特許 6850290 併用療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6850290

(24)【登録日】2021年3月9日

(45)【発行日】2021年3月31日

(54)【発明の名称】併用療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/768 20150101AFI20210322BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210322BHJP

   A61K 39/13 20060101ALI20210322BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210322BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210322BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20210322BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/768

   A61K39/395 T

   A61K39/395 N

   A61K39/13

   A61P35/00

   A61P43/00 121

   C12N15/86

【請求項の数】23

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2018-519304(P2018-519304)

(86)(22)【出願日】2016年10月14日

(65)【公表番号】特表2018-530584(P2018-530584A)

(43)【公表日】2018年10月18日

(86)【国際出願番号】US2016057023

(87)【国際公開番号】WO2017066557

(87)【国際公開日】20170420

【審査請求日】2018年6月5日

(31)【優先権主張番号】62/242,123

(32)【優先日】2015年10月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/361,725

(32)【優先日】2016年7月13日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】514312365

【氏名又は名称】デューク ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ビグナー ダレル ディー．

(72)【発明者】

【氏名】グローマイヤー マサイヤス

(72)【発明者】

【氏名】ナイル スミタ

(72)【発明者】

【氏名】チャンドラモハン ヴィディヤラクシュミ

【審査官】 横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／０８１９３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１５−５０８１５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／１２７５０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／０６９７７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０４７３５０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Mol Ther., 2014, Vol.22 No.11, p.1949-1959

【文献】 Mol Ther., 2012, Vol.20 No.9, p.1664-1675

【文献】 最新医学, 2015.3, Vol.70 No.3, p.378-385

【文献】 Neurology, 2015.4, Vol.84, Suppl 14. Abstract Number: P4.043.

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｐ

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者の腫瘍を治療するための医薬組成物であって、
クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の５’非翻訳領域にヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン１型株を含む、キメラポリオウイルスコンストラクトと、
抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤＬ−１抗体からなる群より選択される、免疫チェックポイント阻害剤と
を含む、前記医薬組成物。

【請求項2】

前記腫瘍が、膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、アストロオリゴデンドログリオーマ（ａｓｔｒｏ−ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、腎細胞癌、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍および／または胃腫瘍、膵腫瘍、結腸直腸腫瘍、肝腫瘍または胆嚢腫瘍、乳房腫瘍、髄芽腫、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、メラノーマ、ならびに肉腫からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記腫瘍がＮＥＣＬ５（ネクチン様タンパク質５）を発現する、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

対流強化輸送法による脳内注入による投与用に製剤化されている、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記腫瘍がＮＥＣＬ５の発現を確認するために試験されている、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記腫瘍への直接投与用に製剤化されている、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項7】

腫瘍を治療するためのキットであって、
クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の５’非翻訳領域にヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン１型株を含む、キメラポリオウイルスコンストラクトと、
抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤＬ−１抗体からなる群より選択される、免疫チェックポイント阻害剤と
を含む、前記キット。

【請求項8】

前記腫瘍が、膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、アストロオリゴデンドログリオーマ、腎細胞癌、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍および／または胃腫瘍、膵腫瘍、結腸直腸腫瘍、肝腫瘍または胆嚢腫瘍、乳房腫瘍、髄芽腫、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、メラノーマ、ならびに肉腫からなる群より選択される、請求項７に記載のキット。

【請求項9】

前記腫瘍がＮＥＣＬ５（ネクチン様タンパク質５）を発現する、請求項７に記載のキット。

【請求項10】

対流強化輸送法による脳内注入による投与用に製剤化されている、請求項７に記載のキット。

【請求項11】

前記腫瘍が、ＮＥＣＬ５の発現を確認するために試験されている、請求項７に記載のキット。

【請求項12】

前記腫瘍への直接投与用に製剤化されている、請求項７に記載のキット。

【請求項13】

キメラポリオウイルスコンストラクトと免疫チェックポイント阻害剤とを含む、腫瘍を治療するための、組合せ医薬であって、前記キメラポリオウイルスコンストラクトが、クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の５’非翻訳領域にヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン１型株を含み、前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤＬ−１抗体からなる群より選択される、前記組合せ医薬。

【請求項14】

クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の５’非翻訳領域にヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン１型株を含む、キメラポリオウイルスコンストラクト
を含む、腫瘍を治療するための医薬であって、
抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤＬ−１抗体からなる群より選択される、免疫チェックポイント阻害剤
と組み合わせて使用される、前記医薬。

【請求項15】

前記腫瘍が、膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、アストロオリゴデンドログリオーマ、腎細胞癌、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍および／または胃腫瘍、膵腫瘍、結腸直腸腫瘍、肝腫瘍または胆嚢腫瘍、乳房腫瘍、髄芽腫、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、メラノーマ、ならびに肉腫からなる群より選択される、請求項１４に記載の医薬。

【請求項16】

前記腫瘍がＮＥＣＬ５（ネクチン様タンパク質５）を発現する、請求項１４に記載の医薬。

【請求項17】

対流強化輸送法による脳内注入による投与用に製剤化されている、請求項１４に記載の医薬。

【請求項18】

前記腫瘍が、ＮＥＣＬ５の発現を確認するために試験されている、請求項１４に記載の医薬。

【請求項19】

前記腫瘍への直接投与用に製剤化されている、請求項１４に記載の医薬。

【請求項20】

抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤＬ−１抗体からなる群より選択される、免疫チェックポイント阻害剤
を含む、腫瘍を治療するための医薬であって、
クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の５’非翻訳領域にヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン１型株を含む、キメラポリオウイルスコンストラクト
と組み合わせて使用される、前記医薬。

