特許 6851201 ポンペ病の治療に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6851201

(24)【登録日】2021年3月11日

(45)【発行日】2021年3月31日

(54)【発明の名称】ポンペ病の治療に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20210322BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20210322BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20210322BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20210322BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20210322BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20210322BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210322BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20210322BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/113 ZZNA

   A61K31/711

   A61K31/7115

   A61K31/712

   A61K31/7125

   A61P3/00

   A61P25/00

   A61P21/00

【請求項の数】22

【全頁数】126

(21)【出願番号】特願2016-572523(P2016-572523)

(86)(22)【出願日】2015年6月10日

(65)【公表番号】特表2017-522010(P2017-522010A)

(43)【公表日】2017年8月10日

(86)【国際出願番号】NL2015050421

(87)【国際公開番号】WO2015190922

(87)【国際公開日】20151217

【審査請求日】2018年6月7日

(31)【優先権主張番号】PCT/NL2014/050374

(32)【優先日】2014年6月10日

(33)【優先権主張国】NL

(31)【優先権主張番号】14177884.5

(32)【優先日】2014年7月21日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】14183589.2

(32)【優先日】2014年9月4日

(33)【優先権主張国】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】315006920

【氏名又は名称】エラスムス ユニバーシティ メディカルセンター ロッテルダム

【氏名又は名称原語表記】Ｅｒａｓｍｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ

(74)【代理人】

【識別番号】100101085

【弁理士】

【氏名又は名称】横井 健至

(74)【代理人】

【識別番号】100134131

【弁理士】

【氏名又は名称】横井 知理

(74)【代理人】

【識別番号】100185258

【弁理士】

【氏名又は名称】横井 宏理

(72)【発明者】

【氏名】ベルグスマ，アッツェ ヤコブス

(72)【発明者】

【氏名】ファン デル ウォル，イーリック

(72)【発明者】

【氏名】パインアップル，ヴィルヘルムス ヴェンセスラウス マッスィアス

(72)【発明者】

【氏名】ファン デル プルーフ，アンティエ ツィツケ

(72)【発明者】

【氏名】ロイザー，アルノールダス

【審査官】 井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１６−５３３７６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５１５５０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５３２９６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０４９７１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０６６９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日経バイオ最新用語辞典，２００２年，第５版，pp. 58-59

【文献】 LUIS GARCIA，IGBMC - EVENTS, SEMINAR : RNA-BASED RNA-BASED THERAPEUTICS FOR NEUROMUSCULAR DISEASES，[ONLINE]，２０１４年 ２月２１日，ＵＲＬ，http://www.igbmc.fr/events/seminar/1090

【文献】 Nature，２０１１年，Vol.478，p.127-131

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ａ６１Ｋ ３１／７１１

Ａ６１Ｋ ３１／７１１５

Ａ６１Ｋ ３１／７１２

Ａ６１Ｋ ３１／７１２５

Ａ６１Ｐ ３／００

Ａ６１Ｐ ２１／００

Ａ６１Ｐ ２５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号10-17および33からなる群から選択される配列を含む、配列番号1を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項2】

ポンペ病の治療に使用するための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項3】

ヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されている、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項4】

オリゴマー化合物が均一に修飾されている、請求項１−３のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項5】

1つまたは複数のヌクレオチドの糖が修飾されており、好ましくは糖修飾が2'-O-メチルまたは2'-O-メトキシエチルである、請求項１−４のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項6】

1以上のヌクレオチドの塩基が修飾されている、請求項１−５のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項7】

オリゴマー化合物の骨格が修飾されている、好ましくはモルホリノホスホロチオエートまたはモルホリノホスホロジアミデートである、請求項１−６のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項8】

アンチセンスオリゴマー化合物が配列番号12または配列番号33である、請求項１−７のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項9】

治療が突然変異c.-32-13T＞Gを含む患者の治療である、請求項２に記載の使用のための、請求項１−８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項10】

治療がエクソンインクルージョン、好ましくはエクソン2のインクルージョンを含む、請求項２に記載の使用のための請求項１−８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項11】

請求項１−８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物と細胞を接触させることを含む、細胞内のGAAプレ-mRNAのスプライシングを調節するインビトロの方法。

【請求項12】

細胞内のGAAプレ-mRNAのスプライシングを調節するための、請求項１−８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項13】

請求項１−８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物の投与を含む、細胞内のGAAの機能を回復するためのインビトロの方法。

【請求項14】

細胞内のGAAの機能を回復させるための請求項１−８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項15】

請求項１−８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物を細胞に投与することを含む、対象の細胞、好ましくは筋肉細胞における異常な遺伝子発現を矯正するインビトロの方法。

【請求項16】

対象の細胞、好ましくは筋肉細胞における異常な遺伝子発現を修正するための、請求項１−８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項17】

細胞または患者が、c.-32-13T＞G、c.-32-3C＞G、c.547-6、c.1071、c.1254およびc.1552-30からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を有する、好ましくは細胞または患者が突然変異c.-32-3C＞Gまたはc.-32-13T＞Gを有する、請求項１１、１３および１５のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

エクソンインクルージョン、好ましくはエクソン2のインクルージョンが達成される、請求項１１、１３、１５および１７のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

細胞または患者が、c.-32-13T＞G、c.-32-3C＞G、c.547-6、c.1071、c.1254およびc.1552-30からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を有する、好ましくは細胞または患者が突然変異c.-32-3C＞Gまたはc.-32-13T＞Gを有する、請求項１２、１４および１６のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項20】

エクソンインクルージョン、好ましくはエクソン2のインクルージョンが達成される、請求項１２、１４、１６および１９のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー化合物。

【請求項21】

請求項１−８のいずれかに記載の少なくとも1つのアンチセンスオリゴマー化合物を含む医薬組成物。

【請求項22】

前記組成物が薬学的に許容される賦形剤および／または細胞送達剤をさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポンペ病の治療に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、GAA遺伝子のプレmRNAのスプライシングおよびポンペ病の治療を調節する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

酸性マルターゼ欠損症またはグリコーゲン貯蔵疾患ＩＩ型としても知られているポンペ病は、体全体の筋肉および神経細胞に損傷を与える常染色体劣性代謝障害である。これは、リソソーム酸α−グルコシダーゼ酵素の欠損によるリソソーム中のグリコーゲンの蓄積によって引き起こされる。グリコーゲンの蓄積は、体全体にわたる進行性の筋力低下（筋障害）を引き起こし、様々な身体組織、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系に影響を及ぼす。

【0003】

ポンペ病では、リソソーム加水分解酵素である酸性マルターゼとも呼ばれる酸性アルファ−グルコシダーゼ（EC3.2.1.20）であるタンパク質が欠損している。このタンパク質は、グリコーゲン、マルトースおよびイソマルトースのα-1,4およびα-1,6結合を通常分解し、細胞グリコーゲンの１〜３％の分解に必要とされる酵素である。この酵素の欠乏は、冒された個体のリソソームおよび細胞質における構造的に正常なグリコーゲンの蓄積をもたらす。リソソーム内の過剰なグリコーゲン貯蔵は、他のオルガネラの正常な機能を中断させ、細胞傷害を引き起こす可能性がある。欠損タンパク質は、17q25.2-q25.3（75,689,876から75,708,272塩基対）の17番染色体の長腕上のGAA遺伝子の突然変異によって引き起こされる選択的スプライシングの結果である。この遺伝子は約20kbに及んでおり、20エクソンを含み、最初のエクソンは転写されない。

【0004】

460以上のGAA突然変異が報告されているが（http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html）、わずかなスプライシング突然変異しか、特徴付けがなされていない。GAA酵素活性を完全に失わせるような重度の突然変異は、肥大性心筋症、全般的な骨格筋の衰弱および呼吸不全を伴う古典的な幼児疾患を引き起こし、そして、1年半以内に死に至る。より軽度の突然変異では、部分的にGAA酵素活性が残り、小児期から成人期にかけて発症する軽度の表現型がもたらされる。一般に、一次線維芽細胞におけるより高い残留酵素活性は、後のポンペ病発症に関連している。ポンペ病のための酵素補充療法（ERT）が開発されており、組換えヒトGAAタンパク質は2週間ごとに静脈内投与される。この治療法は、古典的な小児患者の生活を救済し、発症患者の疾患進行を遅らせることができるが、その効果は不均一である。（TからGへの）突然変異のc.-32-13T＞GであるIVS1突然変異は、この障害を有する小児、若年者および成人の間で最も一般的なものである。この突然変異はRNAスプライシングの部位を中断する。

【0005】

アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴマー化合物）は、現在、臨床試験において、スプライシングを調節する能力について試験されている。古典的な例はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。 この病気では、特定のエクソンに変異のホットスポットが存在する。アンチセンスオリゴマー化合物を用いて、突然変異したエクソンをスキップし、突然変異をバイパスする。これによって、まだ部分的に機能しているタンパク質は、わずかに短くなる。アンチセンスオリゴマー化合物が関連スプライス部位を標的としなければならないことは明らかであるので、アンチセンスオリゴマー化合物を用いてエクソンスキッピングを誘導することは容易である。表皮水疱症（国際公開第2013/053819号）およびレーバー先天黒内障（国際公開第2012/168435号）においても、アンチセンスオリゴヌクレオチドがエクソンスキッピングのために使用されている。

【0006】

ポンペのIVS1変異については、このような戦略は機能しない。IVS突然変異は、エクソン2のスキッピングを引き起こし、基準となる翻訳開始側の欠失を生じさせ、非センス媒介性の崩壊をもたらすため、タンパク質は転写されない。ポンペ病におけるIVS1変異に関してアンチセンス療法を機能させるためには、エクソンのインクルージョンを誘導する必要がある。しかし、それは確実に予測することができないスプライシング抑制配列を標的とすることに依存するため、エクソンのインクルージョンを誘発することは非常に困難である。IVS1突然変異の場合、スプライシング抑制配列をブロックするアンチセンスオリゴマー化合物は、IVS1突然変異の存在下でエクソン2のインクルージョンを促進し得る。そのような抑制配列は、エクソン（エクソンスプライシングサイレンサーまたはESSと呼ばれる）またはイントロン（イントロンスプライシングサイレンサーまたはISSと呼ばれる）のいずれかや、影響を受けたスプライス部位の近くまたはスプライス部位から遠く離れた部位のような、遺伝子のどこに存在していてもよい。

【0007】

インビトロで標的遺伝子のスプライシングを調節することができる多くのアンチセンス化合物が報告されているが、GAA遺伝子のスプライシングを調節し得る化合物を同定する必要性については、依然として存在している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

