特許 6840907 ＦＧＦＲ３結合分子ｌｋｏｋｏｋ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6840907

(24)【登録日】2021年2月22日

(45)【発行日】2021年3月10日

(54)【発明の名称】ＦＧＦＲ３結合分子ｌｋｏｋｏｋ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20210301BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20210301BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20210301BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210301BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20210301BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210301BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20210301BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20210301BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20210301BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210301BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/12ZNA

   C07K19/00

   C07K16/28

   C07K14/47

   C12N15/62

   C12N15/13

   A61K38/17

   A61P1/04

   A61P3/10

   A61P17/06

   A61P21/04

   A61P25/00

   A61P35/00

   A61P37/02

   A61P19/02

   A61P43/00 111

   A61P29/00 101

   A61K48/00

   A61K45/00

   A61K47/55

   A61K47/68

   A61K39/395 L

   A61K39/395 C

【請求項の数】12

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2019-569749(P2019-569749)

(86)(22)【出願日】2018年4月3日

(65)【公表番号】特表2020-518279(P2020-518279A)

(43)【公表日】2020年6月25日

(86)【国際出願番号】EP2018058390

(87)【国際公開番号】WO2018185050

(87)【国際公開日】20181011

【審査請求日】2019年12月13日

(31)【優先権主張番号】17164482.6

(32)【優先日】2017年4月3日

(33)【優先権主張国】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】506157570

【氏名又は名称】シラグ・ゲーエムベーハー・インターナショナル

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｌａｇ ＧＭＢＨ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100186897

【弁理士】

【氏名又は名称】平川 さやか

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】シラッチ メルコ，ミカエラ

(72)【発明者】

【氏名】ウッズ，リチャード

(72)【発明者】

【氏名】ヘンネ，パトリシア

(72)【発明者】

【氏名】ズブラー，バーバラ

(72)【発明者】

【氏名】カゲ，エレナ

(72)【発明者】

【氏名】グラブロブスキ，ドラガン

(72)【発明者】

【氏名】バーツシンガー，ジュリアン

【審査官】 佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５００８７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５２１７５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５１６８０１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

線維芽細胞増殖因子受容体３のアイソフォーム３ｂ及び３ｃ（ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃ）に結合するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号３〜８及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。

【請求項2】

前記ポリペプチドが、
配列番号４、
配列番号５、
配列番号６、
配列番号７、
配列番号８、及び
配列番号２２
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

さらなる化合物に融合した請求項１又は２に記載のポリペプチドを含む融合構築物。

【請求項4】

前記さらなる化合物が毒性化合物である、請求項３に記載の融合構築物。

【請求項5】

前記さらなる化合物が、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体のＦｃドメイン、抗体、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の融合構築物。

【請求項6】

前記抗体が、ＧＭ−２、ＣＤ３８、ＩＣＡＭ−１、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ４５、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＩＧＦＲ−１、ＣＤ２０、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＣＤ６６、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＴＲＯＰ−２、Ｂ７Ｈ３及びＣＥＡＣＡＭ−１からなる群から選択される標的に対して特異的である、請求項５に記載の融合構築物。

【請求項7】

請求項１又は２に記載のポリペプチド、又は請求項３に記載の融合構築物をコードする核酸分子、又は請求項５若しくは６に記載の融合構築物をコードする１つ以上の核酸分子。

【請求項8】

請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３〜６のいずれか一項に記載の融合構築物、請求項７に記載の核酸分子、又はこれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物又は診断用組成物。

【請求項9】

癌又はＴ細胞介在性疾患の治療における使用のための、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記癌が、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、神経膠腫、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、皮膚癌、精巣癌及び尿路上皮癌から選択される、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項11】

前記癌が、多発性骨髄腫、膀胱癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺扁平上皮癌、及び結腸直腸癌から選択される、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項12】

前記Ｔ細胞介在性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、ＩＩ型コラーゲン関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、乾癬、若年発症糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、類肉腫症、自己免疫ぶどう膜炎、炎症性腸疾患（クローン及び潰瘍性大腸炎）、セリアック病及び重症筋無力症から選択される、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

ＦＧＦＲ３は、細胞内シグナル伝達経路に関与する膜貫通チロシンキナーゼ受容体のＦＧＦＲファミリーの４つのメンバーのうちの１つである。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）との相互作用を介するＦＧＦＲの活性化は、細胞増殖及び生存、遊走、分化並びに増殖停止を含む、多面的な範囲の後遺症を有する胚形成及び成体の両方において重要な役割を有すると示されている［１］。

【0002】

ＦＧＦＲは、２つ又は３つの免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＤ１−３）を有する細胞外リガンド結合領域、１回膜貫通領域、及び細胞質のスプリットチロシンキナーゼドメインからなる。

【0003】

ヒトでは、シグナル伝達は２２個のＦＧＦリガンドのうちの１つによって媒介され、リガンド受容体特異性は、受容体の差次的な細胞発現、相互作用を調節する細胞表面タンパク質の分泌及び受容体の選択的スプライシングによって制御される［１］。ＦＧＦＲ１、２及び３の各々は、ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃと称される、２つの主要な選択的にスプライシングされたアイソフォームを有する。これらのアイソフォームは、ＩｇＤ３の後半の約５０アミノ酸が異なり、異なった組織分布及びリガンド特異性を有する。ＦＧＦリガンドは、ＦＧＦＲの二量体化をもたらし、それにより細胞内チロシンキナーゼドメインの活性化及びリン酸化が引き起こされる。これは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を含む発癌シグナル伝達に関連するいくつかの重要な経路の活性化をもたらす。

【0004】

異常に活性化されたＦＧＦＲは、特定のヒトの悪性腫瘍と関連づけられてきた［２］。特に、ｔ（４；１４）（ｐ１６．３；ｐ３２）染色体転座は、多発性骨髄腫患者の約１５〜２０％において発生して、ＦＧＦＲ３の過剰発現をもたらし、全生存期間の短縮と相関する［２］。ＦＧＦＲ３はまた、培養液中の骨髄腫細胞株への化学療法抵抗性の付与と関連づけられており［３］、ｔ（４；１４）患者が従来の化学療法に対して臨床効果が乏しいことと一致している［４］。変異により活性化されたＦＧＦＲ３の過剰発現は、造血細胞及び線維芽細胞［５〜８］、トランスジェニックマウスモデル［９］、並びにマウス骨髄移植モデル［９，１０］における癌化を誘導するのに十分である。

【0005】

したがって、ＦＧＦＲ３は、多発性骨髄腫において有望な治療標的として提案されてきた。実際に、ＦＧＦＲを標的化するいくつかの小分子阻害剤は、ＦＧＦＲ３に対して選択的ではなく、ある種の他のキナーゼに対する交差阻害活性を有するが、培養液及びマウスモデルにおけるＦＧＦＲ３陽性骨髄腫細胞に対する細胞傷害性を実証した［１１〜１５］。

【0006】

ＦＧＦＲ３の過剰発現はまた、大部分の膀胱癌において実証されている［１６，１７］。さらに、ＦＧＦＲ３の体細胞活性化変異が、乳頭癌の６０〜７０％及び筋肉浸潤性膀胱癌の１６〜２０％において同定された［１７，１８］。細胞培養実験において、ＲＮＡ干渉［１９］又はＦＧＦＲ３単鎖Ｆｖ抗体断片は、膀胱癌の細胞増殖を阻害した［２０］。最近の研究は、ＦＧＦＲ３抗体−毒素コンジュゲートが、腫瘍へのＦＧＦＲ３媒介性の毒素送達により膀胱癌細胞株の異種移植片増殖を減弱することを実証した［２１］。ＦＧＦＲ３及び抗ＦＧＦＲ３抗体に関する刊行物としては、米国特許出願公開第２００５／０１４７６１２号明細書；国際公開第２０１０／１１１３６７号パンフレット；Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８（４０）：３８１９４−３８２０５（２００３）［２２］；国際公開第２００６／０４８８７７号パンフレット；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ ｅｔ ａｌ，（２００８）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７（４）：８６２−８７３；国際公開第２００７／１４４８９３号パンフレット；Ｔｒｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）１０７（１０）：４０３９−４０４６；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１（１７）：６２８０−６２９０；Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：４５９−４６５；及び国際公開第２０１０／００２８６２号パンフレットが挙げられる。

【0007】

これらの抗体は、次の欠点の１つ以上を有する：それらは当該アイソフォームのただ１つのみを認識する能力を有するか、又は異なるアイソフォームに対する親和性の間で著しい相違を示す。

【0008】

したがって、ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃの両方のスプライスバリアントに高い親和性及び特異性を有して結合することができ、且つ同時に細胞内へと順調に内部移行することができる分子の必要性が依然として存在している。

【0009】

この必要性は本発明によって対処される。

【発明の概要】

【0010】

いくつかの異なるスクリーニングから、ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃの両方に対する高い親和性、並びに細胞内への順調な内部移行の能力を含む特性の驚くべき組み合わせを有するフィノマーポリペプチドのセットが同定され、このポリペプチドのセットはこれらの特性の組み合わせのための多数の他の候補を凌駕した。これらのポリペプチドの配列が本明細書で開示される。これらのポリペプチド自体に加えて、本発明はまた、抗体へのその融合物を含む、そのようなポリペプチドを含む融合構築物を提供する。本発明はさらに、本発明のポリペプチド又は融合構築物をコードする核酸分子を提供する。さらに、本発明のポリペプチド又は融合構築物を含む医薬組成物又は診断用組成物、並びに癌又はＴ細胞介在性疾患の治療における使用のためのそのような医薬組成物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】配列番号３〜８の抗ＦＧＦＲ３フィノマーのアラインメント。

【図2】抗ＦＧＦＲ３フィノマーの内部移行特性。

【図3-1】図３：Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドのサイズ排除プロファイル：Ａ）ＦＦ２Ｌ４Ｃ３−配列番号３；Ｂ）ＦＦ４４Ｌ６５Ｇ１２−配列番号４；Ｃ）ＦＦ４４Ｌ６５Ｇ７−配列番号５；Ｄ）ＦＦ４８Ｌ６６Ｇ７−配列番号６；Ｅ）ＦＦ４３Ｌ６５Ｄ５−配列番号７；Ｆ）ＦＦ４４Ｌ６５Ｂ７−配列番号８。

【図3-2】（上記の通り。）

【図3-3】（上記の通り。）

【図4】ＦＧＦＲ３に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドのＦＡＣＳ結合：Ａ）ＦＧＦＲ３陽性ＫＭＳ−１１細胞及びＢ）ＦＧＦＲ３陰性Ｎ８７細胞。

【図5-1】図５：Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドの特異性ＥＬＩＳＡ：Ａ）ＦＦ２Ｌ４Ｃ３−配列番号３；Ｂ）ＦＦ４４Ｌ６５Ｇ１２−配列番号４；Ｃ）ＦＦ４４Ｌ６５Ｇ７−配列番号５；Ｄ）ＦＦ４８Ｌ６６Ｇ７−配列番号６；Ｅ）ＦＦ４３Ｌ６５Ｄ５−配列番号７；Ｆ）ＦＦ４４Ｌ６５Ｂ７−配列番号８。試験された抗原：ｈｕＦＧＦＲ３ｂ＝ヒトＦＧＦＲ３スプライスバリアントｂ；ｈｕＦＧＦＲ３ｃ＝ヒトＦＧＦＲ３スプライスバリアントｃ；ｃｙＦＧＦＲ３ｃ＝カニクイザルＦＧＦＲ３スプライスバリアントｃ；ｍｕＦＧＦＲ３ｃ＝マウスＦＧＦＲ３スプライスバリアントｃ；ｈｕＦＧＦＲ３−Ｄ１＝ヒトＦＧＦＲ３のドメイン１；ｈｕＦＧＦＲ３−Ｄ２＝ヒトＦＧＦＲ３のドメイン２；ｈｕＦＧＦＲ３−Ｄ１Ｄ２＝ヒトＦＧＦＲ３のドメイン１及びドメイン２；ＩｇＧ＝ポリクローナルヒトＩｇＧ混合物；ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水溶液。

【図5-2】（上記の通り。）

【図5-3】（上記の通り。）

【図6】Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドの細胞障害効果を示す内部移行アッセイ。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、第１の態様において、線維芽細胞増殖因子受容体３のアイソフォーム３ｂ及び３ｃ（ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃ）に結合するポリペプチドに関し、当該ポリペプチドは、（ａ）

【化1】

（アミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^６）は任意のアミノ酸配列であり得る）；（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列（同一性判定ではアミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^６）を除外し、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１９におけるアミノ酸配列ＥＶＹＧＰＴＰＭ（配列番号２）が保存され、且つ配列番号１のアミノ酸位置３７及び３８におけるアミノ酸Ｐ及びＹが保存されることを条件とする）；（ｃ）

