特許 6840908 エフェクター機能が除去されたＩｇＧ１ Ｆｃ変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6840908

(24)【登録日】2021年2月22日

(45)【発行日】2021年3月10日

(54)【発明の名称】エフェクター機能が除去されたＩｇＧ１ Ｆｃ変異体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20210301BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210301BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210301BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210301BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210301BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/00ZNA

   C07K19/00

   C12N15/13

   C12N15/62 Z

   C12N15/63 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/395 M

   A61P35/00

【請求項の数】21

【全頁数】61

(21)【出願番号】特願2020-517827(P2020-517827)

(86)(22)【出願日】2018年10月1日

(86)【国際出願番号】EP2018076631

(87)【国際公開番号】WO2019068632

(87)【国際公開日】20190411

【審査請求日】2020年4月1日

(31)【優先権主張番号】17194368.1

(32)【優先日】2017年10月2日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】18168959.7

(32)【優先日】2018年4月24日

(33)【優先権主張国】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】506157570

【氏名又は名称】シラグ・ゲーエムベーハー・インターナショナル

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｌａｇ ＧＭＢＨ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ブラック，シモン，セバスティアン

(72)【発明者】

【氏名】エッティンガー−トーラー，イザベラ

(72)【発明者】

【氏名】ブラー，ファビアン

(72)【発明者】

【氏名】グラブロフスキー，ドラガン

(72)【発明者】

【氏名】ベルトシンガー，ジュリアン

(72)【発明者】

【氏名】ズムステグ，エィドリアン

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１６／０５０７２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１６／０８１６４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１３０８３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Lo, M. et al.，"Effector-attenuating Substitutions That Maintain Antibody Stability and Reduce Toxicity in Mice"，J. Biol. Chem.，２０１７年，Vol. 292，pp. 3900-3908

【文献】 GONG, Q. et al.，"Importance of cellular microenvironment and circulatory dynamics in B cell immunotherapy"，J. Immunol.，２００５年，Vol. 174，pp. 817-826

【文献】 Shields, R. L. et al.，"High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R"，J. Biol. Chem.，２００１年，Vol. 276，pp. 6591-6604

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＨ２ドメインを含み、且つその中で２６５位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸がプロリン（Ｐ）と異なる、組換え体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子であって、
前記分子がＦｃＲｎに対する結合を保持し、且つ前記分子が、２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子と比較して、Ｃ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する少なくとも２０倍の結合の低減を有し、且つ番号付けがＫａｂａｔのＥＵインデックスにより示される、
前記組換え体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子。

【請求項2】

前記分子が、２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子と比較して、Ｃ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγＲに対する少なくとも５０倍の結合の低減を有する、請求項１に記載の分子。

【請求項3】

少なくとも１つのＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂから選択される、請求項１又は２に記載の分子。

【請求項4】

ｉ．２６５位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
ｉｉ．２９７位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン（Ｑ）であり、且つ
ｉｉｉ．３２９位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、又はセリン（Ｓ）で置き換えられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子。

【請求項5】

Ｆｃドメインが、配列番号４３を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分子。

【請求項6】

前記分子が、抗体、Ｆｃ領域、Ｆｃ融合タンパク質、又はＦｙｎｏｍＡｂなどの抗体融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子。

【請求項7】

前記分子が、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、又は５８のいずれか１つによる配列を含むＦｃ領域を含み、２６５位のアミノ酸Ｄ、２９７位のＮ及び３２９位のＰが、他のアミノ酸により置き換えられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子をコードする組換え体ポリヌクレオチド。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項10】

請求項８に記載の組換え体ポリヌクレオチド又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項11】

配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＨ２ドメインを含み、且つその中でＫａｂａｔのＥＵインデックスにより示される２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸が、他のアミノ酸で置き換えられる組換え体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を作製する方法であって、
ａ．野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸を提供する工程、
ｂ．組換え体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸を得るために工程（ａ）において提供される前記核酸を改変する工程であって、２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸が、それぞれＤ、Ｎ及びＰ以外のアミノ酸で置き換えられる工程、及び
ｃ．宿主細胞において工程（ｂ）において得る前記核酸を発現させ、前記組換え体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を回収する工程を含み、
前記組換え体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子がＦｃＲｎに対する結合を保持し、且つ前記組換え体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子が、２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子と比較して、Ｃ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する少なくとも２０倍の結合の低減を有する、
前記方法。

【請求項12】

ａ．標的分子に結合することができる少なくとも１つの結合ドメイン；及び
ｂ． 配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであって、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる２６５位、２９７位及び３２９位のアミノ酸が、それぞれＤ、Ｎ、及びＰと異なるヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン
を含む組換え体ポリペプチドであって、
前記組換え体ポリペプチドがＦｃＲｎに対する結合を保持し、且つ
前記組換え体ポリペプチドが、著しいリンパ球活性化、補体依存性溶解、並びに／又は前記標的分子及び／若しくはその表面上に前記標的分子を発現する細胞の細胞媒介性破壊を誘発することなく前記標的分子に結合することができる、
前記組換え体ポリペプチド。

【請求項13】

前記少なくとも１つの結合ドメインが、抗体の結合部位、フィノマー、酵素、ホルモン、受容体の細胞外ドメイン、サイトカイン、免疫細胞表面抗原、リガンド、及び接着分子からなる群から選択される、請求項１２に記載の組換え体ポリペプチド。

【請求項14】

前記Ｆｃドメインが、配列番号４３を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１２又は１３に記載の組換え体ポリペプチド。

【請求項15】

前記結合ドメインが抗体の前記結合部位である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組換え体ポリペプチド。

【請求項16】

請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、請求項８に記載の組換え体ポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、又は請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組換え体ポリペプチド、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項17】

組換え体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を作製するための方法であって、宿主細胞中で請求項８に記載の組換え体ポリヌクレオチドを発現させること及び前記組換え体ポリペプチドを回収することを含む、前記方法。

【請求項18】

疾患又は障害を治療するために用いられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、請求項８に記載の組換え体ポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組換え体ポリペプチド、又は請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記疾患又は障害が癌である、請求項１８に記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、組換え体ポリヌクレオチド、ベクター、組換え体ポリペプチド又は医薬組成物。

【請求項20】

疾患又は障害を治療するための医薬品の製造のための請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、請求項８に記載の組換え体ポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組換え体ポリペプチド、又は請求項１６に記載の医薬組成物の使用。

【請求項21】

前記疾患又は障害が癌である、請求項２０に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書で提供される開示は、ＦｃＲｎ結合を保持するが、Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑに特異的に結合する能力を実質的に失うように変異されたヒト抗体ＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ領域）に関する。

【背景技術】

【0002】

あらゆる哺乳動物の血清、組織、又は体液に存在する糖タンパク質である免疫グロブリンは、外来抗原を認識する機能を有する。免疫グロブリンは、補体系の活性化を介するか又は細胞貪食、抗体依存性細胞障害、及びエフェクター細胞表面上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により誘発されるメディエーター放出における増強などのエフェクター機能の活性化を介する生体防御に、抗原に結合する抗体を通じて関与する。

【0003】

ヒト免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる５つの異なるクラスに分けられる。ＩｇＧはさらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる４つのサブクラスに分類され得る一方で、ＩｇＡはさらに、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２からなる２つのサブクラスに分類され得る。免疫グロブリンの基本構造は、２つの相同な軽鎖（Ｌ鎖）及び２つの相同な重鎖（Ｈ鎖）を含む。免疫グロブリンクラス及びサブクラスは、Ｈ鎖に応じて決定される。

【0004】

免疫グロブリンの異なる型は、異なる機能を有することが知られる。例えば、補体結合能は、ＩｇＭ＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２の順に高く、Ｆｃγ受容体Ｉに対する親和性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順に高い。さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４は、プロテインＡに結合できる。

【0005】

近年、多くのモノクローナル抗体が臨床試験にかけられており、医薬適用のための市場に出されている。これらのモノクローナル抗体の大部分は、ＩｇＧ１サブクラスに由来する。

【0006】

開始点としてＩｇＧ１を使用して、Ｆｃ受容体結合及びエフェクター機能が減少しているが、ＦｃＲｎ結合、長期間の安定性、及び低い免疫原性を保持するＦｃ含有分子を生成するための試みがなされている。これらの種類の分子は、例えば、より良好な安全性プロファイルを有する改善された抗体治療薬を提供し得る。

【0007】

ＩｇＧ抗体は、それらのＦａｂアームを介する抗原特異的結合を除いて、それらのＦｃγドメインを介してＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と結合することができるという意味で二機能性の分子である（Ｗｏｏｆ ＪＭ ａｎｄ ＤＲ Ｂｕｒｔｏｎ（２００４）．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ４（２）：８９−９９）。ＩｇＧに関して異なる親和性を有する、Ｆｃγに関する３種類の受容体ＦｃγＲＩ〜ＦｃγＲＩＩＩがある（Ｂｒｕｈｎｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｂｌｏｏｄ １１３（１６）：３７１６−３７２５）。ＦｃγＲは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのＦｃγ媒介性免疫エフェクター機能を媒介する種々の細胞型上で発現される。抗体Ｆｃγドメインはまた、補体因子Ｃ１ｑに結合し、それにより補体経路を活性化して、最終的に補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を引き起こし得る。ＦｃγＲ又はＣ１ｑによって媒介されるエフェクター機能は、いくつかの治療抗体の活性において役割を果たすと考えられる（Ｒｅｄｍａｎ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２ Ｐｔ Ａ）：２８−４５）。

【0008】

ＦｃγＲ発現免疫細胞を介する作用を誘導することに加えて、ＦｃγＲの結合は、抗体Ｆａｂにより結合される細胞膜抗原の高次のクラスタリング、又は架橋をもたらす抗体の高次クラスターを形成し、それにより下流シグナル伝達を誘発する（Ｓｔｅｗａｒｔ ＲＨ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２（２９））。例として、ＣＤ４０特異的抗体は、ＦｃγＲ依存的な様式においてＣＤ４０の下流シグナル伝達を活性化することが示されている（Ｗｈｉｔｅ ＡＬ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８７（４）：１７５４−１７６３）。

【0009】

多くの治療抗体の適用のために、強力なＦｃγ媒介性エフェクター機能を有することが望ましいが、ある種の適用は、エフェクター機能を必要としない作用様式に依存するか又はＦｃγ媒介性作用を誘導しない不活性抗体を必要とする。この理由のために、エフェクター機能が低減したＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４）又はＦｃγＲに対する親和性を低減するＦｃγ−ＦｃγＲ界面における変異を有する操作されたＦｃγ配列が、このような抗体において利用される。例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１などのＴ細胞抑制性受容体を遮断することによってＴ細胞をブーストする抗腫瘍抗体は、優先的に不活性であるが、それは、完全な能力のあるＦｃ領域が、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを介するＴ細胞の枯渇によって抗体の作用様式を相殺するためである（Ｓｔｅｗａｒｔ ＲＨ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２（２９））。したがって、ＦｃγＲに対する結合の低減又は抑制を有する抗体に関する広範な適用が存在する。

【0010】

本分野では、抗体Ｆｃγドメインにおける標的化変異の導入によってＦｃγＲに対する親和性が低減されたＦｃγを発見する技術的課題に対するいくつかの解決策が見出されている。Ｎｏｓｅ及びＷｉｇｚｅｌｌは、Ｎ２９７でのＮ結合糖を有しない抗体が、ＦｃγＲ発現細胞に結合せず、且つＡＤＣＣ活性を欠いたことを記載した（Ｎｏｓｅ Ｍ ａｎｄ Ｈ Ｗｉｇｚｅｌｌ（１９８３）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８０（２１）：６６３２−６６３６）。Ｔａｏ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、及びＢｏｌｔらは、Ｎ２９７位で部位特異的変異誘発を実施して、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに対する結合が低減されたアグリコシル化抗体をもたらした（Ｔａｏ ＭＨ ａｎｄ ＳＬ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８９）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４３（８）：２５９５−２６０１；Ｂｏｌｔ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３（２）：４０３−４１１）。いくつかの臨床ステージの抗体又はＦｃγ融合タンパク質は、Ｎ２９７で変異を有する（例えば、抗ＰＤＬ１ ｍＡｂアテゾリズマブ、抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ ＴＲＸ５１８、抗ＣＤ３ ｍＡｂオテリキシズマブ又はペプチド−Ｆｃγ融合タンパク質ロミプロスチム）（Ｓｔｒｏｈｌ ＷＲ（２００９）．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０（６）：６８５−６９１；Ｓｔｅｗａｒｔ ＲＨ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２（２９））。

【0011】

ＣＤ３特異的抗体は、ＦｃＲ依存性Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出を誘導する（Ｐａｒｒｅｎ ＰＷ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８（３）：６９５−７０１；Ｘｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００（１）：１６−２６）。ＦｃγにおいてＮ２９７Ａ変異を有するＣＤ３特異的ＩｇＧ１抗体は、Ｎ２９７ＡがＦｃγＲ発現細胞に対して結合が検出されないと記載されてきた事実にも関わらず（Ｂｏｌｔ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３（２）：４０３−４１１）、依然としてＴ細胞活性化を引き起こすことが観察された（国際公開第２０１２１４３５２４号パンフレット）。これらの観察は、ＣＤ３特異的抗体によるインビトロＴ細胞活性化アッセイが、残留性のＦｃγＲ結合に対して非常に敏感であることを示唆する。したがって、ＣＤ３抗体によるインビトロＴ細胞アッセイは、ＦｃγＲに対する結合親和性を有しないか又は最小限に有する操作されたＦｃγ配列を同定するための最適な機能的アッセイとなる。

【0012】

Ｃａｎｆｉｅｌｄ及びＭｏｒｒｉｓｏｎは、ＩｇＧのヒンジ領域が高親和性ＦｃγＲＩに対する結合に寄与することを記載した（Ｃａｎｆｉｅｌｄ ＳＭ ａｎｄ ＳＬ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３（６）：１４８３−１４９１）。Ｘｕらは、下方ヒンジにおける二重変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「Ａｌａ−Ａｌａ」、又は「ＬＡＬＡ」とも称される）を含有するヒト化抗ＣＤ３抗体ｈＯＫＴ３が、Ｃ１ｑ及びＦｃγＲ結合の低減を示して、インビトロでのＦｃγＲ媒介性Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出の抑制をもたらすことを示した（Ｘｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００（１）：１６−２６）。ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）又はテプリズマブと称されるこの抗体は、その後臨床試験において調査されたが、ここで、ＬＡＬＡ変異の導入は、有害なサイトカイン放出の発生の低減をもたらすことが見出された（Ｈｅｒｏｌｄ ＫＣ，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４（６）：１７６３−１７６９）。

