特許 6849868 シングルアーム一価抗体構築物およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6849868

(24)【登録日】2021年3月9日

(45)【発行日】2021年3月31日

(54)【発明の名称】シングルアーム一価抗体構築物およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20210322BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210322BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210322BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20210322BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20210322BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46ZNA

   A61K39/395 L

   A61K39/395 N

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   C07K16/28

   C12P21/08

【請求項の数】13

【全頁数】108

(21)【出願番号】特願2015-510590(P2015-510590)

(86)(22)【出願日】2013年5月8日

(65)【公表番号】特表2015-522526(P2015-522526A)

(43)【公表日】2015年8月6日

(86)【国際出願番号】CA2013050358

(87)【国際公開番号】WO2013166604

(87)【国際公開日】20131114

【審査請求日】2016年5月2日

【審判番号】不服2018-10300(P2018-10300/J1)

【審判請求日】2018年7月27日

(31)【優先権主張番号】61/645,547

(32)【優先日】2012年5月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/671,640

(32)【優先日】2012年7月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/722,070

(32)【優先日】2012年11月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/762,812

(32)【優先日】2013年2月8日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510214045

【氏名又は名称】ザイムワークス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】エング ゴードン イウ コン

(72)【発明者】

【氏名】スプレッター フォン クロイデンシュタイン トマス

(72)【発明者】

【氏名】ヴァイサー ニナ イー．

【合議体】

【審判長】 田村 聖子

【審判官】 小暮 道明

【審判官】 山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５０４００７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０５９０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１３４３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０８６０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５４４３００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１３１２４２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C07K

ＣＡＰｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＰＤＢ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、またはＥＣＤ４のいずれか一つより選択されるＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する一価抗体構築物を含む、患者における低ＨＥＲ２発現の癌を治療する方法に使用するための医薬組成物であって、該一価抗体構築物が、
ａ）ＨＥＲ２の該ＥＣＤに結合する、ＦａｂまたはｓｃＦｖである抗原結合ポリペプチド構築物と、
ｂ）２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド構築物であって、それぞれが変異型ＣＨ３ドメインを含み、該単量体Ｆｃポリペプチドのうちの１つが該抗原結合ポリペプチド構築物に融合されている、ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド構築物と
からなり、
該一価抗体構築物が、ＨＥＲ２に結合する対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して、ＡＤＣＣによって、低ＨＥＲ２発現細胞のより高い最大溶解度を示し、
ここで、該対応する単一特異性二価抗体構築物は、該一価抗体構築物の上記ｂ）のヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド構築物における該抗原結合ポリペプチド構築物に融合されていない他方の単量体Ｆｃポリペプチドも、上記ａ）と同一の第2の抗原結合ポリペプチド構築物に融合されている構築物である、
医薬組成物。

【請求項2】

前記低ＨＥＲ２発現の癌が乳癌である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記患者がトラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、および抗ＨＥＲ二価抗体のうちの１つ以上を用いた治療に部分的に応答性であるか、もしくは応答しない、請求項２記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記癌がプロゲステロン受容体陰性もしくはエストロゲン受容体陰性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記一価抗体構築物が、癌の治療のための別の治療に加えて提供される、請求項１〜４のいずれか一項記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記一価抗体構築物の抗原結合ポリペプチド構築物が、リンカーによって単量体Ｆｃポリペプチドに融合されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記変異型ＣＨ３ドメインが、ネイティブのホモ二量体Ｆｃ領域に相当する安定性を持つヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するアミノ酸変異を含み、かつ該変異型ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上、約７５℃以上、もしくは約８０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド構築物が、Ｆｃγ受容体の選択的結合を促進するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

（ａ）1つの単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含み、他の単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを含むか；
（ｂ）1つの単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを含み、他の単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含むか；
（ｃ）1つの単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖをを含み、他の単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを含むか；
（ｄ）1つの単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含み、他の単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを含むか；または
（ｅ）1つの単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含み、他の単量体Ｆｃポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを含む、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記一価抗体構築物が、ＦｃＲｎに結合し、前記対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して、より高い分布容積（Ｖｓｓ）を示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記一価抗体構築物が、グリコシル化一価抗体構築物もしくは糖改変アフコシル化一価抗体構築物であり、任意で、該抗体構築物が、
（ａ）（Ｉ）重鎖可変ドメインおよび第１のＦｃドメインポリペプチドを含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ配列と、
（ＩＩ）第２のＦｃドメインポリペプチドを含む第２の重鎖ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列であって、該第２の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第２のＤＮＡ配列と、
（ＩＩＩ）軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第３のＤＮＡ配列と
を用いて、該第１のＤＮＡ配列、該第２のＤＮＡ配列、および該第３のＤＮＡ配列が既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞をトランスフェクトする段階、ならびに
（ｂ）重鎖および軽鎖ポリペプチドが少なくとも１つの安定した哺乳類細胞内で所望のグリコシル化一価非対称抗体として発現されるように、少なくとも１つの哺乳類細胞内の該第１のＤＮＡ配列、該第２のＤＮＡ配列、および該第３のＤＮＡ配列を翻訳する段階であって、任意で、該哺乳類細胞が、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそれらのサブクラスおよび変異体からなる群より選択される、段階
を含む方法によって、安定した哺乳類細胞内で生成される、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記一価抗体構築物が、
（ａ）配列番号：１４に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、軽鎖ポリペプチド、
配列番号：１２に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第１の重鎖ポリペプチド、および
配列番号：１６に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第２の重鎖ポリペプチド
を含むか；
（ｂ）配列番号：２０に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、軽鎖ポリペプチド、
配列番号：１８に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第１の重鎖ポリペプチド、および
配列番号：２２に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第２の重鎖ポリペプチド
を含むか；
（ｃ）配列番号：４４に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、軽鎖ポリペプチド、
配列番号：４０に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第１の重鎖ポリペプチド、および
配列番号：４２に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第２の重鎖ポリペプチド
を含むか；
（ｄ）配列番号：５０に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、軽鎖ポリペプチド、
配列番号：４６に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第１の重鎖ポリペプチド、および
配列番号：４８に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第２の重鎖ポリペプチド
を含むか；または
（ｅ）配列番号：３６に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第１のポリペプチド、および
配列番号：３８に示される最終タンパク質生成物配列を含み、シグナルペプチド配列を含まない、第２のポリペプチド
を含む、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記一価抗体構築物が、１つ以上の薬物分子と結合されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１２年５月１０日に出願された、米国仮特許出願第６１／６４５５４７号、２０１２年１１月２日に出願された、米国仮特許出願第６１／７２２０７０号、２０１２年７月１３日に出願された、米国仮特許出願第６１／６７１６４０号、および２０１３年２月８日に出願された、米国仮特許出願第６１／７６２８１２号の利益を主張するものであり、そのそれぞれはその全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ASCII形式でEFS-Webを介して提出されかつその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。2013年6月13日に作成された当該ASCIIのコピーは、40252-722.601_SL.txtという名称であり、134,043バイトのサイズである。

【0002】

本発明の技術分野は、生物学的療法の個々の開発のためのスキャフォールドの合理的設計である。

【背景技術】

【0003】

治療用タンパク質の分野において、その多価標的結合特徴を有する抗体は、薬物候補を設計するための優秀なスキャフォールドである。現在市場にある抗体治療法は、２つの抗体ＦＡＢによって与えられる高親和性結合およびアビディティーに最適化され、選択される二価単一特異性抗体である。抗体Ｆｃ依存性細胞傷害性機構を介して抗体をより効果的にするために、変異誘発によるＦｃｇＲ結合の脱フコシル化（Ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）または強化が用いられてきた。アフコシル化抗体または強化されたＦｃｇＲ結合を有する抗体は、未だ臨床試験における不完全な治療効果に悩まされており、市販薬物の状態は、これらの抗体のいずれにも至っていない。

【0004】

治療用抗体は、抗体依存性の治療効果を最大化するために、対象患者への投与後の標的特異性、生体安定性（ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、バイオアベイラビリティ、および生体内分布、ならびに十分な標的結合親和性および高標的占有率、および標的細胞の抗体装飾（ｄｅｃｏｒａｔｉｏｎ）を含む、ある特定の最低限の特性を理想的に持つことになる。これらの最低限の特性のすべて、特に１：１の抗体対標的比率で標的を完全に占有することができる抗体を有する抗体治療法を作り出す試みにおいて、限られた成果が上がっている。例えば、完全長二価単一特異性ＩｇＧ抗体は、飽和濃度であっても１：１の比率で標的を完全に占有することができない。理論的観点から、飽和濃度において従来の単一特異性二価抗体は、一価抗体フラグメントと比較して、結合作用を与えることができる２つの同一の抗原結合ＦＡＢの存在によって、抗体１：標的２の比率で最大限に標的に結合することが予想される。さらに、そのような完全長抗体は、より大きい分子サイズの結果として、より限定されたバイオアベイラビリティおよび／または生体内分布に悩まされる。その上完全長抗体は、場合によって、標的抗原に結合するとアゴニスト作用を示すことがあり、それはアンタゴニスト作用が所望の治療機能である場合に、望ましくない。いくつかの事例において、この現象は、細胞表面受容体に結合されるとき、受容体活性化を引き起こす受容体二量体形成を促進する二価抗体の「架橋」作用に起因する。加えて、従来の二価抗体は、抗体依存性細胞傷害効果または治療活性の他の機構を可能にする最大治療安全用量における１：２の抗体対標的抗原比において、限定された抗体結合および標的細胞の装飾のための限定された治療効果に悩まされる。

【発明の概要】

【0005】

単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、本一価抗体構築物は、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物であって、１つのその単量体Ｆｃポリペプチドが、その抗原結合ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合する、Ｆｃポリペプチド構築物と、を含み、その一価抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して増加した結合密度およびＢ_ｍａｘで、その単一特異性二価抗体構築物に相当する解離定数（Ｋ_ｄ）で、その単一特異性二価抗体構築物のものに相当するか、またはより遅いオフ速度で、その抗原を提示する標的細胞に選択的および／または特異的に結合し、その一価抗体構築物は、その単一特異性二価抗体構築物に相当する生物物理学的およびインビボ安定性と、その単一特異性二価抗体構築物に相当するか、またはそれを超える細胞傷害性と、を示す。

【0006】

ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が提供され、その一価抗体構築物は、同族リガンドの標的抗原への結合を遮断する。ある特定の実施形態においては、本明細書に提供される単離された一価抗体構築物であり、その一価抗体構築物は、同族リガンドの標的抗原への結合を遮断しない。一実施形態においては、単離された一価抗体構築物であり、１：１の抗体対標的比において、単一特異性二価抗体に対する結合密度およびＢｍａｘの増加が、抗体の観測される平衡定数（Ｋｄ）を超えて飽和濃度までの濃度で観測される。一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その一価抗体構築物は抗体の観測される平衡定数（Ｋｄ）を超えて飽和濃度までの濃度で、その対応する二価抗体構築物と比較してより高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣ効果のうちの少なくとも１つを示す。

【0007】

本明細書に記載の単離された一価抗体構築物がいくつかの実施形態において提供され、その構築物は、エフェクター活性に関与するＦｃドメインを含む一価溶解性抗体構築物であり、その溶解性抗体構築物は、非アゴニストであり、同族リガンドの標的抗原への結合を遮断し、細胞成長を阻害し、ならびにその溶解性抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して、増加したＢ_ｍａｘ、速いオン速度、および同等のオフ速度でその標的細胞に結合し、飽和する。

【0008】

一実施形態においては、単離された一価抗体構築物であり、その構築物はインターナライズされない。いくつかの実施形態においては、単離された一価抗体構築物であり、その構築物はインターナライズされる。

【0009】

本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、その構築物は、効果的にインターナライズされる一価インターナライズ抗体構築物であり、そのインターナライズ抗体は非アゴニストであり、同族リガンドの標的抗原への結合を遮断し、および細胞成長を誘発せず、ならびにそのインターナライズ抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して、増加したＢ_ｍａｘ、速いオン速度、およびより遅いオフ速度でその標的細胞に結合する。

【0010】

一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その構築物のインターナリゼーションは、対応する単一特異性二価抗体のものを超えるか、同等であるか、またはそれを下回る。一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その結合密度およびＢｍａｘの増加は、標的細胞上の抗原の密度に依存しない。一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が提供され、その結合密度およびＢｍａｘの増加は、標的抗原エピトープに依存しない。

【0011】

一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その構築物はアビディティーを示さない。

【0012】

一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その二量体Ｆｃポリペプチド構築物はヘテロ二量体である。一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その一価抗原結合ポリペプチド構築物は、抗原に結合することができるＦａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合ペプチド、またはタンパク質ドメインである。１つの実施形態においては、単離された一価抗体構築物であり、そのＦａｂフラグメントは重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含む。

【0013】

一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その標的細胞は同族の抗原を発現する細胞であり、その細胞はＨＥＲ２を発現する疾患細胞および癌細胞を含む一覧から選択される。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その抗原結合ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に結合し、その標的細胞は、低度、中程度、もしくは高度ＨＥＲ２発現細胞、プロゲステロン受容体陰性細胞、またはエストロゲン受容体陰性細胞のうちの少なくとも１つである。一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２細胞外ドメインに結合し、その細胞外ドメインは、ＥＣＲ１、２、３、および４のうちの少なくとも１つである。

【0014】

ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、本一価抗体構築物は、ＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、その単量体Ｆｃポリペプチドのうちの１つが抗原結合ポリペプチド構築物に融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含み、その抗体構築物は、等モル濃度におけるＨＥＲ２に結合する対応する二価抗体構築物と比較して、ＦＣγＲに対する結合密度の増加を示す。

【0015】

ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、本一価抗体構築物は、ＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物であって、それぞれがＣＨ３ドメインを含み、その単量体Ｆｃポリペプチドのうちの１つがその抗原結合ポリペプチド構築物に融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含み、その抗体構築物は、標的細胞によってインターナライズされ、その構築物はＨＥＲ２に結合する対応する二価抗体構築物と比較して、標的細胞上で提示されるＨＥＲ２への結合密度およびＢｍａｘの増加を示し、ならびにその構築物は、等モル濃度におけるその対応する二価ＨＥＲ２結合抗体構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。

【0016】

一実施形態においては、ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗体構築物であり、本一価抗体構築物は、ＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、その単量体Ｆｃポリペプチドのうちの１つがその抗原結合ポリペプチド構築物に融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含み、その抗体構築物はＦｃＲｎと結合するが、２つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較してより高いＶｓｓを示す。

【0017】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価ＨＥＲ２結合抗体構築物であり、その一価ＨＥＲ２結合ポリペプチド構築物は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、またはポリペプチドのうちの少なくとも１つである。

【0018】

本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、その二量体Ｆｃ構築物は、変異型ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ構築物である。一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その変異型ＣＨ３ドメインは、ネイティブのホモ二量体Ｆｃ領域に相当する安定性を持つそのヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸変異を含む。一実施形態においては、単離された一価抗体構築物であり、その変異型ＣＨ３ドメインは、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。さらなる実施形態においては、単離された一価抗体であり、その変異型ＣＨ３ドメインは、約７５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。また、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が提供され、その変異型ＣＨ３ドメインは、約８０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。さらなる実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その二量体Ｆｃ構築物は、Ｆｃγ受容体の選択的結合を促進するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ２ドメインをさらに含む。関連する実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、そのヘテロ二量体Ｆｃ構築物は、野生型Ｆｃ領域と比べて、ＣＨ３ドメインに追加のジスルフィド結合を含まない。一実施形態においては、本明細書に提供される単離された一価抗体構築物であり、そのヘテロ二量体Ｆｃ構築物は、野生型Ｆｃ領域と比べて変異型ＣＨ３ドメインに追加のジスルフィド結合を含み、その変異型ＣＨ３ドメインは少なくとも約７７．５℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その二量体Ｆｃ構築物は、約７５％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体であり、その二量体Ｆｃ構築物は、約８０％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である。また、単離された一価抗体構築物が提供され、その二量体Ｆｃ構築物は、約９０％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その二量体Ｆｃ構築物は、約９５％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である。

【0019】

本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、その単量体Ｆｃポリペプチドは、リンカーによって抗原結合ポリペプチド構築物に融合する。ある特定の実施形態において、リンカーはポリペプチドリンカーである。

【0020】

本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が一実施形態において提供され、その構築物は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つの約１０５％超を有する。一実施形態においては、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つの約１２５％を有する構築物がある。別の実施形態においては、対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つの約１５０％を有する構築物がある。一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その構築物は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約３００％を有する。

【0021】

本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が一実施形態において提供され、その結合密度およびＢ_ｍａｘの増加は、対応する二価抗体構築物の結合密度およびＢｍａｘの少なくとも約１２５％である。一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その結合密度およびＢ_ｍａｘの増加は、対応する二価抗体構築物の結合密度およびＢｍａｘの少なくとも約１５０％である。また、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が提供され、その結合密度およびＢ_ｍａｘの増加は、対応する二価抗体構築物の結合密度およびＢｍａｘの少なくとも約２００％である。

【0022】

一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物をコードする核酸を含む宿主細胞がある。いくつかの実施形態において、その中で核酸が抗原結合ポリペプチド構築物をコードし、かつ核酸がＦｃ構築物をコードする宿主細胞は、単一のベクター中に存在する。また、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物を調製する方法が提供され、その方法は、（ａ）抗体フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）宿主細胞培養物から抗体フラグメントを回収するステップと、を含む。

【0023】

一実施形態においては、安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物または糖改変アフコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、本方法は、重鎖可変ドメインおよび第１のＦｃドメインポリペプチドを含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ配列；第２のＦｃドメインポリペプチドを含む第２の重鎖ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第２のＤＮＡ配列；ならびに軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第３のＤＮＡ配列を用いて、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように少なくとも１つの安定した哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、その重鎖および軽鎖ポリペプチドがその少なくとも１つの安定した哺乳類細胞内で所望のグリコシル化一価非対称抗体として発現されるように、少なくとも１つの哺乳類細胞内のその第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を翻訳する段階と、を含む。

【0024】

本明細書に記載のグリコシル化一価抗体構築物または糖改変アフコシル化一価抗体構築物を生成する方法が一実施形態において提供され、本方法は、少なくとも２つの細胞のそれぞれが異なる比率で重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを発現するように、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を異なる既定の比率で少なくとも２つの異なる細胞へトランスフェクトする段階を含む。一実施形態においては、グリコシル化一価抗体構築物または糖改変アフコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、本方法は、その第１、第２、および第３のＤＮＡ配列のうちの少なくとも２つを含むマルチシストロンベクターを少なくとも１つの哺乳類細胞へトランスフェクトする段階を含む。一実施形態において、その少なくとも１つの哺乳類細胞は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２、およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそれらのサブクラスおよび変異体から成る群から選択される。

【0025】

一実施形態において、グリコシル化一価抗体構築物または糖改変アフコシル化一価抗体構築物を生成する方法が提供され、その第１のＤＮＡ配列：第２のＤＮＡ配列：第３のＤＮＡ配列のその既定の比率は、約１：１：１である。

【0026】

別の実施形態においては、本明細書に記載のグリコシル化一価抗体構築物または糖改変アフコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、その第１のＤＮＡ配列：第２のＤＮＡ配列：第３のＤＮＡ配列のその既定の比率は、翻訳される第１の重鎖ポリペプチドの量が第２の重鎖ポリペプチドの量およびその軽鎖ポリペプチドの量にほぼ等しくなるようなものである。一実施形態においては、本明細書に記載の方法であり、その少なくとも１つの安定した哺乳類細胞の発現生成物は、単量体重鎖もしくは軽鎖ポリペプチド、または他の抗体と比較して、より大きい割合の所望のグリコシル化一価抗体を含む。

【0027】

一実施形態においては、本明細書に記載のグリコシル化一価抗体構築物または糖改変アフコシル化一価抗体構築物を生成する方法が提供され、本方法は、所望のグリコシル化一価抗体を同定し、精製する段階を含む。ある特定の実施形態において、その同定は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の１つまたは両方によるものである。

【0028】

改善されたＡＤＣＣを持つ抗体構築物を生成する方法が本明細書に提供され、本方法は、重鎖可変ドメインおよび第１のＦｃドメインポリペプチドを含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ配列；第２のＦｃドメインポリペプチドを含む第２の重鎖ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第２のＤＮＡ配列；ならびに軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第３のＤＮＡ配列を用いて、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように少なくとも１つの安定した哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、その重鎖および軽鎖ポリペプチドがその少なくとも１つの安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体として発現されるように、少なくとも１つの哺乳類細胞内のその第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を翻訳する段階と、を含み、そのグリコシル化一価非対称抗体は、対応する野生型抗体と比較してより高いＡＤＣＣを有する。

【0029】

改善されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つを持つＨＥＲ２結合抗体構築物を生成する方法が本明細書に提供され、本方法は、重鎖可変ドメインおよび第１のＦｃドメインポリペプチドを含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ配列；第２のＦｃドメインポリペプチドを含むその第２の重鎖ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第２のＤＮＡ配列；ならびに軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第３のＤＮＡ配列を用いて、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、その重鎖および軽鎖ポリペプチドがその少なくとも１つの安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価非対称ＨＥＲ２結合抗体として発現されるように、少なくとも１つの哺乳類細胞内のその第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を翻訳する段階と、を含み、そのグリコシル化一価ＨＥＲ２結合抗体は、対応する野生型ＨＥＲ２結合抗体と比較して改善されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つを有する。

【0030】

少なくとも１つの標的細胞上で抗体濃度を増加させる方法が提供され、本方法は、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、二量体Ｆｃ領域と、を含む、一価抗体構築物を標的細胞に提供し、その一価抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応する二価抗体構築物と比較してその抗原を提示する標的細胞に対する結合密度およびＢｍａｘの増加を示し、その一価抗体構築物は、対応する二価抗体構築物と比較して改善された効果を示し、その改善された効果は、抗原の架橋、抗原二量体形成、抗原調節の阻止、抗原インターナリゼーションもしくは抗原下方制御、または抗原活性化によるものではない。

【0031】

本明細書に記載の一価抗体構築物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書に提供される。ある特定の実施形態においては、一価抗体構築物と結合される薬物分子をさらに含む、本明細書に記載の医薬組成物がある。

【0032】

その方法を必要とする患者に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を提供する段階を含む、癌を治療する方法が本明細書に提供される。ＨＥＲシグナル伝達の障害を治療する方法を必要とする患者に本明細書に記載の医薬組成物を提供する、その方法が提供される。腫瘍を有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、腫瘍の成長を阻害する方法が本明細書に提供される。腫瘍を有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、腫瘍を縮小させる方法が提供される。

【0033】

乳癌を治療する方法を必要とする患者に有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を提供する段階を含む、その方法が提供される。一実施形態においては、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＴＤＭ１、および抗ＨＥＲ二価抗体のうちの１つ以上を用いた治療に部分的に応答性である患者において乳癌を治療する方法であり、本方法は、その方法を必要とする患者に有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を提供する段階を含む。一実施形態においては、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＴＤＭ１（ＡＤＣ）、および抗ＨＥＲ二価抗体のうちの１つ以上を用いた治療に応答しない患者において乳癌を治療する方法であり、本方法は、その方法を必要とする患者に有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を提供する段階を含む。本明細書に記載の乳癌を治療する方法が提供され、その方法は、別の治療薬に加えてその抗体構築物を提供する段階を含む。一実施形態においては、本明細書に記載の乳癌を治療する方法であり、その抗体構築物は、その治療薬と同時に提供される。また、本明細書に提供される乳癌を治療する方法が提供され、その抗体構築物はその治療薬と結合される。

【0034】

一価抗体構築物が１つ以上の薬物分子と結合している、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が提供される。

【0035】

抗原を有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、抗原分子の多量体形成を阻害する方法が提供される。抗原を、抗原に結合させるのに十分な量の本明細書に記載の一価抗体構築物を含む組成物と接触させることを含む、抗原がその同族の結合パートナーと結合する段階を阻害する方法がまた提供される。

