特許 6849649 乳酸菌（ＬＡＢ）とバチルスの両方を播種した発酵乳

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6849649

(24)【登録日】2021年3月8日

(45)【発行日】2021年3月24日

(54)【発明の名称】乳酸菌（ＬＡＢ）とバチルスの両方を播種した発酵乳

(51)【国際特許分類】

   A23C 9/127 20060101AFI20210315BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20210315BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20210315BHJP

   C12R 1/07 20060101ALN20210315BHJP

【ＦＩ】

   A23C9/127

   C12N1/00 B

   !C12N1/20 A

   C12R1:07

【請求項の数】12

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2018-500306(P2018-500306)

(86)(22)【出願日】2016年6月30日

(65)【公表番号】特表2018-518982(P2018-518982A)

(43)【公表日】2018年7月19日

(86)【国際出願番号】EP2016065327

(87)【国際公開番号】WO2017005601

(87)【国際公開日】20170112

【審査請求日】2019年6月28日

(31)【優先権主張番号】15176049.3

(32)【優先日】2015年7月9日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】503260310

【氏名又は名称】セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】カーリン ベェアア

(72)【発明者】

【氏名】メデ ディーネス カントー

(72)【発明者】

【氏名】トマス ヤンセン

(72)【発明者】

【氏名】パトリク デークス

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 韓国公開特許第１０−２００７−０１１０９８９（ＫＲ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５３９９８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５３１１９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−１１７２００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４４７２６８５（ＣＮ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１３−０１２２２４３（ＫＲ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３３００１４７（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ２３Ｃ １／００−２３／００

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

ＦＳＴＡ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

乳酸菌発酵乳製品を製造する方法であって、以下の工程：
（ａ）２２℃〜４５℃の温度での適切な条件下、１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌（ＬＡＢ）、及び１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌を乳に播種して、当該乳のｐＨが所望の３．５〜５．５に達するまで発酵させる工程、ここで当該乳のバチルス細菌発酵が、当該乳のＬＡＢ発酵の開始の５時間前から４時間後の間に開始される；
を含み、前記工程（ａ）において、バチルス細菌が、以下：
バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アリアブハッタイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ）、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・メチロトロフィクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、バチルス・モヤウェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ）、バチルス・シアメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・シムプレクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・テクイレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ）、及びバチルス・ヴァリスモルティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ）
からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌であり、乳酸菌が、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である、方法。

【請求項2】

前記工程（ａ）における発酵乳が、請求項１に記載の条件と比較してバチルス細菌を乳に播種しない点のみが異なる条件下で行われた比較方法におけるよりも早くｐＨ＝４．５に達する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記工程（ａ）において播種されるバチルス細菌が、バチルス・プミルス又はバチルス・スブチリスからなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。

【請求項4】

前記工程（ａ）において、１０^６〜１０^１０ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌（ＬＡＢ）及び１０^５〜１０^９ｃｆｕ／ｍｌのバチルス細菌が播種される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記工程（ａ）の適切な条件が、以下：
（ｉ）温度３６〜３８℃；及び
（ｉｉ）発酵時間２〜１００時間；
を含み、前記工程（ａ）の所望のｐＨが４．４〜４．６である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記工程（ａ）における乳のバチルス細菌発酵が、当該乳のＬＡＢ発酵の開始の５分前から５分後の間に開始される。請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記工程（ａ）における乳酸菌及びバチルス細菌が、２０分未満の時間内に、好ましくは５分未満の時間内に乳に播種される。請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記工程（ａ）における発酵乳が、請求項１に記載の条件と比較してバチルス細菌を乳に播種しない点のみが異なる条件下で行われた比較方法におけるよりも１時間早くｐＨ＝４．５に達する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記工程（ａ）における乳が牛乳である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記乳酸菌で発酵した乳製品が：ケフィア、ヨーグルト、チーズ、サワークリーム、クレームフレーシュ、クミス（Ｋｕｍｉｓ）、培養バターミルク（Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｕｔｔｅｒｍｉｌｋ）及びアシドフィルスミルク（Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｌｋ）、からなる群から選択される１つ以上の発酵乳製品である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

乳酸発酵乳製品を製造するための組成物であって、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と、以下：
バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アリアブハッタイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ）、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・メチロトロフィクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、バチルス・モヤウェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ）、バチルス・シアメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・シムプレクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・テクイレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ）、及びバチルス・ヴァリスモルティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ）
からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌とを含有するスターター培養物を含む、組成物。

【請求項12】

乳酸菌発酵乳製品を製造するためのバチルス細菌の使用であって、２２℃〜４５℃の温度での適切な条件下、１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌（ＬＡＢ）、及び１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌を乳に播種して、当該乳のｐＨが所望の３．５〜５．５に達するまで発酵させ、当該乳のバチルス細菌発酵が、当該乳のＬＡＢ発酵の開始の５時間前から４時間後の間に開始され；そして
前記バチルス細菌が、以下：
バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アリアブハッタイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ）、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・メチロトロフィクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、バチルス・モヤウェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ）、バチルス・シアメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・シムプレクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・テクイレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ）、及びバチルス・ヴァリスモルティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ）
からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌であり、前記乳酸菌が、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳酸菌（ＬＡＢ）とバチルスの両方を播種して乳を発酵させる工程を含む、乳酸発酵乳製品を製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

乳酸菌（ＬＡＢ）は、ヨーグルトやチーズ等の様々な発酵乳製品の製造のため、乳業において集中的に使用されている。Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）ステータスを達成している。

【0003】

Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）は、その化合物又は物質の食品への添加が安全であると専門家によって認められたことを示すＡｍｅｒｉｃａｎ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）の表示である。

【0004】

乳酸菌は、グラム陽性、微好気性又は嫌気性細菌であり、糖類を発酵して、優勢に生産される酸として乳酸、酢酸及びプロピオン酸を含む酸を生成する。産業上最も有用な乳酸菌はラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ロイコノストク種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）、ペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びエンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）を含む「ラクトバチラレス」目、並びにブレビバクテリウム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）及びプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）を含む「アクチノマイケタレス」目に見られる。

【0005】

バチルス細菌は、乳酸菌とは見做されない。

【0006】

従来技術は、例えばＵＳ２００９／００１１０８１Ａ１（下記参照）等において、ヨーグルト等の発酵乳製品を製造するためのそのようなバチルス細菌の（即ちラクトバチルスやラクトコッカス等のＬＡＢスターター培養物を添加しない）使用を記載している。

【0007】

ＵＳ２００９／００１１０８１Ａ１は、バチルス・スブチリスｖａｒ．ナット（ｎａｔｔｏ）株の、ヨーグルト製造の為の使用を記載している。Ｂ．スブチリスｖａｒ．ナット株は、ヒト病原体と見做されず、ＧＲＡＳに分類されている。Ｂ．スブチリスｖａｒ．ナット株は、幾つかの望ましくない他の細菌（例えば望ましくない大腸菌）の増殖を抑制でき、血栓症治療能力を有すると考えられている衛生的化合物ナットウキナーゼを生成し得るため、Ｂ．スブチリスｖａｒ．ナット株によって製造されたヨーグルトは、心臓血管疾患を防ぐ能力を有する可能性がある。ＵＳ５０７７０６３は、発酵乳製品を製造するためのバチルス・スブチリス株の使用を記載する。この文献は、バチルス細菌株によって生産された抗細菌物質が、棚寿命が長く、活性な治療的及び予防的特性を有する、製品の調製を保証することを記載している。

【0008】

要するに、従来技術は、バチルス細菌の好ましい抗細菌的及び治療的特性に基づく、バチルス細菌の使用を記載している。

【0009】

ＣＮ１０３３００１４７Ａは、２段階の方法を用いて発酵乳を製造する方法を記載している。第１の工程において、乳は、バチルス・スブチリスによって発酵され、バチルスが生産したプロテアーゼによって、スキムミルク中のタンパク質が、アミノ酸又はポリペプチドに分解される。第２の工程において、このバチルス発酵乳に乳酸菌（ラクトバチルス・プランタルム）が添加され、乳酸菌発酵（即ちｐＨの低下−酸性化）が実行される。要約において、この２段階の手順が、ラクトバチルス・プランタルムの増殖において優位をもたらすと言及されている。第１の工程において、乳は、バチルス・スブチリスを用いて４８時間発酵される（例えば［００１８］を参照、そしてその後（工程２）、ラクトバチルス・プランタルムが添加された）。

【0010】

Ｒｏｓｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．の文献（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｌａｃｔｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｉｎ ｍｉｌｋ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｏｏｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １０３（１）， ｐｐ． ６９−７７ （２００５））は、ラクトコッカス又はラクトバチルスがバチルス・セレウスの増殖及び胞子形成を阻害する能力が検証されている。Ｂ．セレウスは、望ましくない病原体と見做され、様々な種類の食品に混入し、当然ＧＲＡＳステータスを有しない。解析を行うため、乳に少量の（１０^２ Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔｓ （ｃｆｕ）／ｍｌ）Ｂ．セレウス及びラクトバチルス又はラクトコッカス株を播種し、共培養／発酵した。Ｂ．セレウスを少量しか播種しないのは、ラクトコッカス又はラクトバチルスがバチルス・セレウスの増殖及び胞子形成を阻害する能力を検証するものであり、市販される発酵乳製品（ヨーグルト又はチーズ等）の製造に関するものではない、この文献の目的に適っている。当業者は、病原性のバチルス・セレウスを、ヨーグルト等を製造するために乳に播種しようとは考えない。

【0011】

ＣＮ１０３１９０４７８Ａは、レバンを含有するヨーグルトを製造する方法を開示し、以下の工程：１）レバンスクラーゼを生産する細菌株を培養して、当該株が放出したレバンスクラーゼ酵素を含有する発酵ブロスを取得する工程、２）工程１）で取得した発酵ブロスを遠心分地して上清と細菌細胞とを分離する工程、３）硫酸アンモニウムを上清に添加して酵素タンパク質を沈殿させ、遠心分離してタンパク質沈殿物を取得し、そしてそのタンパク質沈殿物を精製して純粋なレバンスクラーゼを取得する工程、及び４）生乳にスクロースと純粋なレバンスクラーゼを添加し、乳酸菌を播種し、この混合物を発酵して、レバンを含有するヨーグルトを製造する工程、を含む。レバンスクラーゼを生産する細菌株は、例えば、バチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ１４５８０及びバチルス・スブチリスＡＴＣＣ６０５１であり得る。乳酸菌は、ラクトバチルス・ブルガリクスＣＩＣＣ６０４６及びストレプトコッカス・サーモフィルスＣＩＣＣ６０３８又はそれらの混合物であり得る。

