶ共受容体の阻害物質および標的細胞に対するＨＩＶ融合阻害物質またはＨＩＶ複製阻害物質は、発現ベクター上の異なるプロモーターから発現する。一実施形態では、ＨＩＶ共受容体（例えばＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）の阻害物質はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現し、一方、ＨＩＶ融合および／または複製阻害物質はＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから発現する。２つの異なる阻害物質は、発現構築物から異なる比率で発現できる。

【0013】

本発明は、本明細書に記載の発現ベクターならびに新規の発現ベクターを含む薬学的組成物の作製の方法も提供する。例えば、一実施形態では、細胞に存在時、細胞へのＨＩＶ結合を阻害して、細胞内へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を防止することができるウイルス発現ベクターの産生方法は、細胞内へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を防止できるタンパク質を発現する遺伝子のｃＤＮＡを合成すること；ウイルスベクター制限部位へ合成したｃＤＮＡをクローニングすること；ならびにＨＩＶ共受容体の発現を下方制御できる発現単位をベクター制限部位へ挿入することを含む。

【0014】

本発明は、患者におけるＨＩＶ感染の治療または予防の方法も提供する。一実施形態では、本方法は、本発明の発現ベクターを含む薬学的組成物を患者に投与することを含む。かかる組成物の投与は、ＨＩＶのＲ５向性株とＸ４向性株による感染に対する耐性を付与することができる。一実施形態では、患者はヒトである。患者はＨＩＶ陰性であってもＨＩＶ陽性であってもよい。いくつかの実施形態では、患者は、ＨＡＡＲＴ療法未施行でも、ＨＡＡＲＴ療法施行中の者でも、ＨＡＡＲＴ療法に奏効していないか奏効しなかった者でもよい。他の実施形態では、患者は末期のＡＩＤＳ（例えば、ＡＩＤＳ／リンパ腫）を呈し得る。

【0015】

別の実施形態では、本方法は、本発明の発現ベクターを造血細胞（例えば、ＨＰＳＣ、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または単球／マクロファージ）に形質導入すること、前記形質導入細胞を患者に移植することを含み、前記形質導入細胞は、ＨＩＶ感染に対して耐性である。一実施形態では、造血細胞は、患者への移植後、ＨＩＶ感染に対して耐性である顆粒球、単球／マクロファージ、およびリンパ球を生成する造血前駆／幹細胞（ＨＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ＨＰＳＣは自家かつＣＤ３４陽性である。形質導入ＨＰＳＣは、ＨＩＶのＲ５向性株とＸ４向性株による感染に対して耐性である顆粒球、単球／マクロファージ、およびリンパ球を生成できる。ある実施形態では、形質導入ＨＰＳＣは、ＨＡＡＲＴ耐性であるＨＩＶ株による感染に対して耐性である顆粒球、単球／マクロファージ、およびリンパ球を生成できる。

【0016】

本明細書を通して、文脈上、別段の必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語句またはその変形（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」など）は、指定の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を含むが、他の任意の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を排除しないことを含意することが理解されるであろう。

【0017】

本明細書に含まれている文書、法令、材料、機器、製品などの考察はいずれも、本発明の文脈、環境を提供する目的のみである。これらの事項のいずれかまたはすべては、先行技術の基礎の一部を形成するものまたは本明細書の各請求項の優先日前の本発明の関連分野における共通の一般的な知識であったという承認とみなすべきではない。

【0018】

[本発明1001]
ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第1の核酸配列、ならびに標的細胞へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする第2の核酸配列を含む、発現ベクター。
[本発明1002]
ウイルスベクターである、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1003]
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、本発明1002の発現ベクター。
[本発明1004]
レンチウイルスベクターが自己不活性化する、本発明1003の発現ベクター。
[本発明1005]
宿主細胞内で発現時にＸ4向性ＨＩＶ株およびＲ5向性ＨＩＶ株による感染に対する耐性を付与する、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1006]
宿主細胞内で発現時に高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）耐性ＨＩＶ株による感染に対する耐性を付与する、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1007]
ＨＩＶウイルス結合、標的細胞膜へのＨＩＶウイルス融合またはＨＩＶウイルス複製阻害物質をコードする第3の核酸配列をさらに含む、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1008]
ＨＩＶ共受容体の阻害物質が二重鎖領域を有するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり、前記二重鎖領域が前記ＨＩＶ共受容体の配列と実質的に同一および相補性の配列を含む、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1009]
前記ＨＩＶ共受容体がＣＣＲ5またはＣＸＣＲ4である、本発明1008の発現ベクター。
[本発明1010]
ｓｈＲＮＡが配列番号1の配列を有する、本発明1009の発現ベクター。
[本発明1011]
阻害物質が、前記ベクターが宿主細胞内で発現時にＨＩＶ共受容体の発現を低減できる、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1012]
標的細胞へのＨＩＶ融合を阻害するタンパク質がＣ46タンパク質、Ｔ20タンパク質、エンフビルチド、ＣＰ₃₂Ｍ、およびシフビルチドである、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1013]
ＨＩＶ複製を阻害するタンパク質がヒトＴＲＩＭ5α、アカゲザルＴＲＩＭ5α、キメラＴＲＩＭ5α、ヒトＴＲＩＭ5−シクロフィリン融合タンパク質、シクロフィリン、Ｅ3ユビキチン、ＡＰＯＢＥＣ3Ｇ、および骨髄間質細胞抗原2（ＢＳＴ−2）からなる群から選択される、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1014]
キメラＴＲＩＭ5αがヒトＴＲＩＭ5αタンパク質由来のアミノ末端ドメインおよびアカゲザルＴＲＩＭ5αタンパク質由来のカルボキシ末端ＰＲＹＳＰＲＹドメインを含む、本発明1013の発現ベクター。
[本発明1015]
前記第1の核酸配列と第2の核酸配列がプロモーターと機能的に連結されている、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1016]
前記プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、本発明1015の発現ベクター。
[本発明1017]
前記第1の核酸配列が第1のプロモーターと機能的に連結されており、前記第2の核酸配列が第2のプロモーターと機能的に連結されている、本発明1001の発現ベクター。
[本発明1018]
前記第1のプロモーターと第2のプロモーターが同じである、本発明1017の発現ベクター。
[本発明1019]
前記第1のプロモーターと第2のプロモーターが異なる、本発明1017の発現ベクター。
[本発明1020]
前記第1のプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり、前記第2のプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、本発明1019の発現ベクター。
[本発明1021]
前記第3の核酸配列が第3のプロモーターと機能的に連結されている、本発明1007の発現ベクター。
[本発明1022]
前記第3のプロモーターが第1のプロモーターおよび第2のプロモーターと同じまたは異なる、本発明1021の発現ベクター。
[本発明1023]
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターがＨ1 ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである、本発明1016の発現ベクター。
[本発明1024]
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターがユビキチンＣ ｐｏｌ ＩＩプロモーターである、本発明1016の発現ベクター。
[本発明1025]
本発明1001の発現ベクターを含む宿主細胞。
[本発明1026]
Ｘ4向性ＨＩＶ株またはＲ5向性ＨＩＶ株による感染に対して耐性である、本発明1025の宿主細胞。
[本発明1027]
ＨＡＡＲＴ耐性ＨＩＶ株による感染に対して耐性である、本発明1026の宿主細胞。
[本発明1028]
造血前駆／幹細胞、単球、マクロファージ、末梢血単核球、ＣＤ4＋Ｔリンパ球、ＣＤ8＋Ｔリンパ球、または樹状細胞である、本発明1025の宿主細胞。
[本発明1029]
配列番号1の配列を有するｓｈＲＮＡをコードする第1の核酸配列およびＣ46タンパク質をコードする第2の核酸配列を含み、前記第1の核酸配列がＨ1 ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターと機能的に連結されており、前記第2の核酸配列がユビキチンＣ ｐｏｌ ＩＩプロモーターと機能的に連結されている、発現ベクター。
[本発明1030]
第1のｓｈＲＮＡをコードする第1の核酸配列、第2のｓｈＲＮＡをコードする第2の核酸配列、および標的細胞へのＨＩＶウイルス融合もしくはＨＩＶ複製阻害物質をコードする第3の核酸配列を含む、発現ベクター。
[本発明1031]
前記第1の核酸配列が第1のプロモーターと機能的に連結されており、前記第2の核酸配列が第2のプロモーターと機能的に連結されており、前記第3の核酸配列が第3のプロモーターと機能的に連結されている、本発明1030の発現ベクター。
[本発明1032]
前記第1のｓｈＲＮＡがＣＣＲ5を標的とし、前記第2のｓｈＲＮＡがＣＸＣＲ4を標的とする、本発明1030の発現ベクター。
[本発明1033]
本発明1001の発現ベクターを造血細胞に形質導入する工程、および患者への前記形質導入された造血細胞を移植する工程を含み、前記形質導入された造血細胞がＨＩＶ感染に対して耐性である、患者におけるＨＩＶ感染の治療または予防の方法。
[本発明1034]
前記造血細胞が造血前駆／幹細胞（ＨＰＳＣ）、ＣＤ4＋Ｔリンパ球、ＣＤ8＋Ｔリンパ球、単球／マクロファージ、またはそれらの組み合わせである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記移植されたＨＰＳＣがＨＩＶ感染に対して耐性である顆粒球、単球／マクロファージ、およびリンパ球を生成する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記造血細胞が自家性または同種異系間である、本発明1033の方法。
[本発明1037]
前記第1の核酸配列が二重鎖領域を有するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードし、前記二重鎖領域が、ＣＣＲ5配列と実質的に同一および相補性の配列を含む、本発明1033の方法。
[本発明1038]
ｓｈＲＮＡが配列番号1の配列を有する、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記形質導入された造血細胞が、形質導入されていない造血細胞と比較して低いレベルのＣＣＲ5タンパク質を発現する、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記第2の核酸配列がヒトＴＲＩＭ5α、アカゲザルＴＲＩＭ5α、キメラＴＲＩＭ5α、ヒトＴＲＩＭ5−シクロフィリン融合タンパク質およびＣ46タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、本発明1033の方法。
[本発明1041]
キメラＴＲＩＭ5αがヒトＴＲＩＭ5αタンパク質由来のアミノ末端ドメインおよびアカゲザルＴＲＩＭ5αタンパク質由来のカルボキシ末端ＰＲＹＳＰＲＹドメインを含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記形質導入された造血細胞が、形質導入されていない造血細胞と比較して高いレベルの前記タンパク質を発現する、本発明1040の方法。
[本発明1043]
前記顆粒球、単球／マクロファージ、およびリンパ球がＲ5向性ＨＩＶ株およびＸ4向性ＨＩＶ株による感染に対して耐性である、本発明1035の方法。
[本発明1044]
前記顆粒球、単球／マクロファージ、およびリンパ球がＨＡＡＲＴ耐性ＨＩＶ株による感染に対して耐性である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
患者がＨＡＡＲＴ未施行である、本発明1033の方法。
[本発明1046]
患者がＨＡＡＲＴレジメンを受けている、本発明1033の方法。
[本発明1047]
患者にＨＡＡＲＴレジメンが奏効していないか奏効しなかった、本発明1033の方法。
[本発明1048]
有効量の本発明1001の発現ベクターおよび薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
[本発明1049]
ＨＩＶ感染患者の治療のための薬の製造における、本発明1048の薬学的組成物の使用。
[本発明1050]
本発明1048の薬学的組成物を患者に投与することを含む、患者におけるＨＩＶ感染の治療または予防方法。
[本発明1051]
組成物の投与後、患者がＲ5向性ＨＩＶ株およびＸ4向性ＨＩＶ株による感染に対して耐性である、本発明1050の方法。
[本発明1052]
組成物の投与後、患者がＨＡＡＲＴ耐性ＨＩＶ株による感染に対して耐性である、本発明1051の方法。
[本発明1053]
患者がＨＡＡＲＴ未施行である、本発明1050の方法。
[本発明1054]
患者がＨＡＡＲＴレジメンを受けている、本発明1050の方法。
[本発明1055]
患者にＨＡＡＲＴレジメンが奏効していないか奏効しなかった、本発明1050の方法。
[本発明1056]
患者にＨＩＶ感染リスクがある、本発明1050の方法。
[本発明1057]
ＨＩＶ感染患者の治療のための薬の製造における、本発明1001のウイルス発現ベクターの使用。
[本発明1058]
細胞に存在時、細胞へのＨＩＶ結合を阻害でき、かつ細胞内へのＨＩＶ融合またはＨＩＶ複製を防止できるウイルス発現ベクターの産生方法であって、以下の工程を含む産生方法：
細胞内へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を防止できるタンパク質を発現する遺伝子のｃＤＮＡを合成する段階；
ウイルスベクターの制限部位へ、合成したｃＤＮＡをクローニングする工程；ならびに
ＨＩＶ共受容体の発現を下方制御できる発現単位をベクターの制限部位へ挿入する工程。
[本発明1059]
ｃＤＮＡがＣ46 ｃＤＮＡまたはＴＲＩＭ5α ｃＤＮＡであり、発現単位がＣＣＲ5を標的とするｓｈＲＮＡである、本発明1058の方法。
[本発明1060]
ｓｈＲＮＡが配列番号1の配列を有する、本発明1059の方法。
[本発明1061]
ウイルスベクターがＦＧ11Ｆレンチウイルスベクターである、本発明1059の方法。
[本発明1062]
Ｃ46またはＴＲＩＭ5α ｃＤＮＡがＦＧ11ＦベクターのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位へクローニングされている、本発明1061の方法。
[本発明1063]
ｓｈＲＮＡがＦＧ11ＦベクターのＸｂａｌ／Ｘｈｏｌ制限部位間に挿入されている、本発明1062の方法。
本発明がより明確に理解され得るように、以下の図面の簡単な説明および実施例に関連して好ましい実施形態を記載する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】レンチウイルスベクター構築物。各々示されるベクターを構成する重要要素を示す図式。二重ベクターｓｈ５／Ｃ４６を点線枠により強調して示す。

【図2】主鎖構築物。各主鎖レンチウイルスベクターを構成する重要要素を示す図式。ｐはプラスミドを意味する。ユビキチンプロモーター（Ｕｂｃ）の上流を含む各種位置での複数のクローニング部位（ＭＣＳ）の挿入により、ｐＦＧ１２からｐＦＧ１１Ｆを得た。

【図3】ＦＧ１２主鎖に由来するベクター。ｐＦＧ１２−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−ＥＧＦＰおよびｐＦＧ１２−Ｈ１−Ｒ５の誘導を示す図式。

【図4】ＦＧ１１Ｆ主鎖に由来するベクター。ｐＦＧ１１Ｆ−Ｕ−Ｃ４６およびｐＦＧ１１Ｆ−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−Ｃ４６誘導を示す図式。

【図5】レンチウイルスの産生。図式（左パネル）は一過性共トランスフェクション系に用いたＨＩＶ−１野生型ゲノムおよび遺伝子ベクターを示す：１ ＨＩＶベクタープラスミド（試験ベクター、例えば図１〜４に示す構築物）；２〜４ 各種ヘルパープラスミド。点線枠内の図式（右パネル）は、レンチウイルス産生に使用される実際のヘルパープラスミド要素を示す。

【図6】ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５細胞内の発現の安定性。培養中４週目と８週目、示された構築物での形質導入ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５細胞のＦＡＣＳ分析。細胞の（ＣＤ１９５抗体を介した）ＣＣＲ５発現、（２Ｆ５抗体を介した）Ｃ４６発現、およびＥＧＦＰ発現を分析した。ＧＦＰ発現はＥＧＦＰを含む構築物に見られ（ＧＦＰ対照およびｓｈ５／ＥＧＦＰ；パネル１、３）；ＣＣＲ５発現低下はｓｈ５を含む構築物に見られ（ｓｈ５、ｓｈ５／ＥＧＦＰ、およびｓｈ５／Ｃ４６；パネル２、３、５）、Ｃ４６発現はＣ４６を含む構築物に見られる（Ｃ４６およびｓｈ５／Ｃ４６；パネル４、５）。陽性細胞率を、４分割した各フローサイトメトリー（Ｑ１〜Ｑ４）に示す。４週目と８週目で類似した結果が見られる。