【0036】

また、本明細書に記載の一価抗体構築物をコードし、発現するために、本明細書に記載の核酸分子を含有するように修飾される形質転換体が提供される。

【0037】

[本発明1001]
単離された一価抗体構築物であって、
抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、
それぞれがＣＨ3ドメインを含む2つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物であって、1つの前記単量体Ｆｃポリペプチドが、前記抗原結合ポリペプチド構築物からの少なくとも1つのポリペプチドに融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と
を含み、
前記一価抗体構築物が、
2つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して増加した結合密度およびＢｍａｘで、
前記単一特異性二価抗体構築物に相当する解離定数（Ｋｄ）で、
前記単一特異性二価抗体構築物のものに相当するか、またはより遅いオフ速度で、前記抗原を提示する標的細胞に選択的および／または特異的に結合し、
前記一価抗体構築物が、前記単一特異性二価抗体構築物に相当する生物物理学的およびインビボ安定性と、前記単一特異性二価抗体構築物に相当するか、またはそれを超えるオンターゲット細胞傷害性と、を示す、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1002]
同族のリガンドが前記標的抗原に結合することを遮断する、本発明1001の単離された一価抗体構築物。
[本発明1003]
前記同族リガンドの前記標的抗原への結合を遮断しない、本発明1001の単離された一価抗体構築物。
[本発明1004]
1：1の抗体対標的比において、単一特異性二価抗体に対する結合密度およびＢｍａｘの増加が、前記抗体の観測される平衡定数（Ｋｄ）を超えて飽和濃度までの濃度で観測される、本発明1001の単離された一価抗体構築物。
[本発明1005]
前記抗体の前記観測される平衡定数（Ｋｄ）を超えて飽和濃度までの濃度で、前記対応する二価抗体構築物と比較してより高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣ効果のうちの少なくとも1つを示す、本発明1001〜1004のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1006]
前記構築物が、エフェクター活性に関与するＦｃドメインを含む一価溶解性抗体構築物であり、前記溶解性抗体構築物が、非アゴニストであり、同族リガンドの前記標的抗原への結合を遮断し、抗原シグナル伝達を遮断し、細胞成長を阻害することができ、
前記溶解性抗体構築物が、2つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して、増加したＢｍａｘ、速いオン速度、および同等のオフ速度で前記標的細胞に結合し、飽和する、本発明1001〜1005のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1007]
インターナライズされない、本発明1006の単離された一価抗体構築物。
[本発明1008]
インターナライズされる、本発明1001〜1006のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1009]
前記構築物が、効果的にインターナライズされる一価インターナライズ抗体構築物であり、
前記インターナライズ抗体が、抗原シグナル伝達を遮断することができ、非アゴニストであり、同族リガンドの前記標的抗原への結合を遮断し、かつ細胞成長を誘発せず、
前記インターナライズ抗体構築物が、2つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して、増加したＢｍａｘ、速いオン速度、およびより遅いオフ速度で前記標的細胞に結合する、本発明1001〜1006のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1010]
前記構築物の前記インターナリゼーションが、前記単一特異性二価抗体のものを超える、同等である、またはそれを下回る、本発明1001〜1006、1008、または1009のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1011]
前記結合密度およびＢｍａｘの増加が、前記標的細胞上の前記抗原の密度に依存しない、本発明1001〜1009のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1012]
前記結合密度およびＢｍａｘの増加が、前記標的抗原エピトープに依存しない、本発明1001〜1010のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1013]
前記標的細胞が、前記同族の抗原を発現する細胞であり、前記細胞がＨＥＲ受容体を発現する疾患細胞および癌細胞を含む一覧から選択される、本発明1001〜1011のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1014]
アビディティーを示さない、本発明1001〜1012のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1015]
前記二量体Ｆｃポリペプチド構築物が、ヘテロ二量体である、本発明1001〜1013のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1016]
前記抗原結合ポリペプチド構築物がＨＥＲ2に結合し、前記標的細胞が、低度、中程度、もしくは高度ＨＥＲ2発現細胞、プロゲステロン受容体陰性細胞、またはエストロゲン受容体陰性細胞のうちの少なくとも1つである、本発明1001〜1014のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1017]
前記抗原結合ポリペプチド構築物がＨＥＲ2細胞外ドメインに結合し、前記細胞外ドメインが、ＥＣＤ1、2、3、および4のうちの少なくとも1つである、本発明1001〜1015のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1018]
前記一価抗原結合ポリペプチド構築物が、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合ペプチド、または前記抗原に結合することができるタンパク質ドメインである、本発明1001〜1016のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1019]
前記Ｆａｂフラグメントが、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含む、本発明1017の単離された一価抗体構築物。
[本発明1020]
ＨＥＲ2に結合する単離された一価抗体構築物であって、
ＨＥＲ2に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、
2つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物であって、それぞれがＣＨ3ドメインを含み、前記単量体Ｆｃポリペプチドのうちの1つが前記抗原結合ポリペプチド構築物に融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と
を含み、
前記抗体構築物が、Ｋ_Ｄを上回りかつ飽和状態の等モル濃度においてＨＥＲ2に結合する対応する二価抗体構築物と比較して、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲによって、前記標的細胞の増加した装飾（ｄｅｃｏｒａｔｉｏｎ）を媒介する、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1021]
ＨＥＲ2に結合する単離された一価抗体構築物であって、
ＨＥＲ2に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、
2つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物であって、それぞれがＣＨ3ドメインを含み、前記単量体Ｆｃポリペプチドのうちの1つが前記抗原結合ポリペプチド構築物に融合する、前記二量体Ｆｃポリペプチド構築物と
を含み、
前記抗体構築物が、標的細胞によってインターナライズされ、
前記構築物が、ＨＥＲ2に結合する対応する二価抗体構築物と比較して、前記標的細胞上で提示されるＨＥＲ2への結合密度およびＢｍａｘの増加を示し、
前記構築物が、Ｋ_Ｄを上回りかつ飽和状態の等モル濃度において前記対応する二価ＨＥＲ2結合抗体構築物と比較してより高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣのうちの少なくとも1つを示す、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1022]
ＨＥＲ2に結合する単離された一価抗体構築物であって、
ＨＥＲ2に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、
2つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物であって、それぞれがＣＨ3ドメインを含み、前記単量体Ｆｃポリペプチドのうちの1つが前記抗原結合ポリペプチド構築物に融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と
を含み、
前記抗体構築物がＦｃＲｎに結合するが、2つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較してより高いＶｓｓを示す、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1023]
1つ以上の薬物分子と結合している、本発明1001〜1021のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1024]
アビディティーを示さない、本発明1001〜1023のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1025]
前記一価ＨＥＲ2結合ポリペプチド構築物が、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、またはポリペプチドのうちの少なくとも1つである、本発明1013〜1014のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1026]
2つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも1つの約105％超を有する、本発明1001〜1024のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1027]
2つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも約125％を有する、本発明1001〜1025のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1028]
対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも1つの少なくとも約150％を有する、本発明1001〜1026のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1029]
2つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なく とも1つの少なくとも約300％を有する、本発明1001〜1027のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1030]
前記結合密度およびＢｍａｘの増加が、前記対応する二価抗体構築物の前記結合密度およびＢ_ｍａｘの少なくとも約125％である、本発明1001〜1028のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1031]
前記結合密度およびＢ_ｍａｘの増加が、前記対応する二価抗体構築物の前記結合密度およびＢｍａｘの少なくとも約150％である、本発明1001〜1029のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1032]
前記結合密度およびＢ_ｍａｘの増加が、前記対応する二価抗体構築物の前記結合密度およびＢｍａｘの少なくとも約200％である、本発明1001〜1030のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1033]
前記二量体Ｆｃ構築物が、変異型ＣＨ3ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ構築物である、本発明1001〜1031のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1034]
前記変異型ＣＨ3ドメインが、ネイティブのホモ二量体Ｆｃ領域に相当する安定性を持つ前記ヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸突然変異体を含む、本発明1032の単離された一価抗体構築物。
[本発明1035]
前記変異型ＣＨ3ドメインが、約70℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、本発明1033の単離された一価抗体構築物。
[本発明1036]
前記変異型ＣＨ3ドメインが、約75℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、本発明1034の単離された一価抗体構築物。
[本発明1037]
前記変異型ＣＨ3ドメインが、約80℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、本発明1035の単離された一価抗体構築物。
[本発明1038]
前記二量体Ｆｃ構築物が、Ｆｃγ受容体の選択的結合を促進するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ2ドメインをさらに含む、本発明1001〜1036のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1039]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ構築物が、野生型Ｆｃ領域と比べて、前記ＣＨ3ドメインに追加のジスルフィド結合を含まない、本発明1032〜1037のいずれかの単離された一価抗体。
[本発明1040]
前記ヘテロ二量体Ｆｃ構築物が、野生型Ｆｃ領域と比べて前記変異型ＣＨ3ドメインに追加のジスルフィド結合を含み、前記変異型ＣＨ3ドメインが少なくとも約77．5℃の融解温度（Ｔｍ）を有する、本発明1032〜1038のいずれかの単離された一価抗体。
[本発明1041]
前記二量体Ｆｃ構築物が、約75％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である、本発明1001〜1039のいずれかの単離された一価抗体。
[本発明1042]
前記二量体Ｆｃ構築物が、約80％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である、本発明1001〜1040のいずれかの単離された一価抗体。
[本発明1043]
前記二量体Ｆｃ構築物が、約90％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である、本発明1001〜1041のいずれかの単離された一価抗体。
[本発明1044]
前記二量体Ｆｃ構築物が、約95％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である、本発明1001〜1042のいずれかの単離された一価抗体。
[本発明1045]
前記単量体Ｆｃポリペプチドが、リンカーによって前記抗原結合ポリペプチド構築物に融合する、本発明1001〜1043のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1046]
前記リンカーが、ポリペプチドリンカーである、本発明1044の単離された一価抗体構築物。
[本発明1047]
本発明1001〜1045のいずれかの単離された一価抗体構築物をコードする核酸を含む宿主細胞。
[本発明1048]
前記抗原結合ポリペプチド構築物をコードする前記核酸および前記Ｆｃ構築物をコードする前記核酸が単一のベクター中に存在する、本発明1046の宿主細胞。
[本発明1049]
本発明1001〜1047のいずれかの単離された一価抗体構築物を調製する方法であって、
（ａ）前記抗体フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階と、
（ｂ）前記宿主細胞培養物から前記抗体フラグメントを回収する段階と
を含む、前記方法。
[本発明1050]
本発明1001〜1045のいずれかの前記一価抗体構築物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
[本発明1051]
前記一価抗体構築物と結合している薬物分子をさらに含む、本発明1049の医薬組成物。
[本発明1052]
癌を治療する方法であって、その方法を必要とする患者に、有効量の本発明1049〜1051のいずれかの医薬組成物を提供する段階を含む、前記方法。
[本発明1053]
ＨＥＲシグナル伝達の障害を治療する方法であって、その方法を必要とする患者に、有効量の本発明1049〜1051のいずれかの医薬組成物を提供する段階を含む、前記方法。
[本発明1054]
腫瘍の成長を阻害する方法であって、前記腫瘍を、有効量の本発明1001〜1045のいずれかの前記一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、前記方法。
[本発明1055]
腫瘍を縮小させる方法であって、前記腫瘍を、有効量の本発明1001〜1045のいずれかの前記一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、前記方法。
[本発明1056]
抗原分子のシグナル伝達を阻害する方法であって、前記抗原を、有効量の本発明1001〜1045のいずれかの前記一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、前記方法。
[本発明1057]
抗原がその同族の結合パートナーと結合することを阻害する方法であって、前記抗原を、前記抗原に結合させるのに十分な量の本発明1001〜1045のいずれかの前記一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、前記方法。
[本発明1058]
乳癌を治療する方法であって、その方法を必要とする患者に、有効量の本発明1012〜1045のいずれかの一価抗体構築物を提供する段階を含む、前記方法。
[本発明1059]
トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＴＤＭ1、および抗ＨＥＲ二価抗体のうちの1つ以上を用いた治療に部分的に応答性である患者において乳がんを治療する方法であって、前記方法が、その方法を必要とする患者に、有効量の本発明1012〜1045のいずれかの一価抗体構築物を提供する段階を含む、前記方法。
[本発明1060]
トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＴＤＭ1（ＡＤＣ）、および抗ＨＥＲ二価抗体のうちの1つ以上を用いた治療に応答しない患者において乳がんを治療する方法であって、その方法を必要とする患者に、有効量の本発明1012〜1045のいずれかの一価抗体構築物を提供する段階を含む、前記方法。
[本発明1061]
別の治療薬に加えて前記抗体構築物を提供する段階を含む、本発明1057〜1060のいずれかの乳癌を治療する方法。
[本発明1062]
前記抗体構築物が、前記治療薬と同時に提供される、本発明1060の乳癌を治療する方法。
[本発明1063]
前記抗体構築物が、前記治療薬と結合している、本発明1060の乳癌を治療する方法。
[本発明1064]
安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物または糖が改変されたアフコシル化一価抗体構築物を生成する方法であって、
重鎖可変ドメインおよび第1のＦｃドメインポリペプチドを含む第1の重鎖ポリペプチドをコードする、第1のＤＮＡ配列;
第2のＦｃドメインポリペプチドを含む前記第2の重鎖ポリペプチドをコードする第2のＤＮＡ配列であって、第2の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第2のＤＮＡ配列;及び
軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第3のＤＮＡ配列
を用いて、前記第1のＤＮＡ配列、前記第2のＤＮＡ配列、および前記第3のＤＮＡ配列が既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように、少なくとも1つの安定した前記哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、
前記重鎖および軽鎖ポリペプチドが前記少なくとも1つの安定した哺乳類細胞内で前記所望のグリコシル化一価非対称抗体として発現されるように、前記少なくとも1つの哺乳類細胞内の前記第1のＤＮＡ配列、前記第2のＤＮＡ配列、および前記第3のＤＮＡ配列を翻訳する段階と
を含む、前記方法。
[本発明1065]
少なくとも2つの細胞のそれぞれが、異なる比率で前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドを発現するように、前記第1のＤＮＡ配列、前記第2のＤＮＡ配列、および前記第3のＤＮＡ配列を異なる既定の比率で、前記少なくとも2つの異なる細胞へトランスフェクトする段階を含む、本発明1063の方法。
[本発明1066]
前記第1、第2、および第3のＤＮＡ配列のうちの少なくとも2つを含むマルチシストロンベクターを前記少なくとも1つの哺乳類細胞へトランスフェクトする段階を含む、本発明1064の方法。
[本発明1067]
前記少なくとも1つの哺乳類細胞が、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ0、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ138、ＢＨＫ、ＣＯＳ−7、Ｃａｃｏ−2、およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそれらのサブクラスおよび変異体から成る群から選択される、本発明1063〜1065のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記第1のＤＮＡ配列：第2のＤＮＡ配列：第3のＤＮＡ配列の前記既定の比率が、約1：1：1である、本発明1063〜1066のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記第1のＤＮＡ配列：第2のＤＮＡ配列：第3のＤＮＡ配列の前記既定の比率が、翻訳される第1の重鎖ポリペプチドの量が前記第2の重鎖ポリペプチドの量および前記軽鎖ポリペプチドの量にほぼ等しくなるようなものである、本発明1063〜1067のいずれかの方法。
[本発明1070]
前記少なくとも1つの安定した哺乳類細胞の前記発現生成物が、前記単量体重鎖もしくは軽鎖ポリペプチド、または他の抗体と比較して、より大きいパーセンテージの前記所望のグリコシル化一価抗体を含む、本発明1063〜1068のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記所望のグリコシル化一価抗体を同定し、精製する段階を含む、本発明1063〜1069のいずれかの方法。
[本発明1072]
前記同定が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の1つまたは両方によるものである、本発明1070の方法。
[本発明1073]
改善されたＡＤＣＣを有する抗体構築物を生成する方法であって、
重鎖可変ドメインおよび第1のＦｃドメインポリペプチドを含む第1の重鎖ポリペプチドをコードする、第1のＤＮＡ配列；
第2のＦｃドメインポリペプチドを含む前記第2の重鎖ポリペプチドをコードする第2のＤＮＡ配列であって、第2の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第2のＤＮＡ配列；及び
軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第3のＤＮＡ配列
を用いて、前記第1のＤＮＡ配列、前記第2のＤＮＡ配列、および前記第3のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように、少なくとも1つの安定した前記哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、
前記重鎖および軽鎖ポリペプチドが前記少なくとも1つの安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体として発現されるように、前記少なくとも1つの哺乳類細胞内の前記第1のＤＮＡ配列、前記第2のＤＮＡ配列、および前記第3のＤＮＡ配列を翻訳する段階と
を含み、前記グリコシル化一価非対称抗体が、対応する野生型抗体と比較してより高いＡＤＣＣを有する、前記方法。
[本発明1074]
改善されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも1つを有する、ＨＥＲ2結合抗体構築物を生成する方法であって、
重鎖可変ドメインおよび第1のＦｃドメインポリペプチドを含む第1の重鎖ポリペプチドをコードする、第1のＤＮＡ配列；
第2のＦｃドメインポリペプチドを含む前記第2の重鎖ポリペプチドをコードする第2のＤＮＡ配列であって、第2の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第2のＤＮＡ配列；及び
軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第3のＤＮＡ配列
を用いて、前記第1のＤＮＡ配列、前記第2のＤＮＡ配列、および前記第3のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように、少なくとも1つの安定した前記哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、
前記重鎖および軽鎖ポリペプチドが前記少なくとも1つの安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価非対称ＨＥＲ2結合抗体として発現されるように、前記少なくとも1つの哺乳類細胞内の前記第1のＤＮＡ配列、前記第2のＤＮＡ配列、および前記第3のＤＮＡ配列を翻訳する段階と
を含み、前記グリコシル化一価ＨＥＲ2結合抗体が、対応する野生型ＨＥＲ2結合抗体と比較して改善されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも1つを有する、前記方法。
[本発明1075]
標的細胞に一価抗体構築物を提供する少なくとも1つの標的細胞上で抗体濃度を上昇させる方法であって、
抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、
二量体Ｆｃ領域と
を含み、
前記一価抗体構築物が、2つの抗原結合領域を持つ対応する二価抗体構築物と比較して前記抗原を提示する標的細胞に対する結合密度およびＢｍａｘの増加を示し、
前記一価抗体構築物が、対応する二価抗体構築物と比較して改善された効果を示し、前記改善された効果が前記抗原の架橋、抗原二量体形成によるものではない、前記方法。
[本発明1076]
標的細胞に一価抗体構築物を提供する少なくとも1つの標的細胞上で抗体濃度を上昇させる方法であって、
抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、
二量体Ｆｃ領域と
を含み、
前記一価抗体構築物が、2つの抗原結合領域を持つ対応する二価抗体構築物と比較して前記抗原を提示する標的細胞に対する結合密度およびＢｍａｘの増加を示し、
前記一価抗体構築物が、対応する二価抗体構築物と比較して改善された効果を示し、前記改善された効果が抗原調節を含み得る、前記方法。
[本発明1077]
腫瘍を死滅させる方法であって、前記腫瘍を、有効量の本発明1001〜1045のいずれかの前記一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、前記方法。
[本発明1078]
前記標的細胞が、前記同族の抗原を発現する細胞であり、前記細胞がＨＥＲ2を発現する疾患細胞および癌細胞を含む一覧から選択される、本発明1001〜1011のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1079]
前記構築物が、非アゴニストであるか、または部分的にアゴニストである、本発明1006の単離された一価抗体構築物。
[本発明1080]
ＨＥＲ2に結合する単離された一価抗体構築物であって、
配列番号14に示される最終タンパク質生成物配列を含む、軽鎖ポリペプチドと、
配列番号12に示される最終タンパク質生成物配列を含む、第1の重鎖ポリペプチドと、
配列番号16に示される最終タンパク質生成物配列を含む、第2の重鎖ポリペプチドと
を含み、
前記抗体構築物がＨＥＲ2を呈する標的細胞に一価的に結合することができ、前記最終タンパク質生成物配列のそれぞれがシグナルポリペプチド配列を含まない、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1081]
ＨＥＲ2に結合する単離された一価抗体構築物であって、
配列番号13に示されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、軽鎖ポリペプチドと、
配列番号11に示されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、第1の重鎖ポリペプチドと、
配列番号15に示されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、第2の重鎖ポリペプチドと
を含み、
前記抗体構築物がＨＥＲ2を呈する標的細胞に一価的に結合することができ、前記ポリペプチド配列のそれぞれがシグナルポリペプチド配列を含まない、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1082]
ＨＥＲ2に結合する単離された一価抗体構築物であって、
配列番号44に示される最終タンパク質生成物配列を含む、軽鎖ポリペプチドと、
配列番号40に示される最終タンパク質生成物配列を含む、第1の重鎖ポリペプチドと、
配列番号42に示される最終タンパク質生成物配列を含む、第2の重鎖ポリペプチドと
を含み、
前記抗体構築物がＨＥＲ2を呈する標的細胞に一価的に結合することができ、前記最終タンパク質生成物配列のそれぞれがシグナルポリペプチド配列を含まない、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1083]
ＨＥＲ2に結合する単離された一価抗体構築物であって、
配列番号43に示されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、軽鎖ポリペプチドと、
配列番号39に示されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、第1の重鎖ポリペプチドと、
配列番号41に示されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、第2の重鎖ポリペプチドと
を含み、
前記抗体構築物がＨＥＲ2を呈する標的細胞に一価的に結合することができ、前記ポリペプチド配列のそれぞれがシグナルポリペプチド配列を含まない、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1084]
ＨＥＲ2に結合する単離された一価抗体構築物であって、
配列番号36に示される最終タンパク質生成物配列を含む、第1のポリペプチドと、
配列番号38に示される最終タンパク質生成物配列を含む、第2のポリペプチドと
を含み、
前記抗体構築物がＨＥＲ2を呈する標的細胞に一価的に結合することができ、前記最終タンパク質生成物配列のそれぞれがシグナルポリペプチド配列を含まない、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1085]
ＨＥＲ2に結合する単離された一価抗体構築物であって、
配列番号35に示されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、第1のポリペプチドと、
配列番号37に示されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、第2のポリペプチドと
を含み、
前記抗体構築物がＨＥＲ2を呈する標的細胞に一価的に結合することができ、前記ポリペプチド配列のそれぞれがシグナルポリペプチド配列を含まない、前記単離された一価抗体構築物。
[本発明1086]
前記一価抗体構築物が、2つのＨＥＲ2結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して増加した結合密度およびＢｍａｘで、ＨＥＲ2を呈する標的細胞に選択的および／または特異的に結合し、前記一価抗体構築物が、前記単一特異性二価抗体構築物に相当するか、またはそれを超えるオンターゲット細胞傷害性を示す、本発明1080〜1085のいずれかの単離された一価抗体構築物。
[本発明1087]
前記抗原結合ポリペプチド構築物が、配列番号14、配列番号44、または配列番号36に示される最終タンパク質生成物配列を含むポリペプチドを含み、前記最終タンパク質生成物配列がシグナルポリペプチド配列を含まない、本発明1020〜1022のいずれかの単離された一価ＨＥＲ2結合抗体構築物。
[本発明1088]
前記二量体Ｆｃポリペプチド構築物が、第1および第2の単量体Ｆｃポリペプチドを含み、前記第1の単量体Ｆｃポリペプチドが配列番号12、配列番号40、または配列番号36に示される最終タンパク質生成物配列を含み、前記第2の単量体Ｆｃポリペプチドが配列番号16、配列番号42、または配列番号38に示される最終タンパク質生成物配列を含み、前記最終タンパク質生成物配列のそれぞれがシグナルポリペプチド配列を含まない、本発明1020〜1022のいずれかの単離された一価ＨＥＲ2結合抗体構築物。
[本発明1089]
前記ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド構築物が、第1および第2の単量体Ｆｃポリペプチドを含み、前記第1の単量体Ｆｃポリペプチドが配列番号12、配列番号40、または配列番号36に示される最終タンパク質生成物配列を含み、前記第2の単量体Ｆｃポリペプチドが配列番号16、配列番号42、または配列番号38の最終タンパク質生成物配列を含み、前記最終タンパク質生成物配列のそれぞれがシグナルポリペプチド配列を含まない、本発明1015の単離された一価抗体構築物。
[本発明1090]
前記一価抗原結合ポリペプチド構築物が、配列番号36に示される最終タンパク質生成物配列を含むｓｃＦｖを含み、前記最終タンパク質生成物配列がシグナルポリペプチド配列を含まない、本発明1018の単離された一価抗体構築物。
添付の図面と併せて、本発明の具体的な実施形態の以下の説明を考察することで、本発明の他の態様および特徴が、当業者に明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0038】

本発明の実施形態を例示する図面において、

【図1】抗体Ｆｃ依存性細胞傷害、すなわち、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の図解を示す。

【図2】抗原に結合する一価および二価抗体を示す。図２Ａは１：１の化学量で抗原に結合する本明細書に記載の一価抗体構築物を示す。図２Ｂは１：２の化学量で抗原に結合する二価抗体構築物を示す。本明細書に記載のように、一価抗体構築物は１細胞当たり、より高い抗体濃度／装飾をもたらし、ならびにＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰによる、より大きなＦｃ媒介性細胞死滅をもたらす。

【図3】ＳＫＯＶ３細胞に結合する例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す：Ａ．非線形適合結合曲線（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ ｆｉｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）；Ｂ．対数変換曲線。

【図4】異なる密度において、ＨＥＲ２を発現する細胞に結合する例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す：Ａ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞；Ｂ．ＳＫＯＶ３細胞；Ｃ．ＳＫＢＲ３細胞。

【図5】二価のフルサイズ抗体（ＦＳＡ）と比較して強化されたＡＤＣＣを媒介する例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す。

【図6】二価のフルサイズ抗体（ＦＳＡ）と比較して強化されたＣＤＣを媒介する例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す。

【図7】二価のフルサイズ抗体（ＦＳＡ）と比較して強化されたＣＤＣを媒介する例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す：Ａ．およびＢ．は、それぞれ２つのＰＢＭＣ供与体を用いた実験を表す。Ｃ．は、１供与体当たりで示されるＣＤ１６＋細胞のパーセントを用いた、ＯＡ２−Ｆａｂ−ＨＥＲ２および４つのＰＢＭＣ供与体による２つの別々の実験の要約。データは、ＷＴ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎの最大溶解度に対して正規化され、ＯＡ２−Ｆａｂ−ＨＥＲ２対ＷＴ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎの最大溶解度において倍数の差が存在する。

【図8-1】プロテインＡ精製後の例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の収率および純度の分析を示す。Ａ．精製された一価抗ＨＥＲ２抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。

【図8-2】Ｂ．ＯＡ１−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＬＣＭＳ分析；Ｃ．ＯＡ２−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＬＣＭＳ分析；Ｄ．約０．８％の２本の軽鎖＋１本の短い重鎖（７２，８９８ Ｄａ）、約０．７％の短い重鎖単体（２５，９０７ Ｄａ）で低質量ペプチドを示すＯＡ２−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＬＣＭＳスペクトルの拡大図。

【図9】インターナライズされる一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す。Ａ．インターナリゼーションの割合（％）としてプロットされた結果；Ｂ．対照に対する効果（％）としてプロットされた結果。

【図10】ＳＫＢＲ３細胞の成長を阻害する一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す。

【図11】ＦｃＲｎ受容体に結合する一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す。

【図12】ＳＫＯＶ３細胞に結合する別の例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す。

【図13-1】ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：３）；Ｂ．鎖Ａのアミノ酸配列（配列番号：４）。

【図13-2】ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ｃ．鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：５）；Ｄ．鎖Ｂのアミノ酸配列（配列番号：６）。

【図14-1】ＯＡ３−ｓｃＦｖ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：７）；Ｂ．鎖Ａのアミノ酸配列（配列番号：８）。

【図14-2】ＯＡ３−ｓｃＦｖ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ｃ．鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：９）；Ｄ．鎖Ｂのアミノ酸配列（配列番号：１０）。

【図15-1】ＯＡ１−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．重鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：１１）；Ｂ．重鎖Ａのアミノ酸配列（配列番号：１２）；Ｃ．軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：１３）。

【図15-2】ＯＡ１−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ｄ．軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：１４）；Ｅ．重鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：１５）；Ｆ．重鎖Ｂのアミノ酸配列（配列番号：１６）。

【図16-1】ＯＡ２−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．重鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：１７）；Ｂ．重鎖Ａのアミノ酸配列（配列番号：１８）；Ｃ．軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：１９）。

【図16-2】ＯＡ２−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ｄ．軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：２０）；Ｅ．重鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：２１）；Ｆ．重鎖Ｂのアミノ酸配列（配列番号：２２）。

【図17-1】ｗｔ ＦＳＡ ＨｃｐｔｎのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．重鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：２３）；Ｂ．重鎖Ａのアミノ酸配列（配列番号：２４）。

【図17-2】ｗｔ ＦＳＡ ＨｃｐｔｎのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ｃ．軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：２５）；Ｄ．軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：２６）。

【図18-1】ＦＳＡ−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．重鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：２７）；Ｂ．重鎖Ａのアミノ酸配列（配列番号：２８）；Ｃ．軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：２９）。

【図18-2】ＦＳＡ−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ｄ．軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：３０）；Ｅ．重鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：３１）；Ｆ．重鎖Ｂのアミノ酸配列（配列番号：３２）。

【図19】ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．鎖Ａおよび鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：３３）；Ｂ．鎖Ａおよび鎖Ｂのアミノ酸配列（配列番号：３４）。

【図20-1】ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：３５）；Ｂ．鎖Ａのアミノ酸配列（配列番号：３６）。

【図20-2】ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。Ｃ．鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：３７）；Ｄ．鎖Ｂのアミノ酸配列（配列番号：３８）。

【図21A】異なる細胞株においてＡＤＣＣを媒介する例示的な一価抗体構築物の能力を示す。図２１Ａは、ＭＣＦ７細胞における結果を示す。

【図21B】異なる細胞株においてＡＤＣＣを媒介する例示的な一価抗体構築物の能力を示す。図２１Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における結果を示す。

【図21C】異なる細胞株においてＡＤＣＣを媒介する例示的な一価抗体構築物の能力を示す。図２１Ｃは、ＭＣＦ７細胞における結果を示す。

【図21D】異なる細胞株においてＡＤＣＣを媒介する例示的な一価抗体構築物の能力を示す。図２１Ｄは、ＭＣＦ７細胞における結果を示す。

【図21E】異なる細胞株においてＡＤＣＣを媒介する例示的な一価抗体構築物の能力を示す。図２１Ｅは、ＭＣＦ７細胞における結果を示す。

【図22】マウスにおける例示的な一価抗体構築物の薬物動態プロファイルを示す。

【図23】シグナル伝達分子のリン酸化における例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）を用いたＳＫＢＲ３細胞の治療の効果を示す。パネルＡは、ＥｒｂＢ２のリン酸化における効果を示し、一方パネルＢは、ＭＡＰＫおよびＡＫＴのリン酸化における効果を示す。

【図24】１５分（パネルＡ）および３０分（パネルＢ）時点でＥＬＩＳＡによって測定されるＡｋｔのリン酸化の度合いの定量的評価を示す。

【図25A】ＪＩＭＴ−１細胞（パネルＡ）に結合する、本発明による例示的な一価抗体構築物の能力を示す。

【図25B】ＢＴ４７４細胞（パネルＢ）に結合する、本発明による例示的な一価抗体構築物の能力を示す。

【図25C】ＭＣＦ−７細胞（パネルＣ）に結合する、本発明による例示的な一価抗体構築物の能力を示す。

【図26】ＢＴ−４７４細胞（パネルＡ、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２ ＯＡ２−Ｆａｂ−ＨＥＲ２；パネルＢ、ＯＡ５−Ｆａｂ−ＨＥＲ２、ＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）の成長を阻害する例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を示す。

【図27】ＢＴ−４７４細胞（パネルＡ）またはＪＩＭＴ−１細胞（パネルＢ）中でインターナライズする例示的な一価抗体構築物ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（２００ｎＭにおける）の能力を示す。

【図28】ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞に結合する例示的な一価抗体構築物の能力を示す。

【図29】ＢＴ４７４細胞を死滅させる例示的な一価抗体構築物−抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の能力を示す。

【図30A】構築物の純度を示す。図３０Ａは、プロテインＡ精製後の例示的な一価抗体構築物ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の純度を示す。

【図30B】構築物の純度を示す。図３０Ｂは、ＬＣ／ＭＳによるヘテロ二量体純度分析を示し、これはＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の両方が、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィー後に９９％を超える純度に精製され得ることを示す。

【図31-1】ＯＡ５−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３１Ａは鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：３９）。

【図31-2】ＯＡ５−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３１Ｂは、鎖Ａのアミノ酸配列（配列番号：４０）。

【図31-3】ＯＡ５−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３１Ｃおよび図３１Ｄは、それぞれ鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：４１）およびアミノ酸配列（配列番号：４２）。

【図31-4】ＯＡ５−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３１Ｅおよび図３１Ｆは、それぞれ軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：４３）およびアミノ酸配列（配列番号：４４）。

【図32-1】ＯＡ６−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３２Ａおよび図３２Ｂは、それぞれ鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：４５）およびアミノ酸配列（配列番号：４６）。

【図32-2】ＯＡ６−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３２Ｃは、鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：４７）。

【図32-3】ＯＡ６−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３２Ｄは、鎖Ｂのアミノ酸配列（配列番号：４８）。

【図32-4】ＯＡ６−Ｆａｂ−ＨＥＲ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３２Ｅおよび図３２Ｆは、それぞれ軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：４９）およびアミノ酸配列（配列番号：５０）。

【図33-1】ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３３Ａは、鎖ＡのＤＮＡ配列（配列番号：５１）。

【図33-2】ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３３Ｂは、鎖Ａのアミノ酸配列（配列番号：５２）。

【図33-3】ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３３Ｃは、鎖ＢのＤＮＡ配列（配列番号：５３）。

【図33-4】ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３３Ｄは、鎖Ｂのアミノ酸配列（配列番号：５４）。

【図33-5】ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図３３Ｅおよび図３３Ｆは、それぞれ軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：５５）およびアミノ酸配列（配列番号：５６）。