【請求項21】

前記腫瘍が、膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、アストロオリゴデンドログリオーマ、腎細胞癌、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍および／または胃腫瘍、膵腫瘍、結腸直腸腫瘍、肝腫瘍または胆嚢腫瘍、乳房腫瘍、髄芽腫、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、メラノーマ、ならびに肉腫からなる群より選択される、請求項２０に記載の医薬。

【請求項22】

前記腫瘍がＮＥＣＬ５（ネクチン様タンパク質５）を発現する、請求項２０に記載の医薬。

【請求項23】

前記腫瘍が、ＮＥＣＬ５の発現を確認するために試験されている、請求項２０に記載の医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、米国政府に提供された資金を用いてなされたものである。米国政府は、米国国立衛生研究所Ｒ０１ ＣＡ８７５３７、Ｐ５０ ＮＳ２００２３、Ｐ５０ ＣＡ１９０９９１、Ｒ０１ ＣＡ１２４７５６およびＲ０１ ＣＡ１４０５１０からの助成条件に従って一定の権利を保有する。

【0002】

（発明の技術分野）
本発明は抗癌療法の分野に関する。本発明は、特に腫瘍溶解性ウイルスによる抗癌療法に関する。

【背景技術】

【0003】

（発明の背景）
ＰＶＳ−ＲＩＰＯは腫瘍溶解性ポリオウイルス（ＰＶ）組換え体である。ＰＶＳ−ＲＩＰＯは、ヒトライノウイルス２型（ＨＲＶ２）の外来配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む弱毒化生（セービン）ＰＶ１型ワクチンからなる。ＩＲＥＳは、ＰＶゲノムの５’非翻訳領域に位置するシス作用性の遺伝子エレメントであり、ウイルスのｍ^７Ｇ−ｃａｐ−非依存性翻訳を仲介する。このウイルスには、ヒトへの効果という刺激的な兆候がみられる。それでもなお、この分野では、さらに効果が高く、さらに多くの人々、特に脳腫瘍患者に効果のある抗癌治療薬を特定し開発することが依然必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

本発明の一態様では、患者の腫瘍を治療する方法が提供される。患者にキメラポリオウイルスコンストラクトを投与する。このコンストラクトは、クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の５’非翻訳領域にヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する、ポリオウイルスセービン１型株を含む。患者にはこのほか、同時に、または約３０日以内に免疫チェックポイント阻害剤を投与する。

【0005】

本発明の別の態様では、腫瘍を治療するキットが提供される。このキットは、クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の５’非翻訳領域にヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン１型株を含むキメラポリオウイルスコンストラクトと、免疫チェックポイント阻害剤とを含む。

【0006】

本発明のさらなる態様では、薬剤として使用する、または腫瘍の治療に使用する、キメラポリオウイルスコンストラクトと免疫チェックポイント阻害剤との組合せであって、キメラポリオウイルスコンストラクトが、クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の５’非翻訳領域にヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン１型株と、免疫チェックポイント阻害剤とを含む、組合せが提供される。

【0007】

本明細書を読めば当業者に明らかになる上記のものをはじめとする諸態様は、当該技術分野に癌治療のための新規な治療レジメンを提供する。
[本発明1001]
患者の腫瘍を治療する方法であって、
クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の5’非翻訳領域にヒトライノウイルス2（ＨＲＶ2）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン1型株を含むキメラポリオウイルスコンストラクトを前記患者に投与することと、
免疫チェックポイント阻害剤を前記患者に投与することと
を含む、方法。
[本発明1002]
前記腫瘍が膠芽腫である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記腫瘍が星状細胞腫または乏突起神経膠腫である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記腫瘍がアストロオリゴデンドログリオーマ（ａｓｔｒｏ−ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記腫瘍が腎細胞癌である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記腫瘍が前立腺腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記腫瘍が膀胱腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記腫瘍が食道腫瘍および／または胃腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記腫瘍が膵腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記腫瘍が肝腫瘍または胆嚢腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記腫瘍が乳房腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記腫瘍が髄芽腫である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記腫瘍が肺腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記腫瘍が頭頸部腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記腫瘍がメラノーマである、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記腫瘍が肉腫である、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記腫瘍がＮＥＣＬ5（ネクチン様タンパク質5）を発現する、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記キメラポリオウイルスコンストラクトを対流強化輸送法による脳内注入によって投与する、本発明1001の方法。
[本発明1020]
投与前に、前記腫瘍を検査して前記腫瘍がＮＥＣＬ5を発現することを確認する段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記キメラポリオウイルスコンストラクトを前記腫瘍に直接投与する、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−1抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤＬ−1抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＣＴＬＡ4抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1025]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＬＡＧ−3抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1026]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＴＩＭ−3抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記免疫チェックポイント阻害剤を前記キメラポリオウイルスコンストラクトの投与から30日以内に投与する、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記免疫チェックポイント阻害剤を前記キメラポリオウイルスコンストラクトの投与から7日以内に投与する、本発明1001の方法。
[本発明1029]
腫瘍を治療するためのキットであって、
クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の5’非翻訳領域にヒトライノウイルス2（ＨＲＶ2）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン1型株を含む、キメラポリオウイルスコンストラクトと、
免疫チェックポイント阻害剤と
を含む、キット。
[本発明1030]
腫瘍の治療に使用するための、キメラポリオウイルスコンストラクトと免疫チェックポイント阻害剤とを含む組合せであって、前記キメラポリオウイルスコンストラクトが、クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の5’非翻訳領域にヒトライノウイルス2（ＨＲＶ2）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン1型株を含む、組合せ。
[本発明1031]
薬物として使用するための、キメラポリオウイルスコンストラクトと免疫チェックポイント阻害剤とを含む組合せであって、前記キメラポリオウイルスコンストラクトが、クローバーリーフとオープンリーディングフレームとの間の5’非翻訳領域にヒトライノウイルス2（ＨＲＶ2）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するポリオウイルスセービン1型株を含む、組合せ。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】実験の概要を示す図である。

