特許 6844260 培養容器、及び培養容器の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6844260

(24)【登録日】2021年3月1日

(45)【発行日】2021年3月17日

(54)【発明の名称】培養容器、及び培養容器の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20210308BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20210308BHJP

   C07K 17/08 20060101ALI20210308BHJP

   C12N 5/078 20100101ALN20210308BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 Z

   C07K16/28

   C07K17/08

   !C12N5/078

【請求項の数】5

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2016-565879(P2016-565879)

(86)(22)【出願日】2015年11月20日

(86)【国際出願番号】JP2015005805

(87)【国際公開番号】WO2016103570

(87)【国際公開日】20160630

【審査請求日】2018年10月19日

(31)【優先権主張番号】特願2014-261643(P2014-261643)

(32)【優先日】2014年12月25日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003768

【氏名又は名称】東洋製罐グループホールディングス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002354

【氏名又は名称】特許業務法人平和国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】戸谷 貴彦

(72)【発明者】

【氏名】田中 郷史

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−０９９０２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１７５０２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２３９４０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−０５６０３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Translational Medicine, 2010, Vol.8, No.104, pp.1-15

【文献】 SEKINE T. et al.，Biomedicine & Pharmacotherapy, 1993, Vol.47, pp.73-78

【文献】 OCHOA A.C. et al.，Cancer Research, 1989, Vol.49, pp.963-968

【文献】 藤野 道夫、外２名．，肺癌, 1995, Vol.35, No.3, pp.253-261

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ ３／００

Ｃ１２Ｍ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リンパ球を活性化させるための軟包材からなる袋状の培養容器であって、対向する容器内面の片面に抗ＣＤ３抗体が１０〜３００ｎｇ／ｃｍ^２の密度で固相化された培養面を有しており、且つ、培養時に、前記培養容器内の遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように遊離した抗ＣＤ３抗体が封入されていることを特徴とする培養容器。

【請求項2】

前記対向する容器内面の片面に前記抗ＣＤ３抗体が１０〜４０ｎｇ／ｃｍ^２の密度で固相化されていることを特徴とする請求項１記載の培養容器。

【請求項3】

前記培養面に対向する容器内面に抗ＣＤ３抗体が前記培養面における密度よりも小さい密度で固相化されていることを特徴とする請求項１又は２記載の培養容器。

【請求項4】

リンパ球を活性化させるための軟包材からなる袋状の培養容器の製造方法であって、
対向する容器内面の片面に抗ＣＤ３抗体を１０〜３００ｎｇ／ｃｍ^２の密度で固相化し、
培養時に、前記培養容器内の遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように遊離した抗ＣＤ３抗体を封入する
ことを特徴とする培養容器の製造方法。

【請求項5】

前記対向する容器内面の片面に前記抗ＣＤ３抗体が１０〜４０ｎｇ／ｃｍ^２の密度で固相化されることを特徴とする請求項４記載の培養容器の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞の培養技術に関し、特にリンパ球を活性化させるための培養容器、及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、ガス透過性フィルムから形成された培養容器に細胞と培養液を封入して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。

【0003】

特に、リンパ球を培養する場合には、細胞数を増やすための培養に先立って、まず抗ＣＤ３抗体を用いてリンパ球を活性化させるための培養を行う必要がある。このため、抗ＣＤ３抗体の入った培養容器にリンパ球と培養液を入れて、その活性化が行われる。
ところで、培養容器に溶液状の抗ＣＤ３抗体が少量しか入っていない場合には、リンパ球への刺激が不十分となり、活性化を十分に行うことができない。一方、培養容器に溶液状の抗ＣＤ３抗体が多量に入っている場合には、細胞の防御機構によって細胞膜に存在するＣＤ３抗原が脱落し、リンパ球の活性化は阻害される。