【発明を実施するための形態】

【0039】

抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、１つのその単量体Ｆｃポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む一価抗体構築物が本明細書に提供され、その一価抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して、その抗原を提示する標的細胞に対する結合密度およびＢ_ｍａｘの増加を示し、その一価抗体構築物は、対応する二価抗体構築物と比較して優れた効果および／または生物活性を示し、その優れた効果および／または生物活性は、結合密度の増加の結果であり、標的細胞の装飾の増加をもたらす。ここで挙げられる一価抗体構築物によるＢ_ｍａｘまたは結合密度の増加および標的の装飾の結果として生じる増加は、特異的標的結合の作用であり、非特異的結合によるものではない。ある特定の実施形態において、最大の結合は、１：１の標的対抗体比において生じる。

【0040】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される一価抗体構築物は、以下の特質の少なくとも１つ以上を持つ：対応する単一特異性二価抗体構築物（ＦＳＡ）と比較して増加したＢ_ｍａｘ；対応するＦＳＡに相当するＫ_ｄ；対応するＦＳＡと比較して同等またはより遅いオフ速度；減少したまたは部分的なアゴニズム；標的の架橋および二量体形成がない；対象の標的細胞に特異的および／または選択的である；完全な、または部分的な標的細胞成長の阻害、または標的細胞成長の阻害が無い；エフェクター活性を誘発することができる完全Ｆｃ；ならびに標的細胞によってインターナライズされる能力。

【0041】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される一価抗体構築物は、以下の最低限の特質を持つ：対応するＦＳＡと比較して増加したＢ_ｍａｘ；対応するＦＳＡに相当するＫ_ｄ；対応するＦＳＡと比較して同等またはより遅いオフ速度；減少したまたは部分的なアゴニズム；標的の架橋および二量体形成がない；対象の標的細胞に特異的および／または選択的である；完全な、または部分的な標的細胞成長の阻害、または標的細胞成長の阻害が無い；エフェクター活性を誘発することができる完全Ｆｃ；ならびに標的細胞によってインターナライズされる任意の能力。

【0042】

その構築物が、一価溶解性抗体、一価インターナライズ抗体、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つである、一価抗体構築物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、抗体構築物は、以下の効果要因を示すこれらの抗体のバランスに依存する一価溶解性抗体および／または一価インターナライズ抗体である：ａ）インターナライズされる一価抗体構築物の能力、ｂ）一価抗体構築物の増加したＢ_ｍａｘおよびＫｄ／オン−オフ速度、ならびにｃ）一価抗体構築物のアゴニズム／部分的アゴニズムの程度。

【0043】

抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、二量体Ｆｃ領域と、を含む一価抗体構築物を標的細胞に提供する段階を含む、少なくとも１つの標的細胞において抗体濃度を増加させる方法が本明細書に提供され、その一価抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応する二価抗体構築物と比較して、その抗原を提示する標的細胞に対する結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その一価抗体構築物は、対応する二価抗体構築物と比較してより良い治療効果を示し、ならびにその効果は、抗原の架橋、抗原二量体形成、抗原調節の阻止、または抗原活性化の阻止によって生じるものではない。反対に、これらが最終的な死滅効果を克服しない限り、効果が抗原調節または抗原活性化によって生じ得るということは事実である。

【0044】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その抗体構築物は、アビディティーを示さない。

【0045】

一価溶解性（Ｍｖ−Ｌ）抗体
その構築物がＦＳＡと比較して増加したＢ_ｍａｘおよび同等か、またはより遅いオフ速度を持つ（このため、ＭＶ−Ｌおよび抗体依存性細胞傷害を用いて標的細胞のより高度な装飾をもたらす）、本明細書に記載の一価抗体構築物が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＭＶ−Ｌ抗体構築物は、ＦＳＡと比較して増加したＢ_ｍａｘならびに速いオンおよび遅いオフ速度で、標的細胞に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＭＶ−Ｌ抗体構築物は、同族リガンドの標的抗原への結合を遮断する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＭＶ−Ｌ抗体構築物は、インターナリゼーションを示さず、それにより細胞上の抗体の最大装飾および経路の機能遮断をもたらす。

【0046】

ある特定の実施形態において、ＭＶ−Ｌ抗体構築物は、１）ＦＳＡと比較して増加したＢ_ｍａｘおよび速いオンおよび同等か、もしくはより遅いオフ速度で標的細胞に結合し、飽和する、２）非アゴニストである、３）細胞成長を阻害する、４）同族リガンドの標的抗原への結合を遮断する、５）インターナリゼーションを示さない、ならびに、６）エフェクター活性に関与するＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態において、ＭＶ−Ｌ抗体構築物は、標的細胞表面を最大限に装飾し、細胞生存および成長をもたらし得る対抗活性を生じることなく、標的抗原による標的細胞の活性化を遮断する。

【0047】

１つの実施形態において、本発明による一価溶解性抗体構築物は、１）単一特異性二価抗体構築物と比較して、増加したＢ_ｍａｘで標的細胞に結合し、速いオン速度および同等か、または遅いオフ速度を有する、２）非アゴニストである、３）細胞成長を阻害する、４）同族リガンドの標的抗原への結合を遮断する、５）最低限のインターナリゼーションを示す、ならびに、６）Ｆｃ受容体およびその補体系と相互作用し、免疫系に会合するＦｃドメインを含む。

【0048】

ある特定の実施形態において、ＭＶ−Ｌ抗体構築物は、ＦｃγＲ受容体および補体タンパク質に結合することができ、高い細胞表面濃度において、抗体依存性細胞傷害を誘発するのにより効果的である。ある特定の実施形態においては、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣ等のＦｃエフェクター機能を通して標的細胞を死滅させるのに有用なＭＶ−Ｌ抗体構築物がある。

【0049】

１つの実施形態において、ＭＶ−Ｌ抗体構築物は、ＦＳＡによって実現される会合に対する立体的な違いの結果として、エフェクター系と優先的に会合することができる。ある特定の実施形態において、ＭＶ−Ｌは、アゴニズムを示さずに標的抗原に結合するリガンドを実質的に遮断するが、ＦＳＡと比較して増加したＢｍａｘおよび速いオン速度に加えて同等か、または遅いオフ速度は、ＦＳＡよりも未だ優れた効果的な最終効果をもたらすために、リガンドの部分的な遮断、ある程度のアゴニズムおよび細胞成長、ならびにインターナリゼーション克服することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＭＶ−Ｌ抗体構築物は、ＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態において、抗体構築物は、少なくとも１つのＨＥＲ２細胞外ドメインに結合する。ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、およびＥＣＤ４のうちの少なくとも１つである。ある特定の実施形態において、ＨＥＲ２結合ＭＶ−Ｌは、本明細書に提供されるＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（４１８２）またはＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（１０４０）である。

【0050】

ある特定の実施形態において、一価溶解性抗体構築物（ＭＶ−Ｌ）を用いる疾患細胞の増加した装飾は、単一特異性二価抗体構築物（ＦＳＡ）よりも効果的にＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＡＤＣＰを介して標的細胞の喪失をもたらす。

【0051】

一価インターナライジング（ＭＶ−Ｉｎｔ）抗体
抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む、一価抗体構築物が本明細書に提供され、その一価抗体構築物は、一価インターナライジング（ＭＶ−Ｉｎｔ）抗体構築物である。ある特定の実施形態において、増加したＢ_ｍａｘおよびインターナリゼーションの度合いは、ＭＶ−Ｉｎｔカテゴリー内で一価抗体構築物を分類するための重要な要素である。ある特定の実施形態において、ＭＶ−Ｉｎｔ抗体構築物は、ＦＳＡと比較して増加したＢ_ｍａｘおよび速いオン速度に加えて同等か、または遅いオフ速度で標的細胞と結合する。いくつかの実施形態において、Ｍｖ−Ｉｎｔは、標的細胞のより高度な装飾、同族リガンドの標的抗原への結合および効果的なインターナライジングの遮断、ならびに任意の細胞成長の阻害もしくは無誘導のうちの少なくとも１つを引き起こす。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＭＶ−Ｌ抗体は、ＨＥＲ２に結合する。ある特定の実施形態において、ＨＥＲ２結合ＭＶ−Ｉｎｔは、本明細書に提供されるＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（４１８２）またはＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（１０４０）である。

【0052】

ある特定の実施形態において、ＭＶ−ＬおよびＦＳＡと比較して高いＢｍａｘおよび高いインターナリゼーションを有し、それによりＭＶ−Ｉｎｔのより高い細胞内濃度をもたらすＭＶ−Ｉｎｔ構築物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＭＶ−Ｌ抗体は、ＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態において、抗体構築物は、少なくとも１つのＨＥＲ２細胞外ドメインに結合する。ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、およびＥＣＤ４のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、ＭＶ−Ｌ抗体は、ＨＥＲ２細胞外ドメインの二量体形成を阻害する。いくつかの実施形態において、抗体構築物は、少なくとも１つのＨＥＲ２細胞外ドメインに結合する。ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、およびＥＣＤ４のうちの少なくとも１つである。

【0053】

いくつかの実施形態において、ＭＶ−Ｉｎｔ抗体は、任意に細胞内へのペイロードを用いて本明細書に記載の抗体構築物を往復するためにトロイ（Ｔｒｏｊａｎ）として使用することにより、受容体を部分的に活性化することができる。そのようなＭＶ−Ｉｎｔ抗体は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の調製における使用に適しており、毒性薬物の標的細胞への送達が望まれる治療の適応において使用され得る。この様式において、急性細胞死をもたらすより高い毒性ペイロードの送達は、ＭＶ−Ｉｎｔ中で与えられる一部のアゴニスト活性を克服することになる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＭＶ−Ｉｎｔ抗体は、ＨＥＲ２に結合する。ある特定の実施形態においては、ＨＥＲ２結合一価抗体構築物であり、それはＭＶ−ＬおよびＭＶ−Ｉｎｔの両方である。事例として、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（１０４０）-ｖ１０４０は、ＭＶ−ＬおよびＭＶ−Ｉｎｔに対する十分な性質を示す。

【0054】

１つの実施形態において、ＭＶ−Ｉｎｔにより実現する、ＦＳＡと比べてより高度な装飾およびＢｍａｘは、インターナリゼーションのレベルにおける差を代償し得る。

【0055】

１つの実施形態において、Ｍｖ−Ｉｎｔ抗体構築物は、１）ＦＳＡと比較して増加したＢ_ｍａｘおよび速いオン速度に加えて同等か、または遅いオフ速度で標的細胞に結合する（このため、ＭＶ−Ｉｎｔを用いた標的細胞のより高度な装飾をもたらす）、２）同族リガンドの標的抗原への結合を遮断する、３）非アゴニストである、４）細胞成長を誘発しない、ならびに、５）単一特異性二価抗体構築物よりも大きい程度で効果的にインターナライズされる。別の実施形態において、一価インターナライズ抗体構築物は、１）ＦＳＡと比較して増加したＢ_ｍａｘおよび速いオン速度に加えて遅いオフ速度で標的細胞に結合する（このため、ＭＶ−Ｉｎｔを用いた標的細胞のより高度な装飾をもたらす）、２）同族リガンドの標的抗原への結合を遮断する、３）部分的にアゴニストである、４）細胞成長を誘発しない、ならびに、５）単一特異性二価抗体構築物よりも大きい程度で効果的にインターナライズされる。

【0056】

いくつかの実施形態において、免疫ＴおよびＢ細胞ならびに疾患細胞および薬物耐性疾患細胞によって増加した一価インターナライズ抗体構築物（ＭＶ−Ｉｎｔ）の装飾およびインターナリゼーションは、ＦＳＡよりも効果的にＡＤＣを介して標的細胞の喪失をもたらす。１つの実施形態において、薬物分子と結合している一価インターナライズ抗体構築物（ＭＶ−Ｉｎｔ）は、薬物不応性および耐性の患者、ならびに第一選択治療に反応しない患者の治療において有用である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＭＶ−Ｉｎｔ抗体は、ＨＥＲ２に結合する。ある特定の実施形態においては、ＨＥＲ２結合一価抗体構築物であり、それはＭＶ−ＬおよびＭＶ−Ｉｎｔの両方である。例えば、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（１０４０）。

【0057】

一実施形態において、本明細書に記載の一価溶解性抗体構築物（ＭＶ−Ｌ）を用いたウイルス等の病原体の増加した装飾は、単一特異性二価抗体構築物（ＦＳＡ）よりも効果的に病原体の喪失をもたらす。例えばＨＩＶ等のウイルスは、防御中和抗体反応が一貫して上昇するウイルスと比べた際の顕著な特徴である低密度のエンベロープスパイクを有することによって、二価抗体および二価結合を逃れるように進化してきた。その結果が、高親和性結合および強力な中和を実現するために抗体により通常用いられるアビディティーの極小化であり、それによりウイルスが抗体を逃れることが可能となる。本明細書に記載の一価抗体構築物は、単一のエピトープに対して結合するため、埋伏していない。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、単独で、またはすべての別個のウイルスエピトープを覆うように組み合わせて使用され得る。

【0058】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載のＭＶ＿Ｌ抗体構築物は、直接の標的化および病原体のオプソニン作用を介する抗体媒介クリアランスのために使用され得る。ある特定の実施形態において、ＭＶ−ＬおよびＭｖ−Ｉｎｔ抗体は両方とも、病原体に感染した細胞の抗体依存性の欠失に適している。いくつかの実施形態において、ＭＶ−ＬおよびＭｖ−Ｉｎｔ抗体構築物は、ＨＩＶ感染Ｔ細胞を高度に装飾し、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、またはＡＤＣでの死滅による喪失のためにこれらの細胞を標識付ける。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、単独で、または他の一価抗体構築物と組み合わせて使用され得る。

【0059】

抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、１つのその単量体Ｆｃポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む、単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、その一価抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応するＦＳＡ構築物と比較して、その抗原を提示する標的細胞に対する結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その一価抗体構築物は、対応する二価抗体構築物と比較して優れた効果および／または生物活性を示し、ならびにその優れた効果および／または生物活性は結合密度の増加の結果である。

【0060】

本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が、ある特定の実施形態において提供され、観測される平衡定数（Ｋｄ）を超える濃度で、および抗体の飽和濃度で、単一特異性二価抗体と比べて、結合密度およびＢｍａｘの増加が観測される。いくつかの実施形態において、優れた効果および／または生物活性は、その対応する二価抗体構築物と比較して増加したＦｃγＲまたは補体（Ｃ１ｑ）結合ならびにより高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つの結果である。具体的な実施形態において、単離された一価抗体構築物は、抗増殖性であり、かつインターナライズされる。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、そのＦＳＡと比較したその結合密度およびＢｍａｘの増加は、標的細胞の抗原の密度に依存しない。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が提供され、その標的細胞は、癌細胞またはＨＥＲ２を発現する疾患細胞である。一実施形態において、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物は、アビディティーを示さない。

【0061】

定義
本発明は、特定のプロトコル；本明細書に記載の細胞株、構築物、および試薬に限定されず、それ自体が変化し得ることが理解される。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定するとは意図されず、それは添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることがまた理解される。

【0062】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法、装置、および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、装置、および材料がここに記載される。

【0063】

例えば、ここで説明された発明に関連して使用され得る刊行物に記載される構築物および手順といった、本明細書で言及されるすべての刊行物および特許は、説明および開示のあらゆる目的において参照することにより本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のその開示のために単に提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明者らが、先行の発明または任意の他の理由により、そのような開示に先行する権限がないことの承認であるとは解釈されない。

【0064】

「二量体」または「ヘテロ二量体」は、少なくとも第１の単量体ポリペプチドおよび第２の単量体ポリペプチドを含む分子である。ヘテロ二量体の場合、その単量体のうちの１つは、少なくとも１つのアミノ酸残基によって、他方の単量体と異なる。ある特定の実施形態において、二量体の会合は、表面領域の埋没によって行われる。いくつかの実施形態において、単量体ポリペプチドは、所望の二量体形成を支持する、および／または他の所望されない標本の形成を避けることによって二量体形成を行う静電相互作用および／または塩橋相互作用によって、互いに相互作用する。いくつかの実施形態において、単量体ポリペプチドは、所望の二量体形成を支持する、および／または他の会合の形成を避けることによって所望の二量体形成を行う疎水性相互作用によって、互いに相互作用する。ある特定の実施形態において、単量体ポリペプチドは、共有結合形成によって互いに相互作用する。ある特定の実施形態において、共有結合は、天然に存在するか、または導入される、所望の二量体形成を行うシステインの間で形成される。本明細書に記載のある特定の実施形態において、共有結合は、単量体間で形成されない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、所望の二量体形成を支持する、および／または他の所望されない実施形態の形成を避けることによって二量体形成を行うパッキング／サイズ相補性／ノブ−イントゥー−ホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）／隆起（ｐｒｏｔｒｕｂｅｒａｎｃｅ）−空洞タイプ相互作用によって互いに相互作用する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、二量体形成を行うカチオン−ｐｉ相互作用によって互いに相互作用する。ある特定の実施形態において、個々の単量体ポリペプチドは、溶液中で単離された単量体として存在することはできない。

【0065】

「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、Ｃ末端ポリペプチド配列は無傷抗体のパパイン消化から入手可能なものである。Ｆｃ領域は、ネイティブまたは異型のＦｃ配列を含み得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列は、およそＣｙｓ２２６位におけるアミノ酸残基から、またはおよそＰｒｏ２３０位からＦｃ配列のカルボキシル末端まで広がると通常定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、および任意にＣＨ４ドメインを含む。本明細書において「Ｆｃポリペプチド」は、ポリペプチドＦｃ領域を作り上げるポリペプチドのうちの１つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ等の任意の好適な免疫グロブリンから得ることができる。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列（一般に、そのＮ末端において）の部分またはすべてを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、機能的または野生型ヒンジ配列を含まない。

【0066】

「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応を指す。

【0067】

「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の同族の抗原と複合化する分子（例えば、抗体）への結合によって開始される。

【0068】

「抗体依存性細胞食作用」および「ＡＤＣＰ」は、単球またはマクロファージ媒介性食作用を介した標的細胞の破壊を指す。

【0069】

「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。例えば、あるＦｃＲは、ネイティブ配列ヒトＦｃＲであり得る。一般に、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、対立遺伝子の変異体およびあるいはこれらの受容体のスプライス形態も含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体は、主にそれらの細胞質ドメインにおいて一致しない類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。他のアイソタイプの免疫グロブリンもまた、ある特定のＦｃＲによって結合され得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ ｅｄ．，１９９９）を参照されたい）。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質のドメイン内に免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質のドメイン内に免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａeｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を再考察される）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において再考察される。将来的に同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。本用語はまた、母体ＩｇＧの胎児への転移の原因である新生児受容体ＦｃＲｎを含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）；およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。

【0070】

「障害」は、本発明の抗体または方法を用いる治療から利益を受けるであろう任意の状態である。これは、哺乳動物を問題となる障害にさせる病理学的状態のものを含む、慢性および急性障害または疾患が挙げられる。本明細書において治療される障害の非限定的な例には、悪性および良性腫瘍；非白血病およびリンパ系悪性腫瘍；神経細胞、膠細胞、星状細胞、視床下部および他の腺性、マクロファージ、上皮性、間質性、ならびに胞胚腔障害；ならびに炎症性、免疫性、および他の血管新生関連障害が挙げられる。

【0071】

「癌」および「癌性」という用語は、典型的に未制御の細胞成長／増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、または記述する。癌の例には、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例として、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮細胞腫、腹膜の癌、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫／神経膠腫（例えば、未分化星状細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、退形成乏突起神経膠腫、退形成乏突起膠星状細胞腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺細胞腫、腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞腫、ならびに種々のタイプの頭頸部癌が挙げられる。

【0072】

本明細書で使用される場合、「炎症性疾患（複数可）」または「炎症性障害（複数可）」という用語は、結合組織における炎症、またはそれらの組織の変性によって特徴付けられる状態を包含する。ある特定の実施形態において、炎症性疾患または障害は、アルツハイマー、強直性脊椎炎、変形性関節炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、および乾癬性関節炎が挙げられるが、これらに限定されない関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛症、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、腎炎、パーキンソン病、ならびに潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。

【0073】

本明細書で使用される場合、「治療」とは、治療される個体または細胞の自然経過を変化させるための臨床的処置を指し、予防のため、または臨床病理の経過中のいずれかで実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接または間接病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行の速度の減少、疾患状態の回復または緩和、ならびに寛解または改善された予後が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患または障害の進展を遅らせるために使用される。１つの実施形態において、本発明の抗体および方法は、腫瘍退縮に効果を及ぼす。１つの実施形態において、本発明の抗体および方法は、腫瘍／癌成長の阻害に効果を及ぼす。

【0074】

「実質的に精製された」という用語は、その天然に生じる環境すなわちネイティブ細胞において、あるいはある特定の実施形態において組換え生成されたヘテロ多量体の場合の宿主細胞において見られるような、タンパク質に通常付随するかまたは相互作用する成分を実質的もしくは本質的に含まない本明細書に記載の構築物またはその変異体を指し、実質的に細胞物質を含まず、混在タンパク質が（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満であるタンパク質の調製物を含む。ヘテロ多量体またはその変異体が宿主細胞によって組換え生成される場合、ある特定の実施形態におけるタンパク質は、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、もしくは約１％以下で存在する。ヘテロ多量体またはその変異体が宿主細胞によって組換え生成される場合、ある特定の実施形態におけるタンパク質は、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ以下で培養培地に存在する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法によって生成される「実質的に精製された」ヘテロ多量体は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動等の適切な方法によって判定されるように、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度水準、特異的に少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度水準、より特異的に、少なくとも約９０％の純度水準、少なくとも約９５％の純度水準、少なくとも約９９％以上の純度水準を有する。

【0075】

「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に用いられる方法、例えば、直接取込み、形質導入、ｆ交配、または当該技術分野で知られている組換え宿主細胞を作製するための他の方法にかかわらず、外来性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター、例えばプラスミドとして維持されてもよく、または代替として、宿主ゲノムに統合され得る。

【0076】

本明細書で使用される場合、「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」または「培地（ｍｅｄｉａ）」という用語は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳類宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核宿主細胞、大腸菌もしくはシュードモナス宿主細胞、および細胞含有物を含む任意の宿主細胞を支持し得るか、または含み得る、任意の培養培地、溶液、固体、半固体、または剛性支保を含む。このため、この用語は、そこで宿主細胞が成長した培地、例えば、増殖ステップの前または後のいずれかの培地を含む、その中にタンパク質が分泌された培地を包含し得る。この用語はまた、本明細書に記載のヘテロ多量体が細胞内で生成され、そのヘテロ多量体を放出するように宿主細胞が溶解されるか、または崩壊される場合等に、宿主細胞ライセートを含む緩衝剤または試薬を包含し得る。

【0077】

本明細書で使用される場合、「リフォールディング」とは、ポリペプチドを含むジスルフィド結合を不適切に折りたたまれた状態、または折りたたまれていない状態から、ネイティブまたはジスルフィド結合に対して適切な折りたたみ高次構造に形質転換する任意のプロセス、反応、または方法を述べる。

【0078】

本明細書で使用される場合、「コフォールディング（ｃｏｆｏｌｄｉｎｇ）」とは、具体的に、互いに相互作用し、折りたたまれていないか、または不適切に折りたたまれたポリペプチドの、ネイティブポリペプチドへのまたは適切に折りたたまれたポリペプチドへの形質転換をもたらす、少なくとも２つの単量体ポリペプチドを用いるリフォールディングプロセス、反応、または方法を指す。

【0079】

本明細書で使用される場合、「調節された血清半減期」という用語は、その未調節の形態と比べて、本明細書に記載の抗体構築物を含む抗原結合ポリペプチドの循環半減期における正または負の変化を意味する。血清半減期は、構築物の投与後の種々の時点における血液試料を採取して、各試料における分子の濃度を決定することによって測定される。血清中の濃度と時間との相互関係に基づいて血清半減期を計算することができる。血清半減期の増加は、少なくとも約２倍であることが望ましいが、それよりも少ない増加は、例えば、十分な投薬のレジメンを可能にするか、または毒性効果を回避する場合、有用であり得る。いくつかの実施形態において、増加は少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍である。

【0080】

本明細書で使用される場合、用語「調節された治療半減期」は、未調節の形態と比べて、本明細書に記載の一価抗体構築物を含む、治療的有効量の抗原結合ポリペプチドの半減期の正または負の変化を意味する。治療半減期は、投与後の種々の時点におけるその分子の薬物動態学的および／または薬力学的性質を測定することによって測定される。増加した治療半減期は、特定の有利な投薬レジメン、特定の有利な総用量を可能にするか、または望ましくない効果を回避することが望ましい。いくつかの実施形態において、治療半減期の増加は、効力の増加、その標的に対する修飾された分子の結合性の増加もしくは減少、プロテアーゼ等の酵素による分子の破壊の増加もしくは減少、または修飾されていない分子の作用の別のパラメーターもしくは機構の増加または減少、あるいは分子の受容体媒介性排除の増加もしくは減少に起因する。

【0081】

核酸またはタンパク質に対して適用される場合、「単離された」という用語は、核酸もしくはタンパク質が天然の状態において会合する細胞内の成分の少なくともいくつかを含まないか、または核酸もしくはタンパク質がインビボまたはインビトロの生成物の濃度を超えるレベルに濃縮されていることを示す。それは、均一な状態であってもよい。単離された物質は、乾燥または半乾燥状態のいずれかであってもよく、溶液（水溶液が挙げられるが、これらに限定されない）に溶解した状態であってもよい。それは、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含んでいる医薬組成物の成分であってもよい。純度および均一性は典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を用いて決定される。タンパク質が、調製物中の大部分を占める種である場合、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、この遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて実質的に一本のバンドを生じさせることを示す。特に、この用語は、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋であるか、少なくとも９０％純粋であるか、少なくとも９５％純粋であるか、少なくとも９９％純粋であるか、またはそれ以上純粋であることを意味していてもよい。

【0082】

「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそれらの一本鎖または二本鎖の形態のポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照の核酸と同様の結合性質を有し、かつ天然に生じるヌクレオチドと同じような方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有している核酸を包含する。別途具体的に限定されない限り、この用語はまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含むオリゴヌクレオチド類似体、アンチセンス技術に使用されるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミダート等）も指す。別途指示されない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に修飾された変異体（縮重コドンの置換体が挙げられるが、これらに限定されない）、相補的配列、および明確に示された配列も、暗に包含する。具体的には、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換された配列を作製することによって、縮重コドンの置換体が実現され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。

【0083】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書において交換可能に使用される。つまり、ポリペプチドに対する記述は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく適用され、その逆もまた同様である。これらの用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマーだけでなく、１個以上のアミノ酸残基が天然にコードされていないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書で使用される場合、これらの用語は、アミノ酸残基がペプチド共有結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖（全長のタンパク質が挙げられる）を包含する。

【0084】

「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸、および天然に生じないアミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされたアミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）、ならびにピロリジンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物、すなわち、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム等の炭素が水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している化合物を指す。このような類似体は、修飾されたＲ基を有しているか（ノルロイシン等）、または修飾されたペプチドの骨格を有しているが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸についての参照は、例えば、天然に生じるタンパク新生Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸（アミノ酸の変異体および誘導体等）；βアラニン、オルニチン等の天然に生じる非タンパク新生アミノ酸；およびアミノ酸の特徴であると当該技術分野において知られている性質を有する化学的に合成された化合物を含む。天然に生じないアミノ酸の例としては、αメチルアミノ酸（例えばαメチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、βヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、余分なメチレンを側鎖に有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、ならびに側鎖におけるカルボン酸の官能基がスルホン酸基と置換されたアミノ酸（例えばシステイン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。合成のネイティブでないアミノ酸、置換されたアミノ酸、または１個以上のＤ−アミノ酸を含む、非天然アミノ酸を本発明のタンパク質に組み込むことは、多くの異なる方法において有利であり得る。Ｄ−アミノ酸を含有するペプチド等は、Ｌ−アミノ酸を含有する対応物と比較して、インビトロまたはインビボにおける増加した安定性を示す。このため、Ｄ−アミノ酸を組み込むというペプチドの構築等は、細胞内でのより高い安定性が望まれるか、必要とされる場合、特に有用であり得る。より具体的には、このような性質が望ましいときに、Ｄ−ペプチド等は、内因性のペプチダーゼおよびプロテアーゼに対して耐性を示し、それにより分子のバイオアベイラビリティを改善し、インビボにおける寿命を延長する。さらに、Ｄ−ペプチド等は、Ｔヘルパー細胞への、主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩＩ拘束性の提示のために、効率良く処理されることができず、ゆえに、全生物において体液性免疫反応を誘導する可能性が低い。

【0085】

本明細書においてアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推薦する一般的に知られた３文字表記または１文字表記のどちらかによって示すことがある。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受け容れられている１文字コードによって示すことがある。