【図7】Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞内の発現の安定性。培養中４週目と８週目、示される構築物で形質導入したＭｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞のＦＡＣＳ分析。細胞の（ＣＤ１９５抗体を介した）ＣＣＲ５発現、（２Ｆ５抗体を介した）Ｃ４６発現、およびＥＧＦＰ発現を分析した。ＧＦＰ発現はＥＧＦＰを含む構築物に見られる（ＧＦＰ対照およびｓｈ５／ＥＧＦＰ；パネル１、３）；ＣＣＲ５発現低下はｓｈ５を含む構築物に見られ（ｓｈ５、ｓｈ５／ＥＧＦＰ、およびｓｈ５／Ｃ４６；パネル２、３、５）、Ｃ４６発現はＣ４６を含む構築物に見られる（Ｃ４６およびｓｈ５／Ｃ４６；パネル４、５）。陽性細胞率を、４分割した各フローサイトメトリー（Ｑ１〜Ｑ４）に示す。４週目と８週目で類似した結果が見られる。

【図8】形質導入ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５細胞の増殖特徴。示された濃度で播種から４〜７日後、示されたレンチウイルス構築物での形質導入ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５細胞数を示す棒グラフ；４つの独立した播種はＸ軸上の１〜４の番号で示す。各種構築物（ｓｈ５（２）、ｓｈ５／ＥＧＦＰ（３）、Ｃ４６（４）、ｓｈ５／Ｃ４６（５））での形質導入は、非形質導入細胞（１）と比較して細胞の増殖速度に対する影響はなかった。

【図9】末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の形質導入方法。以下の４つの方法のうちの１つにおいてＰＢＭＣをｓｈ５／ＥＧＦＰレンチウイルス構築物で形質導入した：ウイルス含有培地（ＶＣＭ）での１×形質導入、ＶＣＭでの２×形質導入、ＶＣＭ前負荷での１×形質導入（前負荷×１）、ＶＣＭ前負荷での２×形質導入（前負荷×２）、および濃縮ＶＣＭ。Ａ．示された方法でｓｈ５／ＥＧＦＰレンチウイルス構築物で形質導入したＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析。Ｂ．各形質導入方法におけるＥＧＦＰ陽性細胞率の要約。結果は、形質導入は濃縮ウイルスで最も効果的であり、続いて前負荷２×、前負荷１×、次いで２×および１×懸濁液の順で効果的であることを示す；それぞれで２つの複製を示す。

【図10】ＰＢＭＣ形質導入。形質導入後４日目の示された構築物で形質導入したＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析。ＧＦＰ発現はＥＧＦＰを含む構築物に見られる（パネル１、２）；ＣＣＲ５下方制御はｓｈ５を含む構築物に見られ（パネル２および４）、Ｃ４６発現（２Ｆ５抗体により測定した）はＣ４６を含む構築物に見られる（パネル３、４）。ＭＦＩ値は左から右の順で、１６．２、８．４、１６．８、９．４であった。

【図11】形質導入ＰＢＭＣ（４日目）および形質導入ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５Ｔ細胞（８週目）内の遺伝子発現の比較。類似の発現パターンが２つの細胞タイプ間に観察される。ＧＦＰ発現は、ＥＧＦＰを含む構築物での形質導入細胞に見られる（パネル１、２）；ＣＣＲ５発現は、ｓｈ５を含む構築物での形質導入細胞で低下し（パネル２および４）、Ｃ４６発現（２Ｆ５抗体により測定した）は、Ｃ４６を含む構築物での形質導入細胞に観察される（パネル３、４）。

【図12】形質導入ヒトＰＢＭＣの増殖特徴。各々の示された構築物で形質導入したＰＢＭＣと非形質導入ＰＢＭＣの総細胞／ウェル（パネルＡ）および生存細胞率（パネルＢ）は類似していた。各群の２つの複製播種を示す。

【図13】ＰＢＭＣ内の導入遺伝子発現の安定性。形質導入後４、７および１２日目の示された構築物で形質導入したＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析。ＧＦＰ、ＣＣＲ５、およびＣ４６発現（２Ｆ５抗体により測定した）を分析した。ＧＦＰ発現はパネル１、３に見られる；ｓｈ５発現はパネル２、３、５に見られ、Ｃ４６発現はパネル４、５に見られる。

【図14】ＣＤ３４＋の単離および形質導入。磁気抗体細胞分離によるＣＤ３４＋細胞の単離前（分離前）および単離後（分離後）のヒト単核球集団のＦＡＣＳ分析（上パネル）。示される構築物での形質導入ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞のＦＡＣＳ分析（下パネル）。ＧＦＰ発現はパネル１、２に見られる；Ｃ４６発現はパネル４、５に見られない。

【図15】Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞内の二重向性ＳＦ２株でのＨＩＶ曝露。Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞を形質導入しないかまたはｓｈ５／Ｃ４６レンチウイルスベクターで形質導入してから、ＨＩＶ−ＳＦ２二重向性（ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）ウイルスに０．２、０．０２、０．００２の様々な感染効率（ＭＯＩ）で曝露させた。ＨＩＶ感染の測定値としてウイルス曝露から１３日後にＰ２４タンパク質レベルを評価した。

【図16】Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞内の二重向性ＳＦ２株でのＨＩＶ曝露。Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞を形質導入しないかまたはｓｈ５／Ｃ４６もしくはＣ４６レンチウイルス構築物で形質導入してからＨＩＶ−ＳＦ２二重向性（ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）ウイルスに０．２および０．０２の２つの異なる感染効率（ＭＯＩ）で曝露させた。ＨＩＶ感染の測定値としてウイルス曝露から１１日後にＰ２４タンパク質レベルを評価した（上パネル）。ウイルス曝露日、形質導入しないＭｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞またはＣ４６もしくはｓｈ５／Ｃ４６レンチウイルス構築物で形質導入したＭｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞のＦＡＣＳ分析（下パネル）。ＣＣＲ５発現とＣ４６発現（２Ｆ５抗体により測定した）を評価した。

【図17】Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞内の二重向性ＳＦ２株でのＨＩＶ曝露。Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞を形質導入しないかまたはＣ４６（遺伝子２）もしくはｓｈ５／Ｃ４６（Ｇ２Ｒ５）レンチウイルス構築物で形質導入してからＨＩＶ−ＳＦ２二重向性（ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）、Ｂａｌ（ＣＣＲ５向性）もしくはＮＬ４−３（ＣＸＣＲ４向性）ウイルスにＭＯＩ０．２で曝露させた。ＨＩＶ感染の測定値としてウイルス曝露から１１日後にＰ２４タンパク質レベルを評価した。ヒストグラム上の番号（１〜６）は、使用したＨＩＶ株を指す（右の番号の説明を参照）。

【図18】Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞内のＣＣＲ５向性Ｂａｌ株でのＨＩＶ曝露。Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞を形質導入しない（Ｍｏｌｔ４）かまたは以下の４つのレンチウイルス構築物のうちの１つで形質導入した：ｓｈ５（Ｒ５）；Ｃ４６（Ｇ２）；ｓｈ５／Ｃ４６（Ｒ５−Ｇ２）；もしくはｓｈ５／ＥＧＦＰ（Ｒ５−ＧＦＰ）。「混合」群は、非形質導入、ｓｈ５、Ｃ４６、ｓｈ５／Ｃ４６をすべて均等に（すなわち各タイプ２５％ずつ）混合した混合物である。続いて細胞をＨＩＶ−Ｂａｌ ＣＣＲ５向性ウイルスに感染効率（ＭＯＩ）０．２で曝露させた。ウイルス曝露から７日後および１０日後（各処理に対してそれぞれ第１および第２ヒストグラム）、ＨＩＶ感染の測定値としてＰ２４タンパク質レベルを評価した。

【図19】末梢血単核球内のＨＩＶ曝露。Ａ．二重ｓｈ１００５／Ｃ４６構築物の図式。Ｂ．ＰＢＭＣを以下の４つのレンチウイルス構築物のうちの１つで形質導入した：ｓｈ５／Ｃ４６（ＬＶｓｈ５Ｃ４６）；Ｃ４６（ＬＶＣ４６）；ｓｈ５／ＧＦＰ（ＬＶｓｈ５−ＧＦＰ）；もしくはＧＦＰ対照（ＬＶ−ＧＦＰ）。形質導入４日後の形質導入ＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析。Ｃ．形質導入１６日後、パネルＢに示す細胞をＣＣＲ５（Ｒ５）向性ＨＩＶ株またはＣＸＣＲ４（Ｘ４）向性ＨＩＶ株のいずれかに曝露させて、ウイルス曝露から４日後に培養上清中のｐ２４タンパク質レベルを評価した。

【図20】ＮＯＤ ＳＣＩＤ−ｈｕ ＢＬＴマウスにおける効果的なＣＣＲ５の低下。Ａ．フローサイトメトリー。再構成マウスのリンパ器官において、ＦＡＣＳ分析により、ＥＧＦＰ＋（上パネル）およびｍＣｈｅｒｒｙ＋（下パネル）ＣＤ４＋Ｔ細胞内ＣＣＲ５発現％を評価した。再構成後２０週目のマウス由来の代表的なデータを示す。Ｔｈｙ／Ｌｉｖ：移植したヒト胸腺様小器官。ＬＰＬ：粘膜固有層リンパ球。Ｂ．ＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１のエクスビボ阻害。移植したマウスから単離された脾細胞をＰＨＡで２日間、ＩＬ−２で５日間活性化し、ＣＤ８＋細胞を枯渇させた。細胞のＥＧＦＰ＋およびｍＣｈｅｒｒｙ＋を純度９９％超で分取した。分取したＥＧＦＰ＋（黒色ひし形）およびｍＣｈｅｒｒｙ＋（白四角）細胞（４×１０^４）をＲ５ ＨＩＶ−１_{ＮＦＮＳＸＳＬ９}またはＸ４ ＨＩＶ−１_{ＮＬ４−３}にＭＯＩ２．５で並行して３重で感染させた。感染させた後、細胞を３回洗浄した。ＨＩＶｐ２４ ＥＬＩＳＡアッセイにより、感染後１時間、培養上清中の残りの投入ＨＩＶ−１粒子量をモニタリングした。培養中の感染後４日目、７日目、および１２日目、培養上清中のＨＩＶ産生量をモニタリングした。Ｃ．インビボＣＣＲ５下方制御したＣＤ４＋Ｔ細胞の選択的利点。ＨＰＳＣ移植後９週目、再構成マウスをＲ５向性ＨＩＶ−１_{ＮＦＮＳＸＳＬ９}（ｐ２４の用量＝２００ｎｇ）に感染させた。Ｒ５向性ＨＩＶ注射後、ＥＧＦＰ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団％（灰色棒）の末梢血中動態を８週間モニタリングした。同じ動物で、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団％（白色棒）をモニタリングした。ＨＰＳＣ移植後１７週目、ＨＩＶ未感染マウスのＥＧＦＰ＋％およびｍＣｈｅｒｒｙ＋％を維持した（データは示さず）。代表的なデータを示す。Ｄ．インビボＣＤ４／ＣＤ８比率の選択的維持。Ｒ５向性ＨＩＶ注射後８週間中、ＥＧＦＰ＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞集団（灰色棒）のＣＤ４／ＣＤ８比率の末梢血中動態をモニタリングした。同じ動物で、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団％内のＣＤ４／ＣＤ８比率（白色棒）をモニタリングした。代表的な動物を示す。ＨＰＳＣ移植後１７週目、ＨＩＶ未感染マウスのＥＧＦＰ＋およびｍＣｈｅｒｒｙ＋ＣＤ４５＋細胞内のＣＤ４／ＣＤ８比率を１超に維持した（データは示さず）。

【図21】ＨＡＡＲＴ未施行のＨＩＶ＋個体へのｓｈ５／Ｃ４６形質導入ＣＤ３４＋および／またはＣＤ４＋細胞導入の予測される影響。形質導入細胞の１回投与で治療した患者（星印）と未治療患者（三角）で比較した予測されるウイルス負荷（Ａ）およびＣＤ４数（Ｂ）。

【図22】良好に管理されたＨＡＡＲＴレジメンにあるＨＩＶ＋の個人へのｓｈ５／Ｃ４６形質導入ＣＤ３４＋および／またはＣＤ４＋細胞導入の予測される影響。ｙ軸は予測されるウイルス負荷を示す。ｘ軸は抗レトロウイルス剤療法（ＡＲＴ）を行なった時点または分析療法中断（ＡＴＩ）を行なった時点を詳述する。形質導入細胞の１回投与で治療した患者（星印）と未治療患者（三角）で比較した予測されるウイルス負荷を示す。

【図23】ＨＡＡＲＴが奏効しなかったＨＩＶ＋の個人へのｓｈ５／Ｃ４６形質導入ＣＤ３４＋および／またはＣＤ４＋細胞導入の予測される影響。形質導入細胞の１回投与で治療した患者（星印）と未治療患者（三角）で比較した予測されるウイルス負荷（Ａ）およびＣＤ４数（Ｂ）。

【図24】ＣＣＲ５を標的とするｓｈＲＮＡおよびＴＲＩＭ５αタンパク質との二重レンチウイルス構築物。Ａ．ｐＦＧ１１Ｆ−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−ＴＲＩＭ５α要素を示す図式。Ｂ．三重ベクターｐＦＧ１１Ｆ−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−Ｃ４６−Ｂ−ＴＲＩＭ５αの誘導を示す図式。

【発明を実施するための形態】

【0020】

発明の詳細な説明
本発明は、非ＨＩＶ遺伝子および／またはタンパク質（すなわち宿主細胞遺伝子および／またはタンパク質）を標的とする治療アプローチが新規ＨＩＶ株の阻害物質耐性が出現する可能性を低下させるという認識に部分的に基づく。特に、本発明は、ＨＩＶライフサイクルの異なる段階に影響を与える細胞タンパク質を標的化または使用することによりＨＩＶ感染を予防または治療するベクターおよびかかるベクターの使用方法を提供する。例えば、一実施形態では、このベクターは、ウイルス侵入（結合）の阻害物質および細胞膜へのウイルス融合阻害物質を発現できる。別の実施形態では、このベクターは、ウイルス侵入の阻害物質およびウイルス複製阻害物質を発現できる。したがって、本発明は、ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列、および標的細胞へのＨＩＶウイルス融合またはＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む発現ベクターを提供する。

【0021】

１つの特定の実施形態では、３つすべての要素（例えば、ＨＩＶ共受容体の阻害物質、標的細胞へのＨＩＶウイルス融合を阻害するタンパク質およびＨＩＶ複製を阻害するタンパク質）が１つのベクター内で併合されている。例えば、一実施形態では、発現ベクターは第１、第２、および第３の核酸配列を含み、第１の核酸配列はＨＩＶ共受容体（例えば、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４に対するｓｈＲＮＡ）の阻害物質をコードし、第２の核酸配列は融合阻害物質（例えば、Ｃ４６）をコードし、第３の核酸配列はＨＩＶ複製阻害物質（例えば、ＴＲＩＭ５αタンパク質またはその誘導体もしくは融合物）をコードする。別の実施形態では、発現ベクターは第１、第２、および第３の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、ＨＩＶ共受容体（例えば、ＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡ）の第１の阻害物質をコードし、第２の核酸配列は、ＨＩＶ共受容体（例えば、ＣＸＣＲ４に対するｓｈＲＮＡ）の第２の阻害物質をコードし、第３の核酸配列は標的細胞へのＨＩＶウイルス融合阻害物質（例えば、Ｃ４６）をコードする。

【0022】

本明細書で使用する「発現ベクター」または「ベクター」とは、対象の核酸を、それらが細胞により発現するように細胞内部に送達するために使用できる合成物を指す。当該技術分野で知られている多数のベクターとしては、線状ポリヌクレオチド、イオン化合物もしくは両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、ならびにウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）などが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。好ましくは、ウイルスベクターはレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである。