【化2】

（アミノ酸位置（Ｘ^６）は任意のアミノ酸であり得る）；並びに（ｄ）（ｃ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列（同一性判定ではアミノ酸位置（Ｘ^６）を除外し、配列番号１９のアミノ酸位置１２〜１８におけるアミノ酸配列ＥＶＭＳＴＴＡ（配列番号２０）及び配列番号１９のアミノ酸位置３１〜３５におけるＳＱＳＰＨ（配列番号２１）が保存され、且つ配列番号１９のアミノ酸位置３７及び３８におけるアミノ酸Ｑ及びＹが保存されることを条件とする）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0013】

本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、約６０個を超えるアミノ酸を含有する、単鎖タンパク質又はその断片を含むアミノ酸の線状の分子鎖を示す。ポリペプチドはさらに、少なくとも２つの同一又は異なる分子からなるマルチマー、例えばオリゴマーを形成してもよい。このようなマルチマーの対応する高次構造は、それに対応してホモ二量体又はヘテロ二量体、ホモ三量体又はヘテロ三量体などと呼ばれる。さらに、このようなポリペプチドのペプチド模倣体はまた、アミノ酸及び／又はペプチド結合が機能的アナログによって置き換えられる場合、本発明に包含される。そのような機能的アナログは、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外の全ての既知のアミノ酸、例えば、セレノシスチンを含む。用語「ポリペプチド」はまた、自然に修飾されたポリペプチドも指し、この修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化及び当技術分野でよく知られる同様の修飾によってもたらされる。

【0014】

本発明のポリペプチドは、Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド又はフィノマーである。Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド又はフィノマーは当技術分野でよく知られており、例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４；国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２０（２）：５７−６８；及びＧｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５に記載されている。本明細書で用語「フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）」と互換的に使用される用語「Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド」は、ヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合ポリペプチド（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５に記載されるとおり、いわゆる足場）を指す。フィノマーは約７ｋＤａの小さな球状ポリペプチドである。ヒトＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメインは、異なる標的タンパク質と高い親和性及び特異性で結合するタンパク質（フィノマーと呼ばれるＦｙｎＳＨ３由来結合タンパク質）を操作するための足場として首尾よく使用された（国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット、国際公開第２０１１／０２３６８５号パンフレット、国際公開第２０１３／１３５５８８号パンフレット、国際公開第２０１４／１７００６３号パンフレット、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２，ｐ．３１９６−３２０４、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２０，ｐ．５７−６８、及びＳｃｈｌａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ｍＡｂｓ，４（４）ｐ．４９７−５０）。

【0015】

語句「線維芽細胞増殖因子受容体３のアイソフォーム３ｂ及び３ｃに結合する」（ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃ又はＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃ）が使用される場合、本発明のポリペプチドがＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃとの結合相互作用（インビボ及び／又はインビトロ）を形成することを必要とする。アイソフォーム３ｂ（ＦＧＦＲ３ｂ）及び３ｃ（ＦＧＦＲ３ｃ）は選択的スプライシングによって形成される。スプライスバリアントは、Ｉｇドメイン３のＣ末端側の半分をコードする２つの選択的エクソンである３ｂ及び３ｃの使用によって生成される。上皮細胞は３ｂ転写物のみを示す一方で、線維芽細胞は３ｂ及び３ｃ転写物の混合を示す。ヒトＦＧＦＲ３ｂのアミノ酸配列は、配列番号９に示され、ヒトＦＧＦＲ３ｃのアミノ酸配列は、配列番号１０に示される。本発明のポリペプチドは、好ましくは、ヒト線維芽細胞増殖因子受容体３のアイソフォーム３ｂ及び３ｃに結合する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、１０^−７〜１０^−１２Ｍ、より好ましくは１０^−８〜１０^−１２Ｍ、最も好ましくは１０^−９〜１０^−１２ＭのＫ_ＤでＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃの両方のアイソフォームに結合する。この点に関して、本発明のポリペプチドがＦＧＦＲ３に特異的に結合し、好ましくはアイソフォームＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃの両方に特異的に結合し、したがって、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、又はＦＧＦＲ４などの他の関連するタンパク質に有意に結合しないことが好ましい。この点に関して、有意に結合するとは、好ましくは＞５×１０^−６ＭのＫ_Ｄを有する結合を示す。

【0016】

本明細書中上記で示される配列番号１及び配列番号１９は、ヒトＦｙｎキナーゼ（配列番号１１；１９８６年にＫａｗａｋａｍｉら及びＳｅｍｂａらによって報告されたＦｙｎキナーゼのアミノ酸８３〜１４５）のＳＨ３ドメインのアミノ酸配列に由来する。配列番号１１を示す：

【化3】

上記に示した配列番号１１において、ＲＴ及びｓｒｃループの配列は、それぞれ下線及び二重下線が引かれている。Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４は、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインのＲＴ及びｓｒｃループ中の変異の影響を検討し、疎水性表面に隣接しているこれらのループ中の変異が、このドメインの分子間会合に関与する能力を決定できることを実証した。さらに、欧州特許第２０５４４３２号明細書は、ＲＴ及び／又はｓｒｃループ内の又はこれらに隣接する変異が、ＳＨ３ドメインの結合特異性を決定することを示す。Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインのアミノ酸配列は、ヒト、マウス、ラット及びサル（テナガザル）の間で完全に保存されている。ニワトリのＦｙｎ ＳＨ３は、１カ所、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の１種は、２カ所のアミノ酸位置において対応するヒトドメインと異なる。他のＳＨ３ドメインとまったく同様に、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインは、２つの逆平行βシートで構成され、他のタンパク質と相互作用するために２つのフレキシブルループ（ＲＴループ及びｓｒｃループと呼ばれる）を含有する。

【0017】

より詳細には、配列番号１は、配列番号３〜８のアラインメントからもたらされる配列である（図１を参照のこと）。図１から明らかなとおり、配列番号１の位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^４）は、配列番号１１のＦｙｎキナーゼＳＨ３ドメインのｓｒｃ−ループに相当する。配列番号３〜８の間で、ｓｒｃ−ループ内のアミノ酸は互いに異なる。他方では、ｓｒｃ−ループのＣ末端から２つ目及び３つ目の位置は野生型配列では「ＤＷ」であるが、配列番号３〜８の全てにおいて対応するアミノ酸は「ＰＹ」である。図１からさらに明らかなとおり、配列番号１１のＦｙｎキナーゼＳＨ３ドメインのＲＴ−ループに相当する位置（すなわち、下線の配列及び隣接しているＤ）は、野生型Ｆｙｎ ＳＨ３配列と比較して変化しているが、配列番号３〜８の間で保存されており、配列「ＥＶＹＧＰＴＰＭ」（配列番号２）を有する。これらのループに隣接しているアミノ酸を含むＲＴ及びｓｒｃ−ループ内のアミノ酸位置が、ＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに対する結合特異性を決定する。

【0018】

配列番号１によれば、アミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^４）だけでなく、アミノ酸位置（Ｘ^５）及び（Ｘ^６）もまた任意のアミノ酸であってもよい。図１から理解できるとおり、位置（Ｘ^５）及び（Ｘ^６）のアミノ酸は、配列番号３〜８の間で、配列番号１１の野生型Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインとは異なり得る。これらの位置におけるアミノ酸の相違は、配列番号３〜８の結合特異性に必須ではないと考えられる。したがって、アミノ酸位置（Ｘ^５）及び（Ｘ^６）は、実質的にＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに対する結合特異性を損なうことなく交換又は欠失されてもよいし、さらなるアミノ酸が付加されてもよい。配列番号１〜８のアミノ酸位置において見出すことができるアミノ酸と比較して、アミノ酸がアミノ酸位置（Ｘ^５）〜（Ｘ^６）において交換される場合、保存的交換が好ましい。

【0019】

配列番号１９は、配列番号２２の抗ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃポリペプチドからもたらされる配列である。配列番号２２のアミノ酸位置１２〜１８（ＥＶＭＳＴＴＡ（配列番号２０））は、配列番号１１のＦｙｎキナーゼＳＨ３ドメインのＲＴ−ループに相当し、配列番号２２のアミノ酸位置３１〜３５（ＳＱＳＰＨ（配列番号２１））は、配列番号１１のＦｙｎキナーゼＳＨ３ドメインのｓｒｃ−ループに相当する。ｓｒｃ−ループのＣ末端から２つ目及び３つ目の位置は野生型配列では「ＤＷ」であるが、配列番号２２において対応するアミノ酸は「ＱＹ」である。配列番号２２においても、これらのループに隣接しているアミノ酸を含むＲＴ及びｓｒｃ−ループ内のアミノ酸位置が、ＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに対する結合特異性を決定する。

【0020】

配列番号１９によれば、アミノ酸位置（Ｘ^６）は任意のアミノ酸であってもよい。配列番号１９のアミノ酸位置（Ｘ^６）は、配列番号１のアミノ酸位置（Ｘ^６）に相当する。配列番号１及び１９において、アミノ酸（Ｘ^６）は、配列番号１１の野生型Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインとは異なる。対応するアミノ酸は、配列番号１１においてはＹであり、配列番号１９においてはＷであり、配列番号３〜８においてはＬである。

【0021】

本発明によれば、用語「配列同一性の百分率（％）」は、鋳型核酸又はアミノ酸配列の全長を構成するヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の数と比較して、２つ以上の整列させた核酸若しくはアミノ酸配列の同一なヌクレオチド／アミノ酸の一致する（「ヒットする」）数を指す。言い換えると、部分（配列）が比較用のウィンドウ全体にわたって、若しくは当技術分野において知られる配列比較アルゴリズムを使用して測定されるとおりの指定された領域全体にわたって最大限の一致に対して比較され、整列させる場合、又は手動で整列させ、視覚的に評価される場合、アラインメントを使用して、２つ以上の配列若しくは部分配列について、同一のものである（例えば、９５％、９７％又は９８％の同一性）アミノ酸残基若しくはヌクレオチドの百分率が決定され得る。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、ヌクレオチド若しくはアミノ酸の置換、付加又は欠失によって異なる場合がある。この定義は、試験配列の相補物にも適用する。

【0022】

当業者であれば、ポリペプチド配列を整列させるための好適なプログラムも認識している。ポリペプチド配列の配列同一性の百分率は、例えば、上記で説明したプログラムＣＬＵＳＴＬＡＷ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴのようなプログラムで決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラム、すなわち、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することが好ましい（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ， Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，及びＤａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。

【0023】

本明細書中の上記の項目（ｂ）で記載した配列同一性に関して、配列同一性は少なくとも９８％であることが好ましい。この点に関して、項目（ｂ）で記載した少なくとも９５％の配列同一性により、２つのアミノ酸の変更が可能になるが、少なくとも９８％の好ましい同一性では１つのみのアミノ酸の変更が可能になることにさらに留意されたい。したがって、本明細書中の上記の項目（ｂ）はまた、本明細書中の上記の項目（ａ）のアミノ酸配列とは２つのアミノ酸の変更、及び好ましくは１つのアミノ酸の変更によって異なるが、このアミノ酸の変更は、配列番号１の（Ｘ^１）〜（Ｘ^６）以外のアミノ酸位置、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１９のアミノ酸配列ＥＶＹＧＰＴＰＭ（配列番号２）、及び配列番号１のアミノ酸位置３７及び３８におけるアミノ酸Ｐ及びＹにおいて見出すことができる。配列番号１における（Ｘ^１）〜（Ｘ^６）以外のアミノ酸、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１９のアミノ酸配列ＥＶＹＧＰＴＰＭ（配列番号２）、及び配列番号１のアミノ酸位置３７及び３８におけるアミノ酸Ｐ及びＹは、配列番号３〜８の結合特異性に必須ではないと考えられる。したがって、これらのアミノ酸位置は、実質的にＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに対する結合特異性を損なうことなく交換又は欠失されてもよいし、アミノ酸が付加されてもよい。これらのアミノ酸位置は交換されることが好ましい。アミノ酸が交換される場合、保存的交換が好ましい。

