特許 6846524 移植による、寿命の増強および／または細胞増殖性障害の治療のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6846524

(24)【登録日】2021年3月3日

(45)【発行日】2021年3月24日

(54)【発明の名称】移植による、寿命の増強および／または細胞増殖性障害の治療のための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20210315BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210315BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20210315BHJP

   C07K 14/475 20060101ALI20210315BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210315BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20210315BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20210315BHJP

   C12N 5/074 20100101ALN20210315BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALN20210315BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/28ZNA

   C12N5/10

   C12N5/0789

   C07K14/475

   A61P35/00

   A61P35/04

   !C12N15/86 Z

   !C12N5/074

   !C12N5/0735

【請求項の数】18

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2019-535208(P2019-535208)

(86)(22)【出願日】2017年9月13日

(65)【公表番号】特表2019-532099(P2019-532099A)

(43)【公表日】2019年11月7日

(86)【国際出願番号】US2017051310

(87)【国際公開番号】WO2018052964

(87)【国際公開日】20180322

【審査請求日】2019年4月24日

(31)【優先権主張番号】62/393,665

(32)【優先日】2016年9月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】596118493

【氏名又は名称】アカデミア シニカ

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】シェン， チェ−クン ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】シュー， ユ−チャウ

(72)【発明者】

【氏名】ハン， チュン−ハオ

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１６／０３６７２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００３−５１７３０１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／００ −３５／７６８

Ａ６１Ｐ ３５／００ −３５／０４

Ｃ１２Ｎ ５／００ − ５／２８

Ｃ１２Ｎ １５／００ −１５／９０

Ｃ０７Ｋ １４／００ −１９／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験体の長寿性を増加させ、ならびに／あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法において使用するための、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を含む組成物であって、該ＬＴ−ＨＳＣは、以下：
（ａ）野生型ヒトＥＫＬＦの５４位に相当するリシン（Ｋ）残基のアルギニン（Ｒ）による置換、または野生型マウスＥＫＬＦの７４位に相当するリシン（Ｋ）残基のアルギニン（Ｒ）による置換を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子（Ｅｋｌｆ）遺伝子を有するように胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）および／または臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）を遺伝的に操作する工程、
（ｂ）該遺伝的に操作されたＥＳＣ、ｉＰＳＣおよび／またはＣＳＢＣを分化させ、該ＬＴ−ＨＳＣを得る工程
の工程から調製されたものであり、
該ＬＴ−ＨＳＣは、Ｌｉｎ⁻、ＣＤ１１７^＋、Ｓｃａ−１^＋、Ｔｈｙ１．１^ｌｏ、Ｆｌｋ２⁻、ＣＤ３４⁻として同定され、
該腫瘍が、メラノーマである、組成物。

【請求項2】

前記改変ＥＫＬＦポリペプチドが、全長野生型マウスＥＫＬＦポリペプチドの６８位に相当するアミノ酸の改変を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記細胞が、前記改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードするウイルスベクターの使用により、前記改変ＥＫＬＦポリペプチドを発現するように形質導入されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクチニアウイルス、弱毒化ワクチニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに由来する、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記細胞が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）系の使用により、前記改変ＥＫＬＦポリペプチドを発現するように形質導入されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記改変ＥＫＬＦポリペプチドの前記発現が、寿命の増強、抗転移性、および／または抗腫瘍形成性を引き起こす、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

前記ＥＫＬＦがＬＴ−ＨＳＣ内で比較的高いレベルで発現され、そして、ＥＫＬＦの枯渇が異なる型の造血／血液細胞の集団変化を引き起こす、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記ＥＫＬＦが、ＬＴ−ＨＳＣおよび前記造血前駆細胞内で、コロニー刺激因子２受容体サブユニットＣｓｆ２ｒｂの発現を負に調節する、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

受取被験体の長寿性を増加させ、ならびに／あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法において使用するための、骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を含む組成物であって、該ＢＭＭＮＣは、以下：（ａ）野生型ヒトＥＫＬＦの５４位に相当するリシン（Ｋ）残基のアルギニン（Ｒ）による置換、または野生型マウスＥＫＬＦの７４位に相当するリシン（Ｋ）残基のアルギニン（Ｒ）による置換を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を含むドナー被験体から骨髄を回収する工程、ならびに（ｂ）該１つまたは複数の改変ｅｋｌｆ遺伝子を持つ長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を含む骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を単離する工程、の工程から調製されたものであり、該ＬＴ−ＨＳＣは、Ｌｉｎ⁻、ＣＤ１１７^＋、Ｓｃａ−１^＋、Ｔｈｙ１．１^ｌｏ、Ｆｌｋ２⁻、ＣＤ３４⁻として同定され、該腫瘍が、メラノーマである、組成物。

【請求項10】

前記改変ＥＫＬＦポリペプチドが、全長野生型マウスＥＫＬＦポリペプチドの６８位に相当するアミノ酸の改変を含む、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記ＥＫＬＦがＬＴ−ＨＳＣ内で比較的高いレベルで発現され、そして、ＥＫＬＦの枯渇が異なる型の造血／血液細胞の集団変化を引き起こす、請求項９に記載の組成物。

【請求項12】

前記ＥＫＬＦが、ＬＴ−ＨＳＣおよび造血前駆細胞内で、コロニー刺激因子２受容体サブユニットＣｓｆ２ｒｂの発現を負に調節する、請求項９に記載の組成物。

【請求項13】

前記細胞が、前記改変ＥＫＬＦポリペプチドを発現するように遺伝的に変更された動物から得られたものである、請求項９に記載の組成物。

【請求項14】

前記造血前駆細胞が、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、顆粒球／マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）または骨髄系／赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）である、請求項８または１２に記載の組成物。

【請求項15】

前記ＥＫＬＦが、部分的にＬＴ−ＨＳＣが下流の造血前駆細胞へと過剰に分化することを防ぐことにより、ＬＴ−ＨＳＣの恒常性を維持する、請求項８または１２に記載の組成物。

【請求項16】

野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸の改変を含むＥＫＬＦポリペプチドをコードする遺伝子を有する長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）であって、該１つまたは複数のアミノ酸の改変が、全長野生型ヒトＥＫＬＦの５４位または全長野生型マウスＥＫＬＦポリペプチドの７４位に相当するアミノ酸の改変を含み、そして５４位または７４位に相当する該アミノ酸の該改変が、Ｌｙｓの、Ａｒｇによる（Ｋ５４ＲもしくはＫ７４Ｒ）置換である、ＬＴ−ＨＳＣ。

【請求項17】

１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を持ち、そして発現する、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、（ａ）野生型ヒトＥＫＬＦの５４位に相当するリシン（Ｋ）残基のアルギニン（Ｒ）による置換、または野生型マウスＥＫＬＦの７４位に相当するリシン（Ｋ）残基のアルギニン（Ｒ）による置換を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を有するようにＥＳＣ、ｉＰＳＣ、および／またはＣＢＳＣを遺伝的に操作すること、ならびに（ｂ）該遺伝的に操作されたＥＳＣ、ｉＰＳＣ、および／またはＣＳＢＣを分化させ、該１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を持ち、そして発現するＬＴ−ＨＳＣを得ることを含み、ここで、該ＬＴ−ＨＳＣは健康な長寿性および／または腫瘍抵抗性もしくは転移抵抗性を与え、該腫瘍が、メラノーマである、方法。

【請求項18】

腫瘍抵抗性および健康な長寿性の性質を有する１つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子（ｅｋｌｆ）遺伝子を発現する長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、（ａ）野生型ヒトＥＫＬＦの５４位に相当するリシン（Ｋ）残基のアルギニン（Ｒ）による置換、または野生型マウスＥＫＬＦの７４位に相当するリシン（Ｋ）残基のアルギニン（Ｒ）による置換を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つもしくは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を有するように骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を遺伝的に操作すること、ならびに（ｂ）該１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を持つＬＴ−ＨＳＣを単離することを含み、該腫瘍が、メラノーマである、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年９月１３日に出願された米国仮出願第６２／３９３、６６５号の利益を主張し、当該出願は、その全体が本出願において参考として援用される。

【0002】

配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、紙の複写物に代わってテキスト形式で提供され、ここで、本明細書に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＬＥＬＩＷＯＴＥＭＰ＿ＳＱＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは４ＫＢであり、２０１７年９月１３日に作成されており、そしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

【0003】

発明の分野
本発明は幹細胞の分野に関する。特に本発明は、ＥＫＬＦポリペプチドをコードする改変されたＥｋｌｆ遺伝子を持つ、造血幹細胞（ＨＳＣ）ならびに／あるいは造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の移植（例えば、骨髄移植または多能性幹細胞移植など）を通じて、被験体に腫瘍抵抗性および健康な長寿性を移譲することに関する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
造血とは、造血／血液系が複数の型の骨髄系およびリンパ系の血液細胞を生み出す過程である。リンパ系および骨髄系の分化系列決定は、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、骨髄系／赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、顆粒球／マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）、およびリンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）を含む多能性造血前駆細胞において生じ、ＭＰＰは、造血幹細胞（ＨＳＣ）の自己複製と分化を介して生じる。ＨＳＣは恒常的な状態において、主にＧ０期にある。造血細胞系のまさに頂点として、ＨＳＣは造血における重要な役割を果たし、その恒常性の調節は、様々な造血系／血液細胞の下流の運命を決定する。とりわけ、いくつかのサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦなど）および転写因子（例えば、Ｎｏｔｃｈ１、Ｔａｌ−１、ＨｏｘＢ４、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２およびＧＡＴＡ３など）がＨＳＣおよび造血前駆細胞の恒常性の調節に関与する。純化されたＨＳＣの形態的および機能的な特性について、広範に特徴付けされている。また、ＨＳＣの自己再生、維持およびそして分化の調節についても、分子および細胞レベルでのいくつかの研究が報告されている。