【0023】

「レトロウイルス」は、レトロウイルス逆転写酵素により、宿主細胞ゲノム内に統合したｃＤＮＡコピーに逆転写したＲＮＡゲノムを有するウイルスである。レトロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターの作製方法は当該技術分野で知られている。簡単に述べると、レトロウイルスベクターを構築するため、あるウイルス配列の代わりに対象の遺伝子をコードする核酸をウイルスのゲノム内に挿入して複製欠陥ウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲを含まないパッケージング細胞系ならびにパッケージング成分を構築する（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ． ３３：１５３−１５９， １９８３）。レトロウイルスのＬＴＲおよびパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞系内に導入する場合、このパッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子内にパッケージされることを可能にし、これは、次いで培養培地内に分泌される。次いで組換えレトロウイルスを含む培地を回収し、任意選択的に濃縮し、遺伝子導入のために用いる（実施例１参照）。

【0024】

「レンチウイルス」とは、分裂細胞と非分裂細胞を感染させることができるレトロウイルス属を指す。レンチウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ１型、およびＨＩＶ２型を含む）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因因子；ヒツジにおける脳炎（ビスナ）もしくは肺炎（マエディ）を惹起するビスナ・マエディ、ヤギにおける免疫不全、関節炎、および脳症を惹起するヤギ関節炎脳炎ウイルス；ウマにおける自己免疫溶血性貧血、および脳症を惹起するウマ感染性貧血ウイルス；ネコにおける免疫不全を惹起するネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；蓄牛におけるリンパ節腫大、リンパ球増加、およびおそらく中枢神経系感染を惹起するウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；ならびに類人猿における免疫不全および脳症を惹起するサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、が挙げられる。

【0025】

本明細書で使用する「ハイブリッドウイルス」とは、非レトロウイルスベクター由来の要素、例えば、アデノウイルス−レトロウイルスのハイブリッドを含む、１つまたは複数の他のウイルスベクター由来の成分を有するウイルスを指す。本明細書で使用する、レトロウイルス成分を有するハイブリッドベクターは、レトロウイルスの範囲内とみなされる。

【0026】

「偽型」レトロウイルスは、ＲＮＡゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来する外被タンパク質を有するレトロウイルス粒子である。外被タンパク質は、異なるレトロウイルス由来であってもレトロウイルスではないウイルス由来であってもよい。好ましい外被タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ Ｇ）タンパク質である。しかしながら、ヒト感染の可能性を除去するため、ウイルスは、特定の種（マウスまたは鳥類など）に対する感染を制限する同種志向性外被タンパク質で代替的に偽型化できる。例えば、一実施形態では、変異体の同種志向性外被タンパク質（同種志向性外被タンパク質４．１７など）を使用する（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８（１２）：１２７９−１２８２ （２０００））。

【0027】

「プロウイルス」という用語は、ＲＮＡレトロウイルスのゲノムに対応する真核染色体に存在する二重ＤＮＡ配列を指すために使用される。プロウイルスは、宿主細胞の溶解または破壊を引き起こさずに、一細胞世代から次世代に伝達し得る。

【0028】

レンチウイルスのゲノムは、一般に５'末端反復配列（ＬＴＲ）、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ）および３'ＬＴＲへ組織化される。ウイルスのＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つの領域に分割されている。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーター要素を含む。Ｕ５領域は、ポリアデニル化シグナルを含む。Ｒ（反復）領域はＵ３領域とＵ５領域を分離し、Ｒ領域の転写配列はウイルスＲＮＡの５'末端と３'末端の両端に現れる。例えば、「ＲＮＡウイルス：実用的なアプローチ（ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ａｌａｎ Ｊ． Ｃａｎｎ， Ｅｄ． ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， （２０００））； Ｏ Ｎａｒａｙａｎ ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ （１９８９） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ７０：１６１７−１６３９； Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ．； Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈ， Ｂｌａｍｅｒ Ｕ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ， Ｇａｇｅ Ｆ Ｈ， Ｖｅｒｍａ Ｉ Ｍ． （１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， Ｖｏｌ． ７２（１０）：８１５０ ７、および米国特許第６，０１３，５１６号を参照されたい。

【0029】

レンチウイルスベクターは当該技術分野で知られており、このうちいくつかは造血前駆／幹細胞（ＨＰＳＣ）を感染させるために使用されている。かかるベクターは、例えば、以下の刊行物（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に見ることができる：Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， Ｖｏｌ． １０：１４７９−１４８９， １９９９； Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， Ｖｏｌ． ９６：２９８８−２９９３， １９９９； Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， Ｖｏｌ． ９５：１１９３９−１１９４４， １９９８； Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２８３：６８２−６８６， １９９９； ａｎｄ Ｓｕｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， Ｖｏｌ． ７２：５７８１−５７８８， １９９８。一実施形態では、発現ベクターは改変レンチウイルスであり、したがって分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染させることが可能である。かかるレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列、および標的細胞へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む改変レンチウイルスのゲノムを含む。さらに、改変レンチウイルスのゲノムは、好ましくはウイルス複製に必要なレンチウイルスのタンパク質遺伝子を欠き、したがって望まない複製（標的細胞内の複製など）が防止される。改変ゲノムの複製に必要なタンパク質は、好ましくは組換えレトロウイルス（または具体的には、レンチウイルス）の産生中、パッケージング細胞系内に輸送中に提供される。一実施形態では、パッケージング細胞系は２９３Ｔ細胞系である。レンチウイルスベクターは好ましくはレンチウイルスの５'および３'末端反復配列（ＬＴＲ）由来の配列を含む。一実施形態では、ウイルスの構築物は、レンチウイルスの５'ＬＴＲ由来のＲおよびＵ５配列ならびにレンチウイルス由来の不活性化もしくは自己不活性化３'ＬＴＲを含む。ＬＴＲ配列は、任意の種または株由来を含む任意のレンチウイルス由来ＬＴＲ配列であり得る。例えば、ＬＴＲは、ＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）またはウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）由来のＬＴＲ配列であり得る。好ましくは、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ ＬＴＲ配列である。

【0030】

ある実施形態では、レンチウイルスベクターは、不活性化した、または自己不活性化３'ＬＴＲを含み、すなわち、レンチウイルスベクターは自己不活性化する。「自己不活性化３'ＬＴＲ」は、ＬＴＲ配列が下流遺伝子発現を駆動することを防止する変異、置換または欠失を含む３'ＬＴＲである。３'ＬＴＲ由来のＵ３領域のコピーは、統合したプロウイルスにおいて両ＬＴＲの生成のための鋳型として作用する。したがって、不活性化欠失または突然変異を有する３'ＬＴＲがプロウイルスの５'ＬＴＲとして統合時、５'ＬＴＲからの転写は不可能である。これは、そのウイルスのエンハンサー／プロモーターおよび任意の内部エンハンサー／プロモーター間の競合を排除する。自己不活性化３'ＬＴＲについては、例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， Ｖｏｌ． ７２：９８７３−９８８０，１９９８； Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， Ｖｏｌ． ７２：８１５０−８１５７， １９９８； ａｎｄ Ｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２６１：１２０−１３２， １９９９に記載されている。３'ＬＴＲは、当該技術分野で知られている任意の方法による自己不活性化により作製し得る。一実施形態では、３'ＬＴＲのＵ３要素は、そのエンハンサー配列、好ましくは、ＴＡＴＡボックス、ＳｐｌおよびＮＦ−κＢ部位の欠失を含む。自己不活性化３'ＬＴＲの結果として、宿主細胞ゲノム内に統合したプロウイルスは、不活性化した５'ＬＴＲを含む。本発明のウイルス発現ベクターは、好ましくは産生細胞内でのベクター産生を阻害しない。ある実施形態では、ウイルス発現ベクターは、形質導入した遺伝子含有細胞に対して実質的に無毒性である。

【0031】

本発明の発現ベクターは、ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列を含む。一実施形態では、ＨＩＶ共受容体は、ＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）である。ＣＣＲ５はマクロファージ向性株のための主要ＨＩＶ−１共受容体であり、ＨＩＶ感染に必須である。集団遺伝子試験により、欠陥ＣＣＲ５遺伝子（例えばＣＣＲ５Δ３２）のための各同型接合は、ＨＩＶ感染から保護されていることが示されている。興味深いことに、細胞上ＣＣＲ５の５０％低減を示す異型接合個体では、疾患進行速度が実質的に低下している。ＣＣＲ５Δ３２対立遺伝子の同型接合個体は、西ナイルウイルス脳炎に対する感受性が増加している以外は正常に思われる。低分子ＣＣＲ５阻害物質であるマラビロクは、ヒトにおける使用のため米食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認されている。この阻害物質はＨＩＶ−１感染予防に効果的であり、一部の副作用が認められたが、これらの副作用はいずれもＣＣＲ５のブロック自体に起因するようには思われなかった。予測されるとおり、ＨＩＶ−１耐性が生じるが、興味深いことに、耐性の主な形態は、ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）または他の共受容体ではなくＣＣＲ５の薬剤占有形態を使用するように適合したＨＩＶ−１変異体のようである。したがって、ＣＣＲ５ノックダウン（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスとなど）は、接近をブロックするよりも効果的であり得る。本発明の別の実施形態では、標的とするＨＩＶ共受容体は、Ｔ細胞向性株の主な共受容体であるＣＸＣＲ４である。

【0032】

ある実施形態では、ＨＩＶ共受容体の阻害物質は、阻害核酸である。本明細書で使用する阻害核酸としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アプタマー、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、一実施形態では、第１の核酸配列は、ＨＩＶ共受容体を標的とする阻害核酸をコードする。「標的とする」とは、ＨＩＶ共受容体をコードする内因性転写物に結合するおよび／または干渉する阻害物質の能力を指す。例えば、阻害核酸は、阻害核酸が核酸をコードするＨＩＶ共受容体に結合して、その結果、共受容体核酸の発現をブロックするかまたは分解を開始するように、ＨＩＶ共受容体をコードする核酸に対して実質的に相補性である配列を有することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＩＶ共受容体の阻害物質は、前記阻害物質をコードする発現ベクターが宿主細胞内で発現時、ＨＩＶ共受容体の発現を低減できる。

【0033】

「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、相同性を共有する遺伝子の発現を阻害できる二重鎖ＲＮＡ分子である。相同性を有する遺伝子領域または他のヌクレオチド配列は、「標的領域」として知られている。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス領域、ループ領域およびセンス領域に相補性のアンチセンス領域を含む「ヘアピン」またはステムループＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）であり得る。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、非共有結合して二重鎖を形成する２つの異なるＲＮＡ分子を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターは、ＨＩＶ共受容体（ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４など）をコードする核酸配列の少なくとも一部と実質的に相補性である配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする第１の核酸配列を含む。本明細書で使用する「実質的に相補性」とは、標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補性である配列を指す。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４をコードする核酸配列の少なくとも一部と１００％相補性である配列を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５〜約３０個のヌクレオチドの長さであることができ、いくつかの実施形態では、約１９〜約２５個のヌクレオチドの長さであることができる。

【0035】

他の実施形態では、本発明の発現ベクターは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列を含む。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、好ましくは、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４をコードする核酸の一部と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一および相補性であるＨＩＶ共受容体をコードする核酸配列の一部と実質的に同一および相補性の配列を含む二重鎖領域を有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ＨＩＶ共受容体配列（例えばＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４）と１００％同一および相補性の配列を含む二重鎖領域を有する。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの二重鎖領域は、約５〜約６０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約１０〜約３０個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは、約１５〜約２５個のヌクレオチドの長さ（約２０個のヌクレオチドの長さなど）であることができる。ある実施形態では、発現ベクターの第１の核酸配列は、ステムループ構造を有するｓｈＲＮＡをコードし、ステムまたは二重鎖領域は、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４配列と実質的に同一および相補性である。ｓｈＲＮＡのループ領域は、約２〜約１５個のヌクレオチドを含むことができる。１つの特定の実施形態では、第１の核酸配列は、

の配列を含むｓｈＲＮＡをコードする。

【0036】

本発明の発現ベクターは、好ましくは標的細胞へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞へのＨＩＶ融合を阻害するタンパク質は、Ｃ４６タンパク質である。Ｃ４６は、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＤ３４膜貫通ドメインと融合したＨＩＶ ｇｐ４１のＣ末端7アミノ酸繰り返しに由来する膜アンカー融合阻害物質である。Ｃ４６は、米食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された可溶性薬剤であるエンフビルチド（Ｔ２０）に類似している点で強力なＨＩＶ融合阻害物質であり、ＣＣＲ５共受容体結合とは異なるＨＩＶライフサイクルの時点で作用する。一実施形態では、Ｃ４６の安全性は、Ｃ４６レトロウイルスベクターで形質導入した自家Ｔ細胞を患者に注入する第Ｉ相臨床試験において試験された。別の態様では、患者は遺伝子療法に関わる副作用を有することはなく、明らかな抗Ｃ４６免疫反応は発現しなかった。一実施形態では、第２の核酸配列は、

の配列を含むＣ４６タンパク質をコードする。
別の実施形態では、第２の核酸は、

の配列を含む。標的細胞へのＨＩＶ融合を阻害し本発明の発現ベクター内の第２の核酸配列によりコードできる他の適切なタンパク質としては、Ｔ２０およびＴ２０関連タンパク質、エンフビルチド、ＣＰ_３２Ｍ、およびシフビルチドが挙げられる。

【0037】

ある実施形態では、第２の核酸配列はＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ複製を阻害するタンパク質は、３要素モチーフ含有５α（ＴＲＩＭ５α）タンパク質またはその誘導体もしくは融合物である。例えば、第２の核酸配列は、ヒトＴＲＩＭ５α、アカゲザルＴＲＩＭ５α、キメラＴＲＩＭ５α、またはヒトＴＲＩＭ５−シクロフィリン融合タンパク質をコードできる。一実施形態では、第２の核酸配列は、

の配列を含むヒトＴＲＩＭ５αタンパク質をコードする。
別の実施形態では、第２の核酸配列は、

の配列を含む。

【0038】

「キメラＴＲＩＭ５α」とは、２種以上のＴＲＩＭ５αタンパク質由来のドメインまたは断片を含むＴＲＩＭ５αタンパク質を指す。例えば、キメラＴＲＩＭ５αは、ヒトＴＲＩＭ５α由来のドメインを少なくとも１つおよびアカゲザルＴＲＩＭ５α由来のドメインを少なくとも１つ含むことができる。いくつかの実施形態では、キメラＴＲＩＭ５αタンパク質は、ヒトＴＲＩＭ５αタンパク質由来のアミノ末端ドメインおよびアカゲザルＴＲＩＭ５αタンパク質由来のカルボキシ末端ＰＲＹＳＰＲＹドメインを含む。

【0039】

別の実施形態では、第２の核酸配列は、ＴＲＩＭ ５αおよびシクロフィリンを含む融合タンパク質をコードする。例えば、一実施形態では、ＴＲＩＭ５−シクロフィリン融合タンパク質は、ほぼ完全長のヒトシクロフィリンＡに直接融合するアミノ酸１〜約３０９のヒトＴＲＩＭ５αを含む。別の実施形態では、ＴＲＩＭ５−シクロフィリン融合タンパク質は、ほぼ完全長のヒトシクロフィリンＡに直接融合するアミノ酸１〜約３２２のヒトＴＲＩＭ５αを含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＩＭ５−シクロフィリン融合タンパク質は、ほぼ完全長のヒトシクロフィリンＡに直接融合するアミノ酸１〜約３３１のヒトＴＲＩＭ５αを含む。第２の核酸配列によりコードできるＨＩＶ複製を阻害する他の適切なタンパク質は、シクロフィリン、Ｅ３ユビキチン、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、および骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ−２）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0040】

