特許 6844786 オルガノイド及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6844786

(24)【登録日】2021年3月1日

(45)【発行日】2021年3月17日

(54)【発明の名称】オルガノイド及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/09 20100101AFI20210308BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20210308BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20210308BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20210308BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/09

   A01K67/027ZNA

   C12Q1/02

   G01N33/15 Z

【請求項の数】6

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2018-538470(P2018-538470)

(86)(22)【出願日】2017年9月7日

(86)【国際出願番号】JP2017032335

(87)【国際公開番号】WO2018047914

(87)【国際公開日】20180315

【審査請求日】2019年2月15日

(31)【優先権主張番号】特願2016-175478(P2016-175478)

(32)【優先日】2016年9月8日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2017-49202(P2017-49202)

(32)【優先日】2017年3月14日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２７年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、［革新的先端研究開発支援事業ユニットタイプ「炎症の慢性化機構の解明と制御に向けた基盤技術の創出」研究領域］「消化器がんの発生・進展過程における慢性炎症の誘導と役割の解明」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02384

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02345

(73)【特許権者】

【識別番号】504160781

【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100161207

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 和純

(74)【代理人】

【識別番号】100139686

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 史朗

(74)【代理人】

【識別番号】100192773

【弁理士】

【氏名又は名称】土屋 亮

(72)【発明者】

【氏名】大島 正伸

(72)【発明者】

【氏名】中山 瑞穂

(72)【発明者】

【氏名】坂井 絵梨

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／１９６０１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 WEEBER F. et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, Vol.112, No.4

【文献】 BOJ S.F. et al.，Cell, 2015, Vol.160, pp.324-338

【文献】 CAO D. et al.，PLoS One, 2014, Vol.9, No.1, e86813, pp.1-8

【文献】 大島 浩子、外２名．，遺伝子変異と微小環境の相互作用による発がん．，実験医学, 2016.09.01, Vol.34, No.14, pp.2294-2299

【文献】 MATANO M. et al.，Nature Medicine, 2015, Vol.21, No.3, pp.256-262

【文献】 FUJII M et al.，Cell Stem Cell, 2016.06.02, Vol.18, p.827-838

【文献】 O'ROURKE K.P. et al.，Nature Biotechnology, 2017.05.01, Vol.35, No.6, p.577-582

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

正常免疫のマウスに移植した際に、転移性を有し、ＡＰＣと、ＫＲＡＳと、ＴＰ５３と、ＴＧＦＢＲ２とが変異しており、
前記ＴＰ５３の変異が、機能獲得型変異であり、マウスの腸管上皮腫瘍由来である、オルガノイドであって、
前記ＡＰＣの変異は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の７１６番目のアミノ酸に対応するコドンが翻訳終止変異であり、正常Ａｐｃ遺伝子が欠損し、遺伝子型はＡＰＣ−/Δ７１６であり、
前記ＫＲＡＳの変異は、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の１２番目のアミノ酸に対応するコドンに塩基置換変異が導入された、Ｇ１２Ｄであり、
前記ＴＰ５３における変異は、配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の２７０番目のアミノ酸に対応するコドンに塩基置換変異が導入された、Ｒ２７０Ｈであり、ヘテロ変異であり、
前記ＴＧＦＢＲ２の変異は、ホモ欠失変異であり、エピジェネティックな変化が導入されており、
ドライバー遺伝子としての、前記ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、及び、ＴＧＦＢＲ２が腸管上皮細胞特異的に、前記変異を有するマウスから発生した腫瘍組織を切り出して、前記ドライバー遺伝子が変異した細胞を調整し、前記細胞の一部が腺管様構造に変化して、転移能を獲得するまで３次元培養してなることを特徴とするオルガノイド。

【請求項2】

受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３４５のオルガノイド。

【請求項3】

正常免疫のマウスに移植した際に、転移性を有し、ＡＰＣと、ＫＲＡＳと、ＴＰ５３と、ＴＧＦＢＲ２とが変異しており、
前記ＴＰ５３の変異が、機能獲得型変異であり、マウスの腸管上皮腫瘍由来である、細胞株であって、
前記ＡＰＣの変異は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の７１６番目のアミノ酸に対応するコドンが翻訳終止変異であり、正常Ａｐｃ遺伝子が欠損し、遺伝子型はＡＰＣ−/Δ７１６であり、
前記ＫＲＡＳの変異は、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の１２番目のアミノ酸に対応するコドンに塩基置換変異が導入された、Ｇ１２Ｄであり、
前記ＴＰ５３における変異は、配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の２７０番目のアミノ酸に対応するコドンに塩基置換変異が導入された、Ｒ２７０Ｈであり、ＬＯＨにより野生型（＋）遺伝子が欠失しており、
前記ＴＧＦＢＲ２の変異は、ホモ欠失変異であり、エピジェネティックな変化が導入されており、
請求項１又は２に記載のオルガノイドを２次元培養して、ヘテロ変異のＴＰ５３の野生型（＋）遺伝子をＬＯＨにより欠失させてなることを特徴とする細胞株。

