特許 6842321 ビタミンＤ受容体活性化用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6842321

(24)【登録日】2021年2月24日

(45)【発行日】2021年3月17日

(54)【発明の名称】ビタミンＤ受容体活性化用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/752 20060101AFI20210308BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210308BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20210308BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20210308BHJP

   A61Q 17/04 20060101ALI20210308BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20210308BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/752

   A61P43/00 111

   A61P17/16

   A61K8/9789

   A61Q17/04

   A61K131:00

【請求項の数】4

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2017-32212(P2017-32212)

(22)【出願日】2017年2月23日

(65)【公開番号】特開2018-135309(P2018-135309A)

(43)【公開日】2018年8月30日

【審査請求日】2019年9月25日

(73)【特許権者】

【識別番号】593106918

【氏名又は名称】株式会社ファンケル

(74)【代理人】

【識別番号】100162396

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 泰之

(74)【代理人】

【識別番号】100122954

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷部 善太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100194803

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 理弘

(74)【代理人】

【識別番号】100202430

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 千香子

(72)【発明者】

【氏名】萬治 愛子

(72)【発明者】

【氏名】古元 香津代

【審査官】 菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−２４２３３２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／７５２

Ａ６１Ｋ ８／９７８９

Ａ６１Ｐ １７／１６

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｑ １７／０４

Ａ６１Ｋ １３１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＮＡＰＲＡＬＥＲＴ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

マンダリンオレンジ果皮エキス又はグレープフルーツ果実エキスから選択される１以上を含有するビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）遺伝子の発現増幅用組成物 。

【請求項2】

ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）が皮膚細胞のレセプターである請求項１に記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）遺伝子の発現増幅用組成物。

【請求項3】

請求項１または２に記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）遺伝子の発現増幅用組成物を含むビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）遺伝子の発現増幅用の皮膚外用剤。

【請求項4】

請求項１または２に記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）遺伝子の発現増幅用組成物を含むビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）遺伝子の発現増幅用の皮膚化粧料。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はビタミンＤ受容体活性化用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ビタミンＤは、脂溶性ビタミンの一種であり、主な生理作用として小腸、腎臓、骨におけるカルシウム代謝調節が知られている。皮膚においてもビタミンＤは表皮細胞の分化促進、増殖抑制とバリア機能に重要な役割を担っている。細胞内に取り込まれたビタミンＤはビタミンＤ受容体（以下「ＶＤＲ」）と結合し、標的遺伝子の転写活性を引き起こす。ＶＤＲは、リガンド誘導型の転写制御因子として働き、リガンドと結合したＶＤＲは、レチノイドＸレセプターとヘテロダイマーを形成し、ＤＮＡ上のＶＤＲ認識配列と作用することにより、遺伝子発現を転写レベルで制御している。

【0003】

ＶＤＲは核内受容体スーパーファミリーの一員であり、ヒトのＶＤＲは４２７個のアミノ酸からなる分子量５０ｋＤａのタンパク質として公知である。
ＶＤＲに活性型ビタミンＤが結合すると、９−シス−レチノイン酸が結合したレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロダイマー（ヘテロ二量体）を形成し、ビタミンＤ標的遺伝子のプロモーター上流に存在する特異的エンハンサー配列であるビタミンＤ応答配列（ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＶＤＲＥ）に結合する。
リガンドが結合して核内受容体の構造が変化するとコアクチベーター（転写共役活性化因子）が結合できるようになり、転写を促進できるようになる。
活性型ビタミンＤ３（１α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３：Ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ）と結合したＶＤＲは９−シス−レチノイン酸に結合したレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体を形成してビタミンＤ標的遺伝子の上流にあるビタミンＤ応答配列に結合する。このヘテロ二量体に転写共役活性化因子（コアクチベーター）などの多くのタンパク質が結合して転写活性が亢進する。
ビタミンＤ受容体の活性化による増殖抑制には、細胞周期のＧ０／Ｇ１停止とアポトーシスが関与し、細胞分化も増殖抑制に伴って誘導されると考えられている。

