特許 6842800 酵素的方法を使用してレバウディオサイドＪを調製するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6842800

(24)【登録日】2021年2月25日

(45)【発行日】2021年3月17日

(54)【発明の名称】酵素的方法を使用してレバウディオサイドＪを調製するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20210308BHJP

   C12P 19/56 20060101ALI20210308BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/54ZNA

   C12P19/56

【請求項の数】11

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2019-521072(P2019-521072)

(86)(22)【出願日】2016年10月21日

(65)【公表番号】特表2019-536444(P2019-536444A)

(43)【公表日】2019年12月19日

(86)【国際出願番号】CN2016102942

(87)【国際公開番号】WO2018072211

(87)【国際公開日】20180426

【審査請求日】2019年9月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】591235706

【氏名又は名称】ペプシコ・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】陶 軍華

(72)【発明者】

【氏名】李 国慶

(72)【発明者】

【氏名】王 文霞

(72)【発明者】

【氏名】鄭 雷雷

(72)【発明者】

【氏名】朱 春磊

(72)【発明者】

【氏名】梁 暁亮

(72)【発明者】

【氏名】陳 車翹

【審査官】 井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１９３８８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１５−５１９０５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５２４２４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／０５４５３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０３７５７０７４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０２７１９９６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５０４５５２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／５４

Ｃ１２Ｐ １９／５６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

酵素的方法を使用してレバウディオサイドＪを調製するための方法であって、反応系においてレバウディオサイドＡを、グリコシル供与体と、レバウディオサイドＪを産生するための、ｉ)ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼまたはii)ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組み換え細胞存在下で反応させることを含み、ここで、ｉ)またはii)のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは配列２のアミノ酸配列を有し、グリコシル供与体がラムノシル供与体である、方法。

【請求項2】

ラムノシル供与体がＵＤＰ−ラムノースである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼがＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

反応系が３５〜４５℃の温度及び７．５〜８．５のｐＨを有する水相を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

水相がリン酸緩衝液である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

反応系が細胞透過剤をさらに含有する、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

細胞透過剤がトルエンであり、トルエンが１〜３％の体積比濃度を有する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

組み換え細胞が微生物細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

微生物が大腸菌（Escherichia coli）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

樹脂単離によりレバウディオサイドＪを精製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

樹脂単離により精製されたレバウディオサイドＪが９５％を超える純度を有する、請求項１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、レバウディオサイドＪを調製するための方法に関し、具体的には、レバウディオサイドＪを調製するための生物学的方法に関する。

【背景技術】

【0002】

甘味剤は、食品、例えば、飲料及びキャンディーの製造において広範な用途を有する食品添加剤の部類である。それらは、食品製造プロセスにおいて添加されてもよく、あるいは家庭でのベーキングにおいてスクロースの代用物として適切な希釈を通して使用されてもよい。甘味剤としては、天然甘味剤、例えば、スクロース、高果糖コーンシロップ、ハチミツ等、及び人工甘味剤、例えば、アスパルテーム、サッカリン等が挙げられる。ステビオサイドは、植物Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａから抽出された天然甘味剤の部類であり、存在する食品及び飲料において広く使用されている。Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの抽出物は、レバウディオサイドを含む様々なステビオサイドを含有する。天然に抽出されたステビオサイドは、異なるバッチにわたって成分の大きな違いを有し、その後の精製を必要とする。

【0003】

ステビア葉のステビオサイドに見られるレバウディオサイドＪの含有量は、０．５％を超えない。したがって、従来の方法を使用して、高い純度を有するレバウディオサイドＪの抽出物を得ることは極めて困難である。したがって、レバウディオサイドＪの詳細な研究は限られ、またレバウディオサイドＪの商業用途が妨げられている。

【発明の概要】

【0004】

本発明によって解決される技術的問題は、先行技術における欠陥を克服することである。本発明は、酵素的方法を使用してレバウディオサイドＪを調製するための方法を提供することによってそれを達成する。そのような方法では、高い純度を有するレバウディオサイドＪ製品を、より低いコストで、かつより短い製造サイクルで製造することができる。