【0012】

ＫＲ２００９００３９９４１Ａは、乳酸菌とバチルスの混合物を用いてルブス・コレアヌスＭｉｇ及びクロレラの混合物を用いて機能性発酵材料を製造する方法を開示する。

【0013】

ＵＳ−Ａ−３ ６７４ ５０８は、実施例において、Ｓ．サーモフィルス及びＢ．ステレオサーモフィルスの組み合わせを使用してチーズ香を有する産物を得る、チーズ香を有する発酵乳産物を製造する方法を開示している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明により解決すべき課題は、乳酸菌発酵乳製品（例えばヨーグルト等の乳性食品）を製造する方法であって、乳酸発酵がより迅速に所望のより低いｐＨ（例えばｐＨ４．５付近）に達する方法を提供することである。

【0015】

バチルス細菌が一般に低いｐＨで最適に増殖しないことは、本分野で公知である。従って、ＣＮ１０３３００１４７Ａの従来技術の２段階の方法（上記で論じた）は、ＬＡＢスターター培養物を添加する第２段階の前４８時間に渡りバチルスだけで発酵させる第１の工程が、バチルスが乳の中性付近のｐＨ＝６で好適に動作する十分な時間を確保するのであるから、当業者によって一見して好ましいものと見なされ得る。

【0016】

本発明者らは、そのような従来技術に関連する２段階の方法を試験した。

【0017】

本明細書の実施例１に見られるように、試験された従来技術の２段階の方法は、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）では適切に動作しなかった。

【0018】

プレインキュベーション後バチルス・プミルスで２４時間発酵を行い（即ち従来技術の２段階の方法の第１段階）、続いてＳ．サーモフィルスで発酵する（即ち従来技術の２段階の方法の第２段階）と、発酵乳が２つの相に分離し（図１の上の画像）、望ましくない黄色を有していた（図１の下の画像）。そのような相分離や黄色は、バチルスのプレインキュベーションを用いる概念（即ち従来技術の２段階の方法）の適用の間に顕著な問題をもたらし得る。

【0019】

更に本明細書の実施例１で論じているように（図２も参照）、従来技術の２段階の方法において、Ｓ．サーモフィルス単独の場合と比較して、酸性化活性の改善は無かった。

【0020】

本明細書の実施例２は、バチルス・スブチリスにおいても従来技術の２段階の方法が適切に動作しなかったので、実施例１におけるバチルス・プミルスと同様に、バチルス・スブチリスも本質的に同様であることが実証された。

【課題を解決するための手段】

【0021】

本明細書中で論じるように、発明者らは、異なる１段階の発酵方法を試験した（即ちバチルス及び乳酸菌の両方による１段階の乳酸発酵工程）。

【0022】

従来技術の２段階の方法と反対に、本発明の１段階の発酵方法（例えばバチルス及び乳酸菌の両方による１段階の乳酸発酵工程）は真に良好に動作し、即ち酸性化活性の顕著な改善が見られた（本明細書の多くの実施例を参照）。

【0023】

更に、そして本明細書の実施例で論じるように、本発明の１段階の発酵方法は、商業的に重要な発酵乳製品をもたらす（例えば望ましくない相分離や黄色を呈さない、実施例６参照）。

【0024】

下記表は、本明細書中の実施例において本発明の１段階の発酵方法で好ましく動作することが示された様々なバチルス及び乳酸菌を示し、即ちこれらの乳酸発酵は、所望の低いｐＨ（例えばｐＨ４．５付近）に迅速に到達した。

【表1】

【0025】

従って、本発明の１段階の発酵方法は、異なる属の異なる３つのＬＡＢ及び多くの異なるバチルスにおいて動作することが示されている。

【0026】

理論に拘束されず、従って、それがいわゆるクラス効果である筈が無い、即ち本発明が実質的に全ての本願に関連するバチルス細胞及びＬＡＢ細胞の組み合わせにおいて動作する筈が無い、と考える顕著な技術的根拠が無い。

【0027】

更に、本願の実施例６等に示されるように、所望の特定のＬＡＢ（例えばストレプトコッカス）において、適切な良好に動作するバチルス株を特定するための小スケール（例えば１ｍｌ乳）スクリーニングアッセイを設定することは、比較的容易である。

【0028】

従って、本発明の第一の側面は、乳酸菌発酵乳製品を製造する方法に関し、当該方法は、以下の工程：
（ａ）２２℃〜４５℃の温度での適切な条件下、１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌（ＬＡＢ）、及び１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌を乳に播種して、当該乳のｐＨが所望の３．５〜５．５に達するまで発酵させる工程、ここで当該乳のバチルス細菌発酵が、当該乳のＬＡＢ発酵の開始の５時間前から４時間後の間に開始される；
を含み、前記工程（ａ）におけるバチルス細菌は、以下：
バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アリアブハッタイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ）、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・メチロトロフィクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、バチルス・モヤウェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ）、バチルス・シアメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・シムプレクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・テクイレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ）、及びバチルス・ヴァリスモルティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ）
からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌である。

【0029】

上に列挙した全てのバチルス細菌種は健康であり、そのため病原性ではない。

【0030】

上記のように、バチルス・セレウスは病原性と考えられているため、そのような病原性バチルスの使用は、食料／飼料製品を製造する本発明においてそのような商業的関心の対象とならない。

【0031】

例えば、食品及び飼料に意図的に添加されるＱＰＳ生物剤のリストの維持に関するＥｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ （ＥＵ） Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ （ＥＦＳＡ） Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｈａｚａｒｄｓ （ＢＩＯＨＡＺ） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｐｉｎｉｏｎには（２０１３年改訂）、本発明の第一の側面で列挙したバチルス細菌種に関し、「毒性活性無し」と記載している。

【0032】

また、このＥＦＳＡ２０１３のレポートは、バチルス・セレウスに関し「病原性の証拠が増えている」と言及している。

【0033】

更に、ＥＦＳＡ２０１３のレポートの引用文献は「ＥＦＳＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１３；１１（１１）：３４４９ ［１０８ ｐｐ．］． ｄｏｉ：１０．２９０３／ｊ．ｅｆｓａ．２０１３．３４４９」であり、本願の出願時点で「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｆｓａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｅｎ／ｅｆｓａｊｏｕｒｎａｌ／ｄｏｃ／３４４９．ｐｄｆ」のリンクからダウンロード可能である。

【0034】

例えば本明細書の実施例７に論じるように、記載されたような第一の側面の方法は、本明細書中で記載する第一の側面の方法の工程（ａ）において、１０^４ｃｆｕ／ｍｌ付近（好ましくは１０^５ｃｆｕ／ｍｌ付近）を下回るバチルス細菌を用いることにより、商業的に許容されるレベルで動作しないと考えられる。

【0035】

上記のように、Ｒｏｓｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． （２００５）の文献において、少量（１０^２ｃｆｕ／ｍｌ）のＢ．セレウスが乳に播種され、これはこの文献の目的に沿い、それは、ラクトバチルス又はラクトコッカスがバチルス・セレウスの増殖を阻害する能力の調査に関し、商業に関連する発酵乳製品（ヨーグルト又はチーズ）の製造に関するものではない。

【0036】

従って、本明細書中の実施例で試験された非病原性バチルス細菌は、Ｒｏｓｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． （２００５）の文献中で開示されたような少量（１０^２ｃｆｕ／ｍｌ）のバチルス細菌の使用により適切に動作しなかった。

【0037】

上記のように、第一の側面の工程（ａ）は、ＬＡＢ及びバチルス細菌の両方の存在下で１段階同時発酵を有することである。

【0038】

ＬＡＢ及びバチルス細菌が時間的に同じ点で乳に播種された場合これが得られることは明らかである。

【0039】

しかしながら、当業者が理解するように、この文脈で、ＬＡＢとバチルス細菌は、関連する短い時間範囲の中の異なる点で乳に播種されてもよい。この事実は、第一の側面の工程（ａ）における「当該乳のバチルス細菌発酵が、当該乳のＬＡＢ発酵の開始の５時間前から４時間後の間に開始される」という記載に反映されている。

【0040】

当業者にとって、「乳のＬＡＢ発酵の開始」を決定することは容易であり（例えば乳中の乳酸量の増大を測定し、及び／又はｐＨの酸性化を測定することにより）、故に勿論、当業者にとって、上記時間間隔の範囲の規定を満たすために乳のバチルス細菌発酵を開始する時間における適切な点を同定することも容易である（例えばバチルス細菌を播種する時間の点を適切に選択することにより）。

【0041】

工程（ａ）に関連して、現在の文脈において、「バチルス細菌発酵の開始」及び「乳のＬＡＢ発酵の開始」は、乳が細菌発酵のための適切な温度を有する前であることは出来ないことが理解され、また、実際、ほとんど全ての商業関連の細菌株は、２２℃未満及び４５℃超の温度で顕著な発酵を有しないことが理解される。

【0042】

従って、例えばバチルス細菌が１日目に乳に播種され５℃で２４時間保存された場合、この５℃での保存期間の間、工程（ａ）に関して「バチルス細菌発酵の開始」は未だなされておらず、これは、５℃ではバチルス細胞が本質的に不活性でありそのように乳を発酵しないからである。

【0043】

従って、もし前記バチルスを含有し５℃に保存した乳に２日目に乳酸菌を播種してその後温度を適切な温度（例えば３７℃）に上げるとすると、この例における「バチルス細菌発酵の開始」と「乳のＬＡＢ発酵の開始」は同時（即ち乳が細菌に適した温度に達しバチルス／ＬＡＢの顕著な発酵が実際に始まった時）にされたことになる。

【0044】

実施例で論じるように、バチルス細胞（単独）による発酵はｐＨを顕著に低下させなかった。

【0045】

従って、理論に拘束されず、本明細書中で開示する実験結果は、本明細書中に記載される第一の側面の１段階の発酵方法に従い共培養された場合、何らかの方法によるバチルス又はそれ以外が、ＬＡＢのｐＨ低下能力を増大／増幅することを示す。

【0046】

本明細書中の実施例１に示すように、本願１段階の方法に関連して、本発明の第一の側面の発酵工程（ａ）における試験されたバチルス・プミルス株の顕著な増殖は無かったようである。実際に、それらは発酵プロセスの過程で殆ど死んでいた（おそらくｐＨの低下による）。これは、最終的な乳酸菌発酵乳製品中にバチルス細胞がほとんど又は全く存在しないことになるため、有利であり得る。

【0047】

本願実施例５に論じるように、発明者らは、バチルス株のタンパク質分解系がＬＡＢの増殖促進効果に寄与することに関する従来技術の理論（例えば上記ＣＮ１０３３００１４７Ａ）をチェックする実験を行った。

【0048】

プロテイナーゼ陰性ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を通常のラクトコッカス・ラクティス株と比較し、バチルス株のタンパク質分解系が主要な要因であったら、プロテイナーゼ陰性ＬＡＢにおけるｐＨ低下効果が正常なＬＡＢと比較して相対的により高いことが予想される。