【0004】

このようなＶＤＲと細胞周期の関係性が明らかになるにつれＶＤＲの活性化や抑制、及びその利用について種々の提案がなされるようになった。
特許文献１には、育毛剤や除毛剤のスクリーニングのため、毛包形成・毛幹形成への関与遺伝子を探索し、その結果、成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ５倍以上亢進している遺伝子としてＶＤＲ受容体遺伝子を挙げ、これを活性化する物質を探索することが提案されている。
特許文献２には、心臓血管系、免疫系、腎臓系、又は骨格系のような生理系を標的とする、それらに関連した疾患を治療するための新たなビタミンＤ受容体アゴニストとなる新たな構造を有する化合物が提案されている。
特許文献３には、エイジツエキス、ユキノシタエキス、レイシエキス、ノバラ油、マジョラムエキス、紫根エキスから選ばれる１種又は２種以上を含有することを特徴とするＶＤＲ活性化剤が提案されている。
特許文献４には、ＶＤＲ活性化剤が肺腺癌細胞に対する有効性物質であること、このＶＤＲ活性化作用を評価するため、肺腺癌細胞におけるＴＴＦ−１の発現量又は遺伝子増幅を調べることが有用であることが説明されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００５−３０４４９１号公報

【特許文献2】特表２０１２−５２４０９１号公報

【特許文献3】特開２０１５−２０２０６６号公報

【特許文献4】特開２００８−２６３８３７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者らは、皮膚に対する紫外線や活性酸素の影響を検討する過程で、これらの物理的、化学的刺激が皮膚細胞のＶＤＲの活性を低下させる現象を知見した。そしてこの低下したＶＤＲ活性を回復させ、さらに活性化する物質として種々の物質のスクリーニングを行い複数のＶＤＲ活性化作用を有する物質を見いだした。
すなわち、本発明は新たなＶＤＲ活性化作用を有する組成物を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、次の構成からなる。
（１）柑橘類抽出物、キウイ抽出物、クチナシ抽出物から選択される１以上の物質を含有するビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物。
（２）柑橘類抽出物がグレープフルーツ、マンダリンオレンジ、ユズ、シークワーサーのいずれかである（１）に記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物。
（３）活性化されるビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）が皮膚細胞に発現しているレセプターである（１）又は（２）に記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物。
（４）抽出物が果実又は果皮抽出物である（１）〜（３）のいずれかに記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物。
（５）抽出物が水又はアルコール抽出物である（１）〜（４）のいずれかに記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物。
（６）アルコールが１，３−ブチレングリコールである（５）に記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物を含むＶＤＲ活性化用の皮膚外用剤。
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物を含むＶＤＲ活性化用の皮膚化粧料。

【発明の効果】

【0008】

本発明により、あらたなビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物及び皮膚外用剤、皮膚化粧料及び皮膚用医薬部外品が提供される。また、本発明者らの研究により、ＶＤＲは夜間に活性化されることが判明した。したがって本発明の組成物の最大効果を発揮させるために、夜間に投与する組成物として利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】紫外線が、皮膚細胞のＶＤＲ活性を低下させることを試験した結果を示すグラフである。

【図2】過酸化水素（活性酸素）が、皮膚細胞のＶＤＲ活性を低下させることを試験した結果を示すグラフである。

【図3】各種抽出物のＶＤＲ活性化を試験した結果を示すグラフである。

【図4】紫外線照射によるＶＤＲ遺伝子発現の低下をグレープフルーツ抽出物が抑制していることを示すグラフである。

【図5】過酸化水素によるＶＤＲ遺伝子発現の低下をグレープフルーツ抽出物が抑制していることを示すグラフである。

【図6】同調培養したＮＢ１ＲＧＢ細胞中の時計遺伝子ＢＭＡＬ１、ＰＥＲＩＯＤ２（ＰＥＲ２）の同調後０時間（Ｔ０）、１８時間（Ｔ１８）、２４時間（Ｔ２４）、３０時間（Ｔ３０）の変動を示すグラフである。