【0005】

本発明では、上記の技術的問題を解決するために、以下の技術的解決策が用いられる。

【0006】

酵素的方法を使用してレバウディオサイドＪを調製するためが提供され、この方法において、レバウディオサイドＡが、基質として使用され、グリコシル供与体の存在下で、レバウディオサイドＪが、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組み換え細胞及び／又はそこから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下での反応によって産生される。ＵＧＴとも呼ばれるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（すなわち、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ）は、既に周知である。

【0007】

好ましくは、グリコシル供与体は、ラムノシル供与体である。

【0008】

より好ましくは、ラムノシル供与体は、ＵＤＰ−ラムノースである。

【0009】

好ましくは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（米）由来のＵＧＴ−Ｂである。

【0010】

好ましくは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも６０％一致している。

【0011】

より好ましくは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも７０％一致している。

【0012】

更に、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも８０％一致している。

【0013】

更にＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも９０％一致している。

【0014】

一実施例によると、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と完全に同一である。

【0015】

本発明によると、反応は、水性系中４〜５０℃の温度及び５．０〜９．０のｐＨで実行される。好ましくは、反応は、水性系中３５〜４５℃の温度及び７．５〜８．５のｐＨで実行される。より好ましくは、反応は、４０℃未満の温度及び８．０未満のｐＨで実行される。

【0016】

より好ましくは、反応は、リン酸緩衝液中で実行される。

【0017】

より好ましくは、反応系は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの組み換え細胞及び細胞透過剤を含有し、反応は、細胞透過剤の存在下で実行される。更に、細胞透過剤は、トルエンであり、反応系中のトルエンの体積比濃度は、１〜３％である。更に、トルエンの体積比濃度は、２％である。

【0018】

より好ましくは、反応において使用される全ての原料をリアクターに添加して均一に混合した後、撹拌しながら反応のために設定温度で配置する。反応が完了した後、使用要件を満たすことができるレバウディオサイドＪ産生物を精製処理を通して得ることができる。特定の精製方法は、樹脂単離を含む後処理によるものであり、９５％もの高い純度を有するレバウディオサイドＪ産生物を得ることができる。

【0019】

好ましくは、組み換え細胞は、微生物細胞である。

【0020】

より好ましくは、微生物は、大腸菌（Escherichia coli）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）である。

【0021】

前述の技術的解決策により、本発明は、先行技術と比較して以下の利点を有する。

【0022】

本発明によって提供される酵素的方法を使用するレバウディオサイドＪを調製する方法は、重要な適用価値を有する。基質レバウディオサイドＡは、酵素的方法を使用することにより大量に得ることができるため、レバウディオサイドＪの産生は、原料の量によって制限されない。このため、製造コストが大幅に削減される。また植物におけるステビオサイドの含有量が低いため、及び異なる構造を有する多くのステビオサイドが存在するため、高い純度を有する産生物を抽出することはむしろ困難である。ステビア葉からレバウディオサイドＪを抽出するための先行技術と比較すると、本発明は、新規のステビオサイドレバウディオサイドＪの研究及び適用を促進する酵素合成方法を採用することによって、より高い純度を有する産生物を提供する。

【発明を実施するための最良の形態】

【0023】

レバウディオサイドＡ及びレバウディオサイドＪの構造式については、それぞれ式Ｉ及びＩＩを参照されたい。

【0024】

【化1】

【0025】

本発明により提供されるレバウディオサイドＪの主要合成経路は、以下のとおりである。

【0026】

【化2】

【0027】

本発明において採用されるＵＧＴ−Ｂは、凍結乾燥酵素粉末の形態で、又は組み換え細胞中に存在し得る。

【0028】

ＵＧＴ−Ｂを得るための方法は、以下のとおりである。
ＵＧＴ−Ｂの組み換え大腸菌（又は他の微生物）発現株は、分子クローニング技法及び遺伝子工学技法を利用することによって得られる。次いで、組み換え大腸菌を発酵させて、ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え細胞を得るか、又は上記組み換え細胞由来のＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を調製し、取得する。