本発明の核酸配列は、本明細書に記載のタンパク質の保存的変異体または機能的等価物をコードする核酸配列をさらに含む。本明細書で使用する保存的変異型とは、タンパク質の生物学的機能に対して有害な影響を与えないアミノ酸配列の変更を指す。置換、挿入または欠失は、変更された配列がタンパク質と関連した生物学的機能を妨げる、または妨害する場合に、タンパク質に対して有害な影響を与えるとされる。例えば、タンパク質の全体の電荷、構造または疎水性／親水性特性は、生体活性に対して有害な影響を与えずに変更することができる。したがって、アミノ酸配列は、タンパク質の生体活性に有害な影響を与えずに、例えばタンパク質をより疎水性または親水性にするように変更できる。

【0041】

通常、タンパク質の保存的置換変異体および機能的等価物は、開示された配列の配列番号２および４と少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％〜９９％のアミノ酸配列相同性を有する。本明細書において、かかる配列に関する同一性または相同性は、配列を整列し、必要に応じて、最大相同率に達するようにギャップを導入後に既知のペプチドと同じである候補配列内のアミノ酸残基の率として定義し、保守的置換はいずれも配列同一性の一部とはみなさない。Ｎ末端、Ｃ末端もしくは内部の延長、欠失、またはペプチド配列内への挿入は、相同性に影響を与えるものと解釈すべきではない。

【0042】

したがって、本発明の発現ベクターの核酸配列は、本明細書に記載のタンパク質配列の保存的変異体または機能的等価物をコードできる。意図した変異体には、例えば、相同組換え、部位特異的変異誘発もしくはＰＣＲ変異誘発による既定の変異を含むもの、ならびにウサギ、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマおよび非ヒト霊長類種が挙げられるが、これらに限定されない他の動物種の対応するタンパク質をさらに含む。

【0043】

本発明の発現ベクターのいくつかの実施形態では、ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列は第１のプロモーターと機能的に連結されており、標的細胞へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする第２の核酸配列は第２のプロモーターと機能的に連結されている。発現ベクターが３つの核酸配列を含む本発明のある実施形態では、３つの核酸配列はそれぞれ別々のプロモーターと機能的に連結できる。例えば、一実施形態では、ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列は第１のプロモーターと機能的に連結されており、標的細胞へのＨＩＶ融合を阻害するタンパク質をコードする第２の核酸配列は第２のプロモーターと結合し、ＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする第３の核酸配列は第３のプロモーターと機能的に連結されている。他の実施形態では、３つの核酸配列のうちの２つは単一のプロモーターから転写される（すなわち第１の核酸配列と第２の核酸配列または第２の核酸配列と第３の核酸配列）。さらに他の実施形態では、全３つの核酸配列は単一のプロモーターから転写される。３つすべてのプロモーターは、互いに同じであることも異なることもできる。

【0044】

本明細書で使用する「機能的に連結されている」または「転写制御下」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始および核酸の発現を管理する核酸配列に関してプロモーターの位置および方向性が正確であることを意味する。選択されたプロモーターは好ましくはプロモーター排除を欠き、それにより、あるプロモーターが他のプロモーター（１つまたは複数）に交換されることが回避される。第１、第２、および第３のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターであることができる。プロモーターは、構成的プロモーターであってもよく、誘導可能なプロモーターであってもよい。誘導可能なプロモーターは当該技術分野で知られており、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸反応要素、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導可能なマウス乳癌ウイルスＬＴＲを含むことができる。一実施形態では、プロモーターは、少なくともＨＩＶＬＴＲの一部（例えば、ＴＡＲ）を含み、ＨＩＶ感染により誘導可能である。ある実施形態では、第１のプロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。本発明の発現ベクターにおける使用に適したＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターとしては、ヒトＵ６、マウスＵ６、およびヒトＨ１が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、第１のプロモーターは、Ｈ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。他の実施形態では、第２のプロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。１つの特定の実施形態では、第２のプロモーターは、ユビキチンＣ ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、組織特異性プロモーターであることができる。例えば、適切な組織特異性プロモーターとしては、マクロファージ特異性プロモーター（例えば、ＭＰＧ−１など）およびＴ細胞プロモーター（例えば、ＣＤ４など）が挙げられる。一実施形態では、第３のプロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。別の実施形態では、第３のプロモーターは、ユビキチンＣ ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、第３のプロモーターは、組織特異性プロモーターであることができる。第１、第２、および第３のプロモーターは、本明細書に記載の任意のプロモーターの組み合わせであることができる。ある実施形態では、核酸配列がｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど阻害ＲＮＡ分子をコードするＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが好ましい。他の実施形態では、核酸配列がタンパク質をコードするＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターが好ましい。

【0045】

ＨＩＶ共受容体の阻害物質がｓｉＲＮＡ分子である実施形態では、複数のプロモーターを使用してｓｉＲＮＡ分子を生成し得る。例えば、一実施形態では、発現ベクターは、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖をコードする１つの核酸分子およびｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖をコードする別の核酸分子を、２つの核酸発現後にｓｉＲＮＡ二重鎖が形成されるように含む。かかる実施形態では、発現ベクターは、センス鎖をコードする第１の核酸と機能的に連結されている第１のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターおよびアンチセンス鎖をコードする第２の核酸と機能的に連結されている第２のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを含むことができる。別の実施形態では、発現ベクターは、ＨＩＶ共受容体を標的とするｓｉＲＮＡ分子をコードする第１の核酸配列と機能的に連結されている第１のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、および同じ第１の核酸配列と反対方向で機能的に連結されている第２のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを、第１のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター由来の第１の核酸配列発現によりｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖が合成されて、第２のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター由来の第１の核酸配列発現によりｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が合成されるように含む。２つの異なるプロモーターから第１の核酸配列が発現後、センス鎖とアンチセンス鎖のハイブリッド形成により二重鎖ｓｉＲＮＡが形成される。

【0046】

一実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列は、単一のプロモーターから転写される。例えば、第１の核酸配列と第２の核酸配列は、単一の転写物が生成されるようにプロモーターと機能的に連結されている。別の実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、第２の核酸配列の上流および第１の核酸配列の下流に位置する。発現ベクターが３つの核酸配列を含む他の実施形態では、３つの核酸配列のうち２つは単一のプロモーターから転写される（すなわち第１の核酸配列と第２の核酸配列または第２の核酸配列と第３の核酸配列）。さらに他の実施形態では、全３つの核酸配列は単一のプロモーターから転写される。１つまたは複数のＩＲＥＳ要素は、第２の核酸配列および／または第３の核酸配列の上流に存在し得る。例えば、一実施形態では、第１、第２、および第３の核酸配列は単一のプロモーターと機能的に連結されていることができ、第１のＩＲＥＳ要素は第１の核酸配列と第２の核酸配列間に位置でき、第２のＩＲＥＳ要素は第２の核酸配列と第３の核酸配列間に位置できる。ＩＲＥＳ要素は、多シストロン性伝令の効果的な翻訳を可能とする。当該技術分野で知られている任意のＩＲＥＳ要素を本発明の発現構築物に使用できる。

【0047】

ある実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列は、ＨＩＶ共受容体阻害物質の発現がＨＩＶ複製または融合阻害物質の発現より高いように異なる比率で発現する。例えば、第１の核酸配列の第２の核酸配列に対する発現比率は、約２：１〜約１０：１超、好ましくは約５：１〜約１０：１、より好ましくは約２：１〜約５：１であることができる。一実施形態では、第１の核酸配列の第２の核酸配列に対する発現比率は約２：１である。発現ベクターが３つの核酸配列を含む実施形態では、第１、第２、および第３の核酸配列の発現比率は、ＨＩＶ共受容体阻害物質の発現がＨＩＶ複製および融合阻害物質の発現より高いように操作できる。例えば、ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列（例えばＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）における実施形態では、第２の核酸配列は融合阻害物質をコードし、第３の核酸配列は複製阻害物質をコードし、第１、第２、および第３の核酸配列の発現比率は約２：１：１〜約１０：１：１、約５：１：１〜約１０：１：１、または約２：１：１〜約５：１：１であることができる。

【0048】

本明細書に記載の発現ベクターの生成は、限定しないが、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄ．）， Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， （２０００））， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）， Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ． （Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９９７））および「ＲＮＡウイルス：実用的なアプローチ（ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ａｌａｎ Ｊ． Ｃａｎｎ， Ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， （２０００））に記載されている、ＰＣＲの標準的技術、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定を含む当該技術分野で周知である任意の適切な遺伝子工学技術を用いて成し遂げることができる。

【0049】

一実施形態では、発現ベクターはＦＧ１２ベクターであり、より好ましくは、ＦＧ１１Ｆレンチウイルスベクターである（実施例１参照）。別の実施形態では、第２の核酸配列は、２つの制限部位（例えば、ＦＧ１１ ＦベクターのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）内にクローン化されている。さらに別の実施形態では、第１の核酸配列は、２つの制限部位（例えば、ＦＧ１１ＦベクターのＸｂａｌ／Ｘｈｏｌ部位）間に挿入されている。ある実施形態では、ウイルス発現ベクターは、ＨＩＶ感染を阻害できる、ＨＩＶウイルス配列または宿主配列を標的としたｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、リボザイムまたはアプタマーから選択される少なくとも１つのさらなる核酸分子をさらに含む。他の実施形態では、ウイルス発現ベクターは、本明細書に記載の核酸配列をコードする１つまたは複数のタンパク質をさらに含む。例えば、一実施形態では、ウイルス発現ベクターは、ＨＩＶウイルス融合またはＨＩＶ複製のタンパク質阻害物質をコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに含む。

【0050】

本発明の新規の発現ベクターは、宿主細胞内で発現時に複数のＨＩＶ変異型による感染に対する耐性を付与する。一実施形態では、新規の発現ベクターは、宿主細胞内で発現時にＨＩＶのＲ５向性株およびＸ４向性株による感染に対する耐性を付与する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞内で発現時にＨＡＡＲＴまたはマラビロク療法耐性であるＨＩＶ株による感染に対する耐性を付与する。

【0051】

本発明は、宿主細胞内で発現時、細胞へのＨＩＶ結合を阻害し、細胞へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を防止することができるウイルス発現ベクター産生方法も含む。一実施形態では、本方法は、細胞内へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を防止できるタンパク質を発現する遺伝子のｃＤＮＡを合成すること；ウイルスベクター制限部位へ合成したｃＤＮＡをクローニングすること；ならびにＨＩＶ共受容体の発現を下方制御できる発現単位をベクター制限部位へ挿入することを含む。ｃＤＮＡは、本明細書に記載の任意のタンパク質融合または複製の阻害物質を発現する任意の遺伝子由来であることができる。例えば、一実施形態では、ｃＤＮＡは、Ｃ４６ ｃＤＮＡである。別の実施形態では、ｃＤＮＡは、ＴＲＩＭ５α ｃＤＮＡまたはそのシクロフィリン融合物である。ＨＩＶ共受容体の発現を下方制御できる発現単位は、本明細書に記載の任意の阻害ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、または共受容体を標的とするアンチセンスであることができる。一実施形態では、発現単位は、ＣＣＲ５を標的とするｓｈＲＮＡである。１つの特定の実施形態では、ＣＣＲ５を標的とするｓｈＲＮＡは、配列番号１の配列を有する。

【0052】

ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであることができる。ある実施形態では、ウイルスベクターは、ＦＧ１１Ｆレンチウイルスベクターなどのレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、タンパク質融合または複製阻害物質をコードする遺伝子のｃＤＮＡが、ＦＧ１１ＦベクターのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位へクローン化されている。他の実施形態では、ＨＩＶ共受容体の発現を下方制御できる発現単位は、ＦＧ１１ＦベクターのＸｂａｌ／Ｘｈｏｌ制限部位間に挿入されている。本方法における使用に適した他のレンチウイルスベクターおよび制限部位は、当業者に知られている。

【0053】

本発明は、本発明の新規の発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。「宿主細胞」または「標的細胞」とは、本発明の方法および発現ベクターを用いて変換する細胞を意味する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発現ベクターが発現できる哺乳類細胞である。適切な哺乳類宿主細胞には、ヒト細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞（例えばアカゲザル細胞）、ヒト前駆細胞もしくは幹細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｄ１７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ならびにＣｆ２Ｔｈ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞は、造血前駆／幹細胞などの造血細胞（例えばＣＤ３４陽性造血前駆／幹細胞（ＨＰＳＣ））、単球、マクロファージ、末梢血単核球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または樹状細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＣＲ５＋造血細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、患者由来または患者に適合した宿主細胞であり得る。ある実施形態では、本発明の発現ベクターで形質導入した宿主細胞は、Ｘ４向性ＨＩＶ株またはＲ５向性ＨＩＶ株（ＨＡＡＲＴ耐性株を含む）感染に対して耐性である。

【0054】

発現ベクターおよび核酸の細胞への送達方法は当該技術分野で知られており、例えば、ウイルス感染、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション、細胞超音波処理、高速度微粒子銃を用いた遺伝子照射、および受容体媒介性トランスフェクションを含むことができる。

【0055】

本発明は、本発明の新規の発現ベクターを含む薬学的組成物も包含する。一実施形態では、薬学的組成物は、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つの発現ベクターおよび薬学的に許容可能な担体を含む。例えば、ある実施形態では、薬学的組成物は、有効量の発現ベクターおよび薬学的に許容可能な担体を含み、前記発現ベクターは、本明細書に記載のようにＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列、ならびに標的細胞へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む。

【0056】

「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」という語句は、動物またはヒトへ投与時に有害、アレルギー性、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用する「薬学的に許容可能な担体」は、医薬（ヒトへの投与に適した医薬など）の製剤化における使用のため許容可能な溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延化剤などを含む。薬学的活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が本発明の発現ベクターに適合しない場合を除き、治療組成物におけるその使用が意図される。本発明の薬学的組成物は、経口、経鼻、口腔内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射が挙げられるが、これらに限定されない各種投与経路による投与用に製剤化し得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は直腸投与用に坐剤として製剤化し得る。補充活性成分も、組成物のベクターまたはポリヌクレオチドを不活性化しない限り、組成物に組み込むことができる。

【0057】

本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的調製物を含み得る。例証として、遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液を、界面活性剤（ヒドロキシプロピルセルロースなど）と適切に混合して水中で調製できる。分散物もグリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにその混合物および油中で調製できる。通常の保存および使用条件下において、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含む。

【0058】

注入可能な使用に適した薬学的形態は、例えば、滅菌水溶液もしくは分散物、および滅菌注射液もしくは分散物の即時調製のための滅菌粉末剤を含む。一般に、これらの調製物は滅菌されており、容易に注入可能な範囲で流体である。調製物は、製造および保存条件下で安定しているべきであり、微生物（細菌および真菌など）の汚染作用に対して保護されているべきである。適切な溶媒または分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含んでよい。適切な流動性は、例えば、コーティング（レシチンなど）を用いることにより、分散物の場合は必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤を用いることにより維持することができる。微生物作用の予防は、各種抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行なうことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注入可能な組成物の長期吸収は吸収遅延化剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物を用いてもたらすことができる。

【0059】

滅菌注射液は、溶媒内に活性化合物を適量、所望により他の任意の成分（例えば上に列挙したとおり）と共に混合し、続いて滅菌ろ過することにより調製し得る。一般に、分散物は、例えば、上に列挙したとおりの、塩基性分散媒体および所望の他の成分を含む滅菌ビヒクル内に各種滅菌活性成分を混合することにより調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法としては、活性成分（１つまたは複数）の粉末に加えて任意の追加の所望の成分を、前もって滅菌ろ過したその溶液から得る真空乾燥および乾燥凍結技術が挙げられる。

【0060】

本発明の組成物は一般に、中性型で製剤化してもよいし塩形態で製剤化してもよい。薬学的に許容可能な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）から得られる、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）から得られる酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。タンパク質の遊離カルボキシ基と形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第２鉄）から得ることもでき、または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から得ることもできる。