【0049】

しかしながら、実施例５の実験において、プロテイナーゼ陰性ラクトコッカス・ラクティス株の増殖は、他の試験されたラクトコッカス・ラクティス株と比較してそれほど促進しなかった。

【0050】

従って、理論に拘束されず、バチルス細胞のタンパク質分解系は、ＬＡＢの増殖を改善／増幅する本願で議論する正の相乗効果に関与する唯一の重要な要素ではないようである。

【0051】

要するに、本願実験結果に基づき、バチルス細胞は、同時の共培養の過程で、ＬＡＢ細胞に何らかの正の影響をもたらすようである。

【0052】

更に、バチルス細胞の正の影響は、乳のＬＡＢ乳酸発酵の特に開始時に高い重要性を有すると考えられる。

【0053】

例えば実施例９に論じるように、適切に選択されたバチルス細胞を使用して、例えばテクスチャー特性の改善及び／又はビタミンＫ含量の増大等の商業関連の更なる特性を有する発酵乳製品を作製し得る。

【0054】

更に、本発明は、乳酸発酵乳製品を製造するための組成物であって、１つ以上の乳酸菌と、以下：
バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アリアブハッタイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ）、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・メチロトロフィクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、バチルス・モヤウェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ）、バチルス・シアメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・シムプレクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・テクイレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ）、及びバチルス・ヴァリスモルティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ）
からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌とを含有するスターター培養物を含有する、組成物に関する。

【0055】

更に、本発明は、乳酸菌発酵乳製品を製造するためのバチルス細菌の使用であって、２２℃〜４５℃の温度での適切な条件下、１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌（ＬＡＢ）、及び１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌を乳に播種して、当該乳のｐＨが所望の３．５〜５．５に達するまで発酵させ、当該乳のバチルス細菌発酵が、当該乳のＬＡＢ発酵の開始の５時間前から４時間後の間に開始され；そして
前記バチルス細菌が、以下：
バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アリアブハッタイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ）、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・メチロトロフィクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、バチルス・モヤウェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ）、バチルス・シアメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・シムプレクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・テクイレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ）、及びバチルス・ヴァリスモルティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ）
からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌である、使用に関する。

【0056】

定義
本文中の用語の全ての定義は、関連する技術的文脈との関係で当業者によって理解され得るものに従っている。

【0057】

「細菌」は、本文中、複数形である。例えば本願乳酸菌発酵乳製品が１個の細菌しか含まないことを議論するのは不合理だからである。

【0058】

「発酵」は、微生物の活動によって有機物からエネルギーを放出することを含む生化学的反応を意味する。

【0059】

「発酵乳製品（ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｍｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、動物、より具体的にはヒトの消費を対象とした製品を指し、そして乳基質の乳酸菌による酸性化乳酸発酵（ａｃｉｄｉｆｙｉｎｇ ｌａｃｔｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）から得られる。そのような製品には、例えば果実、野菜、糖、香味料の第二の成分が含まれていてもよい。

【0060】

「乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」とは、グラム陽性、微好気性又は嫌気性細菌を指し、それは、主に産生される酸として乳酸、酢酸、プロピオン酸を含む酸の産生と共に糖を発酵させる。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ロイコノストック種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）、ペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びエンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）を含めた「ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）」目内、並びにブレビバクテリウム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）及びプロピオニバクテリウム種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）を含めた「アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）」目内に見られる。加えて、偏性嫌気性細菌、ビフィズス菌、すなわちビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）の群に属する、乳酸を産生する細菌は、一般的に乳酸菌の群に含まれる。これらは、単独で、又は他の乳酸菌と組み合わせて、しばしば食品培養物として用いられる。

【0061】

「乳酸発酵」は、発酵物中の細菌による特にラクトースの消費の嫌気又は微小好気プロセスを意味し、乳酸、及び潜在的に酢酸の形成を引き起こし、ｐＨを低下する。

【0062】

「乳酸菌発酵乳製品」は、動物、より具体的にはヒトの消費を対象とした製品を指し、そして乳基質の乳酸菌による酸性化乳酸発酵（ａｃｉｄｉｆｙｉｎｇ ｌａｃｔｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）から得られる。そのような製品には、例えば果実、野菜、糖、香味料の第二の成分が含まれていてもよい。

【0063】

「乳（ｍｉｌｋ）」は、哺乳類又は植物の乳を含む。乳の例として、乳牛の乳（牛乳（ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ））、ラクダ乳、水牛の乳、山羊乳、羊乳及び豆乳が挙げられる。随意に乳を、例えば酸（クエン酸、酢酸又は乳酸）を添加することにより酸性化し、又は例えば水と混合する。乳は生のまま、又は例えば濾過、滅菌、低温殺菌、均質化することにより加工してもよく、あるいは再構成された粉乳であってもよい。本発明による「牛乳（ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ）」の重要な例は、低温殺菌された乳牛の乳である。乳は、細菌を植え付ける前、最中及び／又は後で酸性化、混合又は加工されてもよいことが理解される。

【0064】

発酵乳「スターター培養物（ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、乳酸菌のうちの少なくとも１株、例えば、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、又はストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を含む細菌培養物である。本明細書によると、発酵乳製品は、乳を植え付け、菌株が加えられている状態で乳を発酵させることによって得られる。典型的には、ヨーグルト用のスターター培養物は、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスを含有し、ほとんどの国において、ヨーグルトは、これらの２つの株を含有するスターター培養物を使用して生産された発酵乳製品として規定される。

【0065】

本発明の態様は、例示のみを目的として下記に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0066】

【図1】予めインキュベーションしたバチルス・プミルス株ＣＨＣＣ５０４２を用いて得た乳を２つの相に分けた（図１の上の画像）。予めインキュベーションしたバチルス・プミルス株ＣＨＣＣ１６７３５を用いた乳はまだ黄色であった（図１下の画像）。より詳細には、本願実施例１を参照されたい。

【0067】

【図2】Ｂ．プミルス及びＳ．サーモフィルスを用いた酸性化実験の結果を示す。より詳細には本願実施例１を参照されたい。

【0068】

【図3】Ｂ．スブチリス、Ｂ．プミルス及びＳ．サーモフィルスを用いた酸性化実験の結果を示す。より詳細には本願実施例３を参照されたい。

【0069】

【図4】異なる濃度のバチルス・プミルス株ＣＨＣＣ１６７３５によるＳ．サーモフィルスＣＨＣＣ４４６０の増殖刺激に関する実験の結果を示す。より詳細には本願実施例７を参照されたい。

【0070】

【図5】ＳＴ及びバチルスの予共培養に関する実験の結果を示す。より詳細には本願実施例８を参照されたい。

【発明を実施するための形態】

【0071】

当業者により理解されるように、本願に関連する好ましい態様の組み合わせは、尚もより好ましいものと理解され得、例えば、好ましい乳酸菌（ＬＡＢ）を好ましいバチルス細菌と一緒に使用することは、尚もよりこのましいものと理解される。

【0072】

ＬＡＢとバチルス細菌の両方による乳の発酵‐第一の側面の工程（ａ）
上記で論じたように、第一の側面の工程（ａ）は、２２℃〜４５℃の温度での適切な条件下、１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌（ＬＡＢ）、及び１０^４〜１０^１２ｃｆｕ／ｍｌのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌を乳に播種して、当該乳のｐＨが所望の３．５〜５．５に達するまで発酵させる工程であり、ここで当該乳のバチルス細菌発酵は、当該乳のＬＡＢ発酵の開始の５時間前から４時間後の間に開始される。

【0073】

当業者に理解されるように、本文中、工程（ａ）における「播種」は、乳酸菌及びバチルス細菌が活性を持って乳に添加されることを意味する。

【0074】

工程（ａ）において、異なる種類のバチルス細菌の混合物が添加され得るが、その異なる種類は、第一の側面又はその好ましい態様のリストの中の種類であるべきである。

【0075】

例えば、工程（ａ）において、１０^５ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・プミルス及び１０^５ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・スブチリスが添加され、それらは工程（ａ）における添加／播種において、合わせて２ｘ１０^５ｃｆｕ／ｍｌのバチルス細菌を与える。

【0076】

好ましい態様において、工程（ａ）において播種されるバチルス細菌は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・モヤウェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・ヴァリスモルティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ）からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌である。

【0077】

好ましくは、工程（ａ）において播種されるバチルス細菌は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・モヤウェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌である。

【0078】

好ましくは、工程（ａ）において播種されるバチルス細菌は、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌である。

【0079】

好ましいバチルス・スブチリスは、Ｂ．スブチリスｖａｒ．ｎａｔｔｏであり得る。

【0080】

好ましくは、工程（ａ）において播種される乳酸菌は、ラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ロイコノストク種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）、ペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びエンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ブレビバクテリウム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）及びプロピオニバクテリウム種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）からなる群から選択される１つ以上の乳酸菌である。

【0081】

バチルス細菌と同様、工程（ａ）において、例えばストレプトコッカス種とラクトバチルス種の混合物等、異なる種類の乳酸菌の混合物が添加され得る。

【0082】

より好ましくは、工程（ａ）において播種される乳酸菌は、ラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）からなる群から選択される１つ以上の乳酸菌である。

【0083】

尚もより好ましくは、乳酸菌はラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）からなる群から選択され、バチルス細菌は、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択される。

【0084】

尚もより好ましくは、工程（ａ）において播種される乳酸菌は、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からなる群から選択される１つ以上の乳酸菌である。

【0085】

実施例において、特に良好な効果がＳ．サーモフィルスにおいて同定された。

【0086】

従って、工程（ａ）で播種される乳酸菌はＳ．サーモフィルスが好ましくともよい。

【0087】

特に好ましくは、工程（ａ）において播種される乳酸菌は、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）であり、第一の側面の工程（ａ）において播種されるバチルス細菌は、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択される１つ以上のバチルス細菌である。

【0088】

好ましくは、工程（ａ）において、１０^５〜１０^１１ｃｆｕ／ｍｌの播種された乳酸菌（ＬＡＢ）が使用され、より好ましくは、１０^６〜１０^１０ｃｆｕ／ｍｌの播種された乳酸菌（ＬＡＢ）が使用される。

【0089】

好ましくは、工程（ａ）において、２ｘ１０^４〜１０^１０ｃｆｕ／ｍｌの播種されたバチルス細菌が使用され、より好ましくは、１０^５〜１０^９ｃｆｕ／ｍｌの播種されたバチルス細菌が使用され、特に好ましくは、１０^６〜１０^８ｃｆｕ／ｍｌの播種されたバチルス細菌が使用される。

【0090】

当業者にとって、所望のｐＨ値とするために適切な発酵条件を同定することは容易であり、それは、一般に、具体的に使用されるＬＡＢ及びバチルス細菌に依存し得る。

【0091】

適切な条件は：
（ｉ）温度２２℃〜４５℃（好ましくは３２℃〜４２℃、例えば３６℃〜３８℃）；
（ｉｉ）発酵時間２〜１００時間、例えば３〜４８時間、又は例えば１０〜３０時間；
を含み得る。