【0086】

「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異体」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸か、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのコドンは、すべてアミノ酸アラニンをコードしている。このため、コドンによってアラニンが特定されるすべての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンの何れかへコドンを変化させることができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列はまた、この核酸のすべての可能性のあるサイレント変異を表している。当業者は、機能的に同一の分子が得られるように、核酸における各コドンが修飾され得ることを理解するだろう（メチオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧ、およびトリプトファンに対する通常唯一のコドンであるＴＧＧは除く）。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列に潜在的に含まれる。

【0087】

アミノ酸配列に関しては、コードされた配列中の単一のアミノ酸または数％のアミノ酸を変更、付加、または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、そのような変更によってアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを当業者は理解するだろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的な置換表は当業者に既知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の、多型の変異体、種間のホモログ（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｓ）および対立遺伝子に加えられるものであり、それらを排除するものではない。

【0088】

機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的な置換表は当業者に既知である。以下の８群のそれぞれは、互いに保存的な置換となるアミノ酸を含んでいる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および［０１３９］８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照されたい。

【0089】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の配列またはサブ配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して測定されるか、または手動で整列させて目視によって検査して測定されるように、配列を比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大限に対応するように対比および整列させる場合に、アミノ酸残基またはヌクレオチドの割合が同じである場合、配列は「実質的に同一」である（すなわち、指定の領域にわたって約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性）。この定義はまた、試験配列の相補性にも言及する。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、あるいは７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、あるいは、指定されない場合は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列全体にわたって存在し得る。本発明のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でライブラリーをスクリーニングするステップと、このポリヌクレオチド配列を含有する全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するステップと、を含むプロセスによって、ヒト以外の種からのホモログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。このようなハイブリッド形成技術は、当業者によく知られている。

【0090】

配列比較に関しては、典型的に一方の配列を参照配列として、これを試験配列と比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列とをコンピューターに入力し、サブ配列の座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。プログラムのデフォルトのパラメーターを使用してもよく、代わりのパラメーターを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0091】

本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列が隣接する位置の同数の参照配列と比較され得る２０〜６００、一般的に約５０〜約２００、より一般的に約１００〜約１５０から成る群より選択される、いくつかの隣接する位置のいずれか１つの区分への参照を含む。比較のために配列を整列させる方法は、当業者に既知である。限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃのローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似探索手法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター実装（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動による整列、目視の検査（例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照のこと）によって、比較のための最適な整列が行われ得る。

【0092】

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの１例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにて利用可能である））から公的に利用可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列用の）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、１１の語長（Ｗ）、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、３の語長、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）の５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両鎖の比較をデフォルトとして使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的に「低複雑性」フィルタを使用することなく実施される。

【0093】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムから得られる類似性の尺度の１つは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間に偶然に一致が生じる確率の目安を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した場合の最小合計確率が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満であるとき、核酸は参照配列と類似しているとみなされる。

【0094】

「〜と選択的に（または特異的に）ハイブリッド形成する」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（全細胞、ライブラリーＤＮＡ、またはＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）に存在するときに、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、その配列に対してのみ分子が結合すること、二重鎖を形成すること、またはハイブリッド形成することを指す。

【0095】

「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」という語句は、当該技術分野において知られているような低イオン強度および高温の条件下における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸、あるいはそれらの組合せの配列のハイブリッド形成を指す。典型的に、ストリンジェントな条件下において、プローブは、核酸の複合混合物（全細胞、ライブラリーＤＮＡ、またはＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）中のその標的サブ配列とハイブリッド形成するが、この複合混合物中の他の配列とはハイブリッド形成しない。ストリンジェントな条件は配列に依存し、また、異なる環境においては異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリッド形成する。核酸のハイブリッド形成の広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，"Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ"（１９９３） に見られる。

【0096】

本明細書で使用される場合、「真核生物」という用語は、動物（哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等が挙げられるが、これらに限定されない）、繊毛虫類、植物（限定されないが、単子葉植物、双子葉植物、藻類等が挙げられるが、これらに限定されない）、菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等の系統学的なドメイン（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）の真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物を指す。

【0097】

本明細書で使用される場合、「原核生物」という用語は、原核の生物を指す。例えば、非真核の生物は、系統学的なドメインの真正細菌（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サーマス サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等が挙げられるがこれらに限定されない）、または系統学的なドメインの古細菌（メタノコッカス ジャナスキー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム サーモアウトトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）およびハロバクテリウム種（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ＮＲＣ−１等のハロバクテリウム属、アーケオグロブス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエロピラムペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）等が挙げられるが、これらに限定されない）に属し得る。

【0098】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、治療、観察、または実験の対象である動物を指し、いくつかの実施形態において哺乳動物であり、他の実施形態においてはヒトである。動物は、ペット（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット等）であり得る。

【0099】

本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、投与される一価抗体構築物の量であって、治療される疾患、状態、または障害の症状のうちの１つ以上をある程度軽減する量を指す。本明細書に記載の構築物を含有する組成物は、予防的、増強的、および／または治療的な治療のために投与され得る。

【0100】

「増強する」または「増強すること」という用語は、所望の効果を、効力または持続時間のいずれかに関して、増加または延長することを意味する。このため、薬物分子または治療薬の効果の増強に関して、「増強する」という用語は、系における治療薬の効果を、効力または持続時間のいずれかに関して増加または延長する能力を指す。本明細書で使用される場合、「増強に有効な量」は、所望の系における別の治療薬の効果を増強するのに十分な量を指す。患者に使用される場合に、この使用のための有効量は、疾患、障害、または状態の重症度および過程（ｃｏｕｒｓｅ）、薬歴、患者の健康状態および薬物に対する反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に左右される。

【0101】

本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、ポリペプチドの長さに対する変更、アミノ酸配列の長さに対する変更、ポリペプチドの化学構造に対する変更、ポリペプチドの翻訳同時修飾、またはポリペプチドの翻訳後修飾等の所与のポリペプチドに対してなされる任意の改変を指す。ポリペプチドについて議論されている「（修飾）」形態という用語は、任意に修飾されており、つまり、議論されているポリペプチドは修飾されていてもよく、または修飾されなくてもよい。

【0102】

「翻訳後修飾」という用語は、ポリペプチド鎖に組み込まれた後にそのアミノ酸に生じる、天然または非天然のアミノ酸の任意の修飾を指す。この用語は、ほんの一例として、インビボにおける翻訳同時修飾、インビトロにおける翻訳同時修飾（細胞外の翻訳系におけるもの等）、インビボにおける翻訳後修飾、およびインビトロにおける翻訳後修飾を包含する。

【0103】

本明細書で使用される場合、「単一特異性二価抗体構築物」という用語は、その両方が同じエピトープ／抗原に結合する（単一特異性である）２つの抗原結合ドメイン（二価）を有する抗体構築物を指す。抗原結合ドメインは、Ｆａｂ（フラグメント抗原結合）、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、およびｓｄａｂ（単一ドメイン抗体）等のタンパク質構築物であり得るが、これらに限定されない。単一特異性二価抗体構築物はまた、本明細書において、「フルサイズ抗体」または「ＦＳＡ」とも称される。単一特異性二価抗体構築物は、測定される一価抗体構築物の性質と比較する基準である。

【0104】

「アビディティー」という用語は、本明細書において、結合親和性と、治療用単一特異性二価抗体の主要構造および生物学的特質とを組み合わせた相乗強度を指すために使用される。アビディティーの欠如および結合の相乗強度の損失は、見かけの標的となる結合親和性の減少をもたらし得る。一方で、固定数の抗原を有する標的細胞上において、多価の（または二価の）結合からもたらされるアビディティーは、一価の結合を示す抗体と比べて小さい数の抗体分子で標的抗原の上昇した占有率を生じる。二価溶解性抗体の利用において、標的細胞に結合する少ない数の抗体分子を用いることで、抗体依存性の細胞傷害性死滅機序が効率的に生じず、減少した効果がもたらされることがある。ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰが一般に、Ｆｃ濃度閾値依存性と見なされるように、ＡＤＣＣを媒介するのに不十分な抗体が結合される。アゴニスト抗体の場合、アビディティーが減少すると、二量体化する抗原を架橋し、二量体化し、ならびにその経路を活性化するその効率が減少する。

【0105】

ラクダ科のＶｈＨドメイン等の「単一ドメイン抗体」または「Ｓｄａｂ」は、個々の免疫グロブリンドメインである。Ｓｄａｂｓは、かなり安定しており、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとして容易に発現する（Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＭ，Ｄｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（２００７）．"Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ"．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３−２２）。

【0106】

「ＨＥＲ受容体」は、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４受容体を含む。ＨＥＲ受容体は、一般に、ＨＥＲリガンドに結合し得る細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびリン酸化され得るいくつかのチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。

【0107】

ＨＥＲ２の細胞外（ｅｃｔｏ）ドメインは、ドメインＩ（ＥＣＤ１、約１〜１９５のアミノ酸残基）、ドメインＩＩ（ＥＣＤ２、約１９６〜３１９のアミノ酸残基）、ドメインＩＩＩ（ＥＣＤ３、約３２０〜４８８のアミノ酸残基）、およびドメインＩＶ（ＥＣＤ４、約４８９〜６３０のアミノ酸残基）の４つのドメインを含む（シグナルペプチドを伴わない残基番号）。Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１１：４９５−５０５（２００３）、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４２１：７５６−７６０（２００３）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７−３２８（２００４）、Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．２０１２ Ａｐｒ；３８（２）：１３３−４２（２０１２）、またはＰｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１７４６−１７５０（１９９３）を参照されたい。

【0108】

発現「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」は、本明細書において交換可能に使用され、例えば、Ｓｅｍｂａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：６４９７−６５０１（１９８５）およびＹａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２３０−２３４（１９８６）に記載されるヒトＨＥＲ２タンパク質を指す（遺伝子バンク受入番号Ｘ０３３６３）。「ｅｒｂＢ２」および「ｎｅｕ」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２タンパク質をコードする遺伝子を指す。ｐ１８５またはｐ１８５ｎｅｕは、ｎｅｕ遺伝子のタンパク質生成物を指す。好ましいＨＥＲ２は、ネイティブ配列ヒトＨＥＲ２である。

【0109】

「ＨＥＲリガンド」とは、ＨＥＲ受容体に結合するか、および／またはそれを活性化するポリペプチドを意味する。本明細書において特に対象となるＨＥＲリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：７６１２−７６２１（１９７２））；トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１０７９−１０８２（１９８４））；ｓｃｈｗａｎｏｍａまたはケラチノサイト自己分泌型成長因子としても知られるアンフィレギュリン（Ｓｈｏｙａｂ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１０７４−１０７６（１９８９）；Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２５７−２６０（１９９０）；およびＣｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５４７−２５５７（１９９１））；ベータセルリン（Ｓｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６０４−１６０７（１９９３）；およびＳａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９０：１１７３（１９９３））；ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：９３６−９３９（１９９１））；エピレギュリン（Ｔｏｙｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７４９５−７５００（１９９５）；およびＫｏｍｕｒａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：２８４１−２８４８（１９９７））；ヘレグリン（以下を参照されたい）；ニューレグリン２（ＮＲＧ−２）（Ｃａｒｒａｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７：５１２−５１６（１９９７））；ニューレグリン３（ＮＲＧ−３）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：９５６２−９５６７（１９９７））；ニューレグリン４（ＮＲＧ−４）（Ｈａｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２６８１−８９（１９９９））、またはｃｒｉｐｔｏ（ＣＲ−１）（Ｋａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３３３０−３３３５（１９９７））等のネイティブ配列ヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲに結合するＨＥＲリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、およびエピレギュリンが挙げられる。ＨＥＲ３に結合するＨＥＲリガンドには、ヘレグリンが挙げられる。ＨＥＲ４に結合することができるＨＥＲリガンドには、ベータセルリン、エピレギュリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、およびヘレグリンが挙げられる。

【0110】

本明細書で使用される場合、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、米国特許第５，６４１，８６９号またはＭａｒｃｈｉｏｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３１２−３１８（１９９３）に開示されるヘレグリン遺伝子生成物によってコードされるポリペプチドを指す。ヘレグリンの例には、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、およびヘレグリン−β３（Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５−１２１０（１９９２）；および米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Ｐｅｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６９：２０５−２１６（１９９２））；アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）（Ｆａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ７２：８０１−８１５（１９９３））；グリア成長因子（ＧＧＦ）（Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：３１２−３１８（１９９３））；感覚および運動神経由来因子（ＳＭＤＦ）（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４５２３−１４５３２（１９９５））；γ−へレグリン（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：１３８５−１３９４（１９９７））が挙げられる。この用語は、そのＥＧＦ様ドメインフラグメント等のネイティブ配列ＨＲＧポリペプチドの生物活性フラグメントおよび／またはアミノ酸配列変異体を含む（例えば、ＨＲＧβ１１７７−２４４）。

【0111】

「ＨＥＲ活性化」または「ＨＥＲ２活性化」は、ＨＥＲ受容体またはＨＥＲ２受容体のいずれか１つ以上の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化は、シグナル伝達をもたらす（例えば、ＨＥＲ受容体または基質ポリペプチド内のチロシン残基をリン酸化するＨＥＲ受容体の細胞内キナーゼドメインによって引き起こされるもの）。ＨＥＲ活性化は、対象とするＨＥＲ受容体を含むＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドによって媒介され得る。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体内のＨＥＲ受容体のうちの１つ以上のキナーゼドメインを活性化し、それによりＨＥＲ受容体のうちの１つ以上の中でチロシン残基のリン酸化を、および／またはＡｋｔまたはＭＡＰＫ細胞内キナーゼ等のさらなる基質ポリペプチド（複数可）内でチロシン残基のリン酸化をもたらし得る。

【0112】

抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節等が挙げられる。

【0113】

抗体の「Ｆａｂフラグメント」（フラグメント抗原結合とも称される）は、それぞれ軽鎖および重鎖上の可変ドメインＶＬおよびＶＨとともに、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、高頻度可変領域とも称される）を含む。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の追加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。

【0114】

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。１つの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖの抗原結合にとって所望の構造を形成できる、ＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖフラグメントは、国際公開第９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、および米国特許第５，５８７，４５８号に記載される。

【0115】

非ヒト（例えば、齧歯動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから得られる最小限の配列を含むキメラ抗体である。多くの部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種の高頻度可変領域由来の残基（ドナー抗体）によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練させるために行なうことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、このドメイン内では、高頻度可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応しており、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。

【0116】

ヒト化ＨＥＲ２抗体には、参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載のｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、またはトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；ヒト化５２０Ｃ９（国際公開第９３／２１３１９号）および米国特許公開第２００６／００１８８９９号に記載の２０'ヒト化２Ｃ４抗体が挙げられる。

【0117】

「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載のもの等の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。代替として、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評価するために、当該技術分野で知られている方法を使用してエピトープマッピングを行うことができ、および／またはＨＥＲ２のどのドメイン（複数可）が抗体によって結合されるかを理解するために、抗体ＨＥＲ２構造を研究（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７−３２８（２００４））することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩＩ由来の残基を含む。２Ｃ４およびペルツズマブはドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの結合部のＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７−３２８（２００４）。

【0118】

「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４６３）およびトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接しており、およびＨＥＲ２のドメインＩＶ内にある。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載のもの等の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。代替として、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープに結合するかどうかを評価するために、エピトープマッピングを行うことができる（例えば、米国特許公開第２００６／００１８８９９号の図１を含む、約残基５２９から約残基６２５までを含む領域における任意の１つ以上の残基）。

【0119】

「エピトープ７Ｃ２／Ｆ３」は、７Ｃ２および／または７Ｆ３抗体（各々ＡＴＣＣで沈着、以下を参照）が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内のＮ末端における領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載のもの等の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。代替として、抗体がＨＥＲ２上の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合するかどうかを証明するために、エピトープマッピングを行うことができる（例えば、ＨＥＲ２の約残基２２から約残基５３までの領域における残基のうちのいずれか１つ以上、米国特許公開第２００６／００１８８９９号の図１を参照されたい）。

【0120】

本明細書で使用される場合、「抗原調節」という用語は、ＡＤＣにおけるもの等のインターナリゼーションまたは下方制御）を介する表面受容体密度の改変または損失を指す。

【0121】

抗原結合ポリペプチド構築物
抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物は、既知の抗体もしくは抗原結合ドメインから生じ得るか、または新規の抗体もしくは抗原結合ドメインから生じ得る。一価抗体構築物のための抗原結合ポリペプチド構築物の同定は、標的細胞の選択および標的細胞の表面上に発現する抗原の選択に基づく。例えば、一旦標的細胞が選択されると、次いで抗原は、ａ）標的細胞の細胞表面上で発現されるが、他の細胞の表面上では発現されない、またはｂ）標的細胞の細胞表面上でより高いレベルで発現されるが、他の細胞の表面上ではより低いレベルで発現されるように選択される。これは、標的細胞の選択的標的化を可能にする。

【0122】

標的細胞の選択
標的細胞は、一価抗体構築物の使用用途に基づいて選択される。１つの実施形態において、標的細胞は、癌、感染性疾患、自己免疫性疾患において、または炎症性疾患において活性化されるか、または増幅される細胞である。

【0123】

１つの実施形態において、一価抗体構築物が癌の治療において使用されることが意図される場合、標的細胞は、ＨＥＲ２ ３＋過剰発現を示す腫瘍に由来する。１つの実施形態において、標的細胞は、ＨＥＲ２低発現を示す腫瘍に由来する。１つの実施形態において、標的細胞は、ＨＥＲ２耐性を示す腫瘍に由来する。１つの実施形態において、標的細胞は、トリプルネガティブ（ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２）腫瘍である腫瘍に由来する。

【0124】

一価抗体構築物が癌の治療において使用されることが意図される実施形態において、標的細胞は、ＨＥＲ２ ３＋過剰発現を代表する癌細胞株、例えば、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４である。１つの実施形態において、標的細胞は、ＨＥＲ２低発現を代表する癌細胞株、例えば、ＭＣＦ７である。１つの実施形態において、標的細胞は、ＨＥＲ２耐性を代表する癌細胞株、例えば、ＪＩＭＴ１である。１つの実施形態において、標的細胞は、乳癌トリプルネガティブを代表する癌細胞株、例えば、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞である。

【0125】

１つの実施形態において、本発明による一価抗体構築物は、乳癌細胞を標的化するように設計される。乳癌細胞の例示的なクラスには、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性およびエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性細胞、低ＨＥＲ２発現細胞、培地ＨＥＲ２発現細胞、高ＨＥＲ２発現細胞、または抗ＨＥＲ２抗体耐性細胞。

【0126】

１つの実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、胃および食道腺癌を標的化するように設計される。例示的な組織学的タイプには、腸管表現型を有するＨＥＲ２陽性近位胃癌腫ならびにＨＥＲ２陽性遠位瀰漫性胃癌腫が挙げられる。胃癌細胞の例示的なクラスには、（Ｎ−８７、ＯＥ−１９、ＳＮＵ−２１６、およびＭＫＮ−７）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0127】

別の実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、脳内の転移性ＨＥＲ２＋乳癌腫瘍を標的化するように設計される。胃癌細胞の例示的なクラスには、ＢＴ４７４（上記の乳癌に対して）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0128】

抗原の選択
上で示されるように、抗原結合ポリペプチド構築物が結合する抗原は、一価抗体構築物が結合することが意図される標的細胞に応じて選択される。１つの実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物が結合する抗原は、１）標的細胞の表面上で増加する発現、またはｂ）他の細胞の表面に比べて標的細胞の表面上での選択的発現、に基づいて選択される。したがって、１つの実施形態において、一価抗体構築物は、表Ａ１に示される標的細胞型のうちの１つを標的化するように設計される。

【0129】

（表Ａ１）抗体および代表的な標的細胞の一覧

【0130】

表Ａ１は、示された細胞型の標的化に使用され得る既知の抗体をさらに同定し、ひいては、所望の標的細胞上で発現される抗原も同定する。例えば、表Ａ１の「αＣＤ１６ａ」は、ＣＤ１６ａに対する抗体を使用して、ＮＫ細胞およびマクロファージを標的化できることを示す。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、表Ａ１に示される抗体のうちの１つの抗原結合ドメインから得られる抗原結合ポリペプチド構築物を含む。

【0131】

本発明による一価抗体構築物が乳癌細胞を標的化するように設計される実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、乳癌細胞の表面上で発現される抗原に一価的に結合する。好適な抗原には、ＨＥＲ２が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態においては、抗原結合ポリペプチド構築物が標的細胞上の標的抗原の細胞外ドメインに結合するエピトープ。

【0132】

一価抗体構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２に、またはＨＥＲ２の特定のドメインもしくはエピトープに結合する。１つの実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。当該技術分野で知られているように、ＨＥＲ２抗原は、複数の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。

【0133】

１つの実施形態においては、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、およびＥＣＤ４から選択されるＨＥＲ２のＥＣＤに結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む、本明細書に記載の一価抗体構築物である。別の実施形態において、一価抗体構築物は、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、およびＥＣＤ４から選択されるＨＥＲ２のＥＣＤに結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、ＥＣＤ１に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、ＥＣＤ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、ＥＣＤ４に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。別の実施形態において、一価抗体構築物は、２Ｃ４（例えば、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）、４Ｄ５（ＯＡ３−ｓｃＦｖ−Ｈｅｒ２）、およびＣ６．５（ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２）から選択されるＨＥＲ２のエピトープに結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。

【0134】

抗体の選択
一価抗体構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖｓ、およびｓｄａｂを含む種々の形式で、既知の抗ＨＥＲ２抗体または抗ＨＥＲ２結合ドメインから得ることができる。ある特定の実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、それらの抗体のヒト化またはキメラ型から得ることができる。１つの実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、またはそれらのヒト化型のＦａｂフラグメントから得られる。１つの実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖから得られる。そのような抗原結合ポリペプチド構築物の非限定的な例としては、一価抗体構築物ＯＡ３−ｓｃＦｖ−Ｈｅｒ２およびＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２中で見られるものが挙げられる。１つの実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｄａｂから得られる。

【0135】

二量体／ヘテロ二量体Ｆｃ構築物
本発明による一価抗体構築物は、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物を含む。本発明の１つの実施形態において、二量体Ｆｃポリペプチド構築物はヘテロ二量体であり、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する修飾された単量体Ｆｃポリペプチドを含む。１つの実施形態において、単量体Ｆｃポリペプチドは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進するアミノ酸修飾を有する変異型ＣＨ３ドメインを含む。好適な変異型ＣＨ３ドメインは、当該技術分野で既知であり、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１２／０５８７６８号、米国特許第５，８２１，３３３号、同第７，６９５，９３６号[ＫｉＨ]に記載されるものが挙げられる。１つの実施形態において、本発明によるヘテロ多量体は、その第１および第２のＦｃポリペプチドのうちの一方が、ＣＨ３アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ／Ｎ３９０Ｒ／Ｋ３９２Ｒ／Ｔ３９４Ｗを含み、他方のＦｃポリペプチドが、ＣＨ３アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ／Ｓ４００Ｅ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む、ＩｇＧ ＦｃＤ構築物を含む。

【0136】

ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ドメイン抗体等の一価構築物は当該技術分野で既知であるが、これらの一価構築物は、エフェクター活性に有効なＦｃドメインを欠いている。二量体化しない（ホモ二量体化もヘテロ二量体化もしない）Ｆｃの単鎖から成る一価抗原結合構築物もまた、文献［Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｆｃ Ｍｏｄａｌｉｔｙ ｂｙ Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｓｈｉｎｏ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｍ，Ｍｏｓｙａｋ Ｌ，Ｔａｍ Ａ，Ｄｕａｎ Ｗ，Ｓｖｅｎｓｏｎ Ｋ，Ｊｏｙｃｅ Ａ，Ｏ'Ｈａｒａ ＤＭ，Ｌｉｎ Ｌ，Ｓｏｍｅｒｓ ＷＳ，Ｋｒｉｚ Ｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３Ａｐｒ ２４．ＰＭＩＤ：２３６１５９１１］において既知であるが、本発明による構築物と異なり、これらの構築物もまた二量体Ｆｃドメインに依存する免疫エフェクター機能性を欠いている。

【0137】

ヘテロ二量体Ｆｃ形成を促進するために単量体Ｆｃポリペプチドを修飾するさらなる方法が、国際特許公開第ＷＯ９６／０２７０１１号（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）において、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７−４６，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）において、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｄａｖｉｓ，ＪＨ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ；２３（４）：１９５−２０２，ｓｔｒａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）において、ならびにＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ［Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ１ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｆａｂ−ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦ，Ｍｅｅｓｔｅｒｓ ＪＩ，ｄｅ Ｇｏｅｉｊ ＢＥ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｅｍｅｒ ＥＴ，Ｎｅｉｊｓｓｅｎ Ｊ，ｖａｎ Ｋａｍｐｅｎ ＭＤ，Ｓｔｒｕｍａｎｅ Ｋ，Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ Ｓ，Ｋｕｎｄｕ Ａ，Ｇｒａｍｅｒ ＭＪ，ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ＰＨ，ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ ＪＧ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ Ｊ，Ｐａｒｒｅｎ ＰＷ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｍａｒ ２６；１１０（１３）：５１４５−５０において、記載されている。

【0138】

いくつかの実施形態において、修飾単量体Ｆｃポリペプチドは、その融解温度によって決定されるヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド構築物の安定性を増加させるアミノ酸修飾をさらに含む。好適なアミノ酸修飾が当該技術分野で既知であり、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０号に記載されるものが挙げられる。特に、１つの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド構築物は、両方のペプチド内にアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを有する修飾単量体Ｆｃポリペプチドを含む。

【0139】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、本一価抗体構築物は、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、変異型ＣＨ３ドメインを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む。いくつかの実施形態において、変異型ＣＨ３ドメインは、ネイティブのホモ二量体Ｆｃ領域に相当する安定性を有するそのヘテロ二量体の形成を促進するアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態において、変異型ＣＨ３ドメインは、約７０℃以上の融解温度（Ｔ_ｍ）を有する。いくつかの実施形態において、変異型ＣＨ３ドメインは、約７５℃以上の融解温度（Ｔ_ｍ）を有する。選択された実施形態において、変異型ＣＨ３ドメインは、約８０℃以上の融解温度（Ｔ_ｍ）を有する。

【0140】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、本一価抗体構築物は、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、ＣＨ３ドメインを含みＦｃ構築物がそのＣＨ３ドメイン内に野生型Ｆｃ領域と比べて追加のジスルフィド結合を含まない、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む。ある特定の実施形態において、Ｆｃ構築物は、変異型ＣＨ３ドメイン内に野生型Ｆｃ領域と比べて追加のジスルフィド結合を含み、その変異型ＣＨ３ドメインは少なくとも約７７．５℃の融解温度（Ｔ_ｍ）を有する。具体的な実施形態において、二量体Ｆｃ構築物は、約７５％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である。いくつかの実施形態において、二量体Ｆｃ構築物は、約８０％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である。ある特定の実施形態において、二量体Ｆｃ構築物は、約９０％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である。いくつかの他の実施形態において、二量体Ｆｃ構築物は、約９５％を超える純度で形成されたヘテロ二量体Ｆｃ構築物である。

【0141】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、本一価抗体構築物は、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、優れた生物物理学的性質と同様の安定性を有し、Ｆｃポリペプチドに融合しない一価抗原結合ポリペプチドと比べて製造が容易である、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む。

【0142】

ＦｃＲｎ結合およびＰＫパラメーター
当該技術分野で知られているように、ＦｃＲｎへの結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから血流へ再利用する（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９−７６６）。このプロセス、完全長分子のサイズが大きいことによる腎臓濾過の除外と対になって、１〜３週間の範囲の好都合な抗体血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合はまた、抗体輸送において重要な役割を果たす。このように、１つの実施形態において、本発明の一価抗体構築物は、ＦｃＲｎに結合することができる。

【0143】

エフェクター機能を改善するためのさらなる修飾
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、本一価抗体構築物は、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、ＣＨ３ドメインを含み変異型ＣＨ２ドメインをさらに含む、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む。いくつかの実施形態において、変異型ＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲの選択的結合を促進する非対称なアミノ酸修飾を含んでいる。いくつかの実施形態において、変異型ＣＨ２ドメインは、本明細書に記載の単離された一価抗体の分離および精製を可能にする。

【0144】

いくつかの実施形態においては、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチドを含む、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その抗原結合ポリペプチドは、ポリペプチドを介してＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃポリペプチドに融合する。

【0145】

いくつかの実施形態においては、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチドを含む、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その抗原結合ポリペプチドはＦａｂであり、Ｆａｂの重鎖はポリペプチドを介してＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃポリペプチドに融合し、Ｆａｂの軽鎖はポリペプチドを介してＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドに融合する。

【0146】

いくつかの実施形態においては、抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチドを含む、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃポリペプチド、ならびにいずれの抗原にも結合することができない第２のポリペプチドに融合し、その第２のポリペプチドはＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドに融合し、２つの単量体Ｆｃポリペプチドは二量体を形成するように対になる。

【0147】

いくつかの実施形態において、本発明による一価抗体構築物は、そのエフェクター機能を改善するように修飾され得る。そのような修飾は当該技術分野で既知であり、アフコシル化、または活性化受容体、主にＡＤＣＣのＦＣＧＲ３ａに対する、およびＣＤＣのＣ１ｑに対する抗体のＦｃ部分の親和性の操作を含む。以下の表は、エフェクター機能操作に関する文献において報告される異なる設計を要約する。