【図2】乳癌、メラノーマ癌および前立腺癌を代表する４種の異なる腫瘍細胞系を用いた結果を示す図である。ＤＣをディッシュに播いた。ＤＣ培養物に腫瘍溶解物の上清を加え、インキュベートした。次いで、上清を除去し、ＤＣを洗浄した。ＤＮアーゼＩで処理した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を３７℃でインキュベートした。非付着細胞を回収し、ＣＴＬ刺激培地中、ＩＬ−７の存在下で、応答細胞と刺激ＤＣの比を１０：１にして、ポリオウイルスによる腫瘍溶解物を負荷したＤＣで刺激した。第１２〜１４日、Ｔ細胞を回収し、カウントし、ユウロピウム放出ＣＴＬアッセイにエフェクターＴ細胞として用いた。関連する腫瘍抗原および無関係な腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした自己ＤＣを対照標的として用いた。ＤＣ対照標的には、ｍＲＮＡをエレクトロポレートした標的細胞を回収し、洗浄して培地を完全に除去し、ユウロピウム（Ｅｕ）で標識した。これとは別に、元の標的細胞（Ｓｕｍ１４９、ＭＤＡＭＢ２３１、ＬＮＣａＰまたはＤＭ６）をＥｕで標識した。ユウロピウム標識標的（Ｔ）１０，０００個とエフェクター細胞（Ｅ）の段階希釈物を様々なＥ：Ｔ比にて９６ウェルＶ字底プレートでインキュベートした。プレートを３分間遠心分離し、３７℃でインキュベートした。上清５０μｌを回収し、９６ウェル平底プレートの増強溶液１５０μｌに加え、ＶＩＣＴＯＲ３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いて、ユウロピウム放出を時間分解蛍光により測定した。式：％特異的放出＝［（実験による放出量−自発的放出量）／（総放出量−自発的放出量）］×１００を用いて特異的細胞傷害活性を求めた。標的細胞の自発的放出量は、界面活性剤による総放出量の２５％未満であった。標的細胞の自発的放出量は、Ｔ細胞を含まない培地で標的細胞をインキュベートすることにより求めたものである。アッセイはいずれも三重反復で実施したものであり、バーは平均％溶解を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。

【図3】Ｃ５７Ｂｌ６マウスのＣＴ２Ａ神経膠腫を用い、本発明に類似したポリオウイルスとチェックポイント阻害剤との併用療法を含めた様々な治療法を用いた、マウス腫瘍モデルでのｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を示す図であり、マウスおよびＣＴ２Ａ細胞はともにヒトポリオウイルス受容体ＣＤ１５５を発現する。以下の実験的処置による結果（経時的腫瘍体積）を上パネルに示す：グループＩ（青色）：ＤＭＥＭ（ウイルスの対照となる溶媒）＋ＩｇＧ（抗ＰＤ１の対照）；グループＩＩ（灰色）：ＰＶＳＲＩＰＯ＋ＩｇＧの単回腫瘍内注射；グループＩＩＩ（オレンジ色）：ＤＭＥＭ＋抗ＰＤ１の単回腫瘍内注射；グループＩＶ（金色）：ＰＶＳＲＩＰＯ（「ｍＲＩＰＯ」）＋抗ＰＤ１の単回腫瘍内注射。抗ＰＤ１は３回分（第３日、第６日、第９日）を腹腔内注射により投与した。下の３つのパネルは、処置群ＩＩ〜ＩＶの個々のマウス（直線がそれぞれ１匹の異なるマウスを表す）の腫瘍応答（経時的腫瘍体積）を示している。

【発明を実施するための形態】

【0009】

（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ヒトにウイルスコンストラクトと免疫チェックポイント阻害剤とを投与する併用療法レジメンを開発した。ポリオウイルスは潜在的な病原体であるため、対象に病原因子が導入されないよう特別な予防策を講じなければならない。優れた製造方法および精製を用いて、ヒトへの導入が十分可能な程度に純粋な調製物を作製した。

【0010】

ウイルス調製物を直接腫瘍に投与する任意の技術を用い得る。直接投与は、腫瘍まで到達するのに血液系には依存しない。調製物を腫瘍の表面に塗布したり、腫瘍内に注射したり、外科手術時に腫瘍部位内または腫瘍部位に点滴したり、カテーテルから腫瘍内に注入したりし得る。用い得る具体的な技術の１つに対流強化輸送法がある。

【0011】

本発明に従って使用し得る免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Ｔ細胞と腫瘍細胞の阻害相互作用を妨害する任意の免疫チェックポイント阻害剤である。このような阻害剤としては、特に限定されないが、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＬＡＧ−３抗体および／または抗ＴＩＭ−３抗体が挙げられる。米国で承認されているチェックポイント阻害剤としては、イピミルマブ（ｉｐｉｍｉｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブおよびニボルマブが挙げられる。阻害剤は抗体である必要なないが、小分子またはその他のポリマーであり得る。阻害剤が抗体である場合、それはポリクローナル、モノクローナル、フラグメント、一本鎖をはじめとする抗体変異体コンストラクトであり得る。阻害剤は、特に限定されないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲおよびＢ−７リガンドファミリーを含めた当該技術分野で公知の任意の免疫チェックポイントを標的とするものであり得る。単一の標的免疫チェックポイントに対する阻害剤または様々な免疫チェックポイントに対する様々な阻害剤を組み合わせて使用し得る。さらに、遠隔転移および再発腫瘍を効率的に根絶する強力で持続的な免疫が生じるように、ＣＳＦ−１Ｒ遮断剤を免疫チェックポイント阻害剤（１つまたは複数）と組み合わせて、またはこれに代えて使用し得る。この目的には、特に限定されないがイマクツズマブ（ｉｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）およびＡＭＧ８２０を含めたＣＳＦ−１Ｒに特異的な抗体またはＣＳＦ−１Ｒを阻害もしくは遮断する薬物を使用し得る。