【0092】

一般に、また当業者に知られているように、好ましい／最適な発酵温度は、使用されるＬＡＢに依存し得る。例えば、幾つかのＬＡＢは２５℃で最適に増殖し、他のＬＡＢは３７℃付近で最適に増殖する。

【0093】

所望の発酵乳製品に依存して、所望のｐＨは４〜５、例えば４．４〜４．６となり得る。

【0094】

好ましくは、乳のバチルス細菌発酵の開始は、乳のＬＡＢ発酵の開始の３時間前から２時間後の時間範囲内である。例えば、乳のバチルス細菌発酵の開始は、乳のＬＡＢ発酵の開始の２時間前から１時間後の時間範囲内である。

【0095】

より好ましくは、乳のバチルス細菌発酵の開始は、乳のＬＡＢ発酵の開始の１時間前から３０分後の時間範囲内である。

【0096】

尚もより好ましくは、乳のバチルス細菌発酵の開始は、乳のＬＡＢ発酵の開始の３０分前から１５分後の時間範囲内である。

【0097】

最も好ましくは、乳のバチルス細菌発酵の開始は、乳のＬＡＢ発酵の開始の５分前から５分後の時間範囲内である。

【0098】

本文中で当業者により理解されるように、工程（ａ）においてバチルス細菌が乳を発酵するのに適した条件（例えば温度３７℃）下で乳に播種された場合、乳のバチルス細菌発酵の開始は、乳への播種と同時となる。

【0099】

乳酸菌も同様であり、即ち工程（ａ）においてＬＡＢが乳を発酵するのに適した条件（例えば温度３７℃）下で乳に播種された場合、乳のＬＡＢ発酵の開始は、乳への播種と同時となる。

【0100】

上記のように、第一の側面の工程（ａ）の主な目的は、ＬＡＢ及びバチルス細菌の両方の存在下で１段階同時発酵を行うことである。

【0101】

ＬＡＢとバチルス細菌が乳に概ね同時に播種された場合にこれが起こることは明らかである。

【0102】

従って、本発明の第一の側面の方法の好ましい態様は、工程（ａ）において、バチルス細菌とＬＡＢが、５時間未満（好ましくは２時間未満、より好ましくは１時間未満、尚もより好ましくは２０分未満、最も好ましくは５分未満）の時間範囲内で乳に播種される。

【0103】

上記に関して当業者により理解されるように、例えばバチルス細菌が最初に乳に播種され、然る後に乳酸菌が所望の好ましい時間間隔（例えば５分後）以内に当該乳に播種され得る。

【0104】

同様に、乳酸菌が最初に乳に播種され、然る後にバチルス細菌が所望の好ましい時間間隔以内に当該乳に播種され得る。

【0105】

第一の側面の方法の好ましい態様及び本文中に記載のその態様は、工程（ａ）における発酵乳が、工程（ａ）において乳にバチルス細菌を播種しない以外第一の側面の方法と同一の条件で行われた比較方法よりも早くｐＨ＝４．５に達する。

【0106】

そのような真の比較解析を実施することは当業者にとって容易であり、例えば、実施例１において簡単に行われている。本発明の好ましい態様において、当該比較方法は、以下のように行われる。

【0107】

バチルス株をＭＲＳブロスに播種し、３７℃で一昼夜インキュベーションした。当該培養物を遠心分離し、ペレットを１Ｖｏｌ．のＢ−ミルク（９９℃で３０分間煮沸した９．５％スキムミルク）で再懸濁した。Ａ．サーモフィルス株を２％ラクトースを加えたＭ１７中３７℃で前増殖し、遠心分離し、そして１Ｖｏｌ．のＢ−ミルクで再懸濁した。

【0108】

酸性化実験のため、前記再懸濁したバチルス及びＳ．サーモフィルス株を２００ｍｌのＢ−ミルク中にそれぞれ１％播種した。酸性化は、ウォーターバス中３７℃でＰＣロガーを用いてｐＨを測定することにより一昼夜追跡された。

【0109】

当業者によって理解されるように、比較方法は、（バチルス細菌を乳に播種しないことを除き）同一である、即ち、他の全て（例えば工程（ａ）において発酵される乳の量（例えば２００ｍｌ又は１００Ｌ）；温度等）は、第一の側面の方法と同一であり得る（即ち工程（ａ）におけるＬＡＢの播種）。

【0110】

好ましい態様において、工程（ａ）において発酵される乳は、工程（ａ）において乳にバチルス細菌を播種しない以外第一の側面の方法と同一の条件で行われた比較方法よりも３０分（好ましくは１時間及び尚もより好ましくは２時間）早くｐＨ＝４．５に達する。

【0111】

本発明の特定の態様において、工程（ａ）において得られる発酵乳は、工程（ａ）において乳にバチルス細菌を播種しない以外同一の条件で行われたテクスチャー比較方法によって測定した場合と比較して、テクスチャーが増大している。当該テクスチャー比較方法は、下記のようにして実施されたせん断応力を測定する方法であり得る。

【0112】

インキュベーションの翌日、発酵乳を１３℃に調整し、試料が均一になるまで、穴の空いた円盤を取り付けた棒によってゆっくり撹拌した。試料の流動学的特性は、レオメーター（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｐｈｙｓｉｃａ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ ｗｉｔｈ ＡＳＣ， Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓａｍｐｌｅ Ｃｈａｎｇｅｒ， Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ（登録商標） ＧｍｂＨ， Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて評価された。設定を以下に示す。

【0113】

待機時間（ある程度当初の構造まで再建するため）
振動又は旋回無しで５分間
振動（Ｇ＊の計算のためＧ’及びＧ’’を測定するため）
ｙ ＝０．３％、振動数（ｆ）＝［０．５…８］ Ｈｚ
６０ｓに渡り６つの測定ポイント（１０秒に１回）
旋回（３００ １／ｓでのせん断応力を測定するため）
ｙ＝［０．３−３００］１／ｓ及びｙ＝［２７５−０．３］１／ｓ
３００ １／ｓまで上げて２１０ｓに渡り２１個の測定ポイント（１０秒に１回）。
及び
０．３ １／ｓまで下げて２１０ｓに渡り２１個の測定ポイント（１０秒に１回）
更なる解析において、３００ １／ｓでのせん断応力が選択された。

【0114】

好ましくは、第一の側面の工程（ａ）における乳は、牛乳、ラクダ乳、バッファロー乳、ヤギ乳又は羊乳であり、よりこのｍ細工は、第一の側面の工程（ａ）における乳は牛乳である。

【0115】

本発明の第一の側面の方法は、商業関連の相対的に大スケールの製造方法であるのが好ましい。

【0116】

従って、第一の側面の工程（ａ）における乳の量は、少なくとも１００Ｌ、好ましくは少なくとも１０００Ｌ、尚もより好ましくは少なくとも１００００Ｌである。

【0117】

所望の量の乳酸菌（ＬＡＢ）及びバチルス細菌の両方を含有する組成物を含有するスターター培養物を作ること、そしてこのスターター培養物を第一の側面の工程（ａ）において乳に播種するために使用することが好ましい場合もある。

【0118】

従って、好ましい態様において、第一の側面の工程（ａ）における乳への播種は、乳酸菌（ＬＡＢ）及びバチルス細菌の両方を所望の量で含有する単一のスターター培養組成物を用いて行われる。

【0119】

当該単一のスターター培養組成物は、ＬＡＢ及びバチルス細菌を予め共培養して取得されたものであることが好ましい。

【0120】

発酵乳製品を製造する方法の更なる工程
当業者は、乳酸菌発酵乳製品（例えばヨーグルト又はチーズ製品）を製造する手段を承知している。従って、工程（ａ）の後の更なる工程、即ち発酵工程を、本文中で詳細に説明する必要は無い。

【0121】

更なる工程は、適切な容器中に発酵乳製品を単純に包装する工程を含み得る。適切な容器は、例えばボトル、カートン又はそれらに類似するものであり、適切な量は、例えば１０〜５０００ｍＬ又は５０〜１０００ｍＬであり得る。

【0122】

発酵乳がチーズである場合、更なる工程は、凝塊をチーズカード粒子に切り分けてチーズカードから乳清を分離する工程を含み得る。

【0123】

所望の発酵乳製品の種類に依存して、更なる工程は、他の関連する細菌の添加、例えばキモシンやペプシン等の関連する乳凝固酵素の使用等を含み得る。

【0124】

好ましくは、乳酸菌発酵乳製品は、乳性食品製品である。

【0125】

好ましくは、乳酸菌発酵乳製品は、ケフィア、ヨーグルト、チーズ、サワークリーム、クレームフレーシュ、クミス（Ｋｕｍｉｓ）、培養バターミルク（Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｕｔｔｅｒｍｉｌｋ）及びアシドフィルスミルク（Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｌｋ）、からなる群から選択される１つ以上の発酵乳製品である。

【0126】

好ましくは、乳酸菌発酵乳製品は、ヨーグルト及びチーズからなる群から選択される。特定の態様において、乳酸菌発酵乳製品は、ヨーグルトである。特定の態様において、乳酸菌発酵乳製品は、チーズである。

【実施例】

【0127】

他に言及の無い限り、下記実施例で用いる乳は、いわゆるＢ−ミルク（９９℃で３０分間熱処理した９．５％再構築スキムミルク）である。Ｂ−ミルクは牛乳である。

【0128】

実施例１：比較実験‐本発明の１段階発酵方法と比較される従来技術の２段階方法‐Ｂ．プミルス及びＳ．サーモフィルス
上記で論じたように、従来技術、例えばＣＮ１０３３００１４７Ａは、２段階方法を用いて発酵乳を製造する方法を記載している。第一の工程において、乳はバチルス・スブチリスで発酵され（ＣＮ１０３３００１４７Ａにおいて４８時間）、そして第二の工程において、このバチルス発酵乳に乳酸菌が添加されて、乳酸菌発酵（即ちｐＨの低下‐酸性化）が実施される。

【0129】

この実施例１で論じるように、発明者らは、従来技術の２段階の方法と、本発明の１段階の同時方法とを比較した。

【0130】

バチルス・プミルス単独：
バチルス・プミルスＣＨＣＣ５０４２ ａｎｄ ＣＨＣＣ１６７３５を、凍結アンプルから３ｘ５ｍｌ ＢＨＩブロスにそれぞれ播種し、３７℃１５０ｒｐｍで一昼夜インキュベーションした。

【0131】

４本の撹拌容器に２００ｍＬのＢ−ミルクを入れ、前記Ｂ．プミルス株５０４２及び１６７３５を、それぞれ容器２本ずつに（ＢＨＩ培地で一昼夜培養したもの）１％播種した。それらを３７℃１５０ｒｐｍで２４時間インキュベーションした。