【請求項4】

受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３８４の細胞株。

【請求項5】

請求項１又は２に記載のオルガノイド、又は、請求項３又は４に記載の細胞株を移植により備え、正常免疫である、マウス。

【請求項6】

がん治療薬剤候補物質を請求項１又は２に記載のオルガノイド、又は、請求項３又は４に記載の細胞株に接触させ、或いは、請求項５に記載のマウスに投与して、がん細胞増殖抑制を試験する工程を含むことを特徴とする抗がん剤のスクリーニング法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オルガノイド及びその利用に関する。
本願は、２０１６年９月８日に、日本に出願された特願２０１６−１７５４７８号、及び２０１７年３月１４日に、日本に出願された特願２０１７−０４９２０２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

大腸がんの発生と悪性化には、複数のドライバー遺伝子の変異の蓄積が必要である。Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ） Ｎｅｔｗｏｒｋの報告により、大腸がんのドライバー遺伝子候補が明らかにされた（例えば、非特許文献１参照。）。
その中でも、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＧＦＢＲ２、Ｐ５３の各遺伝子変異が高頻度に検出され、これらの遺伝子は、重要なドライバー遺伝子であると考えられている。

【0003】

最近になって、ヒトの正常腸管上皮幹細胞を３次元培養し（オルガノイド培養ともいう。）、この細胞にＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４、Ｐ５３、ＰＩＫ３ＣＡの各遺伝子変異を導入し、免疫不全マウスであるＮＯＧ(ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ, ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ)マウスに移植すると腫瘍が形成されることが報告されている（例えば、非特許文献２〜３参照。）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Cancer Genome Atlas Network., Comprehensive molecular portraits of human breast tumours., Nature, 490(7418),61-70,2012.

【非特許文献2】Matano M., et al., Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids., Nat. Med.,21(3):256-62,2015.

【非特許文献3】Drost J., et al.,Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells., Nature., 521(7550):43-7,2015.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４、Ｐ５３、ＰＩＫ３ＣＡの各遺伝子に変異が導入されたオルガノイドをＮＯＧマウスに移植しても他臓器への転移は認められず、完全な悪性化には進行していない事から、悪性化にはさらに何らかの変化が必要と考えられた。
非特許文献２〜３に記載のようにヒト幹細胞オルガノイドにゲノム編集技術によりドライバー変異を入れて、がんを再現することが可能となった。一方で、がん組織では「がん細胞」に対する生体応答により「微小環境」が形成され、そこに存在する免疫細胞や間質細胞が、がん細胞の生存や増殖に関与することが知られている。
したがって、がん研究又は抗がん剤の評価研究のために、ヒトの発がんや悪性化を再現するためには、免疫応答が正常なモデル動物へのオルガノイド移植実験が必要であり、前記モデル動物と同種の細胞を用いたオルガノイドの樹立が必要となる。

【0006】

そこで本発明は、がん研究又は抗がん剤の評価研究のための手段を提供することを目的とする。より具体的には、オルガノイド、細胞株、非ヒト動物、抗がん剤のスクリーニング方法、オルガノイドの製造方法、細胞株の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、以下の通りである。
（１）正常免疫のマウスに移植した際に、転移性を有し、ＡＰＣと、ＫＲＡＳと、ＴＰ５３と、ＴＧＦＢＲ２とが変異しており、前記ＴＰ５３の変異が、機能獲得型変異であり、マウスの腸管上皮腫瘍由来である、オルガノイドであって、前記ＡＰＣの変異は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の７１６番目のアミノ酸に対応するコドンが翻訳終止変異であり、正常Ａｐｃ遺伝子が欠損し、遺伝子型はＡＰＣ−/Δ７１６であり、前記ＫＲＡＳの変異は、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の１２番目のアミノ酸に対応するコドンに塩基置換変異が導入された、Ｇ１２Ｄであり、前記ＴＰ５３における変異は、配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の２７０番目のアミノ酸に対応するコドンに塩基置換変異が導入された、Ｒ２７０Ｈであり、ヘテロ変異であり、前記ＴＧＦＢＲ２の変異は、ホモ欠失変異であり、エピジェネティックな変化が導入されており、ドライバー遺伝子としての、前記ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、及び、ＴＧＦＢＲ２が腸管上皮細胞特異的に、前記変異を有するマウスから発生した腫瘍組織を切り出して、前記ドライバー遺伝子が変異した細胞を調整し、前記細胞の一部が腺管様構造に変化して、転移能を獲得するまで３次元培養してなることを特徴とするオルガノイド。
（２）受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３４５のオルガノイド。
（３）正常免疫のマウスに移植した際に、転移性を有し、ＡＰＣと、ＫＲＡＳと、ＴＰ５３と、ＴＧＦＢＲ２とが変異しており、前記ＴＰ５３の変異が、機能獲得型変異であり、マウスの腸管上皮腫瘍由来である、細胞株であって、前記ＡＰＣの変異は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の７１６番目のアミノ酸に対応するコドンが翻訳終止変異であり、正常Ａｐｃ遺伝子が欠損し、遺伝子型はＡＰＣ−/Δ７１６であり、前記ＫＲＡＳの変異は、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の１２番目のアミノ酸に対応するコドンに塩基置換変異が導入された、Ｇ１２Ｄであり、前記ＴＰ５３における変異は、配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、最初のメチオニンを１番目として数えた場合の２７０番目のアミノ酸に対応するコドンに塩基置換変異が導入された、Ｒ２７０Ｈであり、ＬＯＨにより野生型（＋）遺伝子が欠失しており、前記ＴＧＦＢＲ２の変異は、ホモ欠失変異であり、エピジェネティックな変化が導入されており、（１）又は（２）に記載のオルガノイドを２次元培養して、ヘテロ変異のＴＰ５３の野生型（＋）遺伝子をＬＯＨにより欠失させてなることを特徴とする細胞株。
（４）受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３８４の細胞株。
（５）（１）又は（２）に記載のオルガノイド、又は、（３）又は（４）に記載の細胞株を移植により備え、正常免疫である、マウス。
（６）がん治療薬剤候補物質を（１）又は（２）に記載のオルガノイド、又は、（３）又は（４）に記載の細胞株に接触させ、或いは、（５）に記載のマウスに投与して、がん細胞増殖抑制を試験する工程を含むことを特徴とする抗がん剤のスクリーニング法。