【0005】

長寿性遺伝子は、その寿命延長の潜在性および生活の質を向上しうる可能性の両点から、明らかに興味深く、そして重要である。しかし、ごくわずかな長寿性遺伝子のみが同定されており、そしてこれらの遺伝子がどのようにして、加齢を防ぐために、および寿命を延長するために振る舞うのかについては、なおさらわかっていない。国際公開第２０１６／０３６７２７号は、野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子（ＥＫＬＦ）遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。遺伝的に変更されたＥＫＬＦマウスは寿命の延長、健康寿命の延長、ならびにがんの発生および／または転移に対する抵抗性を示す。したがって、改変されたＥｋｌｆ遺伝子およびその産物は、加齢の予防および腫瘍の治療に有用である。
ＥＫＬＦ／ＫＬＦ１は、Ｎ末端活性化ドメイン、Ｃ末端ジンクフィンガードメイン、および複数の翻訳後修飾部位からなるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ因子ファミリーの第一のメンバーである。マウス胎児の肝臓のゲノムワイド解析では、特定の調節領域へのＥＫＬＦのＤＮＡ結合を介してそれらの活性化または抑制が調節される、いくつかの遺伝子が同定されている。ＥＫＬＦ／ＫＬＦ１は当初、赤血球系に特異的な転写因子として同定されたが、のちに巨核球ならびにＭＥＰ、ＧＭＰおよびＣＭＰを含む造血前駆細胞にも発現することが発見された（Ｆｒｏｎｔｅｌｏ， Ｐ．， Ｍａｎｗａｎｉ， Ｄ．， Ｇａｌｄａｓｓ， Ｍ．， Ｋａｒｓｕｎｋｙ， Ｈ．， Ｌｏｈｍａｎｎ， Ｆ．， Ｇａｌｌａｇｈｅｒ， Ｐ．Ｇ．， ａｎｄ Ｂｉｅｋｅｒ， Ｊ．Ｊ． （２００７）． Ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＥＫＬＦ ｉｎ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ． Ｂｌｏｏｄ １１０， ３８７１−３８８０）。機能損失および機能増強研究は、ＥＫＬＦが赤血球生成の過程だけではなく（Ｐｏｒｃｕ， Ｓ．， Ｍａｎｃｈｉｎｕ， Ｍ．Ｆ．， Ｍａｒｏｎｇｉｕ， Ｍ．Ｆ．， Ｓｏｇｏｓ， Ｖ．， Ｐｏｄｄｉｅ， Ｄ．， Ａｓｕｎｉｓ， Ｉ．， Ｐｏｒｃｕ， Ｌ．， Ｍａｒｉｎｉ， Ｍ．Ｇ．， Ｍｏｉ， Ｐ．， Ｃａｏ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｋｌｆ１ ａｆｆｅｃｔｓ ＤＮａｓｅ ＩＩ−ａｌｐｈａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｏｆ ａ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｉｓｌａｎｄ： ａ ｎｏｎ−ｃｅｌｌ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３１， ４１４４−４１５４）、ＭＥＰから赤血球または巨核球への分化運命の決定も調節していることを示している。
しかしながら、ＥＫＬＦが、巨核球−赤血球の分離および単球からのマクロファージ化以外の造血の調節に関わるかどうか、そして、どれほど広範に関わるのかについては不明のままである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２０１６／０３６７２７号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｆｒｏｎｔｅｌｏ， Ｐ．， Ｍａｎｗａｎｉ， Ｄ．， Ｇａｌｄａｓｓ， Ｍ．， Ｋａｒｓｕｎｋｙ， Ｈ．， Ｌｏｈｍａｎｎ， Ｆ．， Ｇａｌｌａｇｈｅｒ， Ｐ．Ｇ．， ａｎｄ Ｂｉｅｋｅｒ， Ｊ．Ｊ． （２００７）． Ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＥＫＬＦ ｉｎ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ． Ｂｌｏｏｄ １１０， ３８７１−３８８０

【非特許文献2】Ｐｏｒｃｕ， Ｓ．， Ｍａｎｃｈｉｎｕ， Ｍ．Ｆ．， Ｍａｒｏｎｇｉｕ， Ｍ．Ｆ．， Ｓｏｇｏｓ， Ｖ．， Ｐｏｄｄｉｅ， Ｄ．， Ａｓｕｎｉｓ， Ｉ．， Ｐｏｒｃｕ， Ｌ．， Ｍａｒｉｎｉ， Ｍ．Ｇ．， Ｍｏｉ， Ｐ．， Ｃａｏ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｋｌｆ１ ａｆｆｅｃｔｓ ＤＮａｓｅ ＩＩ−ａｌｐｈａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｏｆ ａ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｉｓｌａｎｄ： ａ ｎｏｎ−ｃｅｌｌ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３１， ４１４４−４１５４

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の要約
本発明は第一に、造血転写因子ＥＫＬＦをコードする遺伝的に操作されたＥｋｌｆ遺伝子からなる、骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）／造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の移植により、腫瘍抵抗性および他の健康で長寿性な性質を移譲することの実行可能性に関する。第二に、本発明は、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）におけるＥＫＬＦの発現、そして、したがって造血調節の標的としてのＥＫＬＦの実証に関する。

【0009】

造血系の恒常性は、ＬＴ−ＨＳＣの自己複製および分化能のある他の造血前駆細胞の増殖とのバランスに部分的に依存する。この分化能は、種々のサイトカインおよびシグナル伝達経路によって調整される。本発明は、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）において比較的高いレベルでＥＫＬＦが発現されることを見出した。このＬＴ−ＨＳＣは造血／血液系の分化プログラムのまさに頂点にある。本発明は、ＥＫＬＦの枯渇が異なる型の造血／血液細胞の集団の変化、特にＬＴ−ＨＳＣの減少および造血前駆細胞の増加を引き起こすことも見出した。したがって、造血転写因子ＥＫＬＦをコードする遺伝的に操作されたＥｋｌｆ遺伝子を持つＨＳＣ／ＨＳＰＣの骨髄移植または幹移植によって、腫瘍抵抗性および健康な長寿性が移譲され得る。

【0010】

したがって、本発明は、被験体の長寿性を増加させ、ならびに／あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法であって、（ａ）野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子（Ｅｋｌｆ）遺伝子を有するように胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）および／または臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）を遺伝的に操作すること、（ｂ）遺伝的に操作されたＥＳＣ、ｉＰＳＣおよび／またはＣＳＢＣを分化させ、造血幹細胞（ＨＳＣ）ならびに／あるいは造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を得ること、ならびに（ｃ）ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを被験体に移植することを含み、これにより、移植されたＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣは、健康な長寿性ならびに／あるいは腫瘍抵抗性または転移への抵抗性を被験体に与える、方法を提供する。

【0011】

本発明はまた、被験体の長寿性を増加させ、ならびに／あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法であって、（ａ）野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を含むドナー被験体から骨髄を回収すること、（ｂ）１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を持つ、ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣ ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを含む骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を単離すること、ならびに（ｃ）受取被験体にＢＭＭＮＣを移植することを含み、これにより、受取被験体は腫瘍抵抗性および／または健康な長寿性を与えられる、方法も提供する。

【0012】

したがって、本発明は、野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸の改変を含むＥＫＬＦポリペプチドをコードする遺伝子により操作された細胞であって、当該細胞は、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、ＣＢＳＣ、ＨＳＣ、ＨＳＰＣまたはＢＭＭＮＣである、細胞を提供する。

【0013】

いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の改変は全長の野生型のマウスＥＫＬＦポリペプチドにおいて７４位に相当するアミノ酸の改変を含む。マウス以外の動物に関する特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の改変は、マウスのＥＫＬＦポリペプチド内のこのアミノ酸残基に相当するＳＵＭＯ化されるアミノ酸残基の改変を含むが、これは異なる位置にあり得る。例えば、ヒトのＥＫＬＦポリペプチドにおいて、マウスのＥＫＬＦポリペプチド内の７４位に相当するＳＵＭＯ化部位はアミノ酸残基５４にある。特定の実施形態では、このアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。特定の実施形態では、５４位または７４位に相当するアミノ酸の改変は、ＬｙｓをＡｒｇ（Ｋ５４ＲもしくはＫ７４Ｒ）または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸に置換するものである。

【0014】

いくつかの実施形態では、改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードするウイルスベクターの使用により、またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）系の使用により、細胞は改変ＥＫＬＦポリペプチドを発現するよう形質導入される。