【0132】

５０４２及び１６７３５は、凍結アンプルから５ｍｌ ＢＨＩブロスに播種され、同様にインキュベーションされもした。

【0133】

１６７３５を播種した容器は、２４時間で黄色を呈した。両方の容器（即ち５０４２及び１６７３５の両方）において、若干の発泡が認められた。

【0134】

Ｂ．プミルス及びＳ．サーモフィルスを用いた酸性化実験
このＢ．プミルス２４時間培養物を撹拌容器から滅菌２００ｍｌ容器に移した。

【0135】

ＢＨＩ中のＢ．プミルス一昼夜培養物を遠心分離し、ペレットを５ｍｌ Ｂ−ミルクに懸濁した。

【0136】

Ｓ．サーモフィルス（ＳＴ）ＣＨＣＣ４８９５及びＣＨＣＣ４４６０は、Ｍ１７＋２％ラクトース中に播種され、３７℃で一昼夜インキュベーションされた。

【0137】

これらの一昼夜ＳＴ培養物を遠心分離し、それぞれ１１ｍＬ Ｂ−ミルク中に再懸濁した。

【0138】

１． 撹拌容器中で２４時間培養した５０４２をＢ−ミルク中に１％播種
２． 撹拌容器からの２４時間５０４２培養物＋１％４８９５
３． 撹拌容器からの２４時間５０４２培養物＋１％４４６０
４． 撹拌容器中で２４時間培養した１６７３５をＢ−ミルク中に１％播種
５． 撹拌容器からの２４時間１６７３５培養物＋１％４８９５
６． 撹拌容器からの２４時間１６７３５培養物＋１％４４６０
７． １％４８９５
８． １％４８９５＋１％５０４２（ＢＨＩ中で一昼夜）
９． １％４８９５＋１％１６７３５（ＢＨＩ中で一昼夜）
１０． １％４４６０
１１． １％４４６０＋１％５０４２（ＢＨＩ中で一昼夜）
１２． １％４４６０＋１％１６７３５（ＢＨＩ中で一昼夜）
１３． Ｂ−ミルク

【0139】

酸性化は、３７℃のウォーターバス中で行われた。ｐＨは、ＰＣロガーで一昼夜測定された。

【0140】

Ｂ．プミルス及びＳ．サーモフィルスを用いた酸性化実験の結果：
予めインキュベーションしたバチルス・プミルス株ＣＨＣＣ５０４２の培養物は、２つの相に分かれた（図１参照‐上の画像、実験＃２に関連する（上記参照））。

【0141】

予めインキュベーションしたバチルス・プミルス株ＣＨＣＣ５０４２の培養物は、まだ黄色であった（図１参照‐下の画像、実験＃５に関連する（上記参照））。

【0142】

相分離や発色は、バチルスプレインキュベーションの概念の適用の過程で顕著な問題をもたらし得る。

【0143】

図２に見られるように、予めインキュベーションしたバチルス・プミルス株ＣＨＣＣ５０４２の容器は、より高いｐＨで出発した。ＳＴ株単独と比較して酸性化活性の改善は無かった。最後のｐＨも、ＳＴ単独に関しては顕著に高かった。

【0144】

下記表は、幾つかの時点での図２のｐＨ値＋ｐＨ＝５に達したときの時間の幾つかを示す（図２から直接読み取った概数）。

【表2】

【0145】

上記で論じたように：
実験番号７はＳＴ４８９５単独（即ち対照）；
実験番号８はＳＴ４８９５＋バチルス１％５０４２
実験番号９はＳＴ４８９５＋バチルス１％１６７３５

【0146】

これらの実験８及び９は、本発明の１段階共培養発酵方法に従って実施され、その結果は、乳酸発酵が所望のｐＨレベルまで顕著により急速に達したことである。例えばｐＨ＝５及びｐＨ＝４．５は、顕著により急速に達した。

【0147】

類似の肯定的な結果が、ＳＴ４４６０株（＃１１及び＃１２と対照＃１０とを比較）において得られた。

【0148】

バチルス細胞によるそのような（単独での）発酵は、顕著にｐＨを低下しなかった（＃１及び＃４参照）。

【0149】

発酵過程でのＢ．プミルスの増殖解析：
培養物８及び９のＢＨＩ上へのプレーティング：
ここで、バチルスとＳＴを共培養する効果がバチルスの乳中での増殖によるかそれ以外によるかを解析した。従って、培養物８及び９は、播種後、１０^−１〜１０^−４にＢＨＩ寒天上でインキュベーションする前にプレーティングされ、それらの増殖が見られた場合その翌日に再びプレーティングした。

【0150】

ＳＴ４８９５を、プレート上で増殖が見られた場合それと同時にＢＨＩ寒天上に擦り付けた。プレートは好気的に３７℃でインキュベーションされた。

【0151】

発酵後、培養物８及び９は１０倍に希釈され、１０^−３〜１０^−６に希釈されてＢＨＩ寒天上に再びプレーティングされた。プレートは好気的に３７℃で一昼夜インキュベーションされた。

【0152】

ＢＨＩ上でのＣＨＣＣ４８９５のプレーティングの結果：この株はプレート上では増殖しない。

【0153】

ＢＨＩ寒天上での培養物８及び９のプレーティングの結果：

【表3】

【0154】

ＣＨＣＣ４８９５はカウントされなかった‐それはプレート上では非常に弱くしか増殖しなかった。

【0155】

ほとんどのバチルス細胞は、恐らく低いｐＨのため、ＳＴによる酸性化の過程で死滅したようである。

【0156】

要するに、バチルス・プミルス株の顕著な増殖は無かった。実際に、それらは、発酵プロセスの過程で基本的に死滅している（おそらくｐＨの低下により）。

【0157】

最終的な乳酸菌発酵乳製品に殆どバチルス細胞が存在しないため、これは有利となり得る。

【0158】

結論：
この実施例１の結果は、バチルス・プミルスにとって、従来技術の２段階の方法は適切に動作しないことを実証した。

【0159】

２４時間のバチルス・プミルスによるプレインキュベーション及び発酵（即ち２段階の方法における第一段階）と、それに続くＳ．サーモフィルスによる発酵（即ち２段階の方法における第二段階）は、２つの相に分離した（図１上の画像）及び好ましくない黄色を呈した（図１下の画像）発酵乳をもたらした。

【0160】

そのような相分離や発色は、バチルスプレインキュベーション（即ち従来技術の２段階の方法）の概念の適用の過程で顕著な問題をもたらし得る。

【0161】

図２に見られるように、従来技術の２段階の方法に関連して：
プレインキュベーションしたバチルス・プミルス株を入れた容器は、より高いｐＨで開始した。
ＳＴ株単独の場合と比較して酸性化活性の改善は無かった。
最終ｐＨも、ＳＴ単独に関しては顕著により高かった。

【0162】

対照的に、本発明の１段階の方法（即ちバチルス・プミルスとＳ．サーモフィルスの両方による１つの発酵工程のみ）は、非常に良好に動作した。

【0163】

図２に見られるように、本発明の１段階の方法が使用された場合、乳酸発酵により所望のｐＨレベルに顕著により迅速に到達する、という、１つの肯定的な結果が得られた。

【0164】

更に、発酵乳（第一の側面の方法における工程（ａ））は、工程（ａ）において乳にバチルス細菌を播種しない（第一の側面の方法における工程（ａ））以外第一の側面の方法と同一の条件で行われた比較方法よりも顕著に早く所望のｐＨに達した。

【0165】

図２において、これは、例えばＳＴ株４４６０単独の酸性化と比較することによって見られ、ＳＴ４４６０＋バチルス５０４２及びＳＴ４４６０＋バチルス１６７３５における１段階同時酸性化よりも顕著に遅い。類似の好ましい結果がＳＴ株４８９５において得られ、バチルスと共に同時１段階発酵を行った場合、顕著により早く所望の低いｐＨレベルに達した。

【0166】

更に、実施例１の結果は、ＳＴ株と共に同時発酵する間バチルス・プミルス株の顕著な増殖が無かったことを実証した。実際に、発酵プロセスの過程で、（おそらくｐＨの低下により）バチルス細胞は殆ど死滅する。

【0167】

最終的な乳酸菌発酵乳製品に殆どバチルス細胞が存在しないため、これは有利となり得る。

【0168】

実施例２：比較実験−従来技術の２段階方法−Ｂ．スブチリス及びＳ．サーモフィルス
この実施例は、上記実施例１と同様である。この実施例において、バチルス・スブチリス株ＣＨＣＣ１５８７７及びＣＨＣＣ１６８７１を用いて同様の実験が行われた（実施例１ではバチルス・プミルスを用いた）。

【0169】

バチルス・スブチリス株ＣＨＣＣ１５８７７及びＣＨＣＣ１６８７１を凍結アンプルからＢＨＩ寒天上に擦り付け、３７℃で一昼夜好気下でインキュベーションした。

【0170】

ＣＨＣＣ１５８７７及びＣＨＣＣ１６８７１から単一コロニーを取って６ｍｌ ＢＨＩに播種し、３７℃１５０ｒｐｍでインキュベーションした。

【0171】

４本の撹拌容器に２００ｍｌのＢ−ミルクを写し、Ｂ．スブチリス株１５８７７ｓｃ及び１６６８７ｓｃをそれぞれ２本ずつに１％（ＢＨＩ中で一昼夜培養したものから）播種した。それらを３７℃１５０ｒｐｍで２４時間インキュベーションした。

【0172】

Ｍ１７＋２％ラクトース中にＳ．サーモフィルスＣＨＣＣ４８９５及びＣＨＣＣ４４６０を播種し、３７℃で一昼夜インキュベーションした。

【0173】

酸性化実験：
前記２４時間Ｂ．スブチリス培養物を撹拌容器から滅菌２００ｍｌ容器に移した。これらの株は、今回も乳を黄色に変色させた（即ち実施例１のバチルス・プミルスと同様）。

【0174】

７ｍｌのＳｔ一昼夜培養物を遠心分離し、それぞれ７ｍｌのＢ−ミルクに再懸濁した。

【0175】

１． 撹拌容器中で２４時間培養した１５８７７をＢ−ミルク中に１％播種
２． 撹拌容器からの２４時間１５８７７培養物＋１％４８９５
３． 撹拌容器からの２４時間１５８７７培養物＋１％４４６０
４． 撹拌容器中で２４時間培養した１６６８７をＢ−ミルク中に１％播種
５． 撹拌容器からの２４時間１６６８７培養物＋１％４８９５
６． 撹拌容器からの２４時間１６６８７培養物＋１％４４６０
７． １％４８９５
８． １％４４６０
９． Ｂ−ミルク