【0012】

免疫チェックポイント阻害剤は、ポリオウイルスと同時に、ポリオウイルスの前に、またはポリオウイルスの後に投与し得る。２つの薬剤は通常、互いに３０日以内、２８日以内、２１日以内、１４日以内、７日以内、４日以内、２日以内または１日以内に投与する。薬剤は、連続して、または１剤目と２剤目からなるサイクルで、反復して投与し得る。必ずというわけではないが、チェックポイント阻害剤の前にワクチンを投与するのが有利であり得る。しかし、これと逆の順序を用いてもよい。ウイルスコンストラクトによる細胞傷害性Ｔリンパ球応答のプライミングには約５日〜約１４日を要し得る。チェックポイント阻害剤の投与は、プライミング期間中またはその後に開始するのが有益であり得る。

【0013】

免疫チェックポイント阻害剤は、具体的な阻害剤に適した当該技術分野で公知の任意の手段によって投与し得る。このような手段としては、静脈内、経口、腹腔内、舌下、髄腔内、腔内、筋肉内および皮下が挙げられる。任意選択で、免疫チェックポイント阻害剤をポリオウイルス剤と組み合わせて投与し得る。

【0014】

小児腫瘍と成人腫瘍をともに含めた任意のヒト腫瘍を治療することができる。腫瘍は、任意の器官、例えば脳、前立腺、乳房、肺、結腸および直腸のものであってよく、例えば膠芽腫、髄芽腫、癌腫、腺癌などを含めた種々の腫瘍を治療し得る。腫瘍のその他の例としては、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、グレードＩ（未分化）星状細胞腫、グレードＩＩ星状細胞腫、グレードＩＩＩ星状細胞腫、グレードＩＶ星状細胞腫、中枢神経系の非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、膀胱癌、乳房肉腫、気管支癌、気管支肺胞癌、子宮頸癌、頭蓋咽頭腫、子宮内膜癌、子宮内膜子宮癌、上衣芽腫、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、線維性組織球腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、頭頸部癌、肝細胞癌、肝門部胆管癌、下咽頭癌、眼内メラノーマ、島細胞腫、カポジ肉腫、ランゲルハンス細胞組織球症、大細胞未分化肺癌、喉頭癌、口唇癌、肺腺癌、悪性線維性組織球腫、髄様上皮腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、内分泌腺腫、鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣明細胞癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓癌、乳頭腫、副鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、松果体実質腫瘍、松果体芽腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、腎細胞癌、第１５番染色体が変化した気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、扁平非小細胞肺癌、頸部扁平上皮癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂癌、尿道癌、子宮肉腫、腟癌、外陰癌およびウイルムス腫瘍が挙げられる。

【0015】

任意選択で、患者は、ＮＥＣＬ５（ポリオウイルス受容体）発現に基づいて層別化し得る。これは例えば、プローブ、プライマーまたは抗体を用いて、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでアッセイすることができる。ＮＥＣＬ５発現は、本発明のキメラポリオウイルスで治療するかどうかを決定する指針となり得る。ＮＥＣＬ５発現はほかにも、用量、頻度および治療持続期間を含めた治療の積極性の指針として用い得る。ＮＥＣＬ５（ＣＤ１５５）に対する抗体は市販されており、それを用い得る。このほか、ＮＥＣＬ５のＲＮＡ発現をアッセイすることができる。Ｈｉｒｏｔａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：２２２９−２２３５（２００５）を参照されたい。

【0016】

治療レジメンには、キメラポリオウイルスコンストラクトと免疫チェックポイント阻害剤との組合せの送達に加えて、腫瘍の外科的除去、腫瘍の外科的縮小、化学療法、生物学的療法、放射線療法を含め得る。これらの様式は、多数の疾患状態の標準治療であり、患者が標準治療を受けるのを拒否する必要はない。キメラポリオウイルスと免疫チェックポイント阻害剤との組合せは、標準治療の前、標準治療実施時または標準治療の後に投与し得る。キメラポリオウイルスと免疫チェックポイント阻害剤との組合せは、標準治療が奏効しなかったときに投与してもよい。組合せが指定されれば、それを単一の併用レジメン内で２つの別個の薬剤として別々の時間に投与し得る。あるいは、２剤（またはそれ以上）を混合物の形で投与し得る。

【0017】

キットは、仕切りの有無を問わず単位一の容器内にキメラポリオウイルスコンストラクトＰＶＳＲＩＰＯおよびチェックポイント阻害剤の両方を含み得る。この２剤は、別個の容器の中に入っていても、混合物の形で単一の容器の中に入っていてもよい。投与に関する指示書が含まれ得る。任意選択で、患者のＮＥＣＬ５発現を試験する抗体がキットの一構成要素となる。

【0018】

出願者らは、キメラポリオウイルスの臨床医薬品が遺伝的な安定性および均一性に優れていることを明らかにした。このことは、ポリオウイルスが培養下でも天然の保有宿主生体内でも極めて変異が起こりやすいことから、特に有利である。遺伝的な安定性および均一性をみるのに適した任意のアッセイを用いることができる。安定性をみるアッセイの１つとして、３９．５℃で増殖できないことを試験することが挙げられる。別のアッセイとして、大量シーケンシングが挙げられる。また別のアッセイとして、霊長類に対する神経毒性に関する試験が挙げられる。

【0019】

出願者らは、いかなる特定の作用機序にも束縛されるのを望むわけではないが、ポリオウイルスコンストラクトの効果には複数の機序が寄与しているのではないかと考えられる。このような機序としては、癌細胞の溶解、免疫細胞の動員および癌細胞に対する特異性が挙げられる。さらに、ウイルスは神経に対する毒性が弱められている。