【0024】

本明細書中の上記の項目（ｄ）で記載した配列同一性に関して、配列同一性は少なくとも９７％であることが好ましい。この点に関して、項目（ｄ）で記載した少なくとも９５％の配列同一性により、２つのアミノ酸の変更が可能になるが、少なくとも９７％の好ましい同一性では１つのみのアミノ酸の変更が可能になることにさらに留意されたい。したがって、本明細書中の上記の項目（ｄ）はまた、本明細書中の上記の項目（ｃ）のアミノ酸配列とは２つのアミノ酸の変更、及び好ましくは１つのアミノ酸の変更によって異なるアミノ酸配列に関し、このアミノ酸の変更は、配列番号１９のアミノ酸位置１２〜１８におけるアミノ酸配列ＥＶＭＳＴＴＡ（配列番号２０）及び配列番号１９のアミノ酸位置３１〜３５におけるＳＱＳＰＨ（配列番号２１）以外の配列番号１９のアミノ酸位置、並びに配列番号１９のアミノ酸位置３７及び３８におけるアミノ酸Ｑ及びＹにおいて見出すことができる。配列番号１９のアミノ酸位置１２〜１８におけるアミノ酸配列ＥＶＭＳＴＴＡ（配列番号２０）及び配列番号１９のアミノ酸位置３１〜３５におけるＳＱＳＰＨ（配列番号２１）以外の配列番号１９のアミノ酸、並びに配列番号１９のアミノ酸位置３７及び３８におけるアミノ酸Ｑ及びＹは、配列番号２２の結合特異性に必須ではないと考えられる。したがって、これらのアミノ酸位置は、実質的にＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに対する結合特異性を損なうことなく交換又は欠失されてもよいし、アミノ酸が付加されてもよい。これらのアミノ酸位置は交換されることが好ましい。アミノ酸が交換される場合、保存的交換が好ましい。

【0025】

配列番号１に関連して本明細書で使用する場合、語句「同一性判定ではアミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^６）を除外する」は、配列番号１に関する配列同一性の計算が、アミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^６）を考慮しないことを規定している。同様に、配列番号１９に関連して本明細書で使用する場合、語句「同一性判定ではアミノ酸位置（Ｘ^６）を除外する」は、配列番号１９に関する配列同一性の計算が、アミノ酸位置（Ｘ^６）を考慮しないことを規定している。

【0026】

本明細書で使用する場合、条件「配列番号１のアミノ酸位置１２〜１９におけるアミノ酸配列ＥＶＹＧＰＴＰＭ（配列番号２）が保存されることを条件とする」は、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１９にアミノ酸の変更が導入され得ないことを規定する。同様に、本明細書で使用される場合、条件「配列番号１のアミノ酸位置３７及び３８におけるアミノ酸Ｐ及びＹが保存されることを条件とする」は、配列番号１のアミノ酸位置３７及び３８にアミノ酸の変更が導入され得ないことを規定する。言い換えると、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１９に相当するアミノ酸位置は、本発明の第１の実施形態の項目（ａ）及び（ｂ）並びにその好ましい例の範囲に該当する全てのポリペプチドにおいて、配列ＥＶＹＧＰＴＰＭ（配列番号２）を有し、位置３７及び３８におけるアミノ酸はそれぞれＰ及びＹである。

【0027】

本明細書で使用する場合、条件「配列番号１９のアミノ酸位置１２〜１８におけるアミノ酸配列ＥＶＭＳＴＴＡ（配列番号２０）及び配列番号１９のアミノ酸位置３１〜３５におけるＳＱＳＰＨ（配列番号２１）が保存されることを条件とする」は、配列番号１９のアミノ酸位置１２〜１８及び３１〜３５にアミノ酸の変更が導入され得ないことを規定する。同様に、本明細書で使用される場合、条件「配列番号１９のアミノ酸位置３７及び３８におけるアミノ酸Ｑ及びＹが保存されることを条件とする」は、配列番号１９のアミノ酸位置３７及び３８にアミノ酸の変更が導入され得ないことを規定する。言い換えると、配列番号１９のアミノ酸位置１２〜１８に相当するアミノ酸位置は、本発明の第１の実施形態の項目（ｃ）及び（ｄ）並びにその好ましい例の範囲に該当する全てのポリペプチドにおいて、配列ＥＶＭＳＴＴＡ（配列番号２０）を有し、配列番号１９のアミノ酸位置３１〜３５に相当するアミノ酸位置は配列ＳＱＳＰＨ（配列番号２１）を有し、且つ位置３７及び３８におけるアミノ酸はそれぞれＱ及びＹである。

【0028】

記載のとおり、配列番号１及び配列番号１９におけるあらゆるアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的置換は、置き換えられるアミノ酸に類似した化学的性質を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を規定している。好ましくは、本明細書で言及される保存的置換は、（ｉ）異なる塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換；（ｉｉ）異なる酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換；（ｉｉｉ）異なる芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換；（ｉｖ）異なる非極性脂肪族アミノ酸による非極性脂肪族アミノ酸の置換；及び（ｖ）異なる極性非荷電アミノ酸による極性非荷電アミノ酸の置換からなる群から選択される置換である。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンである。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンである。非極性脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン及びプロリンである。極性非荷電アミノ酸は、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンである。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は、以上に概説された保存的置換（ｉ）〜（ｖ）に分類されない任意のアミノ酸による１つのアミノ酸の交換である。

【0029】

本明細書で開示される抗ＦＧＦＲ３フィノマーは、有利なことに、ＦＧＦＲ３ｃ及び３ｂに対して優れた結合親和性を有し、さらに細胞内に内部移行するのに特に好適であり、それらは診断及び治療効果を発揮することができる。本明細書中以下の実施例から理解できるとおり、配列番号３の抗ＦＧＦＲ３フィノマーは、フィノマーの大規模なライブラリーをスクリーニングした際に発見された。配列番号３及び１９の抗ＦＧＦＲ３フィノマーは、それらのＦＧＦＲ３アイソフォーム３ｂ及び３ｃに対する結合親和性並びにそれらの細胞内部移行特性の観点から顕著な特性を有することが証明された（実施例１及び７を参照のこと）。したがって、配列番号１９を有するフィノマーは、配列番号１のフィノマーの代替物である。予想外且つ有利なこととして、両フィノマーは同様の組み合わせの有利な特性を有する。配列番号３の抗ＦＧＦＲ３フィノマーは、親和性成熟のための鋳型として使用され、且つそれはＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに対する結合親和性をさらに向上させることすら可能であった。さらに詳細には、親和性成熟過程からもたらされたポリペプチドの大規模なプールの中で、配列番号４〜８の抗ＦＧＦＲ３フィノマーは、配列番号３の抗ＦＧＦＲ３フィノマーよりもＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに対してより一層強力に結合することが見出された。本明細書中以下の実施例はさらに、配列番号３〜８及び２２の抗ＦＧＦＲ３フィノマーが、組換えにより生成することができ、且つ有利な製造性特性を有するため、例えば、治療及び診断用途のために、大規模に生成することができることを示す。加えて、配列番号３〜８及び２２の抗ＦＧＦＲ３フィノマーは、ヒトＦＧＦＲ３ｃ及び３ｂに結合するだけでなく、マウス及びサルのＦＧＦＲ３ｃに（及びおそらく３ｂにも）結合する。この異種間の結合は、前臨床試験に有利である。これらの分子であれば、診断目的のために使用できるであろうし、且つ例えば本明細書でさらに詳細に記載されるとおり、表面にＦＧＦＲ３を発現する腫瘍細胞に対するさらなる治療薬の開発のための起点としても好適である。最初のスクリーニング又はその後の親和性成熟過程によって同定される他の抗ＦＧＦＲ３フィノマーは、配列番号３〜８及び２２の抗ＦＧＦＲ３フィノマーと同様の特性の有利な組み合わせを有しなかった。配列番号３〜８及び２２の抗ＦＧＦＲ３フィノマーの驚くべき且つ予想外の特性の有利な組み合わせはさらに、本明細書中以下の実施例から明らかになる。

【0030】

本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、（Ｘ^１）は、Ｎ、Ｒ、又はＫであり、好ましくはＲ又はＫであり；（Ｘ^２）は、Ｓ、Ｇ、Ｋ又はＲであり、好ましくはＧ、Ｋ又はＲであり；（Ｘ^３）はＳ又はＧであり、好ましくはＧであり；且つ（Ｘ^４）は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｓ又はＫであり、好ましくはＱ、Ｄ、Ｓ又はＫである。

【0031】

本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、（Ｘ^１）は、Ｎ、Ｒ、又はＫであり、好ましくはＲ又はＫであり；（Ｘ^２）は、Ｓ、Ｇ、Ｋ又はＲであり、好ましくはＧ、Ｋ又はＲであり；（Ｘ^３）はＳ又はＧであり、好ましくはＧであり；（Ｘ^４）は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｓ又はＫであり、好ましくはＱ、Ｄ、Ｓ又はＫであり；（Ｘ^５）は、Ｔ又はＡであり；且つ（Ｘ^６）は、Ｙ、Ｗ又はＬであり、好ましくはＬ又はＷである。

【0032】

配列番号１のアミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^４）は、ヒト野生型Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインのｓｒｃ−ループを形成するアミノ酸に相当するアミノ酸位置である。本明細書中以下の実施例は、アミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^４）に関して列記されるアミノ酸が、ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃ、特に、配列番号９を有するＦＧＦＲ３ｂ及び配列番号１０を有するＦＧＦＲ３ｃに対して結合特異性を付与することを示す。より詳細には、図１における本発明の配列番号３〜８の配列アラインメントは、配列番号３〜８の抗ＦＧＦＲ３フィノマーにおいて、上記の好ましい実施形態におけるアミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^４）に関して列記されるアミノ酸を見出すことができることを示す。上記の好ましい実施形態におけるアミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^４）に関して列記される好ましいアミノ酸は、配列番号４〜８の対応するアミノ酸位置において見出すことができ、配列番号４〜８は親和性成熟によって配列番号３から得られたと記載している。配列番号３〜８、好ましくは配列番号４〜８中に存在する（Ｘ^１）〜（Ｘ^４）に関する特定のアミノ酸の組み合わせ以外の、上に定義した（Ｘ^１）〜（Ｘ^４）から選択される他のアミノ酸配列も、ＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに対する結合特異性を付与することが予想され得る。

【0033】

上述のとおり、配列番号１のアミノ酸位置（Ｘ^５）並びに配列番号１及び１９のアミノ酸位置（Ｘ^６）は、ヒト野生型Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインのＲＴ及びｓｒｃ−ループのアミノ酸にも、これらのループのうちの１つに隣接するアミノ酸にも相当しないアミノ酸位置である。したがって、これらの位置におけるアミノ酸は、実質的にＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに対する結合特異性を損なうことなく交換又は欠失されてもよいし、さらなるアミノ酸が付加されてもよいと考えられる。位置（Ｘ^５）及び（Ｘ^６）におけるアミノ酸は交換されることが好ましい。（Ｘ^５）は、Ｔ又はＡであり；且つ（Ｘ^６）は、Ｙ、Ｗ又はＬであり、また最も好ましくはＬ又はＷである。図１から理解できるとおり、配列番号１の（Ｘ^５）並びに配列番号１及び１９の（Ｘ^６）に関するこれらのアミノ酸は、配列番号３〜８及び２２又はヒトＦｙｎ ＳＨ３野生型ドメイン（配列番号１１）又は別のＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃ結合フィノマーのいずれかにおいて見出すことができる。位置（Ｘ^６）に関する最も好ましいアミノ酸の場合、このアミノ酸は配列番号３〜８において見出すことができる。

【0034】

本発明の第１の態様のより好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号３〜８及び２２のいずれか１つからなる群、好ましくは配列番号４〜８又は２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。

【0035】

本明細書中以下の実施例から理解できるとおり、配列番号３〜８及び２２は、生成され、且つ試験された具体的な抗ＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃフィノマーの配列である。

【0036】

本発明の第１の態様のより一層好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドが特に好ましい。別の特に好ましい実施形態は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

【0037】

最初のスクリーニングにおいてすでに低ナノモルの親和性を有するフィノマーを得たことは非常に驚くべきことであった。配列番号３を有するフィノマーは、最も顕著なＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃ結合親和性並びに内部移行特性を有するフィノマーとして、フィノマーのライブラリーから単離された。配列番号４〜８を有するフィノマーは、配列番号３に由来し、配列番号４〜８を有するフィノマーのＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃ結合親和性は、より一層向上する。

【0038】

驚くべきことに、配列番号２２を有するフィノマーもまた、配列番号４〜８を有するものに匹敵する非常に良好な特性を有したが、それはフィノマーの異なるファミリーから最初に得られた。

【0039】

本発明は、第２の態様において、さらなる化合物に融合した本発明のポリペプチドを含む融合構築物に関する。

【0040】

本明細書で使用された「融合構築物」は、本発明のポリペプチドのさらなる化合物への融合物を定義する。その化合物は、タンパク質性化合物であっても、非タンパク質性化合物であってもよい。この場合、化合物はタンパク質性化合物（例えば、本明細書中以下で記載されるサイトカイン若しくはケモカイン、又は抗体若しくは抗体断片）であり、融合構築物はまた融合タンパク質と呼んでもよい。本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」は、別々のポリペプチド及びペプチドをコードする２つ以上の遺伝子の連結及び発現を通して生成される、ポリペプチド構築物を対象とする一般的な用語である。言い換えると、この融合遺伝子の翻訳は、元のポリペプチドのそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドを結果としてもたらす。このポリペプチドは、直接融合されるか、リンカー、すなわち短鎖ペプチド配列を介して融合されるかのどちらでもよい。一般的に、融合タンパク質は、当業者によく知られる組換えＤＮＡ技術によって人工的に生成される（例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，４ｔｈ ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐ．５１８−５１９）。しかしながら、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質は、平易な有機合成戦略、固相支持合成技術などの多くの従来的且つよく知られる技術のいずれかによって、又は市販の自動合成装置によって調製されてもよい。融合タンパク質は、生物学的研究、診断薬又は治療薬で使用されてもよい。