【0061】

本発明は、ＨＩＶ感染の治療または予防を、それを必要としている患者において行なう方法も含む。本明細書で使用する「患者」または「対象」は、ヒトおよび哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない任意の脊椎動物を含み得る。しかしながら、有利に、患者または対象は、ヒトもしくは非ヒト霊長類などの哺乳動物、または例えば、イヌ、ネコ、ウマなどの飼われている哺乳動物などの哺乳動物、または例えば、雌牛、ヒツジ、ブタなどの家畜哺乳動物である。患者がヒト以外である場合、本発明は、患者におけるＨＩＶ関連感染治療または予防方法を提供する（例えば、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶによる感染）。１つの好ましい実施形態では、患者はヒトである。

【0062】

一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の本発明の発現ベクターを含む薬学的組成物を投与することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、発現ベクターを含む薬学的組成物を患者に投与することを含み、前記発現ベクターは、ＣＣＲ５（またはＣＸＣＲ４）を標的とするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列およびＣ４６タンパク質をコードする第２の核酸配列を含み、任意選択的に前記第１の核酸配列は第１のプロモーターと機能的に連結されており、前記第２の核酸配列は記載のように第２のプロモーターと機能的に連結されている。他の実施形態では、本方法は、発現ベクターを含む薬学的組成物を患者に投与することを含み、前記発現ベクターは、ＣＣＲ５（またはＣＸＣＲ４）を標的とするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列、ならびにＴＲＩＭ５αタンパク質またはその誘導体もしくは融合物をコードする第２の核酸配列を含み、任意選択的に前記第１の核酸配列は、第１のプロモーターと機能的に連結されており、前記第２の核酸配列は、記載のように第２のプロモーターと機能的に連結されている。さらに他の実施形態では、本方法は、発現ベクターを含む薬学的組成物を患者に投与することを含み、前記発現ベクターは、ＨＩＶ共受容体の阻害物質（例えば、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４に対するｓｈＲＮＡ）をコードする第１の核酸配列、融合阻害物質（例えば、Ｃ４６）をコードする第２の核酸配列、およびＨＩＶ複製阻害物質（例えば、ＴＲＩＭ５αタンパク質またはその誘導体もしくは融合物）をコードする第３の核酸配列を含み、任意選択的に前記第１、第２、および第３の核酸配列は本明細書に記載の第１、第２、および第３のプロモーターと機能的に連結されている。別の実施形態では、本方法は、発現ベクターを含む薬学的組成物を患者に投与することを含み、前記発現ベクターは、ＨＩＶ共受容体の第１の阻害物質（例えば、ＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡ）をコードする第１の核酸配列、ＨＩＶ共受容体の第２の阻害物質（例えば、ＣＸＣＲ４に対するｓｈＲＮＡ）をコードする第２の核酸配列、および標的細胞へのＨＩＶウイルス融合もしくはＨＩＶ複製阻害物質をコードする第３の核酸配列を含み、任意選択的に前記第１、第２、および第３の核酸配列は本明細書に記載の第１、第２、および第３のプロモーターと機能的に連結されている。

【0063】

ある実施形態では、薬学的組成物を投与する患者は、ＨＩＶのＲ５向性株とＸ４向性株（ＨＡＡＲＴ耐性株を含む）感染リスクがある患者であり、かかるリスクは、組成物の投与後に改善する。いくつかの実施形態では、患者はＨＩＶ陰性である。他の実施形態では、患者（例えば、ヒト）はＨＩＶ陽性であり、高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）未施行、すなわちＨＡＡＲＴを一度も受けたことがないヒト患者であり得、このＨＡＡＲＴはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質、プロテアーゼ阻害物質、および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害物質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、患者はＨＡＡＲＴレジメンを受けている。さらに他の実施形態では、患者はＨＡＡＲＴレジメンが奏効していないか奏効しなかった（すなわちＨＡＡＲＴ耐性のためにＨＡＡＲＴがウイルス負荷の低減において無効である）。したがって、ある実施形態では、発現ベクターは、ＨＩＶ陰性患者を予防するためまたはＨＩＶ陽性患者を治療するために患者に直接導入される。

【0064】

組成物の発現ベクターは、それらが特定的に特定の細胞タイプ（免疫細胞など）に位置するように改変できる。例として、発現ベクターは、受容体媒介性遺伝子標的化ビヒクルとの組み合わせであり得、前記標的化ビヒクルは、細胞受容体特異性リガンドおよびＤＮＡ結合剤を含む。あるいは、細胞受容体特異性リガンドは、発現ベクターを含むリポソームに結合することができる。細胞受容体特異性リガンドは、対象となる細胞タイプに応じて選択することができる。例えば、いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＣＤ３４細胞表面マーカーに結合するリガンドを使用することによりＣＤ３４＋細胞に局在化させ得る。当業者は、免疫細胞などの特異性細胞タイプ（例えば、単球／マクロファージ、末梢血単核球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または樹状細胞）の対象に適したリガンドを選択できる。発現ベクターがウイルスベクターである、ある実施形態では、ウイルスベクターは、ある細胞タイプに対して特定の向性を有するウイルス粒子内にパッケージできる。例えば、一実施形態では、ウイルスベクターは、ＨＩＶレトロウイルス粒子内にパッケージされ、それにより、組換えレトロウイルスをＣＤ４＋Ｔ細胞およびマクロファージに感染させる。

【0065】

本発明による薬学的組成物の患者への投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般の経路を介し得る。これは、経口、経鼻、または口腔内を含む。あるいは、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射であり得る。一実施形態では、薬学的組成物は（例えば、坐剤で）直腸内投与してよい。製剤において、溶液は、好ましくは投与製剤に適合するある方法で治療的有効量投与する。製剤は、様々な投与量形態（注射液、薬剤放出カプセルなど）で容易に投与し得る。水溶液内の非経口投与において、例えば、溶液は一般に適切に緩衝されており、希釈液はまず例えば十分な生理食塩水またはグルコースで等張化されている。かかる水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与において使用することができる。好ましくは、特に本開示の観点から、当業者に知られているように滅菌水性媒体を使用する。例証として、単回用量は、１ｍｌ等張ＮａＣｌ溶液に溶解し得、１０００ｍｌ皮下点滴流体に添加するかまたは提案される注入部位に注射するかのいずれかを行なう（例えば、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐａｇｅｓ １０３５−１０３８ ａｎｄ １５７０−１５８０を参照されたい）。投与量は、治療する患者におけるＨＩＶ感染の段階に応じていくらか変動し得る。いずれにせよ、投与責任者は、個々の患者に適した用量を決定するであろう。さらに、ヒト投与において、調製物は、米食品医薬品局（ＦＤＡ）事務局の生物製剤標準に要される無菌、発熱性、一般的安全性および純度標準を満たすべきである。

【0066】

別の実施形態では、本発明は、細胞を本発明の発現ベクターで形質導入させて産生したＨＩＶ耐性造血細胞を患者に投与することにより、患者におけるＨＩＶ感染を治療または予防する方法を提供する。例えば、一実施形態では、本方法は、造血細胞をエクスビボで本明細書に記載の発現ベクターで形質導入すること、および形質導入細胞を患者に注入することを含む。形質導入細胞は患者に１回または複数回注入することができる。いくつかの実施形態では、患者に一定間隔（週１回、隔週、月１回、３ヶ月に１回、または年１回など）で形質導入細胞を複数回注入する。一実施形態では、患者に形質導入細胞を２週間毎注入する。本方法における使用に適した造血細胞としては、造血前駆／幹細胞（ＨＰＳＣ）、単球、マクロファージ、末梢血単核球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、および樹状細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本方法に使用する造血細胞はＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または単球／マクロファージである。１つの好ましい実施形態では、本方法に使用する造血細胞はＨＰＳＣである。本明細書で使用するように、形質導入造血細胞は、形質導入細胞自体ならびに形質導入細胞に由来する細胞（例えば、形質導入ＨＰＳＣから生成した細胞）を含む。

【0067】

したがって、１つの特定の実施形態では、本発明は、形質導入ＨＰＳＣから生成したＨＩＶ耐性細胞で免疫系を再構成することにより患者におけるＨＩＶ感染の治療または予防方法を提供する。例えば、一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の発現ベクターでＨＰＳＣを形質導入することおよび患者に前記形質導入ＨＰＳＣを移植することを含み、前記移植細胞は、ＨＩＶ感染に対して耐性である顆粒球、単球／マクロファージ、およびリンパ球を生成する。顆粒球、単球／マクロファージ、およびリンパ球は、ＨＩＶのＲ５向性株とＸ４向性株による感染に対して耐性である。いくつかの実施形態では、顆粒球、単球／マクロファージ、およびリンパ球は、ＨＡＡＲＴ耐性であるＨＩＶ株による感染に対して耐性である。患者はＨＩＶ陰性であることもＨＩＶ陽性であることもできる。一実施形態では、ヒト患者は高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）未施行である。別の実施形態では、患者はＨＡＡＲＴレジメンを受けている。さらに別の実施形態では、患者はＨＡＡＲＴレジメンに奏効していないか奏効しなかった者である。

【0068】

本発明の発現ベクターで形質導入する造血細胞（例えばＨＰＳＣ、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、および／または単球／マクロファージ）は、同種異系間であることもでき、自家であることもできる。「同種異系間の細胞」とは、同種の異なる個体から得られた細胞を指す。本明細書で使用する「自家細胞」という語句は、患者から単離されてから同じ患者に再移植または注射された細胞を指す。したがって、自家移植は、ドナーとレシピエントが同じ患者である移植である。ある実施形態では、造血細胞は、自家ＨＰＳＣである。ＨＰＳＣは、好ましくはＣＤ３４陽性であり、患者の骨髄または末梢血から単離することができる。かかる精製方法は当業者に知られている（例えば、米国特許第４，９６５，２０４号、同第４，７１４，６８０号、同第５，０６１，６２０号、同第５，６４３，７４１号、同第５，６７７，１３６号、同第５，７１６，８２７号、同第５，７５０，３９７号、および同第５，７５９，７９３号を参照されたい）。例えば、かかるＣＤ３４陽性幹細胞の１つの精製方法には、単核球と顆粒球を分離するための末梢血試料の遠心分離、続いてＣＤ３４＋細胞を選別するための蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。一実施形態では、細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから利用可能で先に記載されているもの（Ｋｏｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．， Ｖｏｌ． ２１：２３３−２４１； Ｐａｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ．， Ｖｏｌ． １０８： ７９３−８００）などの磁気分離技術を介してＣＤ３４＋細胞に対して富化される。ＣＤ３４陽性細胞は回収前に、造血幹細胞を動員することが知られている１つまたは複数のサイトカイン（顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、および幹細胞因子など）を患者に注射することにより骨髄から血中へ動員させ得る。

【0069】

単離されたＣＤ３４陽性ＨＰＳＣ（および／または本明細書に記載の他の造血細胞）は、好ましくは本発明の発現ベクターで形質導入される。例えば、一実施形態では、発現ベクターは、ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列、ならびに標的細胞へのＨＩＶ融合もしくはＨＩＶ複製を阻害するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含み、任意選択的に前記第１の核酸配列は、第１のプロモーターと機能的に連結されており、前記第２の核酸配列は、第２のプロモーターと機能的に連結されている。別の実施形態では、発現ベクターは、ＨＩＶ共受容体の阻害物質をコードする第１の核酸配列、融合阻害物質をコードする第２の核酸配列、およびＨＩＶ複製阻害物質をコードする第３の核酸配列を含み、任意選択的に前記第１、第２、および第３の核酸配列は第１、第２、および第３のプロモーターと機能的に連結されている。さらに別の実施形態では、発現ベクターは、ＨＩＶ共受容体の第１の阻害物質をコードする第１の核酸配列、ＨＩＶ共受容体の第２の阻害物質をコードする第２の核酸配列、および標的細胞へのＨＩＶウイルス融合もしくはＨＩＶ複製の阻害物質をコードする第３の核酸配列を含み、任意選択的に前記第１、第２、および第３の核酸配列は第１、第２、および第３のプロモーターと機能的に連結されている。

【0070】

一実施形態では、第１の核酸配列（または発現ベクターが３つの核酸配列を含む実施形態の第２の核酸配列）は二重鎖領域を有するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードし、この二重鎖領域は、ＣＣＲ５配列と実質的に同一および相補性の配列を含む。別の実施形態では、第１の核酸配列は、ＣＣＲ５を標的とし配列番号１の配列を有するｓｈＲＮＡをコードする。別の実施形態では、第１の核酸配列は二重鎖領域を有するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードし、この二重鎖領域は、ＣＸＣＲ４配列と実質的に同一および相補性の配列を含む。特定の実施形態では、形質導入造血細胞（例えばＨＰＳＣ、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、および／または単球／マクロファージ）またはそれらから生成された細胞は、形質導入されていない造血細胞と比較してより低いレベルのＨＩＶ共受容体（例えばＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）タンパク質を発現する。例えば、形質導入造血細胞またはそれらから生成された細胞は、ＨＩＶ共受容体タンパク質を形質導入されていない造血細胞と比較して３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％低く発現し得る。他の実施形態では、造血細胞は、本発明の発現ベクターで形質導入されており、第２の核酸配列（または発現ベクターが３つの核酸配列を含む実施形態の第３の核酸配列）はＴＲＩＭ５αタンパク質またはその誘導体もしくは融合物（ヒトＴＲＩＭ５α、アカゲザルＴＲＩＭ５α、キメラＴＲＩＭ５α、またはヒトＴＲＩＭ５−シクロフィリン融合タンパク質など）をコードする。さらに他の実施形態では、造血細胞は、本発明の発現ベクターで形質導入されており、第２の核酸配列（または発現ベクターが３つの核酸配列を含む実施形態の第３の核酸配列）はＣ４６タンパク質をコードする。かかる実施形態では、形質導入造血細胞またはそれらから生成された細胞は、形質導入されていない造血細胞と比較してより高いレベルのタンパク質（例えばＣ４６またはＴＲＩＭ５αまたはその誘導体もしくは融合物）を発現する、すなわち形質導入されていない造血細胞と比較して２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、または２００％超多いタンパク質をコードする。

【0071】

造血細胞（例えば、ＨＰＳＣ、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または単球／マクロファージ）を本発明の発現ベクターで形質導入後、形質導入細胞を患者に再導入または再移植する。形質導入細胞は患者に非経口注射することもでき、当該技術分野で知られている他の任意の経路により再導入することもできる。一実施形態では、形質導入造血細胞を、患者に静脈内注射する。好ましくは、有効量の形質導入造血細胞を、患者に投与する。「有効量」とは有益または所望の臨床結果をもたらす上で十分な量であり、使用する造血細胞タイプによって異なり得る。一実施形態では、造血細胞はＨＰＳＣであり、有効量はＨＩＶ耐性細胞で免疫系を少なくとも部分的に再構築する上で十分な量である。前記用量は１回または複数回投与でき、約０．５×１０^６ＨＰＳＣ／ｋｇ患者体重〜約１×１０^９ＨＰＳＣ／ｋｇ患者体重であり得る。別の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または単球／マクロファージであり、有効量は約１×１０^９細胞／患者〜１×１０^１１細胞／患者であり得る。しかしながら、何が有効量とみなされるかの厳密な決定は、患者のサイズ、年齢、ＨＩＶ感染重症度（例えばウイルス力価）、およびウイルス汚染からの時間を含む各患者に対する個々の要因に基づき得る。当業者、具体的には医師は、有効量を成すであろう形質導入造血細胞数を、過度の実験の必要なしに決定することができるであろう。