【発明の効果】

【0008】

本発明により、がん研究又は抗がん剤の評価研究のための手段を提供することができる。より具体的には、オルガノイド、細胞株、非ヒト動物、抗がん剤のスクリーニング方法、オルガノイドの製造方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】（ａ）は、正常免疫下においても転移性を有するオルガノイド（ＡＫＴＰ−３Ｄ）の観察像である。（ｂ）は、腺管様構造をとるオルガノイドの一例の観察像である。

【図2】（ａ）は、正常免疫下においても転移性を有する細胞株（ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β）の観察像である。（ｂ）は、正常免疫下においても転移性を有する細胞株（ＡＫＴＰ−２Ａ６）の観察像である。

【図3】４か月培養後の腺管様オルガノイドを移植したＮＯＧマウスから採取した肝臓の観察像である。

【図4】オルガノイド（ＡＫＴＰ−３Ｄ）を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した肝臓の観察像である。

【図5】オルガノイド（ＡＫＴＰ−３Ｄ）及びマウス腸管上皮腫瘍細胞株（ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β）におけるＬＯＨ解析の結果である。

【図6】オルガノイド（ＡＫＴＰ−３Ｄ）及びマウス腸管上皮腫瘍細胞株（ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β）における軟寒天コロニーアッセイの結果である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

［オルガノイド］
本発明のオルガノイドは、正常免疫の同種非ヒト動物に移植した際に、転移性を有する。本発明において、オルガノイドとは、細胞が集積した細胞組織体であって、細胞組織が本来有する機能を有する臓器（オルガン）に近似するものをいう。
従来、ゼノグラフトモデルとして、ＮＯＧマウス等、免疫不全の非ヒト動物を用いる以外の手段がなかった。実施例にて後述するように、本発明のオルガノイドは、正常免疫下においても転移性を有するほど、悪性度が高い。そのため、本発明のオルガノイドによれば、Ｃ５７ＢＬ／６マウス等の免疫応答が正常なモデル動物へのオルガノイド移植実験が可能であり、免疫系を考慮した、腫瘍の発育・進展様式の解明、治療剤のスクリーニング等に利用することができる。

【0011】

本発明のオルガノイドは、非ヒト動物由来であれば特に限定されない。非ヒト動物としては、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。中でも、抗がん評価の実績という観点からは、齧歯類が好ましい。齧歯類としては、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられ、ラット、マウスが好ましい。

【0012】

本発明のオルガノイドは、ドライバー遺伝子が変異している細胞を含むことが好ましい。本発明において、ドライバー遺伝子とは、がん遺伝子・がん抑制遺伝子といった、がんの発生・進展において直接的に重要な役割を果たす遺伝子をいう。ドライバー遺伝子としては、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＡＤ４等が挙げられる。また、本発明において変異とは、特定の遺伝子又はこの遺伝子を含む染色体ＤＮＡ中のヌクレオチドが、置換、欠失、付加、反復、逆位、転座等の修飾を受けることをいう。