【0176】

結果：
バチルス・スブチリスでプレインキュベーションした４本の容器の全ては、実施例１における実験の容器５と同様であった（薄く黄色の培養物）。

【0177】

プレインキュベーションしたバチルス・スブチリス株を入れた容器は、より高いｐＨで開始した。

【0178】

ＳＴ株単独と比較して、酸性化活性の改善は無かった。最終ｐＨも、ＳＴ単独に関しては顕著により高かった。

【0179】

結論：
実施例２の結果は、バチルス・スブチリスを用いた場合であっても、実施例１におけるバチルス・プミルスと本質的に同様であることを実証し、バチルス・スブチリスにおいても、従来技術の２段階方法は良好に動作しなかった。

【0180】

実施例３：バチルス・スブチリス及びＢ．プミルスとの共発酵によるＳ．サーモフィルスの増殖刺激−本発明の１段階方法
バチルス・スブチリス由来の株の添加によるＳ．サーモフィルスのＣＨＣＣ４８９５の増殖刺激
下記バチルス・スブチリス株をＭＲＳブロス中に播種し、３７℃で一昼夜インキュベーションした。
ＣＨＣＣ３８１０
ＣＨＣＣ１５８７７
ＣＨＣＣ１６２８２
ＣＨＣＣ１９２００

【0181】

上記一昼夜培養物を遠心分離し、ペレットをそれぞれ１Ｖｏｌ．のＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0182】

Ｓ．サーモフィルスＣＨＣＣ４８９５は、２％ラクトースを添加したＭ１７中３７℃で前培養し、遠心分離し、そして１Ｖｏｌ．のＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0183】

酸性化実験のため、再懸濁した株をそれぞれ２００ｍｌのＢ−ミルク中に１％播種した。酸性化は、３７℃のウォーターバス中で行われた。ｐＨは、ＰＣロガーで一昼夜測定された。

【0184】

１． １％ＣＨＣＣ４８９５
２． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ１５８７７
３． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ１６２８２
４． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ１９２００
５． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ３８１０
６． １％ＣＨＣＣ１５８７７
７． １％ＣＨＣＣ１６２８２
８． １％ＣＨＣＣ１９２００
９． １％ＣＨＣＣ３８１０
１０． Ｂ−ミルク

【0185】

結果：
Ｂ．スブチリス株ＣＨＣＣ３８１０、ＣＨＣＣ１５８７７、ＣＨＣＣ１６２８２、及びＣＨＣＣ１９２００は、ＳＴ ＣＨＣＣ４８９５の酸性化活性を促進した。

【0186】

バチルス・プミルス及びバチルス・スブチリス由来の株の添加によるＳ．サーモフィルスＣＨＣＣ４８９５の増殖刺激
バチルス・プミルス及びバチルス・スブチリス由来の以下の株をＢＨＩブロスに播種し、３７℃の撹拌インキュベーター中１５０ｒｐｍで一昼夜インキュベーションした。

【0187】

これらの株は、従来の株として撹拌せずにＭＲＳ中で最初に播種されたが、僅かな増殖しか示さなかった。

【0188】

Ｂ． プミルスＣＨＣＣ５０４２
Ｂ． プミルスＣＨＣＣ１５５１２
Ｂ． プミルスＣＨＣＣ１５５４４
Ｂ． プミルスＣＨＣＣ１６７３５
Ｂ． プミルスＣＨＣＣ１６８７３
Ｂ． プミルスＣＨＣＣ１７５１３
Ｂ．スブチリスＣＨＣＣ１６８７１

【0189】

ＣＨＣＣ４８９５を、２％ラクトースを添加したＭ１７中に播種し、３７℃で一昼夜インキュベーションした。

【0190】

上記一昼夜培養物を遠心分離し、ペレットをそれぞれ１Ｖｏｌ．のＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0191】

酸性化実験のため、再懸濁した株をそれぞれ２００ｍｌのＢ−ミルク中に１％播種した。酸性化は、３７℃のウォーターバス中で行われた。ｐＨは、ＰＣロガーで一昼夜測定された。

【0192】

１． １％ＣＨＣＣ４８９５
２． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ５０４２（プミルス）
３． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ１５５１２（プミルス）
４． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ１５５４４（プミルス）
５． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ１６７３５（プミルス）
６． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ１６８７１（スブチリス）
７． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ１７５１３（プミルス）
８． １％ＣＨＣＣ４８９５＋１％ＣＨＣＣ１６８７３（プミルス）
９． １％ＣＨＣＣ５０４２
１０． １％ＣＨＣＣ１５５１２
１１． １％ＣＨＣＣ１５５４４
１２． １％ＣＨＣＣ１６７３５
１３． １％ＣＨＣＣ１６８７１
１４． １％ＣＨＣＣ１７５１３
１５． １％ＣＨＣＣ１６８７３
１６． Ｂ−ミルク

【0193】

結果：
結果を図３に示す。全てのバチルス株は、ＣＨＣＣ４８９５の酸性化活性を顕著に促進した。ＣＨＣＣ４８９５単独のインキュベーションと比較して、２時間早くｐＨ５．０に達した。同時にそれらは乳を全く酸性化せず、これは、共発酵におけるｐＨの低下がＢ．スブチリスによる酸の生産によるものではなく、増殖刺激効果によることを意味する。

【0194】

バチルス・プミルス及びバチルス・スブチリス由来の株の添加によるＳ．サーモフィルスの５つの株の増殖刺激
この実験において、５つの追加のＳ．サーモフィルス株の酸性化活性が、Ｂ．スブチリスの２つの株及びＢ．プミルスの２つの株の存在下で試験された。５つのＳ．サーモフィルス株は、乳中で異なる酸性化活性を有することにより特徴づけられる。
Ｓ．サーモフィルス株：
ＣＨＣＣ３１７５
ＣＨＣＣ４４６０
ＣＨＣＣ５３８９
ＣＨＣＣ６５９２
ＣＨＣＣ９２０４
バチルス種株：
ＣＨＣＣ１５８７７ （スブチリス）
ＣＨＣＣ１６８７１ （スブチリス）
ＣＨＣＣ５０４２ （プミルス）
ＣＨＣＣ１６７３５ （プミルス）

【0195】

バチルス種株は、ＢＨＩブロス中３７℃１５０ｒｐｍ撹拌で一昼夜インキュベーションされた。

【0196】

Ｓ．サーモフィルス株は、２％ラクトース添加Ｍ１７中３７℃で一昼夜インキュベーションされた。

【0197】

これら一昼夜培養物を遠心分離し、ペレットを１Ｖｏｌ．のＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0198】

酸性化実験のため、再懸濁した株をそれぞれ２００ｍｌのＢ−ミルク中に１％播種した。酸性化は、３７℃のウォーターバス中で行われた。ｐＨは、ＰＣロガーで一昼夜測定された。

【0199】

結果：
結果は、全てのバチルス株は、５つのＳ．サーモフィルス株ＣＨＣＣ３１７５、ＣＨＣＣ４４６０、ＣＨＣＣ５３８９、ＣＨＣＣ６５９２、及びＣＨＣＣ９２０４の酸性化活性を顕著に促進した。

【0200】

結論：
実施例の結果は、バチルス・スブチリス及びバチルス・プミルス由来の株の添加が、様々なＳ．サーモフィルス株の酸性化を刺激することを示す。試験された全てのＳ．サーモフィルス株は、バチルス・スブチリス及びＢ．プミルスの個別の様々な株と共発酵されたとき、一定の効果を示した。

【0201】

実施例４：Ｂ．プミルスの株との共発酵によるラクトバチルス・デルブルエッキイ種ブルガリクスの増殖刺激−本発明の１段階発酵方法
バチルス・プミルスの株の添加によるラクトバチルス・デルブルエッキイ種ブルガリクスの５つの株の増殖刺激
Ｂ．プミルス５０４２ｓｃ及び１６７３５ｓｃ（シングルコロニー単離、上記参照；ＯＮ培養物から）を、３ｘ５ｍｌのＢＨＩブロスに播種し、１５０ｒｐｍ３７℃でインキュベーションした。

【0202】

ラクトバチルス・デルブルエッキイ種ブルガリクスＣＨＣＣ３９８４を９ｍｌ ＭＲＳに播種した。

【0203】

バチルス・プミルスの一昼夜培養物をプールし、１２ｍｌを遠心分離し、ペレットを１２ｍｌのＢ−ミルクに再懸濁した。

【0204】

ラクトバチルス・デルブルエッキイ種ブルガリクスの株を遠心分離し、９ｍｌのＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0205】

酸性化実験：
２００ｍｌのＢ−ミルク中に１％播種した。３７℃ウォーターバス中で酸性化した。ｐＨは、ＰＣロガーで一昼夜測定した。
１． ３９８４
２． ３９８４＋５０４２
３． ３９８４＋１６７３５
４． Ｂ−ミルク

【0206】

結果：
試験されたバチルス・プミルス株はいずれもラクトバチルス・デルブルエッキイ種ブルガリクスのＣＨＣＣ３９８４に対し顕著な増殖促進効果を有していた。バチルス細胞がラクトバチルス・デルブルエッキイ種ブルガリクス株と共培養されたとき、対照実験（即ちＣＨＣＣ３９８４のみ）と比較して、顕著に早くｐＨ＝５に達した。

【0207】

実施例５：Ｂ．プミルス株との共発酵によるラクトコッカス・ラクティスの増殖刺激−本発明の１段階発酵方法
バチルス・プミルス及びＢ．スブチリスの株の添加によるラクトコッカス・ラクティスの５つの株の増殖刺激
Ｂ．プミルス５０４２及び１６７３５（凍結アンプルから）を、３ｘ５ｍｌのＢＨＩブロスに播種し、１５０ｒｐｍ３７℃でインキュベーションした。

【0208】

ラクトコッカス・ラクティス株ＣＨＣＣ２２８１、ＣＨＣＣ４４２７、ＣＨＣＣ９８６７、ＣＨＣＣ３９４９及びＣＨＣＣ３９５０をＭ１７に播種した。ラクトース陰性の３９４９及び３９５０にはグルコースを添加した。３０℃で一昼夜インキュベーションした。

【0209】

Ｂ．プミルス一昼夜培養物をプールし、１１ｍｌを遠心分離し、ペレットを１１ｍｌのＢ−ミルクに再懸濁した。

【0210】

ラクトコッカス・ラクティス株を遠心分離し、１体積のＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0211】

酸性化実験：
２００ｍｌのＢ−ミルク中に１％播種した。３０℃ウォーターバス中で酸性化した。ｐＨは、ＰＣロガーで一昼夜測定した。
１． ２２８１
２． ２２８１＋５０４２
３． ２２８１＋１６７３５
４． ４４２７
５． ４４２７＋５０４２
６． ４４２７＋１６７３５
７． ９８６７
８． ９８６７＋５０４２
９． ９８６７＋１６７３５
１０． ３９４９＋１％グルコース
１１． ３９４９＋５０４２＋１％グルコース
１２． ３９４９＋１６７３５＋１％グルコース
１３． ３９５０＋１％グルコース
１４． ３９５０＋５０４２＋１％グルコース
１５． ３９５０＋１６７３５＋１％グルコース
１６． Ｂ−ミルク