【0072】

理論に縛られず、本出願者らは、ＨＩＶ疾患の成功裏な幹細胞療法には形質導入された移植細胞の選択が関与することを確信する。本発明の一態様では、ＨＩＶ感染個人の詳細な動態試験により、１日約１０^９〜１０^１０ＣＤ４＋Ｔ細胞をＨＩＶ−１が殺傷し、身体はそれを補充することが示される。これは、１日の総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の０．５％〜５％の交代、その結果約２週間毎の完全なＣＤ４＋Ｔ細胞集団の推定交代を示す。したがって、健常な未治療ＨＩＶ感染個体においてさえ、安定したＣＤ４＋Ｔ細胞数は、大量なＴ細胞の進行死および補充を見えなくする。Ｔ細胞は、２つの源、すなわち既存の末梢Ｔ細胞の拡大および胸腺に由来する新規Ｔ細胞の産生から（ＨＰＳＣ移植後の新規Ｔ細胞生成に見られる様式に類似した様式で）取替えられる。本発明は、保護されたＴ細胞および単球／マクロファージの継続的な供給源を提供する遺伝子改変ＨＰＳＣで再構築する方法を提供する。これらの細胞は、大量ＨＩＶＴ細胞の枯渇に対して選択される可能性が高い。

【0073】

Ｔ細胞死および再生が関与する選択的圧力を、遺伝子形質導入細胞を選択するために利用するという概念は、血液およびリンパ分化の知識の堅固な基盤に基づく。この概念は、移植ＨＰＳＣに由来するＴ細胞を含む遺伝子が同様に選択され、遺伝子的に改変したＴ細胞での再生に至るＸ連結ＳＣＩＤおよびＡＤＡ−ＳＣＩＤのための遺伝子療法臨床試験においても成功裏に試験されている。

【0074】

最近の症例試験は、ＨＩＶ−１感染から保護された細胞での免疫系の再構成は、保護された細胞を選択し、ＨＩＶ−１複製を大幅に弱め、臨床経過を良好にし得ることを支持する。ＡＭＬを併発するＨＩＶ−１陽性の個人を、特にＣＣＲ５Δ３２同型接合ドナーから選択される同種異系間のＨＰＳＣ移植により治療した。著しいことに、ＣＣＲ５Δ３２ドナー細胞が急速６０日間以内にレシピエント細胞に完全に取って代わり、患者は、抗レトロウイルス剤療法なしでＨＩＶ−１が２００日超検出不能なままであった。

【0075】

ここで以下の実施例に記載する具体的な実施形態を参照することにより本発明をさらに詳細に例証する。実施例は、純粋に本発明の例証であることを意図し、本発明の範囲を限定することはどのような形でも意図しない。

【実施例】

【0076】

実施例１．ＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡおよびＣ４６融合阻害物質（ｓｈ５／Ｃ４６二重ベクター）を含む二重ベクターの構築ならびに単一の治療挿入物を有するかもしくは治療挿入物のない対照ベクターの構築
Ａ．ベクタープラスミド構築物
様々な構築物を設計して、プラスミドとしてＤＮＡ形態で加工した。構築物を表１に要約し、図１〜４に図示説明する。これらの構築物はすべてパッケージング細胞系内へトランスフェクション時にレンチウイルスベクターを生じさせる（以下の項目Ｂ参照）。

【0077】

（表１）ベクタープラスミド構築物の説明

【0078】

これらのベクターの遺伝子操作は以下のとおりであった。

【0079】

ユビキチンプロモーターにより駆動されたＥＧＦＰを含むｐＦＧ１２主鎖レンチウイルスベクタープラスミド（ｐＦＧ１２−Ｕ−ＥＧＦＰ）（図２において「ｐＦＧ１２」と標識）は、（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ． １００： １８３−１８８）に記載のように先のレンチウイルスベクターＦＵＧＷ（Ｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２９５： ８６８−８７２）から誘導した。主鎖ベクター内へのさらなる挿入を補助するため、複数のクローニング部位をＦＧ１２に挿入することにより、ｐＦＧ１１Ｆ−Ｕ−ＥＧＦＰ産生を可能とさせて、プラスミド主鎖ｐＦＧ１１Ｆを産生した（図２において「ｐＧ１１Ｆ」と標識）。

【0080】

レンチウイルスベクター内Ｈ１プロモーターの制御下、ヒトケモカイン共受容体５（ｈｕＣＣＲ５）に対して向けられる小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）無作為ライブラリーを、ｃＤＮＡからのＲＮＡｉライブラリーの酵素産生を介して産生した。精製したＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ断片で平滑末端化したＢｐｍＩで消化させ、ＢａｍＨＩで消化させ、ヒトＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよび４Ｔ決定シグナルを含むｐＢＳｈＨ１−５プラスミドＤＮＡにライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌内に導入し、一晩プレート化した。コロニーを併合して、プラスミドＤＮＡを調製した。Ｈ１プロモーター、ｓｈＲＮＡ配列および４Ｔ決定シグナルからなるｓｈＲＮＡ発現単位をＸｂａＩおよびＸｈｏｌＩ消化によりｐＢＳｈＨ１−５プラスミドＤＮＡから切除し、ｐＦＧ１２−Ｕ−ＥＧＦＰベクターのＸｂａＩ／ＸｈｏｌＩ部位内に挿入して、Ｈ１プロモーターにより駆動された、ＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡを産生した。これらの構築物の最良のものであるｓｈ１００５をさらなる実験のために選択した。ｓｈ１００５およびユビキチンプロモーターにより駆動されたＥＧＦＰを含むプラスミド構築物は、ｐＦＧ１２−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−ＥＧＦＰと称される（図３；Ａｎ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ． １０４ （３２）： １３１１０−１３１１５）。制限酵素を用いてＵ−ＥＧＦＰカセットをｐＦＧ１２−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−ＥＧＦＰから除去し、ｐＦＧ１２−Ｈ１−Ｒ５を産生した（図３）。

【0081】

ＥＧＦＰ遺伝子をｐＦＧ１１Ｆ−Ｕ−ＥＧＦＰ（図４におけるｐＦＧ１１Ｆ）から除去し、Ｃ４６遺伝子と置換して、ｐＦＧ１１Ｆ−Ｕ−Ｃ４６を産生した（図４）。ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ消化を用いてＨ１−Ｒ５カセットをｐＦＧ１２−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−ＥＧＦＰから切除し、ｐＦＧ１１Ｆ−Ｕ−Ｃ４６内に挿入し、これもＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで消化して、ｐＦＧ１１Ｆ−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−Ｃ４６を産生した（図４）。

【0082】

Ｂ．レンチウイルスベクターの産生
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）−Ｇ偽型レンチウイルスベクターストックをすべてＨＥＫ−２９３ Ｔ細胞のリン酸カルシウム媒介性一過性トランスフェクションにより産生した。ＨＥＫ−２９３ Ｔ細胞を日常的にＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で培養し、トランスフェクションのためにイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に変更した。すべての培養物は１０％ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００単位のペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有した。細胞を適量のベクタープラスミド、ＨＩＶ−１レンチウイルスのパッケージング構築物であるｐＲＳＶ−ＲｅｖおよびｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、およびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドであるｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇと共トランスフェクトした（表２）。トランスフェクション後２日目および３日目に、ウイルスを培養上清から採取して濃縮した。濃縮ウイルスストックをＧＦＰ発現に基づきＨＥＫ−２９３ Ｔ細胞上で滴定した。ｓｈＲＮＡ発現ＥＧＦＰ構築物の力価は親ＥＧＦＰベクターと比較してわずかにのみ低下した。産生に使用したプラスミドを図５に図式的に示す。

【0083】

（表２）レンチウイルス産生のためのベクター

【0084】

方法１：非キット試薬を用いた塩化カルシウムトランスフェクションによるレンチウイルス産生
１． トランスフェクション前日、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を１．５×１０^７細胞／Ｔ１７５でフラスコのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳおよび抗生剤内に播種する。
２． トランスフェクション日、培地を１０％ＦＢＳ、抗生剤およびクロロキン（１０ｍＭの１００μｌ）含有ＩＭＤＭ２５ｍＬに変更する。
３． ＤＮＡマスター混合物を調製する
ａ． ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ １０μｇ
ｂ． ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ ２．５μｇ
ｃ． ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ ３．２μｇ
ｄ． ベクター（例えば図１〜４の構築物のうちの１つ）１０μｇ
ｅ． 水を添加して総容量９８０μＬに調節する
４． １３３μＬの２Ｍ ＣａＣｌ_２を添加し、混合して、氷上で１０分間インキュベートする。
５． 手で管を撹拌しながら、１１１０μＬの２×ＨＢＳ（１ｇ Ｈｅｐｅｓ、１．６ｇ ＮａＣｌ、０．７２ｍｌの０．２５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１ｍｌの１Ｍ ＫＣｌ）を滴下する。
６． 氷上で２０分間インキュベートする。
７． 細胞のＴ１７５フラスコを逆さに傾け、ＤＮＡ混合物を培地に添加し、フラスコを２〜３回混合し、フラスコを右上方向にフリップする。
８． 培養を６〜８時間インキュベートする
９． 培地を除去して、新規の４２ｍＬのＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳおよび抗生剤と交換する。
１０． 形質導入後４８時間目、培地を回収して、０．２２または０．４５μＭフィルターを介してろ過し、新規の４２ｍｌのＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳおよび抗生剤と交換する。
１１． 形質導入後７２時間目、培地を回収して、０．２２または０．４５μＭフィルターを介してろ過する。
１２． 両回収物をプールする
１３． ウイルス含有培地（ＶＣＭ）を超遠心分離によりＳＷ２８またはＳＷ３２管内で濃縮する。
ａ． ３３〜３８ｍＬのＶＣＭをショ糖緩衝液と共に管内に負荷する。
ｂ． 管を２０，０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離する。
ｃ． 上清を除去して、２５０〜５００μＬのＰＢＳまたはＨＢＳをペレットに添加する。
ｄ． ＶＣＭを４℃で一晩保存する。
ｅ． ＶＣＭをピペットで取って混合し、アリコートして、−７０℃で保存する。
方法２：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＣａｌＰｈｏｓキットを用いた塩化カルシウムトランスフェクションによるレンチウイルス産生。
１． トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を２．１×１０^７細胞／Ｔ２２５で３０ｍＬのＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ溶液に播種する。
２． トランスフェクション日、ＤＮＡマスター混合物を１５ｍＬ管内で調製する：
ａ． ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ １３μｇ
ｂ． ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ ３．２５μｇ
ｃ． ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ ４．１６μｇ
ｄ． ベクター（例えば図１〜４の構築物のうちの１つ）１３μｇ
ｅ． 水を添加して総容量１５００μＬに調節する
３． １８６μＬの２Ｍ ＣａＣｌ_２を添加して、混合する。
４． 管をボルテックスしながら、１５００μＬの２×ＨＢＳを滴下する。
５． 室温で２０分間インキュベートする。
６． ３０ｍＬのＩＭＤＭ＋２％ＦＢＳを５０ｍＬ管に添加する。
７． ＤＮＡ溶液を５０ｍＬ管内のＩＭＤＭに添加する。
８． 前日回収した細胞から培地を吸引する。
９． 細胞単層をかき乱さないように、フラスコ中にＤＮＡ／ＩＭＤＭ溶液を穏やかにそそぐ。
１０． フラスコを左右に穏やかに攪拌して細胞を混合物で覆う。
１１． 培養を４時間インキュベートする。
１２． 培地を除去し、細胞をＰＢＳですすぎ、新規の３０ｍＬのＩＭＤＭ＋２％ＦＢＳと交換する。
１３． 形質導入後２４時間目、培地を回収して、新規の３０ｍＬのＩＭＤＭ＋２％ＦＢＳと交換する。
１４． 回収したＶＣＭを０．２２μＭフィルターを介してろ過し、４℃で一晩保存する。
１５． 形質導入後４８時間目、培地を回収して、０．２２μＭフィルターを介してろ過する。
１６． 両ＶＣＭ回収物をプールおよびアリコートして、−７０℃で保存する。
１７． 必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）カラムを用いてＶＣＭを濃縮する：
ａ． １０ｍＬの７０％エタノールを添加することによりＶｉｖａｓｐｉｎ２０ ＭＷＣＯ １０００００を調製する
ｂ． １０００ｇで１０分間回転させる。
ｃ． 残りのエタノールを廃棄して、ＰＢＳを１５ｍＬ添加する。
ｄ． １０００ｇで１０分間回転させる。
ｅ． 残りのＰＢＳを廃棄して、ＶＣＭを１８ｍＬ添加する。
ｆ． １０００ｇで３０分間または全ＶＣＭがカラムを通過するまで回転させる。

【0085】

いずれかの方法から得られたＶＣＭを用いて（希釈または濃縮して）、標的細胞（Ｔ細胞系、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＣＤ３４＋造血前駆幹細胞（ＨＰＳＣ））を形質導入し、形質導入細胞のＥＧＦＰ発現、（ＣＤ１９５抗体染色を介した）ＣＣＲ５発現および（２Ｆ５抗体染色を介した）Ｃ４６発現についてフローサイトメトリー分析した。

【0086】

実施例２．ｓｈ５／Ｃ４６二重ベクターによるヒト標的Ｔ細胞系の形質導入
実施例１に記載の各種レンチウイルスベクターを用いてＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５およびＭｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞（ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラム）細胞に感染させた。１０％ＦＢＳおよび８μｇ／ｍＬのポリブレンと共に１ｍＬの未濃縮ウイルス含有培地（ＶＣＭ）で２×１０^５細胞を再懸濁した。培養物を３７℃で１時間半インキュベートして、さらに１ｍＬの増殖培地を添加した（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）。形質導入後４日目、細胞のＣ４６発現（２Ｆ５抗体染色による）、ＣＣＲ５ノックダウン（ＣＤ１９５抗体染色による）、およびＧＦＰ発現についてＦＡＣＳ分析により分析した。細胞を連続培養させ続け、週２回最大８週間継代させた。

【0087】

形質導入ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５およびＭｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞内のｓｈＲＮＡ（ＣＣＲ５ノックダウンにより検出した）とＣ４６の同時発現を、それぞれ図６および図７に示す。ＧＦＰ発現はＥＧＦＰを含む構築物に観察された（左から右の順でパネル１、３）；ＣＣＲ５発現低下（例えばＣＣＲ５の下方制御は、ｓｈＲＮＡ発現を示す）はｓｈ５を含む構築物に観察され（左から右の順でパネル２、３、５）、Ｃ４６発現（２Ｆ５抗体により測定した）はＣ４６を含む構築物に観察された（左から右の順でパネル４、５）。培養中４週目と８週目、示されるレンチウイルスベクターでの形質導入細胞の各群における陽性細胞率を、４分割した各フローサイトメトリー（Ｑ１〜Ｑ４）に示す。４週目と８週目で類似した発現レベルが見られた。図６の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を下表３に示し、図７のＭＦＩ値を下表４に示す。

【0088】

（表３）各種構築物を発現するＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５細胞の平均蛍光強度値

【0089】

（表４）各種構築物を発現するＭｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞の平均蛍光強度値

【0090】

導入遺伝子により細胞の増殖変数に何らかの相違が生じたかどうかを決定するため、それぞれ遺伝子導入構築物の１００％発現を示したＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５細胞を２×１０^４細胞／ｍＬ播種し、４日間培養して計数した。次いでこの集団から１または２×１０^５／ｍＬの細胞を４つの別々の状況で３週間かけて播種し、４〜７日後に計数した。異なる構築物での形質導入細胞間に増殖速度差は観察されなかった（図８）。

【0091】

これらの実験結果は、ＣＣＲ５を標的とするｓｈＲＮＡとＣ４６タンパク質の両方がヒトＴ細胞系における同じベクターから十分に発現でき、ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ発現とＣ４６発現は細胞の増殖速度に対して影響がないことを示す。

【0092】

実施例３．ｓｈ５／Ｃ４６二重ベクターによるヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の形質導入
実施例１に記載の各種レンチウイルスベクターを用いて、オーストラリア赤十字輸血施設から得たヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を感染させた。Ｆｉｃｏｌｌ−ｐｌａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＭＣを軟膜から単離してから、ＣＤ８＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＶａｒｉｏＭＡＣＳ磁気単位を用いてＣＤ８を枯渇させた。ＣＤ８＋枯渇ＰＢＭＣを２０％ＦＢＳおよび５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（Ｓｉｇｍａ）で補充したＲＰＭＩ １６４０培地内で２×１０^６細胞／ｍＬで４８時間培養した。ＰＨＡで２日間刺激後、懸濁液中の細胞を回収し、２００ｇで５分間遠心分離して、形質導入前、２×１０^６細胞／ｍＬでＲＰＭＩ＋２０％ＦＢＳ＋１０Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２；Ｒｏｃｈｅ）で４時間再懸濁した。