【図7】ＶＤＲ遺伝子の発現の概日変動を測定した結果を示すグラフである。

【図8】ＨａＣａＴ細胞におけるグレープフルーツ抽出物添加２４時間経過後の時計遺伝子ＢＭＡＬ１（左）、ＰＥＲ２（右）の発現量を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、柑橘類抽出物、キウイ抽出物、クチナシ抽出物から選択される１以上の物質を含有するビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）活性化用組成物に係る発明である。ビタミンＤは、ヒトにおいては、皮膚で７−デヒドロコレステロールから光化学的に生成される。したがって皮膚のＶＤＲが活性化されることで、ビタミンＤの利用効率が上昇し、ビタミンＤ欠乏症の予防にも有用である。
柑橘類には、ＶＤＲ活性化作用があり、なかでもグレープフルーツ、マンダリンオレンジ、ユズ、シークワーサーに強いＶＤＲ活性化作用が存在する。
したがって、本発明に使用する柑橘類としては、ミカン科に属する植物の果実又は果皮の抽出物を使用できる。なかでも前記のグレープフルーツ、マンダリンオレンジ、ユズ、シークワーサーの果実又は果皮の抽出物が好ましい。
グレープフルーツは、学名をCitrus paradisiとする、ミカン科ミカン属の柑橘類である。主として亜熱帯を原産とし、日本国内で広く輸入販売されている。
マンダリンオレンジ類は、学名をCitrus reticulataとする、ミカン科ミカン属の柑橘類である。果皮が薄く手でむくことができるのが特徴である。この類にはポンカンやデコポン（シラヌイ）、タンジェリン、ダンシータンジェリン、地中海オレンジなどが含まれる。したがって本発明においては、これらの柑橘の総称としての用語「マンダリンオレンジ」を使用する。
ユズは、学名をCitrus junosとする、ミカン科ミカン属の柑橘類である。ホンユズとも呼ばれる。
シークワーサー（シークワッシャーあるいはシークヮーサーともいう）は、学名をCitrus depressaとする、ミカン科ミカン属の植物であって、琉球諸島及び台湾に自生する柑橘類である。果実は、ヒラミレモンの別名があり、沖縄県全域において広く食されている。

【0011】

さらに、本発明においては、キウイ抽出物及びクチナシ抽出物にもＶＤＲ作用を見いだしており、これらの果実も本発明に使用できる。
キウイは、マタタビ科マタタビ属の雌雄異株の落葉蔓性植物の果実であり、マタタビ属のActinidia deliciosaを指して特にキウイフルーツとも呼ぶ。本発明においては、キウイフルーツとして利用されているものであれば、どのような品種であっても良い。
クチナシ（梔子、巵子、支子）は、学名をGardenia jasminoidesとする、アカネ科クチナシ属の常緑低木である。野生では森林の低木として自生するが、むしろ園芸用として栽培されることが多い。乾燥果実は、生薬・漢方薬の原料（山梔子・梔子）となることをはじめ、様々な利用がある。

【0012】

本発明のＶＤＲ活性化用組成物は、前記の柑橘類の抽出物、またはキウイ抽出物及びクチナシ抽出物のいずれか１以上を有効成分として含有する。

【0013】

柑橘類の果実、キウイ果実、クチナシ果実は、全体であってもよく、その一部であってもよい。果実は、果肉又は果皮であってもよい。さらに、果実は、そのまま原料として用いてもよく、破砕物であってもよい。また、果実の搾汁残渣であってもよい。

【0014】

抽出は、極性の溶媒を使用する。使用可能な極性溶媒として、水、Ｃ１−Ｃ４のアルコール、例えばエタノール、ブタノール、グリセロール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、が例示できる。好ましくは、１，３−ブチレングリコールである。また、これらの溶媒の混合物であっても良い。特に好ましくは水と１，３−ブチレングリコールの１：１の混合溶媒である。