【0013】

（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（９）：６５９１−６６０４）は、ＦｃγＲ結合に寄与する残基を同定するために抗体Ｆｃγ全体に対するアラニンスキャニング変異誘発法を実施した。その著者らは、Ｄ２６５の変異が全てのＦｃγ受容体に対する親和性を低減することを見出した。加えて、Ｐ３２９位での変異が、Ｆｃγ受容体に対する結合を低減することを示した。Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、リツキシマブ、キメラＩｇＧ１抗体のＣ１ｑ結合部位をマッピングし、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９又はＰ３３１での変異が、Ｃ１ｑに対する結合を低減することを見出した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４（８）：４１７８−４１８４）。Ｗｉｌｓｏｎらは、「ＤＡＮＡ」と称されるＤ２６５とＮ２９７のアラニンへの変異の組合せを記載した。これらの組み合わされた変異は、ＦｃγＲに対する結合を低減したことが主張されたが、マウスＦｃγＲＩＩＩに対する残留性の結合が検出された（Ｗｉｌｓｏｎ ＮＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １９（１）：１０１−１１３）。Ｇｏｎｇらは、「ＤＡＮＡ」変異が、補体活性化における部分的な低減を呈することを記載した（Ｇｏｎｇ Ｑ，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４（２）：８１７−８２６）。

【0014】

他の報告は、抗体のＦｃ部分におけるある種のアミノ酸の変異を記載したが（例えば、Ｄ２６５Ｎ及びＤ２６５Ｅ：Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１−６６０４；Ｎ２９７Ｑ：Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：８８８２−８８９０；Ｎ２９７Ｄ：Ｓａｚｉｎｓｋｙ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５：２０１６７−２０１７２，Ｋｅｌｔｏｎ Ｗ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２１：１６０３−１６０９；Ｐ３２９Ｇ：Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２９：４５７−４６６）、これらの全ての研究がＦｃ機能性の障害に関連しているわけではなかった。

【0015】

ＦｃγＲに対する結合を低減するいくつかのＦｃγ変異が記載されたが、上記のもののうちでＦｃγＲ結合及びＣ１ｑ結合を完全に抑制するものはなかった。Ｓｈｉｅｌｄｓらは、上記の「ＬＡＬＡ」又は「ＤＡＮＡ」の組合せ変異の根底にもある発想である個々の変異を組み合わせることによって（Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（９）：６５９１−６６０４）、ＦｃγＲ結合をさらに低減する可能性について記載した。

【0016】

しかしながら、最適にＦｃγＲ結合の低減をもたらし、且つ重要なこととして、製造性、薬物動態、又は抗原性などの医薬製品にとって重要な他の重要な特性に負の影響を及ぼさない変異の組合せを同定するという課題が残っている。

【0017】

例えば、国際公開第２０１４／１０８４８３号パンフレットは、低減したＦｃγＲ結合を有する変異の組合せを含有するいくつかのＦｃγ配列を記載している。Ｆｃγ変異抗体の大部分は、マウスにおいて対応する非改変ＩｇＧ１抗体より速いクリアランスを有した。したがって、Ｆｃγドメインにおいて変異を導入することは、薬物動態特性に対して潜在的に影響を及ぼすことが知られる。

【0018】

Ｆｃγドメインはまた、新生児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎと相互作用する（Ｋｕｏ ＴＴ ａｎｄ ＶＧ Ａｖｅｓｏｎ（２０１１）．ＭＡｂｓ ３（５）：４２２−４３０）。この相互作用は、抗体再利用、リソソーム分解からの救出、及びしたがってＩｇＧ１抗体の長い半減期に関与する。ＦｃＲｎ結合部位は、Ｆｃγ１のＣＨ２−ＣＨ３界面に位置する（Ｍａｒｔｉｎ ＷＬ，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７（４）：８６７−８７７）。したがって、ＣＨ２ドメインにおいて変異を有する新たに設計されたＦｃγドメインは、ＦｃＲｎ親和性を減少させ、及びしたがって、薬物動態特性を減少させることができた（Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（９）：６５９１−６６０４）。

【0019】

したがって、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに対する結合親和性を有しないか又は最小限に有するが薬物動態プロファイル又は製造性などの医薬品にとって重要な他の特性を保持する、新たに設計されたＦｃγ配列が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0020】

本明細書では、Ｆｃ領域を含むものなど、抗体又は抗体様治療薬の設計に有用な改変免疫グロブリン定常ドメインを含む組成物が提供される。また、提供される改変定常ドメインをコードできる関連するポリヌクレオチド、提供される改変定常ドメインを発現する細胞、及び関連するベクターが記載される。加えて、提供される改変定常ドメインを使用する方法が記載される。

【0021】

記載される組成物は、ＦｃγＲ結合能の減少を呈するがＦｃＲｎ結合が保たれるＩｇＧ１ Ｆｃ変異体である。これらのＩｇＧ Ｆｃ変異体は、可溶性又は細胞表面抗原を標的化する治療薬を可能にする一方で、免疫エフェクター細胞のＦｃ関連結合及び補体媒介性細胞障害を最小化する。一態様では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．の場合のようなＥＵインデックスにより示される２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられるＣＨ２ドメインを含む。

【0022】

一実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子の２６５位のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン酸（Ｅ）で置き換えられ、２９７位のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン（Ｑ）で置き換えられ、且つ３２９位のアミノ酸は、アラニン、グリシン（Ｇ）、又はセリン（Ｓ）で置き換えられる。

【0023】

特定の実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体組成物は、適応症において使用され、治療抗体（又はＦｃ融合体）の半減期の維持は、ＦｃＲｎとの相互作用により保たれるが、免疫細胞と関連するＣ１ｑ及びＦｃγＲの結合及び／又は活性化並びにｉ）抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、ｉｉ）補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、ｉｉｉ）抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、ｉｖ）ＦｃγＲ媒介性細胞活性化、ｖ）ＦｃγＲ媒介性血小板活性化／枯渇、及び／又はｖｉ）結合標的のＦｃγＲ媒介性架橋などのエフェクター機能に由来する望ましくない作用が、最小化又は排除される。

【0024】

一態様では、ＩｇＧ１ Ｆｃ変異は、治療抗体又は多価結合剤、癌、神経障害、Ｂ細胞若しくはＴ細胞活性化に関連するものなどの免疫系障害に関与する細胞上、若しくは線維芽細胞若しくは幹細胞などの組織修復若しくは治癒に関与する細胞上の標的化リガンドなどの結合剤のＦｃ融合体に組み込まれる。

【0025】

特定の実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体は、医薬組成物中に含まれる。特定の実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体は、薬学的に活性な分子の一部である。ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体又は活性ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体を含む分子を含む医薬組成物は、疾患又は障害、例えば、癌の治療に有用である。

【0026】

本明細書ではまた、野生型Ｆｃドメインを有するＦｃ含有分子と比較してＣ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対して親和性が低減した組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子であって、残基の番号付けがＫａｂａｔ ｅｔ ａｌの場合のようなＥＵインデックスにより示されるとおりであるアミノ酸２６５位、２９７位、及び３２９位で変異を含む組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子が提供される。

【0027】

本明細書ではさらに、（ａ）少なくとも１つの標的分子に結合できる１つ以上の結合ドメイン；及び（ｂ）アミノ酸２６５位、２９７位、及び３２９位で変異を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む組換え体ポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、補体依存性溶解、標的分子の細胞媒介性破壊、及び／又は結合標的のＦｃγＲ媒介性架橋などの重大なＦｃγ媒介性作用を誘発することなく標的分子に結合できる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】ｍＡｂ１ ＩｇＧ１及びｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１のサイズ排除クロマトグラフィープロファイル。

【図2】ＣＤ３^＋ジャーカット細胞に対する変異Ｆｃを有する抗ＣＤ３抗体ｍＡｂ１変異体の結合。

【図3A】図３：Ａ）ＣＤ６９表面染色によって決定された変異Ｆｃγ１を有するｍＡｂ１変異体によるヒトＰＢＭＣにおけるリンパ球活性化の誘導。点線は、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを含有する陽性対照ウェルにおいて得られたＣＤ６９陽性細胞のパーセンテージを表す。Ｂ）ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡによって決定された変異Ｆｃγ１を有するｍＡｂ１変異体によるヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン放出の誘導。点線は、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを含有する陽性対照ウェルにおいて得られたＩＦＮγのレベルを表す。

【図3B】（上記のとおり。）

【図4A】図４：Ａ）ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイの略図。Ｂ）ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイによって分析された、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対するＦｃ変異ｍＡｂ１変異体の結合。Ｃ、Ｄ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって分析された、ヒトＦｃγＲＩ（Ｃ）及びヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｄ）に対するＦｃ変異ｍＡｂ１変異体の結合。

【図4B】（上記のとおり。）

【図4C】（上記のとおり。）

【図4D】（上記のとおり。）

【図5】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイによって分析された、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対するＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１形式における各種抗体の結合。

【図6】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイによって分析された、ヒトＦｃγＲＩに対するＤ２６５位、Ｎ２９７位及びＰ３２９位で各種置換を有するｍＡｂ１の結合。

【図7】表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって分析された、ヒトＣ１ｑに対するｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１の結合。

【図8】表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって分析された、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対するｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１の結合。

【図9】それぞれ１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１又はｍＡｂ１ ＩｇＧ１の静脈内投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体血漿濃度。データは、平均±標準偏差として示される（ｎ＝５）。

【図10】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｆｃ受容体競合結合アッセイによって分析された、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対する各種ＣＤ３／ＣＤ３３ ＦｙｎｏｍＡｂの結合。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本出願がより完全に理解され得るように、いくつかの定義を下に記載する。このような定義は、文法的同義語を包含するものとする。

【0030】

本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、参照により本明細書に明示的に組み込まれるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合のようなＥＵインデックスに従う免疫グロブリン重鎖のものである。本明細書で「Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。この番号付けは、当業者によく知られており、当該分野において使用されることが多い。

【0031】

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味する。

【0032】

本明細書で使用する場合、「アミノ酸」は、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの１個又は特定の限定された位置で存在し得る任意の非天然アナログを意味する。

【0033】

「２６５位、２９７位及び３２９位で置換（又は「変異」、若しくは「置き換え」）を有するＦｃ含有分子」は、２６５位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸がプロリン（Ｐ）と異なる分子を意味し、Ｆｃ領域における全ての番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．におけるＥＵインデックスに従う。

【0034】

本明細書の「アミノ酸変化」は、ポリペプチド配列における置換、挿入、及び／又は欠失などのアミノ酸変異を含む。本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ポリペプチド配列における特定の位置のアミノ酸の別のアミノ酸による置き換えを意味する。例えば、置換Ｐ３２９Ａは、この場合、変異体ポリペプチドのＦｃ変異体を指し、ここで３２９位のプロリンは、アラニンで置き換えられる。

【0035】

アミノ酸変異の組合せの場合、好ましい形式は、次の：Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ／Ｐ３２９Ａである。それは、親ポリペプチドと比較して変異体のＦｃ領域において３個のアミノ酸変異：２６５位のもの（アラニン（Ａ）で置き換えられたアスパラギン酸（Ｄ））、２９７位のもの（アラニンで置き換えられたアスパラギン（Ｎ））、及び３２９位のもの（アラニンで置き換えられたプロリン（Ｐ））が存在することを意味する。

【0036】

用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用される。「抗体」は、（ｉ）Ｆｃ領域及び（ｉｉ）免疫グロブリンの可変領域に由来する結合ポリペプチドドメインを少なくとも含む任意のポリペプチドを指す。したがって、抗体としては、全長免疫グロブリン、多重特異性抗体、少なくとも１つの可変領域を含むＦｃ融合タンパク質、合成抗体（本明細書で「抗体ミメティック」と称される場合がある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト型抗体、ヘテロ二量体抗体、抗体融合タンパク質、抗体コンジュゲート及びそれぞれ各々の断片が挙げられるが、これらに限定されない。下により詳細に記載されるとおりの「ＦｙｎｏｍＡｂ」はまた、抗体を含む。

【0037】

本明細書で使用する場合、「全長抗体」又は「免疫グロブリン」は、可変領域及び定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。「全長抗体」は、モノクローナル全長抗体、野生型全長抗体、キメラ全長抗体、ヒト化全長抗体、完全ヒト全長抗体を包含し、このリストは限定的なものではない。

【0038】

ヒト及びマウスを含む大部分の哺乳動物において、全長抗体の構造は一般に四量体である。前記四量体は、各対が１つの「軽」鎖（通常、約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（通常、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する２つの同一のポリペプチド鎖の対で構成される。一部の哺乳動物、例えば、ラクダ及びラマでは、全長抗体は、各重鎖がＦｃ領域に連結された可変ドメインを含む２つの重鎖のみからなり得る。

【0039】

各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与し且ついわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。

【0040】

各鎖のカルボキシ末端部分は、通常主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。

【0041】

ヒト免疫グロブリンの場合、軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンに分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。

【0042】

本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、且つヒト免疫グロブリンライブラリー又は１つ以上のヒト免疫グロブリンに関して遺伝子導入し且つ内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。

【0043】

本明細書で使用する場合、「ＩｇＧ」は、認識される免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトにおいて、ＩｇＧは、サブクラス又はアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスにおいて、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。全長ＩｇＧは、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの軽鎖及び１つの重鎖を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬ及びＣＬを含み、且つ各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１（ＣＨ１とも呼ばれる）、Ｃγ２（ＣＨ２とも呼ばれる）、及びＣγ３（ＣＨ３とも呼ばれる）を含む。ヒトＩｇＧ１の文脈において、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスに従って、「ＣＨ１」は１１８〜２１５位を指し、ＣＨ２ドメインは２３１〜３４０位を指し、且つＣＨ３ドメインは３４１〜４４７位を指す。ＩｇＧ１はまた、ＩｇＧ１の場合において２１６〜２３０位を指すヒンジドメインを含む。