したがって、本発明の目的は、エクソンの封入を誘導することができるアンチセンス化合物を提供することである。本発明の別の目的は、エクソンスプライシングサイレンサー（ESS）またはイントロンスプライシングサイレンサー（ISS）を標的とすることができるアンチセンス化合物を提供することである。本発明のさらに別の目的は、IVS-1突然変異を標的とすることができるアンチセンス化合物を提供することである。本発明は、1つまたは複数の目的に見合う。

【課題を解決するための手段】

【0009】

1つの態様において、本発明は、配列番号1を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0010】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、配列番号2-33を含む群から選択されるアンチセンスオリゴマー化合物およびその少なくとも80％の同一性を有する配列に関する。

【0011】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、配列番号1、37−40およびそれらと少なくとも80％の同一性を有する配列を含む群から選択される配列を有するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0012】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、c-32-156_-210を含む群から選択される配列を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0013】

１つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、配列番号41-54および配列番号541-1583を含む群から選択される配列およびそれらと少なくとも80％の同一性を有する配列を含むアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0014】

１つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、以下の突然変異c.-32-13T＞G、c.-32-3C＞G c.-32-102T＞C、c.-32-56C＞T、c.-32-46G＞A、c.-32-28C＞A、c.-32-28C＞T、c.-32-21G＞A、c.7G＞A、c.11G＞A、c.15_17AAA、c.17C＞T、c.19_21AAA、c.26_28AAA、c.33_35AAA、c.39G＞A、c.42C＞T、c.90C＞T、c.112G＞A、c.137C＞T、c.164C＞T、c.348G＞A、c.373C＞T、c.413T＞A、c.469C＞T、c.476T＞C、c.476T＞G、c.478T＞G、c.482C＞T、c.510C＞T、c.515T＞A、c.520G＞A、c.546+11C＞T、c.546+14G＞A、c.546+19G＞A、c.546+23C＞A、c.547-6、c.1071、c.1254、c.1552-30、c.1256A＞T、c.1551+1G＞T、c.546G＞T、.17C＞T、c.469C＞T、c.546+23C＞A、c.-32-102T＞C、c.-32-56C＞T、c.11G＞A、c.112G＞A、c.137C＞Tの位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列およびそれらと少なくとも80％の同一性を有する配列に相補的なアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0015】

１つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物に関するものであり、ポンペ病の治療に非常に有用である。

【0016】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態では、ヌクレオチドの少なくとも1つが修飾され、好ましくはオリゴマー化合物が一様に修飾される。

【0017】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態では、1つまたは複数のヌクレオチドの糖が修飾され、好ましくは糖修飾は2'-O-メチルまたは2'-O-メトキシエチルである。

【0018】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態では、1つまたは複数のヌクレオチドの塩基が修飾される。

【0019】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態では、オリゴマー化合物の骨格が修飾され、好ましくは、アンチセンスオリゴマー化合物は、モルホリノホスホロチオエートまたはモルホリノホスホロジアミダートである。

【0020】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号12または配列番号33のものである。

【0021】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、c.-32-3C＞G、c.17C＞T c.469C＞T c.546+23C＞A、c.-32-102T＞C c.-32-56C＞T c.11G＞A c.112G＞A、および、c.137C＞Tを含む群から選択される突然変異の位置を含む位置を標的とするGAAのゲノム核酸配列に相補的である。

【0022】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号1、37-40からなる群より選択される配列に相補的である。

【0023】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、細胞を本発明によるアンチセンスオリゴマー化合物と接触させることを含む、細胞中のGAAプレmRNAのスプライシングを調節する方法に関する。

【0024】

別の態様では、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴマー化合物の有効量を前記患者に投与することを含む、患者におけるポンペ病の治療方法に関する。

【0025】

別の態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物を投与する工程を含む、細胞におけるGAAの機能を回復させる方法に関する。

【0026】

別の態様では、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴマー化合物を被験体に投与することを含む、被験体の細胞、好ましくは筋肉細胞における異常な遺伝子発現を矯正する方法に関する。

【0027】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、細胞または患者がc.-32-13T＞G、c.-32-3C＞G、c.547-6、c.1071、c.1254、およびc.1552-300から選択される少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは細胞または患者が突然変異c.-32-3C＞Gまたはc.-32-13T＞Gを含む。

【0028】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、エクソンインクルージョンが達成され、好ましくはエクソン2がインクルージョンされる。

【0029】

別の態様では、本発明は、以下の突然変異c.-32-13T＞G、c.-32-3C＞G c.-32-102T＞C、c.-32-56C＞T、c.-32-46G＞A、c.-32-28C＞A、c.-32-28C＞T、c.-32-21G＞A、c.7G＞A、c.11G＞A、c.15_17AAA、c.17C＞T、c.19_21AAA、c.26_28AAA、c.33_35AAA、c.39G＞A、c.42C＞T、c.90C＞T、c.112G＞A、c.137C＞T、c.164C＞T、c.348G＞A、c.373C＞T、c.413T＞A、c.469C＞T、c.476T＞C、c.476T＞G、c.478T＞G、c.482C＞T、c.510C＞T、c.515T＞A、c.520G＞A、c.546+11C＞T、c.546+14G＞A、c.546+19G＞A、c.546+23C＞A、c.547-6、c.1071、c.1254、c.1552-30、c.1256A＞T、c.1551+1G＞T、c.546G＞T、.17C＞T、c.469C＞T、c.546+23C＞A、c.-32-102T＞C、c.-32-56C＞T、c.11G＞A、c.112G＞A、c.137C＞Tの位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に結合することができる化合物に関する。

【0030】

別の態様では、本発明は、配列番号1、37-40からなる群より選択される配列に結合することができる化合物に関する。

【0031】

別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも1つのアンチセンスオリゴマー化合物または本発明の化合物を含む医薬組成物に関する。

【0032】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、前記医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤および／または細胞送達剤をさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】スプライス部位突然変異の一般的分析のためのワークフロー。スプライス部位の使用の変化は、隣接エクソンにアニーリングするプライマーを用いたPCRによって検出され（隣接エクソンPCR）、続いて配列決定される（左部分）。異常なスプライス産物は、各エクソン内でアニーリングするプライマー（エクソン−内部qPCR；右部分）を用いて定量される。

【図2】健常対照と一般的なIVS1スプライス部位突然変異を有するポンペ患者のスプライシング解析。Ａ）健常対照の隣接エクソンPCR分析。エクソン番号はレーンの上に示されている。PCR産物を、アガロースゲル上での電気泳動により分離した。Ｂ）Ａ）と同様、ただしIVS1変異を有するポンペ患者1について。バンドの上の数字は、詳細に分析された生成物を参照のこと（下記参照）。Ｃ）患者1について検出された主要なスプライシング変異体の概略図。上の概略図はゲノムDNAを表し、突然変異が示されている。下の概略図は、本研究で検出されたスプライシング変異体を意味する。翻訳開始サイトはc.1と表示される。エクソンはボックスとして表示される。非コードエクソンは茶色で、エクソンは緑色である。イントロンは線として描かれている。破線は、イントロンがこの図面より長いことを示すために使用される。選択的スプライス部位が示される。Ｄ）エクソン−内部qPCR分析。ノーマライゼーションのためにβ-アクチンを使用した。健常対照から得られた値を100％に設定した。エラーバーは標準偏差（n=3）を示す。

【図3】ヘテロ接合変異／欠失を有するポンペ患者3および4のスプライシング分析。Ａ）患者3の隣接エクソンPCR分析。Ｂ）患者3について検出された主要なスプライシング変異体の概略図。Ｃ）患者4のエクソンに隣接エクソンPCR分析。Ｄ）患者4で対立遺伝子1から検出された主要なスプライシング変異体の概略図。Ｅ）Ｄ）と同様、ただし患者4の対立遺伝子2について。Ｆ）患者3および4のエクソン内部qPCR分析。エラーバーは標準偏差（n=3）を示す。

【図4】ホモ接合突然変異を有するポンペ患者のスプライシング解析。Ａ）患者5の隣接エクソンPCR分析。Ｂ）患者5について検出されたスプライシング変異体の概略図。Ｃ）患者6の隣接エクソンPCR分析。Ｄ）患者6について検出されたスプライシング変異体の概略図。Ｅ）患者7に隣接エクソンPCR分析。Ｆ）患者7について検出されたスプライシング変異体の概略図。Ｇ）患者5、6、および7のエクソン−内部qPCR分析。エラーバーは標準偏差（n=3）を示す。

【図5】ポンペ患者8の複合スプライシング変化の解析。Ａ）隣接エクソンPCR分析。Ｂ）エクソン8の分析から検出された対立遺伝子1由来のスプライシング変異体の概略図。Ｃ）エクソン9の分析から検出された対立遺伝子1由来のスプライシング変異体の概略図。Ｄ）エクソン10の分析から検出された対立遺伝子2由来のスプライシング変異体の概略図。 Ｅ）エクソン−内部qPCR分析。エラーバーは標準偏差（n=3）を示す。

【図6】表１ 本研究で使用したポンペ患者の検査診断。

【図7】表２ 研究された突然変異から生じるスプライシング事象の概要。患者1-3（青色）は、以前に特徴付けられ、試験の検証のために提供されている。患者4-8（赤色）がこの研究で調査され、すべての患者で新規スプライシング事象が明らかにされた。

【図8】患者2のスプライシング分析。Ａ）隣接エクソンPCR分析。 Ｂ）エクソン−内部PCR分析。

【図9】患者1の配列解析。

【図10】患者3(Ａ)および4（Ｂ−Ｃ）の配列解析。

【図11】Ａ）エクソン5にアニールする順方向プライマーとエクソン8にアニールする逆方向プライマーを使用した、エクソン7についての患者5の隣接エクソンPCR分析。比較のために、エクソン6および8の標準的な隣接エクソンPCR反応を示す。この患者におけるGAAのmRNA量は、NMDのために低いことに注意すること。Ｂ）患者5の配列解析。Ｃ）患者6の配列解析。Ｄ）患者7の配列解析。

【図12】患者8の配列解析。

【図13】患者8におけるエクソンの概略図および隣接エクソンPCR分析に使用されるPCRプライマーの位置。 スプライシング変異によって影響されるエクソンにアニールするプライマー対のみが示される。

【図14】5つのプログラム（SpliceSiteFinder-like（SSF）、MaxEntScan（MES）、NNSplice（NNS）、GeneSplicer（GS）およびHuman Splicing Finder（HSF）が野生型および変異体配列に適用された。