【0015】

溶媒の温度や原料に対する溶媒の重量比率、又は抽出時間などの抽出方法は、原料及び使用する溶媒に対しそれぞれを任意に設定することができる。溶媒の温度としては−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、原料中に含まれる成分の安定性の点から、４〜４０℃付近が好ましい。又、原料に対する溶媒の重量比率も、例えば原料：溶媒が、４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定することができ、特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。

【0016】

本発明に用いる各抽出物は、溶媒抽出後、さらに適宜精製操作を施すことも可能であり、精製操作としては、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等のクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等が例示でき、これらを任意に選択し組み合わせた処理操作を行うことができる。
１，３−ブチレングリコールを用いた抽出の場合も、抽出液から減圧濃縮などの方法で濃縮した濃縮物を本発明のＶＤＲ活性化用組成物とすることができる。

【0017】

本発明のＶＤＲ活性化用組成物を皮膚外用剤や皮膚化粧料とすることができる。この場合の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状等いずれの形状でも良く、抽出状況にあわせて最適な外用剤及び化粧料としての形状を任意に選択することができる。

【0018】

本発明の組成物を含む外用剤及び化粧料には、抽出物の含有量として、ＶＤＲ活性化作用を有することが確認できる範囲であれば特に制限はない。製剤として、一般的には製剤重量当たり０．０１ｍｇ／ｇ〜２００ｍｇ／ｇとなるように配合する。
これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。医薬あるいは化粧料用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水、油脂等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。

【実施例】

【0019】

以下に、試験例、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
１．試験例１（ヒト表皮角化細胞株を用いた外部刺激によるＶＤＲ活性影響試験）
１）細胞培養
ヒト成人男性皮膚から樹立された不死化角化細胞（ケラチノサイト）株であるＨａＣａＴ細胞（Deutsches Krebsforschungszentrumより購入）を３５ｍｍディッシュに１．６×１０^５ｃｅｌｌｓの細胞密度で播種し、２日間前培養した。
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加した培地ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。
なお、通常培養には、１００ｍｍディッシュに細胞を播種し８０〜９０ ％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にて剥離し継代を行った細胞を用いた。

【0020】

２）紫外線又は活性酸素刺激
前記培養後、外部刺激として紫外線（ＵＶＢ １０ｍＪ／ｃｍ^２）照射、もしくは過酸化水素５ｍＭ添加し１時間処理を行った。細胞はＤ−ＰＢＳにて洗浄の後ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて細胞を溶解し回収した。なお過酸化水素は、活性酸素を発生するため、この試験では細胞に対する活性酸素の影響を知ることができる。

【0021】

３）ＲＮＡ抽出
回収した細胞溶液は抽出まで−８０℃にて保存した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔのプロトコルに準じて行った。

【0022】

４）ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ）を用い、プロトコルに準じて行った。
５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ：ｔｏｔａｌ ＲＮＡ （２５０ｎｇ）：ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を１：１：３の割合で混合し、サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて逆転写（３７℃ １５分）、逆転写酵素の熱失活（８５℃ ５秒）を行い合成した。合成したｃＤＮＡは−２０℃にて保存した。

【0023】

５）ＶＤＲ活性の測定
ＶＤＲ遺伝子の増幅発現を指標としてＶＤＲ活性を測定した。
ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。
プライマーはＰｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴを用いて設計し、ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓより購入した。
PCR Forward Primer: GCTTGTCAAAAGGCGGCAG
PCR Reverse Primer: ACCCAAAGGCTTCTGGTCC
増幅反応はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）を用い、プロトコルに準じて行った。すなわち、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（２Ｘ）にＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（０．４ｍＭ）、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（０．４ｍＭ）、およびｃＤＮＡを混合し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え調整した。ＰＣＲ反応は初期変性９５℃、ＰＣＲ反応（９５℃ ５秒、６０℃ ３０秒、４０サイクル）、融解曲線分析（９５℃ ５秒、６０℃ １分）を行い後冷却（５０℃ ３０秒）した。増幅効率は、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて算出した。なお試験結果は、ｃｏｎｔｒｏｌに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定、仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。