【0013】

本発明のオルガノイドにおいては、ＡＰＣと、ＫＲＡＳと、ＴＰ５３及び／又はＴＧＦＢＲ２若しくはＳＭＡＤ４と、が変異していることが好ましい。変異しているドライバー遺伝子の組み合わせとしては、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、及びＴＰ５３；ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、及びＴＧＦＢＲ２；ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、及びＳＭＡＤ４；ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、及びＴＧＦＢＲ２；ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、及びＳＭＡＤ４が挙げられる。
ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＴＧＦＢＲ２、及びＳＭＡＤ４のマウスｃＤＮＡ配列情報を、以下に記載する。
ＡＰＣ NM_007462.3
ＫＲＡＳ NM_021284.6
ＴＰ５３ NM_001127233.1 NM_011640.3
ＴＧＦＢＲ２ NM_009371.3 NM_029575.3
ＳＭＡＤ４ NM_008540.2
上記ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に登録されるＡＰＣ遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号１に示し、ＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＫＲＡＳ遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号３に示し、ＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。ＴＰ５３遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号５及び７に示し、ＴＰ５３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６及び８に示す。ＴＧＦＢＲ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号９及び１１に示し、ＴＧＦＢＲ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０及び１２に示す。ＳＭＡＤ４遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号１３に示し、ＳＭＡＤ４タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。

【0014】

変異型ＡＰＣとしては、一例としてマウスのアミノ酸配列において、７１６番目のコドンに翻訳終止変異が導入されたもの（ＡｐｃΔ７１６）、１６３８番目のコドンに翻訳終止変異が導入されたもの（Ａｐｃ１６３８Ｎ）等が挙げられる。これらの変異は、ヘテロ変異よりホモ変異が好ましい。
変異型ＫＲＡＳとしては、一例としてマウスのアミノ酸配列において、１２番目又は１３番目のコドンに塩基置換変異が導入されたものが挙げられ、Ｇ１２Ｄが好ましい。
変異型ＴＧＦＢＲ２又は変異型ＳＭＡＤ４としては、欠失変異型が好ましい。これらの変異は、ヘテロ変異よりホモ変異が好ましい。両因子は、同一経路に存在するため、いずれか一方の欠失変異があればよい。

【0015】

変異型ＴＰ５３としては、機能獲得（ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）型変異を有するものが好ましい。係る変異としては、一例としてマウスのアミノ酸配列において、１７２番目のコドンに塩基置換変異が導入されたもの（Ｒ１７２Ｈ）、２７０番目のコドンに塩基置換変異が導入されたもの（Ｒ２７０Ｈ）等が挙げられる。係る機能獲得型変異により、変異型ｐ５３は核へ移行し、広範囲の遺伝子の発現を誘導し、細胞に悪性度をもたらすものと考えられる。野生型ｐ５３は、変異型ｐ５３と複合体を形成し、核移行を阻害すると考えられることから、ＴＰ５３における変異は、ヘテロ変異よりホモ変異が好ましい。または、ＬＯＨにより野生型ＴＰ５３が欠失することが好ましい。

【0016】

本発明のオルガノイドが含む細胞の由来は、特に限定されず、種々のがん由来の細胞を用いることができる。がんの種類としては、胆管がん、腸がん、肺がん、胃がん、食道がん、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、骨髄腫、リンパ腫等が挙げられ、腸がんが好ましい。また、腸がんとしては、腸管上皮組織由来のがんが挙げられる。

【0017】

図１（ａ）は、正常免疫下においても転移性を有するオルガノイドの一例の観察像であり、多くのオルガノイドがシスト様の形態を示す。これらオルガノイドの内、一部は図１（ｂ）に示すように、腺管様構造を呈している。

【0018】

本発明のオルガノイドは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３４５であるオルガノイド（以下、「ＡＫＴＰ−３Ｄオルガノイド」という場合がある。）であることが好ましい。本オルガノイドは、今回発明者らが樹立したオルガノイドである。実施例に示すように、本オルガノイドは、免疫不全のＮＯＧマウスに移植しても、正常免疫のＣ５７ＢＬ／６マウスに移植しても腫瘍を形成し、かつ、他臓器へ転移する。
本オルガノイドによって、免疫応答を考慮したがん研究又は抗がん剤について評価研究するための材料が提供される。

【0019】

［細胞株］
本発明の細胞株は、正常免疫の同種非ヒト動物に移植した際に、転移性を有する。実施例で後述するように、本発明の細胞株を３次元培養すると、本発明のオルガノイドと同様の性質を有するオルガノイドを形成する。本発明の細胞株の好ましい構成は、上記［オルガノイド］と同様であるため、その説明を省略する。
図２（ａ）〜（ｂ）は、正常免疫下においても転移性を有する細胞株の一例の観察像である。本発明の細胞株は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３８４である細胞株（以下、「ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β」という場合がある。）であることが好ましい。本細胞株は、今回発明者らが樹立した細胞株である。実施例に示すように、本細胞株は、免疫不全のＮＯＧマウスに移植しても、正常免疫のＣ５７ＢＬ／６マウスに移植しても腫瘍を形成し、かつ、他臓器へ転移する。