【図15】実施例1で使用された隣接エクソンPCRプライマー。

【図16】実施例1で使用されたエクソン−内部qPCRプライマー。

【図17】アンチセンス配列を有する新しいU7 snRNAベクターを迅速に生成するためにオーバーハングPCRとともに使用される修飾U7 snRNA。

【図18】改変されたU7 snRNAレンチウイルス系は、以前に公開されたように[Liu, S., et al., Inhibition of HIV-1 multiplication by antisense U7 snRNAs and siRNAs targeting cyclophilin A. Nucleic Acids Res, 2004. 32(12): p. 3752-9]、CyPAのスプライシングを妨害することができる。上図：シクロフィリンA（CyPA-E4）のエクソン4のRT-PCR分析。- （レーン1）：形質導入されていないHeLa細胞。+（レーン2）：Liuらの図1Bに記載のU7 / E4アンチセンス配列を発現する修飾U7 snRNAレンチウイルス（図17に記載）で形質導入されたHeLa細胞。下：β−アクチンmRNA。M：分子量DNAマーカー。

【図19】U7核内低分子RNAシステムを用いたアンチセンス配列を有するGAAプレ−mRNAのイントロン1およびエクソン2の配列について行われたスクリーニングのRT-qPCRを用いたRNA発現分析。数字は、表１によるアンチセンス配列位置を示す。

【図20】U7核内低分子RNAシステムを用いたアンチセンス配列を有するGAAプレ-mRNAのイントロン1およびエクソン2の配列について行われたスクリーニングのRT-PCRを用いたRNA発現解析。数字は、表１によるアンチセンス配列位置を示す。GAAに関するRT-PCRでは、3つの主要な生成物が観察される。上の生成物はエクソン2のインクルージョンを表し、下の二重線は、エクソン2の部分的スキップ（二重線の上のバンド）と、完全な二次のエクソン2のスキップ（二重線の下のバンド）を表す。β−アクチンRT-PCRをローディングコントロールとして用いた。

【図21】U7核内低分子RNAシステムを用いたアンチセンス配列を有するGAAプレ−mRNAのイントロン1およびエクソン2の配列について行われたスクリーニングのGAAの酵素活性。数字は、表１によるアンチセンス配列位置を示す。

【図22】不偏イントロン1およびエクソン2の検査のためのGAAを標的とするアンチセンス配列の位置の例。

【図23】Human Splicing Finderによるスプライス予測の例では、エンハンサーおよびサイレンサーモチーフの両方が予測されたので、同定された-178配列の相反する予測を示した。

【図24】mRNAスプライシングに影響を及ぼす配列を同定するミニ遺伝子構築物および方法。Ａ.ミニ遺伝子を生成し、ユニークな制限部位を追加する（赤色）。Ｂ.鋳型としてミニ遺伝子を用いて縮重PCRを実施する。Ｃ.ベクター中のPCR産物をライゲーションし、クローンを生成する。Ｄ.クローンをHEK293細胞にトランスフェクションし、エクソン隣接RT-PCRおよびエクソン内部qPCRによりエクソン2を含むRNAを分析する。Ｅ.クローンの配列分析。

【図25】IVS1ミニ遺伝子のスクリーニングで同定された突然変異の例。ミニ遺伝子構築物をHEK293細胞にトランスフェクトし、24時間後にスプライシングを分析した。Ａ．野生型ミニ遺伝子（WT）、IVS1突然変異（IVS1）を含むミニ遺伝子、および不偏ミニ遺伝子に基づくスクリーニングで同定されたクローン115および97のRT-PCR分析。生成物1：野生型mRNA、生成物2：部分的にスキップされたエクソン2 mRNA、生成物3：完全にスキップされたmRNA。Ｂ.スプライス製品の概略図。 Ｃ．RT-qPCR分析。ネオマイシン（別個のプロモーターからの同じプラスミド骨格から発現される）のRT-qPCR分析によるトランスフェクション効率について値を標準化し、β−アクチンRT-qPCR分析を用いた細胞数について測定した。

【図26】患者1におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたGAAエクソン2の異常スプライシングの補正。

【図27】患者2におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたGAAエクソン2の異常スプライシングの補正。

【図28】アンチセンスオリゴマー化合物の特異性。

【図32】患者線維芽細胞株１に対する配列番号33（AON 2）の効果の時間経過。

【図33】GAAエクソンインクルージョンのゲノム標的配列

【図34】健康な人のN-アセチルガラクトサミン4-スルファターゼ（アリルスルファターゼB; ARSB）に関するスプライシング試験。

【図35】ムコ多糖症タイプVI（Maroteaux-Lamy症候群）患者のN-アセチルガラクトサミン4-スルファターゼ（アリルスルファターゼB; ARSB）に関するスプライシング試験。

【図36】GAAエクソン2インクルージョンの標的配列。

【図37】GAA mRNAのイントロン6のインクルージョンにおけるナンセンス媒介性崩壊（NMD）経路の阻害の結果。

【発明を実施するための形態】

【0034】

詳細な説明

【0035】

アンチセンス技術の背後にある原理は、標的核酸にハイブリダイズするアンチセンス化合物が、転写、スプライシングまたは翻訳などの遺伝子発現活性を調節することである。この配列特異性により、アンチセンス化合物は、標的の確認および遺伝子機能化のためのツールとして、そして同時に、疾患に関与する遺伝子または遺伝子産物の発現を選択的に調節するための治療薬として、極めて魅力的なものとなっている。

【0036】

いくつかの真核生物のmRNA転写物は直接翻訳されるが、多くは“イントロン”として知られる1つ以上の領域を含み、それらは翻訳される前に転写物から切り出される。残りの（したがって翻訳された）領域は、“エクソン”として知られており、一緒にスプライスされて連続的なmRNA配列を形成するので、エクソンが結合している部位には、エクソン−エクソン接合が生じる。エクソン−エクソン接合を標的とすることは、正常なスプライス産物の異常なレベルが疾患に関与する状況、または、異常なスプライス産物の異常なレベルが疾患に関与する状況においては、有用であり得る。スプライス部位、すなわちイントロン−エクソン接合またはエクソン−イントロン接合を標的とすることはまた、異常なスプライシングが疾患に関与する状況、または、特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している場合においては、特に有用であり得る。再構成または欠失による異常な融合接合も、適切な標的となっている。異なる遺伝子源からの2つ（またはそれ以上）のmRNAのスプライシングのプロセスによって産生されるmRNA転写物は、“融合転写物”としても知られており、それはまた、適切な標的でもある。イントロンは、たとえば、DNAまたはプレmRNAに標的化されたアンチセンス化合物を用いることで、効果的に標的化され得るものであることも知られている。RNアーゼH機構を介して作用するオリゴヌクレオチド化合物などの一本鎖アンチセンス化合物は、プレmRNAを標的とするので、有効である。占有される塩基の機構を介して機能するアンチセンス化合物は、たとえば、mRNAのRNアーゼH切断を誘発し、むしろmRNAを無傷のままにして、所望のスプライス生成物の収率を促進するよう、スプライシングを再指示するのに効果的である。

【0037】

別のRNA転写物がDNAの同じゲノム領域から産生され得ることも、当該技術分野において知られている。これらの代替転写産物は、一般に“変異体”として知られている。より具体的には、“プレmRNA変異体”は、同じゲノムDNAから産生され、開始ゲノムDNAまたはストップ位置のいずれかで産生され、イントロン配列およびエクソン配列の両方を含む他の転写産物と異なる転写産物である。スプライシングの間に1つ以上のエクソンまたはイントロン領域またはその一部を切除すると、プレmRNA変異体は、より小さい“mRNA変異体”を産生する。その結果、mRNA変異体はプロセシングされたプレmRNA変異体となり、それぞれのユニークなプレmRNA変異体は、スプライシングの結果として常にユニークなmRNA変異体を生成することとなる。これらのmRNA変異体は、“選択的スプライス変異体”としても知られている。プレmRNA変異体のスプライシングが起こらない場合、プレmRNA変異体はmRNA変異体と同一ものとなる。

【0038】

転写を開始または停止させるための別のシグナルの使用によって変異体が産生され得ること、および、プレmRNAおよびmRNAは、より多くの1つの開始コドンまたは停止コドンを有することができることもまた、当該分野で公知である。代替の開始コドンを使用するプレmRNAまたはmRNAに由来する変異体は、そのプレmRNAまたはmRNAの“代替開始変異体”として知られている。代替停止コドンを使用する転写物は、そのプレmRNAまたはmRNAの“代替停止変異体”として知られている。代替停止変異体の1つの特定のタイプは、“ポリA変異体”であり、ここで生成された複数の転写産物は、転写機構による“ポリA停止シグナル”の1つの選択的な選択から生じ、固有のポリA部位で終結する転写産物を産生する。

【0039】

本明細書中で使用される場合、“アンチセンス機構”は全て、標的核酸との化合物のハイブリダイゼーションを含むものであり、ここで、ハイブリダイゼーションの結果または効果は、標的分解または標的占有と、たとえば、転写またはスプライシングのような、細胞機構の関与を同時に停止するものとなる。

【0040】

本明細書で使用されるように、“含む（to comprise）”およびそれに結合される用語は、単語に続く項目が含まれることを意味する非限定的な意味で使用されるが、特に言及されていない項目は除外されない。さらに、“からなる（to consist）”という動詞は、“本質的に〜からなる（to consist essentially of）”と置き換えることができ、本明細書で定義される化合物または補助化合物が、具体的に同定されたものよりも多くの成分を追加で含むことができるが、前記追加成分は本発明のユニークな特性を変えるものではない。

【0041】

冠詞“a”および“an”は、本明細書では、1つまたは複数の（すなわち、少なくとも1つの）文章の文法的対象を指すために使用される。

【0042】

“個体”、“患者”および“被験体”という用語は、本明細書において互換的に用いられ、哺乳動物、特に霊長類および好ましくはヒトを意味する。

【0043】

用語“エクソン”は、成熟形態のmRNA中に存在する遺伝子の一部を指す。 エクソンは、ORF（オープンリーディングフレーム）、すなわちタンパク質をコードする配列、ならびに5'および3'UTR（非翻訳領域）を含む。UTRは、タンパク質の翻訳に重要である。アルゴリズムおよびコンピュータプログラムは、DNA配列におけるエクソンを予測するために利用可能である（Grail、Grail 2およびGenscan、および、エクソン−イントロン接合を決定するための米国特許第20040219522号）。