【0015】

１つの実施形態では、改変ＥＫＬＦポリペプチドの発現は、寿命の増強、抗転移性、および／または抗腫瘍形成性を引き起こす。

【0016】

１つの実施形態では、ＬＴ−ＨＳＣ内でＥＫＬＦが比較的高いレベルで発現し、そして、ＥＫＬＦの枯渇は異なる型の造血／血液細胞の集団の変化を引き起こす。他の実施形態では、ＥＫＬＦは、ＬＴ−ＨＳＣおよび造血前駆細胞（例えばＭＰＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＭＥＰ）内のコロニー刺激因子２受容体サブユニットＣｓｆ２ｒｂの発現を負に調節する。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
被験体の長寿性を増加させ、ならびに／あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法であって、
（ａ）野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子（Ｅｋｌｆ）遺伝子を有するように胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）および／または臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）を遺伝的に操作すること、
（ｂ）該遺伝的に操作されたＥＳＣ、ｉＰＳＣおよび／またはＣＳＢＣを分化させ、造血幹細胞（ＨＳＣ）ならびに／あるいは造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を得ること、ならびに
（ｃ）該ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを被験体に移植することを含み、
これにより、移植された該ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣは、健康な長寿性ならびに／あるいは腫瘍抵抗性または転移への抵抗性を該被験体に与える、方法。
（項目２）
前記野生型ＥＫＬＦポリペプチドが、野生型ヒトＥＫＬＦまたは野生型マウスＥＫＬＦまたは他の脊椎動物の野生型ＥＫＬＦである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記改変マウスＥＫＬＦポリペプチドが、前記野生型マウスＥＫＬＦの７４位に相当するリシン（Ｋ）残基の、アルギニン（Ｒ）、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記改変ヒトＥＫＬＦポリペプチドが、前記野生型ヒトＥＫＬＦの５４位に相当するリシン（Ｋ）残基の、アルギニン（Ｒ）、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記改変ＥＫＬＦポリペプチドが、前記マウスＥＫＬＦのＫ７４、および前記ヒトＥＫＬＦのＫ５４にオーソロガスなＳＵＭＯ化可能部位に相当するリシン（Ｋ）残基の、アルギニン（Ｒ）、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む改変脊椎動物ＥＫＬＦポリペプチドであり、該脊椎動物がマウスまたはヒトではない、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記１つまたは複数のアミノ酸の改変が、全長野生型マウスＥＫＬＦポリペプチドの６８位に相当するアミノ酸の改変を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記細胞が、前記改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードするウイルスベクターの使用により、前記改変ＥＫＬＦポリペプチドを発現するように形質導入される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクチニアウイルス、弱毒化ワクチニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに由来する、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記細胞が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）系の使用により、前記改変ＥＫＬＦポリペプチドを発現するように形質導入される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記改変ＥＫＬＦポリペプチドの前記発現が、寿命の増強、抗転移性、および／または抗腫瘍形成性を引き起こす、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＥＫＬＦがＬＴ−ＨＳＣ内で比較的高いレベルで発現され、そして、ＥＫＬＦの枯渇が異なる型の造血／血液細胞の集団変化を引き起こす、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＥＫＬＦが、ＬＴ−ＨＳＣおよび前記造血前駆細胞（例えば、ＭＰＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、およびＭＥＰ）内で、コロニー刺激因子２受容体サブユニットＣｓｆ２ｒｂの発現を負に調節する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記腫瘍が、肝臓がん、大腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞がん、メラノーマ、肺がん、神経芽細胞腫、脳腫瘍、造血器悪性腫瘍、網膜芽細胞腫、腎細胞がん、頭部および頸部がん、子宮頸がん、すい臓がん、食道がん、または扁平上皮がんである、項目１に記載の方法。ある好ましい例では、該細胞増殖性障害は、メラノーマである。
（項目１４）
受取被験体の長寿性を増加させ、ならびに／あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法であって、（ａ）野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を含むドナー被験体から骨髄を回収すること、（ｂ）該１つまたは複数の改変ｅｋｌｆ遺伝子を持つ、ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣ ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを含む骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を単離すること、ならびに（ｃ）受取被験体に該ＢＭＭＮＣを移植することを含み、これにより、該受取被験体は腫瘍抵抗性および／または健康な長寿性を与えられる、方法。
（項目１５）
前記野生型ＥＫＬＦポリペプチドが、野生型ヒトＥＫＬＦまたは野生型マウスＥＫＬＦまたは他の脊椎動物の野生型ＥＫＬＦである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記改変マウスＥＫＬＦポリペプチドが、前記野生型マウスＥＫＬＦの７４位に相当するリシン（Ｋ）残基の、アルギニン（Ｒ）、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記改変ヒトＥＫＬＦポリペプチドが、前記野生型ヒトＥＫＬＦの５４位に相当するリシン（Ｋ）残基の、アルギニン（Ｒ）、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記改変ＥＫＬＦポリペプチドが、前記マウスＥＫＬＦのＫ７４、およびヒトＥＫＬＦのＫ５４にオーソロガスなＳＵＭＯ化可能部位に相当するリシン（Ｋ）残基の、アルギニン（Ｒ）、または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む改変脊椎動物ＥＫＬＦポリペプチドであり、該脊椎動物がマウスまたはヒトではない、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記１つまたは複数のアミノ酸の改変が、前記全長野生型マウスＥＫＬＦポリペプチドの６８位に相当するアミノ酸の改変を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記ＥＫＬＦがＬＴ−ＨＳＣ内で比較的高いレベルで発現され、そして、ＥＫＬＦの枯渇が異なる型の造血／血液細胞の集団変化を引き起こす、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
前記ＥＫＬＦが、ＬＴ−ＨＳＣおよび前記造血前駆細胞（例えば、ＭＰＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、およびＭＥＰ）内で、コロニー刺激因子２受容体サブユニットＣｓｆ２ｒｂの発現を負に調節する、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞が、前記改変ＥＫＬＦポリペプチドを発現するように遺伝的に変更された動物から得られる、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
前記腫瘍が、肝臓がん、大腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞がん、メラノーマ、肺がん、神経芽細胞腫、脳腫瘍、造血器悪性腫瘍、網膜芽細胞腫、腎細胞がん、頭部および頸部がん、子宮頸がん、すい臓がん、食道がん、または扁平上皮がんである、項目１４に記載の方法。ある好ましい例では、該細胞増殖性障害は、メラノーマである。
（項目２４）
野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸の改変を含むＥＫＬＦポリペプチドをコードする遺伝子により操作された細胞であって、該細胞は、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、ＣＢＳＣ、ＨＳＣ、ＨＳＰＣまたはＢＭＭＮＣであり、そして、該１つまたは複数のアミノ酸の改変が、全長野生型ヒトＥＫＬＦの５４位または全長野生型マウスＥＫＬＦポリペプチドの７４位に相当するアミノ酸の改変を含み、そして５４位または７４位に相当する該アミノ酸の該改変が、Ｌｙｓの、Ａｒｇによる（Ｋ５４ＲもしくはＫ７４Ｒ）または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換であり、該脊椎動物がマウスまたはヒトではない、細胞。
（項目２５）
１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を持ち、そして発現する、ＨＳＣおよび／または／ＨＳＰＣを得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を有するようにＥＳＣ、ｉＰＳＣ、および／またはＣＢＳＣを遺伝的に操作すること、ならびに（ｂ）該遺伝的に操作されたＥＳＣ、ｉＰＳＣ、および／またはＣＳＢＣを分化させ、該１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を持ち、そして発現するＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを得ることを含み、ここで、該ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣは健康な長寿性および／または腫瘍抵抗性もしくは転移抵抗性を与える、方法。
（項目２６）
腫瘍抵抗性および健康な長寿性の性質を有する１つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子（ｅｋｌｆ）遺伝子を発現するＨＳＣおよび／または／ＨＳＰＣを得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、（ａ）野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つもしくは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を有するように骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を遺伝的に操作すること、ならびに該１つまたは複数の改変ＥＫＬＦ遺伝子を持つＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを単離することを含む方法。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1A】図１（Ａ）から（Ｃ）は、Ｅｋｌｆの遺伝子ノックアウト（ＫＯ）を持つマウスの生成について示す。（Ａ）標的化戦略。模式図は、Ｅｋｌｆ遺伝子座の遺伝的な前後関係、およびＥｋｌｆ遺伝子のイントロン１領域内に逆向きｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ｌｏｘＰカセットを有する標的化ＢＡＣコンストラクトのマップを示す。ＰＣＲに基づくジェノタイピングのため、５０ｂｐの欠失（灰色ブロック）が、イントロン１内のＬｏｘＰ部位の５’端の後ろに導入された。ジェノタイピングに用いられるＰＣＲプライマーの位置は小さい黒い矢印で示されている：５’−欠失：５’−ＧＣＧ ＧＣＧ ＣＧＡ ＴＡＡ ＣＴＴ ＣＧＴ ＡＴ−３’（配列番号１）、５’−ＰＧＫ：５’−ＴＴＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＧＧ Ａ−３’（配列番号２）、ＥＫＬＦ−Ｆ：５’−ＡＧＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ Ｃ−３’（配列番号３）、３’−欠失：５’−ＣＣＴ ＡＴＴ ＴＣＴ ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＧＣ Ａ−３’（配列番号４）、ＰＧＫ−Ｒ：５’−ＣＴＧ ＧＣＣ ＣＴＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＣＣ ＴＧ−３’（配列番号５）、３’−ＰＧＫ：５’− ＧＴＴ ＡＴＧ ＣＧＧ ＣＣＣ ＴＡＧ ＴＧＡ ＴＴＴ Ａ−３’（配列番号６）。ＮｉｆｘおよびＦｂｗｘ９はＥｋｌｆ遺伝子座に隣接する２つの遠位の遺伝子座である。ｎｅｏはネオマイシン抵抗性遺伝子、ＰＧＫはホスホグリセリン酸キナーゼＩプロモーター、黒矢印は原核生物プロモーターｇｂ２、黒矢頭はｌｏｘＰ部位。（Ｂ）左パネル、ホモ接合型Ｅｋｌｆ^−/−（ＫＯ）の貧血表現型。野生型Ｅ１４．５胚と比較したＥ１４．５胚。右上２パネル、Ｅ１４．５胚のジェノタイピング。尾部ゲノムＤＮＡは、野生型（５’−ＰＧＫおよび３’−ＰＧＫ）ならびに変異体（５’−欠失および３’−欠失）に対する特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された。＋／＋は野生型、＋／−はヘテロ接合型Ｅｋｌｆ^＋／−、−／−はホモ接合型Ｅｋｌｆ^−／−。右下２パネル、Ｅｋｌｆ遺伝子のノックアウトによるＥＫＬＦタンパク質の発現の枯渇を示す免疫ブロッティング（ＩＢ）解析。βアクチンはインターナルコントロールとして用いられた。（Ｃ）ＷＴおよびＥｋｌｆ^−／−マウスのＥ１４．５胎児肝臓細胞の比較ＦＡＣＳ解析。Ｆｒｏｎｔｅｌｏら（２００７）の報告に類似した、Ｅｋｌｆ^−／−Ｅ１４．５胎児肝臓内での赤血球系列のＴｅｒ１１９^＋細胞の減少およびＣＤ４１^＋、ＣＤ４２ｄ^＋巨核球の増加に着目されたい。Ｎ＝３。

【図1BC】同上

【0018】

【図2A】図２（Ａ）および（Ｂ）は、Ｅｋｌｆ^−／−Ｅ１４．５胎児肝臓の骨髄系列細胞の集団の変化を示す。ＦＡＣＳ解析。ＬＴ−ＨＳＣ（Ｌｉｎ⁻、ＣＤ１１７^＋、Ｓｃａ−１^＋、Ｔｈｙ１．１^ｌｏ、Ｆｌｋ２⁻、ＣＤ３４⁻）、ＭＰＰ（Ｌｉｎ⁻、ＣＤ１１７^＋、Ｓｃａ−１^＋、Ｔｈｙ１．１⁻、Ｆｌｋ２^＋）、ＣＭＰ（Ｌｉｎ⁻、ＣＤ１１７^＋、Ｓｃａ−１⁻、ＣＤ３４^＋、ＣＤ１６／３２^ｉｎｔ）、ＧＭＰ（Ｌｉｎ⁻、ＣＤ１１７^＋、Ｓｃａ−１⁻、ＣＤ３４^＋、ＣＤ１６／３２^ｈｉ）、およびＭＥＰ（Ｌｉｎ⁻、ＣＤ１１７^＋、Ｓｃａ−１⁻、ＣＤ３４⁻、ＣＤ１６／３２^{ｌｏ／ｉｎｔ}）を同定するために、異なる組み合わせの抗体が用いられた。分化した細胞は以下のように同定された。単球（ＣＤ１１ｂ^＋、ＣＤ１１ｃ⁻）、樹状細胞（ＣＤ１１ｂ⁻、３３Ｄ１^＋）、マクロファージ（Ｆ４／８０^＋）。顆粒球のフローデータはここには示されない。Ｎ≧６。（Ｂ）造血の分化の図解、およびＷＴと比較したＥｋｌｆ^−／−Ｅ１４．５胎児肝臓での異なる型の細胞の集団の変化を示すポンチ図。

【図2B】同上

【0019】

【図3A】図３（Ａ）および（Ｂ）はＥｋｌｆおよびその標的遺伝子Ｃｓｆ２ｒｂの発現を示す。（Ａ）ＦＡＣＳによってＥ１４．５マウス胎児肝臓から純化されたＬＴ−ＨＳＣ、ＭＰＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＭＥＰを含む、異なる型の造血幹細胞および前駆細胞から単離されたＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ解析。左パネルで、すべての前駆細胞でのＥｌｋｆのｍＲＮＡの相対レベルが、マウス赤白血病（ＭＥＬ）細胞の相対レベルと比較され、ＭＥＰにおけるレベルが１と設定される。右パネルに、それぞれＷＴおよびＥｋｌｆ^−／−マウスからのＥ１４．５胎児肝臓のＬＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰ内のＥｋｌｆのｍＲＮＡの比較ＲＴ−ｑＰＣＲ解析が示される。（Ｂ）純化されたＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰおよびＭＰＰ内のＣｓｆ２ｒｂ、Ｓｔａｔ１およびＳｔａｔ２のｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ解析。すべての４つの細胞の型でＣｓｆ２ｒｂのｍＲＮＡが有意に増加したが、ＭＥＰでのみＳｔａｔ２のｍＲＮＡが増加し、ならびにＭＥＰおよびＭＰＰでＳｔａｔ１のｍＲＮＡが増加したことに着目されたい。５回の生物学的な反復実験がそれぞれの型の細胞について解析された。それぞれのバーは平均±標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図3B】同上

【0020】

【図4AB】図４（Ａ）から（Ｄ）はＥＫＬＦによるＬＴ−ＨＳＣ分化の調節を示す。（Ａ）ＷＴおよびＫＯのＥ１４．５マウス胎児肝臓から純化されたＬＴ−ＨＳＣ内のＣｓｆ２ｒｂのｍＲＮＡの相対レベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲで解析された。Ｎ≧５。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＷＴ−ＬＴ−ＨＳＣおよびＫＯ−ＬＴ−ＨＳＣ内のＥＫＬＦおよびＣＳＦ２ＲＢの発現の免疫蛍光染色解析。ＤＡＰＩは核マーカーである。ＫＯ−ＬＴ−ＨＳＣ内のＥＫＬＦシグナルの欠如に着目されたい。また、ＫＯ−ＬＴ−ＨＳＣ内のＣＳＦ２ＲＢタンパク質の染色からのシグナルは、ＷＴ−ＬＴ−ＨＳＣのシグナルより強い。３回の生物学的な反復実験が解析された。ＬＴ−ＨＳＣの直径は５〜１０ｕｍの範囲である。右パネルは、ＷＴ−ＬＴ−ＨＳＣと比較したＫＯ−ＬＴ−ＨＳＣ内のＣＳＦ２ＲＢタンパク質の増加の統計解析を示す。ｐ＜０．００１（Ｃ）フローサイトメトリーによってＥ１４．５胎児肝臓細胞から純化（＞９０％）されたＷＴ−ＬＴ−ＨＳＣおよびＫＯ−ＬＴ−ＨＳＣについてメチルセルロースコロニー分析が行われた。３〜４週間サイトカイン／因子で処理されたＫＯ−ＬＴ−ＨＳＣが、ＷＴ−ＬＴ−ＨＳＣと比較したときに約２．５倍のコロニー数の増加を示したことに着目されたい。ウェルあたり１０００細胞が用いられた。Ｎ≧４。＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＬＴ−ＨＳＣの恒常性におけるＥＫＬＦの調節役割を示す単純なモデルであり、このモデル内でＥＫＬＦは、余分なＣｓｆ２ｒｂの発現および結果としてＬＴ−ＨＳＣの分化を防ぐリプレッサーとして働く。