【0212】

結果：
結果は、バチルス・プミルス株と一緒に培養した場合、ラクトコッカス・ラクティスは、僅かに早く酸性化することを示した。しかしながら、この影響は、Ｓ．サーモフィルス株の幾つかにおいて示されたもの程大きくはなかった（上記実施例参照）。

【0213】

この実験においてラクトコッカス・ラクティスＣＨＣＣ３９４９及びＣＨＣＣ３９５０を選択した理由の一つは、Ｂ．プミルス株のタンパク質分解系が、増殖促進効果に寄与するという理論である。プロテイナーゼ陰性であるＣＨＣＣ３９４９及びＣＨＣＣ３９５０は、理論的には、他の試験されたラクトコッカス・ラクティス株（即ちＣＨＣＣ２２８１、ＣＨＣＣ４４２７、ＣＨＣＣ９８６７）よりも、Ｂ．プミルスとの共培養から相対的に多くの利益を受ける筈である。

【0214】

しかしながら、この実験において、ＣＨＣＣ３９４９及びＣＨＣＣ３９５０の増殖は、他の試験されたラクトコッカス・ラクティス株と比較してそれほど促進されなかった。

【0215】

実施例６：適切なバチルス株のスクリーニング−本発明の１段階発酵方法

【0216】

この実施例において、ＬＡＢ株単独の使用と比較して酸性化活性の改善が得られるバチルス細胞がスクリーニングされた。

【0217】

１ｍｌ乳を入れた９６ウェルプレート中でのスクリーニング
Ｓ．サーモフィルス（ＳＴ）株ＣＨＣＣ１２３３９（エキソ多糖類（ＥＰＳ）生産株）が、スクリーニングのために選択された。

【0218】

スクリーニングは、１ｍｌの乳を入れた９６ウェルプレート中で行われ、以下のバチルス種：バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アリアブハッタイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ）、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・メチロトロフィクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、バチルス・モヤウェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ）、バチルス・シアメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・シムプレクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・テクイレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ）、及びバチルス・ヴァリスモルティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ）から選択される１５６種類の異なるバチルス株が試験された。

【0219】

酸性化時間及びテクスチャーが測定された。テクスチャーは、ＴＡＤＭ技術を用いて測定された。その結果は、大半のバチルス細胞が動作した、即ちそれらがＬＡＢ株単独の使用と比較して酸性化活性（速度）及びテクスチャーの改善をもたらしたことを実証した。特に、試験されたバチルス株の１３５個の株は、ＳＴ株単独と比較してより高い酸性化速度をもたらし、６０個の株は、ＳＴ株単独と比較して改善されたテクスチャーを有した。ＳＴ自体による酸性化は緩慢で、ｐＨ６がｐＨ４．５になるのに１４時間掛かる。バチルスの添加は、最速の株でこの時間を２〜４時間に顕著に短縮した。

【0220】

２００ｍｌ容器の結果
評価された候補（９６ウェルプレートスクリーニングから）を、乳を入れた２００ｍｌ容器中で試験した。酸性化時間及テクスチャーを測定した。糖消費、低分子酸（ｓｍａｌｌ ａｃｉｄ）及び揮発性物質の生産のために、試料を採取した。２００ｍｌ容器は冷蔵庫中で４週間保存され；シネレシス、匂い及び揮発性物質が再び解析された。乳中のバチルスの増殖も追跡された。

【0221】

せん断応力測定は、バチルス株ＣＨＣＣ１５１７６が乳に添加された場合、Ｌｂ株単独の場合と比較して、Ｌｂ株ＣＨＣＣ１２９４５のテクスチャーは７５％高くなることを示した。大豆製品の納豆から単離したバチルス株は、Ｌｂ株単独と比較して、Ｌｂ株と組み合わせて４０％高いテクスチャーを与えた。しかしながら、３つのＳＴ株は、ＳＴ株単独を乳に添加した場合と比較して、バチルスと共に添加した場合、テクスチャーはそれほど向上しなかった。ＣＨ−１及びＳｗｅｅｔｙの２つの異なるスターター培養物は、バチルスが乳に添加された場合、テクスチャーが２３％増大することを示した。

【0222】

ＬＡＢ株及びバチルスによる乳中の酸性化は、ＬＡＢ株単独よりも短時間で酸性化した。１ｍｌスケールで、最良の組み合わせ（Ｌｂ ＣＨＣＣ１２９４５とバチルス）において、ｐＨが６から４．５になるのに６時間を要した。また、酸性化の早いＳＴ株ＣＨＣＣ１５９１５は、バチルスと組み合わせて、酸性化時間が４．３５時間から３時間に短縮した。２００ｍｌ容器において、最良の組み合わせ（Ｌｂ ＣＨＣＣ１２９４５及び納豆から単離されたバチルスＣＨＣＣ１８１０２）における酸性化時間の短縮は４時間であった。

【0223】

乳中のバチルスの増殖が調査された。この計画で試験されたバチルス株は、ＬＡＢ添加又は無添加の乳中で増殖しなかった。バチルスは増殖に酸素を要する。酸性化の標準的手順は、２００ｍｌ容器中の２００ｍｌ乳に細菌を播種することである。そして、その容器をウォーターバス中又はインキュベーター中に撹拌せず静置する。ＬＡＢ株が存在する場合、バチルス栄養細胞がより早く減少する傾向が有った。乳中のバチルス株の大半は芽胞を生産したが、ＬＡＢの存在によって芽胞形成も阻害された。

【0224】

バチルスは、Ｌｂ ＣＨＣＣ１２９４５及びＣＨＣＣ１２５６１の両方の増殖及び酸性化を、ＬＡＢ株単独の場合と比較して増強した。ＬＡＢの最終ＣＦＵ／ｍｌは、乳中のＬＡＢ株を単独で播種した場合と比較して倍増した。

【0225】

上記結果を個別のＬＡＢ株についてまとめる。

【0226】

Ｌｂ；ＣＨＣＣ１２９４５
酸性化は、Ｌｂ発酵に添加された幾つかのバチルスよりも早かった。ｐＨが６から４．５になる時間は、Ｌｂ単独において８時間であったのが最速の組み合わせにおいて２時間超にまで減少した。

【0227】

ＳＴ２；ＣＨＣＣ１２５６１（遅い）
酸性化；酸性化は、ＳＴ２自体において６時間であったのが、バチルスとＳＴ２の最良の組み合わせにおいて４時間に短縮された。

【0228】

ＳＴ３；ＣＨＣＣ１５９１５（早い）
このＳＴ３による酸性化は、良好かつ滑らかな酸性化曲線を与えた。バチルスとの幾つかの組み合わせは、ＳＴ３単独と比較してｐＨ６から４．５の酸性化がより早いようであった。

【0229】

乳中のＬＡＢ株にバチルスを添加する効果を評価するため、試料中の糖、揮発成分及び低分子酸を測定した。バチルスを添加した場合としなかった場合との間で顕著な差はみられなかった。

【0230】

発酵乳を保存容器中に入れて４週間冷蔵庫で保存した影響を評価するため、試料中の揮発成分を測定した。発酵乳の匂いは良好で、揮発成分プロフィールは保存１日後と比較して殆ど同じであった。要するに、バチルスを含有する発酵乳の保存の過程で、ＬＡＢのみを添加した発酵乳と比較して異なる変化は無かった。

【0231】

結論：
この実施例の結果は、バチルスを含有する発酵乳の保存の過程で、ＬＡＢのみを添加した発酵乳と比較して異なる変化は無いことを実証した。

【0232】

従って、本発明の１段階発酵方法は、商業関連発酵乳製品をもたらす。上記のように、従来技術の２段階方法は、良好に動作しなかった。

【0233】

全ての試験されたＬＡＢ株（１つのラクトバチルス（Ｌａ）及び３つの異なるＳ．サーモフィルス（ＳＴ）株）において、少なくとも以下の異なるバチルス種：Ｂ．スブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．プミルス、Ｂ．アミリオリケファシエンス、Ｂ．メガテリウム及びその他、から、適切に動作する候補が有った。

【0234】

実施例７：異なる濃度のバチルス・プミルスＣＨＣＣ１６７３５を用いたＳ．サーモフィルスＣＨＣＣ４４６０の増殖刺激−本発明の１段階発酵方法
Ｓ．サーモフィルスＣＨＣＣ４４６０を２％ラクトースを添加した１５ｍｌのＭ１７に播種し、３７℃で一昼夜（ＯＮ）インキュベーションした。

【0235】

バチルス・プミルスＣＨＣＣ５０４２をＢＨＩブロスに播種して、一昼夜３７℃２００ｒｐｍでインキュベーションした。

【0236】

酸性化実験のため、１５ｍｌのＣＨＣ４４６０一昼夜培養物を遠心分離し、ペレットを１５ｍｌのＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0237】

６ｍｌのＣＨＣＣ１６７３５一昼夜培養物を遠心分離し、ペレットを６ｍｌのＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0238】

ＣＨＣＣ４４６０をＢ−ミルク中に単独で１％播種し、下記のスキームに従い異なる濃度のＣＨＣＣ１６７３５と共培養した。

【0239】

ＣＨＣＣ１６７３５の１％播種は、乳発酵の開始時にｃａ． ６ｘ１０^６ｃｆｕ／ｍｌの濃度をもたらす。
１． １％ＣＨＣＣ４４６０
２． １％ＣＨＣＣ４４６０＋１％ＣＨＣＣ１６７３５
３． １％ＣＨＣＣ４４６０＋０．１％ＣＨＣＣ１６７３５
４． １％ＣＨＣＣ４４６０＋０．０１％ＣＨＣＣ１６７３５
５． １％ＣＨＣＣ４４６０＋０．００１％ＣＨＣＣ１６７３５
６． １％ＣＨＣＣ４４６０＋０．０００１％ＣＨＣＣ１６７３５
７． Ｂ−ミルク対照

【0240】

酸性化は、ウォーターバス中３７℃でＰＣロガーを用いてｐＨを測定することにより一昼夜追跡された。

【0241】

結果：
結果は図４に示す。１％及び０．１％の播種に対応するバチルス・スブチリスＣＨＣＣ１６７３５は、ＣＨＣＣ４４６０の酸性化活性の増大をもたらした。ＣＨＣＣ１６７３５の播種パーセンテージが低い場合も、ＣＨＣＣ４４６０の増殖刺激をもたらさなかった。

【0242】

結論：
この実施例の結果は、本発明の方法の工程（ａ）の約６ｘ１０^５ｃｆｕ／ｍｌのバチルス細菌の乳への播種が適切に動作することを実証した。

【0243】

約６ｘ１０^６ｃｆｕ／ｍｌのバチルス細菌を用いてより良好に動作した。

【0244】

これらの結果に基づき、本発明の第一の側面の方法は、工程（ａ）においてバチルス細菌の播種量が約１０^４ｃｆｕ／ｍｌ未満であると、商業的に許容されるレベルで動作し得ないことが考えられる。