【0020】

［非ヒト動物］
本発明の非ヒト動物は、上述した本発明のオルガノイド又は細胞株を備えている。係るオルガノイド又は細胞株を備える手段としては、移植が好ましい。移植箇所としては、特に限定されず、皮下組織内、脾臓、尾静脈等が挙げられる。
非ヒト動物としては、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。中でも、抗がん評価の実績という観点からは、齧歯類が好ましい。齧歯類としては、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられ、ラット、マウスが好ましい。
異種移植の場合には、非ヒト動物は、免疫不全のものが好ましく、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＧマウス）等が挙げられる。
同種移植の場合には、非ヒト動物は、免疫不全のものでも、正常免疫のものでもよく、生理学的な観点から、正常免疫のものが好ましい。
本発明の非ヒト動物は、正常免疫のゼノグラフトモデルとして用いることが可能であるため、本発明の非ヒト動物によって、免疫応答を考慮したがん研究又は抗がん剤について評価研究するための材料が提供される。
更に、実施例で後述するように、本発明の非ヒト動物は、明確なドライバー遺伝子変異だけが導入されたがん細胞の、免疫が正常な個体の転移モデルとして用いることもでき、抗がん剤の評価に好適に用いることができる。

【0021】

［抗がん剤のスクリーニング法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、がん治療薬剤候補物質を上述したオルガノイド、又は、細胞株と接触させて、がん細胞増殖抑制を試験する工程を含む抗がん剤のスクリーニング法を提供する。

【0022】

例えば、化合物ライブラリを、上述したオルガノイド、又は細胞株の培地に添加し、細胞の増殖に対する影響を検討することが挙げられる。より具体的には、例えば、ウェルプレートにオルガノイド、又は細胞株を播種し、化合物ライブラリの存在下で１〜５日間程度培養する。その後、例えばテトラゾリウム塩の還元による発色により、生細胞数を解析することが挙げられる。オルガノイド、又は細胞株の増殖を抑制する化合物は、がん治療薬剤の候補である。テトラゾリウム塩としては、市販の３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）等を利用することができる。

【0023】

（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、上述したオルガノイド、又は細胞株を備えた非ヒト動物にがん治療薬剤候補物質を投与して、がん細胞増殖抑制を試験する工程を含む抗がん剤のスクリーニング法を提供する。

【0024】

例えば、オルガノイド、又は細胞株を移植した免疫正常マウスに経口投与又は非経口投与でがん治療薬剤候補物質を投与する。続いて、がん細胞増殖抑制を試験して、当該がん治療薬剤候補物質の効果を確認する。がん細胞増殖抑制の試験方法としては、例えば、移植されたオルガノイド、又は細胞株に由来するがん組織の大きさ（体積、質量等）を測定すること等が挙げられる。上記がん組織を縮小させるがん治療薬剤候補物質は、がん治療薬剤として利用することができる可能性が高い。

【0025】

［オルガノイドの製造方法］
本発明のオルガノイドの製造方法は、正常免疫の同種非ヒト動物に移植した際に、転移性を有するオルガノイドの製造方法であって、ドライバー遺伝子が変異している非ヒト動物細胞を、転移能を獲得するまで３次元培養し、オルガノイドを得る工程を有する。

【0026】

ドライバー遺伝子としては、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＡＤ４等が挙げられる。本発明のオルガノイドの製造方法において、ＡＰＣと、ＫＲＡＳと、ＴＰ５３及び／又はＴＧＦＢＲ２若しくはＳＭＡＤ４とが変異していることが好ましく、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、及びＴＧＦＢＲ２が変異していることがより好ましい。
また、変異型ＴＰ５３としては、上述した機能獲得（ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）型変異を有するものが好ましい。

【0027】

ドライバー遺伝子が変異している非ヒト動物細胞の調整方法としては、特に限定されず、ゲノム編集法を用いて、非ヒト動物から採取した細胞中のドライバー遺伝子に変異を導入してもよい。ゲノム編集法としては、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムが挙げられる。
または、ドライバー遺伝子が組織特異的に変異している非ヒト動物の前記組織から腫瘍を切り出して、この腫瘍をコラゲナーゼ等で酵素処理して調整してもよい。

【0028】

即ち、一実施形態として、本発明は、正常免疫の同種非ヒト動物に移植した際に、転移性を有するオルガノイドの製造方法であって、ドライバー遺伝子が組織特異的に変異している非ヒト動物の前記組織から腫瘍を切り出して、前記ドライバー遺伝子が変異した細胞を調整する工程１と、前記細胞を、転移能を獲得するまで３次元培養し、オルガノイドを得る工程２と、を有する製造方法を提供する。
以下、各工程について詳細に説明する。