【図4CD】同上

【0021】

【図5】図５（Ａ）および（Ｂ）は、ＥＫＬＦ（Ｋ７４Ｒ）Ｋｉｎマウスからの骨移植の後のＷＴマウス内でのがんの抑制を示す。（Ａ）それぞれ、ＷＴおよびＫｉｎマウスから骨髄移植を受けた後のＷＴマウスからの肺の代表的な写真。（Ｂ）パネル（Ａ）のＷＴマウス内の肺病巣の数の定量的な提示。

【発明を実施するための形態】

【0022】

発明の詳細な説明
利便性のため、本開示の文章中で用いられる特定の用語はここに集められる。他で定義されない限り、この中で用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者による一般的な理解と同じ意味を有する。

【0023】

ここでは、単数型「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文章が明確に他を指示しない限り複数の参照物を含むために用いられる。

【0024】

定義
本明細書で用いられる場合、用語「発現」は、条件が合ったときの遺伝子の転写であって、結果としてｍＲＮＡおよび通常コードされたタンパク質を生じる転写を指すことを意図する。発現は、細胞によって（すなわち、人工的な介入なしに）自然に達成もしくは実施され得、または人工的に（すなわち、例えば化学的な試薬を用いて調節されるプロモーターの使用のような人工的な介入の中で）達成もしくは実施され得る。発現は、例えばＣｒｅ媒介組み換えのような、部位特異的リコンビナーゼが誘発する組み換えイベントによっても始められ得る。発現は遺伝子から転写されたｍＲＮＡの測定により、または遺伝子によってコードされたタンパク質の測定により測定され得る。

【0025】

本明細書で用いられる場合、用語「核酸」は、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場所ではリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを指す。核酸は１本鎖ポリヌクレオチドおよび２本鎖ポリヌクレオチドを含むが、これらに限られない。例示的。

【0026】

本明細書で用いられる場合、用語「ベクター」は、核酸分子であって、その核酸分子に連結された他の核酸を輸送できる核酸分子を指す。用語「発現ベクター」は、作動可能に連結された核酸を発現できる様式で、作動可能に核酸に連結された（ｌｉｎｋｅｒ）プロモーターを含むベクターを指す。したがって、本明細書で用いられる場合、ベクターまたは発現ベクターは、ベクターに持たれるそれぞれの組み換え遺伝子によってコードされる対象のタンパク質を合成できるプラスミドまたはファージを含む。ベクターまたは発現ベクターは、例えば哺乳動物細胞のような細胞に核酸を導入できる、ウイルスを基にしたベクターも含む。特定のベクターは自己複製、および／またはそのベクターに連結された核酸を発現できる。

【0027】

本明細書で用いられる場合、用語「アレル」は、細胞内または集団内の遺伝子のある特定の形であって、遺伝子の配列の中の少なくとも１つの、そしてしばしば１つより多くの変異部位の配列において、同じ遺伝子の他の形と異なり得る特定の形を指す。異なるアレル間で異なるこれらの変異部位での配列は、「バリアンス」、「多型」または「変異」と呼ばれる。被験体がある遺伝子の２つの同一なアレルを持つとき、その被験体はその遺伝子またはアレルについてホモ接合であると言われる。被験体がある遺伝子の２つの異なるアレルを持つとき、その被験体はその遺伝子についてヘテロ接合であると言われる。ある特定の遺伝子のアレルは、１つのヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチドにおいて互いに異なり得、そしてヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含み得る。ある遺伝子のあるアレルはまた、変異を含む遺伝子の形でもあり得る。

【0028】

用語「野生型」は、天然の供給源から単離されたときのその遺伝子または遺伝子産物の性質を持つ遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団内でもっとも頻繁に観察され、そして、そのために恣意的にその遺伝子の「正常な」または「野生型の」形として設計されるものである。

【0029】

本明細書で用いられる場合、用語「トランスフェクション」は、核酸に媒介される遺伝子の輸送による、レシピエント細胞への、例えば発現ベクターのような核酸の導入を指す。「形質転換」は、外因性ＤＮＡまたはＲ Ａの細胞取り込みの結果として細胞の遺伝子型が変えられる過程を指し、そして形質転換された細胞は所望される異種性タンパク質を発現する。

【0030】

本明細書で用いられる場合、用語「ノックイン（Ｋｉｎ）」は、結果としてトランスジーンの発現を引き起こす、宿主細胞ゲノム内へのトランスジーンの標的化挿入を指す。「ノックイン」トランスジェニクスは、トランスジーンのヘテロ接合ノックインを含み得る。特定の実施形態では、「ノックイン」は、外因性遺伝子（またはその一部）による内因性遺伝子（またはその一部）の置き換えを引き起こし、例えば１つまたは両方のアレルの標的化変異を引き起こす。「ノックイン」は、かかる発現を促進する物質に動物を暴露することによる、標的化挿入の部位（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系におけるＣｒｅ）で組み換えを促進する酵素を導入することによる、または他の方法によるトランスジーンの発現も包含する。「ホモ接合」状態は、相同染色体上の相当する遺伝子座に同一アレルがあるときに存在する遺伝状態を意味する。一方で、「ヘテロ接合」状態は、相同染色体上の相当する遺伝子座に異なるアレルがあるときに存在する遺伝状態を意味する。

【0031】

本明細書で用いられる場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ」、「ＣＲＩＳＰＲ系」または「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系」、ならびにこれらの文法的等価物は、ＤＮＡと結合する非コードＲＮＡ分子（例えばガイドＲＮＡ）およびヌクレアーゼ機能性（例えば２つのヌクレアーゼドメイン）を持つＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）を含み得る。

【0032】

本明細書で用いられる場合、用語「ノックアウト」（略語：ＫＯ）は生物の遺伝子の１つを無効にする遺伝的技術である（生物の「ｋｎｏｃｋｅｄ ｏｕｔ」）。

【0033】

本明細書で用いられる場合、用語「トランスジーン」は、トランスジーンを導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞に対して部分的もしくは全体的に異種性である、すなわち外来の核酸配列、またはトランスジーンの導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞の内因性遺伝子と相同な核酸配列であるが、トランスジーンが挿入される細胞のゲノムが変更されるような方法で動物のゲノムへと挿入されるように設計される、または挿入される核酸配列を指す。トランスジーンは、１つまたは複数の転写調節配列、ならびに例えばイントロンのような、選択された核酸の最適な発現に必要であり得る他の任意の核酸と作動可能に連結され得る。したがって、本明細書では用語「トランスジェニック」は、トランスジーンを持つ動物またはコンストラクトの特性を説明するための形容詞として用いられる。例えば、「トランスジェニック動物」は非ヒト動物、好ましくは非ヒト哺乳動物、さらに好ましくは齧歯類であって、その動物の１つまたは複数の細胞が、例えば、遺伝子ノックイン技術を含むこの分野において周知されたトランスジェニック技術のような人間の介入する方法によって導入された異種性の核酸を含む動物である。例えば、マイクロインジェクションまたは組み換えウイルスの感染によるような意図的な遺伝子操作を経由した細胞の前駆体への導入により、核酸は直接的または間接的に細胞に導入される。トランスジェニック動物はノックイン動物を含むが、これに限られない。

【0034】

本明細書で用いられる場合、用語「発現」は、条件が合ったときの遺伝子の転写であって、結果としてｍＲＮＡおよび通常コードされたタンパク質を生じる転写を指すことを意図する。発現は、細胞によって（すなわち、人工的な介入なしに）自然に達成もしくは実施され得、または人工的に（すなわち、例えば化学的な試薬を用いて調節されるプロモーターの使用のような人工的な介入の中で）達成もしくは実施され得る。発現は、例えばＣｒｅ媒介組み換えのような、部位特異的リコンビナーゼが誘発する組み換えイベントによっても始められ得る。発現は遺伝子から転写されたｍＲＮＡの測定により、または遺伝子によってコードされたタンパク質の測定により測定され得る。

【0035】

本明細書で用いられる場合、用語「野生型」は、天然の供給源から単離されたときのその遺伝子または遺伝子産物の性質を持つ遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団内でもっとも頻繁に観察され、そして、そのために恣意的にその遺伝子の「正常な」または「野生型の」形として設計されるものである。一方で、用語「改変」、「変異体」、「多型」および「バリアント」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較されたときに、配列および／または機能的な特性に改変（すなわち、変更された性質）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然の変異体が単離され得、これらが野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較されたときに変更された性質を持つという事実により、この天然の変異体が同定されることも着目される。

【0036】

本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で互換的にアミノ酸残基のポリマーを指すように用いられる。

【0037】

本明細書で用いられる場合、用語「哺乳動物」はヒト、霊長類、例えばウサギ、ブタ、ヒツジおよびウシのような飼育動物ならびに家畜、動物園、スポーツまたはペット動物、ならびに例えばマウスまたはラットのような齧歯類を含む哺乳綱のすべてのメンバーを指す。用語「非ヒト哺乳動物」はヒトを除く哺乳綱のすべてのメンバーを指す。

【0038】

本明細書で用いられる場合、用語「被験体」は、本発明の方法から利益を受け得るヒト種を含む動物を指す。用語「被験体」は、ある性が特別に指示されない限り、雄性および雌性の両方を指すことを意図する。したがって、用語「被験体」は本開示の処理方法から利益を受け得るあらゆる哺乳動物を含む。

【0039】

本明細書で用いられる場合、用語「調整」は効果または結果を変更する能力に関する。

【0040】

本明細書で用いられる場合、用語「移植」およびそのバリエーションは、レシピエントへの移植組織片（移植片とも呼ばれる）の挿入を指し、その移植がシンジェニック（ドナーおよびレシピエントが遺伝的に同一な場合）であるか、アロジェニック（ドナーおよびレシピエントが異なる遺伝子の起源を持つが同種である場合）であるか、またはゼノジェニック（ドナーおよびレシピエントが異なる種である場合）であるかを問わない。

【0041】

本明細書で用いられる場合、用語「ドナー」は、骨髄細胞の天然の供給源である動物、好ましくは哺乳動物、を指す。ドナーは、健康な哺乳動物、すなわちいかなる明らかな疾患にも罹患していない哺乳動物であり得る。代わりに、ドナーは、疾患（例えば、がん）に罹患している哺乳動物であり得る。レシピエントは、ドナーからの骨髄細胞を受け取る動物、好ましくは哺乳動物である。レシピエントは、健康な哺乳動物、すなわちいかなる明らかな疾患にも罹患していない哺乳動物であり得る。代わりに、レシピエントは、疾患（例えば、がん）に罹患している哺乳動物であり得る。本開示の実施形態によれば、ドナーおよびレシピエントは同じ哺乳動物であり得る。

【0042】

本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、本明細書で用いられる場合、疾患の処置に関して所望される結果を達成するための、投薬量において、および必要な時間の期間について有効な量を指す。例えば、がんの処置に関して、がんの任意の症状を減らすか、防ぐか、遅らせるか、または抑制するか、または阻止する薬剤（すなわち、化合物、ポリペプチド、治療的ポリペプチドをコードするポリ核酸、または治療的ポリペプチドを発現するよう操作された細胞）は、有効である。有効量の薬剤は、疾患または状態を治癒することを必要とされないが、疾患もしくは状態の発症が遅れるか、妨げられるか、もしくは阻止されるように、または疾患もしくは状態の症状が軽減されるように、疾患または状態に対する処置を提供する。指示された時間の期間に渡って１、２、またはそれを超えた回数で投与されるに適した形で、有効量は１、２、またはそれを超える用量に分割され得る。