【0044】

本明細書で使用される“タンパク質コードエクソン”という用語は、タンパク質（またはタンパク質の一部）をコードする（または少なくとも部分的にコードする）エクソンを指す。mRNA中のエクソンをコードする最初のタンパク質は、開始コドンを含むエクソンである。mRNA中のエクソンをコードする最後のタンパク質は、終止コドンを含むエクソンである。開始コドンおよび停止コドンは、当技術分野で周知の任意の数のプログラムを用いて予測することができる。

【0045】

本明細書中で使用される場合、用語“内部エクソン”は、別のエクソンによってその5 'および3'末端の両方に隣接するエクソンをいう。n個のエクソンを含むmRNAの場合、エクソン2からエクソン（n-1）は内部エクソンである。mRNAの最初および最後のエクソンは、本明細書では“外部エクソン”と呼ばれる。

【0046】

用語“イントロン”は、タンパク質に翻訳されない遺伝子の一部を指し、ゲノムDNAおよびプレmRNA中に存在するが、成熟mRNAの形成において除去される。

【0047】

“メッセンジャーRNA”または“mRNA”という用語は、ゲノムDNAから転写され、タンパク質合成のためのコード配列を有するRNAを指す。プレmRNA（前駆mRNA）はゲノムDNAから転写される。真核生物では、プレmRNAはmRNAにプロセシングされ、これには、イントロンの除去、すなわち“スプライシング”と5'および3'末端の修飾（たとえば、ポリアデニル化）が含まれる。mRNAは、典型的には、5'から3'、5'キャップ（修飾グアニンヌクレオチド）、5'UTR（非翻訳領域）、コード配列（開始コドンで始まり停止コドンで終わる）、3'UTR、およびポリ（A）テールを含む。

【0048】

用語“核酸配列”または“核酸分子”またはポリヌクレオチドは互換的に使用され、一本鎖または二本鎖形態のDNAまたはRNA分子を指す。“単離された核酸配列”とは、たとえば細胞内の核酸配列のような、単離された自然の環境にもはや存在しない核酸配列を指す。

【0049】

核酸分子における“突然変異”は、野生型配列と比較して1つ以上のヌクレオチドの変化であり、たとえば、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入によって置換されていてもよい。“点突然変異”は、単一ヌクレオチドの置換、または単一ヌクレオチドの挿入または欠失である。

【0050】

“配列同一性”および“配列類似性”は、グローバルまたはローカルアライメントアルゴリズムを用いて2つのペプチドまたは2つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。次いで、配列は、“実質的に同一”または“本質的に類似”と称され得て、たとえば、GAPまたはBESTFITまたはEmboss programの“Needle”（デフォルトパラメーターを使用、以下参照）によって最適に整列されている場合、配列同一性の少なくともある特定の最小パーセンテージを共有する。これらのプログラムは、NeedlemanとWunschのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用し、2つの配列をその全長にわたって整列させ、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小にする。一般に、デフォルトのパラメータが使用され、（ヌクレオチドおよびタンパク質アライメントの両方について）ギャップ作成ペナルティー=10およびギャップ伸長ペナルティー=0.5が用いられる。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはDNAFULLであり、タンパク質の場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはBlosum62である（Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915- 10919）。配列アラインメントおよびパーセンテージ配列同一性のスコアは、たとえばEMBOSS（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）のようなコンピュータプログラムを用いて決定することができる。あるいは、配列類似性または同一性は、FASTA、BLASTなどのようなデータベースを検索し、ヒットは、配列同一性を比較するために検索され、ペアワイズされなければならない。（核酸のスコアリングマトリックスDNAFULLおよびタンパク質のBlosum62を使用して、
デフォルトパラメーター、すなわちギャップ生成ペナルティー=10、ギャップ伸長ペナルティー=0.5を用いた、Emboss “needle”を使用して決定される）配列同一性のパーセンテージが少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれ以上、好ましくは90％、95％、98％、99％である場合、2つのタンパク質または2つのタンパク質ドメイン、または2つの核酸配列は、「実質的な配列同一性」を有する。そのような配列は、本明細書では「変異体」とも呼ばれ、たとえばアンチセンスオリゴマー化合物の他の変種が該当する。実質的な配列同一性を有する配列は必ずしも同じ長さを有さず、長さが異なってもよいことを理解すべきである。たとえば、同じヌクレオチド配列を有するが、3 'および／または5'側にさらなるヌクレオチドを有する配列は、100％同一である。

【0051】

本明細書で使用される用語“ハイブリダイゼーション”は、一般に、プローブ配列および標的配列の性質に応じて当業者に容易に明らかであるように、ストリンジェンシーの適切な条件での核酸のハイブリダイゼーションのことを意味するために使用される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は当該分野で周知であり、溶液のインキュベーション時間、温度および／またはイオン強度を変化させることによる所望のストリンジェンシーに応じた条件の調整は、容易に達成される。たとえば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照されたい。条件の選択は、ハイブリダイゼーションされる配列の長さ、特に、プローブ配列の長さ、核酸の相対的G-C含量および許容されるミスマッチの量によって決定される。相補性低い鎖間の部分的ハイブリダイゼーションが望ましい場合には、低ストリンジェンシー条件が好ましい。完全、または、ほぼ完全な相補性が所望される場合には、高ストリンジェンシー条件が好ましい。典型的な高ストリンジェンシー条件では、ハイブリダイゼーション溶液は、6×SSC、0.01M EDTA、1×デンハルト溶液および0.5％SOSを含む。ハイブリダイゼーションは、クローニングされたDNAの断片については約68℃で約3から4時間、全真核生物DNAについては約12から約16時間実施される。より低いストリンジェンシーのために、ハイブリダイゼーションの温度は、二重鎖の融解温度（TM）より低い約42℃にする。TMは、溶液のイオン強度だけでなく、G-C含量および二本鎖長さの関数であることが知られている。

【0052】

“対立遺伝子”という用語は、特定の遺伝子座における遺伝子の1つ以上の代替形態のいずれかを意味し、その全てが特定の遺伝子座における1つの形質または特徴に関連する。1つの対立遺伝子は、相同染色体対の各染色体上に存在する。これらは、遺伝子の同一の対立遺伝子（ホモ接合体）または2つの異なる対立遺伝子（ヘテロ接合体）であり得る。

【0053】

“突然変異対立遺伝子”は、本明細書では、野生型対立遺伝子と比較して、コード配列（mRNA、cDNAまたはゲノム配列）における1つまたは複数の突然変異を含む対立遺伝子のことを指す。そのような突然変異（たとえば、1つまたは複数のヌクレオチドの挿入、逆位、欠失および／または置換）は、たとえば タンパク質のために、たとえば 短縮され、または1つまたは複数のアミノ酸が欠失、挿入または置換されているアミノ酸配列を有するような、インビトロおよび／またはインビボでの機能性の減少（機能低下）、または、インビトロおよび／またはインビボでの機能性の欠損（機能喪失）したタンパク質をもたらし得る。そのような変化は、異なる立体配座を有し、異なる細胞内区画に標的化され、修飾された触媒ドメインを有し、核酸またはタンパク質等に対する結合活性が改変されたものなどのタンパク質につながる可能性があり、異なるスプライシング事象にもつながる可能性もある。

【0054】

遺伝子またはヌクレオチド配列またはアンチセンスオリゴマー化合物の“断片”は、分子の任意のサブセット、たとえば、より短いポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのことをいう。

【0055】

“変異体”は、アンチセンスオリゴマー化合物またはそのフラグメントと実質的に類似の分子、たとえば、1つ以上の置換ヌクレオチドを有するヌクレオチド置換変異体をいうが、特定の遺伝子とハイブリダイズする能力は維持される。好ましくは、変異体は、本発明によって同定される突然変異を含む。変異体は、より長い配列も含む。

【0056】

“類似体”は、分子全体、その変異体または断片のいずれかと実質的に類似または機能する非天然分子のことをいう。

【0057】

本明細書で使用する“前駆体mRNA”または“プレmRNA”という用語は、1つまたは複数の介在配列（イントロン）を含むメッセンジャーリボ核酸（mRNA）の未成熟一本鎖を指す。プレ−mRNAは、細胞核内のDNAの鋳型由来のRNAポリメラーゼによって転写され、イントロンとコード領域（エクソン）の交互の配列からなる。プレmRNAがイントロンのスプライシングおよびエクソンの接合によって完全にプロセシングされると、それは“メッセンジャーRNA”または“mRNA”と呼ばれ、これは専らエクソンからなるRNAである。真核生物のプレmRNAは、mRNAに完全にプロセシングされる前に一時的にしか存在しない。プレ−mRNAがmRNA配列に適切にプロセシングされた場合、それは核から排出され、最終的に細胞質のリボソームによってタンパク質に翻訳される。

【0058】

本明細書中で使用される場合、“スプライシング”および“プロセッシング”という用語は、イントロンが除去されエクソンが連結される転写後のプレmRNAの修飾を指す。Pre−mRNAスプライシングは、2つの連続した生化学反応を含む。両方の反応は、RNAヌクレオチド間のスプライセオソームのエステル転移反応を含む。第1の反応において、スプライセオソーム集合中に規定されるイントロン内の特定の分岐点ヌクレオチドの2'-OHは、ラリアット中間体を形成する5'スプライス部位でイントロンの第1のヌクレオチドに対して求核攻撃を行う。第2の反応では、放出された5'エクソンの3'-OHが、3'スプライス部位のイントロンの最後のヌクレオチドで求核攻撃を行い、エクソンに結合し、イントロンラリアットを放出する。Pre−mRNAスプライシングは、イントロンサイレンサー配列（ISS）、エクソンサイレンサー配列（ESS）および末端ステムループ（TSL）配列によって調節される。

【0059】

本明細書で使用する“イントロンサイレンサー配列（ISS）”および“エクソンサイレンサー配列（TSL）”という用語は、それぞれイントロンおよびエクソン内の配列要素を指し、プレmRNA内のトランス作用性タンパク質因子の結合による選択的スプライシングを制御し、それによりスプライス部位の差別的使用をもたらす。典型的には、イントロンサイレンサー配列は、エクソンイントロンジャンクションのスプライス部位よりも保存されていない。

【0060】

本明細書中で使用される場合、“スプライシングの調節”は、1つ以上のスプライス産物の増加または減少、または2つ以上のスプライス産物の比の変化が生じるように、mRNA前駆体のプロセシングを改変することを指す。スプライシングの調節は、エクソンスキッピングの結果としての異なるエクソンの組み合わせ、または、1つまたは複数のエクソンの欠失、または、スプライシングされたmRNA（たとえば、イントロン配列）に通常見出されない追加の配列を含むスプライスされたmRNA分子が含有するようなプレmRNA転写物のプロセシングを変化させることを指すこともできる。