【0029】

［工程１］
変異を有するドライバー遺伝子の組み合わせとしては、上述した通り、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、及びＴＧＦＢＲ２の組み合わせが好ましい。これら複数のドライバー遺伝子が組織特異的に変異した非ヒト動物を得るためには、各ドライバー遺伝子が変異した非ヒト動物を交配させることが好ましい。
また、組織特的に変異を導入するためには、組織特異的に部位特異的組み換え酵素を発現している非ヒト動物と、コンディショナルノックアウト非ヒト動物及びコンディショナルトランスジェニック非ヒト動物からなる群から選ばれる少なくとも１種と、を交配してなる非ヒト動物を用いることが好ましい。
コンディショナルノックアウト非ヒト動物としては、欠損させたい標的遺伝子の少なくとも一部を部位特異的組み換え酵素認識配列で挟んだ染色体を有する非ヒト動物が挙げられる。
コンディショナルトランスジェニック非ヒト動物としては、変異を有する標的遺伝子の上流に部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む遺伝子を含む染色体を有する非ヒト動物が挙げられる。
部位特異的組み換え酵素としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐｅ、Ｄｒｅ等が挙げられる。部位特異的組み換え酵素が認識する部位特異的酵素認識配列としては、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ 、ｒｏｘが挙げられる。
また、部位特異的組み換え酵素と変異エストロゲン受容体（ＥＲ）との融合タンパク質を用いてもよい。一例として、Ｃｒｅ−ＥＲタンパク質は通常細胞質に存在するが、エストロゲン誘導体であるタモキシフェンと結合することにより核内に移行し、ｌｏｘＰ配列に対して組換えを起こす。これを利用してＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムの働く時期をタモキシフェン依存的に調節することが可能である。

【0030】

変異を導入する組織としては、特に限定されず、胆管、腸、肺、胃、食道、乳、膀胱、前立腺等のあらゆる組織が挙げられるが、腸管が好ましい。

【0031】

［工程２］
工程２は、工程１で調整した細胞を、転移能を獲得するまで３次元培養し、オルガノイドを得る工程である。
本発明において、３次元培養とは、細胞外マトリクス存在下で細胞を培養する方法をいう。細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられ、マトリゲルが好ましい。
３次元培養に用いられる培地としては、特に限定されず、従来公知の培地が用いられる。

【0032】

工程２において、３次元培養する期間としては、「転移性能を獲得するまで培養する期間」であり、３か月以上が好ましく、４か月以上がより好ましい。正常免疫の同種非ヒト動物に移植した際に、転移性を有するためには、ドライバー遺伝子の変異だけではなく、ドライバー遺伝子の変異に起因したエピジェネティックな変化等の２次的な変化を必要とするものと考えられる。

【0033】

［細胞株の製造方法］
本発明の細胞株の製造方法は、正常免疫の同種非ヒト動物に移植した際に、転移性を有する細胞株の製造方法であって、上述したオルガノイドの製造方法を用いて得られたオルガノイドを２次元培養する工程を有する。
上述したオルガノイドの製造方法を用いて得られたオルガノイドを、２次元培養し、増えてきた細胞をトリプシン処理等により単一の細胞に分離後クローニングすることにより、細胞株を樹立することができる。

【実施例】

【0034】

次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

【0035】

［実験例１］
（オルガノイドの樹立）
ヒト大腸がん発生と悪性化に関わるドライバー遺伝子、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ５３に対応するマウス遺伝子、Ａｐｃ、Ｋｒａｓ、Ｔｇｆｂｒ２、Ｔｒｐ５３の各遺伝子を腸管上皮細胞で欠損又は変異させるため、Ａｐｃ^Δ７１６マウス（Oshima. et. al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,4482-4486,1995）、ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウス（Mouse Repository 01XJ6 NCI-Frederick）、Ｔｇｆｂｒ２^ｆｌｏｘマウス（Mouse Repository 01XN5 NCI-Frederick）、Ｔｒｐ５３^{ＬＳＬ Ｒ２７０Ｈ}マウス（Mouse Repository 01XM3 NCI-Frederick）、及びｖｉｌｌｉｎ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス（el Marjou F. et. al.,Genesis 39,186-193,2004）の５系統のマウスモデルを交配し、Ｔｇｆｂｒ２ ｆｌｏｘ以外の４種類がヘテロ、Ｔｇｆｂｒ２ ｆｌｏｘはホモのマウス（Ａｐｃ^{＋/Δ７１６}，ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ，Ｔｇｆｂｒ２^{ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ}，Ｔｒｐ５３^{＋/ ＬＳＬ Ｒ２７０Ｈ}，Ｖｉｌｌｉｎ−ＣｒｅＥＲＴ２）を作製した。
このマウスにタモキシフェンを投与したところ、腸管上皮細胞特異的にＣｒｅＥＲが核に移行し、ゲノム上のｆｌｏｘ領域を切り出されて、腸管上皮細胞の遺伝子型はＡｐｃ^{＋/Δ７１６}，Ｋ−ｒａｓ^{＋/Ｇ１２Ｄ}，Ｔｇｆｂｒ２^−/−，Ｔｒｐ５３^{＋/ Ｒ２７０Ｈ}となった。
さらに、細胞分裂の過程で正常Ａｐｃ遺伝子が欠損し、遺伝子型はＡＰＣ^{−/Δ７１６}，Ｋ−ｒａｓ^{＋/Ｇ１２Ｄ}，Ｔｇｆｂｒ２^−/−，Ｔｒｐ５３^{＋/ Ｒ２７０Ｈ}となり、４重遺伝子変異の導入により、浸潤性腸腫瘍が発生した。
この４重変異マウスモデルに発生した腫瘍組織を切り出して、コラゲナーゼ処理した後、マトリゲル中でｍＥＧＦ、及びｍＮｏｇｇｉｎを添加したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（３Ｄ培地）で培養した。オルガノイドはシスト様の形態を示して成長した（図１（ａ）参照。）。約１週間おきにオルガノイドをピペットにより機械的に破砕して、新しいマトリゲルに植え継ぎ、４か月間継代培養する間に、オルガノイドは一部、腺管様構造に変化した（図１（ｂ）参照。）。このオルガノイドを独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２３４５、細胞名「ＡＫＴＰ−３Ｄ」）。
なお、このオルガノイドについては、独立行政法人製品評価技術基盤機構に対し、国内寄託から国際寄託への移管の申請を行い、２０１７年８月２５日に受領されている（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３４５）。