【0020】

上記の開示は、本発明を全般的に説明するものである。本明細書に開示される参考文献はいずれも、参照により明示的に組み込まれる。以下の具体例を参照することにより、さらに十全な理解が得られるが、これらは単に説明を目的として記載されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0021】

実施例１
動物腫瘍モデル。胸腺欠損マウスのＨＴＢ−１５ ＧＢＭ異種移植モデルを用いて、ＩＮＤに向けたＰＶＳ−ＲＩＰＯの有効性試験を実施した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ（臨床ロットのもの）を「マウス用に調整した」ＦＤＡ承認最大開始用量［ＦＤＡ承認最大開始用量（１０ｅ８ ＴＣＩＤ）をマウスの小さい腫瘍サイズに合わせて（６．７×１０ｅ６ ＴＣＩＤに）調製したもの］で投与した。送達は目的とする臨床経路、すなわち腫瘍内緩徐注入を模倣した。上記の条件下では、１５日後、ＰＶＳ−ＲＩＰＯにより全個体の腫瘍が完全に消失した。第１０日まで、治療した腫瘍からウイルスが回収されたが、そのレベルはそれほど高いものではなく、このことは、ウイルスによる直接的な腫瘍細胞殺作用のみで治療効果を説明することはできないことを示している。

【0022】

動物腫瘍モデルで得られた証拠から、ＰＶＳ−ＲＩＰＯの腫瘍内接種によって、ウイルスによる直接的な腫瘍細胞殺作用が引き起こされるほか、感染／死滅した腫瘍に対する強力な宿主免疫応答が誘発されることが示唆される（３、７、１０）。ウイルス注入に対する応答は、強力で局所的な炎症性応答であることを特徴とし、腫瘍の免疫浸潤を引き起こす。最終的には、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ注入に対する緩徐な組織応答によって腫瘍塊が消滅し、瘢痕に置き換わる。

【0023】

実施例２
臨床試験。ＩＮＤ番号１４，７３５の「再発性膠芽腫に対するＰＶＳＲＩＰＯの用量探索および安全性試験」が、２０１１年６月１９日にＦＤＡによる承認を受け、２０１１年１０月２７日にＩＲＢによる承認を受けた。現時点で、再発性膠芽腫（ＧＢＭ）の患者を対象とする第Ｉ相／第ＩＩ相臨床試験（ＮＣＴ０１４９１８９３）が患者を登録中である。

【0024】

これまでに、ＩＲＢに承認されたプロトコルに従ってヒト被験者２例をＰＶＳ−ＲＩＰＯで治療した。第一の被験者から得た予備的所見を実施例３に記載する。

【0025】

実施例３
第一のヒト被験者に関する予備的所見。患者は右前頭部ＧＢＭ（ＷＨＯグレードＩＶ）と診断された２１歳の女性看護学生である。同患者は重度の頭痛の既往歴の後、２０１１年６月、２０歳で初めて診断を受け、副鼻腔感染症の疑いで治療を受けるも奏効しなかった。同年６月１７日、脳撮像が得られ、右前頭部に約５×６ｃｍの大きな塊が見られた。同年６月２２日、右前頭部の塊の亜全切除を実施し、病理学的にＧＢＭ（ＷＨＯグレードＩＶ）であることが確認された。患者の年齢が若いこと、一般状態が良好であることおよび腫瘍の亜全切除を実施したことを考慮し、６週間にわたる放射線療法およびＴｅｍｏｄａｒを連日７５ｍｇ／ｍ^２経口投与する併用化学療法と、ベバシズマブ（抗血管新生剤）の隔週投与との併用療法で積極的に治療することにした。２０１１年９月１８日、患者は６週間の治療が終了した。同年１０月３日、ベバシズマブ１０ｍｇ／ｋｇの隔週投与に加え、患者は月１回、５日間のＴｅｍｏｄａｒ化学療法による補助療法を開始した。

【0026】

２０１２年４月１６日、患者は睡眠中に最初の全身性痙攣を発現し、来院した。患者はそれまでに、６か月間のＴｅｍｏｄａｒとベバシズマブの併用療法を終えていた。患者は、ＧＢＭと診断され化学療法を受けているにもかかわらず、小児腫瘍科の看護師になる課程を終えるところであったため、痙攣の原因は学校でのストレスの増大にあるとした。その日に得られた脳ＭＲＩでは、切除腔の内側面に沿う新たな結節性増強をみる腫瘍再発が認められた（図１２）。

【0027】

患者には複数の治療選択肢を提示したが、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ臨床試験の続行を選択した。患者は、最初の全身性痙攣ののちＫｅｐｐｒａを開始したが、服用し忘れることがあり、それと上記の腫瘍再発とが原因となり、２０１２年５月６日、睡眠中に２回目の全身性痙攣を発現した。患者は治療前の神経学的病態に戻り、プロトコルに登録したいという気持ちを生じた。

【0028】

２０１２年５月９日にフォローアップＭＲＩを得た（図１３）後、同年５月１１日、目的とする臨床送達法（造影剤Ｇｄ−ＤＴＰＡを含有するウイルス懸濁液３ｍＬを対流強化輸送法により６時間にわたって腫瘍内に注入する；実施例４を参照されたい）によりＦＤＡ承認最大開始用量（１０ｅ８）のＰＶＳ−ＲＩＰＯを患者に注入したところ、これによる神経学的合併症をはじめとする合併症は一切認められなかった。

【0029】

注入終了直後に得たＭＲＩから、注入液の分布がわかる（図１４）。

【0030】

本発明者らの研究チームは週１回の頻度で患者のフォローアップを実施し、患者は、注入から２週間後に来院したとき、神経学的症状、痙攣の再発、疲労、息切れ、脱力感のいずれも新たに訴えることはなかった。２０１２年６月７日、患者を診療所で再び評価したところ、生理学的状態および神経学的状態は正常であった。その来院時に得た脳ＭＲＩから、疾患が安定していることがわかった（図１５）。