【0024】

６）結果
図１に紫外線によるＶＤＲ活性への影響試験結果を、図２に過酸化水素水添加によるＶＤＲ活性への影響試験結果を示した。
この試験結果から、紫外線及び活性酸素（過酸化水素）によって皮膚角層のＶＤＲ活性が抑制されることが明らかとなった。すなわち、皮膚は日常的に紫外線や活性酸素に曝露しているため、当然皮膚細胞に発現するＶＤＲ活性は低下するものと予想された。

【0025】

２．試験例２（ＶＤＲ活性化作用を有する物質の探索試験）
市販されている各種の抽出エキスのＶＤＲ活性化作用を試験した。
（１）試験試料
次の１１種の植物抽出エキスを試験試料とした。
１．摘果グレープフルーツ／テクノーブル：グレープフルーツ果実エキス
（グレープフルーツ）
２．セイヨウサンザシＢ／一丸ファルコス：セイヨウサンザシ果実エキス
（セイヨウサンザシ）
３．テンニンカ果実抽出液ＢＧ８０／丸善製薬：テンニンカ果実エキス（テンニンカ）
４．ファルコレックス キウイＢ／一丸ファルコス：キウイエキス（キウイ）
５．キュアパッション／一丸ファルコス：クダモノトケイソウ果実エキス
（パッションフルーツ）
６．タイソウリキッドＢ／一丸ファルコス：ナツメ果実エキス（タイソウ）
７．ガデニールイエローＮＥ／一丸ファルコス：クチナシ果実エキス（クチナシ）
８．ファルコレックス ノバラＢ／一丸ファルコス：カニナバラ果実エキス
（カニナバラ）
９．ユズセラミドＢ／一丸ファルコス：ユズ果実エキス（ユズ）
１０．マンダリンクリア／一丸ファルコス：マンダリンオレンジ果皮エキス（オレンジ）
１１．シークワーサーエキスＢＧ／日油：シイクワシャー果皮エキス（シークワーサー）
なお記載は、商品名／販売者：原料部位（植物名）の順。

【0026】

（２）試験方法
試験例１と同様の条件で実施した。
１）細胞培養
ヒト成人男性皮膚から樹立された不死化角化細胞（ケラチノサイト）株であるＨａＣａＴ細胞（Deutsches Krebsforschungszentrumより購入）を３５ｍｍディッシュに１．６×１０^５ｃｅｌｌｓの細胞密度で播種し、２日間前培養した。
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加した培地ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。
なお、通常培養には、１００ｍｍディッシュに細胞を播種し８０〜９０％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にて剥離し継代を行った細胞を用いた。

【0027】

２）試験試料の添加
その後、各試験試料を１質量％になるように添加し、２４時間培養した。細胞はＤ−ＰＢＳにて洗浄の後ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて細胞を溶解し回収した。

【0028】

３）ＲＮＡ抽出
回収した細胞溶液は抽出まで−８０℃にて保存した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔのプロトコルに準じて行った。

【0029】

４）ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ）を用い、プロトコルに準じて行った。
５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ：ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（２５０ｎｇ）：ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を１：１：３の割合で混合し、サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて逆転写（３７℃ １５分）、逆転写酵素の熱失活（８５℃ ５秒）を行い合成した。合成したｃＤＮＡは−２０℃にて保存した。

【0030】

５）ＶＤＲ活性の測定
ＶＤＲ遺伝子の増幅発現を指標としてＶＤＲ活性を測定した。
ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。
プライマーはＰｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴを用いて設計し、ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓより購入した。
用いたプライマーの配列は試験例１と同様とした。
増幅反応はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）を用い、プロトコルに準じて行った。すなわち、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（２Ｘ）にＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ （０．４ｍＭ）、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（０．４ｍＭ）、およびｃＤＮＡを混合し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え調整した。ＰＣＲ反応は初期変性９５℃、ＰＣＲ反応（９５℃ ５秒、６０℃ ３０秒、４０サイクル）、融解曲線分析（９５℃ ５秒、６０℃ １分）を行い後冷却（５０℃ ３０秒）した。増幅効率は、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて算出した。なお試験結果は、ｃｏｎｔｒｏｌに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定、仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。