【0041】

さらなる化合物としての非タンパク質性化合物の例は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒなどの有機低分子、又は放射性核種である。さらなる非タンパク質性化合物のさらなる具体例は本明細書中以下に論じる。

【0042】

本発明の第２の態様のある種の実施形態によれば、さらなる化合物は、薬学的に活性な化合物、プロドラッグ、薬学的に許容される担体、診断上の活性がある化合物、細胞透過性増強剤、及び／又は血清半減期を調節する化合物である。

【0043】

薬学的に活性な化合物は、対象に投与される際に、対象に対して有益な効果をもたらす、生物活性を有する化合物である。プロドラッグは、不活性な（又は完全な活性よりも低い）形態で対象に投与され、その後対象の代謝プロセスを通して、薬学的に活性な又は薬学的に完全に活性な化合物に変換される化合物である。薬学的に（完全に）活性な化合物は、好ましくは、本明細書中以下に定義される特定の疾患のいずれかの予防の治療に好適な化合物である。

【0044】

診断上の活性がある化合物は、対象に投与される際に活性を有し、個体が罹患している場合に疾患又は障害の判定又は同定を可能にする（支援する）化合物である。診断上の活性がある化合物の例としては、蛍光色素、放射性核種又は医用画像化用造影剤などの検出可能なマーカーが挙げられる。蛍光色素、放射性核種及び医用画像化用造影剤の具体例が、本明細書中以下に記載される。本発明のポリペプチドに融合した診断上の活性がある化合物は、特に、原因及び／又は症状がＦＧＦＲ３に関連する、特にＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃに関連するということで共通している、本明細書中以下で定義される特定の疾患のいずれか１つを判定若しくは同定するために支援するか、又は判定若しくは同定するために使用することができる。対象の体内のそのような疾患の部位は、本発明の診断上の活性がある化合物に融合した本発明のポリペプチドによって検出又は同定することができる。

【0045】

細胞透過性増強剤は、本発明のポリペプチドの（インビトロ、エクスビボ又はインビボでの）細胞への送達を促進する化合物である。

【0046】

血清半減期を調節する化合物は、特に血液循環系において、本発明のポリペプチドのインビボ半減期の延長を可能にする化合物である。血清半減期を調節する成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましい。

【0047】

薬学的に許容される担体は、例えば、対象に投与する際の本発明のポリペプチドの送達及び／又は有効性を促進又は向上させる化合物である。好適な薬学的に許容される担体は当技術分野でよく知られており、例えば、安定化剤、抗酸化剤、ｐＨ調整物質などが挙げられる。

【0048】

本発明の第２の態様の一実施形態によれば、さらなる化合物は毒性化合物である。

【0049】

毒性化合物は、好ましくは、低分子有機化合物又はポリペプチド、例えば、カリケアマイシン、マイタンシノイド、ネオカルチノスタチン、エスペラマイシン、ダイネマイシン、ケダルシジン、マデュロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、オーリスタチン、リシン−Ａ鎖、モデクシン、短縮型緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素及び組換えゲロニンからなる群から選択される毒性化合物である。

【0050】

本発明の第２の態様の別の実施形態によれば、本発明のさらなる化合物は、（ａ）蛍光色素、（ｂ）光増感剤、（ｃ）放射性核種、（ｄ）医用画像化用造影剤、（ｅ）サイトカイン、（ｆ）ケモカイン、（ｇ）プロコアグラント因子、（ｈ）プロドラッグ活性化酵素、（ｉ）アルブミン結合体、（ｊ）アルブミン、（ｋ）ＩｇＧ結合体、又は（ｌ）ポリエチレングリコールからなる群から選択される。

【0051】

蛍光色素の例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ及びＣｙ色素である。

【0052】

光増感剤の例は、光毒性赤色蛍光タンパク質のＫｉｌｌｅｒＲｅｄ及びヘマトポルフィリンである。

【0053】

放射性核種の例は、ガンマ放射同位体、例えば^９９ｍＴｃ、^１２３Ｉ、^１１１Ｉｎ、ポジトロン放射体、例えば^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^１２４Ｉ、ベータ放射体、例えば^１３１Ｉ、^９０Ｙ、^１７７Ｌｕ、^６７Ｃｕ、及びアルファ放射体、例えば^２１３Ｂｉ、^２１１Ａｔである。

【0054】

本明細書で使用される造影剤は、医用画像化において体内の構造物又は液体のコントラストを増強するために使用される物質である。一般的な造影剤は、Ｘ線減衰及び磁気共鳴信号増強に基づいて機能する。

【0055】

サイトカインは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦベータ、ＬＴ−ベータ、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓ−リガンド、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータからなる群から選択され得る。当技術分野においてよく知られるとおり、サイトカインは、免疫系の炎症誘発性応答又は抗炎症性応答に有利に働き得る。したがって、治療される疾患に応じて、炎症誘導性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインとの融合構築物のいずれかが有利であり得る。例えば、炎症性疾患の治療に対しては、一般的に、抗炎症性サイトカインを含む融合構築物が好ましいが、一方癌の治療に対しては、一般的に炎症誘発性サイトカインを含む融合構築物が好ましい。

【0056】

ケモカインは、例えば、ＩＬ−８、ＧＲＯアルファ、ＧＲＯベータ、ＧＲＯガンマ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１アルファ／ベータ、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３アルファ、ＭＩＰ−３ベータ、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチン及びフラクタルカインからなる群から選択され得る。

【0057】

プロコアグラント因子の例は、組織因子（ＴＦ）及び癌プロコアグラント（ＣＰ）である。

【0058】

プロドラッグ活性化酵素の例は、カルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼ又はグルコシダーゼなどの酵素である。

【0059】

アルブミン結合体、及びＩｇＧ結合体の例は、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．，１３（３）：２４５−２５５において記載されている。したがって、アルブミン結合体及びＩｇＧ結合体の例は、ヒト単一Ｉｇドメイン（ダブルアルブミン Ｄａｂ）、ナノボディ、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）のプロテインＧに由来する天然に存在するアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びＩｇＧに結合するドメインである。このような融合構築物は、例えば、患者に投与する際に、特に血液循環系において、本発明のポリペプチドの半減期を増大させる。

【0060】

本発明の第２の態様の他の実施形態によれば、本発明のさらなる化合物は、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体のＦｃドメイン、抗体、又はこれらの組み合わせを含む。

【0061】

用語「抗体」は、モノクローナル抗体、単鎖抗体、又はこれらの断片を含み、また、二重特異性抗体、合成抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ_２）’、Ｆｖ若しくはｓｃＦｖ断片などの重鎖及び軽鎖以外の結合能を保持する抗体断片、又は これらのいずれかの化学修飾された誘導体も含む。抗体又はそれらの断片は例えば、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８において記載される方法を用いることによって得ることができる。前記抗体の誘導体をファージディスプレイ技術によって得るとき、ＢＩＡｃｏｒｅシステムで利用される表面プラズモン共鳴を使用して、本発明のペプチド又はポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７−１３）。キメラ抗体の産生は、例えば、国際公開第８９／０９６２２号パンフレットに記載される。本発明に従って利用される抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種抗体である。マウスにおけるヒト抗体などの異種抗体の産生に関する一般原則は、例えば国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレットに記載される。本発明に従って利用される抗体又はそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、当技術分野で知られる従来技術を使用して、例えばアミノ酸の欠失、挿入、置換、付加及び／若しくは組換え並びに／又は当技術分野で知られる任意の他の改変を、単独又は組み合わせて使用することによって、さらに改変することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基盤となるＤＮＡ配列においてこのような改変を導入するための方法は当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照されたい。

【0062】

抗体という用語はまた、それらの結合特異性を保持するか、又は本質的に保持する前記抗体の誘導体に関する。前記誘導体の特に好ましい実施形態は、本明細書中以下にさらに規定されるが、そのような抗体の他の好ましい誘導体は、例えばマウス又はラットの可変領域及びヒトの定常領域を含むキメラ抗体である。

【0063】

抗体は、ヒト化抗体であってもよい。用語「ヒト化抗体」は、本発明によれば、非ヒト起源の抗体であり、そのタンパク質配列が、ヒトにおいて自然に産生される抗体変異体に対してその類似性を増大させるように改変されているものを意味する。ヒト化抗体の作製は、例えば、ＣＤＲ３及び好ましくは全ての６つのＣＤＲなどの適切なＣＤＲコードセグメント（所望の結合特性に関与する）をヒト抗体の「足場」に挿入することによって行われ得る。ヒト化抗体の製造方法は、例えば、欧州特許出願公開第Ａ１０２３９４００号明細書及び国際公開第９０／０７８６１号パンフレットに記載されている。

【0064】

用語「抗体軽鎖」は、抗体の小さいポリペプチドサブユニットを意味し、一方用語「抗体重鎖」は、抗体の大きいポリペプチドサブユニットを意味する。典型的な抗体は、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖及び２つのＩｇ軽鎖から構成される。各軽鎖は２つのタンデムな免疫グロブリンドメイン（１つは定常（Ｃ_Ｌ）ドメインであり、もう１つは抗原への結合に重要である可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）である）から構成される。重鎖は抗体のクラス又はアイソタイプを決定する。各重鎖は、２つの領域、すなわち、定常領域（これは同一のクラスの全ての免疫グロブリンに関して同一であるが、クラス間で異なる）及び各種Ｂ細胞間で異なるが、同一のＢ細胞又はＢ細胞クローンによって産生される全ての免疫グロブリンに関して同一である可変領域を有する。任意の重鎖の可変ドメインは、単一の免疫グロブリンドメインから構成される。

【0065】

抗体の「機能的Ｆｃドメイン」は、当業者によく知られる用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンはクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分けられ、これらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けられ得る。重鎖定常領域に従って、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、［α］、［δ］、［ε］、［γ］、及び［μ］と呼ばれる。抗体の機能的Ｆｃドメインは、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、新生児型Ｆｃ受容体、活性化Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩａ）、抑制性受容体ＦｃγＲＩＩｂ、及び異なる親和性を有するＣ１ｑなどの各種受容体と結合して、非常に異なる活性をもたらす。ヒト抗体のＦｃドメインの活性化及び抑制性受容体に対する親和性は、操作され且つ改変できることが知られている（Ｓｔｒｏｈｌ Ｗ．（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０，ｐ．６８５−６９１を参照のこと）。

【0066】

Ｆｃドメインは、本発明のポリペプチドのインビボ半減期の延長を可能にする１つ以上のヒト機能的Ｆｃドメインであり、そのいくつかは、例えば本明細書中以下に記載する治療、予防及び／又は診断用途において、本発明の融合タンパク質のポリペプチド成分の特異的な標的結合部位に、哺乳動物の免疫応答を誘導することが好ましい。このようなヒト機能的Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１抗体のドメインであることがより好ましい。本発明のポリペプチドは、１つ以上の機能的ＦｃドメインのＮ−若しくはＣ−末端のいずれか、又は１つ以上のＦｃドメインのＮ−及びＣ−末端の両方に融合され得る。ある種の実施形態では、本発明の融合タンパク質はまた、少なくとも一方、例えばＦｃドメインのＮ末端に融合した本発明のポリペプチドの多量体、例えば四量体、三量体又は二量体を含み得る。

【0067】

Ｆｃドメインは、活性化又は抑制性エフェクター機能を有するＩｇＧ１の１つ以上の操作されたヒト機能的Ｆｃドメイン、例えば、抑制性エフェクター機能を有するＩｇＧ１の１つ以上の操作されたヒト機能的Ｆｃドメイン、例えばＫａｂａｔのＥＵインデックスに従うナンバリング（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｇ．ａｎｄ Ｗｕ Ｔ．Ｔ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，ｐ．２１４−２１８を参照のこと）でＬ２３４及びＬ２３５に変異を伴い（例えば、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを伴い）抑制性エフェクター機能を有するＩｇＧ１の１つ以上の操作されたヒト機能的Ｆｃドメインであり得る。

【0068】

本発明のポリペプチドは、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体のＦ_ｃドメイン、抗体、又はこれらの組み合わせを含む前記さらなる化合物のＣ末端の下流に位置してもよい。或いは、本発明のポリペプチドは、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体のＦ_ｃドメイン、抗体、又はこれらの組み合わせを含む前記さらなる化合物のＮ末端の下流に位置してもよい。