【0044】

本明細書で使用する場合、「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く全長免疫グロブリンの定常領域を意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、且つこれらのドメインの可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭに関して、Ｆｃは、Ｊ鎖を含んでもよい。ＩｇＧに関して、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ１とＣＨ２の間の下方ヒンジ領域を含む。ＩｇＧ１のＦｃ領域は、アミノ酸Ｃ２２６からカルボキシ末端のドメインを含み、番号付けは、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスに従う。例えば、「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」は、限定されないが、配列番号４３及び５２〜５８（これらの各々は、ヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列の例である）のうちのいずれか１つを含むか、又は配列番号４３若しくは配列番号５２〜５８のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一な配列を含むＩｇＧ１のＦｃ領域を含み得る。好ましい実施形態では、２２６位（Ｋａｂａｔ番号付け）以降の本発明によるＦｃ領域は、配列番号４３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一な配列を含み、２６５位のアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸はアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸はプロリン（Ｐ）と異なる。他のＩｇＧサブクラスに関する類似のドメインは、前記ＩｇＧサブクラスの重鎖又は重鎖断片とヒトＩｇＧ１のそれとのアミノ酸配列アラインメントから決定され得る。

【0045】

本明細書で使用する場合、「ＣＨ２ドメイン」は、好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にあり、且つ配列番号６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。本明細書で記載されるとおりのヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の「ＣＨ３ドメイン」は、配列番号６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。

【0046】

本明細書で使用する場合、「Ｆｃ含有分子」は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃ含有分子としては、抗体、Ｆｃ融合体、単離Ｆｃ、Ｆｃコンジュゲート、抗体融合体、ＦｙｎｏｍＡｂなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0047】

本明細書の「野生型」又は「ＷＴ」は、天然に見出される、すなわち、対立遺伝子の変異を含んで天然に存在するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、変異誘発などの分子生物学的手法によって意図的に改変されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。例えば、「野生型Ｆｃ領域」は、限定されないが、配列番号４３の配列を含むＩｇＧ１のＦｃ領域を含んでもよく、これはヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列、又は配列番号５２〜５８の配列のいずれか１つを含むＩｇＧのＦｃ領域の例であり、これらの各々はまた、ヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列の例でもある。

【0048】

用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、Ｆｃ領域（例えば、抗体のＦｃ領域）に結合する受容体を記載するために使用される。

【0049】

用語「Ｆｃガンマ受容体」、「Ｆｃγ受容体」又は「ＦｃγＲ」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合するヒト受容体を指す。本明細書で使用する場合、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）サブクラスであって、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的にスプライシングされた形態を含むサブクラスを含む。

【0050】

これらのＦｃγＲはまた、それらが免疫機能を誘発するか又は抑制するため、活性化受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ／ｂ）又は抑制性受容体（ＦｃγＲＩＩｂ）のいずれかとして定義される。

【0051】

ＦｃγＲＩファミリーは、３つの遺伝子（ＦＣＧＲＩＡ、ＦＣＧＲＩＢ及びＦＣＧＲＩＣ）から構成されるが、ＦＣＧＲＩＡの産物のみが全長表面受容体として同定されている。前記産物、すなわちＦｃγＲＩは、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、また活性化好中球によって発現される。

【0052】

ＦｃγＲＩＩファミリーは、ＦｃγＲＩＩａ、ＦＣγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩｃタンパク質をコードする３つの遺伝子（ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ及びＦＣＧＲ２Ｃ）から構成される。ＦｃγＲＩＩａは、単球、ある種の樹状細胞及び好中球上で発現される。ＦｃγＲＩＩｃは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される。ＦｃγＲＩＩｂは、広く発現されるＦｃγＲである。ＦｃγＲＩＩｂは、ＮＫ細胞及びＴ細胞を除く全ての白血球上に実質的に存在する。

【0053】

ＦｃγＲＩＩＩファミリーは、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂをコードする２つの遺伝子ＦＣＧＲ３Ａ及びＦＣＧＲ３Ｂから構成される。ＦｃγＲＩＩＩａタンパク質は、単球、組織特異的マクロファージ、樹状細胞、γδＴ細胞、及びナチュラルキラー細胞上の幕貫通タンパク質として発現される。ＦｃγＲＩＩＩｂは、好中球及び好塩基球の表面上で発現されるＧＰＩアンカー型受容体である。

【0054】

ＦｃγＲＩＩａをコードする遺伝子の２つの対立遺伝子は、１３１位で異なる２つの変異体（低応答物ＦｃγＲＩＩａＲ１３１及び高応答物ＦｃγＲＩＩａＨ１３１）を生成する。同様に、ＦｃγＲＩＩＩａをコードする遺伝子の２つの対立遺伝子は、１５８位で異なる２つの変異体（低応答物ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８及び高応答物ＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８）を生成する。

【0055】

顕著には、抗体依存性細胞障害の非常に重要なメディエーターであると考えられるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｃのみを発現し、他のＦｃγＲ、特に、抑制性ＦｃγＲＩＩｂを発現しない。

【0056】

各ＦｃγＲタンパク質は、ＩｇＧサブクラスに対する異なるリガンド結合の優先度及びＩｇＧサブクラスに対する異なる親和性を有する。

【0057】

活性化ＦｃγＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による貪食、呼吸性バースト及びサイトカイン産生（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）並びに好中球及びＮＫ細胞による脱顆粒などの種々の免疫応答を誘発する。活性化ＦｃγＲはまた、免疫複合体のクリアランスにおいて重要な役割を果たす。他方では、抑制性受容体ＦｃγＲＩＩｂは、Ｂ細胞恒常性における非常に重要な調節要素である。それは、細胞活性化の閾値及び程度を制御する。

【0058】

Ｆｃガンマ受容体及びそれらの機能は、Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，８，３４−４７において概説される。

【0059】

本明細書で使用する場合、「Ｃ１ｑ」は、およそ４６０，０００の分子量を有し、６つのコラーゲン性の「軸」が６つの球状ヘッド領域に連結されているチューリップの花束に例えられる構造を有する六価分子である。Ｃ１ｑと２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒ及びＣ１ｓは、補体カスケード経路の第１成分である複合体Ｃ１を形成する。

【0060】

Ｃ１ｑ及びその機能は、例えば、Kishore et al., Immunopharmacology, 2000, 49:159-170及びSjoberg et al., Trends Immunol. 2009 30(2):83-90において概説される。

【0061】

本明細書で使用する場合、「ＦｃＲｎ」又は「新生児Ｆｃ受容体」は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、且つＦＣＲＮ遺伝子によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質を意味する。当該技術分野で知られるとおり、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる場合が多い２つのポリペプチドを含む。軽鎖はベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦＣＲＮ遺伝子によってコードされる。ＦｃＲｎ又はＦｃＲｎタンパク質は、α−鎖のベータ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。ヒトにおいて、ＦｃＲｎをコードする遺伝子は、ＦＣＧＲＴと呼ばれる。ＦｃＲｎは、母親から胎児への受動液性免疫の移送に関与し、またＩｇＧのクリアランスの制御にも関与する。

【0062】

ＦｃＲｎ及びその機能は、例えば、Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，７，７１５−７２５において概説される。

【0063】

本明細書で使用する場合、分子は、それが、ＫＤがｐＨ６．０で測定される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定される際に５倍より低い、好ましくは４倍より低い、より好ましくは３倍より低い、さらにより好ましくは２倍より低い、アミノ酸置換を有しない親Ｆｃ含有分子（例えば、野生型ＩｇＧ１）のＫＤであるＫＤでＦｃＲｎに結合するとき、「ＦｃＲｎに対する結合を保持する」。特定の実施形態では、ＫＤは、親分子のＫＤの約１〜２倍、例えば、約１．５倍、又は親分子のＫＤとほぼ同じ（すなわち、１倍）であり、また特定の実施形態では、ＫＤはまた、親分子のＫＤより低い場合もある。

【0064】

「結合の低減」は、アミノ酸置換を有しない親Ｆｃ含有分子の結合と比較したとき、例えばＣ１ｑ及び／又はＦｃγＲ受容体に対する、本明細書に記載されるＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸置換を有する本発明のＦｃ含有分子の結合の低減を指す。「結合の低減」は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、又は少なくとも約１００倍の結合の低減であり得る。Ｆｃ含有分子の結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含むがこれに限定されない当該技術分野で知られる種々の手法を用いてアッセイされ得る。ＳＰＲ測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）機器を用いて実施され得る。実際に、特定のＦｃγＲに対して「結合の低減」を呈するＦｃ含有分子は、特定のＦｃγＲによって媒介されるエフェクター機能を著しく低減又は抑制したＦｃ含有分子を指す。

【0065】

本明細書で使用する場合、「組換え体」は、組換え手段によって作製、発現、創出又は単離される抗体及び他のタンパク質を含む。

【0066】

「ベクター」は、生物システム内で複製することができ、且つそのようなシステム間で移動できるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは通常、生物システムにおいてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するために機能する複製開始点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含有する。このような生物システムの例としては、ベクターを複製できる生物学的構成要素を利用する細胞、ウイルス、動物、植物、及び再構成された生物システムを挙げてもよい。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってもよい。

【0067】

「ポリヌクレオチド」は、糖リン酸骨格又は他の同等の共有結合性の化学によって共有結合されたヌクレオチドの鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡがポリヌクレオチドの典型的な例である。

【0068】

Ｃ１ｑ及びＦｃγＲに対する結合が低減したＦｃ変異体
本発明は、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスに従うＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ）の２６５位、２９７位、及び３２９位における組み合わされた置換の最初の実証である。複数の残基置換の特異的な選択は予想外に、抗体操作における使用及び融合ポリペプチドとしての使用のための機能的Ｆｃドメイン並びに測定可能なエフェクター機能を欠く治療薬の実体をもたらす可能性を提供した。

【0069】

したがって、本発明は、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される２６５位のアミノ酸Ｄ、２９７位のアミノ酸Ｎ、及び３２９位のアミノ酸Ｐが他のアミノ酸により置き換えられるＣＨ２ドメインを含む、組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を提供する。

【0070】

好ましいＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子としては、２６５位、２９７位及び３２９位でアミノ酸置換を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。下で述べられるとおり、このようなポリペプチドは、Ｆｃ領域内で１つ以上の追加の欠失、付加、又は置換を有し得る。したがって、２６５位でのアミノ酸置換（すなわち、この位置でＤとは異なるアミノ酸を有する）、２９７位でのアミノ酸置換（すなわち、この位置でＮとは異なるアミノ酸を有する）及び３２９位でのアミノ酸置換（すなわち、この位置でＰとは異なるアミノ酸を有する）を有するＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は本発明の範囲内であり、同時に２２６位（Ｋａｂａｔ番号付け）以降のＦｃ領域は、配列番号４３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一である。

【0071】

用語「配列同一性のパーセント（％）」又は「％同一性」は、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較して、２つ以上の整列させたアミノ酸配列の同一のアミノ酸の一致する（「ヒットする」）数を指す。言い換えると、配列が当該技術分野において既知である配列比較アルゴリズムを使用して測定される際に最大限の一致に対して比較され整列させる場合、又は手動で整列させ視覚的に検証される場合、アラインメントを使用して、２つ以上の配列について、同一のものである（例えば、９０％、９５％、９７％又は９８％の同一性）アミノ酸残基の百分率が決定されてもよい。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加又は欠失によって異なってもよい。タンパク質配列を整列させるための好適なプログラムは、当業者に知られている。タンパク質配列のパーセント配列同一性は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、又は例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴなどのプログラムにより決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。

【0072】

例えば、アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／又は類似性は、当該術分野で知られる標準的な技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５により記載されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを使用することにより、又は目視により決定され得る。特定の実施形態では、同一性のパーセントは、以下のパラメータに基づきＦａｓｔＤＢによって算出される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；及び結合ペナルティが３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。

【0073】

有用なアルゴリズムの別の例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ法によるペアワイズアラインメントを使用して関連配列群から多重配列アラインメントを生成する。これにより、アラインメントの生成に使用されたクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトのギャップ加重が３．００、デフォルトのギャップ長加重が０．１０であり、加重エンドギャップを含む。

【0074】

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７において記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０から入手したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用しており、その大部分がデフォルト値に設定される。

【0075】

その他の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されたギャップ付きＢＬＡＳＴである。

【0076】

多置換ＩｇＧ１変異体は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイ及びＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって評価されるヒトＦｃＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃＲｎ）に対するそれらの相対的な親和性に基づいて選択された。これらの変異体はさらに、ＰＢＭＣによりサイトカイン放出を誘導するそれらの能力に関して適切な細胞系において試験され、且つ分類された。本明細書で提供される実験データのセットにおいて、ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子と比較された。いくつかのインビトロでのバイオアッセイにおけるこれらの変異体のさらなる分析は、軽微から検出限界以下のレベルの活性及び著しく除去されたＦｃγＲに対する結合親和性を実証した。これらの選別に基づいて、組み合わされた３つ全てのアミノ酸２６５位、２９７位及び３２９位での置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ変異体は、驚くべきことに、ＦｃγＲに対して親和性がないか又は最小の検出可能な親和性を有することが同定され、且つ種々の前述のエフェクター／免疫賦活性バイオアッセイにおける活性を大部分又は完全に欠く。本発明のＩｇＧ１ Ｆｃ変異体は、ＦｃγＲに結合するか、エフェクター機能を媒介するか、又はＦｃ媒介性サイトカイン放出を保証する能力がないか又はその最小の能力を有する点で実際に「サイレンシングされた」Ｆｃと考えられ得る。

【0077】

本発明に基づいて、アミノ酸２６５位、２９７位及び３２９位での置換は、他のアミノ酸変異と任意選択により組み合わされ得るか、又はその置換は、本明細書で教示されるとおりのエフェクター機能の類似の又は選択的なサイレンシングを達成するために別のＩｇＧアイソタイプにおいて使用され、且つ当該技術分野で知られるものと組み合わされ得る。２６５位、２９７位及び３２９位での変異のこの組合せは、驚くべきことに、各々が最小の残留性のＦｃγＲ相互作用が望まれる臨床ステージの治療抗体／Ｆｃ含有タンパク質において使用されてきた以前に記載されたＦｃ変異Ｎ２９７Ａ、又はＦｃ二重変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａと比較して著しく向上したサイレンシングをもたらした（Ｈｅｒｏｌｄ ＫＣ，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４（６）：１７６３−１７６９）。

【0078】

本発明によるＤ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９三重変異体は、その野生型対応物と比較して第１補体成分Ｃ１ｑに対する結合の低減を呈する。言い換えると、Ｃ１ｑに対する変異体の親和性は、野生型のものより低い。

【0079】

本発明によるＤ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９三重変異体はまた、その親ポリペプチドのものより低い少なくとも１つのＦｃγ受容体に対する親和性を呈する。本明細書で使用する場合、Ｆｃγ受容体としては、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ受容体が挙げられる。好ましくは、少なくとも１つのＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａからなる群から選択される。