【0061】

本明細書中で使用される場合、“スプライス部位”は、プレmRNA（スプライシングされていないRNA）分子（スプライスジャンクションとしても知られている）におけるエクソンとイントロンとの間の接合を指す。“隠れたスプライス部位”は、典型的には用いられないスプライス部位であるが、通常のスプライス部位がブロックされているかまたは利用できない場合、または突然変異により通常の休止部位が活性スプライス部位になる場合に使用され得る。“異常なスプライス部位”は、天然のDNAおよびプレmRNAの突然変異から生じるスプライス部位である。

【0062】

本明細書中で使用される場合、“スプライス生成物”または“スプライシング生成物”は、プレmRNAをスプライシングするプロセスから生成される成熟mRNA分子である。代替的に、スプライシングされたプレmRNAは、少なくとも2つの異なるスプライス産物を有する。たとえば、第1のスプライシング産物は、第2のスプライシング産物と比較して、追加のエクソンまたはエクソンの一部を含み得る。選択されたプレmRNAのスプライス生成物は、当業者に周知の様々な異なる技術によって同定することができる。

【0063】

本明細書中で使用される場合、“スプライスドナー部位”は、イントロンの5'末端、またはエクソンの3'末端に見出されるスプライス部位をいう。スプライスドナー部位は、“5'スプライス部位”と互換的に用いられる。本明細書において、“スプライスアクセプター部位”とは、イントロンの3'末端、またはエクソンの5'末端に見出されるスプライス部位をいう。スプライスアクセプター部位は、3'スプライス部位と互換的に使用される。

【0064】

本明細書で使用する“標的化する”または“標的化する”とは、化合物が核酸分子の選択された核酸分子または領域とハイブリダイズするようにオリゴマー化合物を設計するプロセスをいう。オリゴマー化合物を特定の標的核酸分子に標的化することは、多段階プロセスであり得る。このプロセスは、通常、発現が調節される標的核酸の同定から始まる。本明細書中で使用される場合、用語“標的核酸”および“GAAをコードする核酸”は、GAAをコードするDNA、そのようなDNAから転写されたRNA（プレmRNAおよびmRNAを含む）およびそのようなRNAに由来するcDNAをインクルージョンする。たとえば、標的核酸は、その発現が特定の障害または疾患状態に関連する細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたmRNA）、または感染因子由来の核酸分子であり得る。本明細書に開示されるように、標的核酸はGAAをコードしている。

【0065】

標的化プロセスは、通常、アンチセンス相互作用が生じる標的核酸内の少なくとも1つの標的領域、セグメント、または部位の決定を含み、その結果、所望の効果、たとえば、発現の調節が生じる。

【0066】

本明細書で使用される“標的mRNA”は、本明細書で提供されるオリゴマー化合物がハイブリダイズするように設計された核酸分子を指す。本開示の文脈において、標的mRNAは、通常、スプライシングされていないmRNAまたはプレmRNAである。本発明の文脈において、標的mRNAは、GAA mRNAまたはGAAプレmRNAである。

【0067】

“領域”は、少なくとも1つの同定可能な構造、機能、または特性を有する標的核酸の一部として定義される。標的領域は、たとえば、特定のエクソンまたはイントロンを含み得るか、または適切な標的領域として同定されるエクソンまたはイントロン内の選択されたヌクレオチドのみを含み得る。標的領域は、スプライシング抑制部位であってもよい。 標的核酸の領域内にセグメントがある。“セグメント”は、標的核酸内の領域のより小さい部分またはサブ部分として定義される。本発明において使用される“部位”は、標的核酸内のユニークな核酸塩基位置として定義される。本明細書中で使用される場合、オリゴマー化合物の“標的部位”は、化合物が結合する標的核酸の最も5'側のヌクレオチドである。

【0068】

標的分解は、RNA：DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼであるRNアーゼHを含むことができる。当技術分野では、“DNA様”である一本鎖アンチセンス化合物は、RNAseHによる切断を誘発することが知られている。アンチセンス化合物がハイブリダイズするが標的の切断を誘発しない占有に基づくアンチセンス機序は、翻訳の阻害、スプライシングの調節、ポリ（A）部位選択の調節および調節RNA構造の破壊を含む。本発明では、占有に基づくアンチセンス機構において使用するための“RNA様”アンチセンス化合物が好ましい。

【0069】

本開示の文脈において、“スプライス部位を標的とする”オリゴマー化合物は、スプライス部位をコードする核酸の領域の少なくとも一部とハイブリダイズする化合物またはmRNAのスプライシングが調節されるようにスプライス部位に近接したイントロンまたはエクソンとハイブリダイズする化合物を指す。

【0070】

“オリゴマー化合物”という用語は、核酸分子の領域にハイブリダイズすることができるポリマー構造を指す。この用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド模倣物およびこれらのキメラの組み合わせを含む。オリゴマー化合物は、通常は直線的に調製されるが、結合され、または環状であるようにも調製され得る。さらに、分枝構造は当該分野で公知である。オリゴマー化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分枝鎖またはヘアピンの形態で導入することができ、内部または末端の隆起またはループなどの構造要素を含むことができる。オリゴマー二本鎖化合物は、ハイブリダイゼーションおよび完全または部分的二本鎖化合物の形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する二本鎖化合物または一本鎖を形成するようにハイブリダイズされた二本鎖であり得る。

【0071】

“アンチセンスオリゴヌクレオチド、AONまたはアンチセンスオリゴマー化合物”という用語は、相補的なヌクレオチド配列を有するプレmRNAまたはmRNAと相互作用および／またはハイブリダイズし、それによって遺伝子発現および／またはスプライシングを改変することができるオリゴヌクレオチドを指す。酵素依存性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的mRNAを分解するためのRNアーゼH活性に依存する形態を含み、一本鎖DNA、RNA、およびホスホロチオエートアンチセンスを含む。ステロイド阻止アンチセンスオリゴヌクレオチド（RNase-H非依存性アンチセンス）は、mRNAの標的配列に結合することによって、遺伝子発現または他のmRNA依存性細胞プロセスを妨害する。立体遮断アンチセンスには、2'-Oアルキルアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびトリシクロ-DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。立体的なブロッキングアンチセンスオリゴヌクレオチドが本発明において好ましい。

【0072】

本明細書で使用される場合、“リボヌクレアーゼH非依存性”であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズした場合、RNアーゼHによる切断を誘発しない化合物である。RNアーゼH非依存性オリゴマー化合物は、スプライシングのような遺伝子発現を、標的占有に基づく機構によって調節する。RnaseH非依存性アンチセンスオリゴヌクレオチドが、本発明においては好ましい。

【0073】

本明細書で使用される“ハイブリダイゼーション”は、オリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本開示の文脈において、オリゴマー化合物は、非標的核酸配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合には、特異的にハイブリダイズ可能である。当業者は、オリゴマー化合物がいつ特異的にハイブリダイズ可能であるかを決定することができるであろう。

【0074】

本明細書中で使用される場合、“相補的”とは、伝統的なワトソン−クリック塩基対形成または他の非伝統的な種類の対形成（たとえば、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合）を可能にする。本開示のアンチセンスオリゴマー化合物に関して、アンチセンスオリゴマー化合物のその相補的配列との結合自由エネルギーは、アンチセンスオリゴマー化合物の関連する機能を進行させるのに十分であり、アンチセンスオリゴマー化合物の非共有結合を回避するのに十分な程度の相補性特異的結合が所望される条件下においては、すなわちex vivoまたはin vivo治療処置の場合の生理学的条件下においては、アンチセンスオリゴマー化合物の非標的配列への特異的結合を可能にする。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野において周知である（たとえば、Turner et ah, CSH Symp. Quant. Biol. 1/7:123-133 (1987); Frier et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-77 (1986); and Turner et al, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785 (1987)）。したがって、“相補的”（または“特異的にハイブリダイズ可能”）とは、アンチセンスオリゴマー化合物とプレmRNAまたはmRNA標的との間に、安定かつ特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性のある、または正確な対を形成していることを示す用語である。当技術分野では、核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能な標的核酸配列に対して100％相補的である必要はないことが理解される。すなわち、2つ以上の核酸分子は、完全に相補的ではない可能性がある。相補性は、第2の核酸分子と水素結合を形成することができる核酸分子中の隣接する残基のパーセンテージによって示される。たとえば、第1の核酸分子が10ヌクレオチドを有し、第2の核酸分子が10ヌクレオチドを有する場合、第1の核酸分子と第2の核酸分子との間の5、6、7、8、9または10ヌクレオチドの塩基対合は、それぞれ50％、60％、70％、80％、90％および100％の相補性を表す。標的核酸の領域とのオリゴマー化合物のパーセント相補性は、BLASTプログラム（基本的な局所アライメント検索ツール）および当該分野で公知のPowerBLASTプログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）を用いて慣例的に決定することができる。相同性、配列同一性または相補性のパーセンテージは、たとえば、SmithおよびWatermanのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を用いるGapプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.）によって決定される。“完全に”または“完全に”相補的な核酸分子は、第1の核酸分子のすべての連続する残基が第2の核酸分子中の同数の連続する残基と水素結合するものを意味し、核酸分子は、同じ数のヌクレオチドを有する（すなわち、同じ長さを有する）か、または2つの分子が異なる長さを有するかのいずれかである。

【0075】

本明細書中で使用される場合、“一様に修飾された”または“完全に修飾された”は、オリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または、本質的に各ヌクレオシドが均一修飾を有する糖修飾ヌクレオシドであるヌクレオチドの領域に用いられる。

【0076】

本明細書中で使用される場合、“キメラオリゴマー化合物”、“キメラアンチセンス化合物”または“キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物”は、それぞれ少なくとも1つのモノマー単位を含む2つ以上の化学的に異なる領域を含む化合物（すなわち、オリゴヌクレオチド化合物）である。“キメラアンチセンス化合物”という用語は、具体的には、同じオリゴマー化合物内の他の糖、ヌクレオチドおよびヌクレオシド間結合と比較して差異的に修飾されている、少なくとも1つの糖、核酸塩基および／またはヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物を指す。糖、ヌクレオチドおよびヌクレオシド間結合の残りの部分は、独立して改変または非改変することができる。一般に、キメラオリゴマー化合物は、単離された位置に存在し得るか、または特定のモチーフを規定する領域において一緒にグループ化され得る修飾ヌクレオシドを有する。キメラオリゴマー化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増大、細胞摂取の増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加をもたらすように改変された少なくとも1つの領域を含む。本開示の文脈において、“キメラRNase H非依存性アンチセンス化合物”は、少なくとも2つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物であり、標的核酸にハイブリダイズした場合にはRNアーゼHによる切断の影響を受けない。