【0043】

本明細書で用いられる場合、用語「処置」は、本明細書で用いられる場合、例えばがんの発生、成長、もしくは移転の遅延もしくは阻害、または臓器への損傷の軽減のような、所望される薬理学的および／または生理的効果を得ることを意味することを意図する。その効果は、完全または部分的に疾患またはその症状の発生を防止、または阻害するという点において予防的であり得、ならびに／あるいは、疾患および／または疾患に起因すると思われる有害な効果に対する、部分的または完全な治癒という点において治療的であり得る。「処置」は、本明細書で用いられる場合、哺乳動物、とくにヒトにおける疾患の、予防に寄与する（例えば、予防的）処置、治癒用の処置、または緩和的処置を含み、そして、（１）その疾患に罹患しやすくあり得るが、その疾患を持っているとまだ診断されていない個体に起こる疾患または状態（例えば、がんもしくは心不全）の、予防に寄与する（例えば、予防的）処置、治癒用の処置、または緩和的処置、（２）疾患の阻害（例えば、疾患の発達を阻止することによって）、または（３）疾患をやわらげること（例えば、疾患に関連する症状の減少）を含む。

【0044】

本明細書で用いられる場合、用語「投与される」、「投与する」、または「投与」は互換的に、本明細書では、本発明の薬剤（例えば、化合物もしくは合成物）の静脈内投与、筋肉内投与、腹膜内投与、動脈内投与、頭蓋内投与または皮下投与を制限なしに含む送達の様式を指すために用いられる。

【0045】

本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、本明細書で用いられる場合、疾患、または例えば加齢のような状態の処置に関して所望される結果を達成するための、投薬量において、および必要な時間の期間について有効な量を指す。例えば、がんの処置に関して、がんの任意の症状を減らすか、阻害するか、防ぐか、遅らせるか、または抑制するか、または阻止する薬剤（すなわち、化合物、ポリペプチド、または治療的ポリペプチドをコードするポリ核酸）は、有効である。有効量の薬剤は、疾患または状態を治癒することを必要とされないが、疾患もしくは状態の発症が遅れるか、妨げられるか、もしくは阻止されるように、または疾患もしくは状態の症状が軽減されるように、疾患または状態に対する処置を提供する。指示された時間の期間に渡って１、２、またはそれを超えた回数で投与されるに適した形で、有効量は１、２、またはそれを超える用量に分割され得る。

【0046】

本明細書で用いられる場合、用語「細胞表面マーカー」は、対象細胞がその細胞原形質膜に、抗体に結合できる、および／または酵素基質を消化できる、タンパク質、酵素、または炭水化物を持つということを意味する。細胞表面マーカーは、特定の型の細胞の性質を同定するのに役立つと本分野において認識される。

【0047】

本明細書で用いられる場合、用語「造血幹細胞」は、被験体の骨髄または血液に由来する幹細胞を指す。これらの幹細胞は多能性であり、したがって任意の他の型の血液細胞または免疫細胞へと転換される能力を有する。血液における造血幹細胞の役割は、毎日血液細胞が置き換えられなければならないため、絶えず体に血液細胞を補充し続けることである。長期および短期の、２つの異なる型の造血幹細胞が存在する。２つの型の細胞間の違いは、長期は無限に再生し得るが、短期幹細胞は長い時間の期間に渡って自身を再生できないことである。この長期幹細胞は、自己再生する能力を有するが、短期幹細胞は約６か月間しか生存しない。

【0048】

本明細書で用いられる場合、用語「長寿性の増強」、「長命性の増加」、および「寿命延長」は本明細書で互換的に用いられ、そして正常な加齢過程の遅延、および／または、動物、例えば生命を脅かす障害（例えば、がんまたは腫瘍）を罹患した動物の寿命を延ばすことを指す。好ましくは、その長寿性は、未成熟な生活相の延長とは対照的な、成熟した生活相の延長によるものであり、そして本方法による処置をなされることから生じるものである。

【0049】

本明細書で用いられる場合、用語「健康寿命の増強」は、加齢に関連する身体の劣化、疾患、または障害の発症または重篤性の遅延を指す。増強された健康寿命は、例えば特定の年齢での、加齢に通常関連する身体の劣化、疾患、または障害の減少または減少量も指す。

【0050】

本明細書で用いられる場合、用語「アレル」は、細胞内または集団内の遺伝子のある特定の形であって、遺伝子の配列の中の少なくとも１つの、そしてしばしば１つより多くの変異部位の配列において、同じ遺伝子の他の形と異なり得る特定の形を指す。異なるアレル間で異なるこれらの変異部位での配列は、「バリアンス」、「多型」または「変異」と呼ばれる。被験体がある遺伝子の２つの同一なアレルを持つとき、その被験体はその遺伝子またはアレルについてホモ接合であると言われる。被験体がある遺伝子の２つの異なるアレルを持つとき、その被験体はその遺伝子についてヘテロ接合であると言われる。

【0051】

用いられる場合、用語「自家性」は、生物材料であって、その材料が後に再導入される同じ個体に由来する生物材料を指す。

【0052】

用いられる場合、用語「異種性」は、生物材料であって、その材料が後に再導入される異なる個体に由来する生物材料を指す。

【0053】

用いられる場合、用語「アロジェニック」は、生物材料であって、その材料が導入される個体と同種の、遺伝的に異なる個体に由来する生物材料を指す。

【0054】

長寿性を増加させ、ならびに／あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法
１つの側面では、本発明は、被験体の長寿性を増加させ、ならびに／あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法であって、（ａ）野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変赤血球クルッペル様因子（Ｅｋｌｆ）遺伝子を有するように胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）および／または臍帯血幹細胞（ＣＳＢＣ）を遺伝的に操作すること、（ｂ）遺伝的に操作されたＥＳＣ、ｉＰＳＣおよび／またはＣＳＢＣを分化させ、造血幹細胞（ＨＳＣ）ならびに／あるいは造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を得ること、ならびに（ｃ）ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを被験体に移植することを含み、これにより、移植されたＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣは、健康な長寿性ならびに／あるいは腫瘍抵抗性または転移への抵抗性を被験体に与える、方法を提供する。本発明は、１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を持ち、そして発現する、ＨＳＣおよび／または／ＨＳＰＣを得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を有するようにＥＳＣ、ｉＰＳＣ、および／またはＣＢＳＣを遺伝的に操作すること、ならびに（ｂ）遺伝的に操作されたＥＳＣ、ｉＰＳＣ、および／またはＣＳＢＣを分化させ、１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を持ち、そして発現するＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを得ることを含み、ここで、ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣは健康な長寿性および／または腫瘍抵抗性もしくは転移抵抗性を与える、方法も提供する。あるいは、本発明は、被験体の長寿性を増加させ、および／または腫瘍の発生もしくは腫瘍の移転を阻害または減少させるための医薬の製造における、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、ＣＳＢＣ ＨＳＣ、および／またはＨＳＰＣの使用であって、ここで、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、ＣＢＳＣ ＨＳＣ、および／またはＨＳＰＣは、野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を持ち、そして発現する、使用を提供する。

【0055】

別の側面では、本発明は、受取被験体において長寿性を増加させ、ならびに／あるいは腫瘍の発生または腫瘍の転移を阻害または減少させる方法であって、（ａ）野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を含むドナー被験体から骨髄を回収すること、（ｂ）１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を持つ、ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣ ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを含む骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を単離すること、ならびに（ｃ）受取被験体にＢＭＭＮＣを移植することを含み、これにより、受取被験体は腫瘍抵抗性および／または健康な長寿性を与えられる、方法を提供する。あるいは、本発明は、腫瘍抵抗性および健康な長寿性の性質を有する１つまたは複数のＥｋｌｆ遺伝子を発現するＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、（ａ）野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つもしくは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を有するようにＢＭＭＮＣを遺伝的に操作すること、ならびに１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を持つＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを単離することを含む方法を提供する。本発明は、被験者の長寿性を増加させ、および／または腫瘍の発生もしくは腫瘍の転移を阻害もしくは減少させるための医薬の製造における、ＢＭＭＮＣの遺伝的な操作の使用であって、ここで、ＢＭＭＮＣは、野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を持つ、使用も提供する。

【0056】

したがって、本発明は、野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸の改変を含むＥＫＬＦポリペプチドをコードする遺伝子により操作された細胞であって、当該細胞は、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、ＣＢＳＣ、ＨＳＣ、ＨＳＰＣまたはＢＭＭＮＣである、細胞を提供する。

【0057】

特定の実施形態は、野生型のＥＫＬＦポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の改変を含む改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする、１つまたは複数の改変Ｅｋｌｆ遺伝子を有するＥＳＣ、ｉＰＳＣ、ＣＢＳＣ、またはＢＭＭＣを指向する。いくつかの実施形態では、細胞は、１つまたは両方のＥＫＬＦ遺伝子座に改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つのＥＫＬＦ遺伝子座に改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。特定の実施形態では、細胞は、両方のＥＫＬＦ遺伝子座に改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。特定の実施形態では、細胞は改変ＥＫＬＦポリペプチドを発現する。

【0058】

いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の改変は全長の野生型のマウスＥＫＬＦポリペプチドにおいて７４位に相当するアミノ酸の改変を含む。マウス以外の動物に関する特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の改変は、マウスのＥＫＬＦポリペプチド内のこのアミノ酸残基に相当するＳＵＭＯ化可能アミノ酸残基の改変を含むが、これは異なる位置にあり得る。例えば、ヒトのＥＫＬＦポリペプチドにおいて、マウスのＥＫＬＦポリペプチド内の７４位に相当するＳＵＭＯ化部位はアミノ酸残基５４にある。特定の実施形態では、このアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。特定の実施形態では、７４位に相当するアミノ酸の改変は、ＬｙｓをＡｒｇ（Ｋ７４Ｒ）または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸に置換するものである。他の実施形態では、「他のアミノ酸」はＨｉｓである。マウスおよびヒト以外の脊椎動物においては、改変脊椎動物ＥＫＬＦポリペプチドは、マウスＥＫＬＦのＫ７４およびヒトＥＫＬＦのＫ５４にオーソロガスなＳＵＭＯ化可能部位に相当するリシン（Ｋ）残基の、アルギニン（Ｒ）または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換を含む。

【0059】

特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の改変は、全長の野生型のヒトＥＫＬＦポリペプチドの５４位に相当するアミノ酸の改変を含む。ある実施形態では、５４位のアミノ酸の改変は、Ｌｙｓの、Ａｒｇ（Ｋ５４Ｒ）または腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸による置換である。他の実施形態では、「他のアミノ酸」はＨｉｓである。特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の改変は、例えば、ヒトＥＫＬＦポリペプチドにおいて、リン酸化されるアミノ酸、例えば限定されるものではないが、全長の野生型のマウスＥＫＬＦポリペプチドの６８位に相当するリン酸化アミノ酸の改変を含む。