【0031】

６）結果
図３にＶＤＲ活性化を測定した結果を示す。なお測定結果は、試験試料無添加のＨａＣａＴ細胞のＶＤＲ活性を１とする相対値で示す。
試験に用いた試料のなかで、柑橘類抽出物は全てＶＤＲ活性を上昇させた。またキウイ抽出物、クチナシ抽出物も高値を示した。柑橘類ではオレンジ抽出物及びグレープフルーツ抽出物が高値を示した。これらの抽出物は、紫外線や活性酸素によって低下したＶＤＲを活性化するのに有用である。

【0032】

３．試験例３（グレープフルーツ抽出物が紫外線及び過酸化水素によるＶＤＲ発現低下作用を抑制する効果を有することを確認した試験）
（１）試験方法
試験例１と同様に、３５ｍｍディッシュに、ＨａＣａＴ細胞を１．６×１０^５ｃｅｌｌｓの細胞密度で播種した。１日間前培養の後、試験例で陽性となったグレープフルーツエキスを１％濃度で添加し、２４時間培養を行った。
培養終了後、細胞をＤ−ＰＢＳで洗浄し、紫外線（ＵＶＢ １０ｍＪ／ｃｍ^２）照射し、グレープフルーツ未添加の培地にて２４時間培養を行った。
また、対照として前培養の後、細胞をＤ−ＰＢＳで洗浄し、グレープフルーツ未添加の培地にて過酸化水素を５ｍＭ添加し１時間処理を行った。
各処理後の細胞は、Ｄ−ＰＢＳにて洗浄の後ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて細胞を溶解した。回収した細胞溶液は、抽出まで−８０℃にて保存した。試験例１と同様にｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、さらにＶＤＲの遺伝子発現を検出した。

【0033】

（２）結果
１）紫外線に対する効果
紫外線によるＶＤＲ発現低下に対する効果試験結果を図４に示す。４０〜５０％コンフルエント状態の表皮角化細胞において、グレープフルーツ抽出物を２４時間前処理した細胞と、グレープフルーツ抽出物無処理の細胞とを比較した。ＵＶＢ １０ｍＪ／ｃｍ²照射２４時間後に、無処理の細胞は有意にＶＤＲの発現低下を示した。一方、グレープフルーツ前処理した細胞は、紫外線によるＶＤＲの発現低下を抑制することができた。

【0034】

２）過酸化水素（活性酸素）に対する効果
過酸化水素によるＶＤＲ発現低下に対する効果試験結果を図５に示す。紫外線に対する試験と同様に、４０〜５０％コンフルエント状態の表皮角化細胞において、グレープフルーツ抽出物を２４時間前処理した細胞と、グレープフルーツ抽出物無処理の細胞とを比較した。過酸化水素５ｍＭ添加１時間後に、無処理の細胞は、有意にＶＤＲの発現低下を示した。一方、グレープフルーツ前処理した細胞は、過酸化水素によるＶＤＲの発現低下を抑制することができた。

【0035】

４．試験例４（ＶＤＲ遺伝子が概日リズムを持つ遺伝子であることの確認試験）
ＶＤＲ遺伝子が概日リズムを持つ遺伝子であることを明らかにした。
１）試験対象細胞及び細胞培養
ヒト新生児由来線維芽細胞株であるＮＢ１ＲＧＢ細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより購入）を３５ｍｍディッシュに１．６×１０^５ｃｅｌｌｓの細胞密度で播種し、２日間前培養した。
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加した培地ＭＥＭ α，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。
なお、通常培養には、１００ｍｍディッシュに細胞を播種し８０〜９０％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にて剥離し継代を行った細胞を用いた。

【0036】

２）細胞の同調培養
３５ｍｍディッシュにＮＢ１ＲＧＢを１×１０^５ｃｅｌｌｓになるように播種し、３日間前培養を行った。そして、ＭＥＭ αに１００ｎＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した培地にて２時間培養した。その後、再度１００ｎＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ未添加のＭＥＭ αに培地を交換し、所定の時間培養を行い、ＮＢ１ＲＧＢ細胞を同調させた。