【0148】

このようにして、１つの実施形態において、本一価抗体構築物は、改善されたエフェクター機能を与える、上記表に示される１つ以上のアミノ酸修飾を含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物を含むことができる。別の実施形態において、本一価抗体構築物は、エフェクター機能を改善するためにアフコシル化される。

【0149】

その同族の抗原に対する抗原結合ポリペプチド構築物の親和性を増加させることが望ましい事例において、当該技術分野で知られている方法を使用して、その抗原に対する抗原結合ポリペプチド構築物の親和性を増加させることができる。そのような方法の例は、以下の参照文献内に記載されている、Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＪＭＢ ３７７，１５１８−１５２８；Ｇｅｒｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）ＪＭＢ ３２１，８５１−８６２；Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２（２７），６８２８−６８３５；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＪＢＣ ２８５（６），３８６５−３８７１、およびＶａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＭＢ ３２０，４１５−４２８。

【0150】

そのような方法の１つの例は、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）である。ＨＥＲ２抗原結合ドメインの親和性成熟のための１つの例示的な方法は、以下に記載されている。トラスツズマブ／ＨＥＲ２（ＰＤＢコード１Ｎ８Ｚ）複合体およびペルツズマブ／ＨＥＲ２複合体（ＰＤＢコード１Ｓ７８）の構造をモデル化に使用する。分子動力学（ＭＤ）を用いて、水性環境におけるＷＴ複合体の内在性の動的性質を評価することができる。柔軟な骨格を用いて平均場およびデッドエンド排除（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）法を使用して、スクリーニングされる変異体のモデル構造を最適化および調製することができる。パッキングに続いて、接触密度、クラッシュスコア（ｃｌａｓｈ ｓｃｏｒｅ）、疎水性、および静電気を含む、いくつかの特徴が点数化される。一般化ボルン法によって、溶媒環境の効果の正確なモデル化が可能となり、残基型を交代させるタンパク質の特定の位置の変異に従って、その自由エネルギー差を算出する。接触密度およびクラッシュスコアは、有効なタンパク質パッキングの重要な側面である相補性の尺度を提供する。スクリーニング手順は、知識ベースのポテンシャル、ならびに対残基相互作用エネルギーおよびエントロピー計算に依存する結合分析スキームを用いる。ＨＥＲ２結合を強化することが知られている文献の変異およびそれらの組み合わせを以下の表に要約する。

【0151】

（表１Ｂ）トラスツズマブ−ＨＥＲ２系に対するＨＥＲ２への結合を増加することが知られているトラスツズマブ変異

【0152】

（表１Ｃ）ペルツズマブ−ＨＥＲ２系に対するＨＥＲ２への結合を増加することが知られているペルツズマブ変異

【0153】

本明細書に記載の一価抗体構築物は、一旦標的細胞に結合するとインターナライズされる。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して同程度にインターナライズされる。いくつかの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物と比較してより効率的にインターナライズされる。

【0154】

増加したＢｍａｘおよびＫＤ／オン−オフ速度
Ｂｍａｘは飽和抗体濃度で実現され、Ｋｄ（抗体のオンおよびオフ速度）は、Ｂｍａｘに寄与する。遅いオンおよび速いオフ速度を有する抗体は、結合の速いオンおよび遅いオフ速度を有する抗体と比較して、見かけのＢｍａｘが低くなる。本発明による一価抗体構築物に関しては、ＢｍａｘがＦＳＡでそれ以上増加されない飽和濃度において、ＦＳＡに対するＢｍａｘにおいて明らかな分離が生じる。この有意性は、不飽和濃度においてはあまりない。１つの実施形態において、単一特異性二価抗体構築物と比較して一価抗体構築物のＢｍａｘおよびＫＤ／オン−オフ速度の増加は、標的細胞上の標的抗原発現のレベルに左右されない。一価抗体構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む１つの実施形態において、単一特異性二価抗体構築物と比較して一価抗体構築物のＢｍａｘおよびＫＤ／オン−オフ速度の増加は、標的細胞上のＨＥＲ２発現のレベルに左右されない。

【0155】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その一価抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して、その抗原を提示する標的細胞に対する結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示す。いくつかの実施形態において、その結合密度およびＢｍａｘの増加は、対応する二価抗体構築物の結合密度およびＢｍａｘの少なくとも約１２５％である。ある特定の実施形態において、結合密度およびＢｍａｘの増加は、対応する二価抗体構築物の結合密度およびＢｍａｘの少なくとも約１５０％である。いくつかの実施形態において、結合密度およびＢｍａｘの増加は、対応する二価抗体構築物の結合密度およびＢｍａｘの少なくとも約２００％である。いくつかの実施形態において、結合密度およびＢｍａｘの増加は、対応する二価抗体構築物の結合密度およびＢｍａｘの少なくとも約１１０％を超える。

【0156】

端的に、アゴニズムは、生化学的／生物学的作用を誘起する細胞上のいくつかの受容体に対する固有の活性を有する薬剤の結合の結果である。アゴニストは、ＴＲＫ（チロシン受容体キナーゼ）を含む多くの細胞表面タンパク質ファミリーに対して同定されてきた。ＴＲＫに関して、アゴニスト結合は、下流シグナル伝達事象を誘起する受容体ヘテロ二量体形成を促進する。生物学的作用の範囲は、効果と呼ばれる。アゴニズムは、受容体リン酸化等の近位の近位生化学的マーカー、または細胞増殖等の遠位のバイオマーカーの両方によって評価され得る。ＭＶ−ＬまたはＭＶ−Ｉｎｔにおいて、抗体媒介性細胞傷害での死滅の作用機序によって克服される場合、ある程度のアゴニズムが許容され得る。ＭＶ−Ｉｎｔの場合、ある程度のアゴニズムは、インターナリゼーションの速度および範囲を増加させ、それによりＭＶ−Ｉｎｔ細胞内レベルおよび細胞を死滅させるための毒性ペイロードの送達が増加され得る。

【0157】

二価抗体による受容体の架橋および二量体形成は、標的受容体上の同族のアゴニスト作用を模倣する。架橋の効率は典型的に、効果に関連付けられる。ＭＶ−ＬおよびＭＶ−Ｉｎｔの場合、一価結合は、ＦＳＡのように受容体を架橋することはできなかった。しかしながら、データは、一価抗体が受容体リン酸化または細胞増殖に対する影響等のいくつかのアゴニスト作用を誘発することができることを示す。

【0158】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される一価抗体構築物は、二価抗体の一体型のアビディティーを欠いており、同じように２つの標的抗原を空間的に制限しない。

【0159】

優れた効果／生物活性
本明細書に示されるように、本明細書に記載の一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して優れた効果および／または生物活性を示す。本発明による一価抗体構築物の効果および／または生物活性の１つの非限定的な例は、標的細胞の成長を阻害する一価抗体構築物の能力に代表される。１つの実施形態において、一価抗体構築物の優れた効果および／または生物活性は、主として、単一特異性二価抗体構築物と比較して増加した一価抗体構築物のエフェクター機能の結果である。一価抗体構築物のこのタイプの例は、一価溶解性抗体（ＭＶ−Ｌ）に代表される。

【0160】

ＡＤＣＣ
増加したエフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣのうちの少なくとも１つを含む。このため、１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物よりも高いレベルのＡＤＣＣによる細胞死滅を示す。この実施形態によると、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物のＡＤＣＣ活性の約１．２〜１．６倍の活性増加を示す。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．３倍の増加を示す。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．４倍の増加を示す。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．５倍の増加を示す。

【0161】

１つの実施形態において、一価抗体構築物は、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含み、対応する単一特異性二価抗体構築物のＡＤＣＣ活性の約１．２〜１．６倍の活性増加を示す。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含み、対応する単一特異性二価抗体構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．３倍の増加を示す。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含み、対応する単一特異性二価抗体構築物よりもＡＤＣＣによる細胞死滅において約１．５倍の増加を示す。

【0162】

ＡＤＣＰ
１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物よりも高いレベルのＡＤＣＰによる細胞死滅を示す。

【0163】

ＣＤＣ
１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物よりも高いレベルのＣＤＣによる細胞死滅を示す。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含み、対応する単一特異性二価抗体構築物よりもＣＤＣによる細胞死滅において約１．５倍の増加を示す。

【0164】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その構築物は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約１２５％を有する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その構築物は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約１５０％を有する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その構築物は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約３００％を有する。

【0165】

ＦｃγＲへの増加した結合能
いくつかの実施形態において、一価抗体構築物は、１つ以上のＦｃγＲに対してより高い結合能（Ｒｍａｘ）を示す。一価抗体構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物を超える約１．３〜２倍の１つ以上のＦｃγＲに対するＲｍａｘの増加を示す。一価抗体構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物を超える約１．３〜１．８倍のＣＤ１６ ＦｃγＲに対するＲｍａｘの増加を示す。一価抗体構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物を超える約１．３〜１．８倍のＣＤ３２ ＦｃγＲに対するＲｍａｘの増加を示す。一価抗体構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む１つの実施形態において、一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物を超える約１．３〜１．８倍のＣＤ６４ ＦｃγＲに対するＲｍａｘの増加を示す。

【0166】

ＦｃγＲの増加した親和性
本明細書に提供される一価抗体構築物は、対応する二価抗体構築物と比較してＦｃγＲの予想外に増加した親和性を有する。装飾の結果として得られる増加したＦｃ濃度は、増加したＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ活性と一致している。

【0167】

いくつかの実施形態において、一価抗体構築物は、１つ以上のＦｃγＲの増加した親和性を示す。一価抗体構築物がＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む１つの実施形態において、一価抗体構築物は、少なくとも１つのＦｃγＲの増加した親和性を示す。この実施形態によると、一価抗体構築物は、ＣＤ３２の増加した親和性を示す。

【0168】

別の実施形態においては、本明細書に記載の一価抗体構築物であり、本一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して増加したインターナリゼーションを示し、それにより優れた効果および／または生物活性をもたらす。

【0169】

薬物動態パラメーター
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される一価抗体構築物は、市販の治療用抗体に相当する薬物動態（ＰＫ）特性を示す。１つの実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、血清濃度、ｔ１／２、β半減期、および／またはＣＬに関して、既知の治療用抗体と同様のＰＫ特性を示す。１つの実施形態において、一価抗体構築物は、その単一特異性二価抗体構築物に相当するか、またはそれを超えるインビボ安定性を示す。そのようなインビボ安定性パラメーターは、血清濃度、ｔ１／２、β半減期、および／またはＣ_Ｌを含む。

【0170】

１つの実施形態において、本明細書に提供される一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物と比較してより高い分布容積（Ｖｓｓ）を示す。抗体の分布容積は、血漿または血液の容積（Ｖｐ）、組織の容積（ＶＴ）、および組織対血漿分割（ｋＰ）に関連する。線形条件下において、ＩｇＧ抗体は、動物またはヒトにおける血管内投与に従って、まず血漿区画および血管外液中に分配される。いくつかの実施形態において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）による取込み等の能動輸送過程はまた、抗体生体内分布、中でも結合タンパク質に影響する。

【0171】

別の実施形態において、本発明による一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物と比較してより高い分布容積（Ｖｓｓ）を示し、同様の親和性でＦｃＲｎに結合する。

【0172】

ＨＥＲ２結合構築物
本明細書に記載の一価抗体構築物のいくつかの実施形態において、二量体Ｆｃポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体である。１つの実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、ＨＥＲ２を発現する細胞を標的化するように設計され、抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２に結合する。ＨＥＲ２は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーに属する癌原遺伝子であり、しばしば乳癌の対象において過剰発現される。ＨＥＲ２タンパク質はまた、ｎｅｕ遺伝子、ＥＧＦＲ２、ＣＤ３４０、ＥｒｂＢ２、およびｐ１８５の生成物ともされる。いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、低度、中程度、または高度ＨＥＲ２発現細胞である。一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２に結合し、標的細胞は低ＨＥＲ２発現細胞である。別の実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、二価ＨＥＲ２結合抗体に対する減少した結合性を有する低ＨＥＲ２発現細胞である。さらなる実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、トラスツズマブに対する減少した結合性を有する低ＨＥＲ２発現細胞である。一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２に結合し、標的細胞は癌細胞である。ある特定の実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２に結合し、標的細胞は乳癌細胞である。

【0173】

本明細書に記載の一価抗体構築物のいくつかの実施形態において、二量体Ｆｃポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体である。記載される一価抗体構築物のいくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、少なくとも１つのＨＥＲ２細胞外ドメインに結合する。ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、およびＥＣＤ４のうちの少なくとも１つである。ある特定の実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物は、低度、中程度、または高度ＨＥＲ２発現細胞である標的細胞によって発現されるＨＥＲ２に結合する。ある特定の実施形態において、ＨＥＲ２発現細胞は、二価ＨＥＲ２結合抗体への減少した結合性を示す。一実施形態において、抗原結合ポリペプチド構築物はＨＥＲ２に結合し、標的細胞は、エストロゲン受容体陰性細胞、プロゲステロン受容体陰性細胞、および二価ＨＥＲ２結合抗体に対する減少した結合性を有する抗ＨＥＲ２抗体耐性腫瘍細胞のうちの少なくとも１つである。

【0174】

本明細書に記載の一価抗体構築物のいくつかの実施形態において、二量体Ｆｃポリペプチド構築物は、ヘテロ二量体である。本明細書に記載の一価抗体構築物のある特定の実施形態において、一価抗原結合ポリペプチド構築物は、抗原に結合することができるＦａｂフラグメント、ｓｃＦｖおよびｓｄＡｂ、抗原結合ペプチド、またはタンパク質ドメインである。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物が提供され、一価抗原結合ポリペプチド構築物は、Ｆａｂフラグメント重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含む。

【0175】

ＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、１つのその単量体Ｆｃポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む、ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、その抗体構築物は、抗増殖性であり、かつ標的細胞によってインターナライズされ、その構築物は、ＨＥＲ２に結合する対応する二価抗体構築物と比較して標的細胞上で提示されるＨＥＲ２に対して結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その構築物は、その対応する二価ＨＥＲ２結合抗体構築物と比較してより高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。

【0176】

低ＨＥＲ２発現を有する標的細胞上のＨＥＲ２に結合する単離された一価抗体構築物がある特定の実施形態において提供され、本一価抗体構築物は、ＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、１つのその単量体Ｆｃポリペプチドが抗原結合ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含み、その抗体構築物は、抗増殖性であり、かつ標的細胞によってインターナライズされ、その構築物は、ＨＥＲ２に結合する対応する二価抗体構築物と比較して標的細胞上で提示されるＨＥＲ２に対して結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その構築物は、その対応する二価ＨＥＲ２結合抗体構築物と比較してより高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。ある特定の実施形態において、低ＨＥＲ２発現を有する標的細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、低ＨＥＲ２発現を有する標的細胞は、乳癌細胞である。

【0177】

ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、およびＥＣＤ３〜４のうちの少なくとも１つである細胞外ドメイン（ＥＣＤ）でＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、１つのその単量体Ｆｃポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む、ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、その抗体構築物は抗増殖性であり、かつ標的細胞によってインターナライズされ、その構築物は、ＨＥＲ２に結合する対応する二価抗体構築物と比較して、標的細胞上で提示されるＨＥＲ２ ＥＣＤ１、２、および３〜４のうちの少なくとも１つに対する結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その構築物は、その対応する二価ＨＥＲ３結合抗体構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。

【0178】

ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、およびＥＣＤ４のうちの少なくとも１つである細胞外ドメイン（ＥＣＤ）でＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、１つのその単量体Ｆｃポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む、ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、その抗体構築物は抗増殖性であり、かつ標的細胞によってインターナライズされ、その構築物は、ＨＥＲ２に結合する対応する二価抗体構築物と比較して、標的細胞上で提示されるＨＥＲ２ ＥＣＤ１、２、３、および４のうちの少なくとも１つに対する結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その構築物は、その対応する二価ＨＥＲ２結合抗体構築物と比較して、より高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。

【0179】

一実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その抗体構築物は、標的細胞増殖を阻害する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その一価ＨＥＲ２結合ポリペプチド構築物は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、またはポリペプチドのうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その構築物は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のより高い程度のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その構築物は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つの少なくとも約１０５％を有する。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の単離された一価抗体構築物であり、その構築物は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を持つ対応する二価抗体構築物のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのうちの少なくとも１つの約１１０％超を有する。

【0180】

抗体構築物の組換えおよび合成生成方法：
安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法がある特定の実施形態において提供され、本方法は、重鎖可変ドメインおよび第１のＦｃドメインポリペプチドを含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ配列；第２のＦｃドメインポリペプチドを含むその第２の重鎖ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第２のＤＮＡ配列；ならびに軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第３のＤＮＡ配列を用いて、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように少なくとも１つの安定した哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、その重鎖および軽鎖ポリペプチドがその少なくとも１つの安定した哺乳類細胞内で所望のグリコシル化一価非対称抗体として発現されるように少なくとも１つの哺乳類細胞内のその第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を翻訳する段階と、を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、本方法は、２つの細胞のそれぞれが異なる比率で重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを発現するように、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を異なる既定の比率で少なくとも２つの異なる細胞へトランスフェクトする段階を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、本方法は、その第１、第２、および第３のＤＮＡ配列を含むマルチシストロンベクターを少なくとも１つの哺乳類細胞へトランスフェクトする段階を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの哺乳類細胞は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２、およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそれらのサブクラスおよび変異体から成る群から選択される。

【0181】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、第１のＤＮＡ配列：第２のＤＮＡ配列：第３のＤＮＡ配列の既定の比率は、約１：１：１である。いくつかの実施形態において、第１のＤＮＡ配列：第２のＤＮＡ配列：第３のＤＮＡ配列のその既定の比率は、翻訳される第１の重鎖ポリペプチドの量が第２の重鎖ポリペプチドの量および軽鎖ポリペプチドの量にほぼ等しくなるようなものである。

【0182】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、その少なくとも１つの安定した哺乳類細胞の発現生成物は、単量体重鎖もしくは軽鎖ポリペプチド、または他の抗体と比較して、より大きい割合の所望のグリコシル化一価抗体を含む。

【0183】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、本方法は、所望のグリコシル化一価抗体を同定し、精製する段階を含む。いくつかの実施形態において、その同定は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の１つまたは両方によるものである。

【0184】

重鎖可変ドメインおよび第１のＦｃドメインポリペプチドを含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ配列；第２のＦｃドメインポリペプチドを含む第２の重鎖ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている第２のＤＮＡ配列；ならびに軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第３のＤＮＡ配列を用いて、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように少なくとも１つの安定した哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、その重鎖および軽鎖ポリペプチドがその少なくとも１つの安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体として発現されるように、少なくとも１つの哺乳類細胞内のその第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を翻訳する段階と、を含み、そのグリコシル化一価非対称抗体は、対応する野生型抗体と比較してより高いＡＤＣＣ、ＣＤＣ、およびＡＤＣＰのうちの少なくとも１つを有する、改善されたＡＤＣＣを持つ抗体構築物を生成する方法が本明細書に提供される。

【0185】

ある特定の実施形態においては、酵母、細菌等の微生物、またはヒトもしくは動物細胞株からの分泌物によって組換え分子として生成される抗体構築物がある。実施形態において、ポリペプチドは、宿主細胞から分泌される。

【0186】

実施形態は、本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質を発現するように形質転換された酵母細胞等の細胞を含む。形質転換された宿主細胞自体に加えて、これらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に同種）培養物、栄養培地においてモノクローナル培養物から得られた培養物が提供される。ポリペプチドが分泌される場合、培地は、細胞を有するか、または濾過または遠心分離で除かれた場合には細胞を有さないポリペプチドを含む。細菌（例えば、大腸菌およびバシラス サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、糸状菌類（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、ならびに昆虫細胞を含む、多くの発現系が既知であり、使用され得る。

【0187】

本明細書に記載の抗体構築物は、例えば、宿主染色体中または遊離プラスミド上に挿入されたコード化配列から、従来の方法で生成される。酵母は、通常の方法のいずれか、例えば電気穿孔法において、所望のタンパク質に対するコード化配列で形質転換される。電気穿孔法による酵母の形質転換の方法は、Ｂｅｃｋｅｒ＆Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示されている。

【0188】

うまく形質転換された細胞、すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞は、よく知られた技術によって同定され得る。例えば、発現構築物の導入から得られる細胞は、成長し、所望のポリペプチドを生成することができる。細胞を収集および溶解し、それらのＤＮＡ含量を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３またはＢｅｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８によって記載されるもの等の方法を使用して、ＤＮＡの存在に対して検査した。代替として、上清中のタンパク質の存在は、抗体を使用して検出され得る。

【0189】

有用な酵母プラスミドベクターには、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６が挙げられ、一般的に利用可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択可能マーカーＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母動原体プラスミド（Ｙｃｐ）である。

【0190】

相補的付着末端を介してＤＮＡをベクターに操作的に連鎖するために、種々の方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマー区域を、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに付加することができる。次いで、ベクターおよびＤＮＡセグメントは、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合により連結されて組換えＤＮＡ分子を形成する。

【0191】

１つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する別の方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化によって生成されたＤＮＡセグメントを、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼで、あるいは、３'５'−エキソヌクレアーゼ活性で突出している＿−一本鎖末端を除去し、かつポリマー形成活性で陥凹３'末端を塞ぐ酵素である、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１で処理する。

【0192】

したがって、これらの活性の組み合わせにより平滑末端ＤＮＡセグメントが生成される。次いで、この平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ等の平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる酵素の存在下でモル過剰のリンカー分子とインキュベートする。ゆえに、この反応の生成物は、末端にポリマーリンカー配列を保有するＤＮＡセグメントである。次いで、これらのＤＮＡセグメントは、適切な制限酵素で切断され、ＤＮＡセグメントのものと適合する末端を生成する酵素で切断されている発現ベクターに連結される。

【0193】

種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、いくつかの販売元から市販されている。

【0194】

アルブミン融合タンパク質を発現する宿主として本発明の実施において有用であると考えられる酵母の例示的な属は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（以前はハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属として分類された）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シテロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、メトシュニコウイア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ルコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ボトリオアスカス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）属、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、エンドミコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属等である。好ましい属は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クルイベロミセス属、ピキア属、およびトルラスポラ属から成る群から選択されるものである。サッカロミセス種の例は、Ｓ．セレビシア、Ｓ．イタリクス（Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ）、およびＳ．ルキシイである。

【0195】

クルイベロミセス種の例は、Ｋ．フラジリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）、およびＫ．マルキシアナス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）である。好適なトルラスポラ種は、Ｔ．デルブリュッキイ（Ｔ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）である。ピキア（ハンゼヌラ）種の例は、Ｐ．アンガスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ）（以前はＨ．ポリモルファ(H. polymorpha)）、Ｐ．アノマラ（Ｐ． ａｎｏｍａｌａ）（以前はＨ．アノマラ（Ｈ． ａｎｏｍａｌａ））、およびＰ．パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。Ｓ．セレビシアの形質転換の方法は、一般に、欧州特許第２５１ ７４４号、欧州特許第２５８ ０６７号、および国際公開第９０／０１０６３号において教示されており、それらのすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0196】

本明細書に記載の抗体構築物タンパク質、宿主細胞、ならびに合成および組換え技術によるヘテロ多量体タンパク質の生成物をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。このベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能があるか、または複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、補完できる宿主細胞においてのみ生じる。

【0197】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物をコードするポリヌクレオチドは、宿主内での増殖のための選択可能マーカーを含むベクターに連結される。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物等の沈殿物に、または荷電脂質との複合物に導入される。ベクターがウイルスである場合、それは適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ、次いで、宿主細胞内に形質導入される。

【0198】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド挿入は、適切なプロモーター、数例を挙げると、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｒａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスのＬＴＲのプロモーター等に操作的に連結される。他の好適なプロモーターが当業者によく知られるであろう。発現構築物は、転写開始、終了のための部位、および転写領域においては、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始端に翻訳開始コドンを、およびその終端に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。

【0199】

示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。そのようなマーカーには、真核細胞培養におけるジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌および他の細菌内における培養におけるテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例には、大腸菌、ストレプトミセス、およびサルモネラ・チフィリウム細胞等の細菌細胞；酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシアまたはピキア・パストリス（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））等の真菌細胞；ドロソフィラＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、およびボーズメラノーマ細胞等の動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記宿主細胞のための適切な培養培地および状態が、当該技術分野で既知である。

【0200】

細菌における使用に好適なベクターの中には、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ファージスクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＮＨ４６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。好ましい真核ベクターの中は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬである。酵母系における使用に好適な発現ベクターには、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なベクターが、当業者に容易に明らかとなるであろう。

【0201】

１つの実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物をコードするポリヌクレオチドは、原核もしくは真核細胞の特定の区画への本発明のタンパク質の局在化を指示するか、および／または原核もしくは真核細胞からの本発明のタンパク質の分泌を指示するシグナル配列に融合する。例えば、大腸菌においては、細胞膜周辺腔へのタンパク質の発現を指示することが望ましいことがある。細菌の細胞膜周辺腔へのポリペプチドの発現を指示するために抗体構築物がそこに融合するシグナル配列またはタンパク質（またはそのフラグメント）の例には、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズム大腸菌熱不安定性エンテロトキシンＢサブユニットのシグナル配列、ならびにアルカリフォスファターゼのシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．から入手可能なベクターのｐＭＡＬシリーズ（具体的には、ｐＭＡＬ−．ｒｈｏ．シリーズ）等のいくつかのベクターがタンパク質の局在化を指示する融合タンパク質の構築用に市販されている。具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質は、ｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列に融合され、グラム陰性細菌においてそのようなポリペプチドの発現および精製の効率を上昇させる。米国特許第５，５７６，１９５号、および同第５，８４６，８１８号を参照されたく、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0202】

哺乳類細胞におけるその分泌を指示するための抗体構築物に融合されるシグナルペプチドの例には、ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１−２１）、スタンニオカルシンシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ（配列番号：１））、およびコンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ（配列番号：２））が挙げられるが、これらに限定されない。バキュロウイルス発現系と併せて使用され得る好適なシグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１−１９）である。

【0203】

選択可能マーカーとしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを使用するベクターは、それぞれ、メチオニンスルホキシミンまたはメトトレキサートの薬物の存在下で増幅され得る。ベクターに基づくグルタミンシンターゼの利点は、グルタミンシンターゼ陰性である細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株、ＮＳＯ）の利用可能性である。グルタミンシンターゼ発現系は、内因性遺伝子の機能を抑制するさらなる阻害剤を与えることによりグルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）中でも機能することができる。グルタミンシンターゼ発現系およびその構成要素は、ＰＣＴ公開：ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／１００３６；ＷＯ８９／１０４０４；およびＷＯ９１／０６６５７に詳述されており、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎ．Ｈ．）から入手可能である。マウス骨髄腫細胞におけるＧＳ発現系を使用したモノクローナル抗体の発現および生成は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９（１９９２）に、およびＢｉｂｌｉａ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）に記載され、それらは参照により本明細書に組み込まれる。

【0204】

本明細書に記載の単離された一価抗体構築物をコードする核酸を含む宿主細胞が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の宿主細胞であり、その抗原結合ポリペプチド構築物をコードするその核酸と、Ｆｃ構築物をコードするその核酸とは、単一のベクター中に存在する。

【0205】

本明細書に記載の単離された一価抗体構築物を調製する方法が本明細書に提供され、本方法は、（ａ）抗体構築物をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）宿主細胞培養物から抗体構築物を回収するステップと、を含む。

【0206】

本明細書に記載のベクター構築物を含む宿主細胞、およびさらに、当該技術分野で既知の技術を使用して、１つ以上の異種の制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と操作可能に会合されるヌクレオチド配列を含む宿主細胞がまた提供される。宿主細胞は、哺乳類細胞（例えば、ヒト由来細胞）等の高等真核生物、もしくは酵母細胞等の下等真核細胞であってもよく、または宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞であってもよい。挿入される遺伝子配列の発現を調節するか、または望ましい特定の様式で遺伝子生成物修飾および処理する宿主株が選択され得る。ある特定のプロモーターからの発現は、ある特定のインデューサーの存在下で増加され、このようにして、遺伝子操作されたポリペプチドの発現が制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングならびに修飾（例えば、リン酸化、切断）のための特性および特定の機序を有する。適切な細胞株は、異種タンパク質の所望の修飾およびプロセシングの発現を確実にするように選択され得る。

【0207】

宿主細胞への核酸および本発明の核酸構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染、または他の方法によって達成され得る。そのような方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）等の多くの標準実験マニュアルに記載されている。本発明のポリペプチドが、事実上、組換えベクターを欠いている宿主細胞によって発現され得るということが特に意図される。

【0208】

本明細書で考察されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含する事に加えて、本発明はまた、内因性遺伝物質を欠失させるか、もしくは置き換えるように、および／または遺伝物質を含むように操作された脊椎動物由来、特に哺乳類由来の一次、二次、および不死化宿主細胞を包含する。内因性ポリヌクレオチドに操作可能に会合された遺伝物質は、内因性ポリヌクレオチドを活性化するか、変化させるか、および／または増幅する。