【0036】

培養に用いた３Ｄ培地の組成を以下に示す。
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１×ＧｌｕｔａＭａｘ(Ｇｉｂｃｏ)、１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ Ｂｕｆｆｅｒ(Ｇｉｂｃｏ)、１×Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ(Ｇｉｂｃｏ)、１×Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ(Ｇｉｂｃｏ)、１ｍＭ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎ(Ｇｉｂｃｏ)、０．１μｇ／ｍｌ ｍＮｏｇｇｉｎ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５μｇ／ｍｌ ｍＥＧＦ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)、１×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ(Ｗａｋｏ)

【0037】

［実験例２］
（細胞株の樹立）
実験例１と同様の方法で、３か月間、３次元培養にて継代培養して得られたオルガノイドを、コラーゲンコートしたディッシュ上で、ＦＢＳと３種類のインヒビター（ＧＳＫインヒビター, ＡＬＫインヒビター, ＲＯＣＫインヒビター）を加えた３Ｄ培地（Ｆ３ｉ−３Ｄ培地；上記３Ｄ培地、ＦＢＳ、 Ａ−８３０１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ−２７６３２）で２次元培養し、増えてきた細胞をトリプシン処理により単一の細胞に分離後クローニングし、マウス腸管上皮腫瘍細胞株（ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β及びＡＫＴＰ−２Ａ６）を樹立した。ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β及びＡＫＴＰ−２Ａ６は、ＦＢＳ及び上記３種類のインヒビターを加えたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｆ３ｉ−Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆ１２培地；ＦＢＳ、 Ａ−８３０１、ＣＨＩＲ９９０２１、 Ｙ−２７６３２、 Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で維持した。図２（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ樹立した細胞株ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β及びＡＫＴＰ−２Ａ６の観察像である。
これら細胞株を独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２３８４、細胞名「ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β」；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２３８５、細胞名「ＡＫＴＰ−２Ａ６」）。
なお、このＡＫＴＰ−１Ｃ９−βについては、独立行政法人製品評価技術基盤機構に対し、国内寄託から国際寄託への移管の申請を行い、２０１７年８月２５日に受領されている（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３８４）。
これら細胞株は、マトリゲル中ではシスト様及び腺管様のオルガノイドを形成するなど、３次元培養条件下では上皮様の構造を維持できることが確認された。

【0038】

［実験例３］
（オルガノイドを移植したＮＯＧマウス）
４か月培養後の腺管様オルガノイドを、ＮＯＧマウスの皮下に移植すると、腫瘍の形成が確認された。
また、３次元培養直後のシスト様オルガノイドと、４か月培養後の腺管様オルガノイドのそれぞれを、ＮＯＧマウスの脾臓に移植すると、後者だけ肝臓への転移が認められた。４か月培養後の腺管様オルガノイドを移植したＮＯＧマウスから採取した肝臓を図３に示す。図３中、矢印は転移箇所を示す。
また、この腺管様オルガノイドを、尾静脈から血中にインジェクションすると、肺に転移する事も認められた。
３次元培養直後のシスト様オルガノイドと、４か月培養後の腺管様オルガノイドではＤＮＡメチル化パターンに違いが認められ、オルガノイドを４か月培養する間にエピジェネティックな変化が導入されていることが確認された。

【0039】

［実験例４］
（マウス腸管上皮腫瘍細胞株を移植したＮＯＧマウス）
実験例２で樹立したマウス腸管上皮腫瘍細胞株（ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β）を、ＮＯＧマウスの皮下に移植すると、腫瘍の形成が確認された。
また、このマウス腸管上皮腫瘍細胞株を、ＮＯＧマウスの脾臓に移植すると、肝臓への転移が認められた。
また、このマウス腸管上皮腫瘍細胞株を、尾静脈から血中にインジェクションすると、肺に転移する事も認められた。