【0004】

抗ＣＤ３抗体を主成分とする免疫抑制剤は、このようなリンパ球の性質に着目して創られたものであり、これを臓器・組織移植後に拒絶反応が生じた患者に投与すると、多量の抗ＣＤ３抗体が抗原に結合して集積し、その集積物は細胞内に取り込まれて細胞外に排出される。あるいは、集積物は酵素により切断されて、細胞表面から抗原が除去される。その結果、細胞内に刺激が伝達されなくなり、リンパ球の活性化は抑制される。
このように、溶液中に遊離する抗体を用いてリンパ球の活性化を適切に制御することは難しく、従来は、一般的に培養容器の底内面に抗ＣＤ３抗体を固相化し、このような培養容器を用いてリンパ球を適度に刺激することで、リンパ球を活性化することが広く行われていた。

【0005】

また、リンパ球の活性化用培養バッグ（以下、単に活性化バッグと称する場合がある）を製造するにあっては、バッグ内に抗ＣＤ３抗体を含む抗体溶液を封入してバッグ内面に抗ＣＤ３抗体を固相化させた後、バッグ内を洗浄して遊離抗体を除去し、その後にリンパ球と培養液を封入して活性化培養が行われていた。このようにバッグ内を洗浄して遊離抗体を除去することにより、リンパ球の活性化をより効率的に行うことが可能となっていた。

【0006】

【特許文献1】特開２００７−１７５０２８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

そこで、本発明者らは、活性化バッグに抗体溶液が残存した場合の遊離抗体による活性化への悪影響を調べるため、様々な濃度の抗体溶液を用いて、リンパ球の活性化を行った。
その結果、驚くべきことに、抗体濃度が活性化バッグの製造に用いる程度の比較的高濃度の場合には、リンパ球の活性化が抑制されるものの、ある一定範囲の低濃度の場合には、反対にリンパ球の活性化が促進されることが見いだされた。
すなわち、活性化バッグに抗ＣＤ３抗体を固相化すると共に、低濃度の遊離抗体を封入することで、活性化バッグによるリンパ球の活性化を促進することができ、その結果、リンパ球の増殖効率をより一層向上できることが判明した。

【0008】

ここで、特許文献１の実施例１には、リンパ球の活性化バッグを製造するために、バッグ内に抗ＣＤ３抗体を含む抗体溶液を封入してバッグ内面に抗ＣＤ３抗体を固相化させた後、抗体溶液を封入したまま活性化を行ったことが記載されている。また、同実施例２には、バッグ内面に抗ＣＤ３抗体を固相化させた後、バッグ内を洗浄して遊離抗体を除去し、その後にリンパ球と培養液を封入して活性化を行ったことが記載されている。そして、その結果、抗体溶液を封入したまま活性化を行った実施例１の方が、バッグ内を洗浄して遊離抗体を除去した実施例２よりもリンパ球の増殖効率が低かったことが示されている。

【0009】

すなわち、実施例１ではバッグ内に多量の遊離抗体が残っていたためにリンパ球の活性化が抑制され、実施例２よりもリンパ球の増殖効率が低くなったと考えられる。
一方、特許文献１には、リンパ球の活性化効率をより向上させるために、抗ＣＤ３抗体を固相化した活性化バッグに一定範囲の低濃度の遊離抗体を封入することについては、記載も示唆もされていない。

【0010】

本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、リンパ球を従来よりも高効率で活性化可能な培養容器、及びその製造方法の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、リンパ球を活性化させるための軟包材からなる袋状の培養容器であって、対向する容器内面の片面に抗ＣＤ３抗体が１０〜３００ｎｇ／ｃｍ^２の密度（以下、単位面積当たりの抗体固相化量を単に密度と称する場合がある）で固相化されており、且つ、培養時に、前記培養容器内の遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように遊離した抗ＣＤ３抗体が封入されている構成としてある。

【0012】

また、本発明の培養容器の製造方法は、リンパ球を活性化させるための軟包材からなる袋状の培養容器の製造方法であって、対向する容器内面の片面に抗ＣＤ３抗体を１０〜３００ｎｇ／ｃｍ^２の密度で固相化し、培養時に、前記培養容器内の遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように遊離した抗ＣＤ３抗体を封入する方法としてある。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、リンパ球を従来よりも高効率で活性化できる培養容器、及びその製造方法を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明の実施形態に係る培養容器の概略を示す正面模式図である。