【0031】

２０１２年７月９日、患者が来院した。今回も同じく、患者は新たな神経学的症状を訴えることはなく、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ注入前の２０１２年５月６日に痙攣が認められて以来、痙攣活動が再発することもなかった。患者はほかにも、気分が良好であること、看護学校での成果に満足しており、注入後の方がはるかに学業に専念できると思うことを報告した。このほか、２人のルームメイトと行動を共にできること、定期的な運動ができることに大きな喜びを感じていた。その日に得た患者の脳ＭＲＩには、腫瘤効果のわずかな増大および上方の線状増強のわずかな増大が見られ、疾患の進行が懸念された（図１６）。

【0032】

臨床的悪化はみられないがＸ線像の変化が懸念されることを考慮し、１８−ＦＤＧ ＰＥＴスキャンを得ることにした。１８−ＦＤＧ ＰＥＴスキャンでは、ＭＲＩで懸念された領域に低代謝活性が見られ、壊死過程が示唆された（治療反応効果；図１７）。７月９日のＰＥＴスキャンから、生存可能な腫瘍が存在しないことが示唆される。患者およびその母親と話し合った後、臨床およびＸ線像の観点から同患者の追跡を継続することにした。

【0033】

８月２７日および１０月２２日の検査では、患者は新たな神経学的症状を訴えることはなく、２０１２年５月６日（ＰＶＳ−ＲＩＰＯ注入前）の痙攣以来、痙攣活動も一切みられなかった。患者は、認知／記憶機能、運動機能（運動）の改善を報告している。１０月２６日の時点で、患者は神経学的に正常な状態である。

【0034】

８月２７日、Ｘ線像が良好なものであったため、ＰＥＴスキャンは指示しなかった。１０月２２日、患者に再びスキャンを実施したところ、定量化可能なＸ像での反応が認められた。

【0035】

ＭＲＩ／ＰＥＴのオーバーレイ画像から、腫瘍再発領域全体からのシグナルが見られないことがわかる。

【0036】

実施例４
対流注入。術前ＭＲＩから得られる情報を用いた分布予測に基づき、術前にＢｒａｉｎＬａｂ ｉＰｌａｎ Ｆｌｏｗシステムを用いてカテーテル挿入経路を計画する。

【0037】

本発明では、ポリオウイルスの分布を確認する代替トレーサーとして１ｍＭのガドリニウムを用いる。これは他の薬物注入にも用いることが可能である。ガドリニウムをその薬物と同時注入し、様々なＭＲＩシーケンスを用いて分布を定量化する。

【0038】

送達する薬剤を治験薬剤師がシリンジに予め全量充填し、手術室またはＮＩＣＵで注入開始直前に無菌条件下でカテーテルに接続する。注入に必要な全構成要素（手術室にいる時間、調剤時間および放射線科の予約）について計画を立てるのは複雑な作業であるため、試験には被験薬注入のための時間枠が１日加えられている。つまり、生検／カテーテル留置の翌日に注入を開始することができるということである。プロトコルに関して言えば、これを「第０日」およびのちの事象のタイミングと見なす。ウイルス注入時、エピネフリンおよびジフェンヒドラミンを含めた緊急薬を使用可能な状態にしておき、神経学的状態、酸素飽和度および心リズムをモニターする。他のあらゆる緊急設備が使用できるように、神経外科集中治療室（ＮＳＣＵ）で薬物注入を実施する。患者をナフシリン、第二世代セファロスポリンまたはバンコマイシンなどの予防的抗生物質で処置し、麻酔を導入してカテーテルを留置する。

【0039】

本発明者ら自身の経験、既に公開されている報告（１９）ならびに同様の注入技術を用いたＩＲＢ承認試験およびＦＤＡ承認試験（ＩＲＢ番号４７７４−０３−４Ｒ０）に基づけば、患者への注入は５００μＬ／時の速度で実施する。Ｍｅｄｆｕｓｉｏｎ ３５００注入ポンプであれば、予め送達速度５００μＬ／時にプログラムしておく。注入が一切妨げられないように、開始時に薬剤（注入システムの「デッドスペース」３．３７２３ｍＬを考慮して全量を１０ｍＬとする）を２０ｍＬシリンジに充填してシリンジポンプ内に注入する。患者に送達する接種量は計３ｍＬとする。カテーテルそのもの（長さ３０ｃｍ、内径１ｍｍ）には予めウイルス懸濁液を充填することができない。このため、注入の最初の約２５０μＬは、留置カテーテルの「デッドスペース」内にあり保存剤を含まない生理食塩水となる。これを考慮に入れ、注入ポンプを３．２５０ｍＬ送達するようプログラムする。Ｍｅｄｆｕｓｉｏｎ ３５００（Ｍｅｄｅｘ社、ダルース、ジョージア州）シリンジ注入ポンプを用いて注入を実施する。ウイルス注入処置は６．５時間以内に終了する。ＰＶＳＲＩＰＯの送達後、直ちにカテーテルを取り外す。

【0040】

注入カテーテル（ＰＩＣ０３０）および注入チューブ（ＰＩＴ４００）はＳｏｐｈｙｓａ社（クラウンポイント、インディアナ州）製のものとする。Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｃａｔｈｅｔｅｒ Ｋｉｔは、透明で開口部のある長さ３０ｃｍのカテーテル（内径１．０ｍｍ／外径２．０ｍｍ）であり、２０ｃｍの長さにわたって１ｃｍ刻みの目盛がある。このカテーテルは、３０ｃｍのステンレス鋼製スタイレットと、キャップ付きの反矢じりメス型ルアーロックと、ステンレス鋼製套管針とを備えている。Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｔｕｂｉｎｇ Ｋｉｔは、エアフィルタを備えた三方活栓コネクタと、アンチサイフォンバルブを備えた４ｍのマイクロボアチューブと、赤いベントキャップと、白いルアーロックキャプとからなる。カテーテル製品は無菌かつ無発熱性の状態で包装されており、単回（１回）のみ使用できるものである。注入はＭｅｄｆｕｓｉｏｎ ３５００（Ｍｅｄｅｘ社、ダルース、ジョージア州）シリンジ注入ポンプを用いて実施する。