【0060】

所望されるＥＫＬＦ変異アレル産物（すなわち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するＥＫＬＦ）をコードするポリヌクレオチドは、関連分野の任意の既知の方法により、自然のＥＫＬＦ配列から改変されるか、またはｄｅ ｎｏｖｏで製造され得、そして、適した発現ベクターへとクローニングされ得る。典型的には、所望されるＥＫＬＦ変異アレルを持つポリヌクレオチドは、所望されるＥＫＬＦ変異ポリペプチドの細胞内での発現に影響できる適した制御配列と作動可能に連結される。特定の実施形態では、ＥＫＬＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、マウスＥＫＬＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、そして特定の実施形態では、改変コドンは７４位アミノ酸での改変をコードする。特定の実施形態では、ＥＫＬＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＥＫＬＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、そして特定の実施形態では、改変コドンは５４位アミノ酸での改変をコードする。特定の実施形態は、ＥＫＬＦポリペプチドが、マウスにおける７４位のリシンか、ヒトにおける５４位のリシンか、または相当するＳＵＭＯ化部位でＳＵＭＯ化されることを意図する。特定の実施形態は、ヒトＥＫＬＦポリペプチドが５４位のリシンでＳＵＭＯ化されることを意図する。特定の実施形態では、マウスＥＫＬＦポリペプチドの７４位のリシンに相当するＳＵＭＯ化部位は、ヒトＥＫＬＦポリペプチドの５４位のリシンに相当する。いくつかの実施形態は、アルギニン、腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸によるマウスＥＫＬＦポリペプチド内のリシン７４の改変、アルギニンもしくは腫瘍抵抗性および健康な長寿性を与える他のアミノ酸によるヒトＥＫＬＦポリペプチド内のリシン５４の改変、または他のＥＫＬＦポリペプチド内のＳＵＭＯ化部位に相当する改変が、ＥＫＬＦポリペプチドのＳＵＭＯ化を防ぐことを意図する。哺乳動物におけるＥＫＬＦポリペプチドのＳＵＭＯ化部位の改変は、哺乳動物の長寿性の増加、寿命の増加、および健康寿命の増加、ならびに哺乳動物における腫瘍形成性の減少および腫瘍の転移の減少を引き起こす。加えて、がん性の細胞に対するＥＫＬＦのＫ７４Ｒ（またはＥＫＬＦのＫ５４Ｒ）の改変の役割が担メラノーママウスで試験された。驚くべきことに、ＥＫＬＦのＫ７４Ｒ（またはＥＫＬＦのＫ５４Ｒ）アレルの発現は、がん性メラノーマ細胞が転移することを防ぎ、そして、長寿性を増加させる。

【0061】

特定の実施形態では、所望されるＥＫＬＦ変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ベクター、例えば、ＤＮＡプラスミド、ウイルス、または他の適したレプリコンに挿入される。好ましくは、所望されるＥＫＬＦ変異ポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば高度に純化されたＨＳＣの集団のような骨髄細胞へと後に導入される、ウイルスのゲノムに統合される。本開示での使用に適したウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス（ｃｏｒｃｏａｖｉｒｕｓ）、例えばオルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）のようなマイナス鎖ＲＮＡウイルス、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、例えばピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクチニア、鶏痘およびカナリア痘）を含む２本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限られない。他のウイルスとしては、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病・肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶグループ、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられるが、これらに限られない。他の例としては、ネズミ白血病ウイルス、ネズミ肉腫ウイルス、マウス乳腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。

【0062】

あるいは、Ｃａｓ酵素と、ゲノム遺伝子座内の改変Ｅｋｌｆ遺伝子産物をコードする核酸の標的化配列にハイブリダイズするＲＮＡとをそれぞれ細胞内に運搬する、少なくとも２つのベクターが用いられるような、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）系を用いて、細胞は、改変ＥＫＬＦポリペプチドを発現するように形質導入される。Ｃａｓ酵素は後に、ゲノム遺伝子座上の標的化配列にハイブリダイズするＲＮＡによりリクルートされ、発現された改変Ｅｋｌｆ遺伝子産物を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素はＣａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９酵素はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９であり、そして、これらの生物に由来する変異型Ｃａｓ９を含み得る。この酵素は、Ｃａｓ９のホモログまたはオーソログであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核生物細胞内での発現についてコドン最適化される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は標的ＥＫＬＦ配列の位置で、１本また２本鎖の切断を指揮する。

【0063】

パッケージング細胞株は、所望される遺伝子産物（例えば、ＥＬＫＦのＫ５４ＲまたはＥＫＬＦのＫ７４Ｒポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えゲノムを含む組み換えウイルスベクターを生み出すためにも用いられ得る。パッケージング細胞株の使用は、産された組み換えビリオン（ｖｉｒｏｎ）の感染の効率とスペクトルの両方を増加させ得る。所望される遺伝子産物（例えば、少なくとも１つのアミノ酸改変を有する本ＥＫＬＦ）をコードする核酸を含む組み換えゲノムを含む組み換えウイルスベクターを生み出すために有用なパッケージング細胞株は、宿主細胞、例えば哺乳動物の宿主細胞を、ウイルスのゲノムへと統合された所望される遺伝子産物をコードする核酸を有するウイルスベクターでトランスフェクトすることで産される。細胞株を生み出すために適した宿主細胞としては、ヒト（例えば、Ｈｅｌａ細胞）、雌ウシ、ブタ、マウス（例えば、胚性幹細胞）、ウサギ、およびサル（例えば、ＣＯＳ１細胞）の細胞が挙げられる。細胞株を生み出すために適した宿主細胞は、胚性細胞、骨髄幹細胞、または他の前駆細胞であり得る。

【0064】

細胞を形質導入または形質転換するために適した方法の例としては、感染、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、および直接取り込みが挙げられるが、これらに限られない。かかる方法は、この分野で周知である。所望されるＥＫＬＦ変異アレル産物をコードする核酸を含む組み換えゲノムを含む、組み換えウイルスベクターからなるウイルスのストックは、ウイルス産出に適した条件下（例えば、適切な成長培地内、および適切な時間の期間）で、形質導入された細胞を維持することで産される。こういった条件は本開示にとって重要ではなく、そして関連する分野で一般に知られている。

【0065】

所望される核酸の産物をコードし、そして細胞内で所望される核酸の産物の発現に影響できる統制配列に作動可能に連結された組み換え遺伝子は、目的の特定の細胞に入るウイルスのゲノムに組み入れられ得る。細胞は、所望される核酸の産物をコードする安定的に組み込まれた組み換え遺伝子を含むように、遺伝的に変更または形質転換される。このような方法で遺伝的に変更または形質転換された細胞は、次いで、哺乳動物（例えば、レシピエント）への投与に先立って、組み換え遺伝子の発現を検査され得る。例えば、発現される所望される遺伝子産物（例えば、ＥＫＬＦのＫ５４ＲまたはＥＫＬＦのＫ７４Ｒポリペプチド）の量は、標準的な方法にしたがって（例えば、ウェスタンブロットによって）測定され得る。このような様式で、哺乳動物への投与に先立って、形質転換された細胞内で所望される核酸の産物が適したレベルで発現されているかどうかが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで決定され得る。

【0066】

適したレベルで所望される核酸の産物を発現する遺伝的に変更された細胞は、レシピエント被験体に導入または注入される前に、特定の数まで拡張（成長）され得る。細胞の拡張法は関連分野において周知である。

【0067】

多能性幹細胞の培養に適する任意の培地が、本発明に従って用いられ得、そしていくつかのそういった培地は本分野で知られている。例えば、多能性幹細胞の培養のための培地は、ノックアウトＤＭＥＭ、２０％ノックアウト血清代替品、非必須アミノ酸、２．５％ＦＢＳ、グルタマックス、ベータメルカプトエタノール、１０ｎｇ／マイクロリットルｂＦＧＦ、および抗生物質を含み得る。使用される培地は、例えば、２．５％ＦＢＳを含まない、またはより高い％もしくはより低い％のノックアウト血清代替品を含む、または抗生物質を含まないような、培地のバリエーションであり得る。使用される培地は、未分化な状態のヒト多能性幹細胞の成長を支援するために適した任意の他の培地であり得、例えばｍＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、またはＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔから入手可能）、またはＥＳ培地、または本分野で知られる任意の他の適する培地であり得る。凍結保護剤を用いて、または凍結保護剤を用いずに凍結されていた組織試料から成長させられた細胞集団から、多能性幹細胞を生み出す／得るための他の典型的な方法。

【0068】

遺伝的に操作されたＥＳＣ、ｉＰＳＣ、および／またはＣＳＢＣは、ＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣを得るために分化され得る。例えば、様々な分化因子の使用によるような、多能性幹細胞の指向された分化、または自発的な分化のための方法が、本分野で知られている。多能性幹細胞の分化は、本分野で知られる様々な方法によってモニターされ得る。幹細胞と分化因子で処置された細胞との間のパラメーターの変化は、処置された細胞が分化していることを示し得る。分化の間の細胞の形態を直接的にモニターするため、顕微鏡が使われ得る。

【0069】

いくつかの例では、細胞はヒトＨＳＣであって、Ｌｉｎ、Ｓｃａ−１、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ９０．１、ＣＤ９３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）、ＣＤ１５０、ＣＤ１６６、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１８４、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２４３、ＣＤ２７１、ＣＤ３０９、ＣＤ３３８、ＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３、ｃ−ｍｙｂ、Ａｉｏｌｏｓ、ＴｄＴ、Ｉｋａｒｏｓ、ＰＵ．１、ＨＬＡ ＤＲ、およびＭＨＣクラスＩからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーで陽性に染色される細胞である。他の例では、細胞はマウスＨＳＣであって、Ｌｉｎ、Ｓｃａ−１、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ５９、ＣＤ９０．１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３５、ＣＤ１５０、ＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３、ＴｄＴ、Ｉｋａｒｏｓ、ＰＵ．１、Ａｉｏｌｏｓ、ｃ−ｍｙｂ、およびＭＨＣクラスＩからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーで陽性に染色される細胞である。

【0070】

驚くべきことに、本発明は、ＥＫＬＦが比較的高いレベルでＬＴ−ＨＳＣ内で発現され、そしてＥＫＬＦの枯渇が異なる型の造血／血液細胞の集団の変化を引き起こすことを見出した。さらに、ＥＫＬＦは、ＬＴ−ＨＳＣおよび造血前駆細胞（例えばＭＰＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＭＥＰ）内のコロニー刺激因子２受容体サブユニットＣｓｆ２ｒｂの発現を負に調節する。結果として、ＬＴ−ＨＳＣは、ＥＫＬＦの枯渇および結果としてＣｓｆ２ｒｂの増加により、分化能力の増加を獲得する。ＬＴ−ＨＳＣから始まり、そして骨髄単球系列に渡るＥＫＬＦ−ＣＳＦ２ＲＢ軸、およびＥＫＬＦによる造血の調節は、部分的には、ＬＴ−ＨＳＣが下流の造血前駆細胞へと過剰に分化することを防ぐことにより、ＬＴ−ＨＳＣの恒常性を維持する。ある実施形態では、ＥＫＬＦの枯渇はＬＴ−ＨＳＣ内のＣｓｆ２ｒｂの発現を増加させる。他の実施形態では、ＥＫＬＦの発現は造血幹細胞／前駆細胞内のＣｓｆ２ｒｂの発現を減少させる。ＥＫＬＦは、余分なＣｓｆ２ｒｂの発現および結果としてＬＴ−ＨＳＣの分化を防ぐリプレッサーとして働く。

【0071】

前掲のように、本発明は、ＥＫＬＦ発現の枯渇が、予想外に長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を含む異なる型の造血細胞の集団を大きく変えることを示す。興味深い相関として、ＥＫＬＦは、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）と同様にＬＴ−ＨＳＣ内でも、比較的高いレベルで発現される。さらに、ＥＫＬＦは、ＬＴ−ＨＳＣ、ＭＰＰ、ＧＭＰおよびＣＭＰ内で、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５に対する受容体の共通サブユニットとして知られるコロニー刺激因子２受容体アルファサブユニット（ＣＳＦ２ＲＢ）の発現を抑制するようである。結果として、ＬＴ−ＨＳＣは、ＥＫＬＦの枯渇および結果としてのＣＳＦ２ＲＢの増加により、増加した分化能を得る。これらの結果は共に、ＬＴ−ＨＳＣから始まり、そして骨髄単球系列に渡るＥＫＬＦ−ＣＳＦ２ＲＢ軸による造血の調節を実証する。