【0069】

本発明の融合構築物が抗体に融合された本発明のポリペプチドを含む場合、本発明の融合構築物は、本発明のポリペプチドの２つのコピーを含むことが好ましい。２つのコピーは、本発明の同じポリペプチドの２つのコピーであっても、本発明の異なるポリペプチドの２つのコピーであってもよく、本発明の同じポリペプチドの２つのコピーであることが好ましい。より好ましくは、本発明のポリペプチドの２つのコピーは、抗体の２つの軽鎖のＮ末端、抗体の２つの軽鎖のＣ末端、抗体の２つの重鎖のＮ末端、又は抗体の２つの重鎖のＣ末端に融合され得る。二重特異性を有するいわゆるフィノマブをもたらすモノクローナル抗体に融合されたフィノマー及びその調製物の例は、例えば（例えばＳｉｌａｃｃｉ ｅｔ ａｌ，２０１６，ｍＡｂｓ ８：１，１４１−１４９；Ｂｒａｃｋ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １３（８）：ｐ．２０３０−９；国際公開第２０１４／０４４７５８Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１４／１７００６３Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１５／１４１８６２Ａ１号パンフレット）において十分に記載されている。

【0070】

抗体に融合した本発明のポリペプチドを含む本発明による融合構築物は、好適な条件下で、抗体の軽鎖及び抗体重鎖を、本発明のポリペプチドがこれらの鎖の少なくとも１つに融合されることに留意しながら接触させることによって、エクスビボ又はインビトロにおいて得てもよい。当業者は好適な条件を認識している。好適な条件下でこのように接触させることにより、抗体軽鎖と抗体重鎖の間の相互作用によって誘発される非共有結合性の会合が可能になる。好ましくは、一般に抗体において見出されるジスルフィド結合が、このような本発明の構築物中に存在する。ジスルフィド結合は通常、ヒンジ領域付近に存在し、２つの重鎖並びに／又は軽鎖及び重鎖を連結する。例えば、このような構築物は、哺乳動物細胞における標準的な組換え発現によって作製することができ、通常、対になったインタクトな抗体を含む本発明のインタクトな融合タンパク質が続いて細胞から分泌される。

【0071】

本発明の第２の態様のある種の非限定的な実施形態によれば、抗体は、ＧＭ−２、ＣＤ３８、ＩＣＡＭ−１、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ４５、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＩＧＦＲ−１、ＣＤ２０、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＣＤ６６、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＴＲＯＰ−２、Ｂ７Ｈ３及びＣＥＡＣＡＭ−１からなる群から選択される標的に対して特異的である。

【0072】

したがって、本発明のさらなる化合物はまた、ＧＭ−２、ＣＤ３８、ＩＣＡＭ−１、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ４５、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＩＧＦＲ−１、ＣＤ２０、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＣＤ６６、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＴＲＯＰ−２、Ｂ７Ｈ３又はＣＥＡＣＡＭ−１からなる群から選択される標的に対して特異的である抗体軽鎖、抗体重鎖、又は抗体を含み得る。

【0073】

本明細書において上述のとおり、ＦＧＦＲ３の過剰発現は、いくつかの癌種において実証されている。ＧＭ−２、ＣＤ３８、ＩＣＡＭ−１、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ４５、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＩＧＦＲ−１、ＣＤ２０、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＣＤ６６、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＴＲＯＰ−２、Ｂ７Ｈ３及びＣＥＡＣＡＭ−１の過剰発現もまた、いくつかの癌種において実証されている。この理由のため、第１の標的としてのＦＧＦＲ３ｂ／３ｃ並びにＧＭ−２、ＣＤ３８、ＩＣＡＭ−１、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ４５、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＩＧＦＲ−１、ＣＤ２０、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＣＤ６６、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＴＲＯＰ−２、Ｂ７Ｈ３及びＣＥＡＣＡＭ−１から選択される化合物である第２の標的に結合可能な二重特異性融合構築物が、癌及び関連疾患を治療するために特に好適であると予想される。

【0074】

本明細書中上記のさらなる化合物は、本発明のポリペプチドに直接融合されても、リンカーを介してもよい。したがって、ポリペプチドは、例えば、さらなる化合物のＣ末端に、より具体的には、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ基とＮ末端アミノ酸のアミノ基の間のペプチド結合の形成によって、（直接）融合されてもよく、或いはリンカーを介してさらなる化合物鎖のＣ末端に連結されてもよい。

【0075】

好適なリンカーは、当業者の裁量に委ねられる。本発明によるリンカーは、例えば、１〜３０個の炭素原子を有するアルキル、１〜２０個のエチレン部分を有するポリエチレングリコール、１〜２０個の残基を有するポリアラニン、カプロン酸、置換された又は非置換のポリ−ｐ−フェニレン及びトリアゾールからなる群から選択され得る。ペプチド性リンカー、より具体的には１〜３０個のアミノ酸長を有するオリゴペプチドが好ましい。好ましい長さの範囲は５〜１５個のアミノ酸である。

【0076】

少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％の、グリシン、セリン及びアラニンなどの小さいアミノ酸からなるペプチドであるリンカーが特に好ましい。グリシン及びセリンのみからなるリンカーが特に好ましい。好適なリンカーの非限定的な例は、（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの３回の繰り返し）である。

【0077】

第３の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド、若しくは本発明の融合構築物をコードする核酸分子、又は本発明の融合構築物をコードする１つ以上の核酸分子に関する。

【0078】

本発明の構築物をコードする１つ以上の核酸分子は、例えば、２つの核酸分子であってもよく、一方の核酸分子が抗体の軽鎖をコードし、もう一方の核酸分子が抗体の重鎖をコードする。上記のとおり、本発明のポリペプチドは、この場合、軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかに融合され得る。

【0079】

本発明による核酸分子は、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、及びｍＲＮＡ並びにＰＮＡを含む。さらに、ＤＮＡ又はＲＮＡ並びにセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の混合ポリマーの合成又は半合成誘導体などの当技術分野で知られる核酸模倣分子が含まれる。当業者に容易に理解されるとおり、それらは、追加の非天然の又は誘導体化ヌクレオチド塩基を含有してもよい。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸分子は、ＤＮＡである。本発明によるこのような核酸模倣分子又は核酸誘導体としては、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミデート核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８，１−７（２００１）を参照のこと）。ＬＮＡは、リボース環が２’−酸素と４’−炭素の間のメチレン結合によって拘束されているＲＮＡ誘導体である。

【0080】

核酸分子が記載された配列（からなるではなく）を含むこれらの実施形態では、追加のヌクレオチドは、５’末端上若しくは３’末端上のいずれか又はこの両方の特定の配列を超えて伸びている。

【0081】

追加の異種配列は、上記分子のコード配列に作動可能に連結された異種プロモーターを含んでもよい。したがって、核酸分子はプロモーターに作動可能に連結されてもよい。プロモーターは当業者によく知られており、当技術分野で日常的に使用されている。非限定的な例は、典型的に哺乳動物細胞において強力な発現を駆動するＣＭＶ最初期プロモーターである。

【0082】

本発明はまた、本発明の１つ以上の核酸分子を含む１つ以上のベクター及び本発明の１つ以上の核酸分子又は本発明の１つ以上のベクターを含む１つ以上の宿主細胞に関する。

【0083】

加えて、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む細胞、好ましくは単離細胞に関する。この細胞はまた宿主細胞とも呼ばれる。

【0084】

ベクター及び単離細胞、特に宿主細胞は、目的、例えば本発明のポリペプチド及び／若しくは融合構築物の製造に適する任意の従来型、並びに／又は治療上有用なベクター及び宿主細胞であり得る。当業者であれば、それらのベクター及び宿主細胞を技術から選択し、所望の目的に対するそれらの特定の適合性を、過度な負担なしに通例の方法によって確認することが可能であろう。

【0085】

本発明の１つ以上のベクターは、本発明の１つ以上の核酸を含み、好ましくは、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質を生成する能力を有する。ある種の実施形態では、そのようなベクターは、ｐＱＥベクター、ｐＥＴベクター、ｐＦＵＳＥベクター、ｐＵＣベクター、ＹＡＣベクター、ファージミドベクター、ファージベクター、遺伝子治療に使用されるベクター、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスからなる群から選択される。ベクター改変技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１を参照されたい。一般に、ベクターは、クローニング若しくは発現のための１つ以上の複製開始点（ｏｒｉ）及び遺伝形質、宿主における選択、例えば抗生物質耐性のための１つ以上のマーカー、並びに１つ以上の発現カセットを含有することができる。好適な複製開始点（ｏｒｉ）としては、例えば、Ｃｏｌ Ｅ１、ＳＶ４０ウイルス及びＭ１３複製開始点が挙げられる。

【0086】

本発明の１つ以上の核酸分子はまた、別の核酸分子との翻訳融合物が生成されるように１つ以上のベクターに挿入されてもよい。他の核酸分子は、例えば、抗体の軽鎖及び／若しくは重鎖、並びに／又はリンカーをコードすることができ、その好ましい例は本明細書で上述されている。

【0087】

１つ以上の宿主細胞は、本発明の１つ以上の核酸分子又は１つ以上のベクターを、それらの存在時に、前記核酸分子又はベクターによってコードされるポリペプチドの発現を媒介する１つ以上の宿主細胞に導入することによって作製されてもよい。宿主細胞は、単離された宿主細胞であることが好ましく、これは細胞が生存する生物の状態にないことを意味する。宿主は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。好適な真核細胞宿主は、哺乳動物細胞、両生類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、真菌細胞又は植物細胞であってもよい。真核細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞などの昆虫細胞、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母細胞、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞などの真核細胞、又は脊椎動物細胞であってもよい。後者に関して、細胞は、例えばヒト細胞、ハムスター細胞又はサル細胞などの哺乳動物細胞であることが好ましい。細胞は、細胞株の一部であってもよい。

【0088】

原核生物／細菌の好適な例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ株のＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、Ｙ１０９０及びＪＭ１０１）のような一般にクローニングのために使用されるものである。

【0089】

第４の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明の融合構築物、本発明の核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む、医薬組成物又は診断用組成物に関する。

【0090】

本発明の医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。「薬学的に許容される担体又は賦形剤」とは、非毒性の固体、半固体若しくは液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は任意のタイプの製剤助剤を意味する。薬学的に許容される担体又は賦形剤の例は、例えば、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９に記載されている。

【0091】

本明細書中上記でより詳細に論じられるとおり、ＦＧＦＲ３は多くの疾患及び特に癌に関与する。したがって、本発明のポリペプチド、融合構築物、核酸分子、ベクター、又はこれらの任意の組み合わせは、薬剤として有用である。前記医薬組成物内で、本発明のポリペプチド、融合構築物、核酸分子、ベクター、又はこれらの任意の組み合わせが、唯一の活性薬剤であってもよいが、一方でそれらは、例えば組み合わせ製品において、他の活性薬剤と組み合わせることもできる。医薬組成物は、例えば、家畜並びに愛玩動物、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物などの哺乳動物に投与することができる。好ましくは、それはヒトに投与される。本明細書に記載される医薬組成物は、好適な用量で対象に投与されることになる。

【0092】

本発明に従う使用のための医薬組成物は、１つ以上の生理学的担体又は賦形剤を使用して、当技術分野において認められる方法に従う従来の方法で製剤化することができ、例えば、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９を参照されたい。したがって、医薬組成物は、従来の薬学的に許容される賦形剤を任意選択で含む投与単位形態で、経口的に、非経口的に、例えば、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、経皮的に、経粘膜的に、硬膜下に、イオン導入法を介して局部若しくは局所的に、舌下に、吸入スプレーにより、エアロゾルで又は直腸からなどで投与されてもよい。また本発明の診断用組成物は、任意の従来の方法で製造されてもよい。

【0093】

本発明の医薬組成物は、例えば、上述の疾患の治療又は予防のために、唯一の活性成分として、又は免疫抑制剤若しくは免疫調節剤若しくは他の抗炎症剤などの別の活性成分と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明のポリペプチド、融合構築物及び構築物が、モノクローナル抗体、例えば、ＧＭ−２、ＣＤ３８、ＩＣＡＭ−１、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ４５、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＩＧＦＲ−１、ＣＤ２０、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＣＤ６６、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＴＲＯＰ−２、Ｂ７Ｈ３又はＣＥＡＣＡＭ−１に親和性を有するモノクローナル抗体と組み合わせて使用されてもよい。

【0094】

本発明の診断用組成物は、特にＦＧＦＲ３の不要な過剰発現に起因する望ましくない生理学的ＦＧＦＲ３レベルの検出に有用である。前記検出は通常、試料を本発明のポリペプチド、融合構築物、構築物、核酸分子、ベクター、宿主細胞又はこれらの任意の組み合わせと接触させること、及び試料中におけるＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃ、特に配列番号９及び１０のＦＧＦＲ３ｂ及び３ｃの存在を検出することを含む。したがって、本発明の診断用組成物は、発症又は疾患状態、及び特にＦＧＦＲ３の過剰発現に関連する癌又は関連疾患を評価するために使用され得る。