【0041】

実施例５−結果
免疫チェックポイント阻害剤の機序は、細胞傷害性Ｔ細胞のエフェクター機能を阻止する腫瘍が引き起こす事象から同細胞の機能を開放することである。腫瘍は、天然に存在し細胞傷害性Ｔ細胞を制御する「ブレーキ」のシステムを利用する。このことは腫瘍にとって、変異タンパク質を発現するため異質なシグナルを提示する腫瘍を免疫系が攻撃する可能性を抑えるという利点がある。免疫チェックポイント阻害剤はこの腫瘍の機序を逆転させ、免疫機能を開放する。

【0042】

本発明者らは、ＰＶＳＲＩＰＯが、腫瘍を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に依存する免疫応答を誘発することを明らかにしている。したがって、ＰＶＳＲＩＰＯとチェックポイント阻害剤との併用によって治療効果が増強される。以下に示すように、ＰＶＳＲＩＰＯは実際、ＣＴＬ応答を誘導することによって腫瘍を治療するよう作用する。

【0043】

本発明者らは、メラノーマ細胞、乳房腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、前立腺癌細胞にＰＶＳＲＩＰＯを感染させ、死滅しつつある細胞／死滅細胞から上清を収集した。感染腫瘍細胞由来の上清を用いてヒト被験者由来の樹状細胞（ＣＴＬとのコミュニケーションおよびＣＴＬ活性化の調整を担う免疫細胞の集団）を曝露した。その結果、樹状細胞に炎症誘発活性化の強い徴候がみられた（すなわち、腫瘍細胞のウイルス感染によって、樹状細胞のＣＴＬ活性化機能を促進する可溶性因子が産生された）。

【0044】

次いで、活性化された樹状細胞と、樹状細胞を提供した同じヒト被験者のＴ細胞（ＣＴＬを含む）とを共培養した。次いで、共培養したＴ細胞（ＣＴＬを含む）と、感染段階に用いたのと同じ系列の未感染腫瘍細胞とを共培養した。

【0045】

本発明者らは、腫瘍細胞に対する活性化ＣＴＬの高レベルの細胞傷害性を観察した。図２を参照されたい。

【0046】

この実験は、患者に起こると考えられること、つまり、ウイルス感染が、最終的に腫瘍に対するＣＴＬ応答を生じさせる一連の事象を誘発することをｉｎ ｖｉｔｒｏで実証するものである。この一連の事象は、免疫チェックポイント阻害剤によって相乗的に増強され得るものである。

【0047】

天然に存在するＴ細胞機能に対する「ブレーキ」（免疫チェックポイント）の１つにＰＤ１−ＰＤ−Ｌ１の関係がある。腫瘍内の樹状細胞は多くの場合、ＰＤ−Ｌ１を発現するよう誘導され、次いで、これがＴ細胞上のＰＤ１と結合してＴ細胞の活性化を阻害する。

【0048】

本発明者らは、ＰＶＳＲＩＰＯ／ＰＶＳＲＩＰＯ−腫瘍溶解物に曝露した樹状細胞はＰＤ−Ｌ１発現が増大することを明らかにした。系列的チェックポイント阻害剤であるＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、この効果を阻害し、ＰＶＳＲＩＰＯの腫瘍溶解作用によるＣＴＬ活性化を増大させる。