【図2】本発明の実施形態に係る培養容器の概略を示す平面模式図である。

【図3】本発明の実施形態に係る培養容器にリンパ球と培養液を封入して、活性化培養を行う様子を示す正面模式図である。

【図4】本発明の実施形態に係る培養容器の応用例の概略を示す正面模式図である。

【図5】本発明の実施形態に係る培養容器による各種遊離抗体濃度（１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ）の細胞増殖倍率を示す実験１（活性化培養工程のみ）の結果を示す図である。

【図6】本発明の実施形態に係る培養容器による各種遊離抗体濃度（５ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ）の細胞増殖倍率を示す実験２（活性化培養工程＋増幅培養工程）の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の培養容器、及び培養容器の製造方法の実施形態について、図１〜４を用いて詳細に説明する。図１は、本実施形態に係る培養容器の概略を示す正面模式図、図２は、同平面模式図であり、図３は、この培養容器にリンパ球と培養液を封入して、活性化培養を行う様子を示す正面模式図である。また、図４は、この培養容器の応用例の概略を示す正面模式図である。

【0016】

［培養容器］
図１，２に示すように、本発明の実施形態に係る培養容器１０は、上下に対向する容器壁を有している。そして、容器内面の一方が、抗体１２を固相化した固相化面１１（図１，２の容器内の底面）となっており、この固相化面１１が培養面として用いられる。また、培養容器１０内には、抗体１２が遊離する抗体溶液１３が封入されている。
なお、培養容器１０には、チューブ１４を接続可能なポートが備えられ、これによって培養容器１０内へのリンパ球と培養液の封入、及び培養したリンパ球と培養液の回収が行われる。図１，２の例では一つのチューブ１４が培養容器１０に接続されているが、２本以上接続されていても良い。

【0017】

培養容器１０は、細胞培養に必要なガス透過性を有するフィルムを用いて、袋状（バック型）に形成されている。このような培養容器１０の材料として、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。

【0018】

固相化面１１に固相化する抗体１２としては、抗ＣＤ３抗体が用いられる。リンパ球は、抗ＣＤ３抗体によって活性化され、増殖させることができる。
固相化面１１における抗体１２の固相化の密度は、１０〜３００ｎｇ／ｃｍ^２とすることが好ましく、１０〜４０ｎｇ／ｃｍ^２とすることがより好ましい。
抗体１２の固相化の密度を１０ｎｇ／ｃｍ^２以上とすれば、リンパ球を効果的に活性化させることができる。また、固相化面１１における抗ＣＤ３抗体の最密充填密度は、３００ｎｇ／ｃｍ^２であるため、抗体１２をこの密度範囲まで固相化することによって、リンパ球を好適に活性化させることが可能である。さらに、抗体１２の固相化の密度を１０〜４０ｎｇ／ｃｍ^２とすれば、リンパ球の増殖効率を特に大きく向上させることが可能である。

【0019】

培養容器１０には、培養面として用いられる固相化面１１において、溶液状の抗体１２を、１ｃｍ^２当たり０．２５〜４００ｎｇ且つ０．１〜８００μlの量で封入することが好ましい。培養容器１０に溶液状の抗体１２をこのような量で封入することで、リンパ球の活性化をより向上させることができ、その結果として増殖効率を一層向上させることができるためである。
このような観点から、溶液状の抗体１２を、培養面１ｃｍ^２当たり０．５〜３００ｎｇ且つ０．１〜６００μlの量で封入することがより好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜４００μlの量で封入することがさらに好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜２００μlの量で封入することがより一層好ましい。

【0020】

また、培養容器１０における遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度（以下、単に遊離抗体濃度と称する場合がある）を５〜１００ｎｇ／ｍｌとすることが好ましい。遊離抗体濃度をこのような範囲にすることで、リンパ球の活性化をより向上させることができ、その結果として増殖効率を一層向上させることができるためである。