【0095】

本明細書中上記の本発明の一実施形態では、本発明のポリペプチドは、蛍光色素、光増感剤、放射性核種、又は医用画像化用造影剤に連結される。このような融合構築物は特に診断用途に好適である。これは、ＦＧＦＲ３が、例えば、癌において過剰発現され、その結果、検出できるほどに標識された本発明のポリペプチドを使用して、疾患部位を画像化して、癌を有するような対象を診断できるためである。

【0096】

本発明の診断用組成物及び医薬組成物の投与量は、本発明の特定のペプチド、融合構築物、構築物、１つ以上の核酸分子、１つ以上のベクター又はこれらの任意の組み合わせ、個々の患者集団又は患者、さらなる診断用の又は医学的に活性な化合物の任意選択的な存在、並びに診断又は治療される疾患の性質及び重症度に応じて変動することになる。通常、診断用組成物及び医薬組成物は、約０．０１ｍｇ〜約２０ｍｇ／キログラム体重、例えば、約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ／キログラム体重の投与量で使用される。診断用組成物又は医薬組成物は、２回以上投与されて、例えば、診断用組成物の場合は疾患の経過をモニターするか、又は医薬組成物の場合は治療を延長し得る。例えば、診断用組成物又は医薬組成物の投与の頻度は、毎日から約３ヶ月毎に１回まで、例えば、約２週間毎に１回から約１０週間毎に１回まで、例えば４〜８週間毎に１回の範囲であり得る。ある種の実施形態では、投与計画は、１ヶ月に１回から２〜３ヶ月毎に１回、又はそれより少ない頻度での本発明の診断用組成物又は医薬組成物の投与を含む。

【0097】

ある種の実施形態によれば、本発明の第４の態様の医薬組成物又は診断用組成物は、癌又はＴ細胞介在性疾患の治療における使用のためのものである。

【0098】

本明細書において上述のとおり、ＦＧＦＲ３の過剰発現は、いくつかの癌種において報告されており、その結果、医薬組成物又は診断用組成物は、癌の治療及び診断に特に好適である。したがって、癌細胞がそれらの表面上にＦＧＦＲ３を発現するか、又は癌がＦＧＦＲ３の過剰発現と関連する癌が好ましい癌である。

【0099】

癌におけるＦＧＦＲ３発現の既知の役割のために、本発明の医薬組成物又は診断用組成物はまた、良性及び悪性腫瘍を含む新生物の治療においても一般に使用され得る。

【0100】

ＦＧＦＲ３活性の阻害が、Ｔ細胞媒介性疾患、特にＴ細胞介在性炎症性疾患及び自己免疫疾患を治療する手段であることは、米国特許出願公開第２００８／０４４４１９号明細書において報告されている。

【0101】

本発明の第４の態様のある種の実施形態によれば、癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、神経膠腫、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、皮膚癌、精巣癌及び尿路上皮癌から選択される。

【0102】

「Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ００００００６８０７８−ＦＧＦＲ３／ｃａｎｃｅｒを参照のこと）によれば、ＦＧＦＲ３の発現は、次の癌種：乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、神経膠腫、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、皮膚癌、精巣癌及び尿路上皮癌において見出された。したがって、ＦＧＦＲ３の発現は、これらの癌種の発生において関連があると予想することができる。

【0103】

本発明の第４の態様のある種の実施形態によれば、癌は、多発性骨髄腫、膀胱癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺扁平上皮癌、及び結腸直腸癌から選択される。

【0104】

ＦＧＦＲ３の過剰発現が、多発性骨髄腫及び膀胱癌において報告されていることは、本明細書において上述されている。ＦＧＦＲ３の発現はまた、子宮頸癌（Ｃａｐｅｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｓｅｐ；２３（１）：１８−２０．）、膵臓癌（Ｌａｆｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ，２０１３，１２：８３）、及び結腸直腸癌（Ｓｏｎｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２０１０；１０２（７）：１１４５−１１５６）と関連づけられている。さらに、ＦＧＦＲ３の発現は、肺扁平上皮癌（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ（２０１３），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３（１６）：５１９５−５２０５）において観察された。

【0105】

本発明の第４の態様のある種の実施形態によれば、Ｔ細胞介在性疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、ＩＩ型コラーゲン関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、乾癬、若年発症糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、類肉腫症、自己免疫ぶどう膜炎、炎症性腸疾患（クローン及び潰瘍性大腸炎）、セリアック病及び重症筋無力症から選択される。

【0106】

上に列挙された疾患は、ＦＧＦＲ３の阻害によって治療され得る特定のＴ細胞媒介性疾患の非限定的な例である。

【0107】

本明細書には、特許出願及び製造業者のマニュアルを含めて、いくつかの文献が引用されている。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連するとみなされるものではないが、これをもってその全体が参照により組み込まれる。より具体的には、全ての参照された文献は、あたかもそれぞれの個々の文献が具体的且つ個別に参照により組み込まれることを指示されるのと同程度まで、参照により組み込まれる。

【0108】

本発明の全体にわたって、用語「含む」は、列挙される全ての要素が包含されることを意味する。この用語が用いられるとき、追加の不特定の要素もまた任意選択的に存在する場合がある。したがって、「含む」は、「〜からなる」を意味する場合があるか（すなわち、列挙された要素のみが存在する）、又は「含有する」を意味する場合がある（すなわち、列挙された全ての要素以外の他の要素もまた存在する）。したがって、配列番号ｘを含むポリペプチドは、配列番号ｘのみからなる場合があるか、又は他の実施形態において、例えば、配列番号ｘが抗体重鎖又は軽鎖に融合されている実施形態では、例えば融合タンパク質におけるものなど、追加のアミノ酸を含む場合がある。

【0109】

別途定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本特許明細書が優先する。

【0110】

本明細書で、特に、特許請求の範囲で特徴づけられた実施形態に関して、従属請求項に記載される各実施形態は、前記従属請求項が従属する各請求項（独立又は従属）の各実施形態と組み合わされることが意図される。例えば、独立請求項１が３つの選択肢Ａ、Ｂ、及びＣを挙げ、従属請求項２が３つの選択肢Ｄ、Ｅ及びＦを挙げ、且つ請求項１及び２に従属する請求項３が３つの選択肢をＧ、Ｈ及びＩを挙げる場合、別途具体的な記載がない限り、明細書では、組み合わせ、すなわち、Ａ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する実施形態が一義的に開示されると理解すべきである。

【0111】

同様にまた、独立及び／又は従属請求項が選択肢を挙げない場合、従属請求項が大部分の先行請求項に戻って参照するとき、それにより包含される主題の任意の組み合わせが明示的に開示されるものとみなされると理解される。例えば、独立請求項１、請求項１に戻って参照する従属請求項２、及び請求項２及び１の両方に戻って参照する従属請求項３の場合、請求項３及び１の主題の組み合わせは、請求項３、２、及び１の主題の組み合わせとして、明確に且つ一義的に開示されることになる。請求項１〜３のいずれか一項を参照するさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４及び１、請求項４、２、及び１、請求項４、３、及び１、さらには請求項４、３、２、及び１の主題の組み合わせが明確に且つ一義的に開示されることになる。

【0112】

上記の考慮を、必要な変更を加えて全ての添付の特許請求の範囲に適用する。

【実施例】

【0113】

実施例は本発明を説明する。

【0114】

実施例１：ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃに結合するＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド。
ＦＧＦＲ３の標的化を可能にするために、本発明者らは設計して、それに対する特異的なＦｙｎ ＳＨ３由来結合分子を得た。各種腫瘍細胞上における２つの異なるスプライスバリアント（ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃ）の分布及び発現は完全に理解されていないため、Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドがその両方に結合できることは重要である。

【0115】

組換えヒトＦＧＦＲ３ｂ−Ｆｃ（配列番号１２）及びＦＧＦＲ３ｃ−Ｆｃ（配列番号１３）を標的として使用して、本発明者らは、ヒトＦＧＦＲ３の両方のスプライスバリアント（配列番号９及び１０）に結合することができるＦｙｎ ＳＨ３由来結合タンパク質のいくつかのファミリーを首尾よく選択し、且つ単離した。本発明者らは、さらなる試験のために最も有望な候補ファミリーで続けた。

【0116】

興味深いことに、ＲＴ−ループ「ＥＶＹＧＰＴＰ」（配列番号２）を有し、ＦＦ２Ｌ４Ｃ３（配列番号３）と称されるＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、選択過程中に濃縮され、２９個の試験された抗ＦＧＦＲ３フィノマーの中で最も有望な内部移行特性を示した（図２を参照のこと）。より詳細には、５個の他の配列ファミリーが、さらなる分析から除外された。最も有望な配列ファミリーに属するフィノマーは、最も高い親和性及び内部移行特性を示した。

【0117】

より高い親和性及び向上した内部移行特性を有するＦｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合体を得るために、ＦＦ２Ｌ４Ｃ３（配列番号３）を、親和性成熟のための鋳型として使用した。ＲＴ−ループ配列「ＥＶＹＧＰＴＰ」（配列番号２）は不変のままとし、無作為抽出のｎ−ｓｒｃ−ループレパートリーと組み合わせた（一続きの４〜６個の無作為抽出のアミノ酸残基が、配列番号１における位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^４）に導入された）。親和性成熟ライブラリーの生成の過程は、無作為抽出のｎ−ｓｒｃ−ループによるナイーブライブラリーのクローニングについて記載されたものと本質的に同じである（［２５］において記載される「ライブラリー０」）。

【0118】

ナイーブ及び親和性成熟選択の後、濃縮されたＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドを、ライセートＥＬＩＳＡによってＦＧＦＲ３への結合についてスクリーニングした。Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．［２６］に記載されるとおりに、得られた構築物がＣ末端ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグを有するように、Ｆｙｎ ＳＨ３由来結合タンパク質をコードするＤＮＡを、細菌発現ベクターｐＱＥ１２（Ｑｉａｇｅｎ）にクローン化した。ポリペプチドを、９６ウェルフォーマットにおいて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌の細胞質ゾル中で発現させて、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．［２７］に記載されるとおりに、ウェル当たり２００μｌの透明なライセートを調製した。簡単に言うと、形質転換された細菌コロニーを、寒天プレートから拾い上げ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含有する２００μｌの２ｘＹＴ培地中で、丸底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１６３３２０）において増殖させた。３７℃及び２００ｒ．ｐ．ｍ．で回転させながら３時間振盪して増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧ（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによってタンパク質発現を誘導した。回転式振盪機（２００ｒ．ｐ．ｍ．、３０℃）中でタンパク質を一晩発現させた。引き続いて、９６ウェルプレートを１８００ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）とＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ７０７５０−３）を使用して細菌ペレットを溶解し、続いてライセートを１８００×ｇでの１０分間の遠心分離によって清澄化した。６０μｌのライセートを１７０μｌのＰＢＳと混合し、残留している細菌の残骸を除去するために、０．４５μｍのマルチスクリーンフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＳＨＶＮ４５１０）に通して濾過した。

【0119】

単クローンの細菌ライセートをＥＬＩＳＡに使用した。ＥＬＩＳＡのために、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、５μｇ／ｍｌのｈｕＦＧＦＲ３ｂ−Ｆｃ（配列番号１２）、５μｇ／ｍｌのｈｕＦＧＦＲ３ｃ−Ｆｃ（配列番号１３）又は５μｇ／ｍｌポリＩｇＧのいずれかで一晩コーティングし、２％のＭＰＢＳで少なくとも１時間ブロックした。Ｃ末端ｍｙｃ及びヘキサヒスチジンペプチドタグを有する可溶性フィノマーを含有する清澄化されたライセートを、マウスモノクローナル抗ｍｙｃタグ抗体、クローン９Ｅ１０（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１ ６６７ ２０３ ００１）を含有する２％ＭＰＢＳ中において、ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに添加した。結合されたフィノマーを、抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ２５５４）によって９Ｅ１０を介して検出した。ＢＭ ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加することによりペルオキシダーゼ活性の検出を行い、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することにより反応を停止させた。

【0120】

特異的な結合体のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

【0121】

結果
ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃに結合するＥＬＩＳＡ陽性のＦｙｎ ＳＨ３由来の好ましいポリペプチドのアミノ酸配列は、配列リスト中に添付されるとおり配列番号３〜８において示される。Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド 配列番号４〜８は、ＦＦ２Ｌ４Ｃ３（配列番号３）の親和性成熟の後に得られた分子の大規模なプールに由来する結合体の選択物であり、それらの親和性及び内部移行特性は向上しているため（実施例２及び５において示される）ここに示す。

【0122】

より詳細には、配列番号３に由来する８０個を超えるフィノマーが、それらの生物物理学的特性、親和性及び内部移行特性に関して特徴づけられた。配列番号４〜８は、生物物理、親和性及び内部移行の観点における特性の最良のセットを有する結合体である。