【0080】

Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９三重変異体は、その野生型対応物と比較してＣ１ｑとＦｃγ受容体の両方に対する結合の低減を呈する。

【0081】

特定の実施形態では、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、その野生型対応物と比較してＣ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の低減を呈する。

【0082】

Ｃ１ｑ又はＦｃ受容体のいずれか１つに対する結合は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの当該先行技術分野のよく知られた方法によって評価され得る。

【0083】

例えば、目的のタンパク質（Ｃ１ｑ又はＦｃγＲなど）に対する本発明の変異体の結合強度は、実施例４において記載されるとおりのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイによって得られるそれらの特定のＩＣ_５０値の比を計算することによって、その野生型対応物のものと比較され得る。ハイスループットなスクリーニングにおいて使用されるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）は、結合などの分子現象の検出を可能にするホモジニアスアッセイ技術である。コーティングされた「ドナー」及び「アクセプター」ビーズがこのアッセイ技術の基盤である。ビーズ系アッセイとして、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）は、近接しているビーズの相互作用を通して機能して、非常に増幅されたシグナルを生成するように作用する化学反応のカスケードをもたらす。直接的又は間接的、例えば、競合的結合測定は、タンパク質間の相対的な親和性及び結合力を評価するために適用され得る。

【0084】

代替として、目的のタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγＲ）に対する変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子及びその野生型対応物の結合は、適切なＥＬＩＳＡアッセイによるＥＣ_５０の測定を通して比較され得る。ＥＣ_５０は、変異体の濃度の対数に対する結合された目的のタンパク質のパーセンテージに関する曲線の５０％の飽和を表すシグナルをもたらす変異体の濃度を指す。一般的に、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、そのＥＣ_５０が、その野生型対応物のそれより少なくとも１．５倍高い場合、その野生型対応物と比較して、目的のタンパク質（Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγＲなど）に対する結合の低減を示すと考えられる。

【0085】

目的のタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγＲ）に対する変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子の結合親和性はまた、解離定数（Ｋｄ）の測定を通してＳＰＲにより評価され得る。一般的に、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、そのＫｄが、その親ポリペプチドのそれより少なくとも１．５倍高い場合、その野生型対応物と比較して、目的のタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγＲ）に対する結合の低減を示すと考えられる。

【0086】

Ｃ１ｑ又はＦｃγＲに対する変異体の親和性は、非常に弱いためＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイによる特定のシグナル及びＳＰＲによるＫｄ又はＥＬＩＳＡアッセイによるＥＣ_５０でさえ、その結合シグナルがバックグラウンドノイズ中にあるか又は検出の閾値の下であるため正確に決定できない。そのような場合、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、Ｃ１ｑ及び／又は対応するＦｃγＲに結合していないと考えられる。

【0087】

例えば、本発明による三重変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は少なくとも１つのＦｃγＲに結合しない場合があり、且つＣ１ｑに対する結合の低減を示すか又はそれに対する結合を示さない。そのような変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、本出願の実施例において明確に示される。

【0088】

いくつかの実施形態では、本発明の変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体から選択される少なくとも１つのタンパク質に結合しない。

【0089】

本出願人は、Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９での変異の導入が、Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体に対する結合を著しく減少させるのに十分であることを示した。言い換えると、Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９以外での変異は、Ｃ１ｑ及び／又はＦｃγ受容体に対する適切な結合の低減を有する変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を得るために、ＩｇＧ１野生型対応物のＩｇＧ１ Ｆｃ領域内に導入される必要がない。それにもかかわらず、例えば、分子の他の機能性を変更するために、所望される場合には本発明のＦｃ含有分子に対してさらなる変異を加えることが任意選択により可能であろう。

【0090】

いかなる理論によっても束縛されることなく、本出願人は、本発明によってもたらされるアミノ酸置換がＩｇＧ１ Ｆｃ領域における主要な構造的再編成を著しく引き起こすことはなく、その結果、いくつかの場合において、Ｃ１ｑ及びＦｃγＲに対する結合によって媒介されない他の機能が親ポリペプチドのものと比較して著しく変更されないと考えている。顕著には、本出願人は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域における位置Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９での置換変異の導入が、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対するそれらの親和性を著しく減少させないことを示した。例えば、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ及びＰ３２９ＡのＩｇＧ１ Ｆｃ置換（ＤＡＮＡＰＡ）を含むｍＡｂ１に関する解離定数、Ｋ_Ｄは５００ｎＭであり、その野生型対応物に関しては４７０ｎＭである（実施例８を参照のこと）。言い換えると、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子及び本発明による変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、ＦｃＲｎに対して近い結合特性を示す。

【0091】

本明細書で上に言及されるとおり、野生型のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧの野生型Ｆｃ領域、その断片及び変異体からなる群から選択され得る。

【0092】

本明細書で上に示されるとおり、本発明のＦｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃにおける少なくとも３つのアミノ酸のアミノ酸置換を含み得る。注意のために、野生型Ｆｃ領域としては、配列番号４３を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が挙げられるが、これに限定されない。ヒトＦｃ領域の対立遺伝子変異体が知られており、本発明による変異の組合せを導入するための親分子として使用することもできる。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃの対立遺伝子変異体は、３５６位（グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））、及び／又は３５８位（メチオニン（Ｍ）又はロイシン（Ｌ））及び／又は４３１位（アラニン（Ａ）又はグリシン（Ｇ））で互いに異なる。対立遺伝子変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体及び非天然の対立遺伝子変異体を含む。非天然の対立遺伝子変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体において発生するが、天然に見出されない組合せにおいて発生する残基を含有する。Ｊｅｆｆｅｒｉｓらは、当業者が天然に存在し且つ非天然のＦｃ配列の対立遺伝子変異体を導き出すことを可能にするヒトＩｇＧ対立遺伝子変異体に対する概要を提供する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ Ｒ ａｎｄ Ｍ−Ｐ Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）ｍＡｂｓ １：１−７）。特定の実施形態では、本発明による変異の組合せ（すなわち、Ｋａｂａｔの番号付けによる２６５位、２９７位及び３２９位での変異）の導入のための親分子は、したがって、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、及び５８からなる群から選択されるヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列を含む分子である。したがって、特定の実施形態における本発明は、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、及び５８のいずれか１つによるアミノ酸配列を含む組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有ポリペプチドを提供し、これらは、（ｉ）２６５位のアミノ酸Ｄが別のアミノ酸により置き換えられており、（ｉｉ）２９７位のアミノ酸Ｎが別のアミノ酸により置き換えられており、且つ（ｉｉｉ）３２９位のアミノ酸Ｐが別のアミノ酸により置き換えられていることを特徴とし、この番号付けは、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される。

【0093】

野生型又は親Ｆｃ領域と比較した本発明によるＦｃ領域は、２６５位、２９７位及び３２９位のアミノ酸残基がそれぞれ、Ｄ、Ｎ及びＰとは異なるような変異の組合せを有し、番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．におけるＥＵインデックスに従う。特定の実施形態では、２６５位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｎ又はＥである。特定の実施形態では、２９７位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｄ又はＱである。特定の実施形態では、３２９位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ又はＳである。当業者は、他のアミノ酸がこれらの位置で置換されてもよく（例えば、２６５位でＲ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、又はＶ；２９７位でＲ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、又はＶ；３２９位でＲ、Ｃ、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、又はＶ）、２６５位、２９７位及び３２９位で指定されたアミノ酸を有する得られたＦｃ変異体を、Ｆｃ受容体及びＣ１ｑに対する結合において本明細書の実用的な実施例において例示される実施形態と実質的に同じ特性を有することに関して通例の方法によって試験することができ、且つそのような変異体が本発明に含まれることを理解することになる。

【0094】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子のアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｐ３２９Ａを含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子のアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｄ２６５Ｎ、Ｎ２９７Ｄ、Ｐ３２９Ｇを含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子のアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｄ２６５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ３２９Ｓを含む。

【0097】

特定の実施形態では、変異体が野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子と比較してタンパク質Ｃ１ｑ及び少なくとも１つの受容体ＦｃγＲに対する結合の低減を示す変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、
１．２６５位のアミノ酸が、アラニン、アスパラギン又はグルタミン酸で置き換えられ、
２．２９７位のアミノ酸が、アラニン、アスパラギン酸、又はグルタミンで置き換えられ、且つ
３．３２９位のアミノ酸が、アラニン、グリシン、又はセリンで置き換えられることを特徴とし、
アミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスによって示される。

【0098】

いくつかの実施形態では、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸が、それぞれＤ、Ｎ及びＰ以外のアミノ酸で置き換えられるＣＨ２ドメインを含む組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を作製する方法は、
（ａ）親ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸を提供する工程、
（ｂ）組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸を得るために工程（ａ）において提供される核酸を改変する工程であって、２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、得られたコードされたＦｃ含有分子において、これらの位置のアミノ酸がＤ（２６５位）、Ｎ（２９７位）及びＰ（３２９位）とは異なるように置き換えられる工程、及び
（ｃ）宿主細胞において工程（ｂ）において得る核酸を発現させ、前記変異体を回収する工程を含む。

【0099】

当然、親分子が既に２６５位でＤ、２９７位でＮ、又は３２９位でＰとは異なるアミノ酸を含有する場合、これらの３つの位置のうちの他の１つ又は２つのみが依然として本発明によるＦｃ含有分子を生成するために改変される必要がある。

【0100】

このような工程は、分子生物学の従来の慣例により実施され得る。本発明の組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を作製する方法を実行するために、当業者は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇから簡約したプロトコル：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００６）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００４）において見出され得る当該先行技術分野において記載されたよく知られる手順を参照してもよい。

【0101】

野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子の核酸は市販されている場合があるか、又は分子生物学又は化学合成の古典的な手順によって得てもよい。工程（ｂ）において言及されるとおりの変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸を、化学合成、又は当該先行技術分野で知られる種々の方法を用いて親ポリペプチドの核酸を改変することによって得てもよい。これらの方法としては、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、ＰＣＲ変異誘発及びカセット変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。

【0102】

変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸分子は、宿主細胞中でのその発現のための発現ベクターに組み込まれ得る。

【0103】

発現ベクターは通常、作動可能に連結された、すなわち、プロモーターなどの制御又は調節配列との機能的関連性において置かれ、且つ選択可能マーカー、任意の融合パートナー、及び／又は追加の要素を任意選択により含む配列をコードするタンパク質を含む。本発明の変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、核酸、好ましくは、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、適切な条件下で培養して、タンパク質の発現を誘導するか又は引き起こすことによって産生され得る。哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、及び酵母を含むがこれらに限定されない多種多様な適切な宿主細胞株が使用され得る。

【0104】

例えば、使用され得る種々の哺乳動物細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能なＡＴＣＣ細胞株カタログにおいて記載される。宿主細胞は、ＹＢ２／０（ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．ＧＩＩ．ＩＧＡｇ．２０細胞、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへの寄託、ＡＴＣＣｎ°ＣＲＬ−１６６２）、ＳＰ２／０、ＹＥ２／０、１Ｒ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＨＯ細胞株、特に、ＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃｌ０、ＣＨＯ−Ｌｅｃｌ、ＣＨＯ−Ｌｅｃｌ３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、不死化羊膜細胞株（ＣＡＰ）、ＥＢ６６、ＫＧＨ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｃ１２７、ＪＣ、ＬＡ７、ＺＲ−４５−３０、ｈＴＥＲＴ、ＮＭ２Ｃ５、ＵＡＣＣ−８１２などであり得るが、これらに限定されない。宿主細胞に外来性核酸を導入する方法は、当該技術分野でよく知られており、使用される宿主細胞により異なり得る。

【0105】

宿主細胞は、任意選択により、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物に属し得る。したがって、この場合、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子はトランスジェニック生物から得られる。

【0106】

トランスジェニック非ヒト動物は、所望の遺伝子を直接的に受精卵に注入することによって得ることができる（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．；７７：７３８０−４）。トランスジェニック非ヒト動物としては、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、雌ウシ、ウシ又は家禽などが挙げられる。所望の遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物は、所望の遺伝子を胚性幹細胞に導入し、アグリゲーションキメラ法又は注入キメラ法によって動物を作製することによって得ることができる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３））。胚性幹細胞の例としては、マウス（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ；２９２：１５４−１５６）、ラット、ヤギ、ウサギ、サル、家禽、ウシなどの胚性幹細胞が挙げられる。加えて、トランスジェニック非ヒト動物はまた、所望の遺伝子が導入される核が除核卵に移植されるクローン技術を用いて作製され得る（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７８：８７３−８７６；Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１２５６−１２５８）。変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードするＤＮＡを上記の方法によって作製された動物に導入することによって、動物中において変異体分子を形成し且つ蓄積させた後、動物から変異体を回収することによって生成され得る。変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、動物の乳、卵などの中で形成され且つ蓄積されるように作製されてもよい。

【0107】

上記の全ての実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、天然に存在するポリペプチド（野生型ポリペプチド）、天然に存在するポリペプチドの変異体若しくは操作された型、又は合成ポリペプチドであり得る。

【0108】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、ＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質、ＩｇＧ１ Ｆｃコンジュゲート、及び抗体からなる群から選択される。

【0109】

本明細書で使用する場合、Ｆｃ融合タンパク質及びＦｃコンジュゲートは、パートナーに連結されたＦｃ領域からなる。Ｆｃ領域は、リンカーとも呼ばれるスペーサーにより又はそれによらずにそのパートナーに連結され得る。

【0110】

好適なリンカーは、当業者の裁量に委ねられる。リンカーは、例えば、１〜３０個の炭素原子を有するアルキル、１〜２０個のエチレン部分を有するポリエチレングリコール、１〜２０個の残基を有するポリアラニン、カプロン酸、置換又は非置換のポリ−ｐ−フェニレン及びトリアゾールからなる群から選択され得る。ペプチド性リンカー、より具体的には１〜３０個のアミノ酸長を有するオリゴペプチドが好ましい。好ましい長さの範囲は５〜１５個のアミノ酸である。

【0111】

少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％の、グリシン、セリン及びアラニンなどの小さいアミノ酸からなるペプチドであるリンカーが特に好ましい。グリシン及びセリンのみからなるリンカーが特に好ましい。好適なリンカーの非限定的な例は、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号４０）である。