【0245】

実際に、本発明の第一の側面の工程（ａ）において、１０^５ｃｆｕ／ｍｌ以上のバチルス細菌を使用するのがより好ましいようである。

【0246】

実施例８：ＳＴ及びバチルスの前共培養
この実験において、上記実施例１と同様、同じバチルス・プミルスＣＨＣＣ５０４２、ＣＨＣＣ１６７３５及びＳ．サーモフィルスＣＨＣＣ４４６０が使用された。

【0247】

実施例１で論じたように、この実施例において、ＢＨＩ中の一昼夜培養物を遠心分離し、ペレットを乳中に再懸濁した。

【0248】

下記に論じるように、この実施例において、Ｓ．サーモフィルス株はＢ．プミルス株とプレインキュベーションされ、その後一昼夜培養物を乳に播種するための第二の工程に用いた。この一昼夜培養物はそのまま（遠心分離せず）用いられた。改善されたより急速なｐＨの低下がみられた。

【0249】

Ｓ．サーモフィルス株ＣＨＣＣ４４６０を２％ラクトースを添加した１５ｍｌのＭ１７に播種し、３７℃で一昼夜（ＯＮ）インキュベーションした。

【0250】

バチルス・プミルスＣＨＣＣ５０４２及びＣＨＣＣ１６７３５をＢＨＩブロスに播種して、一昼夜３７℃２００ｒｐｍでインキュベーションした。

【0251】

Ｍ１７＋２％ラクトースに、ＣＨＣＣ４４６０の一昼夜培養物を０．５％、及びＣＨＣＣ５０４２又はＣＨＣＣ１６７３５の一昼夜培養物を０．５％播種した。

【0252】

共培養のインキュベーションは撹拌せず３７℃一昼夜で行われた。

【0253】

ＣＨＣＣ４４６０は、Ｍ１７＋２％ラクトース１５ｍｌ中に凍結ストックから再び播種され、３７℃で一昼夜インキュベーションされた。ＣＨＣＣ５０４２及びＣＨＣＣ１６７３５は、凍結ストックから１０ｍｌのＢＨＩに再び播種され、３７℃２００ｒｐｍ一昼夜でインキュベーションされた。

【0254】

酸性化実験：
１５ｍｌのＣＨＣＣ４４６０一昼夜培養物を遠心分離して、ペレットを１５ｍＬのＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0255】

６ｍｌのＣＨＣＣ５０４２及び６ｍｌのＣＨＣＣ１６７３５の一昼夜培養物を遠心分離して、ペレットをそれぞれ６ｍＬのＢ−ミルク中に再懸濁した。

【0256】

２つの共培養物は遠心分離しなかった。それらはプレインキュベーションした共培養物から２００ｍｌのＢ−ミルク中に直接１％で播種された。

【0257】

対照として、一昼夜培養物から２００ｍｌのＢ−ミルク中に直接１％播種された。

【0258】

１． 一昼夜培養物から１％ＣＨＣＣ４４６０
２． 前共培養物から１％ＣＨＣＣ４４６０／ＣＨＣＣ５０４２
３． 前共培養物から１％ＣＨＣＣ４４６０／ＣＨＣＣ１６７３５
４． １％ＣＨＣＣ４４６０、遠心及び再懸濁
５． １％ＣＨＣＣ４４６０＋１％ＣＨＣＣ５０４２、いずれも遠心及び再懸濁
６． １％ＣＨＣＣ４４６０＋１％ＣＨＣＣ１６７３５、いずれも遠心及び再懸濁
７． Ｂ−ミルク対照

【0259】

結果：
ＣＨＣＣ４４６０とＣＨＣＣ５０４２／ＣＨＣＣ１６７３５とのプレインキュベーションは、一昼夜培養物からＣＨＣＣ４４６０を単独で播種した場合と比較して、酸性化活性が改善している。

【0260】

遠心分離及びＢ−ミルクに再懸濁され、Ｂ−ミルク中に１％播種されたプレインキュベーションされた共培養物において、単一株の培養物として遠心分離及び乳中に再懸濁されたＣＨＣＣ４４６０と比較して、酸性化活性も増大した。

【0261】

一昼夜培養後のプレインキュベーション培養物ＣＨＣ４４６０＋ＣＨＣＣ１６７３５において、９ｘ１０^４のバチルス細胞のタイターが測定された。この前培養の播種及び乳中への播種（発酵２日目）後、１ｘ１０^３のバチルス細胞のタイターが測定された。

【0262】

結論：
この実施例の結果は、更に、バチルスとＬＡＢ細胞の共培養の好ましい効果を実証した。培養前にバチルス細胞をＳ．サーモフィルスとプレインキュベーションしたものを乳への播種に用いる場合、播種のために共培養物を直接用いるか、又は共培養物を遠心分離し乳中に再懸濁したものを播種する（１日目の増殖培地からのキャリーオーバーを排除し得る）かに拘らず、酸性化活性の強力な増大が見られる。

【0263】

実施例９：様々なバチルス株とＳ．サーモフィルスとの共発酵−本発明の１段階発酵方法
テクスチャーの相乗作用
日本の食品の納豆に由来するバチルス株を単離し、ＣＨＣＣ１８１０２及びＣＨＣＣ１８１０３として寄託した。プレート上ではＣＨＣＣ１８１０２とＣＨＣＣ１８１０３は類似しており、グルタミン酸のポリマーであるγ−ＰＧＡの生産を誘導する。前記発想は、バチルス株が乳のテクスチャーに貢献し得るというものである。２つのバチルス株を、ＳＴ株（ＣＨＣＣ１６４０４、緩慢に酸性化しグルコースを生産する）と共に乳中に播種した。両株を１％播種し、一昼夜培養した。２４時間１ｍｌのＢ−ミルク中で酸性化した後、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｒｏｂｏｔでのＴＡＤＭ技術を用いてテクスチャーを測定した。結果は、乳中のＳＴに２つのバチルス株が添加された場合テクスチャーが異なることを明確に示した。これは、これらの２つのバチルス株と共に乳を共酸性化することで、テクスチャーが明確に増大することを示す。

【0264】

少量の培地中での増殖実験において、ＣＨＣＣ１８１０２及びＣＨＣＣ１８１０３は、ラクトース又はグルコース上で増殖しなかった。これら２つの株をＳｗｅｅｔｙ ＳＴと共に乳中に添加したとき、排出されたグルコースは２つのバチルス株によって使用されなかった。バチルス株は増殖を示さなかったため、解析データ（低分子酸、揮発成分、糖）は、発酵乳中で生じた全ての化学成分及び代謝物に対して顕著な形で貢献しなかったことを示した。ＣＨＣＣ１８１０２は、ＣＨＣＣ１８１０３よりも大きくテクスチャーに貢献した。バチルス株がどうやって発酵乳のテクスチャーに貢献するかの疑問は残る。

【0265】

我々は、テクスチャーの増大は、γ−ＰＧＡ、バイオフィルムを生産する、又はＳＴの酸性化及び増殖を増強する、バチルスの能力によるものと予想している。

【0266】

乳における酸性化の相乗作用
乳における酸性化は、より早い酸性化が発酵乳生産の生産者にとって時間の節約となり、又は同じ活性を有するより少ない細菌を販売できるため、重要な要素である。０．０２４％スターター培養物（ＣＨＣＣ１６４０４、ＳＴ−１６７３１、ＳＴ−１５７５７及びＬＢＡｂｕ１６１５９を含有する）と一緒に乳中に異なるバチルス株を添加（ＯＤ０．０２）したところ、４つの株における酸性化において、有益な効果が見られた。酸性化は低温で開始され、これは長い酸性化時間を説明する。

【表4】

【0267】

重要な時点は「ｐＨ４．５５に達する時間」である。ＣＨＣＣ１８１０２及びＣＨＣＣ１８１０３のいずれのバチルス株も、スターター培養物単独よりも早くｐＨ４．５５に達した。最も早いＣＨＣＣ１８１０２を用いた培養は、純粋なスターター培養の４５分前にｐＨ４．５５に達した。ＣＨＣＣ１８１０３及びＣＨＣＣ１５１４６を用いた培養は、純粋なスターター培養の２５分前にｐＨ４．５５に達した。ＣＨＣＣ１５３９６を用いた培養は、純粋なスターター培養の１５分前にｐＨ４．５５に達した。これは、様々なバチルス株が、酸性化に関してスターター培養物に有益であり得ることを示した。

【0268】

他の実験において、生乳から単離したバチルス株Ｂ．プミルスＡ６５０−３は、異なるＳＴ生産株の酸性化活性を刺激できた。ＳＴ株及びＢ．プミルス株は、一昼夜培養物から１％播種された。

【0269】

ビタミンＫ
バチルス・スブチリス「ナット」はビタミンＫを生産し、日本の大豆食品の納豆を発酵させるものとして知られている。この実験において、２００ｍｌの乳にＳＴ株（ＣＨＣＣ１６４０４、テクスチャー実験と同一）の存在下又は非存在下、納豆から単離したバチルス株を播種し、２４時間３７℃でインキュベーションした。その結果、両バチルス株は、ＳＴ株の存非に拘らずビタミンＫを生産し得ることを示した。そのレベルは、ＣＨＣＣ１８１０２において６−７μｇ／１００ｍｌ発酵乳、ＣＨＣＣ１８１０３において〜９ μｇ／１００ｍｌ発酵乳であった。表５を参照されたい。バチルス株は主にＭＫ−４及びＭＫ−７を生産したが、少量のＫ１も生産した（ＭＫ−４、ＭＫ−７及びＫ１はビタミンＫの異なる種類である）。ＳＴ株は、ビタミンＫレベルに貢献しなかった。

【表5】

【0270】

結論：
２つの納豆バチルス株とＳ．サーモフィルス（ＳＴ）の共インキュベーションから興味深い結果が得られた：
−６−９μｇ／１００ｍｌ発酵乳のビタミンＫ生産
−発酵乳中のテクスチャー性能の増大（ＴＡＤＭ値−５５００Ｐａ対−１２０００Ｐａ）
−酸性化速度（ｐＨ４．５５に達する時間）の増大

【0271】

Ｂ．プミルス株が、単独では乳を酸性化しないが、ＳＴ ＣＨＣＣ４８９５の増殖を顕著に促進することが示された。

【0272】

参考文献
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２． ＵＳ５０７７０６３．
３． ＣＮ１０３３００１４７Ａ．
４． ＲＯＳＳＬＡＮＤ， Ｅ．， ＬＡＮＧＳＲＵＤ， Ｔ． ａｎｄ ＳＯＲＨＡＵＧ， Ｔ．， ２００５． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｌａｃｔｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｉｎ ｍｉｌｋ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｏｏｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １０３（１）， ｐｐ． ６９−７７．
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】