【0021】

ここで、軟包材からなる培養容器を用いた細胞培養は、優れた培養効率を得るために、一般に培養液の液厚を０．２〜２ｃｍとして行われることが多い。遊離抗体濃度が５ｎｇ／ｍｌの場合、液厚を０．２ｃｍとすると、１ｃｍ^２当たりの抗体量は１ｎｇとなる。また、遊離抗体濃度が１００ｎｇ／ｍｌの場合、液厚を２ｃｍとすると、１ｃｍ^２当たりの抗体量は２００ｎｇとなる。したがって、遊離抗体濃度を５〜１００ｎｇ／ｍｌとし、培養液の液厚を０．２〜２ｃｍとすると、培養容器１０には、溶液状の抗体１２が培養面１ｃｍ^２当たり１〜２００ｎｇの量で封入されることになる。

【0022】

また、細胞密度の調整等の理由で培養液の液厚が０．０５〜４ｃｍの範囲から選択される場合がある。この場合の遊離抗体濃度を５〜１００ｎｇ／ｍｌとし、培養を行うとすると、遊離抗体濃度が５ｎｇ／ｍｌの場合、液厚を０．０５ｃｍとすると、１ｃｍ^２当たりの抗体量は０．２５ｎｇとなる。また、遊離抗体濃度が１００ｎｇ／ｍｌの場合、液厚を４ｃｍとすると、１ｃｍ^２当たりの抗体量は４００ｎｇとなる。したがって、培養容器１０には、溶液状の抗体１２が培養面１ｃｍ^２当たり０．２５〜４００ｎｇの量で封入されることになる。

【0023】

さらに、溶液状の抗ＣＤ３抗体を培養容器に培養面積１ｃｍ^２当たり０．１μlより少ない量で封入することは困難であるため、０．１μl以上の量で封入することが好ましい。また、軟包材からなる培養容器の取り扱いなどの観点から通常用いられる培養容器の容量は、培養面積１ｃｍ^２当たり４０００μl以下である場合が多く、培養液量に対する抗体溶液量の割合は、優れた培養効率を得るために、好ましくは２割以下、より好ましくは１割以下、さらに好ましくは０．５割以下とすることが望ましい。このため、溶液状の抗ＣＤ３抗体を培養容器に培養面積１ｃｍ^２当たり８００μl以下の量で封入することが好ましく、４００μl以下の量で封入することがより好ましく、２００以下の量で封入することがさらに好ましい。

【0024】

このような培養容器１０にリンパ球と培養液をチューブ１４を介して注入して、リンパ球の活性化を行うことによって、抗体１２の固相化のみが行われている培養容器を用いる場合に比較して、リンパ球を抗ＣＤ３抗体に好適に接触させることができ、リンパ球の活性化効率をより向上させることができる。
図３は、このような活性化培養の様子を模式的に示したものであり、培養容器１０の底内面に抗体１２が固相化されると共に、抗体１２が培養液３０において低濃度で遊離している。そして、リンパ球２０が固相化された抗体１２と遊離している抗体１２とによって、活性化されるようになっている。

【0025】

また、本発明の実施形態に係る培養容器を、図４に示すように、固相化面１１に対向する容器内面（以下、対向面と称する場合がある）に抗ＣＤ３抗体を固相化面１１における密度よりも小さい密度で固相化した培養容器１０ａとして構成することも好ましい。
すなわち、対向面が、抗体１２が固相化されていない非固相化面である場合、例えば保管時や輸送時に溶液中の遊離抗体が非固相化面に吸着すると、培養容器における遊離抗体の濃度が低下するため、その濃度制御が困難になる。

【0026】

そこで、本実施形態の培養容器１０ａでは、対向面に抗ＣＤ３抗体を固相化することで、培養容器における遊離抗体の濃度が低下するのを抑制可能にしている。対向面に固相化する抗ＣＤ３抗体の濃度は特に限定されないが、固相化面１１の０．０１〜０．９倍程度の密度にすることが好ましい。