【0112】

本発明によれば、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域に共有結合されたタンパク質、ポリペプチド又は小ペプチドを含むタンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、任意選択により、上記のとおりのペプチドリンカーを含む。実質的に任意のタンパク質又は小ペプチドがＦｃ領域に結合されて、Ｆｃ融合体を生成し得る。タンパク質融合パートナーは、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、又はいくつかの他のタンパク質若しくはタンパク質ドメインを含み得るが、これらに限定されない。Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの非限定的な例としては、アレファセプト、アバタセプト、ベラタセプト、リロナセプト、エタネルセプト、ロミプロスチム、及びアブリフェルセプト（ａｂｌｉｆｅｒｃｅｐｔ）が挙げられる。

【0113】

特に、Ｆｃ融合タンパク質は、イムノアドヘシン、すなわち、異種「アドへシン」タンパク質（すなわち、受容体、リガンド又は酵素）の結合ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン（すなわち、Ｆｃ領域）の断片と組み合わせる抗体様タンパク質であり得る（イムノアドヘシンについての概説に関しては、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ａ，Ｃｈａｍｏｗ ＳＭ．１９９７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（２）：１９５−２００を参照のこと）。

【0114】

小ペプチドは、Ｆｃ融合体を治療標的に導く任意の治療剤を含み得るが、これに限定されない。

【0115】

本発明によれば、Ｆｃコンジュゲートは、特定の実施形態において、Ｆｃ領域とコンジュゲートパートナーとの化学的カップリングから生じる場合があり、且つ任意選択により、Ｆｃ領域をコンジュゲートパートナーに結合するスペーサーを含む。コンジュゲートパートナーは、タンパク質性又は非タンパク質性であり得る。カップリング反応は一般に、Ｆｃ領域及びコンジュゲートパートナー上の官能基を使用する。

【0116】

好適なコンジュゲートパートナーとしては、治療用ポリペプチド、標識（標識の例に関しては、さらに下記を参照のこと）、薬物、細胞傷害性薬剤、細胞傷害性薬物（例えば、化学療法剤）、毒素及びそのような毒素の活性断片が挙げられるが、これらに限定されない。好適な毒素及びそれらの対応する断片としては、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞傷害性薬剤は、ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体に直接的にコンジュゲートされ得るか又はＩｇＧ１ Ｆｃ変異体に共有結合されるキレート剤によって隔離され得る任意の放射性核種であり得る。さらなる実施形態では、コンジュゲートパートナーは、カリチアマイシン、オーリスタチン、ゲルダナマイシン、マイタンシン、並びにデュオカルマイシン及びアナログからなる群から選択され得る。

【0117】

一実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、「フィノマー」を含む。フィノマーは、ヒトＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメイン（Ｆｙｎ ＳＨ３、Ｆｙｎキナーゼのａａ ８３〜１４５：

【化1】

）に由来する小型の７ｋＤａ球状タンパク質である。上記に示されるとおりの配列番号５９において、ＲＴ及びｓｒｃループの配列はそれぞれ下線及び二重の下線が引かれ、そのような分子は、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインにおける他の選択された位置の変異と任意選択により組み合わされたＦｙｎ ＳＨ３ドメインの表面上の２つのループ（ＲＴ及びｓｒｃループ）のランダムな変異を介する選択の任意の標的に対して実質的に抗体様親和性及び特異性を有して結合するために操作され得る（例えば、国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレットを参照のこと）。Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド又はフィノマーは当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４；国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２０（２）：５７−６８；及びＧｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５に記載されている。本明細書で用語「フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）」と互換的に使用される用語「Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチド」は、ヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合ポリペプチド（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５に記載されるとおり、いわゆる足場）を指す。フィノマーは、抗体などの他の分子に遺伝的に融合されて、二重特異性を有するように操作され得るいわゆるＦｙｎｏｍＡｂを生成する（例えば、Ｓｉｌａｃｃｉ ｅｔ ａｌ，２０１６，ｍＡｂｓ ８：１，１４１−１４９；Ｂｒａｃｋ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １３（８）：ｐ．２０３０−９；国際公開第２０１４／０４４７５８Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１４／１７００６３Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１５／１４１８６２Ａ１号パンフレット）。

【0118】

記載されるとおり、用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用される。本発明によれば、「抗体」は、（ｉ）Ｆｃ領域及び（ｉｉ）免疫グロブリンの可変ドメインに由来する結合ポリペプチドドメインを少なくとも含む任意のポリペプチドを指す。前記結合ポリペプチドドメインは、所与の標的抗原又は標的抗原の群に特異的に結合できる。免疫グロブリンの可変領域に由来する結合ポリペプチドドメインは、少なくとも１つ以上のＣＤＲを含む。本明細書において、抗体としては、全長抗体、多重特異性抗体、少なくとも１つの可変領域を含むＦｃ融合タンパク質又は合成抗体（本明細書で「抗体ミメティック」と称される場合がある）、抗体融合タンパク質、抗体コンジュゲート及びそれぞれ各々の断片が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によるＦｙｎｏｍＡｂはまた、Ｆｃ領域を有する抗体を含む。したがって、本発明はまた、ＦｙｎｏｍＡｂ、すなわち、本発明による変異を有するＦｃ領域を含む、すなわち、２６５位でＤとは異なるアミノ酸、２９７位でＮとは異なるアミノ酸、及び３２９位でＰとは異なるアミノ酸を有する抗体に結合されたフィノマーの１つ以上の複製物を提供し、番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌの場合のようなＥＵインデックスに従う。特定の実施形態におけるフィノマーは、抗体の重鎖のＣ末端の下流、又は抗体の重鎖のＮ末端の上流、又は抗体の軽鎖のＣ末端の下流、又は抗体の軽鎖のＮ末端の上流に置かれてもよい。好ましくは、フィノマーの２つの複製物は、抗体の２つの鎖における対応する末端に対して各々のうちの１つ、例えば、抗体の第１の片方の軽鎖のＮ末端で１つの複製物及び抗体の第２の片方の軽鎖のＮ末端で１つの複製物（抗体の「片方」は本明細書において結合領域をともに含む重鎖及び軽鎖を意味する）、又は抗体の第１の片方の重鎖のＮ末端で１つの複製物及び抗体の第２の片方の重鎖のＮ末端で１つの複製物、又は抗体の第１の片方の軽鎖のＣ末端で１つの複製物及び抗体の第２の片方の軽鎖のＣ末端で１つの複製物、又は抗体の第１の片方の重鎖のＣ末端で１つの複製物及び抗体の第２の片方の重鎖のＣ末端で１つの複製物が抗体に結合される（ＩｇＧ抗体の４つの末端でのフィノマーの様々な位置の例については、例えば、Ｂｒａｃｋ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １３：２０３０−２０３９、及び国際公開第２０１３／１３５５８８号パンフレットの図８を参照のこと）。このような融合体は、遺伝子改変、フィノマー部分をコードする核酸のクローニング及び単一の融合分子を形成するためのインフレームの対応する抗体鎖によって生成され得る。細胞内での抗体の他の鎖（例えば、フィノマーが重鎖に融合される場合の軽鎖、又はフィノマーが軽鎖に融合される場合の重鎖）との共発現は、機能的なＦｙｎｏｍａｂの発現をもたらすことになる。フィノマー部分は、抗体部分とは異なる標的分子に結合し得るか（非限定的な例に関して、例えば、Ｓｉｌａｃｃｉ ｅｔ ａｌ，２０１６，ｍＡｂｓ ８：１，１４１−１４９；国際公開第２０１４／０４４７５８Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１４／１７００６３Ａ１号パンフレット；国際公開第２０１５／１４１８６２Ａ１号パンフレットを参照されたい）、又はフィノマー部分は、抗体部分と同じ標的分子上の異なるエピトープに結合し得る（非限定的な例に関して、Ｂｒａｃｋ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １３（８）：ｐ．２０３０−９；国際公開第２０１３／１３５５８８号パンフレットにおいて記載されるＦｙｎｏｍＡｂを参照されたい）。

【0119】

少なくとも１つの可変領域を含むＦｃ融合タンパク質は、（ｉ）Ｆｃ領域及び（ｉｉ）免疫グロブリンの可変ドメインに由来する結合ポリペプチドドメインを含む操作されたタンパク質を意味する。特に興味深いのは、（ａ）本発明のＩｇＧ１ Ｆｃ変異体、及び（ｂ）免疫グロブリンの可変領域に由来する以下の結合ポリペプチドドメイン（すなわち、少なくとも１つのＣＤＲを含む）：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖ）連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することが可能となるペプチドリンカーにより連結される単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ並びに（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により構築された多価断片又は多重特異性断片である「ダイアボディ」又は「トリアボディ」（このリストは限定的なものではない）のうちの１つを含む抗体である。

【0120】

本明細書において「全長抗体」は、可変及び定常領域を含む抗体の天然に存在する生物学的形態を有する抗体を意味する。全長抗体は、野生型抗体、野生型抗体の変異体（例えば、既存の改変を含む）、野生型抗体の操作された型（例えば、キメラ、ヒト化抗体又は完全ヒト型抗体、下をさらに参照のこと）であってもよく、このリストは限定的なものではない。よく知られているとおり、全長抗体の構造は一般に、一部の免疫グロブリンが二量体であるラマ及びラクダなどの一部の哺乳動物を除いて、四量体である。

【0121】

全長抗体の足場部分は、異なる種からの混合物であってもよい。このような抗体変異体は、キメラ抗体及び／又はヒト化抗体であり得る。一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種に由来する領域を組み合わせている抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、慣例上、非ヒト動物、一般にマウス（又はいくつかの場合においてはラット）由来の可変領域及びヒト由来の定常領域を含む。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体の全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、又はそのＣＤＲの範囲内を除くヒト抗体と同一である。一部又は全てが非ヒト生物に起源をもつ核酸によってコードされるＣＤＲがヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植されて抗体を生成し、その特異性は、移植されたＣＤＲによって決定される。このような抗体を作製するための方法はよく知られており、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット；Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６，Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ＆ Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ））において記載される。

【0122】

本明細書で使用する場合、「完全ヒト型抗体」又は「完全ヒト抗体」は、ヒト遺伝子に起源をもつ配列を全体的に含む抗体を指す。いくつかの場合において、これは、本明細書で概説された改変を有するヒト染色体に由来する抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体であってもよい。或いは、抗体の構成要素はヒトであり得るが、１つの遺伝子に由来しない場合がある。したがって、例えば、１つの抗体に由来するヒトＣＤＲは、１つ以上のヒト抗体からの足場配列などの配列と組み合わされ得る。例えば、種々の生殖系列配列が組み合わされて、ヒト抗体又はヒト足場を形成し得る。

【0123】

共有結合性の改変を含む全長抗体もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような改変としては、グリコシル化、標識化及びコンジュゲーションが挙げられるが、これらに限定されない。

【0124】

標識化は、検出可能な標識と全長抗体の結合を指す。本明細書で使用する場合、標識としては、ａ）放射性又は重同位体であり得る同位体標識；ｂ）磁性標識（例えば、磁性粒子）；ｃ）酸化還元活性のある部分；ｄ）発色団、蛍光体及びフルオロフォアなどの光学色素；酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ｅ）ビオチン化基；及びｆ）第２のレポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0125】

コンジュゲーションは、ポリペプチド、又は受容体の標識結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、薬物、細胞傷害性薬物（例えば、化学療法剤）又は毒素などの非ペプチド分子と全長抗体の結合を指す。

【0126】

特定の実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、キメラ免疫グロブリン、ヒト化免疫グロブリン、完全ヒト型免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧの中から選択される免疫グロブリン、及び任意選択によりコンジュゲート又は標識化されたものからなる群から選択される。

【0127】

変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子の特性は一般に、変異体のＣ１ｑ及びＦｃγＲへの結合は２６５位、２９７位、及び３２９位でのアミノ酸改変により制御されるため、Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体に対する結合に関するもの以外の野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子のものから推定され得る。これらの非常に関連する相違の他に、本発明のＦｃ含有分子とそれらの対応する野生型の特性においては、わずかな相違、例えば、Ｎ結合グリコシル化の欠如による熱安定性の軽微な低下がある。

【0128】

本発明のさらなる対象は、本明細書において上で定義されるとおりの変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする単離核酸である。本発明はまた、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸を含むベクター及び前記ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、前記ベクターをコードする核酸は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれている。本発明はまた、前記核酸又はゲノムに安定して組み込まれる前記ベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物に関する。

【0129】

本発明による方法及び変異体の使用
本出願人は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸２６５、２９７、及び３２９の置換が、Ｃ１ｑ並びにＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａなどのＦｃγＲに対するＦｃ変異体の親和性を徹底的に減少させることを示した。これらのエフェクター分子に対する親和性の減少は非常に顕著であるため、いくつかの場合において、Ｃ１ｑ及び／又は特定のＦｃγＲに対するＦｃ変異体の結合を、従来のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）／ＳＰＲアッセイによってインビトロで観察することができない。Ｃ１ｑに対するＩｇＧ１ Ｆｃ領域の結合は、インビボでのＣＤＣの誘導に必須である。同様に、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａに対するＩｇＧ１ Ｆｃ領域の結合は、インビボでのＡＤＣＣ及びＡＤＣＰの誘導のための重要なステップである。ＦｃγＲに対する結合は同種受容体のクラスター化を誘導することができ、これは、その受容体を介してアゴニストシグナルを標的細胞にもたらし得る。

【0130】

したがって、Ｃ１ｑに対する親和性が低いため、本発明の変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、ＣＤＣ活性を有しないか、又はそれらの野生型対応物（すなわち、２６５位でアミノ酸Ｄ、２９７位でＮ、及び３２９位でＰを有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスを基準とする）と比較して著しく低いＣＤＣ応答をインビボで誘導すると予測される。同様に、特定のＦｃγＲ（特に、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａ）に対する親和性が低いため、本発明の変異体は、ＡＤＣＣ活性を有しないか、又はそれらの野生型対応物と比較して著しく低いＡＤＣＣ応答をインビボで誘導すると予測される。同様に、本発明の変異体は、インビボでのＦｃγＲ結合を介する受容体のクラスター化又はアゴニズムを誘導しないと予測される。同じ結果はまた、インビトロでのＣＤＣアッセイ、ＡＤＣＣアッセイ及び受容体クラスター化アッセイに関しても予想される。

【0131】

それらのエフェクター活性プロファイルのために、本発明の変異体は、広範な科学的分野において有用であり得る。特に、本発明の変異体は、研究用試薬、診断用薬又は治療薬として使用され得る。