【0077】

本明細書で使用する“ヌクレオシド”は塩基−糖の組み合わせであり、“ヌクレオチド”はヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。

【0078】

本明細書で使用されるように、修飾糖残基を有するヌクレオシドは、ヌクレオシドのリボース糖が化学的に修飾された糖部分で置換されている任意のヌクレオシドである。本開示の文脈において、化学的に修飾された糖部分は、以下に限定されるものではないが、2'-O-メトキシエチル、2'-フルオロ、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ、2'-グアニジニウム、2'-O-グアニジニウムエチル、2'-カルバメート、2'-アミノオキシ、2'-アセトアミド、および、ロックド核酸を含む。

【0079】

本明細書で使用される場合、“RNアーゼH分解に耐性がある”化合物は、RNアーゼH切断に対する化合物の耐性を増加させる少なくとも1つの化学修飾を有するアンチセンス化合物である。そのような修飾には、限定されるものではないが、糖修飾されたヌクレオチドが含まれる。本明細書中で使用される場合、修飾された糖を有するヌクレオチドは、限定されるものではないが、2'-デオキシリボース糖が化学的に修飾された糖部分で置換されている任意のヌクレオチドを含む。本発明の文脈において、化学的に修飾された糖部分としては、限定されるものではないが、2'-O-（2-メトキシエチル）、2'-フルオロ、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ、2'-グアニジニウム、2'-O-グアニジニウムエチル、2'-カルバメート、2'-アミノオキシ、2'-アセトアミド、ロックされた核酸（LNA）およびエチレン架橋核酸（ENA）を含む。RNアーゼH開裂に耐性の改変化合物は、本明細書に完全に記載されており、当業者に周知である。

【0080】

本開示の文脈において、“細胞取り込み”は、オリゴマー化合物の細胞への送達および内部移行を指す。オリゴマー化合物は、たとえば、培養（in vitro）、動物から採取した細胞（ex vivo）または動物投与後の組織（in vivo）により増殖させた細胞によって内在化することができる。

【0081】

“被験体”は、外植された細胞のドナーまたはレシピエントである生物体または細胞それ自体を意味する。“被験体”はまた、本開示の核酸分子が投与され得る生物を指す。本発明の一実施形態および／またはその実施形態は、被験体は哺乳動物または哺乳動物細胞である。別の実施形態では、被験体はヒトまたはヒト細胞である。

【0082】

本明細書中で使用される場合、用語“治療有効量”は、それが投与される被験体（たとえば、ヒト）において、記載の疾患、障害または状態を治療または予防するために使用される、十分な程度のアンチセンスオリゴマー化合物の量を意味する。本開示のアンチセンスオリゴマー化合物は、個々に、または他の薬物と組み合わせて、または他の薬物と組み合わせて、本明細書で論じられる疾患または状態を処置するために使用され得る。たとえば、特定の疾患、障害または状態を治療するために、治療に適した条件下で、個別に、または1つ以上の薬物と組み合わせて、アンチセンスオリゴマー化合物を患者に投与することができ、または、当業者に明らかな他の適切な細胞に投与することができる。本発明において、疾患は、好ましくはポンペ病である。

【0083】

本明細書で使用される“薬学的に許容される”という語句は、ヒトに投与された場合、典型的にはアレルギー反応または同様の不都合な反応、たとえば胃の不調和、めまいなどを引き起こさない、生理学的に許容される化合物および組成物を指す。好ましくは、本明細書中で使用される場合、“薬学的に許容される”という用語は、連邦または州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方または動物、特にヒトにおける使用のために一般に認められている薬局方に列挙されることを意味する。

【0084】

本明細書で使用される場合、用語“単離された”は、参照された物質が、その天然の環境、たとえば細胞から除去されることを意味する。したがって、単離された生物学的材料は、細胞成分のいくつかまたは全て、すなわち、ネイティブ材料が自然に生じた（たとえば、細胞質または膜成分）細胞の成分を、含まなくてもよい。

【0085】

本明細書で使用される「精製された」という用語は、無関係の物質、すなわち物質が得られる元の物質を含む汚染物質の存在を低減または排除する条件下で単離された物質を指す。たとえば、精製されたtc-DNAアンチセンスオリゴマー化合物は、組織培養成分、夾雑物などを含む細胞成分または培養成分を実質的に含まないことが好ましい。本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、材料の分析試験の文脈では、操作上にて使用される。好ましくは、実質的に汚染物質を含まない精製された物質は少なくとも50％の純度であり、より好ましくは少なくとも90％純粋、より好ましくは少なくとも99％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および、当該分野で公知の他の方法によって評価することができる。

【0086】

本明細書では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値および適宜、それらの分数（たとえば、10分の1および100分の1 整数）である。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さのような任意の物理的特徴に関する本明細書に記載された任意の数の範囲は、他に示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、他に指示がない限り、示された範囲、値または構造の平均±20％を“約”または“本質的に”とする。

【0087】

本明細書で使用される場合、用語“含む”および“含む”は同義語として使用される。 本明細書で使用される用語“a”および“an”は、列挙された構成要素の“1つまたは複数”を指すことを理解されたい。代替物（たとえば、“または”）の使用は、代替物の1つ、その両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。

【0088】

“約”または“およそ”という用語は、統計的に意味のある値の範囲内を意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の1桁以内、好ましくは50％以内、より好ましくは20％以内、より好ましくは10％以内、さらにより好ましくは5％以内であり得る。用語“約”または“およそ”に包含される許容可能な変動は、研究中の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。

【0089】

一態様では、本発明は、配列番号1を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物および配列番号1の一塩基多型を対象とする。

【0090】

他の者の以前の研究により、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を含むいくつかのヒト疾患におけるエクソン排除を促進するアンチセンスオリゴマー化合物の設計がもたらされた。この戦略は単純かつ直接的であり、よく定義されたスプライス部位をブロックすることに依存する。これによりエクソンがスキップされ、それにより病原性遺伝子変異体を含むエクソンが除去される。得られたmRNAは少し短くなり、かなりの残留活性を有する切断されたタンパク質の発現をもたらし、疾患を少なくとも部分的に軽減するのに十分である。この戦略は、事実上すべての遺伝子について標準的スプライス部位が知られているため、単純である。唯一の要件は、プレmRNAの古典的スプライス部位に結合するアンチセンスオリゴマー化合物を設計することであり、その部位のブロッキングを引き起こし、関与するエクソンのスキップを生じる。

【0091】

はるかに困難な作業は、エクソンの排除ではなくインクルージョンを促進する逆のプロセスである。エクソンのインクルージョンを促進するために、アンチセンスオリゴマー化合物を用いてスプライスリプレッサーをブロックすることができる。しかしながら、スプライスリプレッサーがどこに位置しているかは不明である。これらは、イントロンまたはエクソンに存在することができ、イントロンまたはエクソンスプライスサイレンサー（それぞれISSまたはESS）と命名される。このようなサイレンサーの存在を予測するソフトウェアはあるが、これらは非常に信頼性がない。これは、予測スプライスサイレンサーモチーフの活性を確認することができなかったGAAエクソン1-3を含むミニ遺伝子システムを用いた我々自身の経験によってさらに説明される。ポンペ病を治療するためのアンチセンスオリゴマー化合物を用いたエクソン2のGAAのインクルージョンを促進する考えは全く新規である。本発明者らは、スプライスリプレッサー配列がU7-snRNAアンチセンスオリゴマー化合物スクリーニングおよびランダム突然変異誘発／ミニ遺伝子スクリーニングの2つのスクリーニングによって同定され得ることを特許出願（PCT/NL2014/050375）に示す。このスクリーニングからの1つの標的配列は、アンチセンスオリゴマー化合物でうまく標的化され、IVS1変異体の文脈におけるGAAエクソン2のインクルージョンが強化された。これは、野生型GAA mRNAの豊富な存在量によって視覚化されるように、IVS1変異体によって引き起こされるエクソン2の異常なスプライシングを修正した。

【0092】

配列番号1を標的とする配列は、GAAエクソン2のインクルージョンを増強することができることが見出された。また、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40を標的とする配列は、GAAエクソン2のインクルージョンを高めることができることが見出された。標的化とは、配列番号1の配列の少なくとも一部が標的化されることを意味すること、配列番号1の少なくとも一部にハイブリダイズする配列によって、または配列番号1の少なくとも一部に結合する配列によってコードされていることに留意されたい。標的とする配列は、標的配列よりも短くても長くてもよい。

【0093】

【0094】

適切には、配列番号1を標的とする配列は、配列番号1の少なくとも一部とハイブリダイズする。ハイブリダイズする配列は、標的配列よりも短くても長くてもよい。配列番号2-33のヌクレオチド配列は、GAAエクソン2のインクルージョンを増強することができるオリゴマーである。

【0095】

2つの変異型アンチセンスオリゴマー化合物（21ヌクレオチド（配列番号33）の1つと25ヌクレオチド（配列番号12）の1つ）が試験され、両方がエクソン2インクルージョンを増強することが見出された。これは、少なくとも2倍のGAA酵素活性の増強を伴う。 IVS1変異体を有する患者は、約15％の漏出性野生型スプライシングを有することが知られている。2倍の増強は、20％の疾患閾値を上回ることが知られている約30％の酵素活性をもたらし、したがって、リソソームグリコーゲン分解の少なくとも一部、または完全に回復することが予期される。

【0096】

その側面および／またはその実施形態の1つの態様または実施形態において、本発明は、配列番号2-33を含む群から選択されるアンチセンスオリゴマー化合物、および少なくとも80％の同一性を有する改変体および断片に関する。アンチセンスオリゴマー化合物はまた、配列番号1、37、38、39、40の一塩基多型を標的とすることができる。配列番号2-33の全長を有する必要はなく、より短いまたはより長い配列を有する断片もまた想定されることに留意すべきである。本発明者らは、GAAのエクソン2を含むことを可能にする標的ゲノム配列を見出したので、当業者は、この標的ゲノム配列、たとえば配列番号1、37、38、39、40およびその一塩基多型を標的とする適切な配列を見出すことができる。この標的ゲノム配列を標的とする例示的な配列、たとえば配列番号1、37、38、39、または41は、配列番号2-33でもよいが、それらの同一性が少なくとも80％である変異体および断片であってもよい。特に、より短い断片、たとえば配列番号2-33の18、19、20、21、22、23または24ヌクレオチドの断片が想定される。