【0027】

［培養容器の製造方法］
本実施形態の培養容器１０は、例えば以下のように製造することができる。
まず、プラスチック押出成形装置を用いて低密度ポリエチレンを押出成形し、フィルムを形成する。そして、インパルスシーラーを用いて、このフィルムからバッグ型の培養容器１０を製造する。また、チューブ１４を培養容器１０にポートを介して接続する。

【0028】

次に、培養容器１０を積載台に載置して、所定の量の気体を封入すると共に、抗体１２を溶解した緩衝液を続けて封入する。そして、培養容器１０を揺動することなどによって、培養容器１０内の底面上で緩衝液の液滴を移動させ、緩衝液に含まれる抗体１２を、培養容器１０内の底面上に付着させる。
このとき、固相化面１１に固相化する抗体１２として抗ＣＤ３抗体を用い、前述したように、固相化面１１における抗体１２の固相化の密度は、１０〜３００ｎｇ／ｃｍ^２とすることが好ましく、１０〜４０ｎｇ／ｃｍ^２とすることがより好ましい。

【0029】

また、固相化面１１に対向する容器内面にも抗ＣＤ３抗体を固相化することによって、図４に示す培養容器１０ａを製造することができる。
このとき、抗ＣＤ３抗体を固相化面１１の０．０１〜０．９倍程度の密度により固相化することが好ましい。

【0030】

さらに、このようにして抗体１２が固相化された培養容器１０（又は培養容器１０ａ）内に、溶液状の抗ＣＤ３抗体を培養面（固相化面１１）１ｃｍ^２当たり０．２５〜４００ｎｇ且つ０．１〜８００μlの量で封入する。また、前述したように、溶液状の抗ＣＤ３抗体を、培養面１ｃｍ^２当たり０．５〜３００ｎｇ且つ０．１〜６００μlの量で封入することがより好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜４００μlの量で封入することがさらに好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜２００μlの量で封入することがより一層好ましい。

【0031】

以上説明したように、本実施形態によれば、抗体１２が固相化された固相化面１１を備えると共に、溶液状の抗ＣＤ３抗体が上記最適な量で封入された培養容器を得ることができる。そして、このような培養容器によって、リンパ球を従来よりも高効率で活性化することができ、リンパ球の増殖効率をより一層向上させることが可能である。

【実施例】

【0032】

様々な濃度の抗体溶液を封入した培養容器を製造してリンパ球の活性化を行い、それぞれの培養容器によるリンパ球の増殖効率を確認した。具体的には、以下のように行った。

【0033】

＜実験１＞
［培養容器の作製］
ラボプラストミル（東洋精機製作所製）を用いて低密度ポリエチレンを押出成形して厚み１００μｍのフィルムを成形し、インパルスシーラーで１１ｃｍ×２０．５ｃｍ（約２２５ｃｍ^２）のバッグを作製した。

【0034】

［抗体の固相化］
このバッグにエアー約２５０ｍｌを封入し、２０μｇの抗ＣＤ３抗体（タカラバイオ株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（抗体溶液，ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）２ｍｌを封入した。そして、バッグを揺動して、液滴を１０ｍ／分の速度で、２．５分間バッグ内面上で移動させた。次いで、抗体溶液を排出した後、リン酸緩衝液２ｍｌを封入して、１０ｍ／分の速度で２．５分間バッグ内面上で移動させ、排出することによって洗浄し、バッグ内面から遊離抗体を除去した。固相化された抗体量をＢＣＡ法にて測定した結果、３７ｎｇ／ｃｍ^２の固相化量であった。

【0035】

［活性化培養試験用バッグの作製］
抗体を固相化したバッグをインパルスシーラーで５ｃｍ×５ｃｍにリサイズし、活性化培養試験に用いるためのバッグを作製した。次に、培養時の遊離抗体の濃度が、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌとなるように、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液（各々１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）５０μｌを活性化試験用バッグに封入した。また、対照実験として、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液を封入しないバッグを準備した。