【0132】

例えば、変異体は、フルオロフォア又はインジウム−１１１若しくはテクネチウム−９９ｍなどの同位体により標識されてもよいし、またインビボイメージングのために使用されてもよいが、これは、そのような適用においてはＡＤＣＣ又はＣＤＣの活性化が必要とされないためである。

【0133】

治療薬として使用されるとき、変異体は、標的細胞、例えば、癌細胞に放射性核種、毒素、サイトカイン又は酵素などの治療剤を運ぶために使用され得る。この場合、変異体は、抗体と細胞傷害性薬物の間のコンジュゲートであってもよく、その治療活性は、細胞傷害性薬物に依存する（例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８０，７７，４５３９−４５４３）。

【0134】

本発明のＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子はまた、標的分子の遮断薬又は中和薬として機能し得る。それはまた、標的分子を刺激するか、アンタゴナイズするか又は阻害する。

【0135】

本発明のＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、ＦｃγＲを介する受容体のクラスター化又はアゴニズムを誘導することなく受容体を標的化するために使用され得る。

【0136】

標的分子は、任意の種類のものであってもよく、外来分子及び内在性分子の両方を含む。標的分子（ポリペプチド変異体が抗体であるか又は抗体を含む場合に抗原とも呼ばれる）としては、ウイルス、細菌及び真菌タンパク質、プリオン、毒素、酵素、膜受容体、薬物及び可溶性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0137】

膜受容体としては、ＲｈＤ抗原、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１４７、ＣＤ１６０、ＣＤ２２４、受容体のＥｒｂＢファミリ−に属するもののような増殖因子受容体ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）、ＰＤ１、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＩＧＦ−Ｒ１、ＰＩＧＦ−Ｒ、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉ型インターフェロン受容体、インターロイキン受容体様ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒアルファ、ＩＬ−２Ｒベータ及びＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−６Ｒ、ホルモン受容体様ミュラー管抑制因子ＩＩ型受容体、ＬＤＬ受容体、ＮＫｐ４４Ｌ、ケモカイン受容体様ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＴＮＦＲ、ＣＤ１３７、インテグリン、接着分子様ＣＤ２、ＩＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、Ｇタンパク質共役型受容体などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0138】

他の有望な標的タンパク質としては、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＡ１２５、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｔｎ、糖タンパク質７２、ＰＳＭＡ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＤＣ細胞に特異的なＢＤＣＡ−２、グルカゴン様ペプチド（例えば、ＧＬＰ−１など）、酵素（例えば、グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、アルファガラクトシダーゼ−Ａ、アガルシダーゼアルファ及びベータ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、キチナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、イミグルセラーゼ、リパーゼ、ウリカーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、中性エンドペプチダーゼ、ミエロペルオキシダーゼなど）、インターロイキン及びサイトカイン結合タンパク質（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ結合タンパク質など）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー阻害剤、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子などの他のタンパク質などの腫瘍マーカーが挙げられる。

【0139】

可溶性タンパク質としては、例えば、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＧＦベータ、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮガンマ、ケモカイン、増殖因子様ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ホルモンなどのサイトカイン及びＦＶＩＩＩ抑制性などの抑制性抗体、転移増殖因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、アルファ−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリスロポエチン、高度にグリコシル化されたエリスロポエチン、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、抗トロンビンＩＩＩ、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインＣ、Ｃ反応性タンパク質、Ｂ細胞活性化因子受容体、受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ１−Ｒａ）、補体タンパク質、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、因子Ｈ、因子Ｉ、因子Ｐ、ＣＳＡＰ、ＣＤ１３７リガンド、レクチン、シアル酸付加タンパク質などの他のタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。

【0140】

いくつかの例示的且つ非限定的な実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、抗ＣＤ３、抗ＨＥＲ２、及び抗ＰＤ１抗体又はそのような抗体を含む分子から選択され得る。

【0141】

特定の実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、抗ＣＤ３抗体を含む。特定の実施形態では、本発明の分子は、ＣＤ３に結合する抗体、及び別の標的に結合するフィノマーなどの別の結合部分を含み、すなわち、それは二重特異性結合活性を有する。このような分子は、癌を標的化するために使用されるアゴニストｍＡｂであってもよく、例えば、本明細書の実施例においてより詳細に記載される。

【0142】

いくつかの実施形態では、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、膜受容体、ヒト可溶性タンパク質、毒素、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質及び真菌タンパク質の群から選択される標的分子に特異的な中和抗体であるか、又はそれを含む。

【0143】

Ｃ１ｑ及びいくつかのＦｃγＲに対する低い結合のために、本発明の変異体は、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣを介する免疫系の動員、又は同種受容体のクラスター化若しくはＦｃγＲを介するアゴニズムが治療効率のために非常に重要でない状態の治療のために使用されることに特に適切である。

【0144】

いくつかの場合、本発明の変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子の投与は、それらのＩｇＧ１ Ｆｃ領域におけるアミノ酸２６５位、２９７位、及び３２９位で変異を含まない大部分の抗体及びイムノアドヘシンより少ない副作用及びＩｇＧ媒介性細胞障害を誘導すると予測される。

【0145】

したがって、本発明のさらなる対象は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ応答の誘導を含むＦｃＲ媒介性作用、又はＦｃγＲを介する同種受容体のクラスター化が望ましくない病態を予防又は治療するための本発明の変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子の使用である。

【0146】

ＡＤＣＣ及びＣＤＣ応答の誘導は、変異体の治療効果がエフェクター細胞の活性化又はＣＤＣ活性化を必要としないときには望ましくない。このような変異体としては、例えば、遮断抗体又は中和抗体が挙げられる。

【0147】

治療及び予防がＣＤＣ及びＡＤＣＣの誘導を必要としない病態としては、移植片拒絶、自己免疫疾患、炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

【0148】

ＦｃγＲを介する受容体のクラスター化の誘導は、変異体の治療効果が治療効果のためのＦｃγＲ媒介性の受容体のクラスター化を必要としないときには望ましくない。このような変異体としては、例えば、厳密に腫瘍抗原依存的な様式においてＣＤ３受容体のクラスター化を必要とするが、ＦｃγＲ依存的な様式においてはそれを必要としない、ＣＤ３／腫瘍抗原二重特異性分子が挙げられる。

【0149】

特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体部分及びＣＤ３３に結合するフィノマー部分を有する本発明によるＦｙｎｏｍＡｂ（すなわち、２６５位のアミノ酸がＤではなく、２９７位のアミノ酸がＮではなく、且つ３２９位のアミノ酸がＰではないＣＨ２ドメインを有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、番号付けはＫａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスに従う）を提供する。

【0150】

本発明の別の対象は、医薬組成物を調製するための本発明の変異体の使用である。

【0151】

本発明のさらなる対象は、前記変異体を含む医薬組成物を提供することである。変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子が抗体であるとき、変異体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体の形態で存在し得る。医薬組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、所望の純度を有するポリペプチド変異体と任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤を混合することによって調製される。

【0152】

本発明の医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｔｗｅｎｔｙ ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５）において記載されるものなどの標準的な方法に従って製剤化され得る。

【0153】

使用され得る薬学的に許容される賦形剤は、特に、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；６ｔｈ ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９）において記載される。

【0154】

必要とする患者を治療するために、治療有効用量の本発明の変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子が投与され得る。本明細書における「治療有効用量」は、投与の目的となる効果をもたらす用量を意味する。正確な用量は、治療の目的に依存することになり、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である。投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重以上の範囲であり得るが、例えば、０．００１、０．０１、０．１、１．０、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。当該技術分野において知られるとおり、タンパク質分解、全身対局所送達、及び新たなプロテアーゼ合成の速度、並びに年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、及び状態の重症度に対する調整が必要となる場合があり、これは、当業者によって慣習的な実験を用いて確認可能となる。

【0155】

本発明の変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、非経口、鼻腔内、皮質内（ｉｎｔｒａｏｒｔｉｃａｌｌｙ）、眼内、直腸、膣、経皮、局所（例えば、ゲル）、腹腔内、筋肉内、肺内を含むがこれらに限定されない種々の方法においてなされ得る。

【0156】

本明細書に記載される変異体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、任意選択により、他の治療薬と同時に投与されてもよく、すなわち、本明細書に記載される治療薬は、任意選択により、例えば小分子、他の生物製剤、放射線療法、外科手術などを含む他の療法又は治療薬と同時投与されてもよい。

【0157】

記載される主題の例示的な実施形態
本明細書における主題をより十分に且つより完全に説明するために、本節は、示される主題の列挙された例示的な実施形態を提供する。

【0158】

列挙された実施形態：
実施形態
１．番号付けがＫａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される、２６５位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）と異なり、２９７位のアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）と異なり、且つ３２９位のアミノ酸がプロリン（Ｐ）と異なるＣＨ２ドメインを含む組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子。

【0159】

２．分子が、２６５位でＤ、２９７位でＮ及び３２９位でＰを含む野生型ＣＨ２ドメインを有するＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子と比較して、Ｃ１ｑ及び少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する結合の低減を有する、実施形態１の分子。

【0160】

３．分子がＦｃＲｎに対する結合を保持する、実施形態１又は２の分子。

【0161】

４．少なくとも１つのＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂである、実施形態２〜３のいずれか１つの分子。

【0162】

５．
ｉ．２６５位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
ｉｉ．２９７位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はグルタミン（Ｑ）であり、且つ
ｉｉｉ．３２９位のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、又はセリン（Ｓ）で置き換えられる、実施形態１〜４のいずれか１つの分子。

【0163】

６．Ｆｃドメインアミノ酸配列が、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号４３）と少なくとも９０％同一である、実施形態１〜５のいずれか１つの分子。

【0164】

７．分子が、抗体、Ｆｃ領域、Ｆｃ融合タンパク質、又はＦｙｎｏｍＡｂなどの抗体融合タンパク質である、実施形態１〜６のいずれか１つの分子。

【0165】

８．分子が抗体である、実施形態１〜７のいずれか１つによる分子。

【0166】

９．分子が抗体融合タンパク質である、実施形態１〜７のいずれか１つによる分子。

【0167】

１０．分子がＦｙｎｏｍＡｂである、実施形態１〜７のいずれか１つによる分子。

【0168】

１１．分子が、配列番号４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、又は５８のいずれか１つによる配列を含むＦｃ領域を含み、２６５位のアミノ酸Ｄ、２９７位のＮ及び３２９位のＰが、他のアミノ酸により置き換えられる、実施形態１〜１０のいずれか１つの分子。

【0169】

１２．実施形態１〜１１のいずれか１つの分子をコードする組換え体ポリヌクレオチド。

【0170】

１３．実施形態１２のポリヌクレオチドを含むベクター。

【0171】

１４．実施形態１２の組換え体ポリヌクレオチド又は実施形態１３のベクターを含む宿主細胞。

【0172】

１５．Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスにより示される２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸が、他のアミノ酸で置き換えられるＣＨ２ドメインを含む組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を作製する方法であって、
ａ．野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸を提供する工程、
ｂ．組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子をコードする核酸を得るために工程（ａ）において提供される核酸を改変する工程であって、２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸が、それぞれＤ、Ｎ及びＰ以外のアミノ酸で置き換えられる工程、及び
ｃ．宿主細胞において工程（ｂ）において得る核酸を発現させ、前記変異体を回収する工程を含む、方法。

【0173】

１６．
ａ．標的分子に結合することができる少なくとも１つの結合ドメイン；及び
ｂ．Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスによる２６５位、２９７位、及び３２９位のアミノ酸が、それぞれＤ、Ｎ、及びＰと異なるＩｇＧ１ Ｆｃドメイン
を含む組換え体ポリペプチドであって、
ポリペプチドが、著しいリンパ球活性化、補体依存性溶解、並びに／又は標的分子及び／若しくはその表面上に標的分子を提示する細胞の細胞媒介性破壊を誘発することなく標的分子に結合することができる、組換え体ポリペプチド。

【0174】

１７．少なくとも１つの結合ドメインが、抗体の結合部位、フィノマー、酵素、ホルモン、受容体の細胞外ドメイン、サイトカイン、免疫細胞表面抗原、リガンド、及び接着分子からなる群から選択される、実施形態１６の組換え体ポリペプチド。

【0175】

１８．Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号４３）と少なくとも９０％同一である、実施形態１６又は１７の組換え体ポリペプチド。

【0176】

１９．結合ドメインが抗体の結合部位である、実施形態１６〜１８のいずれか１つの組換え体ポリペプチド。

【0177】

２０．実施形態１〜１１のいずれか１つのＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、実施形態１２の組換え体ポリヌクレオチド、実施形態１３のベクター、又は実施形態１６〜１９のいずれか１つの組換え体ポリペプチド、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【0178】

２１．対象又は患者に、実施形態１〜１１のいずれか１つのＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、実施形態１２の組換え体ポリヌクレオチド、実施形態１３のベクター、実施形態１６〜１９のいずれか１つの組換え体ポリペプチド、又は実施形態２０による医薬組成物を投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法。

【0179】

２２．疾患又は障害が癌である、実施形態２１の方法。

【0180】

２３．疾患又は障害を治療する際の使用のための実施形態１〜１１のいずれか１つのＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、実施形態１２の組換え体ポリヌクレオチド、実施形態１３のベクター、実施形態１６〜１９のいずれか１つの組換え体ポリペプチド、又は実施形態２０による医薬組成物。

【0181】

２４．疾患又は障害が癌である、実施形態２３のＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、組換え体ポリヌクレオチド、ベクター、又は組換え体ポリペプチド。

【0182】

２５．疾患又は障害を治療するための医薬品の製造のための実施形態１〜１１のいずれか１つのＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子、実施形態１２の組換え体ポリヌクレオチド、実施形態１３のベクター、実施形態１６〜１９のいずれか１つの組換え体ポリペプチド、又は実施形態２０による医薬組成物の使用。

【0183】

２６．疾患又は障害が癌である、実施形態２５による使用。

【0184】

２７．組換え体ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子を作製するための方法であって、宿主細胞中で実施形態１２の組換え体ポリヌクレオチドを発現させること及び組換え体ポリペプチドを回収することを含む方法。

【実施例】

【0185】

以下の実施例は、前の開示を補い、且つ本明細書に記載される主題のより適切な理解をもたらすために提供される。これらの実施例は、記載される主題を限定するものと考えられるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示のみを目的としており、それを考慮した様々な変形形態又は変更が、当業者に明らかであり、且つ本発明の真の範囲に含まれ、且つ本発明の真の範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解される。