【0209】

加えて、当該技術分野で知られている技術を使用して、異種のポリヌクレオチドおよび／または異種の制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を、相同的組み換えを介して治療用タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列と操作可能に会合することができる（例えば、１９９７年６月２４日に取得された米国特許第５，６４１，６７０号；国際特許第ＷＯ９６／２９４１１号；国際特許第ＷＯ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照されたく、そのそれぞれの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0210】

本明細書に記載の抗体構築物は、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿法、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性荷電相互作用クロマトグラフィー、ならびにレクチンクロマトグラフィーを含む、よく知られた方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。精製に高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を用いることが最も好ましい。

【0211】

ある特定の実施形態において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥ セファロース、ｐｏｒｏｓ ＨＱ、ｐｏｒｏｓ ＤＥＡＦ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ ＱおよびＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＱおよびＤＥＡＥカラム上でのクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されないアニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製される。

【0212】

具体的な実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、ＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ｐｏｒｏｓ ＨＳ、ｐｏｒｏｓ ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ ＳおよびＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳおよびＣＭカラム、ならびにそれらの等価物および相当物が挙げられるが、これらに限定されないカチオン交換クロマトグラフィーを用いて精製される。

【0213】

加えて、本明細書に記載の抗体構築物は、当該技術分野で知られている技術を用いて化学的に合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照されたい）。例えば、ポリペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチドシンセサイザーの使用によって合成され得る。さらに、所望に応じて、非古典的なアミノ酸または化学アミノ酸類似体が、ポリペプチド配列への置換または添加として導入されてもよい。非古典的なアミノ酸には、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４ジアミノ酪酸、αアミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸等のデザイナーアミノ酸、および一般的にアミノ酸類似体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。

【0214】

一価抗体構築物の試験。ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、およびＣ１ｑ結合
本発明による一価抗体構築物は、対応する単一特異性二価抗体構築物と比較して強化されたエフェクター機能を示す。一価抗体構築物のエフェクター機能は、以下のように試験され得る。インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害アッセイを行い、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＣ活性を評価することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行い、ＦｃγＲ結合を測定することができる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞である、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページにある表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの一例は、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替として、または追加として、対象の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるもの等の動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを行い、一価抗体構築物がＣ１ｑに結合することができ、これによりＣＤＣを活性化させるかどうかを判定することもできる。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）を実施してもよい。当該技術分野でよく知られている方法を使用して、抗体のＳＰＲおよびインビボでのＰＫ判定によるＦｃＲｎ結合を実施してもよい。

【0215】

生物学的および治療的用途：
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の構築物は、１つ以上の生物活性を試験するためのアッセイに使用される。構築物が特定のアッセイにおいて活性を示す場合、その抗体構築物によって構成される抗原結合構築物は生物活性に関連付けられる疾患に関係する可能性がある。このため、この構築物は、その関連疾患の治療に役立つ。

【0216】

ある特定の実施形態においては、抗原分子の多量体形成を阻害するための医薬品の製造のための本明細書に記載の一価抗体構築物の使用がある。ある特定の実施形態においては、抗原のその同族の結合パートナーへの結合を阻害するための一価抗体構築物の使用がある。

【0217】

ある特定の実施形態において、疾患または障害を治療する方法であって、そのような治療、予防、または回復が望まれる患者に本明細書に記載の抗体構築物をその疾患または障害を治療する、予防する、または回復するのに有効な量で投与する段階を含む方法が提供される。

【0218】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物は、内分泌系の疾患および／または障害の診断、予後、予防、および／または治療に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物は、神経系の疾患および／または障害の診断、予後、予防、および／または治療に使用される。

【0219】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物は、免疫系の疾患および／または障害の診断、予後、予防、および／または治療に使用される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物は、呼吸器系の疾患および／または障害の診断、予後、予防、および／または治療に使用される。

【0220】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物は、心血管系の疾患および／または障害の診断、予後、予防、および／または治療に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物は、生殖器系の疾患および／または障害の診断、予後、予防、および／または治療に使用される。

【0221】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物は、消化器系の疾患および／または障害の診断、予後、予防、および／または治療に使用される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物は、血液に関連する疾患または障害の診断、予後、予防、および／または治療に使用される。

【0222】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物および／または本明細書に記載の抗体構築物をコードするポリヌクレオチドは、プロホルモン活性化、神経伝達物質活性、細胞シグナル伝達、細胞増殖、細胞分化、および細胞遊走が挙げられるが、これらに限定されない活性に関連する疾患および／または障害の診断、検出、および／または治療において使用される。

【0223】

ある態様において、本明細書に記載の抗体構築物は、開示される疾患、障害、または状態のうちの１つ以上を治療するために抗体構築物を患者に投与する段階を含む、抗体ベースの療法を対象とする。本明細書に記載の治療化合物には、本明細書に記載の抗体構築物、本明細書に記載の抗体構築物をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。

【0224】

具体的な実施形態においては、抗体ベースの療法であり、その療法は、神経障害、免疫障害、筋肉障害、増殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎臓障害、増殖性障害、ならびに／または癌性疾患および状態、ならびに／または本明細書の他の箇所に記載されるものを含むが、これらに限定されない１つ以上の疾患、障害、または状態を治療するために、抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは変異体を含む本明細書に記載の抗体構築物を患者に投与する段階を含む。

【0225】

抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは変異体を含む本明細書に記載の抗体構築物は、単独で、または他の種類の治療（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、および抗腫瘍剤）と組み合わせて投与されてもよい。一般に、患者のものと同じ種である種起源または種反応性（抗体の場合）の生成物の投与が好ましい。このため、一実施形態において、ヒト抗体、フラグメント誘導体、類似体、または核酸が、治療または予防のためにヒト患者に投与される。

【0226】

患者における感染性疾患を治療する方法もまた提供され、本方法は、治療的有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を患者に投与する段階を含む。ある特定の実施形態において、感染性疾患は、ウイルス性因子によって引き起こされる。ある特定の実施形態において、感染性疾患は、細菌性因子または真菌因子によって引き起こされる。一定量の本明細書に記載の一価抗体構築物を与えることによって治療され得る細菌因子には、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、大腸菌、ストレプトコッカス、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メチシリン耐性Ｓ．アウレウス（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）、およびその他が挙げられ、これらに限定されない。一定量の本明細書に記載の一価抗体構築物を与えることによって治療され得るウイルス性因子には、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ａ群、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、狂犬病、ワクチニア、水疱性口内炎ウイルス（ＶＺＶ）、ＨＩＶ、ＷＮＶ、ＳＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。一定量の本明細書に記載の一価抗体構築物を与えることによって治療され得る真菌因子には、クリプトコッカス髄膜炎、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ． ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）（ＣＮ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）（ＨＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0227】

個体において対象のバイオマーカーの存在を検出するためのキットが提供され、そのキットは、（ａ）本明細書に記載の単離された一価抗体構築物、ならびに（ｂ）使用説明書を含む。ある特定の実施形態においては、ＨＥＲ２およびその可溶性ＥＣＤのうちの少なくとも１つの検出のためのキットであり、そのキットは、（ａ）本明細書に記載の単離された一価ＨＥＲ２結合抗体構築物、ならびに（ｂ）使用説明書を含む。いくつかの実施形態においては、ＨＥＲ２およびその可溶性ＥＣＤのうちの少なくとも１つの濃度を判定するためのキットであり、そのキットは、（ａ）本明細書に記載の単離された一価ＨＥＲ２結合抗体構築物、ならびに（ｂ）使用説明書を含む。

【0228】

癌の治療
癌を治療するための医薬品の製造のための本明細書に記載の一価抗体構築物の使用が、本明細書に提供される。免疫系障害のための医薬品の製造のための本明細書に記載の一価抗体構築物の使用もまた、提供される。ある特定の実施形態においては、腫瘍の成長を阻害するための医薬品の製造のための本明細書に記載の一価抗体構築物の使用がある。ある特定の実施形態においては、腫瘍を縮小させるための医薬品の製造のための本明細書に記載の一価抗体構築物の使用がある。

【0229】

癌を治療するための医薬品の製造のための本明細書に記載の一価ＨＥＲ２結合担体構築物の使用が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、癌は、低ＨＥＲ２発現の癌である。ある特定の実施形態において、癌は、二価ＨＥＲ２抗体による治療に抵抗性である。トラスツズマブでの治療に抵抗性の癌を治療するための医薬品の製造のための本明細書に記載の一価ＨＥＲ２結合担体構築物の使用が、本明細書に提供される。

【0230】

１つの実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、癌の治療に使用される。１つの実施形態において、本明細書に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド構築物を含む一価抗体構築物は、ＨＥＲ１機能不全、ＨＥＲ２機能不全、ＨＥＲ３機能不全、および／またはＨＥＲ４機能不全を含む、ＨＥＲ機能不全と関連する、癌または任意の増殖性疾患の治療に有用である。ある特定の実施形態において、癌は、乳癌、胃癌、脳腫瘍、肺癌のうちの少なくとも１つであるか、または癌腫の少なくとも１つの種類である。

【0231】

１つの実施形態において、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体構築物は、乳癌細胞の治療に使用される。ある特定の実施形態において、ＨＥＲ２結合一価抗体構築物は、乳癌を患う個体に投与するための医薬組成物の調製に使用される。いくつかの実施形態においては、個体における乳癌の治療であり、本治療は、少なくとも１つの本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体構築物の有効量をその個体に提供することによるものである。

【0232】

１つの実施形態において、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体構築物は、現在の抗ＨＥＲ２療法に部分的に応答性である患者の治療に使用される。１つの実施形態において、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体構築物は、現在の抗ＨＥＲ２療法に抵抗性である患者の治療に使用される。別の実施形態において、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体構築物は、現在の抗ＨＥＲ２療法に対する抵抗性が発生しつつある患者の治療に使用される。

【0233】

１つの実施形態において、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体構築物は、現在の抗ＨＥＲ２療法に非応答性である患者の治療に有用である。ある特定の実施形態において、これらの患者は、トリプルネガティブ癌を患う。いくつかの実施形態において、トリプルネガティブ癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびＨｅｒ２の遺伝子の発現が低度からわずかである、乳癌である。ある特定の他の実施形態において、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体構築物は、任意に１つ以上の現在の抗ＨＥＲ２療法と組み合わせて、現在の抗ＨＥＲ２療法に非応答性の患者に提供される。いくつかの実施形態において、現在の抗ＨＥＲ２療法には、抗ＨＥＲ２もしくは抗ＨＥＲ３単一特異性二価抗体、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、二重特異性ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ ｓｃＦｖ、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、抗ＨＥＲ２、または抗ＨＥＲ３に応答しない患者の治療に、単独で、または組み合わせて使用される。

【0234】

１つの実施形態において、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含むＨＥＲ２結合一価抗体構築物は、転移性乳癌を有する患者の治療に使用することができる。１つの実施形態において、ＨＥＲ２結合一価抗体は、局所進行性または進行性の転移性乳癌を有する患者の治療に有用である。１つの実施形態において、ＨＥＲ２結合一価抗体は、難治性乳癌を有する患者の治療に有用である。１つの実施形態において、ＨＥＲ２結合一価抗体は、以前の抗ＨＥＲ２療法で患者が進行した場合に、転移性乳癌の治療のためにその患者に提供される。１つの実施形態において、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体は、トリプルネガティブ乳癌を有する患者の治療に使用することができる。１つの実施形態において、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体は、進行性、難治性ＨＥＲ２増幅型ヘレグリン陽性癌を有する患者の治療に使用される。

【0235】

癌治療のための他の既知の療法と組み合わせて投与されるＨＥＲ２結合一価抗体構築物が、提供される。この実施形態によると、一価抗体構築物は、Ｂ_ｍａｘおよび抗体依存性細胞傷害活性をＦＳＡよりも高く有意に増加させるために、結合標的エピトープが重複しない他の一価抗体構築物または多価抗体と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明による一価抗ＨＥＲ２抗体は、次のように組み合わせて投与することができる：１）ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎに基づく）等の一価抗体構築物とＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（ペルツズマブに基づく）との組み合わせ、２）ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２および／またはＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２とセツキシマブ二価ＥＧＦＲ抗体との組み合わせ、ならびに３）同じ標的細胞上で同じおよび異なる表面抗原を対象とする非競合型抗体の複数の組み合わせ。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、進行性のＨＥＲ２増幅型ヘレグリン陽性乳癌を有する患者の治療のために、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、ＴＤＭ１、アフコシル化抗体、またはＰｅｒｊｅｔａから選択される治療法と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の一価抗体構築物は、食道末端部、胃食道（ＧＥ）接合部、および胃のＨＥＲ２発現癌腫を有する患者に、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）またはＰｅｒｊｅｔａと組み合わせて投与される。

【0236】

遺伝子療法：
具体的な実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物をコードする配列を含む核酸は、遺伝子療法として、タンパク質の異常な発現および／または活性と関連する疾患または障害を治療、阻害、または予防するために投与される。遺伝子療法とは、発現されたか、または発現可能な核酸を対象に投与することによって行われる治療法を指す。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらがコードしたタンパク質を生成し、これが治療効果を媒介する。当該技術分野で利用可能な遺伝子療法の方法のうちのいずれかを使用することができる。

【0237】

治療的／予防的投与および組成物
本明細書に記載の抗体構築物または医薬組成物の有効量を対象に投与することによる治療、阻害、および予防の方法が提供される。一実施形態において、抗体構築物は、実質的に精製される（例えば、その効果を制限するか望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。ある特定の実施形態において、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物を含むがこれらに限定されない動物であり、ある特定の実施形態では、哺乳動物、最も好ましくはヒトである。

【0238】

種々の送達系、例えば、リポソームへのカプセル封入、マイクロ粒子、マイクロカプセル、化合物の発現、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照されたい）、レトロウイルスもしくは他のベクターの一部として核酸の構築が可能な組み換え細胞が、既知であり、本明細書に記載の抗体構築物製剤を投与するために使用することができる。導入の方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の便宜的な経路、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜の裏層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を通じた吸収によって投与することができ、また他の生物学的活性剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身的または局所的であり得る。加えて、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体構築物組成物を、脳室内および髄腔内注射を含む任意の好適な経路によって、中枢神経系に導入することが望ましく、脳室内注射は、例えば、オマヤレザーバー等のレザーバーに取り付けられた、脳室内カテーテルによって促進され得る。例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を有する製剤の使用による肺内投与もまた利用され得る。

【0239】

具体的な実施形態において、本明細書に記載の抗体構築物または組成物を、治療が必要な場所に局所的に投与することが望ましく、これは、例えば、限定するものではなく、外科手術中の局所注入によって、局所適用、例えば、手術後の創傷包帯と併せて、注射によって、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、または埋め込み装置を用いて、達成することができ、その埋め込み装置は、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜等の膜、または繊維を含む、多孔質、無孔質、またはゼラチン状材料でできている。好ましくは、本発明の抗体を含むタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するように注意する必要がある。

【0240】

別の実施形態において、抗体構築物または組成物は、小胞、特にリポソーム中で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０），Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７−３２７を参照されたく、広くは前書を参照のこと）。

【0241】

さらに別の実施形態において、抗体構築物または組成物は、制御放出系において送達することができる。１つの実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ（上記）、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照されたい）。別の実施形態において、ポリマー材料が使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照されたく、また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照されたい）。さらに別の実施形態において、制御放出系は、治療標的、例えば、脳の近位で行うことができ、したがって、全身用量のごく一部のみを要する（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（上記）ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照されたい）。

【0242】

本明細書に記載の抗体構築物をコードする核酸を含む具体的な実施形態において、核酸は、それがコードするタンパク質の発現を促進するために、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、それが細胞内に入るようにそれを投与することによって、例えば、レトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、または直接注射によって、またはマイクロ粒子の衝突を使用して（例えば、遺伝子銃、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングして、または核に侵入することが既知のホメオボックス様ペプチドとの結合でそれを投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照されたい）等によって、インビボで投与され得る。あるいは、核酸は、相同的組み換えによって、細胞内に導入され、発現のために宿主細胞のＤＮＡに組み込まれ得る。

【0243】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の一本アームの一価抗体構築物は、結合標的エピトープが重複しない他の一本アームの一価または多価抗体との組み合わせとして、投与される。

【0244】

医薬組成物もまた、本明細書に提供される。このような組成物は、治療有効量の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む。具体的な実施形態において、「薬学的に許容される」とは、動物、およびより具体的にはヒトにおける使用について、連邦もしくは州政府によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の広く認識される薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤がそれとともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等といった、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む、水および油等の滅菌の液体であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合に、好ましい担体である。食塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液もまた、特に注射可能溶液のための液体担体として、用いることができる。好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物は、所望に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤もまた含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤等の形態をとり得る。組成物は、トリグリセリド等の従来的な結合剤および担体とともに、坐剤として製剤化されてもよい。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含み得る。好適な薬学的担体の例は、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。このような組成物は、患者への適切な投与のための形態をもたらすように、好適な量の担体とともに、好ましくは精製された形態で治療有効量の化合物を含有する。製剤は、投与方法に適したものでなければならない。

【0245】

ある特定の実施形態において、抗体構築物を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合される医薬組成物として、日常的な手順に従って製剤化される。典型的に、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリグノカイン等の局所麻酔薬も含み得る。一般に、成分は、別々に、または単位剤形に一緒に混合されてのいずれかで、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたは小袋といった密封容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、供給される。組成物が注入によって投与される場合、これは、滅菌の医薬品グレードの水または食塩水を含有する注入ボトルによって分注され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用の滅菌水または食塩水のアンプルが提供され得る。

【0246】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、中性または塩形態として製剤化される。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものといった、アニオンにより形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものといった、カチオンにより形成されるものが含まれる。

【0247】

治療用タンパク質の異常な発現および／または活性と関連する疾患または障害の治療、阻害、および阻止に有効な本明細書に記載の組成物の量は、標準的な臨床技法によって決定することができる。加えて、インビトロアッセイを任意に用いて、最適な投薬量範囲の特定に役立ててもよい。製剤中に用いられる正確な用量は、投与の経路、および疾患または障害の重症度に左右されることになり、施術者の判断および各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデルの試験システムから導出された用量応答曲線から推定される。

【0248】

薬物分子との結合：
ある特定の実施形態においては、薬物分子と結合している本明細書に記載の一価抗体構築物を含む医薬組成物がある。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの薬物分子は、治療薬である。ある特定の実施形態において、薬物分子は、毒素である。ある特定の実施形態において、薬物分子は、抗原類似体である。一実施形態において、薬物分子は、天然の生成物、その類似体、またはプロドラッグである。

【0249】

ある特定の実施形態において、薬物分子は、生体分子である。一実施形態において、薬物分子は、天然または合成の核酸である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの薬物分子は、ＤＮＡ、ＰＮＡ、および／またはＲＮＡオリゴマーのうちの１つ以上である。

【0250】

治療的または予防的活性の実証：
本明細書に記載の抗体構築物または医薬組成物を、インビトロで試験し、次いで、ヒトにおける使用の前に、所望される治療的または予防的活性について、インビボで試験する。例えば、化合物または医薬組成物の治療的または予防的有用性を実証するためのインビトロアッセイには、細胞株または患者組織試料に対する化合物の効果が含まれる。細胞株および／または組織試料に対する化合物または組成物の効果は、ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイを含むがこれらに限定されない、当業者に既知の技術を利用して判定することができる。本発明によると、特定の化合物の投与が適応されるかどうかを判定するために使用可能であるインビトロアッセイには、患者の組織試料を培養で成長させて、抗体構築物に暴露させるかまたはそれを投与し、組織試料に対するこのような抗体構築物の効果を観測する、インビトロ細胞培養アッセイが含まれる。

【0251】

例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合等によって、翻訳の間または後に異なって修飾される抗体構築物が提供される。多数の化学修飾のいずれも、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ_４による特異的な化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成等を含むがこれらに限定されない、既知の技術によって実行することができる。

【0252】

本明細書に包含されるさらなる翻訳後修飾には、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ末端もしくはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学成分の付加、Ｎ結合型もしくはＯ結合型炭水化物鎖の化学修飾、ならびに原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失が含まれる。抗体構築物は、タンパク質の検出および単離を可能にするために、酵素、蛍光、同位体、または親和性標識といった、検出可能な標識で修飾される。

【0253】

好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジンビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例には、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、ならびに好適な放射性物質の例には、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。

【0254】

具体的な実施形態において、抗体構築物またはそれらのフラグメントまたは変異体は、放射性金属イオンと会合している大環状キレート剤に付着している。

【0255】

言及されるように、本明細書に記載の抗体構築物は、翻訳後プロセシング等の天然のプロセスによって、または当該技術分野でよく知られている化学修飾技術によってのいずれかで修飾される。同じ種類の修飾が、所与のポリペプチド内のいくつかの部位において同じまたは異なる程度に存在し得ることが理解されよう。本発明のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化を受けて分枝状であってもよく、および分枝を伴うか、または伴わない環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果であってもよく、または合成法によって作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボース化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化等の転移ＲＮＡ媒介性のタンパク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化が含まれる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。

【0256】

ある特定の実施形態において、抗体構築物はまた、固体支持体に付着されてもよく、この固体支持体は、本発明のアルブミン融合タンパク質よって結合されるか、それに結合するか、またはそれと会合するポリペプチドの免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0257】

また、ポリペプチドの可溶性、安定性、および循環時間の増加、または免疫原性の低下等のさらなる利点を提供し得る、本抗体構築物の化学修飾された誘導体もまた本明細書に提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい）。誘導体化のための化学的成分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーから選択され得る。このタンパク質は、分子内の無作為な位置、または分子内の既定の位置で修飾されてもよく、また、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の付着された化学成分を含んでもよい。

【0258】

ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分枝または非分枝であってもよい。ポリエチレングリコールに関して、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造を容易にするため、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製物中で、いくつかの分子が述べられた分子量よりいくらか大きいか、または小さい重量であることを示す）。他のサイズが、所望の治療プロファイル（例えば、所望の持続放出の持続期間、存在する場合生物活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の既知の効果）に応じて使用されてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１０５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。

【0259】

本明細書に記載の抗体構築物の存在または量は、当該技術分野で既知の免疫アッセイであるＥＬＩＳＡを使用して判断され得る。本明細書に記載のヘテロ多量体を検出／定量化するために有用な１つのＥＬＩＳＡプロトコルは、ＥＬＩＳＡプレートを抗ヒト血清アルブミン抗体で被覆するステップと、そのプレートを遮断して非特異的結合を防止するステップと、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄するステップと、本明細書に記載のタンパク質を含有する溶液を（１以上の異なる濃度で）付加するステップと、（本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該技術分野で既知のように）検出可能な標識に結合された二次抗−抗体構築物ポリペプチド特異的抗体を付加するステップと、二次抗体の存在を検出するステップと、を含む。

【0260】

ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の一価抗体構築物およびアジュバントを含む、医薬組成物がある。ある特定の実施形態においては、一価抗体構築物と結合している薬物分子をさらに含む、本明細書に記載の医薬組成物がある。ある特定の実施形態において、薬物分子は、自己免疫性障害の治療のためのものである。いくつかの実施形態において、薬物分子は、癌の治療のためのものである。いくつかの実施形態において、薬物分子は、化学治療薬である。

【0261】

その方法を必要とする患者に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を提供する段階を含む、癌を治療する方法が本明細書に提供される。１つの実施形態において、治療される癌は、乳癌である。別の実施形態において、治療される癌は乳癌であり、その乳癌の細胞は、高、中、または低密度でＨＥＲ２タンパク質を発現する。ＨＥＲ２は受容体のＥＧＦＲファミリーに属し、乳癌の対象において過剰発現される傾向にある。ＨＥＲ２タンパク質はまた、遺伝子、ＥＧＦＲ２、ＣＤ３４０、ＥｒｂＢ２、およびｐ１８５の生成物ともされる。以下の表Ａは、いくつかの代表的な乳癌細胞株におけるＨＥＲ２の発現レベルを記載する（Ｓｕｂｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：４；３５−４１；Ｐｒａｎｇ ｅｔ ａ．（２００５）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：９２；３４２−３４９）。表に示されるように、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は低ＨＥＲ２発現細胞と考えられ、ＳＫＯＶ３細胞は中ＨＥＲ２発現細胞と考えられ、ならびにＳＫＢＲ３細胞は高ＨＥＲ２発現細胞と考えられる。

【0262】

（表Ａ２）

【0263】

いくつかの実施形態においては、免疫系障害を治療する方法であり、本方法は、その方法を必要とする患者に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を提供する段階を含む。ある特定の実施形態においては、腫瘍の成長を阻害する方法であり、本方法は、腫瘍を有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む。腫瘍を有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、腫瘍を縮小させる方法が提供される。いくつかの実施形態においては、抗原分子の多量体形成を阻害する方法であり、本方法は、抗原を有効量の本明細書に記載の一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む。抗原に結合させるのに十分な量の本明細書に記載の一価抗体構築物を含む組成物と接触させる段階を含む、抗原がその同族の結合パートナーと結合することを阻害する方法が本明細書に提供される。

【0264】

安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法がある特定の実施形態において提供され、本方法は、重鎖可変ドメインおよび第１のＦｃドメインポリペプチドを含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ配列；第２のＦｃドメインポリペプチドを含むその第２の重鎖ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第２のＤＮＡ配列；ならびに軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第３のＤＮＡ配列を用いて、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように少なくとも１つの安定した哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、その重鎖および軽鎖ポリペプチドがその少なくとも１つの安定した哺乳類細胞内で所望のグリコシル化一価非対称抗体として発現されるように少なくとも１つの哺乳類細胞内のその第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を翻訳する段階と、を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、本方法は、２つの細胞のそれぞれが異なる比率で重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを発現するように、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を異なる既定の比率で少なくとも２つの異なる細胞へトランスフェクトする段階を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、本方法は、その第１、第２、および第３のＤＮＡ配列を含むマルチシストロン（ｍｕｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｉｏｎｉｃ）ベクターを少なくとも１つの哺乳類細胞へトランスフェクトする段階を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの哺乳類細胞は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２、およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそれらのサブクラスおよび変異体から成る群から選択される。

【0265】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、第１のＤＮＡ配列：第２のＤＮＡ配列：第３のＤＮＡ配列の既定の比率は、約１：１：１である。いくつかの実施形態において、第１のＤＮＡ配列：第２のＤＮＡ配列：第３のＤＮＡ配列のその既定の比率は、翻訳される第１の重鎖ポリペプチドの量が第２の重鎖ポリペプチドの量および軽鎖ポリペプチドの量にほぼ等しくなるようなものである。

【0266】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、その少なくとも１つの安定した哺乳類細胞の発現生成物は、単量体重鎖もしくは軽鎖ポリペプチド、または他の抗体と比較して、より大きい割合の所望のグリコシル化一価抗体を含む。

【0267】

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法であり、本方法は、所望のグリコシル化一価抗体を同定し、精製する段階を含む。いくつかの実施形態において、その同定は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の１つまたは両方によるものである。

【0268】

重鎖可変ドメインおよび第１のＦｃドメインポリペプチドを含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ配列；第２のＦｃドメインポリペプチドを含む第２の重鎖ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第２のＤＮＡ配列；ならびに軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第３のＤＮＡ配列を用いて、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように少なくとも１つの安定した哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、その重鎖および軽鎖ポリペプチドがその少なくとも１つの安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体として発現されるように、少なくとも１つの哺乳類細胞内のその第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を翻訳する段階と、を含み、そのグリコシル化一価非対称抗体は、対応する野生型抗体と比較してより高いＡＤＣＣを有する、改善されたＡＤＣＣを持つ抗体構築物を生成する方法が本明細書に提供される。

【0269】

抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、二量体Ｆｃ領域と、を含む一価抗体構築物を標的細胞に提供する段階を含み、その一価抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応する二価抗体構築物と比較して、その抗原を提示する標的細胞に対する結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その一価抗体構築物は、対応する二価抗体構築物と比較してより良い治療効果を示し、ならびにその効果は、抗原の架橋、抗原二量体形成、抗原調節の阻止、または抗原活性化の阻止によって生じるものではない、少なくとも１つの標的細胞において抗体濃度を増加させる方法が本明細書に提供される。

【0270】

抗原に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、ＣＨ３ドメインを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む、単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、その一価抗体構築物は、２つの抗原結合領域を持つ対応する二価抗体構築物と比較して、その抗原を提示する標的細胞に対する結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その一価抗体構築物は、対応する二価抗体構築物と比較してより良い治療効果を示し、ならびにその効果は、抗原の架橋、抗原二量体形成、抗原調節の阻止、または抗原活性化の阻止によって生じるものではない。

【0271】

ＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、ＣＨ３ドメインを含む二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含む、ＨＥＲ２に結合する単離された一価抗体構築物が本明細書に提供され、その抗体構築物は標的細胞によってインターナライズされ、その構築物はＨＥＲ２に二価的に結合する対応する二価抗体構築物と比較して標的細胞上で提示されるＨＥＲ２に対する結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その構築物はその対応する二価ＨＥＲ２結合抗体構築物と比較してより高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。