【0072】

本発明の特定の実施形態によれば、細胞は、本明細書に記載された改変Ｅｋｌｆ遺伝子、改変ＥＫＬＦポリペプチド、および形質導入（またはトランスフェクション）の方法に従い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝的に操作される。胚性幹細胞（ＥＳＣ）は霊長類種のメンバーの胚盤胞から単離され得る。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．、１９９８)、およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆらＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９、２０００によって記載された技術を用いて、ヒト胚盤胞細胞から調製され得る。ｉＰＳＣは一般に、ｈＥＳＣ様の形態であって、高い核−細胞質比、はっきりとした境界、そして目立った核を有し、平らなコロニーとして成長するという形態を有する。加えて、ｉＰＳＣは一般に、本分野の当業者に知られる１つまたは複数の鍵となる多能性マーカーであって、アルカリフォスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２を含むがこれらに限られないマーカーを発現する。例示的なｉＰＳＣは、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ遺伝子を形質導入された細胞である。他の典型的なｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８を形質導入された細胞である。当業者は、例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８からなる群から選択される因子のような、様々な異なるリプログラミング因子のカクテルがｉＰＳＣを産するために用いられ得ることを知る。臍帯血幹細胞は、多能性であり、異なる幹細胞の型を形成する能力を有すると考えられており、そして、臍帯血幹細胞は、分娩後の胎盤および付着していた臍帯に残る臍帯血から単離され得る。

【0073】

本発明の特定の実施形態によれば、細胞は、例えば、ＥＫＬＦのＫ７４Ｒ（またはＥＫＬＦのＫ５４Ｒ）ポリペプチドを発現するノックイン（Ｋｉｎ）マウスのような、所望される核酸の産物を発現するように遺伝的に変更された動物から得られる。こういった実施形態では、所望されるＥＫＬＦのＫ７４Ｒ変異アレルを持つトランスジェニックＫｉｎマウスは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組み換え系を用いて、または、例えば部位指向的組み換え系のような本分野で周知の任意の他の方法を用いて作り出される。目的の形質を有するこれらの動物を選び出すために、トランスジェニック動物はスクリーニングされ、そして評価される。最初のスクリーニングは、例えば、サザンブロット解析またはＰＣＲ技術を用いて動物の組織を解析し、トランスジーンの組み入れが起きたということを確認するために行われ得る。トランスジェニック動物の組織内におけるトランスジーンｍＲＮＡの発現レベルも、限定されるものではないが、動物から得られた組織試料のノーザンブロット解析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析、および逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＴ）を含む技術を用いて評定され得る。適した組織の試料は、トランスジーンに特異的な抗体を用いて、免疫細胞化学的に評価され得る。トランスジーンの存在を評価するための代替的な、または追加の方法として、例えば、酵素および／または免疫学的なアッセイ、特定のマーカーまたは酵素の活性についての組織染色、フローサイトメトリー解析などのような、適した生化学的アッセイが挙げられるが、これらに限られない。血液の解析も、血液中のトランスジーン産物の存在を検出するために有用であり得る。

【0074】

本開示の他の実施形態によれば、細胞は、正常で健康なドナー哺乳動物から単離され、その後、所望される核酸の産物（すなわち、ヒトＥＫＬＦのＫ５４Ｒポリペプチド）を発現するように遺伝的に変更され、これらの遺伝的に変更された細胞は、その後、拡張され、そしてレシピエント哺乳動物に投与される。

【0075】

本開示のさらなる実施形態によれば、細胞は、処置を必要とする哺乳動物から単離され、細胞はその後、所望される核酸の産物（すなわち、ＥＫＬＦのＫ５４Ｒポリペプチド）を発現するように遺伝的に変更され、拡張され、そして移植によって同じ哺乳動物に戻される。

【0076】

細胞の移植
好ましくは、受取被験体（例えばヒト）への細胞の移植の様式は、点滴および／またはボーラス注入を含む静脈内投与、あるいは注入による腹膜内投与である。例えば、非経口投与、粘膜投与、埋め込み投与、筋肉内投与、皮内投与、経皮投与のような他の様式も用いられ得る。好ましくは、骨髄細胞は、哺乳動物への投与の特定の様式および経路に適した媒体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水の中で投与される。

【0077】

本発明は、驚くべきことに、改変ＥＫＬＦポリペプチドをコードする遺伝子を持ち、そして発現するＢＭＭＣ、ＨＳＣ、またはＨＰＳＣの受取被験体への移植の後に、レシピエント被験体が、腫瘍細胞の成長および／または転移を抑制して、より長い寿命を満喫し得るということを見出した。したがって、この結果は、移植を介した、ＥＫＬＦ変異アレル遺伝子産物を発現するよう操作された自家性または異種性の細胞の送達が、被験体の寿命の延長、および／またはがんの処置のための新しい道筋を提供し得る、ということを示唆する。

【0078】

本発明によって抑制される腫瘍障害は、肝臓がん、大腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞がん、メラノーマ、肺がん、神経芽細胞腫、脳腫瘍、造血器悪性腫瘍、網膜芽細胞腫、腎細胞がん、頭部および頸部がん、子宮頸がん、すい臓がん、食道がん、または扁平上皮がんのいずれかであり得る。ある好ましい例では、細胞増殖性障害はメラノーマである。

【0079】

さらなる記述なしに、当業者は、先の記述および次の典型的な例示を用い、本発明の化合物を製造および利用し、そして請求される方法を実践できると考えられる。したがって、次の実施例は、本発明の好ましい実施形態を特に明らかにするものであり、そして、いかなる方法によっても本開示の他の部分を制限するものとは解釈されない。

【実施例】

【0080】

材料と方法
Ｅｋｌｆ−ＫＯマウスの産出

【0081】

研究に渡って、Ｃ５７ＢＬ１６またはＢ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いた。Ａｃａｄｅｍｉａ ＳｉｎｉｃａのＩＭＢのＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＴＣＦ）にて、標準的な手順に従い、Ｅｋｌｆ遺伝子のヘテロ接合およびホモ接合ノックアウトを有するＢ６マウス系列の産出を行った。このＥｋｌｆ−ＫＯマウスの産出には、遺伝的に操作されたＥｋｌｆ遺伝子座（さらなる詳細には、図１Ａの説明を参照のこと）を含むＢＡＣコンストラクトおよびＥ２Ａ−Ｃｒｅマウスを用いた。

【0082】

ＥＫＬＦ（Ｋ７４Ｒ）ノックインマウスの産出

【0083】

Ｃ５７Ｂ／６ＪのＥＳ細胞由来のマウスのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、ＥＫＬＦエキソン２の一部を含む断片をＰＣＲで増幅し、そして標的ベクターを構築するために用いた。テンプレート標的化ベクターへのクローニングに先立ち、エキソン２にコードされるコドン７４を標準的な突然変異誘発技術を用いて変異させ、アルギニン（Ｋ７４Ｒ）をコードさせた。カナマイシン抵抗性をＥ．ｃｏｌｉで発現する原核生物プロモーター（ｇｂ２）と、ネオマイシン抵抗性を哺乳動物細胞で発現する真核生物プロモーター（ＰＧＫ）とを連結するネオマイシン／カナマイシン抵抗性遺伝子をＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏテンプレートがコードするネオマイシンカセットも、標的ベクター内に構築した。さらに、この改変ＷＴ ＤＮＡに、その除去を促進する「ｌｏｘＰ」部位を隣接させた。その後、標的コンストラクトをＣ５７Ｂ／６ＪのＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、そしてネオマイシン抵抗性について選択した。５’および３’サザンブロットで、適切に標的化されたＥＳクローンを同定した。ｎｅｏカセットの除去、およびＥＫＬＦのＫ７４Ｒをコードする改変ゲノム領域の構造物の確認に続き、ＥＳクローンを胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅ）に注入してキメラマウスを産出した。ノックインアレルを含むヘテロ接合マウスを得るため、全身でＣｒｅリコンビナーゼを発現するＥＩＩａ−Ｃｒｅマウスと生殖系列伝達Ｆ１系列とをかけ合わせた。点変異を含む１つのアレルを有するｅｋｌｆヘテロ接合体を相互交雑し、ホモ接合のｅｋｌｆ（Ｋ７４Ｒ）ノックインマウスを達成した。

【0084】

ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ

【0085】

標準的な手順に従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを調製し、そしてｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（ＲＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを逆転写した。検証済みのＴａｑＭａｎアッセイを用いて、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）装置上で、デフォルトのサイクリング条件下（５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、そして６０℃で１分を４０サイクル）で行った。段階希釈したｃＤＮＡ試料の標準曲線から相対的なＥＫＬＦ（Ｍｍ０４２０８３３０＿ｇ１およびＭｍ００５１６０９６＿ｍ１；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の発現レベルを決定し、そして、その後、β−アクチン（Ａｃｔｂ：Ｍｍ００６０７９３９＿ｓ１；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＧａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の発現レベルに対して標準化した。

【0086】

骨髄移植（ＢＭＴ）

【0087】

２７Ｇニードル／シリンジおよび１９Ｇニードル／シリンジを用いて、ＣＤ４５．２／ＥＫＬＦ（Ｋ７４Ｒ）ドナーマウス（８〜１０週齢）の大腿骨、脛骨、および上腕骨からマウスの骨髄を抽出し、集め、そしてストレーナーに通し、そしてその後、Ｌｉｏｕら（２０１４）に記載された方法に従って、造血幹細胞（ＨＳＣ）のプールを単離した。８〜１０週齢のレシピエントＣＤ４５．１／ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、致死量（１０Ｇｙ）または致死量の半量（５Ｇｙ）のＸ線を照射した。単離された骨髄ＨＳＣ混合物を、Ｘ線照射されたレシピエントマウスの尾静脈に注入した。フローサイトメトリー解析により、各レシピエントマウスでのＢＭＴの成功を確認した。そして、ＢＭＴの８〜９週後に、下記に記載する肺コロニーアッセイにより抗腫瘍形成性を評価した。

【0088】

寿命の測定

【0089】

これは、標準的な手順に従った。Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）の動物施設で、ＥＫＬＦ（Ｋ７４Ｒ）ノックインマウスの寿命を追跡調査した。

【0090】

腫瘍形成に対する抵抗性のアッセイ

【0091】

ＥＫＬＦ（Ｋ７４Ｒ）Ｋｉｎマウスおよび野生型マウス（グループあたり３匹）のそれぞれの尾静脈に、静脈内投与（ｉ．ｖ．注入）で、ネズミの転移性メラノーマ細胞Ｂ１６−Ｆ１０（１０^６細胞／０．２ｍＬ）を注入し、これらの細胞からの腫瘍形成および転移の可能性を検査した。Ｂ１６−Ｆ１０細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスに由来し、そしてＣ５７ＢＬ／６マウス（野生型およびＥＫＬＦ（Ｋ７４Ｒ）ノックインマウス）と免疫学的に適合するため、この細胞を試験に選んだ。２週間後、マウスをＣＯ_２で窒息死させ、そして肺を取り出し、さらに検査した。肺表面上の転移性結節を、画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｉｎｃ．）を用いて測定した。各マウスの腫瘍数の測定は、注入から１４日後に行った。肺のコロニゼーションアッセイを成功させる１つの重要な秘訣は、注入に際して適切な数のがん細胞を用いることである。一般に、多くの場合、２〜３の異なる量のがん細胞が注入に用いられる。そして、注入から２〜６週間後に肺の腫瘍コロニーを定量し、そして比較した。

【0092】

フローサイトメトリー解析およびセルソーティング

【0093】

Ｅ１４．５ネズミ胎児の肝臓細胞を４０ｍｍナイロンセルストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通してろ過し、単細胞の懸濁液を得た。補足表１でリストするように、細胞表面マーカーに対する次の抗体、抗Ｌｉｎ、抗Ｓｃａ−１、抗ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、抗ＣＤ３４、抗Ｔｈｙ１．１、抗Ｆｌｋ２、抗ＣＤ１６／３２、ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ、抗Ｔｅｒ１１９、抗ＣＤ４２ｄ、抗ＣＤ４１、抗Ｇｒ−１、抗Ｆ４／８０、および抗３３Ｄ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、の異なる組み合わせを用いて、異なる型の造血細胞を同定した。抗体による免疫染色後、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて細胞を解析するか、あるいはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ ＳＯＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてソートした。