【0093】

好ましい形質導入方法を確認するため、ＰＢＭＣを以下の様々な条件を用いてｓｈ５／ＥＧＦＰレンチウイルス構築物で形質導入した：ＶＣＭでの１×形質導入、ＶＣＭでの２×形質導入、ＶＣＭ前負荷での１×形質導入（前負荷１）、ＶＣＭ前負荷での２×形質導入（前負荷２）、約２０倍（濃縮した）濃縮ＶＣＭ（実施例１、項目Ｂ参照）。図９に示すとおり、濃縮ウイルスでの形質導入が最も効果的であった。ＶＣＭ前負荷での単回形質導入（前負荷１）をさらなる実験に好ましい方法として選択した。図９のＭＦＩ値を下表５に示す。

【0094】

（表５）ｓｈ５／ＥＧＦＰ構築物を発現するＰＢＭＣの平均蛍光強度値

【0095】

ＰＢＭＣを形質導入しないままか、または以下の手順に従いｓｈ５／ＧＦＰ、Ｃ４６、ｓｈ５／Ｃ４６、ＧＦＰ対照もしくはｓｈ５レンチウイルス構築物のうちの１つで形質導入した（１×前負荷）。未濃縮ＶＣＭ２５０μＬを（６時間）前負荷したレトロネクチン被覆２４ウェルプレート（５μｇ／ｃｍ^２）上に１ｍＬのＰＢＭＣを移して、一晩培養した。翌日、細胞を３ｍＬのＲＰＭＩ＋２０％ＦＢＳ＋１０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２内で６ウェルプレートに移した。形質導入後４日目、細胞のＥＧＦＰ、ＣＣＲ５およびＣ４６発現について分析した。結果を図１０〜１３に示す。

【0096】

図１０に示すとおり、形質導入後４日目の異なる構築物におけるＰＢＭＣ内でのＥＧＦＰ、ＣＣＲ５、およびＣ４６発現は、予測したとおりであった。ＥＧＦＰ発現はＥＧＦＰを含む構築物に観察された（ＧＦＰ対照およびｓｈ５／ＧＦＰ；パネル１、２）；（ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡの発現を例証する）ＣＣＲ５発現低下はｓｈ５を含む構築物に見られ（ｓｈ５／ＥＧＦＰおよびｓｈ５／Ｃ４６、パネル２および４）、Ｃ４６発現（２Ｆ５抗体により測定した）はＣ４６を含む構築物に観察された（Ｃ４６およびｓｈ５／Ｃ４６；パネル３、４）。ＭＦＩ値は図１０の左から右の順で１６．２、８．４、１６．８、９．４であった。

【0097】

図１１は、形質導入ＰＢＭＣ（４日目）および形質導入ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５Ｔ細胞系（８週目）における遺伝子発現の比較を示す。ＥＧＦＰ発現はＥＧＦＰを含む構築物での形質導入細胞に観察された（ＧＦＰ対照およびｓｈ５／ＧＦＰ；パネル１および２）；ＣＣＲ５下方制御はｓｈ５を含む構築物での形質導入細胞に見られ（ｓｈ５／ＥＧＦＰおよびｓｈ５／Ｃ４６；パネル２および４）、Ｃ４６発現（２Ｆ５抗体により測定した）はＣ４６を含む構築物での形質導入細胞に観察された（Ｃ４６およびｓｈ５／Ｃ４６；パネル３および４）。両細胞タイプにおいてレンチウイルス構築物から十分な発現レベルが観察されたが、Ｔ細胞内でＰＢＭＣと比較してより高い発現レベルが観察された。図１１のＭＦＩ値を下表６に示す。

【0098】

（表６）各種構築物を発現するＰＢＭＣまたはＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５Ｔ細胞の平均蛍光強度値

【0099】

加えて、１、４、８および１２日目、遺伝子形質導入（ｓｈ５、ｓｈ５／ＥＧＦＰ、Ｃ４６、ｓｈ５／Ｃ４６）ＰＢＭＣと非形質導入ＰＢＭＣ間で増殖速度を比較した。各群の２つの複製播種を用いた。すべての形質導入ＰＢＭＣは互いに、および非形質導入細胞と比較して類似した総細胞／ウェルおよび生存細胞率を示した（図１２）。

【0100】

ＰＢＭＣ内の導入遺伝子発現の安定性も試験した。図１３は、４、７および１２日目、示される構築物で形質導入した細胞内のＥＧＦＰ、ＣＣＲ５、およびＣ４６の発現（２Ｆ５抗体により測定した）を示す。１２日目の細胞生存能は不明であったため、４日目と７日目間のみ比較した。図１３に示すとおり、両時点の各種導入遺伝子の発現は経時的に明らかに低下した。これは、おそらく経時的な増殖低下および生存能低下に関連する（図１２参照）。図１３のＭＦＩ値を下表７に示す。

【0101】

（表７）各種構築物を発現するＰＢＭＣの平均蛍光強度値

【0102】

これらの結果は、ＣＣＲ５を標的とするｓｈＲＮＡとＣ４６タンパク質の両方がヒトＰＢＭＣにおける同じベクターから十分に発現できることを示す。

【0103】

実施例４．ｓｈ５／Ｃ４６二重ベクターによるヒト造血前駆／幹細胞（ＨＰＳＣ）の形質導入
ｓｈ５／Ｃ４６レンチウイルスベクター（ＬＶ）を用いて、大量ドナー末梢血単核球から得たＣＤ３４＋造血前駆／幹細胞（ＨＰＳＣ）を形質導入した。ドナーに顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を注射してＨＰＳＣおよび末梢血単核球を動員した。Ｇ−ＣＳＦ注射後、アフェレーシスにより細胞を回収し、動員したＨＰＳＣを含む大量単核球集団を凍結した。この実施例に用いた単核球試料は、これらの凍結ストックから得た。凍結時点で推定３．７×１０^７ ＣＤ３４＋ＨＰＳＣを含んだ５０ｍＬ幹細胞回収バッグを融解した。融解時、総３３．６×１０^８生存細胞（７３％生存能）を含むことが分かり、ＭＡＣＳ（磁気抗体細胞分離）を用いて単離されたＣＤ３４＋ＨＰＳＣ数は約３．３×１０^７、すなわち約１％総単核球数（９８％ＣＤ３４陽性）であり、これは予測範囲内であった（図１４の上パネルの分離分析前後を参照されたい）。

【0104】

次いでこれらの細胞を以下の実験プロトコルに用いた：
１． 幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）（各５０ｎｇ／ｍＬ）を含むＸビボ血清非含有培地内で６×１０^６細胞を２４時間、前刺激した。
２． 次いでウイルス含有培地（ＶＣＭ）で６時間、前負荷した１２ウェルプレートに４×１０^５細胞のアリコートを移した。細胞を一晩（ＧＦＰ対照、ｓｈ５、ｓｈ５／ＥＧＦＰ、Ｃ４６、またはｓｈ５／Ｃ４６と）形質導入するかまたは形質導入しないままにしてから新規培地に７２時間移した。
３． 形質導入後７２時間目に実施したＦＡＣＳ分析により、ＧＦＰによる２５〜３０％形質導入が示された（図１４、下パネル）。この実施例において、Ｃ４６は２Ｆ５染色により検出不能であった。これは明らかにこれらの細胞がフローサイトメトリー感受性を欠くためである。残りの細胞をＣＡＭＥＯ−４（Ｈｅｍｏｇｅｎｉｘ）メチルセルロース培養に入れ、複製で１００細胞／ウェルでプレート化した。コロニーをスコア時、１１日目の培養間に有意差は見られなかった（表８）。

【0105】

（表８）各種レンチウイルス構築物で形質導入したＣＤ３４＋ＨＰＳＣのコロニー率（％）

【0106】

実施例５．ｓｈ５／Ｃ４６二重ベクター形質導入Ｔ細胞系はＨＩＶ複製を阻害する
ｓｈ５／Ｃ４６二重レンチウイルス構築物で形質導入したＴ細胞系（Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５）（実施例１のベクター説明を参照されたい）をＨＩＶの各種株：ＨＩＶ_Ｂａｌ（ＣＣＲ５向性）、ＨＩＶ_ＩＩＩＢ（ＣＸＣＲ４向性）、およびＨＩＶ_ＳＦ２（ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４向性）に曝露させた。曝露アッセイにおいて、１×１０^６形質導入Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞を１５ｍＬ管に添加し、遠心分離した。上清を廃棄した。ＨＩＶウイルス含有培地（ＶＣＭ）を添加して各管の最終濃度を感染効率（ＭＯＩ）０．２〜０．００２にした。次いでポリブレンを添加して最終濃度を８μｇ／ｍＬにし、各管を穏やかに軽く叩いた。細胞およびウイルスを３７℃で２時間インキュベートし、３０分毎に穏やかに撹拌した。２時間インキュベーション後、培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）内で細胞を洗浄し、Ｔ２５フラスコ内培地３〜４ｍＬで再懸濁した。細胞試料を採取して、１１日目までに３〜４日毎に供給した。上清１５０μｌを２回反復除去し、４℃で保存した。製造業者のプロトコルに従い、一般に値が標準曲線上に乗ることを確実にするために１／１０^５〜１／１０^６希釈を用いてＰ２４タンパク質レベル（ＨＩＶ感染の測定値）をアッセイした。

【0107】

図１５は、二重向性ＨＩＶ株ＳＦ２（ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４向性）で曝露から１３日後、非形質導入細胞または二重ｓｈ５／Ｃ４６レンチウイルス構築物での形質導入細胞のｐ２４タンパク質レベルを示す。結果は、ｓｈ５／Ｃ４６構築物での形質導入細胞は、２つの独立した試料採取のそれぞれにおいて全３つのＭＯＩ（０．２、０．０２、０．００２）で非形質導入細胞と比較して約２対数の阻害を示したことを示す。図１６は、二重向性ＨＩＶ株ＳＦ２曝露から１１日後、非形質導入細胞またはｓｈ５／Ｃ４６もしくはＣ４６レンチウイルス構築物のいずれかでの形質導入細胞のｐ２４タンパク質レベルを示す。データは、２つの独立した試料採取のそれぞれにおいて、試験した２つのＭＯＩでｓｈ５／Ｃ４６構築物による約２対数の阻害およびＣ４６による３対数の阻害（明らかにこの特定の構築物内のＣ４６高発現のため）を示す。図１６の下パネルは、フローサイトメトリーによる発現を示す。平均蛍光強度値を下表９に示す。

【0108】

（表９）Ｃ４６またはｓｈ５／Ｃ４６レンチウイルス構築物を発現するＭｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞の平均蛍光強度値

【0109】

別の実験において、Ｍｏｌｔ４／ＣＣＲ５細胞を形質導入しないかまたはＣ４６（遺伝子２）もしくはｓｈ５／Ｃ４６（Ｇ２Ｒ５）レンチウイルス構築物で形質導入してからＨＩＶ−ＳＦ２二重向性（ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）、Ｂａｌ（ＣＣＲ５向性）もしくはＮＬ４−３（ＣＸＣＲ４向性）ウイルスにＭＯＩ０．２で曝露させた。ＨＩＶ感染の測定値としてウイルス曝露から１１日後にＰ２４タンパク質レベルを評価した。図１７に示すとおり、両レンチウイルス構築物を発現する細胞は全３つのＨＩＶ株への感染を効果的に低減した。図１８は、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ株ＢａｌをＭＯＩ０．２で曝露してから７日後および１０日後の、非形質導入細胞（Ｍｏｌｔ４）または４つのレンチウイルス構築物［（１）ｓｈ５（Ｒ５）；（２）Ｃ４６（Ｇ２）；（３）ｓｈ５／Ｃ４６（Ｒ５−Ｇ２）；（４）ｓｈ５／ＥＧＦＰ（Ｒ５−ＧＦＰ）］のうちの１つでの形質導入細胞のｐ２４タンパク質レベルを示す。「混合」群は、非形質導入、ｓｈ５、Ｃ４６、ｓｈ５／Ｃ４６をすべて均等に（すなわち各２５％ずつ）混合した混合物である。結果は、単一のレンチウイルス構築物（二重構築物）からのＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡおよびＣ４６遺伝子を発現する細胞では、ウイルス曝露から７日後と１０日後の両日でＣＣＲ５向性ＨＩＶ株への感染に対する保護が高まったことを示す。

【0110】

この一連の実験の結果は、二重ｓｈ５／Ｃ４６レンチウイルス構築物で形質導入したＴ細胞は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ならびに二重向性ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４ ＨＩＶ株への感染に対して保護されることを示す。

【0111】

実施例６．ｓｈ５／Ｃ４６二重ベクター形質導入ＰＢＭＣはＨＩＶ複製を阻害する
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）／ＩＬ２刺激末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を実施例３に記載のレンチウイルスベクターで形質導入した。ＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡとＣ４６タンパク質を発現する二重構築物（ＬＶｓｈ５Ｃ４６）の図式を図１９Ａに示す。形質導入後４日目、適切なモノクローナル抗体（例えば、ＣＤ１９５または２Ｆ５抗体）で細胞を着色し、ＣＣＲ５、Ｃ４６、およびＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより分析した（図１９Ｂ）。レンチウイルス（ＬＶ）形質導入後１６日目、ＬＶ形質導入ＰＢＭＣをＲ５向性ＨＩＶ株またはＸ４向性ＨＩＶ株に曝露させた。ＨＩＶ感染後４日目、培養上清を回収してｐ２４タンパク質をＥＬＩＳＡによりアッセイした（図１９Ｃ）。

【0112】

図１９Ｃに示すとおり、ｓｈ５／Ｃ４６レンチウイルスベクターで形質導入したＰＢＭＣは、ｐ２４タンパク質レベルにより評価したＲ５向性株とＸ４向性株の両方に誘発されたＨＩＶ感染が低下したことを示す。ｓｈ５／ＧＦＰ構築物で形質導入したＰＢＭＣは、Ｒ５向性ＨＩＶに誘発される感染に対して耐性であるが、Ｘ４向性ＨＩＶに誘発される感染に対しては耐性ではない。これらの結果は、ｓｈ５／Ｃ４６二重ベクターは、Ｒ５向性株またはＸ４向性株のいずれかの誘発されるＨＩＶ感染に対しても保護できることを示す。

【0113】

実施例７．ｓｈ５ベクターは、リンパ器官内のＣＣＲ５発現を下方制御し、エクスビボで形質導入ＣＤ４＋Ｔリンパ球の優先的生存をもたらす
マトリゲルと胸腺切片との組み合わせで固化したｓｈ５レンチウイルス形質導入ＣＤ３４＋造血前駆／幹細胞（ＨＰＳＣ）をヒト化骨髄／肝臓／胸腺（ＢＬＴ）マウスモデルの腎臓莢膜下で移植した（Ｍｅｌｋｕｓ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔ Ｍｅｄ， Ｖｏｌ． １２：１３１６−１３２２； Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌ． １１５：１５３４−１５４４を参照されたい）。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−ｈｕ ＢＬＴヒト化マウスでは、ヒト胸腺様小器官（ｔｈｙ／ｌｉｖ）における形質導入ヒトＨＰＳＣ分化、およびＨＩＶ複製の主要部位である腸関連リンパ組織を含む全身性リンパ器官内の分化したヒトＴリンパ球移動の評価が可能である。