【0272】

重鎖可変ドメインおよび第１のＦｃドメインポリペプチドを含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ配列；第２のＦｃドメインポリペプチドを含むその第２の重鎖ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列であって、第２の重鎖ポリペプチドが可変ドメインを欠いている、第２のＤＮＡ配列；ならびに軽鎖可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドをコードする、第３のＤＮＡ配列を用いて、その第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列が、既定の比率で哺乳類細胞にトランスフェクトされるように少なくとも１つの安定した哺乳類細胞へトランスフェクトする段階と、その重鎖および軽鎖ポリペプチドがその少なくとも１つの安定した哺乳類細胞内で所望のグリコシル化一価非対称抗体として発現されるように少なくとも１つの哺乳類細胞内のその第１のＤＮＡ配列、その第２のＤＮＡ配列、およびその第３のＤＮＡ配列を翻訳する段階と、を含む、安定した哺乳類細胞内でグリコシル化一価抗体構築物を生成する方法が本明細書に提供される。

【0273】

個体において対象のバイオマーカーの存在を検出するためのキットが提供され、そのキットは、（ａ）本明細書に記載の単離された一価抗体構築物と、（ｂ）使用説明書とを含む。

【0274】

また、本明細書に記載の一価抗体構築物をコードし、発現するために、本明細書に記載の核酸分子を含有するように修飾される形質転換体が提供される。

【0275】

低ＨＥＲ２発現を有する標的細胞上のＨＥＲ２に結合する単離された一価抗体構築物がある特定の実施形態において提供され、本一価抗体構築物は、ＨＥＲ２に一価的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物と、それぞれがＣＨ３ドメインを含む２つの単量体Ｆｃポリペプチドを含み、１つのその単量体Ｆｃポリペプチドが抗原結合ポリペプチド構築物からの少なくとも１つのポリペプチドに融合する、二量体Ｆｃポリペプチド構築物と、を含み、その抗体構築物は、抗増殖性であり、かつ標的細胞によってインターナライズされ、その構築物は、ＨＥＲ２に結合する対応する二価抗体構築物と比較して標的細胞上で提示されるＨＥＲ２に対して結合密度およびＢｍａｘの増加（最大結合）を示し、その構築物は、その対応する二価ＨＥＲ２結合抗体構築物と比較してより高いＡＤＣＣ、より高いＡＤＣＰ、およびより高いＣＤＣのうちの少なくとも１つを示す。ある特定の実施形態において、低ＨＥＲ２発現を有する標的細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、低ＨＥＲ２発現を有する標的細胞は、乳癌細胞である。

【0276】

抗原が本明細書に提供される一価抗体構築物に結合することによる、抗原細胞外ドメインのタンパク質分解性切断を防ぐ方法もまた提供される。

【0277】

種々の刊行物が本明細書に引用され、それらの開示は参照することによりその全体が組み込まれる。

【0278】

参考文献

【実施例】

【0279】

以下の実施例は、本発明の実施を例示するために提供される。これらは、本発明の全範囲を制限することも、定義することも意図するものではない。

【0280】

実施例１：構築物の調製および発現
以下の一価抗ＨＥＲ２抗体および対照を調製し、試験した。
１．ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、一価抗ＨＥＲ２抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインは鎖ＡのＦａｂであり、Ｆｃ領域は、変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに有し、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン４である。
２．ＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、一価抗ＨＥＲ２抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインは鎖ＡのＦａｂであり、Ｆｃ領域は、変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ｂに有し、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ａに有するヘテロ二量体であり、抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン４である。
３．ＯＡ３−ｓｃＦｖ−Ｈｅｒ２、一価抗ＨＥＲ２抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインはｓｃＦｖであり、Ｆｃ領域は、変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに有し、Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン４である。
４．ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−Ｈｅｒ２、二価抗Ｈｅｒ２抗体であり、いずれのＨｅｒ２結合ドメインもｓｃＦｖ形式であり、Ｆｃ領域は、変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに有し、Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン４である。
５．ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、二価抗Ｈｅｒ２抗体であり、いずれのＨｅｒ２結合ドメインもＦａｂ形式であり、Ｆｃ領域は、変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに有し、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン４である。
６．ｗｔ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎ、対照としてＣＨＯにおいて内部生成した野生型Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ。抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン４である。
６Ａ．市販のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、対照としてＲｏｃｈｅから購入した野生型Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ。抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン４である。
７．ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２、一価抗ＨＥＲ２抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインは鎖ＡのｓｃＦｖであり、Ｆｃ領域は、変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに有し、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体である。抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン１である。
８．ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２、二価抗Ｈｅｒ２抗体であり、いずれのＨｅｒ２結合ドメインもｓｃＦｖ形式であり、Ｆｃ領域はＷＴである。抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン１である。
Ｒｏｃｈｅから購入した市販のＨｅｒｃｅｐｔｉｎを除いて、ＣＨＯにおいて発現され、実施例１および実施例１６に記載されるすべての抗体は、フコシル化抗体である。市販のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体は、ＣＨＯにより生成された抗体と比べて、より高い割合のアフコシル化を含有する。

【0281】

これらの抗体および対照を、以下のようにクローニングし、発現させた。抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を、ヒト／哺乳動物での発現のために最適化されたコドンを用いた遺伝子合成を介して構築した。Ｆａｂ配列は、既知のＨｅｒ２／ｎｅｕ結合Ａｂ（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ Ｐ１８５ Ｈｅｒ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８９，４２８５．）から生成し、Ｆｃは、ＩｇＧ１アイソタイプであった。ｓｃＦｖ配列、ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−Ｈｅｒ２およびＯＡ３−ｓｃＦｖ−Ｈｅｒ２は、既知のＨｅｒ２／ｎｅｕ結合Ａｂ（Ｆｉｎｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｔｏ ｅｉｔｈｅｒ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｒ ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：１５５０）から生成した。ｓｃＦｖ配列、ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２およびＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２は、既知のＨｅｒ２／ｎｅｕ結合Ａｂ（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｃ−ｅｒｂＢ−２ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １，７３）から生成した。

【0282】

最終的な遺伝子生成物を、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ、Ｃａｎａｄａ）にサブクローニングし、ＣＨＯ細胞において発現させた（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．＆Ｋａｍｅｎ，Ａ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，Ｅ９（２００２））。

【0283】

対数成長期（１．５〜２百万細胞／ｍＬ）に、１ｍｇ／ｍＬの２５ｋＤａのポリエチレンイミン水溶液（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＰＥＩ：ＤＮＡ比２．５：１で、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４−５１（２０１１））。ヘテロ二量体を形成するのに最適な濃度範囲を判定するために、ＤＮＡを、ヘテロ二量体の形成を可能にする重鎖Ａ（ＨＣ−Ａ）、軽鎖（ＬＣ）、および重鎖Ｂの最適なＤＮＡ比（例えば、ＨＣ−Ａ／ＨＣ−Ｂ／ＬＣ比＝２５：２５：５０％（ＯＡＡ）、５０：０：５０％（ＷＴ ｈｃｐｔｎ）、２５：２５：５０（ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）、５０：５０：０（ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２）、および５０：５０：０（ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２）で、トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を５〜６日後に採取し、培養培地を４０００ｒｐｍでの遠心分離の後に収集し、０．４５μｍのフィルタを用いて浄化した。

【0284】

実施例２：抗体の精製および分析
上述の一価抗ＨＥＲ２抗体および対照抗体を、次のように精製した。浄化した培養培地を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムに充填し、ｐＨ７．２で、１０カラム体積のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。抗体を、ｐＨ３．６で１０カラム体積のクエン酸緩衝液で溶出し、抗体を含有するプールした画分を、ｐＨ１１でＴＲＩＳにより中和した。図８Ａは、プロテインＡ精製後のｗｔ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎ、ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、およびＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。「ＦＳＡ」と記したレーンには、フルサイズ抗体（２つのＦａｂアームおよびＦｃ領域）を充填した。「無関係」と記したレーンには、無関係のタンパク質試料を充填した。抗Ｈｅｒ２ ＯＡＡが発現し、抗Ｈｅｒ２ ＦＳＡのものに相当する量および純度まで精製する。

【0285】

プロテインＡ抗体の溶出液を、ゲル濾過（ＳＥＣ）によってさらに精製した。ゲル濾過については、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬまで濃縮し、１ｍＬ／分の流量で、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣを介してＳｅｐｈａｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６００ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を、１ｍＬ／分の流量で使用した。精製された抗体に対応する画分を収集し、約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、−８０℃で保管した。精製されたタンパク質を、実施例８に記載のようにＬＣＭＳによって分析した。

【0286】

プロテインＡクロマトグラフィーおよびＳＥＣによって精製された抗体を、次の実施例に記載されるアッセイに使用した。

【0287】

実施例３：一価抗ＨＥＲ２抗体（ｓｃＦｖ）は、ＳＫＯＶ３細胞において、二価抗ＨＥＲ２抗体と比較して増加した濃度依存性結合密度（Ｂ_ｍａｘ）を示す
例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ３−ｓｃＦｖ−Ｈｅｒ２）の結合を、以下に記載されるように、Ｈｅｒ２を発現する細胞株ＳＫＯＶ３において、二価抗Ｈｅｒ２抗体（ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−Ｈｅｒ２）のものと比較した。ＳＫＯＶ細胞株は、２＋レベルでＨｅｒ２受容体を発現し、中程度の細胞当たりの密度で受容体を発現すると考えられる。この実施例で試験した一価抗体は、ｓｃＦｖである抗体結合領域を含む。

【0288】

ＳＫＯＶ３細胞の表面への試験抗体の結合を、フローサイトメトリーによって判定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１×１０^５細胞／１００μｌでＤＭＥＭ中に再懸濁させた。１００μｌの細胞懸濁液を各微小遠心分離管に添加した後、１０μｌ／管の抗体変異体を添加した。管を、４℃で２時間、ローテーターでインキュベートした。微小遠心管を、室温で２分間、２０００ＲＰＭで遠心分離し、細胞ペレットを５００μｌの培地で洗浄した。各細胞ペレットを、培地中で２μｇ／試料に希釈した１００μｌの蛍光色素標識した二次抗体に再懸濁させた。次いで、試料を、４℃で１時間、ローテーターでインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を、２０００ＲＰＭで２分間遠心分離し、培地中で洗浄した。細胞を５００μｌの培地中に再懸濁させ、５μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する管に濾過し、製造業者の説明に従ってＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。

【0289】

結果を図３ＡおよびＢに示し、抗Ｈｅｒ２ ＯＡ抗体が、抗Ｈｅｒ２ ＦＳＡ（フルサイズ抗体）と比較してより高い結合密度およびＢ_ｍａｘで、濃度依存方式でＳＫＯＶ３細胞に結合することを示す。したがって、二価抗体と同じ濃度では、より多くのＯＡ抗体分子がＨｅｒ２抗原を提示する細胞に結合し、それを装飾する。この実施例で試験したＯＡ抗Ｈｅｒ２抗体は、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含み、二価ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有するＦＳＡと比較してより高いＢ_ｍａｘで結合する。

【0290】

実施例４：一価抗ＨＥＲ２抗体（Ｆａｂ）は、細胞上のＨｅｒ２密度に依存しない二価抗体と比較してより高いＢ_ｍａｘを示す
例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）の結合を、以下に記載されるように、３つのＨｅｒ２発現細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＯＶ３、およびＳＫＢＲ３において、二価抗Ｈｅｒ２抗体（ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）および野生型Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（ｗｔ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎ）のものと比較した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、低密度（０−１＋）でＨｅｒ２を発現すると考えられ、ＳＫＯＶ３細胞株は、中密度（２＋）でＨｅｒ２を発現すると考えられ、ＳＫＢＲ３細胞株は、高密度（３＋）でＨｅｒ２を発現すると考えられる（Ｓｕｂｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：４；３５−４１およびＰｒａｎｇ ｅｔ ａ．（２００５）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：９２；３４２−３４９を参照されたい）。この実施例で試験した一価抗体は、Ｆａｂである抗体結合領域を含む。

【0291】

ＳＫＢＲ３細胞への試験抗体の結合を、実施例２に記載のように、フローサイトメトリーによって判定した。

【0292】

結果を図４Ａ〜Ｃに示し、Ｋ_ＤおよびＢ_ｍａｘの値を以下の表に示す。

【0293】

（表１）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における結合データ

【0294】

（表２）ＳＫＯＶ３細胞における結合データ

【0295】

（表３）ＳＫＢＲ３細胞における結合データ

【0296】

（表４）結合における変化倍率−ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２

【0297】

表４は、１＋、２＋、および３＋のＨｅｒ２受容体密度を有する細胞株に対する飽和状態での結合について、ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２とＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２との間のＫ_ＤおよびＢ_ｍａｘの変化倍率を要約する。ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２は、試験したすべての細胞株にわたって、ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２と対比して、Ｂ_ｍａｘに一貫したおおよそ１．４倍の増加を有し、Ｋ_Ｄに３倍の増加を有した。

【0298】

図４は、一価抗ＨＥＲ２抗体が、二価抗体結合が飽和となる濃度において、より高い結合密度およびＢ_ｍａｘを有し、ＯＡ結合密度の増加が細胞上のＨｅｒ２の密度に依存しないことを示す。抗Ｈｅｒ２ ＯＡＡ（一本アーム抗体）は、低（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、中（ＳＫＯＶ３）、および高（ＳＫＢｒ３）Ｈｅｒ２密度を示す細胞において、抗Ｈｅｒ２ ＦＳＡと比較してより高いＢｍａｘを有する。

【0299】

Ｆａｂ抗原結合ドメインを有する抗Ｈｅｒ２ ＯＡＡは、二価Ｆａｂ抗原結合ドメインを有するＦＳＡと比較してより高いＢｍａｘで結合する。

【0300】

実施例５：一価抗ＨＥＲ２抗体は、二価抗ＨＥＲ２抗体と比較して増加したＡＤＣＣを示す
ｗｔ ＦＳＡ ＨｃｐｔｎおよびＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２と比較した、ＡＤＣＣを媒介する例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）の能力を、ＳＫＢＲ３細胞において次のように判定した。

【0301】

概要：標的細胞を、試験抗体（４５μｇ／ｍＬから１０倍下降濃度）で３０分間予めインキュベートした後、エフェクター細胞を、５：１のエフェクター／標的細胞比で添加し、３７℃／５％ＣＯ_２インキュベータにおいて、さらに６時間インキュベーションを継続した。試料を、４５ｕｇ／ｍｌから１０倍下降の８つの濃度で試験し、一方で内部対照Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（ｗｔ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎ）は、１０μｇ／ｍｌから１０倍下降で滴定した。ＬＤＨ放出を、ＬＤＨアッセイキットを用いて測定した。

【0302】

用量応答研究を、事前に最適化したエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比（５：１）で、種々の濃度の試料を用いて行った。半最大有効濃度（ＥＣ_５０）値を、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍによるＳｉｇｍｏｉｄａｌ用量応答非線形回帰適合を用いて分析した。

【0303】

細胞を、３７℃／５％ＣＯ_２でマッコイ５Ａ完全培地中に維持し、ＡＴＣＣからのプロトコルに従って、１０％ＦＢＳを補充した好適な培地で定期的に継代培養した。Ｐ１０よりも少ない継代数の細胞を、このアッセイに使用した。試料を、アッセイで使用する前に、１％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したフェノールレッド不含ＭＥＭ培地で０．３〜３００ｎＭの濃度に希釈した。

【0304】

ＡＤＣＣアッセイ
ＳＫＢＲ３標的細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−３０）を、８００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって採取した。細胞をアッセイ培地で一度洗浄し、遠心分離を行い、ペレットより上の培地を完全に除去した。細胞を、アッセイ培地で穏やかに懸濁させて、単一細胞溶液を作製した。ＳＫＢＲ３細胞の数を、４×細胞ストック（５０μｌのアッセイ培地中１０，０００細胞）に調節した。試験抗体を、次いで、上に記載された所望の濃度まで希釈した。

【0305】

ＳＫＢＲ３標的細胞を、次のようにアッセイプレートに播種した。５０μｌの４×標的細胞ストックおよび５０μｌの４×試料希釈剤を、９６ウェルのアッセイプレートのウェルに添加し、プレートを、室温で３０分間細胞培養インキュベータにおいてインキュベートした。エフェクター細胞（ＮＫ９２／ＦｃＲγ３ａ（１５８Ｖ／Ｖ）、１００μｌ、Ｅ／Ｔ＝５：１、すなわち、１ウェル当たり５０，０００エフェクター細胞）を添加して反応を開始し、交差振盪によって穏やかに混合した。プレートを、インキュベータにおいて３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。

【0306】

Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、エフェクター細胞を有さない細胞対照および抗体に１％の最終濃度で添加して、標的細胞を分解し、これらの対照は、最大溶解対照として機能した。ＡＤＣＣアッセイ緩衝液（９８％フェノールレッド不含ＭＥＭ培地、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および１％ＦＢＳ）を、エフェクター細胞を有さない細胞対照および抗体に添加し、これは、最小ＬＤＨ放出対照として機能した。抗体の存在なしでエフェクター細胞とともにインキュベートした標的細胞は、両方の細胞を一緒にインキュベートした場合、非特異的ＬＤＨ放出のバックグラウンド対照として設定した。細胞生存率を、ＬＤＨキット（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６４４７９３００１）で分析した。吸光度データを、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３においてＯＤ４９２ｎｍおよびＯＤ６５０ｎｍで読み取った。

【0307】

データ分析
細胞溶解のパーセンテージを、以下の式に従って計算した：
細胞溶解の割合（％）＝１００＊（実験データ−（Ｅ＋Ｔ））／（最大放出−最小放出）。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ（ｖ４．０）によって提示し、分析した。

【0308】

用量応答曲線を図５に示し、試験した抗体のＥＣ_５０および最大溶解度を以下の表５に示す。

【0309】

（表５）

【0310】

結果は、一価非対称抗Ｈｅｒ２抗体ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２が、濃度依存性溶解および二価抗体対照と比較してより高い最大溶解度を示すことを表す。一価非対称抗Ｈｅｒ２抗体ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２は、二価抗体対照（ＦＳＡ）と比較してより高い最大ＮＫ細胞媒介性の標的細胞溶解度（％）を示す。

【0311】

実施例６：一価抗ＨＥＲ２抗体は、二価抗ＨＥＲ２抗体と比較して増加したＣＤＣを示す
二価抗体と比較した、ＳＫＢＲ３細胞のＣＤＣを媒介する一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を、次のように判定した。

【0312】

ＳＫＢＲ−３細胞を、Ｔ１５０細胞培養フラスコにおいて、１０％ウシ胎仔血清を含む２５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ−１２中に２．５×１０６生細胞で播種した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２でのインキュベーションによって予め培養した。

【0313】

５日間のＳＫＢＲ３の予め培養した後、トリプシン処理し、細胞を採取した。細胞懸濁液を分離フィルタ上ですすぎ、アッセイ結果を歪める可能性のある細胞集団を回避した。細胞を、１ｍＬ当たり１×１０^６生細胞でＴ２５懸濁細胞培養フラスコに播種した。抗ＣＩＰＳ（補体阻害因子）抗体（例えば、ラット抗ＣＤ５９およびマウス抗ＣＤ５５）を、５×１０^６の生細胞当たり１０μｇの抗体で細胞懸濁液に添加した。細胞懸濁液を、４５分間、５％ＣＯ２で抗ＣＩＰ抗体とともにインキュベートした。

【0314】

試験抗Ｈｅｒ２抗体の希釈物を調製し、白色の発光９６ウェルプレートに添加した。プレートには、全細胞溶解のための対照と自然発生溶解のための対照とが含まれた。

【0315】

ＳＫＢＲ３細胞を懸濁フラスコから採取し、細胞密度および生存率を判定した。細胞懸濁液を、４．０×１０^５生細胞／ｍＬの濃度で生成した。この懸濁液５０μＬを、必要に応じて白色の発光９６ウェルプレートのウェルに播種した。プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。１０μＬの血清をすべてのウェルに添加し、プレートを３７℃および５％ＣＯ２で３時間半インキュベートした。

【0316】

全細胞溶解を、次のように誘発した。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、２ｍＬのアッセイ緩衝液を３３．０μＬのジギトニンと混合した。この溶液１０μＬを、全細胞溶解対照の各ウェルに添加した。プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。

【0317】

読み出しおよび分析を、次のように行った。凍結乾燥させた基質を、ＣｙｔｏＴｏｘ Ｇｌｏキットの説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って５ｍＬのアッセイ緩衝液で再構築した。この溶液５０μＬを、プレートの７２ウェルすべてに添加した。プレートを室温で１５分間インキュベートし、発光強度をＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００プレートリーダーを使用して判定した。

【0318】

特異的細胞溶解を次のように計算した：
特異的細胞溶解度［％］＝［ＭＦＩ（試料）−ＭＦＩ（自然発生）］／［ＭＦＩ（全）−ＭＦＩ（自然発生）］×１００。

【0319】

結果を図６Ａ〜Ｃに示し、ＥＣ_５０、Ｒ２、および最大溶解度を以下の表６に示す。

【0320】

（表６）

【0321】

これらの結果は、試験した一価抗体が、同じ試験濃度において、二価抗体と比較して増加した濃度依存性およびより高いＣＤＣ効果を示すことを表す。抗Ｈｅｒ２ ＯＡＡの投与は、抗Ｈｅｒ２ ＦＳＡと比較して、標的細胞に対するより高い補体依存性細胞傷害性をもたらす。

【0322】

実施例７：一価抗ＨＥＲ２抗体は、二価抗ＨＥＲ２抗体と比較して増加したＡＤＣＰを示す
二価抗体と比較した、ＳＫＢＲ３細胞のＡＤＣＰを媒介する一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を、次のように判定した。

【0323】

ＡＤＣＰプロトコル
概要：このプロトコルは、抗体の連続希釈物とともに事前にインキュベートした、ＰＫＨ２６で標識化した標的細胞で共培養した、インビトロ分化マクロファージを使用した。２４時間インキュベートした後、マクロファージをＡＰＣ（アロフィコシアニン）結合型抗ＣＤ４５および／またはＣＤ１１ｂ抗体で染色した。続いて、標的細胞の食作用をフローサイトメトリーによって分析した。

【0324】

本方法は、次のように実行した。ＰＢＭＣを、勾配密度の遠心分離によって健常ヒトドナーの白血球分離材料から調製した。ＣＤ１４陽性細胞を、磁気ビーズを使用して分離し、細胞培養培地中に２×１０^６の生細胞／ｍＬで播種した。マクロファージの分化を、５００Ｕ／ｍＬの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の添加によって誘発した。細胞は合計７日間培養し、ＧＭ−ＣＳＦは３日目に添加した。

【0325】

細胞のマーカー発現を、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１４、および抗ＣＤ１６抗体を用いてフローサイトメトリー分析によって調べた。

【0326】

使用した標的細胞株はＳＫＢＲ３であった。ＨＥＲ−２の存在を、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）およびＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した。標的細胞をＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。標的細胞を、試験抗Ｈｅｒ２抗体の１：６希釈物によりオプソニン化し（６０分間）、１：１の比率でマクロファージとともに２２時間インキュベートした。

【0327】

単球を、ＡＰＣ結合型抗ＣＤ４５および抗ＣＤ１１ｂ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４５陽性細胞による食作用を、ＰＫＨ２６蛍光強度によって判定した。

【0328】

プレート当たりの対照には次のものが含まれた（二連で）：ＰＫＨ２６染色ＳＫ−ＢＲ−３細胞のみの標的細胞対照、単球のみのエフェクター細胞対照、ならびに非特異的ＩｇＧ１抗体によるエフェクターおよび標的細胞対照。（プレート特異的バックグラウンド除去＝非特異的抗体とともにインキュベートしたエフェクターおよび標的細胞対照）。

【0329】

抗体依存性食作用のパーセンテージを、１）バックグラウンド除去した標的細胞対照の平均蛍光強度を１００％に設定すること、ならびに２）エフェクターおよび標的細胞アイソタイプ対照の平均蛍光強度を０％に設定することによって、判定した。

【0330】

次の等式を、抗体依存性食作用のパーセンテージの計算に使用した。

ＢＳＭＦＩ＝バックグラウンド除去した平均蛍光強度

【0331】

この実験の結果を図７Ａ〜Ｃに示し、これは、試験した一価抗ＨＥＲ２抗体が二価抗Ｈｅｒ２抗体と比較して増加したＡＤＣＰを示したことを示す。図５は、（Ａ）ドナー１の代表的なＡＤＣＰ（９１％ ＣＤ１６＋細胞）、（Ｂ）ドナー１の研究２からの代表的なＡＤＣＰデータ（４５％ ＣＤ１６＋細胞）、（Ｃ）ＣＤ１６＋細胞／ドナーの割合に基づいて、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の変化倍率をＷＴ−ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎに対して比較した全データプロット（研究１および２の全ドナー）を示す。抗Ｈｅｒ２ ＯＡＡの投与は、エフェクター細胞としてインビトロで分化させたマクロファージのより高い割合の抗体依存性細胞食作用（ＳＫＢｒ３標的細胞）を媒介し、ＡＤＣＰ効果もまた、エフェクター：標的細胞の割合が関係し、図７Ｃにおいて、より多いエフェクターマクロファージ数ではより高い効果が観測される。

【0332】

表７は、図７Ａのプロットから得られたデータを提供する。

【0333】

（表７）ドナー１および２の平均（ドナー１は９１％、ドナー２は９３％のＣＤ１６＋）

【0334】

表８および９は、図７Ｂのプロットから得られたデータを提供する

【0335】

（表８）ドナー１（４３％ ＣＤ１６＋濃縮）

【0336】

（表９）ドナー２（１４％ ＣＤ１６＋濃縮）

【0337】

実施例８：ヘテロ二量体Ｆｃ領域を有する一価抗ＨＥＲ２抗体の精製および収率
一価のＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の精製および収率を、実施例２に記載のように、プロテインＡおよびＳＥＣ精製の後にＬＣＭＳによって試験した。

【0338】

ヘテロ二量体純度のＬＣＭＳ分析
例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の純度を、標準的条件下でＬＣＭＳを使用して判定した。抗体を、ＬＣ−ＭＳに充填する前にＰＮＧａｓＦで脱グリコシル化した。液体クロマトグラフィーは、次の条件下においてＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣで行った。
流量：分離ポストカラムでの１ｍＬ／分〜ＭＳでの１００ｕＬ／分
溶媒：Ａ＝ｄｄＨ_２Ｏ中０．１％ギ酸、Ｂ＝６５％アセトニトリル、２５％ＴＨＦ、９．９％ｄｄＨ_２Ｏ、０．１％ギ酸
カラム：２．１×３０ｍｍ ＰｏｒｏｓＲ２
カラム温度：８０℃、溶媒も事前に加熱
勾配：２０％Ｂ（０〜３分）、２０〜９０％Ｂ（３〜６分）、９０〜２０％Ｂ（６〜７分）、２０％Ｂ（７〜９分）

【0339】

質量分析法（ＭＳ）を、続いて、次の条件下においてＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計で実行した。
イオン化の方法：イオンマックスエレクトロスプレー
較正および調整方法：ＣｓＩの２ｍｇ／ｍＬ溶液を、１０μＬ／分の流量で注入する。Ｏｒｂｉｔｒａｐを、次いで、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｔｕｎｅ機能を使用してｍ／ｚ ２２１１で調整する（観測される全体的なＣｓＩイオン範囲：１６９０〜２８００）。
コーン電圧：４０Ｖ
チューブレンズ：１１５Ｖ
ＦＴ分解能：７，５００
スキャン範囲ｍ／ｚ４００〜４０００
スキャン遅延：１．５分

【0340】

データの分子量プロファイルを、ＴｈｅｒｍｏのＰｒｏｍａｓｓデコンボリューションソフトウェアを用いて生成した。

【0341】

ＬＣ−ＭＳ結果を図８Ｂ〜Ｄに示し、図８Ｂは、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＬＣＭＳ分析を示し、図８Ｃは、ＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＬＣＭＳ分析を示し、図８Ｄは、約０．８％の２本の軽鎖＋１本の短い重鎖（７２，８９８Ｄａ）、約０．７％の短い重鎖単独（２５，９０７Ｄａ）で検出された混入物質を示すＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＬＣＭＳスペクトルの拡大表示である。図８Ｂに関して、一本アームのヘテロ二量体の計算されたＭＷは９８，６５３Ｄａであり（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２またはＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）、一本アームのホモ二量体の計算されたＭＷは５２，１５９Ｄａであり（１つの重鎖のみ）、全長鎖のホモ二量体の計算されたＭＷは１４５，１４７Ｄａである（２対のフルサイズ重鎖、Ａ／Ａ（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の場合）またはＢ／Ｂ（ＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の場合）。