【0037】

３）時計遺伝子のリズム確認
時計遺伝子ＢＭＡＬ１、ＰＥＲ２を指標に、ＶＤＲ遺伝子が概日リズムを有している細胞であることを確認した。同調後０時間（Ｔ０）、１８時間（Ｔ１８）、２４時間（Ｔ２４）、３０時間（Ｔ３０）において細胞を回収し、試験例１、２と同様にしてＲＮＡを回収した。このＲＮＡを用いて、ＢＭＡＬ１、ＰＥＲ２遺伝子発現の変動を指標としてリズムの確認を行った。

【0038】

４）ＲＮＡ抽出
回収した細胞溶液は抽出まで−８０℃にて保存した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔのプロトコルに準じて行った。

【0039】

５）ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ）を用い、プロトコルに準じて行った。
５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ：ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（２５０ｎｇ）：ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を１：１：３の割合で混合し、サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて逆転写（３７℃ １５分）、逆転写酵素の熱失活（８５℃ ５秒）を行い合成した。合成したｃＤＮＡは−２０℃にて保存した。

【0040】

６）時計遺伝子ＢＭＡＬ１、ＰＥＲ２活性の測定
ＢＭＡＬ１、ＰＥＲ２遺伝子の増幅発現を指標としてＢＭＡＬ１、ＰＥＲ２活性を測定した。
ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。
プライマーはＰｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴを用いて設計し、ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓより購入した。
用いたプライマーの配列は以下の通りである。
（ＢＭＡＬ１）PCR Forward Primer: GAGGTGACCAAGTCCAGAG
PCR Reverse Primer: GGGACATGAAATCACTGATGG
（ＰＥＲ２）PCR Forward Primer: GACATGAGACCAACGAAAACTGC
PCR Reverse Primer: AGGCTAAAGGTATCTGGACTCTG
増幅反応はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）を用い、プロトコルに準じて行った。すなわち、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（２Ｘ）にＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（０．４ｍＭ）、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（０．４ｍＭ）、およびｃＤＮＡを混合し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え調整した。ＰＣＲ反応は初期変性９５℃、ＰＣＲ反応（９５℃ ５秒、６０℃ ３０秒、４０サイクル）、融解曲線分析（９５℃ ５秒、６０℃ １分）を行い後冷却（５０℃ ３０秒）した。増幅効率は、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて算出した。なお試験結果は、ｃｏｎｔｒｏｌに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定、仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。
測定結果を図６に示す。２４時間サイクルで変動していることが確認された。したがってＮＢ１ＲＧＢ細胞は、時計遺伝子の制御下で、概日リズムを持って生育活動しているものと判断した。

【0041】

７）ＤＮＡマイクロアレイ
同調後０時間（Ｔ０）、１８時間（Ｔ１８）、２４時間（Ｔ２４）、３０時間（Ｔ３０）において回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ｎ＝４）をＷｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｅｒ．２ ４×４４Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、アジレント遺伝子発現マイクロアレイ１色法プロトコル ｖｅｒ．６．９（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に準じて行った。

【0042】

８）網羅的遺伝子発現解析
スキャンされたマイクロアレイの生データはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ｖｅｒ．１４．５（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にインポートし、Ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ Ｓｈｉｆｔ ７５％で正規化、Ｔ０の中央値をベースラインになるように補正を行った。また、解析にはＴ１８対Ｔ２４、Ｔ２４対Ｔ３０が１．５倍以上変化する遺伝子を抽出した。

【0043】

９）概日リズムを持つ遺伝子の抽出
時計遺伝子と同調する概日リズムを持つ遺伝子を同定するために、Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｅｒ．２ ４×４４Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて概日リズムを持つ遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、時計遺伝子ＢＭＡＬ１と同様の変動を示す遺伝子（Ｔ１８対Ｔ２４が１．５倍減少、Ｔ２４対Ｔ３０が１．５倍増加）５０４１遺伝子、ＰＥＲ２と同様の変動を示す遺伝子（Ｔ１８対Ｔ２４が１．５倍増加、Ｔ２４対Ｔ３０が１．５倍減少）１７３遺伝子を同定した。