【0029】

本発明において記載される分子クローニング技法及び遺伝子工学技法の両方は、既に周知されている。分子クローニング技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２００５）に見出すことができる。

【0030】

遺伝子工学技法を用いることによって構築された本明細書における組み換え株の発現ステップは、以下のとおりである。
（１）（配列表に示される配列１及び配列２に従って）必要な遺伝子断片を遺伝的に合成し、ｐＵＣ５７ベクターにライゲーションする一方で、２つの末端にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素切断部位をそれぞれ付加する。
（２）各遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴ３０ａの対応する酵素切断部位に二重消化及びライゲーションにより挿入し、それにより各遺伝子を、Ｔ７プロモーターの制御下で配置する。
（３）組み換えプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。標的タンパク質の発現は、ＩＰＴＧを利用することによって誘導され、次いでＵＧＴ−Ｂの組み換え大腸菌の発現株が得られる。

【0031】

ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え大腸菌の発現株を利用することによって、ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え細胞及びＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を調製するためのステップは、以下のとおりである。
ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え大腸菌発現株を、１％の割合に従って４ｍＬの液体ＬＢ培地に接種する。振盪培養を、３７℃で（２００ｒｐｍで）一晩実行する。一晩培養した物質を採取し、１％の割合に従って５０ｍＬのＬＢ液体培地に接種する。ＯＤ_６００値が０．６〜０．８に達するまで、振盪培養を、３７℃で（２００ｒｐｍで）一晩実行する。次いで、０．４ｍＭの最終濃度を有するＩＰＴＧを、一晩の振盪培養にわたって２０℃で添加する。誘導が完了した後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）によって回収する。次いで、細胞を５ｍＬの２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁して、組み換え細胞を得る。次いで、細胞を氷浴中で超音波的に破壊した。ホモジネートを遠心分離する（８，０００ｒｐｍ、１０分）。また上清を回収し、凍結乾燥粉末を得るために２４時間凍結乾燥させる。

【0032】

本発明は、以下の特定の実施例と組み合わせて更に詳述される。

【0033】

実施例１：ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え大腸菌細胞の調製
配列３及び配列４に従って、ＵＧＴ−Ｂ遺伝子断片を遺伝的に合成し、一方で２つの末端にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素切断部位をそれぞれ付加し、ｐＵＣ５７ベクター（Ｓｕｚｈｏｕ Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製）にライゲーションした。ＵＧＴ遺伝子セグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅｌ及びＢａｍＨＩで酵素消化した後、セグメントを回収し、精製した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換するために、Ｔ４リガーゼを付加して、セグメントをｐＥＴ３０ａの対応する酵素切断部位にライゲーションした。

【0034】

ＵＧＴ株を、１％の割合に従って４ｍＬの液体ＬＢ培地に接種した。振盪培養を、３７℃で（２００ｒｐｍで）一晩実行した。一晩培養した物質を採取し、１％の割合に従って５０ｍＬの液体ＬＢ培地に接種した。ＯＤ_６００値が０．６〜０．８に達するまで、振盪培養を、３７℃で（２００ｒｐｍで）一晩実行した。次いで、０．４ｍＭの最終濃度を有するＩＰＴＧを、一晩の振盪培養にわたって２０℃で添加した。誘導が完了した後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）によって回収した。回収した細胞を、５ｍＬの２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁して、触媒作用のためにＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え細胞を得た。

【0035】

実施例２：ＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末の調製
実施例１で調製したＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え細胞を、氷浴中で超音波的に破壊した。ホモジネートを遠心分離した（８，０００ｒｐｍ、１０分）。また上澄みを回収し、２４時間凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を得た。

【0036】

実施例３：基質としてのレバウディオサイドＡによるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下でのレバウディオサイドＪの合成
この実施例では、実施例２の方法に従って調製したＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を、レバウディオサイドＪの触媒作用及び合成に使用した。