【0097】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、配列番号1、37-40およびその一塩基多型を含む群から選択される配列を有するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴマー化合物に関する。また、配列番号1、37-40を含む群から選択される配列を有するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴマー化合物に対して少なくとも80％の同一性を有する配列も想定される。1つ以上の一塩基多型を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物を設計することができる。

【0098】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、ゲノム配列c-32-156_-210を含む群から選択される配列を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0099】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、配列番号2-33、41-153および少なくとも80％の同一性を有する配列を含む群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0100】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、配列番号2-33および41-540を含む群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0101】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、以下の突然変異c.-32-13T＞G、c.-32-3C＞G c.-32-102T＞C、c.-32-56C＞T、c.-32-46G＞A、c.-32-28C＞A、c.-32-28C＞T、c.-32-21G＞A、c.7G＞A、c.11G＞A、c.15_17AAA、c.17C＞T、c.19_21AAA、c.26_28AAA、c.33_35AAA、c.39G＞A、c.42C＞T、c.90C＞T、c.112G＞A、c.137C＞T、c.164C＞T、c.348G＞A、c.373C＞T、c.413T＞A、c.469C＞T、c.476T＞C、c.476T＞G、c.478T＞G、c.482C＞T、c.510C＞T、c.515T＞A、c.520G＞A、c.546+11C＞T、c.546+14G＞A、c.546+19G＞A、c.546+23C＞A、c.547-6、c.1071、c.1254、c.1552-30、c.1256A＞T、c.1551+1G＞T、c.546G＞T、.17C＞T、c.469C＞T、c.546+23C＞A、c.-32-102T＞C、c.-32-56C＞T、c.11G＞A、c.112G＞A、c.137C＞Tの位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0102】

上記の突然変異はスプライシングを調節することが見出されている。突然変異の位置を標的とすることによって、スプライシングを調節することもできる。したがって、アンチセンスオリゴマー化合物が変異の位置を標的とすることが理解される。突然変異の命名法は、位置および突然変異を同定する。アンチセンスオリゴマー化合物は突然変異の位置を標的とし、突然変異はゲノム配列またはプレmRNAに存在する必要はないことが理解される。したがって、突然変異の位置は、突然変異したヌクレオチドの位置、または突然変異の野生型ヌクレオチドの位置である。アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の上流のヌクレオチドおよび下流のヌクレオチドを含む配列を標的とすることができる。適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の2-50ヌクレオチド上流および／または2-50ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の3-45ヌクレオチド上流および／または3-45ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の5-40ヌクレオチド上流および／または5-40ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の6-35ヌクレオチド上流および／または6-35ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の7-33ヌクレオチド上流および／または7-33ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の8-30ヌクレオチド上流および／または8-30ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の9-28ヌクレオチド上流および／または9-28ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の10-25ヌクレオチド上流および／または10-25ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の11-22ヌクレオチド上流および／または11-22ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の12-20ヌクレオチド上流および／または12-20ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の13-18ヌクレオチド上流および／または13-18ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より適切には、アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置の14-16ヌクレオチド上流および／または14-16ヌクレオチド下流を含む配列を標的とする。

【0103】

命名法は当業者に周知であり、Dunnen and Antonarakis Human mutation 15:7-12(2000)およびAntonarakis SE, the Nomenclature Working Group. 1998.、ヒト遺伝子突然変異のための命名法システムに関する推奨事項、Hum Mutat 11：1-3、およびウェブサイト（http://www.dmd.nl/mutnomen.html）に見出すことができる。ゲノムの位置は、www.pompecenter.nlでも見つけることができる。これらの全ては、参考として援用される。

【0104】

好ましくは、ゲノム核酸配列はプレmRNAである。

【0105】

これらのアンチセンスオリゴマー化合物は、グリコーゲン貯蔵疾患II型/ポンペ病の治療に有用である。

【0106】

1つの局面において、または標的配列は、イントロンスプライシングサイレンサーまたはISSである。本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、標的配列はGCTCTGCACTCCCCTGCTGGAGCTTTTCTCGCCCTTCCTTCTGGCCCTCTCCCCA（配列番号1）である。天然に存在する一塩基多型も含まれることに留意すべきである。配列番号1を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物は、ポンペ患者を治療するのに非常に適している。配列番号1を標的とする例示的なアンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号2-33、特に配列番号12および配列番号33である。しかしながら、本発明はこれらの2つの配列に限定されない。当業者は、標的配列の配列番号1、37、38、39、または40に対するアンチセンスオリゴマー化合物を設計することができる。標的配列配列番号1に対するアンチセンスオリゴマー化合物は、10から100ヌクレオチドの長さを有し得るものであり、好ましくは11から75ヌクレオチド、好ましくは12から73ヌクレオチド、好ましくは13から70ヌクレオチド、好ましくは14から65ヌクレオチド、好ましくは15から60ヌクレオチド、好ましくは16から55ヌクレオチド、好ましくは17から50ヌクレオチド、好ましくは18から45ヌクレオチド、好ましくは19から40ヌクレオチド、好ましくは20から38ヌクレオチド、好ましくは21から35ヌクレオチド、好ましくは22から33ヌクレオチド、好ましくは23から30ヌクレオチド、好ましくは24から29ヌクレオチド、好ましくは25から28ヌクレオチド、好ましくは26から27ヌクレオチドである。

【0107】

以下に、配列番号1を標的とする例示的なアンチセンスオリゴマー化合物を示す

【0108】

【0109】

上記の例では、配列は25ヌクレオチド長であるが、より長い変異体またはより短いフラグメントもまた想定される。例示的なものは、わずか21ヌクレオチド長であり、配列番号12と同じヌクレオチドを含むがより短い配列番号33である。本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号2-33の群、その断片、および、少なくとも80％の配列同一性を有するおよび変異体の群から選択される。本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号2-33の群、その断片、および、少なくとも80％、83％、85％、87％、90％、92％、93％、94％、95 配列番号2-33に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％の配列同一性を有する変異体の群から選択される。

【0110】

本発明は、配列番号2-33と少なくとも80％同一である配列にも関する。好ましくは配列番号2-33と少なくとも85％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも88％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも90％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも91％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも92％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも93％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも94％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも95％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも96％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも97％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも98％同一であり、より好ましくは配列番号2-33と少なくとも99％同一である。

【0111】

好ましいアンチセンス配列は、配列番号12および配列番号33、または、それらと少なくとも80％同一である配列であって、配列番号12、および／または33に対して好ましくは少なくとも85％同一であり、より好ましくは少なくとも88％同一であり、より好ましくは少なくとも90％同一であり、より好ましくは少なくとも91％同一であり、より好ましくは少なくとも92％同一であり、より好ましくは少なくとも93％同一であり、より好ましくは少なくとも94％同一であり、より好ましくは少なくとも95％同一であり、より好ましくは少なくとも96％同一であり、より好ましくは少なくとも97％同一であり、より好ましくは少なくとも98％同一であり、より好ましくは少なくとも99％同一のものである。

【0112】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、フラグメントが16、17、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチド長である、配列番号2-33のフラグメントの群から選択される。本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、フラグメントが17、18、19、20、21または22ヌクレオチド長である、配列番号2-33のフラグメントから選択される。本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、フラグメントが19、20または21ヌクレオチド長である、配列番号2-33のフラグメントの群から選択される。

【0113】

アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号41-540の群から選択され得る：

【0114】

U7スクリーニングで同定された配列：配列番号41-97

【0115】

上記の例では、配列は25ヌクレオチド長であるが、より長い変異体またはより短いフラグメントもまた想定される。本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号41−540、そのフラグメントおよび少なくとも80％の配列同一性を有する改変体の群から選択される。本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号41-540、そのフラグメント、および、配列番号41-540と少なくとも80％、83％、85％、87％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％の配列同一性を有する改変体の群から選択される。

【0116】

本発明は、配列番号41-540と少なくとも80％同一である配列にも関する。好ましくは配列番号41-540と少なくとも85％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも88％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも90％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも91％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも92％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも93％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも94％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも95％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも96％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも97％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも98％同一であり、より好ましくは配列番号41-540と少なくとも99％同一である。

【0117】

本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、16、17、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチドの長さのフラグメントである配列番号41-540のフラグメントの群から選択される。本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、17、18、19、20、21、または22ヌクレオチドの長さのフラグメントである配列番号41-540のフラグメントの群から選択される。本発明の好ましい態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、19、20または21ヌクレオチドの長さのフラグメントである配列番号41-540のフラグメントの群から選択される。

【0118】

本発明の好ましい実施形態および／またはその実施形態では、標的配列はイントロン6の排除を提供する。配列番号1584は、イントロン6を排除するための標的配列を提供することが見出された。

【0119】

本発明の好ましい態様および／または態様の実施形態および／またはその実施形態において、標的配列はAACCCCAGAGCTGCTTCCCTTCCAGATGTGGTCCTGCAGCCGAGCCCTGCCCTTAGCTGGAGGTCGACAGGTGGGATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGCCCAGAGCCCAAGAGCGTGGTGCAGCAGTACCTGGACGTTGTGGGTAGGGCCTGCTCCCTGGCCGCGGCCCCCGCCCCAAGGCTCCCTCCTCCCTCCCTCATGAAGTCGGCGTTGGCCTGCAGGATACCCGTTCATGCCGCCATACTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCCGCTGGGGCTACTCCTCCACCGCTATCACCCGCCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGTGAGTTGGGGTGGTGGCAGGGGAG（配列番号1584）である。天然に存在する一塩基多型も含まれることに留意すべきである。

【0120】

また、以下のゲノム配列は、GAAのイントロン6を除外するための標的配列である：

【0121】

標的化とは、配列番号1584-1589の配列の少なくとも一部、たとえば 配列番号1584-1589の少なくとも一部とハイブリダイズする、または配列番号1584-1589の少なくとも一部に結合する配列によって、標的化されることを意味する。標的とする配列は、標的配列よりも短くても長くてもよい。

【0122】

適切には、配列番号1584-1589を標的とする配列は、配列番号1584-1589の少なくとも一部とハイブリダイズする。ハイブリダイズする配列は、標的配列よりも短くても長くてもよい。配列番号541-1583のヌクレオチド配列は、GAAイントロン6の排除を増強することができるオリゴマーである。

【0123】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、配列番号541-1583および少なくとも80％の同一性を有する変異体および断片を含む群から選択されるアンチセンスオリゴマー化合物に関する。アンチセンスオリゴマー化合物はまた、配列番号1584-1589の一塩基多型を標的とすることもできる。配列番号541-1583の全長を有する必要はなく、より短いまたはより長い配列を有する断片もまた想定されることに留意すべきである。本発明者らは、イントロン6の排除を可能にする標的ゲノム配列を見出し、そして、当業者は、この標的ゲノム配列を標的とする適切な配列、たとえば配列番号1584-1589およびその一塩基多型を見出すことができる。この標的ゲノム配列を標的とする例示的な配列、たとえば配列番号1584-1589は、配列番号541-1583であり得るが、それらの同一性を少なくとも80％有する変異体および断片でもあり得る。特に、配列番号541-1583の18、19、20、21、23または24ヌクレオチドを有する断片などのより短い断片が想定される。