【0186】

実施例１． Ｆｃ変異抗体の発現及び精製
ヒトＣＤ３に特異的なｍＡｂ、ヒトＩｇＧ１抗体に基づくいくつかの抗体は、ＣＨ２ドメインにおける各種変異を有して産生された。変異は：
− ｉ）Ｎ２９７Ａ、
− ｉｉ）Ｄ２６５とＰ３２９Ａ（ＤＡＰＡ）
− ｉｉｉ）Ｄ２６５とＮ２９７ＡとＰ３２９Ａ（ＤＡＮＡＰＡ）、及び
− ｉｖ）Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）
であった
（Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（１９９１）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１に従うＥＵ番号付け）。

【0187】

抗体の発現に関して、切断され且つ分泌産物においてもはや存在しないリーダー配列が通常存在する。本明細書に記載される実施例における発現のために使用されるリーダー配列の例は、配列番号４２において提供され、それをコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号４１において提供される。

【0188】

各種Ｆｃ変異を有する抗体をコードする発現ベクターは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ−Ｓ細胞に一過的にトランスフェクトされ、無血清／動物成分不含培地中で６日間発現された。AKTA Purifier装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号８９９２８）により、抗ＣＤ３抗体を上清から精製し、ＰＢＳに対して透析した。２８０ｎｍでの吸光度測定により濃度を決定した。

【0189】

ＳＥＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １２６０システム上でＳＥＣ−５カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、５μｍ粒径、３００Å）を用いて実施された。１０μｌの精製タンパク質をカラムにロードし、溶出をＯＤ２８０測定によって記録した。

【0190】

Ｆｃ変異抗体変異体を、シングルステップのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって良好な収量及び高純度で精製できた。収量を表１に列挙する。
ＳＥＣによって見出されるとおり、全てのタンパク質はおよそ９５％単量体であった。ｍＡｂ１ ＩｇＧ１及びｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１のＳＥＣプロファイルを図１に示す。
これらの結果は、ヒトＩｇＧ１配列に挿入されたＤＡＮＡＰＡ三重変異が、両者が医薬品の重要な判定基準である良好な発現及び単分散度を保持することを実証している。

【0191】

【表1】

【0192】

実施例２：Ｆｃ変異抗体は、非改変抗体と同一の親和性でＣＤ３発現細胞に結合する
各種Ｆｃ変異ｍＡｂ１を、ＣＤ３^＋ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１５２（商標））に対してタイトレーションして、ヒトＣＤ３に対する結合親和性を評価した。５０ｎＭと０．１３ｐＭ濃度の間でのＦｃ変異抗体の段階希釈物を、ジャーカット細胞に加え、結合した抗体を、抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗体で検出した。サイトメーター上で測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、対数目盛上の抗体濃度に対してプロットした。

【0193】

ＣＤ３^＋ジャーカット細胞に対して得られた結合曲線を図２に示す。

【0194】

Ｆｃ変異抗体変異体は、同一の親和性でＣＤ３に結合したが、これは、Ｆｃ変異が標的細胞結合に対してなんら影響を及ぼさないことを示している。

【0195】

実施例３：ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１はリンパ球活性化を誘導しない
免疫細胞活性化に対するＦｃ変異ｍＡｂ１の効果を調査するために、新鮮な単離ヒトＰＢＭＣを、Ｆｃ変異ｍＡｂ１の存在下でインキュベートした。免疫細胞活性化を、ｉ）１４時間のインキュベーション後のＣＤ６９表面染色、又はｉｉ）３日のインキュベーション後の上清におけるＩＦＮγの定量化によって検出した。ヒトＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ単離の１日前にＢｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって収集されたバフィーコート調製物から単離した。ＰＢＭＣを、Ｐａｎｃｏｌｌチューブ（Ｐａｎ−ＢｉｏＴｅｃｈ）を用いて、製造業者の指示書に従って密度遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ単離の後、残留している赤血球細胞を１×ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で溶解した。

【0196】

１００，０００個の新鮮な単離ＰＢＭＣを、９６ウェルＵ底プレートのウェル中において１０％熱不活性化ＦＢＳで補充された２００μｌの総量のＲＰＭＩ１６４０中で段階希釈（３００ｎＭと０．１５ｐＭの間の濃度）のｍＡｂ１の種々のＦｃ変異体と混合した。陽性対照として、ＰＢＭＣを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉから購入したヒトＴ細胞活性化／増殖キットに含有される抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ＭＡＣＳｉｂｅａｄｓの存在下でインキュベートした。

【0197】

ＣＤ６９の表面発現は、１４時間のインキュベーション後に測定された。アッセイウェルの内容物を混合し、各ウェルの１００μｌを、後のＣＤ６９染色のために９６ウェルＵ底プレートに移した。細胞をペレット化し、１％ＦＢＳ及び０．２％アジ化ナトリウムを含有するＦＡＣＳ緩衝液中の４０μｌの抗ＣＤ６９−ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で再懸濁した。氷上での４５分のインキュベーションの後、未結合抗体を洗い落とし、試料を、５０μｌの１．８％ホルマリン中において氷上で１５分間固定し、Ｇｕａｖａ ｅａｓｅＣｙｔｅ ８ＨＴフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で分析した。ＣＤ６９陽性のリンパ球のパーセンテージを、対数目盛上の抗体濃度に対してプロットした。

【0198】

上清中のＩＦＮγレベルは、３日間のインキュベーション後、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造業者の指示書に従ってサンドウィッチＥＬＩＳＡにより測定された。ＩＦＮγ濃度を、対数目盛上の抗体濃度に対してプロットした。

【0199】

予想外に、ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１は、ＰＢＭＣ上のＣＤ６９発現の誘導（図３Ａ）、及び培養上清中のＩＦＮγ（図３Ｂ）の欠如によって示されるとおり、リンパ球活性化を誘導しなかった唯一のコンストラクトであった。対照的に、以前にＦｃＲ結合を低減すると報告された単一又は組合せのＦｃ変異を含有する他の全ての変異体は、依然として著しいリンパ球活性化を誘導した。重要なこととして、ＤＡＮＡＰＡ Ｆｃ配列は、最小限のＦｃＲ相互作用が望ましいいくつかの臨床ステージの治療薬であるＦｃ含有タンパク質において使用される両方ともにサイレンシングされたＦｃ配列である、Ｎ２９７Ａ Ｆｃ配列又はＬＡＬＡ Ｆｃ配列より良好なサイレンシングをもたらした。これらの結果は、ＤＡＮＡＰＡ Ｆｃ配列が、ヒトＰＢＭＣアッセイにおいてＴ細胞活性化及びサイトカイン放出を誘導するための潜在力を強力に低減することを示唆する。

【0200】

実施例４：ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１はヒトＦｃγ受容体に対して最小の結合を示す
ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対する結合は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイによって特徴付けられた（Ｖａｆａ，Ｏ．，Ｇ．Ｌ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｒ．Ｊ．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｂ．Ｓｔｒａｋｅ，Ｔ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｒ．Ｌａｃｙ，Ｂ．Ｓｃａｌｌｏｎ，Ａ．Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｌｉａ ａｎｄ Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ（２０１４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５（１）：１１４−１２６）。このアッセイを、図４Ａにおいて概略的に示す。ビオチン化対照抗体は、ストレプトアビジンドナービーズ上で捕捉され；Ｈｉｓタグ付きＦｃγ受容体は、Ｎｉ^２＋アクセプタービーズ上で捕捉され；目的のＦｃを有する非標識抗体の段階希釈物が競合物としてアプライされる。この形式は、競合物の受容体結合が起こるときにシグナルの低減をもたらす。

【0201】

呼吸器多核体ウイルスに特異的であり且つ健常哺乳動物における任意の標的に特異的に結合しないと考えられるＢ２１Ｍ、ヒトＩｇＧ１対照抗体（Ｖａｆａ，Ｏ．，Ｇ．Ｌ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｒ．Ｊ．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｂ．Ｓｔｒａｋｅ，Ｔ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｒ．Ｌａｃｙ，Ｂ．Ｓｃａｌｌｏｎ，Ａ．Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｌｉａ ａｎｄ Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ （２０１４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５（１）：１１４−１２６）は、ビオチンで標識化された（ＳｕｒｅＬＩＮＫ発色団ビオチン標識化キット、ＫＰＬ）。０．２μｇ／ｍｌのビオチン化Ｂ２１Ｍ ＩｇＧ１対照抗体、Ｆｃ変異試験抗体（４００μｇ／ｍｌ、及びその８段階３倍希釈）、Ｈｉｓタグ付きヒトＦｃγ受容体（Ｒ＆Ｄ、無担体製剤）、Ｎｉ^２＋−アクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１：２５０希釈）、及びストレプトアビジンドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１：２５０希釈）を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．２）中において上に示される順に混合した。ヒトＦｃγ受容体は、次の濃度で使用された：２００ｎｇ／ｍｌのＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡ；１０ｎｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＡ；１４ｎｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＢ。

【0202】

ＦｃγＲＩに対する結合評価に関して、ビオチン化Ｂ２１Ｍ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を、アッセイの感受性を増大させるためにＢ２１Ｍ ＩｇＧ１（重鎖配列番号１８；軽鎖配列番号３２）の代わりに使用した。Ｂ２１Ｍ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（重鎖配列番号３０；軽鎖配列番号３２）は、Ｌ２３４及びＬ２３５で２つのアラニン置換を有し（実施例１もまた参照のこと）、これはＦｃγＲＩに対する結合親和性を低減する。

【0203】

３０分のインキュベーション後、プレートを、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて分析した。
％最大シグナルは、以下の式を使用する最小及び最大シグナルに対する標準化により未加工のＥｎＶｉｓｉｏｎデータから得た：
％最大＝（Ｅｘｐ−最小）／（最大−最小）＊１００
式中、
Ｅｘｐ＝ＥｎＶｉｓｉｏｎの未加工のウェルシグナル
最小＝プレート上の全ての試験競合物の中で最高の競合物濃度で得られた最小のシグナル。
最大＝最大シグナル（すなわち、通常、競合物の非存在下）。

【0204】

％最大値を、ｙ軸上の平均±標準偏差（ｎ＝３）、及びｘ軸上の対数（阻害剤）としてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットした。データを、可変ヒル勾配による応答モデルに対する４つのパラメータ対数（阻害剤）を用いて、非線形回帰によってフィットさせた。

【0205】

ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイの結果を確認するために、高親和性ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）及び低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対するＦｃ変異ｍＡｂ１変異体の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析した。ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップを、ＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリングキット（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１４００ＲＵのヒト組換え体ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は１５００ＲＵのヒト組換え体ＦｃγＲＩ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングした。２０００ｎＭと３１ｎＭの間の濃度の段階２倍希釈のＦｃ変異ｍＡｂ１を調製し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で補充されたＰＢＳ ｐＨ７．４中において３０μｌ／分でＦｃＲでコーティングされたチップ表面及びコーティングされていない基準表面上に注入した。注入と注入の間に、１０ｍＭ ＮａＯＨでチップ表面を再生した。得られた結合曲線は、リファレンスが差し引かれ、続いて緩衝液が差し引かれ、得られた二重リファレンスの曲線を、動力学的結合定数及び解離定数、ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆを得て、それから熱力学的解離定数Ｋ_Ｄがｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算される１：１のラングミュア動力学モデル、又は熱力学的解離定数、Ｋ_Ｄを直接的に得るための定常状態親和性モデルのいずれかを用いるＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用して評価した。

【0206】

ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイの結果を、図４Ｂ及び表２に示す。ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１は、非改変ＩｇＧ１と比較して４００倍を超えて低減されるＦｃγＲＩに対する最小の競合（ＩＣ_５０＞１０００ｎＭ）を示したが、これは、このＦｃ配列が、最小の残留性のＦｃγＲ結合活性を有することを示している。予想外に、ＤＡＮＡＰＡ Ｆｃは、最小のＦｃＲ相互作用が望ましい臨床ステージの抗体において使用されるＬＡＬＡ Ｆｃ又はＮ２９７Ａ Ｆｃ配列と比較してＦｃγＲＩに対して結合の著しい低減を示した。ｍＡｂ１ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１、ｍＡｂ１ Ｎ２９７Ａ ＩｇＧ１及びｍＡｂ１ ＤＡＰＡ ＩｇＧ１は、ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１よりもヒトＦｃγＲＩに対して低減されるが依然として３７倍を超えて強力な結合を示した（ＩＣ_５０＝２７ｎＭ、２４ｎＭ及び１８ｎＭ）。

【0207】

いずれの他のヒトＦｃγＲに対する結合も、ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１、ｍＡｂ１ ＤＡＰＡ ＩｇＧ１、及びｍＡｂ１ Ｎ２９７Ａ ＩｇＧ１に関して見出されなかった。ｍＡｂ１ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１は、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、且つＦｃγＲＩＩＢに対して非常に弱く結合することが観察された。

【0208】

ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの結果を、図４Ｃ及び表３（ＦｃγＲＩ結合）、並びに図４Ｄ及び表４（ＦｃγＲＩＩＩＡ結合）に示す。予想外に、ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１は、ＦｃγＲＩに対して完全に抑制された結合を示す。ｍＡｂ１ ＤＡＰＡ ＩｇＧ１、ｍＡｂ１ Ｎ２９７Ａ ＩｇＧ１及びｍＡｂ１ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１は、ＦｃγＲＩに対する残留性の結合活性を保持するが、ｍＡｂ１ ＩｇＧ１と比較して低減した親和性を有する。ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合を示さない。同様に、ｍＡｂ１ ＤＡＰＡ ＩｇＧ１及びｍＡｂ１ Ｎ２９７Ａ ＩｇＧ１はＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合を示さない一方で、ｍＡｂ１ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する残留性の結合を示すが、ｍＡｂ１ ＩｇＧ１と比較して低減した活性を有する。

【0209】

結論的に、これらの結果は、ＤＡＮＡＰＡ Ｆｃ配列が、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対して結合の著しい低減を有することを実証している。ＤＡＮＡＰＡ Ｆｃ配列がＦｃＲ結合活性を低減した程度は、ＦｃγＲ結合活性の低減をもたらす以前に知られる他の単一又は組み合わさされたＦｃ変異と比較して格段に優れている。これらの結果はさらに、本明細書で試験されたＤＡＮＡＰＡ Ｆｃと他のＦｃの間の主な相違が、ＦｃγＲＩに対する結合の著しい低減にあることを示唆している。