【0114】

このヒト化マウスモデルにおいてｓｈ１００５（ＣＣＲ５を標的とするｓｈＲＮＡ）を評価するため、マトリゲルと胸腺切片で固化したベクター形質導入胎児肝由来ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ３４−細胞を腎臓莢膜下で移植して、ベクター形質導入ｔｈｙ／ｌｉｖ組織を生成した。３週間後、ベクター形質導入自家ＣＤ３４＋ＨＰＳＣ（１×１０^６細胞）を亜致死照射したマウス尾に静脈内注射した。動物内のＣＣＲ５低下の影響を評価するため、ｓｈ１００５ベクター（ＥＧＦＰ＋）と非ｓｈＲＮＡ対照ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）で形質導入したＣＤ３４＋ＨＰＳＣ（５×１０^５細胞）の等量混合を共移植した。この実験設計は、ＣＣＲ５低下の安定性および特異性レベルに関してｓｈ１００５ベクター形質導入細胞が非ｓｈＲＮＡベクター形質導入細胞と異なるかどうかの評価を可能にする；マウス間の変動を制御するために、両ベクターは同じ動物に存在する。ＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ単独のいずれも再集団動態またはＣＣＲ５発現に対していかなる影響も与えなかった（データは示さず）。

【0115】

ＣＤ３４＋注射後１１週からヒト細胞移植を評価した。フローサイトメトリー分析により、移植したマウス由来の末梢血のゲートされたリンパ球集団でヒトＣＤ４５＋リンパ細胞を検出した（平均４４％、標準偏差±２８、ｎ＝１９）。ＥＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現がこの移植マウス内のヒトＣＤ４５＋集団に見出された（平均ＥＧＦＰ２２％、標準偏差±１９、平均ｍＣｈｅｒｒｙ２２％、標準偏差±１３、ｎ＝１６）。ＣＤ３４＋ＨＰＳＣ移植後１４〜２０週目、再構成動物の各種リンパ組織内のヒトＣＤ４＋およびＣＤ４５＋Ｔ−リンパ球内のＣＣＲ５−ノックダウンを評価した（図２０Ａ）。分析した全組織内でＥＧＦＰ＋ヒトＣＤ４＋およびＣＤ４５＋Ｔ−リンパ球内のＣＣＲ５発現は効果的に低下した。注目すべきことに、腸から単離されたＣＣＲ５高発現粘膜固有層リンパ球内でさえＣＣＲ５低下は効果的であった。ＣＣＲ５は、同じ動物のｍＣｈｅｒｒｙ＋ヒトＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ−リンパ球では低下しなかった。これらの結果は、ＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ発現はヒトＴ−リンパ球の分化および移動に影響を与えず、インビボ全身性リンパ器官内のＣＣＲ５下方制御を効果的に誘発したことを示す。

【0116】

ＣＣＲ５下方制御した細胞内のＨＩＶ感受性を評価するため、ＥＧＦＰ＋およびｍＣｈｅｒｒｙ＋脾細胞を細胞分取により動物から単離した。分取した細胞をＲ５向性ＨＩＶ−１_{ＮＦＮＳＸＳＬ９}またはＸ４向性ＨＩＶ−１_{ＮＬ４−３}のいずれかに感染させた（感染効率２．５で三つ組）。１２日間の培養期間にわたり、ＥＧＦＰ＋脾細胞の培養上清内でｐ２４ＨＩＶｇａｇ殻タンパク質産生は増加しなかった（図２０Ｂ）。一方、ｍＣｈｅｒｒｙ＋脾細胞はＲ５向性ＨＩＶ−１_{ＮＦＮＳＸＳＬ９}の影響を受けやすく、７日目および１２日目に培養上清中で約４倍高いレベルのｐ２４を産生し（Ｐ値＝０．００３）、これは、ＣＣＲ５下方制御がＲ５向性ＨＩＶ−１感染を効果的に阻害したことを示す。Ｒ５向性ＨＩＶ−１感染とは異なり、Ｘ４向性ＨＩＶ−１_{ＮＬ４−３}感染により、ＥＧＦＰ＋脾細胞培養上清とｍＣｈｅｒｒｙ＋脾細胞培養上清の両方で同等量のｐ２４が産生され、阻害の特異性が確認された（Ｐ値＝０．２３）。これらの結果により、ｓｈ１００５によるＣＣＲ５下方制御は、エクスビボ刺激した細胞をＲ５向性ＨＩＶ−１曝露から保護する上で十分であったが、Ｘ４向性ＨＩＶ−１曝露からは保護しなかったことが示された。

【0117】

ＣＣＲ５下方制御したＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボＨＩＶ感受性ならびに選択的保護および生存を評価するため、ＨＰＳＣ移植後９週目、Ｒ５向性ＨＩＶ−１_{ＮＦＮＳＸＳＬ９}を再構成マウスに静脈内注射した（ｐ２４＝２００ｎｇ）。ＨＩＶ注射後８週目、ＰＨＡ／ＩＬ２活性化ヒトＰＢＭＣで共培養したマウス末梢血上清中のｐ２４の存在によりマウスがＨＩＶに感染したことを確認した。ＥＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の末梢血中動態を評価した（図２０Ｃ）。この動物へのＨＩＶ注射後８週目までに、末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞内のＥＧＦＰ＋集団％は２０％から４０％に増加した。一方、この動物内のＣＤ４＋Ｔ細胞内のｍＣｈｅｒｒｙ＋集団は４０％から３％に低下した。ＨＩＶ誘発性ＣＤ４ Ｔ細胞損失を示すＣＤ４／ＣＤ８比率の反転を評価した。末梢血中のＨＩＶ曝露後８週目までに、ＥＧＦＰ＋リンパ球内のＣＤ４／ＣＤ８比率は１超に維持された（図２０Ｄ）。一方、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＣＤ４５＋細胞内のＣＤ４／ＣＤ８比率は０．１に反転した。これらの結果は、ｓｈ１００５による安定したＣＣＲ５の下方制御は、Ｒ５向性ＨＩＶインビボ曝露後にＣＤ４＋Ｔ細胞を選択的に増加させるのに十分であったことを示す。

【0118】

実施例８．ヒト化マウスモデルにおけるｓｈ５／Ｃ４６二重ベクターの試験
ｓｈ５ベクター（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌ． １１５： １５３４−１５４４）について実施例７に記載のように、ヒト化ＢＬＴマウスモデルにおいてｓｈ５／Ｃ４６二重レンチウイルスベクターを試験する。このヒト化マウスモデルにおいてｓｈ５／Ｃ４６二重ベクターを評価するため、マトリゲルと胸腺切片で固化したベクター形質導入胎児肝由来のＣＤ３４＋細胞およびＣＤ３４−細胞を腎臓莢膜下で移植してベクター形質導入ｔｈｙ／ｌｉｖ組織を生成する。３週間後、ベクター形質導入自家ＣＤ３４＋ＨＰＳＣ（１×１０^６細胞）を亜致死照射したマウス尾に静脈内注射する。動物内のＣＣＲ５低下およびＣ４６発現の影響を評価するため、二重ｓｈ５／Ｃ４６ベクター（ＥＧＦＰ＋）と対照（空レンチウイルス）ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）形質導入した等量混合のＣＤ３４＋ＨＰＳＣ（５×１０^５細胞）を共移植する。他の対照、例えば別の蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ）を含むｓｈ５単独ベクター、およびさらに別の蛍光タンパク質（例えばＣＦＰ）を含むＣ４６単独ベクターがＣＤ３４＋ＨＰＳＣを形質導入するために使用され、移植のための混合物に存在する。この実験設計は、各種構築物の形質導入細胞間におけるＣＣＲ５低下およびＣ４６発現の安定性および特異性レベルに関する相違を評価することを可能にする；マウス間の変動を制御するために、ベクターはすべて同じ動物に存在する。

【0119】

フローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて、対照（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）および活性ｓｈ５／Ｃ４６（ＥＧＦＰ＋）形質導入細胞を経時的に比較する。ｓｈ５／Ｃ４６形質導入細胞と、単一ベクター（ｓｈ５またはＣ４６）の１つで形質導入した細胞を比較する。ＨＰＳＣ移植後、再構成動物にＲ５、Ｘ４、または二重向性ＨＩＶ株を静脈内注射することによりＨＩＶ感染に対する感受性を評価する。各ベクター形質導入集団のＣＤ４＋Ｔ細胞％およびＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞比率を評価して、ＣＤ４＋Ｔ細胞生存に対するＣＣＲ５ノックダウンおよびＣ４６発現効果を確認する。

【0120】

実施例９．ヒトＨＩＶ患者における二重構築物の使用
ｓｈ５／Ｃ４６二重ベクター、ｓｈ５／ＴＲＩＭ５α二重ベクター、またはｓｈ５／ＴＲＩＭ５α−シクロフィリン二重ベクターを含む二重レンチウイルス構築物を自家ヒト細胞内に導入し、続いて患者に投与する。二重レンチウイルス構築物を再移植予定の患者から単離されたＣＤ３４＋ＨＰＳＣ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球／マクロファージ（例えば自家細胞）の１つまたは複数内に導入する。あるいは、別の個人由来の（同種異系間の）細胞を使用する。あるいは、本明細書に記載の三重ベクターを使用する。

【0121】

ＨＩＶ向性に関して、多くの患者はＲ５ウイルスを有し、少ない比率の患者がＸ４ウイルスを有し、中程度数の患者が混合集団を有する。本明細書に記載の二重構築物はＲ５ウイルスとＸ４ウイルスの両方を標的とする能力を有し、混合した細胞集団を有する患者に有益であり得、単独の集団を有する患者における耐性を予防もし得る。構築物は、ＨＡＡＲＴ耐性ウイルスを有する患者においても有益であり得る。

【0122】

形質導入のための細胞は、ＨＰＳＣおよび他の細胞を動員するサイトカインを１つまたは複数注射することにより患者から得られ、関連細胞集団がレンチウイルス形質導入のために分離される。形質導入細胞は、同じ患者または別の患者の静脈内に導入してＨＩＶ感染を治療または予防する。形質導入細胞の１回もしくは複数回投与または注入は本明細書に記載のように使用する。

【0123】

臨床試験は、患者の臨床状態、先行治療および／または治療耐性などの考慮に基づき設計する。様々な患者群を試験対象とする。例えば、１つの小集団の患者は、高活性抗レトロウイルス剤療法未施行（すなわちＨＡＡＲＴ未施行）である。通常、これらの患者は、（ＨＩＶ感染という背景にも関わらず）非常に健康であり、二重レンチウイルス形質導入造血細胞を受ける選択基準は、比較的急速なＣＤ４低下、高いウイルス負荷、および／または早期症状の既往歴を有する患者を含み得る。図２１は、かかる患者群において予測される反応を示す。二重レンチウイルスベクター形質導入細胞は、０時点で患者に導入する。図２１Ａおよび２１Ｂは、形質導入細胞の１回注入で治療した患者（星印）と二重レンチウイルスベクター形質導入細胞を受けていない患者（三角）で比較した予測されるウイルス負荷およびＣＤ４数を示す。未治療患者は高いウイルス負荷、および経時的なＣＤ４数の継続的低下を維持することが予測される。一方、二重レンチウイルスベクター形質導入細胞で治療した患者は、経時的なウイルス負荷の低下および（アフェレーシスに起因する潜在的な初期のわずかな低下後の）ＣＤ４数の増加を示すことが予測される。したがって治療は、ＨＡＡＲＴの必要性を遅らせ得るおよび／またはＨＡＡＲＴを開始後のＨＡＡＲＴの必要条件を低減し得る。

【0124】

第２の小集団患者はＨＩＶ陽性であり、現在良好に管理されているＨＡＡＲＴ治療中である。図２２に、かかる患者群における二重レンチウイルスベクター形質導入細胞の単回注入に対して予測される反応を詳述する。形質導入細胞の１回投与で治療した患者（星印）と未治療患者（三角）で比較した予測されるウイルス負荷を示す。二重レンチウイルスベクター形質導入細胞は、０時点で患者に導入する。２つのＨＡＡＲＴ治療を各種時点（ＡＴＩ）、例えば２４〜２８週間および４０〜４８週間に中断し、ウイルス負荷が事前に設定した安全性限界値（例えば、１００Ｋの複製／ｍＬ）未満にとどまる場合に患者のＨＡＡＲＴを中断する。ＨＡＡＲＴ中断は、二重レンチウイルス構築物により保護されたこれらの細胞のＨＩＶ誘発性優先的生存およびその結果のウイルス負荷低下期間を設けるためである。主要エンドポイントは４８週目であるが、４０〜４８週目および４０〜１００週目のウイルス負荷曲線下領域も測定できる。（必要に応じて）患者がＨＡＡＲＴを再開時、ウイルス負荷は治療患者と未治療患者の両方で（ただし、二重レンチウイルス形質導入細胞を注入しない患者ではよりゆっくりと）長期間低下することが予測される。治療は、ＨＡＡＲＴの必要性およびＨＡＡＲＴ関連合併症を低減し得る。

【0125】

第３の患者群は、ＨＡＡＲＴ薬剤耐性、非コンプライアンス、または他のいくつかの理由のためにＨＡＡＲＴが奏効していない個人を含む。図２３はかかる患者において予測されるウイルス負荷（図２３Ａ）および予測されるＣＤ４数（図２３Ｂ）を示す。二重レンチウイルス形質導入細胞の注入後の０日目、ウイルス負荷は同じままかまたは増加すると予測されてＣＤ４数は経時的に減少すると予測される未治療患者（三角）と比較して、ウイルス負荷は低減してＣＤ４数は増加すると予測される（星印）。

【0126】

すべての患者群におけるエンドポイントは、ウイルス負荷、ＣＤ４数、ＨＡＡＲＴの再開／開始までの時間、形質導入細胞率（％）、およびＴ細胞受容体切除サークル（最近の胸腺移出の測定値）およびＨＡＡＲＴのための必要条件の低減を含む。

【0127】

実施例１０．ＣＣＲ５およびＴＲＩＭ５αに対するｓｈＲＮＡを含む二重ベクター（ｓｈ５／ＴＲＩＭ５α二重ベクター）の構築
Ｈ１プロモーターの管理下でＣＣＲ５を標的とするｓｈＲＮＡ、およびユビキチンプロモーターの管理下でＴＲＩＭ５αタンパク質をコードする核酸を含む二重レンチウイルスベクターを、実施例１に記載の主鎖ベクターを用いて構築する。例えば、Ｕ−ＥＧＦＰカセットは、制限酵素を用いてｓｈ１００５およびユビキチンプロモーターにより駆動されたＥＧＦＰを含むプラスミド構築物であるｐＦＧ１２−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−ＥＧＦＰ（図３参照）から除去してｐＦＧ１２−Ｈ１−Ｒ５を産生する。

【0128】

ＥＧＦＰ遺伝子をｐＦＧ１１Ｆ−Ｕ−ＥＧＦＰ（図４のｐＦＧ１１Ｆ）から除去し、ＴＲＩＭ５α遺伝子（配列番号５）と置換してｐＦＧ１１Ｆ−Ｕ−ＴＲＩＭ５αを産生する。Ｈ１−Ｒ５カセットは、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ消化を用いてｐＦＧ１２−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−ＥＧＦＰから切除してｐＦＧ１１Ｆ−Ｕ−ＴＲＩＭ５α内に挿入し、これもＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで消化させて、ｐＦＧ１１Ｆ−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−ＴＲＩＭ５αを産生する（図２４Ａ）。この構築物を用いて実施例１の項目Ｂに記載のレンチウイルスを作製する。

【0129】

実施例１１．ＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡ、Ｃ４６、およびＴＲＩＭ５αを含む三重ベクター（ｓｈ５／Ｃ４６／ＴＲＩＭ５α三重ベクター）の構築
図２４Ｂに示すとおり、βアクチンプロモーター−ＴＲＩＭ５αを多クローニング部位へクローニングすることにより二重ベクターｐＦＧ１１Ｆ−Ｈ１−Ｒ５−Ｕ−Ｃ４６から三重ベクターを産生する。

【0130】

本明細書において論じ、引用した刊行物、特許および特許出願はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示した発明は、記載の特定の方法、プロトコルおよび材料は変わり得るので、それらに限定されないことが理解される。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するのみの目的で記載され、本発明の範囲を制限することを意図せず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも理解される。

【0131】

当業者は、通例の実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態の等価物を多く認識するか、または確認できるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]