【0040】

［実験例５］
（オルガノイド又はマウス腸管上皮腫瘍細胞株を移植したＣ５７ＢＬ／６マウス）
実験例１で樹立したオルガノイド（ＡＫＴＰ−３Ｄ）、及び実験例２で樹立したマウス腸管上皮腫瘍細胞株（ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β）のそれぞれを、免疫が正常なＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓に移植すると、ともに肝臓への転移が認められた。
オルガノイド（ＡＫＴＰ−３Ｄ）を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した肝臓を図４に示す。図４中、矢印は転移箇所を示す。
本発明のオルガノイド又は細胞株は、正常免疫下においても転移性を有することが確認された。本発明の非ヒト動物は、明確なドライバー遺伝子変異だけが導入された大腸がん細胞の、免疫正常マウスでの転移モデルとして用いることもできる。係る転移モデルは、世界に例が無く、抗がん剤の評価に大変重要なモデルになり得る。

【0041】

［実験例６］
（ＬＯＨ解析）
実験例１で樹立したオルガノイド（ＡＫＴＰ−３Ｄ；図５中、Ｍａｔｒｉｇｅｌと表記）、このオルガノイドを２次元培養した、継代１回目の細胞（図５中、１^ｓｔと表記）、２回目の細胞（図５中、２^ｎｄと表記）、及び実験例２で樹立したマウス腸管上皮腫瘍細胞株（ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β；図５中、２Ｄ１Ｃ９と表記）を用いてＧｅｎｏｍｉｃＰＣＲを行った。結果を図５に示す。図５中、数値は、変異型Ｔｒｐ５３（Ｒ２７０Ｈ；図５中、Ｍｕｔ ｐ５３と表記）のシグナル強度を１としたときの、野生型Ｔｒｐ５３（図５中、Ｗｉｌｄ ｐ５３と表記）のシグナル強度を示す。
図５に示すように、２次元培養の継代を重ねる度に、野生型Ｔｒｐ５３の割合が減少していくことが確かめられた。正常幹細胞や良性腫瘍細胞は、オルガノイド培養により培養出来るが、２次元培養ではがん細胞形質を獲得したか不死化した細胞しか継代できない。実験例１で樹立したオルガノイド（ＡＫＴＰ−３Ｄ）のＴｒｐ５３遺伝子は、Ｒ２７０Ｈ/＋のヘテロだが、実験例２で樹立したマウス腸管上皮腫瘍細胞株のＴｒｐ５３遺伝子は、ＬＯＨにより野生型（＋）遺伝子が欠失していることが、確かめられた。

【0042】

［実験例７］
（軟寒天コロニーアッセイ）
実験例１で樹立したオルガノイド（ＡＫＴＰ−３Ｄ）、及び実験例２で樹立したマウス腸管上皮腫瘍細胞株（ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β；図６中、ＡＫＴＰ−２Ｄと表記）のそれぞれを、軟寒天中に播いて培養し、形成されたコロニー数をカウントした。更に、同じ面積の視野内で形成されたコロニー数を、コロニー及びコロニーとして形成しなかった細胞塊を母数として除した値を%表示した。結果を図６に示す。
図６に示すように、実験例２で樹立したマウス腸管上皮腫瘍細胞株（ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β）の方が強い腫瘍原性の性質を持っていることが確認された。

【0043】

実験例６及び７の結果から、実験例２で樹立したマウス腸管上皮腫瘍細胞株の遺伝子型は、野生型（＋）遺伝子が欠失することで、ヒトの大腸がん細胞を忠実に再現するのと同時に、２次元の培養条件でも継代可能な悪性化形質を獲得したことが確かめられた。

【産業上の利用可能性】

【0044】

本発明により、がん研究又は抗がん剤の評価研究のための手段を提供することができる。より具体的には、オルガノイド、細胞株、非ヒト動物、抗がん剤のスクリーニング方法、オルガノイドの製造方法を提供することができる。

【受託番号】

【0045】

オルガノイド（細胞名「ＡＫＴＰ−３Ｄ」）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、「受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２３４５」として寄託されている。このオルガノイド（細胞名「ＡＫＴＰ−３Ｄ」）については、独立行政法人製品評価技術基盤機構に対し、国内寄託から国際寄託への移管の申請を行い、２０１７年８月２５日に受領されている（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３４５）。

【0046】

細胞株（細胞名「ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β」）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、「受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２３８４」として寄託されている。この細胞株（細胞名「ＡＫＴＰ−１Ｃ９−β」）については、独立行政法人製品評価技術基盤機構に対し、国内寄託から国際寄託への移管の申請を行い、２０１７年８月２５日に受領されている（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０２３８４）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]