【0210】

【表2】

【0211】

【表3】

【0212】

【表4】

【0213】

実施例５：ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１ Ｆｃは、異なる抗体配列の文脈においてＦｃγＲ結合の低減を示す
前の上記実施例において提示されるｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１に加えて、異なるＦａｂ配列及び異なる同種標的を有する３種類の抗体が、ｍＡｂ１に関して実施例１に記載されるとおりのＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１形式において作製された：抗ＣＤ３抗体ｍＡｂ２（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号１６）、抗ＨＥＲ２抗体（重鎖配列番号１０；軽鎖配列番号１２）、及び抗ＰＤ１抗体（重鎖配列番号６；軽鎖配列番号８）。ＦｃγＲ結合活性は、実施例４に記載されるとおりのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイにおいてｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１と比較された。

【0214】

結果を図５に示す。ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１形式におけるＣＤ３特異的抗体ｍＡｂ２、ＨＥＲ２特異的抗体及びＰＤ−１特異的抗体は全て、ＦｃγＲＩに対して最小限の結合を示し（ＩＣ_５０＝６００ｎＭ以上）、他の試験ＦｃＲに対しては結合しない。これらのデータは、ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１配列が、Ｆａｂ配列又は同種標的とは無関係にＦｃＲ結合を強力に低減し、且つ実質的にいずれの抗体に対しても最小限のＦｃγＲ結合を潜在的に付与することを示す。

【0215】

実施例６：Ｄ２６５、Ｎ２９７、及びＰ３２９で置換を有するｍＡｂ１はヒトＦｃγＲ１に対する結合の低減を示す
ＤＡＮＡＰＡ ＦｃのＦｃ受容体に対して結合する能力の強力な低減が、アラニンとは異なるアミノ酸により同じセットの残基（すなわち、Ｄ２６５、Ｎ２９７及びＰ３２９）を置換することによって反映され得るかどうかを決定するために、以下の置換を有するｍＡｂ１を実施例１に記載されるとおりに作製した：
ａ）Ｄ２６５Ｎ、Ｎ２９７Ｄ、Ｐ３２９Ｇ（ＤＮＮＤＰＧと称される）
（重鎖配列番号１８；軽鎖配列番号４）
ｂ）Ｄ２６５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ３２９Ｓ（ＤＥＮＱＰＳと称される）
（重鎖配列番号２０；軽鎖配列番号４）。
ＦｃγＲＩ結合活性は、実施例４に記載されるとおりのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイにおいてｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１と比較された。

【0216】

結果を図６に示す。３種類全ての抗体が、ＦｃγＲＩに対する最小限の結合を示し、その相互作用は明らかに、Ｆｃ操作により抑制する最大の課題である（実施例４を参照のこと）。これらの結果は、ＦｃγＲＩ相互作用が、３つの残基Ｄ２６５、Ｎ２９７、及びＰ３２９を、単にアラニンによる置換ではなく異なるアミノ酸残基で置換することにより低減され得ることを示す。

【0217】

実施例７：ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１はＣ１ｑ結合を抑制する
抗体Ｆｃに対するＣ１ｑの結合は、抗体媒介性補体活性化及びその後の補体媒介性標的細胞溶解の誘導における第１段階である。ヒトＣ１ｑに対するｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００装置上でのＳＰＲ結合アッセイにおいて測定された。抗体は、アミンカップリングを介して５０００ＲＵのコーティング密度でＣＭ５チップ上にコーティングされた。ヒトＣ１ｑ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、ランニング緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）中において２００ｎＭ及びその３倍段階希釈にて３０μｌ／分の流速で注入された。結合が記録され、Ｋ_Ｄが、定常状態親和性モデルを用いるＢＩＡｃｏｒｅソフトウェアを使用してカーブフィッティングすることによって決定された。

【0218】

実験の結果を図７に示す。ｍＡｂ１ ＩｇＧ１は、見かけ上３０ｎＭのＫ_Ｄを有してＣ１ｑに対する強力な結合を示し、このことは、この相互作用に関する公開された親和性値と一致し、アッセイ機構を確証する（Ｍｏｏｒｅ ＧＬ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｍａｂｓ ２（２）：１８１−１８９）。

【0219】

ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１は、Ｃ１ｑに対する任意の検出可能な結合を示さなかった。

【0220】

注目すべきことに、ＤＡＮＡＰＡ Ｆｃγ１中に存在するＤ２６５ＡとＮ２９７Ａ変異を組み合わせるがＰ３２９Ａ変異を欠く、類似のＦｃγ１配列であるＤＡＮＡ Ｆｃγ１は、文献中に記載されており、残留性のＣ１ｑ結合を示す（Ｇｏｎｇ，Ｑ，ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４（２）：８１７−８２６）。

【0221】

ＤＡＮＡ Ｆｃγ１と対照的に、ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１は、Ｃ１ｑに対する結合の完全な消失を著しく実証した。

【0222】

実施例８：ＤＡＮＡＰＡ変異はヒトＦＣＲＮに対する結合を減少させない
ＩｇＧ ＦｃのＦｃＲｎとの相互作用は、抗体の代謝回転において重要な役割を果たす（Ｋｕｏ ＴＴ ａｎｄ ＶＧ Ａｖｅｓｏｎ（２０１１），ＭＡｂｓ ３（５）：４２２−４３０）。ピノサイトーシスを介して細胞により吸収されたＩｇＧは、エンドソームの酸性環境中においてＦｃＲｎ受容体と結合する。ＦｃＲｎはＩｇＧを再循環させて細胞表面に戻し、そこで抗体は、中性又は塩基性ｐＨでＦｃＲｎから解離することにより、リソソームによる分解から救出される。この機構は、ＩｇＧの長い血清半減期に関する説明を与える。したがって、長い血中半減期を有するために、Ｆｃ中に置換を有する抗体は、酸性ｐＨでＦｃＲｎと十分な結合を保持し、中性ｐＨで容易に解離することが重要である。

【0223】

ヒトＦｃγＲは、ＩｇＧ抗体の下方ヒンジ中の残基及びＣＨ２ドメインに結合するが（Ｗｏｏｆ ＪＭ ａｎｄ ＤＲ Ｂｕｒｔｏｎ（２００４），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４（２）：８９−９９）、ヒトＦｃＲｎは、ＣＨ２−ＣＨ３界面中のいくつかの残基と相互作用する（Ｍａｒｔｉｎ ＷＬ， ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７（４）：８６７−８７７）。したがって、ＦｃＲ結合を低減するために導入される変異は、Ｆｃ−ＦｃＲｎ相互作用に影響を及ぼし得る。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓらは、ＦｃγＲ結合の低減をもたらした下方ヒンジ又はＣＨ２ドメイン中のいくつかの変異はまた、ＦｃＲｎ結合の低減も引き起こしたことを観察した（例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｑ２９５Ａ）。したがって、ＦｃＲｎ結合に対するＤＡＮＡＰＡ変異の影響を評価することが特に重要である。

【0224】

ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１のＦｃＲｎに対する結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析された。ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップを、ＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリングキット（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて６００ＲＵのヒト組換え体ＦｃＲｎ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングした。２０００ｎＭと３１ｎＭの間の濃度の段階２倍希釈のＤＡＮＡＰＡ Ｆｃ変異ｍＡｂ１及び未変異のｍＡｂ１ ＩｇＧ１を調製し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で補充されたＰＢＳ ｐＨ６．０中において３０μｌ／分でＦｃＲｎでコーティングされた表面及びコーティングされていない基準表面上に注入した。注入と注入の間に、ＰＢＳ ｐＨ７．４でチップ表面を再生した。得られた結合曲線は、リファレンスが差し引かれ、続いて緩衝液が差し引かれ、得られた二重リファレンスの曲線を、定常状態親和性モデルを用いるＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用して評価して、熱力学的解離定数Ｋ_Ｄを得た。

【0225】

ヒトＦｃＲｎに対する結合アッセイの結果を図８に示す。解離定数Ｋ_Ｄは、ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１に関しては５００ｎＭ、及びｍＡｂ１ ＩｇＧ１に関しては４７０ｎＭであったが、このことは、ヒトＦｃＲｎに対する結合において差がないことを示している。ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１は、ｍＡｂ１ ＩｇＧ１と本質的に同一の解離動態を有して中性ｐＨで迅速な解離を示す。これらの結果は、ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１が、ＦｃγＲに対する結合の抑制にも関わらずＦｃＲｎに対するＩｇＧ１様結合を保持することを示唆する。

【0226】

実施例９：ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１は、ＩｇＧ１様薬物動態プロファイルを呈する
良好な薬物動態特性、すなわち、血中の長い半減期は、抗体に基づく医薬品が満たさなければならない重要な判定基準の１つである。抗体Ｆｃ配列の操作は、薬物動態プロファイルに対して予想外の効果を有する場合がある。例えば、Ｆｃ受容体結合を低減する５つの変異を含有するＦｃ配列を有する抗体（「ＬＦＬＥＤＡＮＱＰＳ」［注記：最後のＰからＳまでの変異はＫａｂａｔ番号付けによる３３１位であり、すなわち、本開示における変異とは異なる位置］）は、野生型ＩｇＧ１と比較して３〜５倍増大したクリアランスを有し、対応する野生型ＩｇＧ１より短い終末半減期をもたらした（国際公開第２０１４１０８４８３号パンフレット）。

【0227】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）におけるｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１の薬物動態プロファイルを調査し、ｍＡｂ１ ＩｇＧ１と比較した。５頭のＣ５７ＢＬ／６マウスを、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１又はｍＡｂ１ ＩｇＧ１で静脈内注射した。１０分、６、２４、４８、９６、１２０、１４４、及び２１６時間後、ＥＤＴＡでコーティングしたｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中に血液を回収し、９３００ｇで１０分間遠心分離し、ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１及びｍＡｂ１ ＩｇＧ１の血清レベルをＦｃ特異的サンドウィッチＥＬＩＳＡにより決定した。透明なマキシソープマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、４４０倍希釈したＦｃ特異的抗ヒトＩｇＧ１捕捉抗体（Ｉ２１３４ Ｓｉｇｍａ）でコーティングした。ＰＢＳ中２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロッキングした後、４０μｌのＰＢＳ及び適切な希釈度の１０μｌの血漿をアプライした。１時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、結合したｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１又はｍＡｂ１ ＩｇＧ１を、１０，０００倍希釈されたＦｃ特異的ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ１検出抗体（Ａ０１７０、Ｓｉｇｍａ）で検出した。アッセイをＱｕａｎｔａＲｅｄ蛍光発生基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させ、５４４ｎｍ（励起）及び５９０ｎｍ（発光）で２〜４分後に蛍光強度を測定した。ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１及びｍＡｂ１ ＩｇＧ１の血漿レベルを、対応する抗体の検量線を用いて決定した。血漿中の抗体暴露量は、２１６時間にわたる片対数プロットにおいて示される。

【0228】

ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１及びｍＡｂ１ ＩｇＧ１の薬物動態プロファイルを図９に示す。本発明に対して重要であり且つ予想外なこととして、ｍＡｂ１ ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１は、ｍＡｂ１ ＩｇＧ１と本質的に同一である薬物動態特性を有する。

【0229】

実施例１０：ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１ Ｆｃを有するＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂは、ＦｃγＲ結合の低減を示す
Ｆｃ受容体発現細胞と相互作用すると、腫瘍抗原に特異的な第１の結合部位及びＴ細胞に特異的な第２の結合部位を有するＦｃ含有二重特異性Ｔ細胞エンゲージング分子は、腫瘍非依存性Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出を誘導し得る（ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ効果）（国際公開第２０１２１４３５２４号パンフレットを参照のこと）。このリスクを軽減するために、このような分子は、最小の固有のＦｃγＲ親和性を有する操作されたＦｃ配列を備え得る。

【0230】

ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂは、可動性（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号４０）を用いるＣＤ３３特異的フィノマーＧ１（配列番号３６）又はＣＤ３３特異的フィノマーＤ５（配列番号３８）のヒト化ＣＤ３特異的抗体ｍＡｂ２（重鎖配列番号１４；軽鎖配列番号１６）の軽鎖のＣ末端への融合によって作製された。これらのＦｙｎｏｍＡｂのＦｃγＲ結合は、実施例４に記載されるとおりのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）競合アッセイにおいて決定された。

【0231】

ＣＤ３／ＣＤ３３ ＦｙｎｏｍＡｂのＦｃγＲ結合は、ＣＯＶＡ４６７（重鎖配列番号２６；軽鎖配列番号２８）であって、ＣＤ３３特異的フィノマーＢ３をＣＤ３特異的抗体ｍＡｂ３軽鎖のＣ末端に融合することによって作製された、ＬＡＬＡ ＩｇＧ１ Ｆｃ（すなわち、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ）を有する以前に記載されたＣＤ３／ＣＤ３３ ＦｙｎｏｍＡｂと比較された（国際公開第２０１４１７００６３号パンフレットを参照のこと）。Ｂ２１Ｍ ＩｇＧ１は、陽性対照として機能した（実施例４を参照のこと）。

【0232】

結果を図１０に示す。ＣＯＶＡ４６７が、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩに対して残留性の結合を示した一方で（それぞれ、ＩＣ_５０＝３９０ｎＭ及び２９ｎＭ）、ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１ Ｆｃを有する２種類のＦｙｎｏｍＡｂは、ＣＯＶＡ４６７と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡに対していかなる結合も示さず、且つＦｃγＲＩに対する結合を強力に低減した（それぞれ、ＩＣ_５０＝２０６ｎＭ又は８００ｎＭ）。ＦｃγＲＩＩＡ及びＢに対する著しい結合は、これらのコンストラクトについては見出されなかった。これらの結果は、ＤＡＮＡＰＡ ＩｇＧ１ Ｆｃを有するＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂが、ＣＯＶＡ４６７と比較してＦｃγＲ結合の低減を示すことを実証する。したがって、それらは、望ましくないｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出を誘導する可能性を低減し、ＣＤ３／ＣＤ３３二重特異性ＦｙｎｏｍＡｂの改善された変異体となる。

【0233】

【表5】

【0234】

【表6】

【0235】

【表7】

【0236】

【表8】

【0237】

【表9】

【0238】

【表10】

【0239】

【表11】

【0240】

【表12】

【0241】

【表13】

【0242】

【表14】

【0243】

【表15】

【0244】

【表16】

【0245】

【表17】

【0246】

【表18】

【0247】

【表19】

【0248】

【表20】

【0249】

【表21】

【要約】

様々な疾患及び障害の治療において使用され得る、Ｃ１ｑ及びＦｃガンマ受容体に対する結合の低減を有するＦｃ領域における変異を有する抗体及び他のＦｃ含有分子が提供される。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]