【0044】

変動数の多い、ＢＭＡＬ１様変動を示す遺伝子について、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ｖｅｒ．１４．５（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｐａｔｈｗａｙ解析を行った。有意水準ｐ＜０．０５とし、有意に相同性を示したｐａｔｈｗａｙ解析結果を下記の表１に示す。

【0045】

【表1】

【0046】

ＶＤＲ遺伝子は、概日リズムを有する遺伝子であることが確認できた。

【0047】

１０）ＶＤＲ遺伝子の発現リズム
ＶＤＲ遺伝子の発現変動を指標としてＶＤＲの発現リズムを確認した。
１１）ＲＮＡ抽出
回収した細胞溶液は抽出まで−８０℃にて保存した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔのプロトコルに準じて行った。

【0048】

１２）ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ）を用い、プロトコルに準じて行った。
５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ：ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（２５０ｎｇ）：ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を１：１：３の割合で混合し、サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて逆転写（３７℃ １５分）、逆転写酵素の熱失活（８５℃ ５秒）を行い合成した。合成したｃＤＮＡは−２０℃にて保存した。

【0049】

１３）ＶＤＲ活性の測定
ＶＤＲ遺伝子の増幅発現を指標としてＶＤＲ活性を測定した。
ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。
プライマーはＰｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴを用いて設計し、ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓより購入した。
用いたプライマーの配列は試験例１と同様とした。
増幅反応はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）を用い、プロトコルに準じて行った。すなわち、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（２Ｘ）にＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（０．４ｍＭ）、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（０．４ｍＭ）、およびｃＤＮＡを混合し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え調整した。ＰＣＲ反応は初期変性９５℃、ＰＣＲ反応（９５℃ ５秒、６０℃ ３０秒、４０サイクル）、融解曲線分析（９５℃ ５秒、６０℃ １分）を行い後冷却（５０℃ ３０秒）した。増幅効率は、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて算出した。なお試験結果は、ｃｏｎｔｒｏｌに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定、仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。
測定結果を図７に示す。
ＶＤＲは１８〜２４時に低下し、その後上昇するという周期を持っている。したがってＶＤＲ活性化用組成物は、この遺伝子のリズムに合わせて、活性が低下したとき投与すれば効果的であることが判明した。

【0050】

５．試験例５（グレープフルーツ抽出物が概日リズム遺伝子を活性化することの確認試験）
１）試験方法
試験例１と同様に、３５ｍｍディッシュにＨａＣａＴ細胞を１．６×１０^５ｃｅｌｌｓの細胞密度で播種した。２日間前培養の後、グレープフルーツエキス１％を添加し、２４時間培養した。細胞はＤ−ＰＢＳにて洗浄の後ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて細胞を溶解し細胞溶解液を回収した。試験例４に記載した手法で、時計遺伝子ＢＭＡＬ１、ＰＥＲ２の発現量を測定した。

【0051】

２）結果
時計遺伝子ＢＭＡＬ１、ＰＥＲ２の２４時間経過後の発現量を図８に示す。グレープフルーツ抽出物の添加によりＢＭＡＬ１は有意な発現亢進を示した。しかし、ＰＥＲ２は発現変動を示さなかった。
このＢＭＡＬ１の結果は、試験例４で示すように、時計遺伝子様変動遺伝子であるＶＤＲの低下がグレープフルーツ抽出物の添加によって活性化され、これに伴って生体リズムを制御するＢＭＡＬ１遺伝子が活性化されるためと考えられる。一方ＰＥＲ２は試験例４に示すように２４時間目には亢進しており、グレープフルーツ抽出物による作用は影響しなかったものと考えられる。
すなわちグレープフルーツ抽出物は、ＶＤＲ遺伝子を活性化させ、これに伴ってＢＭＡＬ１遺伝子に作用を及ぼすものと考えられた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】