【0342】

図８Ｃに関して、一本アームのヘテロ二量体の計算されたＭＷは９８，６５３Ｄａであり、一本アームのホモ二量体の計算されたＭＷは５１，８１５Ｄａであり、全長鎖ホモ二量体の計算されたＭＷは１４５，４９２Ｄａであり、一本の短いアームおよび２本の軽鎖の計算されたＭＷは７２，８９８Ｄａであり、短い重鎖単独の計算されたＭＷは２５，９０７Ｄａである。

【0343】

要約すると、図８Ｂ〜Ｃは、ＬＣＭＳ分析によって判定される、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィー後の純度が９５％を上回る、精製された一価抗ＨＥＲ２抗体の収率を示す。ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の収率は、ＬＣＭＳ分析によって判定すると、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーの後、ヘテロ二量体１００％であった。ＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の収率は、９８．５％を上回るヘテロ二量体であり、２本の軽鎖および１本の短い重鎖が０．８％、ならびに短い重鎖種単独が０．７％であった。

【0344】

（表１０）ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の精製データの要約

【0345】

実施例９：一価抗ＨＥＲ２抗体は、インターナライズされ、標的細胞の成長を阻害する
ＳＫＢＲ３細胞によってインターナライズされる一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を、次のように試験した。

【0346】

ＳＫＢＲ３細胞を、２０００〜４０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレートにＤＭＥＭ中１００μｌ／ウェルで蒔いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。

【0347】

細胞傷害性研究／成長阻害アッセイ
試験抗体を培地に希釈し、１０μｌ／ウェルで三連に細胞に添加した。プレートを３７℃で３日間インキュベートした。細胞生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ ＃ＤＡＬ１１００）を用いて測定した。１０μｌ／のａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）を、ウェル毎に添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。吸光度を５３０／５８０ｎｍで読み取った。

【0348】

インターナリゼーション研究
抗ヒトサポリン結合型二次抗体（Ｆａｂ−Ｚａｐヒト、カタログ番号ＩＴ−５１）を、製造業者のプロトコル（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って細胞に添加する前に当モル濃度で一次ヒト抗体とともにインキュベートした。細胞培養上清を除去することなく、２５μｌを１時間で添加した。プレートを水道水で４回洗浄し、室温で空気乾燥させた。１００μｌの０．０５７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＲＢ（スルホローダミンＢ）を、３０分間各ウェルに添加した。プレートを１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）酢酸で４回迅速にすすぎ、室温で空気乾燥させた。１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基溶液（ｐＨ１０．５）を添加し、プレートを５分間振盪させた。ＯＤを、マイクロプレートリーダーで５１０ｎｍにおいて測定した。

【0349】

図９ＡおよびＢは、インターナリゼーション実験の結果を示す。図９ａは、試験した抗体のインターナリゼーションの割合を示し、一方で図９ｂは、対照と比べた効果の割合としてプロットしたデータを示す。このデータは、試験した一価抗ＨＥＲ２抗体が、標的細胞によってインターナライズされることを示す。抗Ｈｅｒ２ ＯＡＡおよび抗Ｈｅｒ２ ＦＳＡは、１０ｎＭで６０％に等しいインターナリゼーションの割合（％）を有する。

【0350】

表１１は、データの要約を示す。

【0351】

（表１１）インターナリゼーションデータ

【0352】

図１０は、細胞成長アッセイの結果を示す。１ｎＭで４５％の抗Ｈｅｒ２ ＦＳＡの最大成長阻害と比較して、一価抗ＨＥＲ２抗体は３０ｎＭで３５％の（ＳＫＢＲ３標的細胞の）最大成長阻害を示す。表１２はデータの要約を提供する。

【0353】

（表１２）

【0354】

（ａ）実施例１０：一価抗ＨＥＲ２抗体は、等しいＫ_ＤでＦｃＲｎに結合する
ＦｃＲｎに結合する一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を、次のようにＳＰＲによって試験した。

【0355】

ＦｃＲｎは、約３０００ＲＵまで、標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ結合を介してＢｉｏＲａｄ ＧＬＭチップに固定化した。抗体変異体を、５０ｕｌ／分の流量で１２０秒間注入し、３００秒間解離させた。１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭの濃度系列、および二重参照用のブランク緩衝液。センサグラムを、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｍａｎａｇｅｒにおいて平衡適合モデルを用いて分析した。

【0356】

結果を図１１Ａ（ｗｔ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎ）、９Ｂ（ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）、および１１Ｃ（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）に示す。これらの図は、一価抗ＨＥＲ２抗体および二価抗Ｈｅｒ２抗体が、同等のＫ_ＤでＦｃＲｎに結合することを示す。結果の要約を、以下の表１３に見出すことができる。

【0357】

（表１３）

【0358】

実施例１１：一価抗ＨＥＲ２抗体（ｓｃＦｖ）は、ＳＫＯＶ３細胞において、二価抗ＨＥＲ２抗体と比較して増加した濃度依存性結合密度（Ｂ_ｍａｘ）を示す
別の例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２）の結合を、以下に記載のように、対応する二価抗Ｈｅｒ２抗体（ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２）のもの、およびＨｅｒ２を発現する細胞株であるＳＫＯＶ３における他の一価抗ＨＥＲ２抗体のものと比較した。他の箇所に記載されるように、ＳＫＯＶ細胞株は、２＋レベルでＨｅｒ２受容体を発現し、これは、中程度の細胞当たりの密度であると考えられる。結合アッセイを、実施例３に記載のように実行した。

【0359】

結果を図１２に示し、表１４および１５に要約する。結果は、一価抗ＨＥＲ２抗体ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２が、二価ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２と比較してより高いＢ_ｍａｘを有すること、およびＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２が、当モル濃度でＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２と対比してより高いＢｍａｘを有することを示す。

【0360】

（表１４）試験した抗体の結合特性の要約

【0361】

（表１５）試験した抗体の結合における変化倍率

【0362】

実施例１２：一価抗ＨＥＲ２抗体は、トリプルネガティブおよびＨｅｒ２ １＋の細胞株において、増加したＡＤＣＣを示す
ｗｔ ＦＳＡ ＨｃｐｔｎおよびＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２と比較した、ＡＤＣＣを媒介する例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）の能力を、実施例５に記載のプロトコルに従って、トリプルネガティブ細胞株ＭＤＡ−ＭＤ−２３１およびＨｅｒ２ １＋細胞株ＭＣＦ７において判定した。ＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞を、ＤＭＥＭ培地で成長させ、一方でＭＣＦ７細胞は、イーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ番号１１０９５）で成長させ、いずれの培地も、０．０１ｍｇ／ｍｌのヒト組み換えインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１００９９）、および１％非必須アミノ酸Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０）が補充されていた。

【0363】

用量応答曲線を図２１Ａ（ＭＣＦ７細胞）および図２１Ｂ（ＭＤＡ−ＭＤ−２３１）に示し、抗体のＥＣ_５０および最大溶解度を表１６および１７に示す。

【0364】

（表１６）ＥＣ_５０および最大溶解度（ＭＣＦ７細胞）

【0365】

これらの結果は、ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＥＣ_５０の変化倍率は１０．３（増加）であったが、最大溶解度の変化倍率は１．３（増加）であったことを示す。

【0366】

（表１７）ＥＣ_５０および最大溶解度（ＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞）

【0367】

ＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞におけるＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＥＣ_５０の変化倍率は１．８（増加）であったが、最大溶解度の増加倍率は、１．５（増加）であった。

【0368】

実施例１３：一価抗ＨＥＲ２抗体は、ＦＳＡと比較してより広範な分布（Ｖｓｓ）およびｔ１／２βを有する
例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）の薬物動態（ＰＫ）を試験し、対照二価抗Ｈｅｒ２抗体（ｗｔ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎ）のものと比較した。これらの研究は、以下に記載のように実行した
系統／性別：ＣＤ−１ヌード／雄性
処置時の動物の標的体重：０．０２５ｋｇ
動物数：１２
体重：投与量の計算のため処置の前日に記録。
臨床兆候の観察：注射後最大２時間、および１日目〜１１日目には１日２回。
１日目に、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、試験物質を尾静脈への静脈内注射によってマウスに投与した。おおよそ０．０６０ｍＬの血液試料を、以下の表のように、投与後最大２４０時間までの選択された時点で（１つの時点につき３匹の動物）顎下腺または伏在静脈から採取した。処置前の血清試料（Ｐｒｅ−Ｒｘ）を、ナイーブ動物から得た。血液試料は、室温で１５〜３０分間凝固させた。血液試料を、２７００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離し、血清を−８０℃で保管した。最後の出血については、血液を心穿刺によって採取した。
用量レベル：１０ｍｇ／ｋｇ

【0369】

血清濃度をＥＬＩＳＡによって判定した。簡単に言うと、Ｈｅｒ２を、ＰＢＳ中０．５ｕｇ／ｍｌで、ＨｉｇｈＢｉｎｄ ３８４プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３７００）のプレートにおいて２５ｕｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、室温で１〜２時間、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、８０ｕｌ／ウェルで遮断した。抗体血清および標準物質の希釈物を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで調製した。遮断後、遮断物を除去し、抗体希釈物をウェルに移した。ＥＬＩＳＡプレートを１０００ｇで３０秒間遠心分離して気泡を除去し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０および２５ｕｌ／ウェルのＡＰ結合型ヤギ抗ヒトＩｇＧで３回洗浄し、Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中１：５０００希釈で）、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、２５ｕｌ／ウェルのＡＰ基質（５．５ｍＬのｐＮＰＰ緩衝液中１錠）を添加した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーを使用して、ＯＤを、異なる時間間隔（０〜３０分間）で４０５ｎｍにおいて読み取った。反応を、ＯＤ４０５が２．２に達する前に、５ｕＬの３Ｎ ＮａＯＨを添加して停止させた。最後の読み取りを行う前に、プレートを１０００ｇで２分間遠心分離した。

【0370】

血清濃度を、ＷｉｎｎｏｎＬｉｎソフトウェアバージョン５．３を使用して分析して、ＰＫパラメーターを得た。血清試料は、２セットの複数希釈物において分析し、有効範囲内の結果を許容し平均化した。ＥＬＩＳＡ分析後の定量化下限（ＬＬＯＱ）に満たない血清濃度値は、平均血清濃度の計算について０とみなした。ＥＬＩＳＡアッセイから得られたＬＬＯＱは、おおよそ１．２μｇ／ｍＬであった。

【0371】

結果を図２２に示し、試験したＰＫパラメーターを表１８に示す。

【0372】

（表１８）ＰＫパラメーター

【0373】

図２２に示される結果は、試験した一価抗ＨＥＲ２抗体が、ヒトでの投与のために適当なＰＫパラメーターを有することを示す。とりわけ、一価抗ＨＥＲ２抗体は、より高いＶｓｓ（安定な状態での量）を有し、抗体がより多くの量で分布し、組織内へのより大きな分布を有することを示す。

【0374】

実施例１４：一価抗ＨＥＲ２抗体処置は、ＳＫＢＲ３細胞においてＥｒｂ２およびＭＡＰＫのリン酸化を低減させる
シグナル伝達分子のリン酸化に対する、例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）によるＳＫＢｒ３の処置の効果を、次のように判定した。

【0375】

ウエスタン免疫ブロットによるリン酸化の検出のために、１２ウェルプレートに、血清含有培地中５０，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃でインキュベートした。２４時間後に培地を置き換え、処置用抗体を、１００ｎＭの最終濃度でウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。抗体をインキュベートした後、適切なウェルを、１ｎＭで１５分間、培地中のｒｈＨＲＧβ１で処置を行った。プレートを氷上に設置することによって処置を停止させ、培地を吸引し、氷冷ｄＰＢＳでウェルを洗浄した。溶解−Ｍ緩衝液を添加し（５０μｌ／ウェル）、穏やかに振盪させながら５分間室温でインキュベートした。

【0376】

細胞溶解物を１４，０００ｇで１０分間遠心分離し、細胞溶解物を除去し、還元または非還元緩衝液中に保管し、５分間沸騰させた（試料の還元）。ＢＣＡタンパク質の判定を、製造業者の説明に従って、残りの粗製細胞溶解物を用いて完了させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、３μｇ／ウェルで充填し、イモビロン−Ｐ ＰＶＤＦ膜上に移した。膜をｚｅｎｏｐｕｒｅ水で洗浄し、メタノール中に２分間浸漬させ、一晩（または室温で１時間）空気乾燥させた。膜を、適切な一次抗体（マウス抗ＰＹ２０ ＺＹＭＥＤ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ウサギ抗ＥｒｂＢ２；ウサギ抗全Ａｋｔ；ウサギ抗Ｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）；ウサギ抗ｐ４４／ｐ４２；ウサギ抗Ｐ−ｐ４４／ｐ４２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。膜を、ＴＢＳ−Ｔ中で４×２０分間洗浄し、二次抗体（ＨＲＰ結合型ヤギ抗マウスＩｇＧ；ＨＲＰ結合型ロバ抗ウサギＩｇＧ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに、室温で３０分間、穏やかに旋回振盪させながらインキュベートした。膜をＴＢＳ−Ｔ中で４×２０分間洗浄し、ＥＣＬ基質の添加前に水ですすいだ。フィルムを種々の時点で露光させ、ＡＦＰ ｍｉｎｉ−ｍｅｄ ９０で現像した。

【0377】

ｐ−ＡＫＴの検出については、ＰａｔｈＳｃａｎ Ｐｈｏｓｐｏ−ＡＫＴ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号７２５２）を使用し、プロトコルは、製造業者の説明に詳述されるものに従った。

【0378】

図２３ＡおよびＢは、ＥｒｂＢ、ＭＡＰＫ、およびＡｋｔのリン酸化に関する結果を示す。これらの結果は、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２での処置が、ｈＩｇＧ対照と比べて総ｐ−ＭＡＰｋおよびｐ−ＥｒｂＢ２の量を低減させることを示す。試験した３つの抗Ｈｅｒ２抗体の中でも、最も大きなｐ−ＭＡＰｋおよびｐ−ＥｒｂＢ２の低減は、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２で見られる。ＥＬＩＳＡによって測定されるＡｋｔのリン酸化の度合いの定量的評価を、図２４ＡおよびＢに示す。これらの結果は、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２処置が、未処置対照（「ＣＴＬ」）およびｈＩｇＧ対照と比べて総ｐ−ＡＫＴの量を低減させることを示す。試験した３つの抗Ｈｅｒ２抗体の中でも、最も大きなｐ−ＡＫＴの低減は、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２で見られる。

【0379】

実施例１５：一価抗ＨＥＲ２抗体は、二価抗Ｈｅｒ２抗体と比較して増加したＣＤ１６ａおよびＣＤ３２ａ／ｂへの結合を示す
ＦｃγＲ ＣＤ１６ａおよびＣＤ３２ａ／ｂに結合する例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて試験した。

【0380】

表面プラズモン共鳴分析：抗体Ｆｃに対するＦｃγＲの親和性を、ＢＩＯ−ＲＡＤからのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６システムを使用してＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって測定した。緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ６．８）中のＨＥＲ−２を、３０００ＲＵまで、アミン結合を通じてＣＭ５チップに固定化した。抗ＨＥＲ２ Ｆ（ａｂ）２を含有する抗体形式のＦｃ変異体を、３００ＲＵまでＨＥＲ−２表面に固定化した。泳動緩衝液および界面活性剤を、ｐＨ６．８に維持した。精製された検体ＦｃＲを、この泳動緩衝液中に希釈し、２０〜３０ｍｕｌ／分の流量で２分間注入した後、さらに４分間解離させた。各抗体の５つの２倍希釈物（２０ｎＭで開始）を、三連で分析した。センサグラムを、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに全体的に適合させた。すべての実験は室温で行った。

【0381】

ＳＰＲ結合研究の結果を表１９に示す。

【0382】

（表１９）一価抗ＨＥＲ２抗体の結合能力

【0383】

表１９の結果は、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２が、より多くのＦｃ領域が抗原（Ｈｅｒ２）固定化抗体への結合に利用可能であるため、ＦｃγＲｓへの結合に関して対照ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２と比較してより高いＲｍａｘを示すことを表す。さらに、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２は、１．４〜２．０倍に増加したＣＤ３２に対する親和性を示す。

【0384】

実施例１６：追加の構築物の調製および発現
実施例１に記載される構築物１〜８に加えて、以下の追加の一価抗ＨＥＲ２抗体および対照を調製し、試験した。
９．ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、一価抗ＨＥＲ２抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインは鎖ＡのＦａｂであり、Ｆｃ領域は、変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに有し、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン２である。
１０．ＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、一価抗ＨＥＲ２抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインは鎖ＢのＦａｂであり、Ｆｃ領域が、変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに有し、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン２である。
１１．ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｐｅｒｔ、二価抗Ｈｅｒ２抗体であり、いずれのＨｅｒ２結合ドメインもＦａｂ形式のペルツズマブであり、Ｆｃ領域は、変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに有し、Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体である。抗原結合ドメインのエピトープは、Ｈｅｒ２のドメイン２である。

【0385】

これらの構築物を、実施例１に記載の方法に従って調製し、発現させた。

【0386】

実施例１７：一価抗ＨＥＲ２抗体ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の精製
これらの構築物を、実施例１に記載の方法に従って調製し、発現させた。図３０Ａは、プロテインＡ精製後のＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の純度を示す。図３０Ｂは、ＬＣ／ＭＳによる５つのヘテロ二量体純度分析を示し、これは、ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のいずれも、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィー後に９９％を超える純度に精製され得ることを示す。ヘテロ二量体の純度は、実施例８に記載される方法に従って行った。

【0387】

実施例１８：一価抗ＨＥＲ２抗体（Ｆａｂ）は、ＪＩＭＴ−１およびＢＴ−４７４細胞において、ＦＳＡと対比してより高いＢ_ｍａｘを有する
例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）の結合を、Ｈｅｒ２を発現する細胞株であるＪＩＭＴ−１およびＢＴ−４７４において、これらの抗Ｈｅｒ２抗体の二価形式のもの（ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔ）と比較した。これらの細胞株は、候補抗癌薬の効果を試験するために、異種移植モデルにおいて使用される。ＪＩＭＴ−１細胞株は、２＋レベルでＨｅｒ２受容体を発現し、したがって、中程度の細胞当たりの密度で受容体を発現すると考えられる。ＢＴ−４７４細胞株は、ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抵抗性細胞株であり、３＋レベルでＨｅｒ２受容体を発現し、したがって、高い細胞当たりの密度で受容体を発現すると考えられる。この実施例で試験した一価抗体は、Ｆａｂである抗体結合領域を含む。これらの細胞の表面に結合するこれらの抗体の能力を、実施例３に記載のフローサイトメトリーによって判定したが、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を、ＪＩＭＴ−１細胞およびＢＴ−４７４細胞の培養に使用したことを除く。

【0388】

結果を図２５Ａ（ＪＩＭＴ−１細胞）および図２５Ｂ（ＢＴ−４７４細胞）に示し、Ｋ_ＤおよびＢ_ｍａｘの値は、以下の表２０および２１に示す。

【0389】

（表２０）ＪＩＭＴ−１細胞での結合データ

【0390】

図２５Ａおよび表２０に示されるデータは、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＫ_Ｄにおける変化倍率が２．５７（増加）であり、一方でＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＢ_ｍａｘにおける変化倍率が１．４３（増加）であることを示す。ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔのＫ_Ｄにおける変化倍率は２．２６（増加）であり、一方でＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔのＢ_ｍａｘにおける変化倍率は１．４６（増加）である。

【0391】

（表２１）ＢＴ−４７４細胞の結合データ

【0392】

図２５Ｂおよび表２１に示されるデータは、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＫ_Ｄにおける変化倍率は６．３５（増加）であり、一方でＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２のＢ_ｍａｘにおける変化倍率は１．５２（増加）であることを示す。ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔのＫ_Ｄにおける変化倍率は４．６６（増加）であり、一方でＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２対ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔのＢ_ｍａｘにおける変化倍率は１．４５（増加）である。

【0393】

要約すると、この実施例において試験したいずれの細胞型においても、試験した一価抗Ｈｅｒ２抗体は、関連する二価対照抗体と比較してより高いＢ_ｍａｘを有する。これらの結果はまた、ペルツズマブ（ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）に基づく一価抗ＨＥＲ２抗体が、ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）に基づくものよりも高いＢ_ｍａｘを有することを示す。

【0394】

実施例１９：一価抗ＨＥＲ２抗体は、ＢＴ−４７４細胞の成長を阻害する
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で成長させた、ＢＴ−４７４細胞およびＪＩＭＴ−１細胞の成長を阻害する一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を、実施例９に記載される方法を使用して試験した。

【0395】

ＢＴ−４７４細胞の結果を図２６ＡおよびＢに示し、試験した抗体の最大成長阻害の割合（％）を表２２に示す。

【0396】

（表２２）最大成長阻害

【0397】

試験した抗体（ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、ｗｔ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎ、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、ＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、ＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、ＦＳＡ−Ｆａｂ−ｐｅｒｔ、または市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）のいずれも、ＪＩＭＴ−１細胞の成長を阻害することができなかった（データは示されない）。

【0398】

実施例２０：一価抗ＨＥＲ２抗体は、インターナライズされる
ＢＴ−４７４細胞によってインターナライズされる例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体の能力を、実施例９で使用した「間接的な」方法とは異なる「直接的な」方法を使用して判定した。

【0399】

直接的なインターナリゼーション方法は、Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ，ｂｉｖａｌｅｎｃｙ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００８）５７：１８７９−１８９０に詳述されるプロトコルに従った。具体的には、抗体を、製造業者の説明に従ってＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質標識化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０２３５）を使用して標識化した。

【0400】

インターナリゼーションアッセイについては、１２ウェルプレートに、１×１０^５細胞／ウェルで播種し、３７℃＋５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日に、標識化した抗体を、１０および２００ｎＭでＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に添加し、３７℃＋５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。暗所条件下で、培地を吸引し、ウェルを２×５００μＬのＰＢＳで洗浄した。細胞を採取するために、細胞解離緩衝液を３７℃で添加した（２５０μＬ）。細胞をペレット状にし、５０μｇ／ｍＬで抗Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、ウサギＩｇＧ画分（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ１１０９４、ロット１２１４７１１）ありまたはなしで１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。分析の前に、３００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで試料を濾過し、４ｕｌのヨウ化プロピジウムを添加した。試料を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用して分析した。

【0401】

結果を図２７ＡおよびＢに示す。図２７Ａは、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（２００ｎＭで）がいずれも、親ＦＳＡ抗体に相当するパーセンテージでＢＴ−４７４細胞中にインターナライズすることができることを図示する。ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の場合、そのＦＳＡであるＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｐｅｒｔ（５１％）と比較して、より高い総インターナリゼーションがＯＡ（６２％）で見られる。図２７Ｂは、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２およびＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（２００ｎＭで）がいずれも、親ＦＳＡ抗体に相当するパーセンテージでＪＩＭＴ−１（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ耐性）細胞中にインターナライズすることができることを図示する。ＢＴ−４７４およびＪＩＭＴ−１では、ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２は、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２と比較してより高いインターナリゼーション（％）を有する。

【0402】

実施例２１：一価抗ＨＥＲ２抗体は、Ｈｅｒ２ １＋細胞株（ＭＣＦ７細胞）において増加したＡＤＣＣを示す
（ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２）において試験した例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体に加えて、関連対照ＦＳＡ抗体と比較した、ＡＤＣＣを媒介する追加の一価抗ＨＥＲ２抗体ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２、ＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、およびＯＡ６−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の能力を試験した。追加の対照には、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）抗体、ｗｔ ＦＳＡ Ｈｃｐｔｎ、およびＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２が含まれた。ＡＤＣＣ活性を、実施例５および１２に記載されるプロトコルに従って、Ｈｅｒ２ １＋細胞株ＭＣＦ７において測定した。

【0403】

結果を、図２１Ｃ、Ｄ、およびＥに示す。図２１Ｃは、ＭＣＦ−７（Ｈｅｒ２ １＋）細胞でのＡＤＣＣアッセイにおけるＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２、ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２、およびＯＡ５−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の比較を示す。図２１Ｃの結果は、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２での処置が最も高い最大標的細胞溶解を媒介すること、およびこの最大標的細胞溶解が、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎのものを上回ることを示す。市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、約１８％少ないコアフコース残基を有し、コアフコースの欠如または低減は、フコシル化抗体と比較して、インビトロ標的細胞溶解（ＡＤＣＣによる）を強化することが知られている（Ｓｕｚｕｋｉ Ｅ．ｅｔ ａｌ．２００７，Ａ ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＨＥＲ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｕｇｍｅｎｔｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：１８７５−１８８２）。ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２は、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎと比べてより高い割合のフコシル化ペプチド配列を持つにも関わらず、より高い標的細胞溶解を媒介することができる。図２１Ｄの結果は、ＦＳＡ抗Ｈｅｒ２変異体を比較し、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎと比べて低下した標的細胞溶解を示す。市販ＨｅｒｃｅｐｔｉｎとＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（フコシル化の違いを除いて同一の分子）とを比較することにより、グリコシル化によりもたらされる大きな影響を例証する。図２１Ｅの結果は、親ＦＳＡ抗体、ＦＳＡ−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２と比較して、さらには市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎと比較して、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２に媒介されるより優れた死滅を示す。３つのＯＡ抗Ｈｅｒ２抗体の中でも、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２は、ＭＣＦ−７細胞において最も高い標的細胞溶解度（％）を媒介する。

【0404】

実施例２２：一価抗ＨＥＲ２抗体（ｓｃＦｖ）は、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞においてＦＳＡと対比してより高いＢ_ｍａｘを有する
例示的な一価抗ＨＥＲ２ ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２の結合を、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞において、この抗Ｈｅｒ２抗体の二価形態であるＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２のものと比較した。アッセイは、実施例３に記載のようにフローサイトメトリーによって行った。結果を図２８に示す。データは、ＯＡ４−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２が、ＦＳＡ−ｓｃＦｖ−ＢＩＤ２抗体と比較して優れたＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞への結合を示すことを表す。

【0405】

実施例２３：細胞を死滅させる一価抗体構築物−ＡＤＣの能力
毒性薬物分子と結合した一価抗体構築物ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（ＯＡ−Ｆａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１）を、次のように調製した：抗体薬物複合体を、Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ：ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９２；５２：１２７−３１に記載されるチオエーテル結合にＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて調製した。ＢＴ４７４細胞の成長を阻害するこの分子の能力を、実施例９に記載の方法を使用して試験した。結果を図２９に示し、７２時間の処置後、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２−ＭＣＣ−ＤＭ１が、１００ｎＭにおいて、ＯＡ１−ＦＳＡ−Ｈｅｒ２による３８％の成長阻害と比較して、ＢＴ−４７４における６３％の成長阻害をもたらしたことを示す。このデータは、ＯＡ−Ｆａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１が、ＯＡ１−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２と比較して優れた成長阻害を示すことを表す。

【0406】

実施例２４：例示的な一価抗体構築物の結合動態および親和性の判定
ＨＥＲ２に対するＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２の結合動態および親和性を、ＢＩＯ−ＲＡＤからのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６システムを使用してＳＰＲによって次のように判定した。おおよそ３３００ＲＵの抗ヒトＩｇＧ ２５ｕｇ／ｍｌを、標準的なアミン結合を用いてＧＬＣチップに固定化した。Ｗｔ ＦＳＡ ＨｃｐｔｎまたはＯＡ２−Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（ＰＢＳＴ中２０ｕｇ／ｍｌ、２５ｕｌ／分）を、おおよそ７００ＲＵの捕捉レベルまで、抗ヒトＩｇＧを固定化したチップに捕捉した。組み換えヒトＨＥＲ２を、６０、２０、６．６６、２．２２、０．７４ｎＭでＰＢＳＴ中に希釈し、５０μｌ／分の流量で２分間注入した後、さらに４分間解離させた。ＨＥＲ２希釈物を三連に分析した。センサグラムを、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに全体的に適合させた。すべての実験は室温で行った。

【0407】

結果を以下の表２３に示し、ｋ_ａ（オンレート、動態結合速度）、ｋ_ｄ（オフレート、動態解離速度）、およびＫ_Ｄ（平衡解離定数）を提供する。

【0408】

（表２３）対応する単一特異性二価抗体構築物と比較したＯＡ２−Ｆａｂ−ＨＥＲ２の結合動態および親和性の要約

【0409】

これらの結果は、試験した例示的な一価抗体構築物のオンレート、オフレート、および平衡解離定数が、対応する単一特異性二価抗体構築物のものに相当することを示す。

【0410】

実施例で用いた試薬は、市販入手可能であるか、または、当該技術分野で既知の市販入手可能な器具、方法、もしくは試薬を用いて調製することができる。前述の実施例は、本発明の種々の態様および本発明の方法の実施を例示する。実施例は、本発明の多数の異なる実施形態の完全な説明を提供することを意図するものではない。したがって、上述の発明は、理解の明確さの目的で図解および例としてある程度詳細に記載されているが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、多数の変更および修正がなされ得ることを理解するであろう。

【0411】

本明細書に記述されるすべての出版物、特許、および特許出願は、それぞれ個別の出版物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図21E】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図31-1】

【図31-2】

【図31-3】

【図31-4】

【図32-1】

【図32-2】

【図32-3】

【図32-4】

【図33-1】

【図33-2】

【図33-3】

【図33-4】

【図33-5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]