【0123】

実施例２：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドの発現
本実施例は、好ましいＦｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドの発現収量及びサイズ排除クロマトグラフィーによるこれらのポリペプチドの特徴づけを示す。

【0124】

方法
ａ）Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドの発現収量
Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドを、ＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌の細胞質ゾルにおいて発現させ、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．［２］に記載されるとおりに精製した。

【0125】

ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ ＰＷ Ｇ３０００ＰＷｘＬ；Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣ；ＰＢＳ ｐＨ７．４移動相）によって分析した。１０μｌの未希釈の試料をカラムに注入し、得られたプロファイルを分析した。

【0126】

結果
ａ）発現収量
本発明の単量体Ｆｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドの発現収量は、振盪フラスコにおいて最適化されていない条件下で１５〜５１ｍｇ／１リットルの細菌培養液の範囲であり（表１）、Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドに関する典型的な範囲である。

【0127】

【表1】

【0128】

ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルは、全ての構築物が主に単一の単量体ピークとして溶出されることを実証した（図３）。これは一般に良好な生物物理学的特性を示し、これはフィノマー（抗体との融合タンパク質であるフィノマブを含むＦｙｎ ＳＨ３由来結合分子）の製造上の観点から有利であり、Ｆｙｎ ＳＨ３由来分子の以前の観測結果と一致する。

【0129】

実施例３：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、高い親和性を有してヒトＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃに結合する。
本実施例は、表面プラズモン共鳴及びフローサイトメトリー実験による好ましいＦｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドの特徴づけを示す。

【0130】

方法
ａ）ＢＩＡｃｏｒｅによる親和性測定
親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して測定した。ＣＭ５シリーズＳチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ−１００５−３０）上の１つのフローセルを、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ１００６３３）を使用して、抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（Ｒｏｃｈｅ １１ ６６７ ２０３ ００１；６０００と８０００ＲＵの間の範囲のコーティング密度）でコーティングした。

【0131】

５００ｎＭの濃度の親フィノマーＦＦ２Ｌ４Ｃ３（配列番号３）、及び１００ｎＭの濃度の配列番号４〜８を有するフィノマーを、９Ｅ１０表面上で捕捉した後、様々な濃度のｈｕＦＧＦＲ３ｂ−Ｆｃ（配列番号１２）、ｈｕＦＧＦＲ３ｃ−Ｆｃ（配列番号１３）又はｃｙｎｏＦＧＦＲ３ｃ−Ｆｃ（配列番号１４）を注入した（親フィノマーＦＦ２Ｌ４Ｃ３の測定のために０ｎＭ、３．９ｎＭ、７．８ｎＭ、１５．６ｎＭ、３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ及び５００ｎＭ、配列番号４〜８を有するフィノマーのために０ｎＭ、０．０４６ｎＭ、０．１４ｎＭ、０．４１ｎＭ、１．２ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ及び１００ｎＭ）。センサーグラムを記録し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウェアにおける１．１ラングミュア相互作用モデルを用いたカーブフィッティングによって、見かけの動力学定数を決定した。

【0132】

ｂ）フローサイトメトリーによる親和性測定
細胞上のｈｕＦＧＦＲ３に対するフィノマーの結合を、ＦＧＦＲ３陽性細胞としてのＫＭＳ−１１細胞（ＪＣＲＢ１１７９）及びＦＧＦＲ３陰性対照細胞株としてのＮ８７（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−５８２２）を使用して、フローサイトメトリーによって分析した。ＫＭＳ−１１細胞及びＮ８７細胞の両方を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ５２４００−２５）中で維持した。全ての培地に、２５Ｕ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％のＦＣＳを補充した。Ｔ１５０フラスコから半付着性のＫＭＳ−１１細胞を回収するために、上清を５０ｍｌファルコンチューブに取り出し、細胞を１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、これもまたファルコンチューブに加えた。２ｍｌのＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ａ６９６４）をフラスコに加え、３７℃で１０分間インキュベートした。１０ｍｌの培地の添加によりＡｃｃｕｔａｓｅを不活性化し、ファルコンチューブに加え、続いてこれを遠心分離（２５０×ｇ、５分）して細胞をペレットにした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＣＳ＋０．２％アジ化ナトリウム）中で再懸濁して、１×１０^６細胞／ｍｌの細胞濃度にし、９６ウェル丸底プレート（Ｎｕｎｃ １６３３２０）中でのフローサイトメトリー染色のために、１ウェル（１×１０^５細胞／ウェル）当たり１００μｌを使用した。付着性のＮ８７細胞については、上清及び洗浄液を捨て、Ａｃｃｕｔａｓｅにより剥離した細胞のみを回収し、調製した。

【0133】

フィノマーをマウス抗ｍｙｃ抗体（クローン９Ｅ１０；Ｒｏｃｈｅ １１６６７１４９００１）とコインキュベーションして、細胞結合の前にｍｙｃタグ付きフィノマーの架橋を行った。フィノマーを希釈して１μＭにし、およそ１０分間氷上でＦＡＣＳ緩衝液中において６６７ｎＭの９Ｅ１０抗ｍｙｃ抗体とコインキュベーションした（３：２モル比）。

【0134】

この混合物を４分の１ずつ段階希釈して、０．０６ｎＭのフィノマー濃度にした（全体で８種の濃度）。対照は、二次抗体９Ｅ１０のみ（フィノマーなし；６６７ｎＭ ９Ｅ１０）、細胞のみ（ＦＡＣＳ緩衝液のみ）、及び１０ｎＭの濃度の抗ＦＧＦＲ３抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号ＭＡＢ７６６）を含んだ。細胞を９６ウェルプレート中で遠心分離し（２５０×ｇ、５分）、上に示される試料とともに再懸濁した後、氷上で１時間インキュベーションした。プレートを遠心分離し、洗浄（ＰＢＳ＋０．２％アジ化ナトリウム）した後、再度遠心分離した。次に、５０μｌの二次抗体である抗ｍＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ２１２０２）を、４μｇ／ｍｌの濃度で細胞に加えた後、暗室の氷上において４５分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、ＰＢＳ＋０．２％アジ化ナトリウムで２回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、ＦＡＣＳ分析を行った（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ）。

【0135】

ＦＡＣＳデータ分析をＰｒｉｓｍ ６を使用して実施した。データを変換し（Ｘ＝ｌｏｇＸ）、非線形フィット、ｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．反応−可変勾配（４つのパラメーター）を用いて分析した。

【0136】

結果
ａ）ＢＩＡｃｏｒｅによる親和性測定
結合特性を、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上のリアルタイム相互作用分析によって分析して、選択されたＦＧＦＲ３結合ポリペプチドについて以下の解離定数（ＫＤ）を明らかにした。

【0137】

【表2】

【0138】

ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃ（配列番号９及び１０）に結合するＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド（配列番号３〜８）の測定された見かけの親和性（表２）は、ｎＭ以下の値がただ１ラウンドの親和性成熟後に得られたという事実を考慮すると、驚くほど高い。さらに、これらの測定値は、両方のＦＧＦＲ３のヒトアイソフォーム（ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃ；配列番号９及び１０）、並びにカニクイザルＦＧＦＲ３ｃ（カニクイザルＦＧＦＲ３ｂへの結合は試験されなかった）に対するＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド（配列番号３〜８）の同等の結合特性を確証した。

【0139】

ｂ）フローサイトメトリーによる親和性測定
結合特性を、ＦＧＦＲ３陽性ＫＭＳ−１１細胞及び陰性対照としてのＦＧＦＲ３陰性Ｎ８７細胞を用いて、フローサイトメトリーによって分析した。選択されたＦＧＦＲ３結合ポリペプチドに関する以下のＥＣ５０値は、表３及び図４において示されるとおりに測定された。

【0140】

【表3】

【0141】

ＦＧＦＲ３を発現する細胞株上で測定された低ナノモル濃度範囲（表３）のＥＣ５０値（図４Ａ、ＫＭＳ−１１）は、表面プラズモン共鳴によって測定された高い見かけの親和性（表２）を確証し、細胞表面の自然な状態におけるＦＧＦＲ３への結合を実証している。ＦＧＦＲ３に結合する全てのＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド（配列番号３〜８）は、ＦＧＦＲ３を発現しない細胞株に対して非特異的な結合を示さなかった（図４Ｂ）。

【0142】

実施例４：ＦＧＦＲ３に特異的な本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、リガンド結合を妨げない。
リガンド結合部位は、ＦＧＦＲ３ｂ又はＦＧＦＲ３ｃのいずれかを生じるスプライス部位に近接して位置するため、両方のアイソフォームＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃに結合するためのＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドが、リガンド（例えば、ＦＧＦ１）結合を妨げなければ好ましいであろう。

【0143】

リガンドのうちの１つの存在下で、Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドのＦＧＦＲ３に結合する能力を検証する目的で、ＢＩＡｃｏｒｅ実験を設計して、ＦＧＦ１の存在下又は非存在下でのフィノマーのＦＧＦＲ３に対する親和性を測定した（線維芽細胞増殖因子１は、ＦＧＦＲ３の主要なリガンドの１つである）。

【0144】

親和性を測定するために使用される方法と同様に、１００ｎＭの濃度のフィノマー（５００ｎＭの濃度で使用されるＦＦ２Ｌ４Ｃ３−配列番号３を除いて）を９Ｅ１０表面上で捕捉した後、様々な濃度のｈｕＦＧＦＲ３ｃ−Ｆｃ（配列番号１３）（０ｎＭ、１１ｎＭ、３３ｎＭ、１００ｎＭ）を、２００ｎＭのＦＧＦ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ２３２−ＦＡ−０２５／ＣＦ）の存在下又は非存在下において注入した。センサーグラムを記録し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウェアを用いて見かけの動力学定数を計算した。

【0145】

結果
溶液中における２００ｎＭのＦＧＦ１の有無に関わらず、ｈｕＦＧＦＲ３ｃに対するＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドの結合は変化しなかったが、これは、ＦＧＦＲ３に対するフィノマーの結合がリガンド結合を妨げなかったことを示している。

【0146】

【表4】

【0147】

アッセイの変動性によって、ＦＧＦ１の非存在下でのＫＤ_ａｐｐの値は、実施例２に示される実験において得られた値（表２）とはわずかに異なるものの、この実験は、Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドが、たとえリガンド（この場合ＦＧＦ１）がリガンド結合部位に結合しているとしても、ＦＧＦＲ３に結合できることを示す。

【0148】

これより、本発明者らは、本明細書に記載されるＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドにより結合されるエピトープは、ＦＧＦＲ３の定常領域に位置すると結論する。

【0149】

実施例５：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３のドメインＤ１〜Ｄ２に結合する。
ＦＧＦＲ３に対するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド結合の特異性をＥＬＩＳＡによって試験した。

【0150】

各種抗原をプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート；Ｎｕｎｃ ４３９４５４）上にコーティングした：ｈｕＦＧＦＲ３ｂ−Ｆｃ（配列番号１２）、ｈｕＦＧＦＲ３ｃ−Ｆｃ（配列番号１３）、ｃｙＦＧＦＲ３ｃ−Ｆｃ（配列番号１４）、ｍｕＦＧＦＲ３ｃ−Ｈｉｓ（配列番号１５）、ｈｕＤ１−Ｆｃ（配列番号１６）、ｈｕＤ２−Ｆｃ（配列番号１７）、ｈｕＤ１−Ｄ２−Ｆｃ（配列番号１８）。

【0151】

プレートを５μｇ／ｍｌ（０．５μｇ／ウェル）の１００ｕｌ抗原でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、２００μｌの４％ＰＢＳにより室温で１時間ブロックした。ウェルを再度洗浄し、１５μｇ／ｍｌの９Ｅ１０を含有する２０μｌの１０％ＭＰＢＳを加えた後、８０μｌの２５０ｎＭフィノマーを加えた（２００ｎＭの最終フィノマー濃度）。ウェルを室温で４５分間インキュベートした後、洗浄し、２％ＭＰＢＳ中で１：１０００に希釈された１００μｌの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ２５５４）を加えた。ウェルを室温で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回、続いてＰＢＳで３回洗浄した。１００μｌのＢＭ ＰＯＤ Ｂｌｕｅ基質（Ｒｏｃｈｅ １１ ４８４ ２８１ ００１）を各ウェルに加えた後、５０μｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止した。吸光度４５０ｎｍ〜６５０ｎｍを、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００機器を使用して記録した。