【0036】

［リンパ球の活性化工程］
リンパ球の一種であるヒト末梢血単核球（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＩＮＣ．製）８．２×１０^５個を２％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）入りのＡＬｙＳ５０５Ｎ−７（株式会社細胞科学研究所）培地に懸濁して、細胞懸濁液を準備した。そして、細胞懸濁液５ｍｌをそれぞれ活性化培養試験用バッグに封入した。

【0037】

これらのバッグを３７℃で１１６時間静置培養することで、リンパ球の活性化を行った（活性化培養工程）。そして、活性化培養の終了時にバッグにおける細胞数をカウントして、増殖倍率を算出した。その結果を図５に示す。
同図に示されるように、リンパ球の増殖倍率は、対照実験（固相化のみ）が４．３０倍であり、遊離抗体濃度１０ｎｇ／ｍｌが５．２４倍、同５０ｎｇ／ｍｌが５．２０倍、同１００ｎｇ／ｍｌが４．８８倍、同２００ｎｇ／ｍｌが３．７７倍、同５００ｎｇ／ｍｌが３．１８倍であった。

【0038】

すなわち、遊離抗体濃度が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの場合は、固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が向上していることが分かる。
これに対して、遊離抗体濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上の場合には、固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が低下していることが分かる。
このように、遊離抗体濃度が上記一定範囲の低濃度の場合には、リンパ球の増殖効率をより向上することができている。一方、遊離抗体濃度がより大きい場合には、リンパ球の活性化が阻害されて、増殖効率が低減したと考えられる。

【0039】

＜実験２＞
培養容器における遊離抗体濃度が１０ｎｇ／ｍｌよりも小さい場合のリンパ球の増殖効率を確認するための実験を行った。培養容器の作製、及び抗体の固相化については、実験１と同様にして行った。

【0040】

［活性化培養試験用バッグの作製］
抗体を固相化したバッグをインパルスシーラーで５ｃｍ×５ｃｍにリサイズし、活性化培養試験に用いるためのバッグを作製した。次に、培養時の遊離抗体の濃度が、それぞれ５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるように、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液（各々０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ）５０μｌを活性化試験用バッグに封入した。また、対照実験として、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液を封入しないバッグを準備した。

【0041】

［リンパ球の活性化工程］
リンパ球の一種であるヒト末梢血単核球（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＩＮＣ．製）８．６×１０^５個を２％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）入りのＡＬｙＳ５０５Ｎ−７（株式会社細胞科学研究所）培地に懸濁して、細胞懸濁液を準備した。そして、細胞懸濁液５ｍｌをそれぞれ活性化培養試験用バッグに封入した。
そして、これらのバッグを３７℃で１２２時間静置培養することで、リンパ球の活性化を行った。

【0042】

次に、活性化したリンパ球を抗体が固相化されていないディッシュ（コーニング製）に移し替え、適宜希釈操作を行って、１９２時間培養した（増幅培養工程）。そして、増幅培養の終了時にバッグにおける細胞数をカウントして、増殖倍率を算出した。その結果を図６に示す。
同図に示されるように、リンパ球の増殖倍率は、対照実験（固相化のみ）が７３倍であり、遊離抗体濃度５ｎｇ／ｍｌが１２５倍、同１０ｎｇ／ｍｌが１０３倍であった。
すなわち、遊離抗体濃度が５ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌの場合は、いずれも固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が大きく向上していることが分かる。

【0043】

以上の通り、実験１及び実験２の結果によって、培養容器における遊離抗体濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌの場合、固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が向上できることが確認された。

【0044】

本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、培養容器の大きさ、リンパ球の種類、及び培地を実施例とは異なるものにするなど適宜変更することが可能である。

【産業上の利用可能性】

【0045】

本発明は、リンパ球を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。

【0046】

この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。

【符号の説明】

【0047】

１０，１０ａ 培養容器
１１ 固相化面
１２ 抗体
１３ 抗体溶液
１４ チューブ
２０ リンパ球
３０ 培養液

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】