【0037】

１Ｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｇのＵＤＰラムノース、１ｇのレバウディオサイドＡ、１０ｇのＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を反応系に順次添加し、均一に混合した後４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌しながら２４時間にわたって反応させた。反応が完了した後、５００μＬの反応液を等量の無水メタノールに添加し、均一に混合した。次いで、それを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、濾過膜で濾過した後、高性能液体クロマトグラフィを使用して上清を検出した（クロマトグラフ条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ｅｃｌｉｐｓｅ ｓｂ−Ｃ１８ ４．６×１５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：アセトニトリル：脱イオン水＝２４％：７６％、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：３０℃）。レバウディオサイドＡの変換率は、９０％を超えた。シリカ樹脂による単離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、０．５２ｇのレバウディオサイドＪを得て、その純度は９５％を超えた。

【0038】

実施例４：基質としてのレバウディオサイドＡによるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの組み換え細胞の触媒作用下でのレバウディオサイドＪの合成
この実施例では、実施例１の方法に従って調製したＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え細胞を、レバウディオサイドＪの触媒作用及び合成に使用した。

【0039】

１Ｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｇのＵＤＰラムノース、１ｇのレバウディオサイドＡ、２０ｍＬのトルエン、４０ｇのＵＧＴ−Ｂ全細胞を反応系に順次添加し、均一に混合した後４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌しながら２４時間にわたって反応させた。反応が完了した後、５００μＬの反応液を取り、遠心分離した。上清を等量の無水メタノールと共に添加し、均一に混合した。次いで、それを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、濾過膜で濾過した後、高性能液体クロマトグラフィを使用して上清を検出した（クロマトグラフ条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ｅｃｌｉｐｓｅ ｓｂ−Ｃ１８ ４．６×１５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：アセトニトリル：脱イオン水＝２４％：７６％、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：３０℃）。レバウディオサイドＡの変換率は、９０％を超えた。シリカ樹脂による単離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、０．４９ｇのレバウディオサイドＪを得て、その純度は９５％を超えた。

【0040】

上述の実施例は、単に、本発明の技術的概念及び特徴の説明のためのものである。実施例を提供する目的は、当業者が本発明を理解し、それを適宜実施することを可能にすることだけである。本発明の範囲は、これに限定されない。本発明の本質から誘導されるいかなる同等の変更又は修正も、本発明の保護範囲内に包含されるものとする。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
１. 酵素的方法を使用してレバウディオサイドＪを調製するための方法であって、前記方法において、レバウディオサイドＡが、基質として使用され、グリコシル供与体の存在下で、レバウディオサイドＪが、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組み換え細胞及び／又はそこから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下での反応によって産生される、方法。
２. 前記グリコシル供与体が、ラムノシル供与体である、項１に記載の方法。
３. 前記ラムノシル供与体が、ＵＤＰ−ラムノースである、項２に記載の方法。
４. 前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂである、項１に記載の方法。
５. Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも６０％一致している、項４に記載の方法。
６. Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも７０％一致している、項５に記載の方法。
７. Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも８０％一致している、項６に記載の方法。
８. Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも９０％一致している、項７に記載の方法。
９. 前記反応が、水性系中３５〜４５℃の温度及び７．５〜８．５のｐＨで実行される、項１に記載の方法。
１０. 前記反応が、リン酸緩衝液中で実行される、項９に記載の方法。
１１. 前記反応系が、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの組み換え細胞及び細胞透過剤を含有する、項９に記載の方法。
１２. 前記細胞透過剤が、トルエンであり、前記反応系中のトルエンの体積比濃度が、１〜３％である、項１１に記載の方法。
１３. 前記反応に使用される全ての原料を反応ケトルに添加して均一に混合した後、撹拌しながら反応のために設定温度で配置する、項９に記載の方法。
１４. 前記組み換え細胞が、微生物細胞である、項１に記載の方法。
１５. 前記微生物が、大腸菌（Escherichia coli）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）である、項１４に記載の方法。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]