【0152】

結果
図５Ａ〜Ｆにおいて示されるとおり、Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは全て、カニクイザル及びマウスＦＧＦＲ３ｃに対して交差反応性を示す。興味深いことに、全ての結合体は、ドメインＤ１及びＤ２が物理的に連結しているときにのみ存在するエピトープに対して特異的であり（図５Ａ〜ＦのバーｈｕＦＧＦＲ３−Ｄ１Ｄ２）、実際に、単一のドメインＤ１又はＤ２（ｈＦＧＦＲ３−Ｄ１又はｈｕＦＧＦＲ３−Ｄ２）がＥＬＩＳＡプレート上に固定化されている場合には結合は観察されない。

【0153】

実施例６：本発明のＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドはＦＧＦＲ３の効率的な内部移行をもたらす。
内部移行は、本明細書で記載されるＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドの中心的な特性であり、毒性ペイロード及び／又は抗体などの融合されたタンパク質を細胞内に送達するためにこれらの結合体を使用する機会を提供する。

【0154】

ＦＧＦＲ３に結合しているＦｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドが標的に結合しているときに内部移行する能力を評価するために、細胞傷害性薬剤の細胞内送達に基づく内部移行アッセイを確立した。

【0155】

本アッセイは、ＫＭＳ−１１細胞上でＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）コンジュゲート９Ｅ１０と架橋した抗ＦＧＦＲ３フィノマーの細胞障害効果を測定する。ＭＭＡＦは、有糸分裂阻害剤（チューブリンの重合を遮断する）であり、細胞内に内部移行したときにのみ活性である。したがって、このアッセイは、フィノマーがどの程度ＭＭＡＦの内部移行を促進するかを示す。５０μｌの２×１０^５細胞／ｍｌ ＫＭＳ−１１を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ３６１０）に播種し、ウェル当たり１０，０００細胞を得た。細胞を４時間インキュベートして、細胞を付着させた（３７℃、５％ＣＯ２）。フィノマー及び９Ｅ１０−ＭＭＡＦを３：１の比で混合した。フィノマー（４μＭ）の４×原液及び９Ｅ１０−ＭＭＡＦ（１．３３μＭ）の４×原液を、ＲＰＭＩ培地中で調製し（節５．４．１を参照のこと）、１：１（４０μｌ＋４０μｌ）で混合した。次に、この混合物を３分の１ずつ段階希釈して、１０００ｎＭ〜５０ｐＭの濃度範囲を得た。５０μｌの試料を５０μｌの細胞（上で播種された）に加え、５日間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。適切な対照、野生型フィノマーＦｙｎＳＨ３、フィノマーを伴わないＭＭＡＦ−９Ｅ１０及びいかなる試薬の添加もない細胞が含まれた。全ての試料を複製して調製した。５日後、１００μｌのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７３）を各ウェルに加え、暗室中で緩やかに振盪させながら１０分間インキュベートした。細胞生存率のための読み出し情報として、輝度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００機器を使用して測定した。分析をＰｒｉｓｍ ６を使用して実施した。データを変換し（Ｘ＝ｌｏｇＸ）、非線形フィット、ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．反応−可変勾配（４つのパラメーター）を用いて分析した。

【0156】

結果
本明細書で記載される全てのＦｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドは、ＭＭＡＦ標識二次抗体のみ（図６Ａにおける９Ｅ１０）、又はおそらくＭＭＡＦ自体の細胞傷害性に起因して、試験された最高の濃度でのみ細胞障害性を示す、３つ全ての実験において示されるＭＭＡＦ標識９Ｅ１０と組み合わせた野生型フィノマーＦｙｎＳＨ３（ＦｙｎＳＨ３として示される図６Ａ〜Ｃ）で処理された細胞と比較して、細胞傷害性の上昇を示す。図６は、異なる実験において得られた細胞障害性プロファイルを示し、表５は、異なるＦｙｎ ＳＨ３由来ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドについて得られたＥＣ５０を示す。

【0157】

【表5】

【0158】

図６及び表５において示されるデータは、親和性の上昇が、より効率的な内部移行にもつながることを示す。

【0159】

実施例７：優れた結合特性及び内部移行特性を示し、且つ異なるファミリーに由来する代替のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド
配列（配列番号１）の好ましいファミリーに加えて、本発明者らは１つの代替のフィノマー、ＦＦ４０Ｌ５４Ａ５（配列番号２２）を同定したが、これはまた驚くべきことに、優れた結合特性及び内部移行特性を示し、配列番号１に由来するフィノマーと製造性及び交差反応特性を共有している（表６を参照のこと）。フィノマーＦＦ４０Ｌ５４Ａ５は、その配列が、非常に乏しい内部移行特性のみを示したフィノマーに由来したため、優れた内部移行特性を有すると予想されなかった。

【0160】

表６には、フィノマーＦＦ４０Ｌ５４Ａ５の特性をまとめる。

【0161】

【表6】

【0162】

【表7】

【0163】

【表8】

本発明は以下を提供する。
［１］
線維芽細胞増殖因子受容体３のアイソフォーム３ｂ及び３ｃ（ＦＧＦＲ３ｂ及びＦＧＦＲ３ｃ）に結合するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
（ａ）アミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^６）が任意のアミノ酸配列であり得る、

【化1】

（ｂ）同一性判定ではアミノ酸位置（Ｘ^１）〜（Ｘ^６）を除外し、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１９における前記アミノ酸配列ＥＶＹＧＰＴＰＭ（配列番号２）が保存され、且つ配列番号１のアミノ酸位置３７及び３８における前記アミノ酸Ｐ及びＹが保存されることを条件とする、（ａ）の前記アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）前記アミノ酸位置（Ｘ^６）が任意のアミノ酸であり得る、

【化2】

並びに
（ｄ）同一性判定ではアミノ酸位置（Ｘ^６）を除外し、配列番号１９のアミノ酸位置１２〜１８における前記アミノ酸配列ＥＶＭＳＴＴＡ（配列番号２０）及び配列番号１９のアミノ酸位置３１〜３５におけるＳＱＳＰＨ（配列番号２１）が保存され、且つ配列番号１９のアミノ酸位置３７及び３８におけるアミノ酸Ｑ及びＹが保存されることを条件とする、（ｃ）の前記アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［２］
（Ｘ^１）が、Ｎ、Ｒ、又はＫであり、好ましくはＲ又はＫであり；
（Ｘ^２）が、Ｓ、Ｇ、Ｋ又はＲであり、好ましくはＧ、Ｋ又はＲであり；
（Ｘ^３）がＳ又はＧであり、好ましくはＧであり；
（Ｘ^４）が、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｓ又はＫであり、好ましくはＱ、Ｄ、Ｓ又はＫであり；
（Ｘ^５）が、Ｔ又はＡであり；且つ
（Ｘ^６）が、Ｙ、Ｗ又はＬであり、好ましくはＬ又はＷである、
上記［１］に記載のポリペプチド。
［３］
前記ポリペプチドが、配列番号３〜８又は２２のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
［４］
前記ポリペプチドが、
配列番号４、
配列番号５、
配列番号６、
配列番号７、
配列番号８、及び
配列番号２２
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［３］に記載のポリペプチド。
［５］
さらなる化合物に融合した上記［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合構築物。
［６］
前記さらなる化合物が毒性化合物である、上記［５］に記載の融合構築物。
［７］
前記さらなる化合物が、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体のＦｃドメイン、抗体、又はこれらの組み合わせを含む、上記［５］に記載の融合構築物。
［８］
前記抗体が、ＧＭ−２、ＣＤ３８、ＩＣＡＭ−１、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ４５、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＩＧＦＲ−１、ＣＤ２０、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＣＤ６６、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＴＲＯＰ−２、Ｂ７Ｈ３及びＣＥＡＣＡＭ−１からなる群から選択される標的に対して特異的である、上記［７］に記載の融合構築物。
［９］
上記［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチド、又は上記［５］若しくは［７］に記載の融合構築物をコードする核酸分子、又は上記［７］若しくは［８］に記載の融合構築物をコードする１つ以上の核酸分子。
［１０］
上記［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチド、上記［５］〜［８］のいずれかに記載の融合構築物、上記［９］に記載の核酸分子、又はこれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物又は診断用組成物。
［１１］
癌又はＴ細胞介在性疾患の治療における使用のための、上記［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］
前記癌が、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、神経膠腫、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、皮膚癌、精巣癌及び尿路上皮癌から選択される、上記［１１］に記載の使用のための医薬組成物。
［１３］
前記癌が、多発性骨髄腫、膀胱癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺扁平上皮癌、及び結腸直腸癌から選択される、上記［１１］に記載の使用のための医薬組成物。
［１４］
前記Ｔ細胞介在性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、ＩＩ型コラーゲン関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、乾癬、若年発症糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、類肉腫症、自己免疫ぶどう膜炎、炎症性腸疾患（クローン及び潰瘍性大腸炎）、セリアック病及び重症筋無力症から選択される、上記［１１］に記載の使用のための医薬組成物。

【0164】

参考文献
１．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．ａｎｄ Ｒ．Ｇｒｏｓｅ，Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ｆｒｏｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２０１０．１０（２）：ｐ．１１６−２９．
２．Ｋａｌｆｆ，Ａ．ａｎｄ Ａ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｔｈｅ ｔ（４；１４） ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＦＧＦＲ３ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ，２０１２．２：ｐ．ｅ８９．
３．Ｐｏｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｅｌｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ｃｏｎｆｅｒｓ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｂｌｏｏｄ，２００２．１００（１０）：ｐ．３８１９−２１．
４．Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ，２００３．１０１（１１）：ｐ．４５６９−７５．
５．Ａｇａｚｉｅ，Ｙ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＳＨＰ２ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３．２２（４４）：ｐ．６９０９−１８．
６．Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＦＧＦＲ３ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｔ（４；１４）：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｙ３７３Ｃ，Ｋ６５０Ｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ Ｇ３８４Ｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１．２０（２７）：ｐ．３５５３−６２．
７．Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ｉｓ ａｎ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ，２００１．９７（３）：ｐ．７２９−３６．
８．Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｃｔｏｐｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ，２０００．９５（３）：ｐ．９９２−８．
９．Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＧＦＲ３ ｍｕｔａｎｔｓ ｓｉｇｎａｌ ｔｈｒｏｕｇｈ ＰＬＣｇａｍｍａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ，２００５．１０６（１）：ｐ．３２８−３７．
１０．Ｌｉ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｍｙｅｌｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ｉｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，２００１．９７（８）：ｐ．２４１３−９．
１１．Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔ（４；１４） ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ，２００４．１０３（９）：ｐ．３５２１−８．
１２．Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＨＩＲ−２５８，ａ ｎｏｖｅｌ，ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔ（４；１４） ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ，２００５．１０５（７）：ｐ．２９４１−８．
１３．Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＧＦＲ３ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＰＫＣ４１２ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５．２４（５６）：ｐ．８２５９−６７．
１４．Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，２００４．１２４（５）：ｐ．５９５−６０３．
１５．Ｇｒａｎｄ，Ｅ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＦＧＦＲ３ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＳＵ５４０２ ａｎｄ ＰＤ１７３０７４．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００４．１８（５）：ｐ．９６２−６．
１６．Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００５．１１（２ Ｐｔ １）：ｐ．４５９−６５．
１７．Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＧＦＲ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｉｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００７．２１３（１）：ｐ．９１−８．
１８．ｖａｎ Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ＦＧＦＲ３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｐａｐｉｌｌｏｍａ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００２．１９８（２）：ｐ．２４５−５１．
１９．Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｃ．Ｄ．Ｈｕｒｓｔ，ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｂｙ ｓｈＲＮＡ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｓ２４９Ｃ ｍｕｔａｎｔ ＦＧＦＲ３ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７．２６（４０）：ｐ．５８８９−９９．
２０．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００５．１１（１７）：ｐ．６２８０−９０．
２１．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，２００８．７（４）：ｐ．８６２−７３．
２２．Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｆａｂ ｌｉｂｒａｒｙ ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００３．２７８（４０）：ｐ．３８１９４−２０５．
２３．Ｂｒａｃｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＨＥＲ２−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＦｙｎｏｍＡｂ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，２０１４．１３（８）：ｐ．２０３０−９．
２４．Ｓｉｌａｃｃｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＯＶＡ３２２，ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｓｔａｇｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＮＦ／ＩＬ−１７Ａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ．ＭＡｂｓ，２０１６．８（１）：ｐ．１４１−９．
２５．Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄａｔａ ｏｆ ｃｈｙｍａｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｆｙｎ ｋｉｎａｓｅ ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ．ＭＡｂｓ，２０１２．４（４）：ｐ．４９７−５０８．
２６．Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ，Ｄ．，Ｍ．Ｋａｓｐａｒ，ａｎｄ Ｄ．Ｎｅｒｉ，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｆｙｎ ＳＨ３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００７．２８２（５）：ｐ．３１９６−２０４．
２７．Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ，Ｊ．，Ｄ．Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ，ａｎｄ Ｄ．Ｎｅｒｉ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｏｖａｌｅｎｔ ＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２００７．２０（２）：ｐ．５７−６８．

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【配列表】

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