【表S1】

【0094】

ＲＮＡ解析

【0095】

ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｅ１４．５ネズミ胎児の肝臓から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、純化された細胞のミクロスケールのＲＮＡを単離した。その後、ＲＴ−ｑＰＣＲ解析をするために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ＲＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行い、そしてＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＬＣ４８０ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置を用いて、産物を検出した。ｑＰＣＲ解析に用いたプライマーの配列は、補足表２に示されるホームデザインしたものであるか、オンラインのデータベースであるＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ：ｈｔｔｐ：／／ｐｇａ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒｂａｎｋからダウンロードしたものである。

【表S2】

【0096】

免疫蛍光染色解析

【0097】

上記のフローソーティングによって純化されたＬＳＫ（Ｌｉｎ⁻、Ｓｃａ−１^＋、およびｃ−Ｋｉｔ^＋）−ＣＤ３４⁻−Ｆｌｋ２⁻のＬＴ−ＨＳＣを懸濁し、そして、４ウェルのカルチャースライド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＥＺ ＳＬＩＤＥ）上で、１％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理を施し、そしてマウス抗マウスＣＳＦ２ＲＢ（Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ）またはホームメイドのウサギ抗マウスＥＫＬＦ（ＡＥＫ、Ｓｈｙｕら、２００６）で染色した。抗マウスおよび抗ウサギの２次抗体には、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８および５４３を接合した。４９−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、核の染色に用いた。ＬＳＭ７１０およびＬＳＭ５１０を用いて、蛍光の励起および画像の表出を達成した。画像データはＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて解析した。

【0098】

メチルセルロースコロニー形成アッセイ

【0099】

ＭｉｌｌｅｒおよびＬａｉ（２００５）による記述に従って、このアッセイを行った。マウス胎児の肝臓から蛍光活性セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて純化されたＬＴ−ＨＳＣを、幹細胞用の培地（無血清拡張培地、ＳＴＥＭＣＥＬＬ）で培養した。ｒｍＳＣＦ、ｒｈＩＬ−６、ｒｍＩＬ−３を含むがｒｈＥＰＯを含まない培地（ＧＦ Ｍ２５３４、ＳＴＥＭＣＥＬＬ）にＬＴ−ＨＳＣを再播種し、そして播種から１４日後に、形成されたコロニーの数を数えた。

【0100】

統計

【0101】

両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）を用いて有意差を求めた。０．０５以下のｐ値を有意とみなした。

【0102】

実施例１ ＥＫＬＦの枯渇による造血細胞の恒常性の乱れ
赤血球系列に対する巨核球系列の分化以外の、造血系の恒常性におけるＥＫＬＦの調節効果を検査するために、本発明者らはまず、遺伝子標的化戦略を用いてＥｋｌｆ遺伝子ノックアウト（ＫＯ）を有するモデルマウスを産出した（図１Ａ）。ホモ接合型Ｅｋｌｆ^−／−マウスはＥ１４．５日で胎生致死であり、そして変異型の胚は貧血で、部分的にグロビン遺伝子の発現の欠如によるアルビノ様の形質を示した（図１Ｂ）。その後、本発明者らは、Ｅｋｌｆ^＋／＋（ＷＴ）マウスおよびＥｋｌｆ^−／−（ＫＯ）マウスからＥ１４．５胎児肝臓をそれぞれ調製し、そして異なる組み合わせの抗体で染色した後に、フローサイトメーターを用いて細胞をソートした。先行研究（Ｆｒｏｎｔｅｌｏら、２００７）から予想されるように、ＥＫＬＦの不在は、ＫＯマウスのＥ１４．５胎児肝臓において、赤血球の大きな減少と、そして同時に、巨核球の増加を引き起こした（図１Ｃ）。

【0103】

驚くべきことに、本発明者らは、ＷＴのＥ１４．５胎児肝臓と比較してＫＯのＥ１４．５胎児肝臓においては、ＭＰＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰ、単球、および樹状細胞を含む多くの型の造血細胞の数も増えていることを見出した。一方で、ＣＬＰおよび顆粒球の数は変わらなかったが、ＬＴ−ＨＳＣとマクロファージの数は減少した（図２および表１）。

【表1】

【0104】

上記データは、ＥＫＬＦが、造血系の恒常性を幅広く調節することを実証する。特に、この因子の存在は、骨髄単球系統のすべての前駆細胞を増やし得る。同様に、ＥＫＬＦはＬＴ−ＨＳＣの恒常性も調節するようである（下記を参照のこと）。

【0105】

実施例２ 造血幹細胞および前駆細胞における、ＥｋｌｆおよびＣｓｆ２ｒｂの発現パターン
ＥＫＬＦの造血系に対する調節効果の分子的な基盤を解明するために、本発明者らはまず、ＬＴ−ＨＳＣおよび異なる造血前駆細胞における、ＥｋｌｆのｍＲＮＡのレベルを解析、そして比較した。ＷＴのＥ１４．５胎児肝臓におけるｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ解析が示すように、ＭＥＰ内のＥｋｌｆのｍＲＮＡのレベルは、マウスの赤白血病（ＭＥＬ）細胞でのレベルと同等であり、一方で、ＣＭＰおよびＧＭＰにおけるレベルは非常に低かった（図３Ａ、左の棒グラフ）。このＥｋｌｆの発現パターンは、成体マウスの骨髄から単離されたＭＥＰ、ＣＭＰ、およびＧＭＰの解析に由来する発現パターン（Ｆｒｏｎｔｅｌｏら、２００７）と類似した。しかし、驚くべきことに、Ｅ１４．５胎児肝臓のＭＰＰおよびＬＴ−ＨＳＣにおけるＥｋｌｆのｍＲＮＡのレベルは比較的高く、ＭＥＰにおけるレベルのおよそ５０％であった（図３Ａ、左の棒グラフの右の２つの棒）。ＬＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰで例示するように（図３Ａ、右の棒グラフ）、ＫＯマウスのＥ１４．５胎児肝臓の上記の型の細胞においては、予想通りＥｋｌｆのｍＲＮＡは存在しなかった。

【0106】

造血系の恒常性は、ＬＴ−ＨＳＣの自己再生と、様々なサイトカインおよびシグナル伝達経路によって分化能を調整される異なる造血前駆細胞の増殖とのバランスに、部分的に依存する（Ｇｈｉａｕｒら、２０１３；Ｋｅｎｔら、２０１３；Ｗａｎｇら、２０１３）。ＫＯマウスのＥ１４．５胎児肝臓における造血細胞の集団の変化（図１）という点から、本発明者らは、造血幹細胞および前駆細胞の増殖、自己再生、および／または維持に関与することが知られているＣｓｆ２ｒｂ、Ｓｔａｔ１、およびＳｔａｔ２の３遺伝子（ＡｎａｍおよびＤａｖｉｓ、２０１３）の発現について、定量的ＲＴ−ｑＰＣＲ解析を行った。図３Ｂに示すように、Ｅｋｌｆのノックアウトにより、ＣＭＰおよびＧＭＰにおいてＳｔａｔ１のｍＲＮＡおよびＳｔａｔ２のｍＲＮＡのレベルは変わらないままであったが、これらのｍＲＮＡのレベルはＭＥＰにおいて増加した。一方で、ＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦの受容体の共通サブユニットＣＳＦ２ＲＢをコードするＣｓｆ２ｒｂのｍＲＮＡのレベルは、ＭＰＰと同様にこれら３つの前駆細胞において、大幅に増加した（図３Ｂ）。

【0107】

本発明者らはさらに、ＬＴ−ＨＳＣにおけるＣｓｆ２ｒｂのｍＲＮＡの発現レベルについて解析した。図４Ａに示すように、ＬＴ−ＨＳＣにおいても、ＥＫＬＦの枯渇によりＣｓｆ２ｒｂのｍＲＮＡは増加した。蛍光免疫共染色により、ＫＯマウスのＥ１４．５胎児肝臓のＬＴ−ＨＳＣにおいて、ＣＳＦ２ＲＢタンパク質のレベルも上昇することを示した（図４Ｂ）。興味深いことに、ＥＫＬＦは主にＬＴ−ＨＳＣの細胞質に存在しており（図４Ｂ）、これは赤血球前駆細胞において以前から観察されていた分布パターンに類似した（Ｓｈｙｕら、２０１４）。

【0108】

実施例３ ＬＴ−ＨＳＣの複数系列への分化決定の、ＥＫＬＦによる負の調節
Ｅｋｌｆ^−／−マウスのＥ１４．５胎児肝臓におけるＬＴ−ＨＳＣ数の減少の基盤について、さらに理解するために、本発明者らは、ＭｉｌｌｅｒおよびＬａｉ（２００５）によって記載されるように、ソートされたＬＴ−ＨＳＣのコロニー形成アッセイを行った。予想されるように、プレート上のサイトカインを含まないメチルセルロース培地で、Ｅｋｌｆ^＋／＋またはＥｋｌｆ^−／−どちらかのＥ１４．５胎児肝臓からソートして純化したＬＴ−ＨＳＣを培養したときには、コロニーは形成されなかった（データは示さない）。しかし、サイトカイン／因子ｒｍＳＣＦ、ｒｈＩＬ−６、およびｒｍＩＬ−３を用い、ｒｈＥＰＯを用いずにインキュベートしたとき、１０^３個のＷＴのＬＴ−ＨＳＣの内、およそ１５０個がコロニーを形成した（図４Ｃ、棒グラフの左の棒）。さらに、Ｅｋｌｆ^−／−のＥ１４．５胎児肝臓からのＬＴ−ＨＳＣは、サイトカイン／因子による刺激に関して、より頑強な分化能を獲得し、これはコロニー数の２．５倍の増加に反映された（図４Ｃ、棒グラフの右の棒）。図４Ｃのデータは、ＥＫＬＦが、部分的には、ＬＴ−ＨＳＣが下流の造血前駆細胞へと過剰に分化することを防ぐことにより、通常の条件下でＬＴ−ＨＳＣの恒常性を維持するということを示す。

【0109】

実施例４ ＥＫＬＦ（Ｋ７４Ｒ）マウスの骨髄の、ＷＴマウスへの移植が、ＷＴマウスに腫瘍抵抗性を与える
ＥＫＬＦのＫ７４Ｒ変異アレルを持つトランスジェニックマウスを、国際公開第０３６７２７２０１６号に記載される手順に従って産出した。

【0110】

本実施例において、ＣＤ４５．１／野生型マウス（レシピエント）に、ＣＤ４５．２／ＥＫＬＦ（Ｋ７４Ｒ）マウス（ドナー）の骨髄を移植し、その後、上述の腫瘍コロニーアッセイを用いて、各レシピエントマウスの腫瘍抵抗性を評価した。

【0111】

図５Ａに示すように、ＥＫＬＦ（Ｋ７４Ｒ）マウスからの骨髄ＨＳＣ細胞の移植の後、ＷＴマウスは、メラノーマ細胞の静脈内注入によって誘導される肺病巣の数の有意な減少（約３倍低い）によって立証されるように（図５Ｂ）、はるかに強い腫瘍抵抗性を有するようになった。このデータは、骨髄移植によって他のマウスに移され得る、遺伝的に操作された造血／血液系によって、ＥＫＬＦのＫ７４Ｒマウスの腫瘍抵抗能力が与えられるということを示す。

【図1A】

【図1BC】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4AB】

【図4CD】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]