【0049】

実施例６−方法
１０ｃｍディッシュのコンフルーエントなＳｕｍ１４９細胞、ＭＤＡＭＢ２３１細胞、ＬＮＣａＰ細胞またはＤＭ６細胞をＡＩＭＶ培地中、モック（ＤＭＥＭ）またはＰＶＳＲＩＰＯ（ＭＯＩ ０．１）に４８時間感染させた。上清を収集し、遠心分離により細胞残屑を除去した。凍結ＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳで洗浄し、Ｔ−１５０組織培養フラスコ中のＡＩＭ−Ｖ培地３０ｍｌに２×１０^８細胞で再懸濁させた（３）。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。フラスコを左右に揺り動かすことによって非付着細胞を遊離させて回収した。８００Ｕ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４を添加したＡＩＭ−Ｖ ３０ｍｌを付着細胞に補充し、次いで３７℃でインキュベートした。第６日、非付着細胞をすべて収集し、次いで冷ＰＢＳで洗浄することによりＤＣを回収した。なおも付着している細胞を細胞解離緩衝液で解離させた。ＤＣをＡＩＭＶ培地で洗浄し、カウントし、３５ｍｍディッシュに１ディッシュ当たり１×１０^６細胞で播いた。ＤＣ培養物に腫瘍溶解物の上清を加え、２４時間インキュベートした。次いで、上清を除去し、ＤＣをＡＩＭＶ培地で洗浄した。ＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳに再懸濁させ、３７℃で２０分間、２００Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼＩで処理した。ＤＮアーゼＩで処理したＰＢＭＣを３７℃で１時間インキュベートした。非付着細胞を回収し、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下、応答細胞と刺激ＤＣの比を１０：１にして、ポリオウイルスによる腫瘍溶解物を負荷したＤＣで刺激した。刺激はいずれも、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５×１０^−５Ｍ β−メルカプトエタノール（ＣＴＬ刺激培地）を含むＲＰＭＩ１６４０中で実施した。応答Ｔ細胞濃度は２×１０^６細胞／ｍｌであった。第３日のほか４〜５日毎に１２〜１４日間、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。Ｔ細胞をＣＴＬ刺激培地中、１〜２×１０^６細胞／ｍｌで維持した。第１２〜１４日、Ｔ細胞を回収し、カウントし、ユウロピウム放出ＣＴＬアッセイにエフェクターＴ細胞として用いた。対照には、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした自己ＤＣを標的として用いた。ＤＣ標的対照には、ｍＲＮＡをエレクトロポレートした標的細胞（図２に示されるもの）を回収し、洗浄して培地を完全に除去し、ユウロピウム（Ｅｕ）で標識した。これとは別に、元の標的細胞（Ｓｕｍ１４９、ＭＤＡＭＢ２３１、ＬＮＣａＰまたはＤＭ６）をＥｕで標識した。Ｅｕ標識緩衝液（１標的当たり１ｍｌ）には、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍｌ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、９３ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４）、Ｅｕ １０μｌ（０．０１Ｎ ＨＣｌ中１０ｍＭのＥｕＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）、ＤＴＰＡ ５μｌ（ＨＥＰＥＳ緩衝液中１００ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸）およびＤＳ ４μｌ（１％デキストラン硫酸）が含まれていた（４）。５×１０^６個の標的細胞をユウロピウム標的緩衝液１ｍｌにごく穏やかに再懸濁させ、氷上で２０分間インキュベートした。次いで、標識した細胞にＣａＣｌ_２溶液（１００ｍＭ）３０μｌを加えてかき混ぜ、細胞を氷上でさらに５分間インキュベートした。細胞に修復緩衝液（１０ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むＨＥＰＥＳ緩衝液）３０ｍｌを加え、細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞をカウントし、細胞５×１０^６個を修復緩衝液で４回洗浄した。最後の洗浄の後、ペニシリン−ストレプトマイシンを含まないＣＴＬ刺激培地に細胞を１０^５細胞／ｍｌで再懸濁させた。ユウロピウム標識標的（Ｔ）１０，０００個とエフェクター細胞（Ｅ）の段階希釈物を様々なＥ：Ｔ比で、９６ウェルＶ字底プレートのペニシリン−ストレプトマイシンを含まないＣＴＬ刺激培地２００μｌ中でインキュベートした。プレートを５００×ｇで３分間遠心分離し、３７℃で４時間インキュベートした。上清５０μｌを回収し、９６ウェル平底プレートの増強溶液（Ｗａｌｌａｃ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）１５０μｌに加え、ＶＩＣＴＯＲ３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いて、ユウロピウム放出を時間分解蛍光により測定した。式：％特異的放出＝［（実験による放出量−自発的放出量）／（総放出量−自発的放出量）］×１００を用いて特異的細胞傷害活性を求めた。標的細胞の自発的放出量は、界面活性剤による総放出量の２５％未満であった。標的細胞の自発的放出量は、Ｔ細胞を含まない培地で標的細胞をインキュベートすることにより求めたものである。アッセイはいずれも三重反復で実施したものであり、バーは平均％溶解を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。

【0050】

実施例７
ＰＶＳＲＩＰＯの抗腫瘍効果は、感染した腫瘍細胞および感染した抗原提示細胞（樹状細胞、マクロファージ、ミクログリア）に免疫原性の強い１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を誘発するというウイルスの能力によって支えられていると思われる。しかし、１型ＩＦＮ応答は免疫療法のメディエーターとして極めて望ましいものではあるが、同時に、ＰＶＳＲＩＰＯによって誘発される抗腫瘍免疫応答を抑制し得る既知の免疫チェックポイント、例えばＰＤ−Ｌ１を巻き込む。このため、ＰＶＳＲＩＰＯによる免疫療法を最大限に活用するには、免疫チェックポイント遮断剤と併用するのが望ましいものと思われる。このことは、免疫適格性で同系の神経膠腫モデル（例えば、ＣＴ２Ａ）を用いたアッセイで明らかである。Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｕｒｉｌｌｏら，Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１２：１３０９−２６（２００７）を参照されたい。

【0051】

本発明者らは、ポリオウイルス受容体ＣＤ１５５遺伝子導入Ｃ５７Ｂｌ６マウスに皮下ＣＴ２Ａ神経膠腫を移植した。腫瘍のイニシエーションに用いるＣＴ２Ａ細胞には、（ヒト細胞に類似したＰＶＳＲＩＰＯ感染が起こるよう）予めＣＤ１５５を形質導入した。担腫瘍個体（ｎ＝１０）からなる４つのグループに以下の処置を実施した：グループＩ：ＤＭＥＭ（ウイルスの対照となる溶媒）＋ＩｇＧ（抗ＰＤ１の対照）；グループＩＩ：ＰＶＳＲＩＰＯ＋ＩｇＧの単回腫瘍内注射；グループＩＩＩ：ＤＭＥＭ＋抗ＰＤ１の単回腫瘍内注射；グループＩＶ：ＰＶＳＲＩＰＯ＋抗ＰＤ１の単回腫瘍内注射。抗ＰＤ１は３回分（第３日、第６日、第９日）を腹腔内注射により投与した。結果を図３に示す。上パネルはグループの結果を示し、下パネルは個々のマウスの結果を示している。

【0052】

ＰＶＳＲＩＰＯ、抗ＰＤ１ともに個別に有意な抗腫瘍効果を示した（上パネル）。２剤を併用すると治療効果が増大し、機構的な相乗効果が示唆された（上パネル）。重要なのは、併用療法のみで持続的な腫瘍寛解（腫瘍応答曲線が腫瘍体積の極めて小さい位置で平坦な直線になっていることからわかる）が得られたことである。

【0053】

（参考文献）
引用される各参考文献の開示は、本明細書に明示的に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】