【0124】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、配列番号1584-1589を含む群から選択される配列およびその一塩基多型を有するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴマー化合物に関する。また、配列番号1584-1589を含む群から選択される配列を有するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴマー化合物に対して少なくとも80％の同一性を有する配列も想定される。1つ以上の一塩基多型を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物を設計することができる。

【0125】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、ゲノム配列c.956-25_1194+25を含む群から選択される配列を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0126】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、配列番号41-1583およびその少なくとも80％の同一性を有する配列を含む群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0127】

1つの態様または態様の実施形態および／またはその実施形態において、本発明は、配列番号541-1583を含む群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴマー化合物に関する。

【0128】

配列番号1584を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物は、ポンペ患者を治療するのに非常に適している。配列番号1584を標的とする例示的なアンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号541-1853である。しかし、本発明はこれらの配列に限定されない。当業者は、標的配列配列番号1584、1885、1586、1587、1588、1589に対するアンチセンスオリゴマー化合物を設計することができる。標的配列配列番号1584、1885、1586、1587、1588または1589に対するアンチセンスオリゴマー化合物は、10から100ヌクレオチドの長さを有してもよく、好ましくは11から75ヌクレオチド、好ましくは12から73ヌクレオチド、好ましくは13から70ヌクレオチド、好ましくは14から65ヌクレオチド、好ましくは15から60ヌクレオチド、好ましくは16から55ヌクレオチド、好ましくは17から50ヌクレオチド、好ましくは18から45ヌクレオチド、好ましくは19から40ヌクレオチド、好ましくは20から38ヌクレオチド、好ましくは21から35ヌクレオチド、好ましくは22から33ヌクレオチド、好ましくは23から30ヌクレオチド、好ましくは24から29ヌクレオチド、好ましくは25から28ヌクレオチド、好ましくは26から27ヌクレオチドである。

【0129】

アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号541-1583の群から選択することができる:

【0130】

上記の例では、配列は18ヌクレオチド、21ヌクレオチドおよび25ヌクレオチドであるが、より長いバリアントまたはより短いフラグメントもまた想定される。本発明の好ましい態様および／または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号541-1583、およびその断片、および、少なくとも80％の配列同一性を有するその変異体の群から選択される。本発明の好ましい態様および／または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号541-1583、およびその断片、および配列番号541-1583と少なくとも80％、83％、85％、87％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％ 、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％の配列同一性を有する変異体の群から選択される。

【0131】

または配列番号541-1583と少なくとも80％同一である配列。好ましくは配列番号541-1583と少なくとも85％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも88％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも90％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも91％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも92％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも93％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも94％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも95％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも96％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも97％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも98％同一であり、より好ましくは配列番号541-1583と少なくとも99％同一である。

【0132】

本発明の好ましい態様および／または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号541-1583のフラグメントであって、16、17、18、19、20、21、22、23または24ヌクレオチドの長さのフラグメントの群から選択される。本発明の好ましい態様および／または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号541-1583のフラグメントであって、17、18、19、20、21、または22ヌクレオチドの長さのフラグメントの群から選択される。本発明の好ましい態様および／または態様の実施形態および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号541-1583のフラグメントであって、19、20または21ヌクレオチドの長さのフラグメントの群から選択される。

【0133】

アンチセンスオリゴマー化合物はまた、c.-32-13T＞G (IVS1)、c.1636+5G＞T、c.525delT、c.-32-3C＞G、c. 1551+1G＞A、c.1075G＞A、c.1552-3C＞G、c.1437G＞A、c.1256A＞T、c.1551+1G＞Tの群から選択される突然変異の位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的であってもよい。

【0134】

好ましくは、ゲノム核酸配列はプレmRNAである。

【0135】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物はまた、c.-32-3C＞G、c.-32-13T＞G、c.-32-102T＞C、c.-32-56C＞T、c.-32-46G＞A、c.-32-28C＞A、c.-32-28C＞T、c.-32-21G＞A、c.7G＞A、c.11G＞A、c.15_17AAA、c.17C＞T、c.19_21AAA、c.26_28AAA、c.33_35AAA、c.39G＞A、c.42C＞T、c.90C＞T、c.112G＞A、c.137C＞T、c.164C＞T、c.348G＞A、c.373C＞T、c.413T＞A、c.469C＞T、c.476T＞C、c.476T＞G、c.478T＞G、c.482C＞T、c.510C＞T、c.515T＞A、c.520G＞A、c.546+11C＞T、c.546+14G＞A、c.546+19G＞A、c.546+23C＞A、c.547-6、c.1071、c.1254およびc.1552-30の群から選択される突然変異の位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的であり得る。

【0136】

好ましくは、ゲノム核酸配列はpre-mRNAである。

【0137】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物はまた、c.17C＞T c.469C＞T c.546+23C＞A、c.-32-102T＞C c.-32-56C＞T c.11G＞A c.112G＞A c.137C＞Tの群から選択される突然変異の位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的であり得る。

【0138】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物はまた、c.17C＞T c.469C＞T c.546+23C＞Aの群から選択される突然変異の位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的であり得る。

【0139】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物はまた、c.-32-102T＞C c.-32-56C＞T c.11G＞A c.112G＞A c.137C＞Tの群から選択される突然変異の位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的であり得る。

【0140】

最も好ましいのは、c.-32-13T＞G (IVS1)の突然変異の位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴマー化合物である。

【0141】

最も好ましいのは、c.-32-3C＞G、c.1256A＞T、c.1551+1G＞T, c.546G＞Tの突然変異の位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴマー化合物である。

【0142】

最も好ましいのは、c.-32-3C＞Gの突然変異の位置を含む位置を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴマー化合物である。

【0143】

最も好ましいのは、配列番号1を標的とするGAA遺伝子のゲノム核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴマー化合物である。

【0144】

GCTCTGCACTCCCCTGCTGGAGCTTTTCTCGCCCTTCCTTCTGGCCCTCTCCCCA（配列番号1）。

【0145】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、8から80ヌクレオチドの長さ、9から50ヌクレオチドの長さ、10から30ヌクレオチドの長さ、12から30ヌクレオチドの長さ、15から25ヌクレオチドの長さまたは約20ヌクレオチドの長さである。当業者は、これが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80ヌクレオチドの長さのアンチセンス化合物を含むことを理解するであろう。

【0146】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は13から80ヌクレオチドを含む。当業者は、これが13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80ヌクレオチドのアンチセンス化合物を具体化することを理解するであろう。

【0147】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は13から50ヌクレオチドを含む。当業者は、これが13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドのアンチセンス化合物を具体化することを理解するであろう。

【0148】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は13から30ヌクレオチドを含む。当業者は、これが13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 または30ヌクレオチドのアンチセンス化合物を具体化することを理解するであろう。

【0149】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は20から30ヌクレオチドを含む。当業者は、これが20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドのアンチセンス化合物を具体化することを理解するであろう。

【0150】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は15から25ヌクレオチドを含む。当業者は、これが15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 または25ヌクレオチドのアンチセンス化合物を具体化することを理解するであろう。

【0151】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は20ヌクレオチドを含む。

【0152】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は190ヌクレオチドを含む。

【0153】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は18ヌクレオチドを含む。

【0154】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は17ヌクレオチドを含む。

【0155】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は16ヌクレオチドを含む。

【0156】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は15ヌクレオチドを含む。

【0157】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は14ヌクレオチドを含む。

【0158】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は13ヌクレオチドを含む。

【0159】

本発明の1つの態様および／またはその実施形態では、化合物は、特許請求されるアンチセンス化合物のうちの1つ由来の少なくとも8個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。好ましくは、請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも9個の連続したヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも10個の連続するヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも11個の連続したヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも12個の連続するヌクレオチド、より好ましくは、請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも13個の連続したヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも14個の連続したヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも15個の連続するヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも16個の連続するヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも17個の連続したヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも18個の連続したヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも19個の連続するヌクレオチド、より好ましくは請求項に記載のアンチセンス化合物の1つからの少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含む。

【0160】

オリゴヌクレオチドからの残りのヌクレオチドは、RnアーゼH、細胞標的化配列、細胞浸透配列、マーカー配列または任意の他の配列に対する耐性を改善するオリゴヌクレオチドであり得る。

【0161】

本明細書中に開示されるアンチセンス化合物で武装した当業者は、過度の実験をすることなく、さらなるアンチセンス化合物を同定することができるであろう。

【0162】

アンチセンスオリゴヌクレオチドが治療上の成功を達成するためには、オリゴヌクレオチド化学は適切な細胞取り込みを可能にしなければならない（Kurreck, J. (2003) Eur. J. Biochem. 270:1628-1644）。スプライシングオリゴヌクレオチドは、従来、オリゴヌクレオチドをRNA様にする均一な修飾から構成されており、したがってRNアーゼHによる切断に耐性であり、このことはスプライシングの調節を達成するためには重要である。本明細書において、スプライシングの調節のためのアンチセンス化合物が提供される。

【0163】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物はRNA様およびDNA様化学の領域を有するキメラである。DNA様化学の領域にもかかわらず、キメラ化合物は好ましくはRNアーゼ耐性であり、インビトロおよびインビボで標的mRNAのスプライシングを効果的に調節する。別の好ましい実施形態では、開示されるアンチセンスオリゴマー化合物は、均一に修飾されたオリゴヌクレオチドと比較して、細胞取り込みの増大および薬理活性の増大を示す。

【0164】

本明細書では、標的mRNAのスプライス部位を標的とする、またはリプレッサー配列をスプライシングする、またはエンハンサー配列をスプライシングする、好ましくはリプレッサー配列をスプライシングするアンチセンスオリゴマー化合物が考えられる。スプライス部位は、異常なスプライス部位および潜在的なスプライス部位を含む。

【0165】

当業者は、アンチセンス化合物の活性を排除することなく、ミスマッチの包含が可能であることを認識する。したがって、本明細書で提供される化合物は、アンチセンス化合物の標的への塩基対形成を破壊するヌクレオチドを約20％まで含むことができるアンチセンス化合物を対象とする。好ましくは、化合物は、約15％以下、より好ましくは約10％以下、最も好ましくは5％以下またはミスマッチを含まない。残りのヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション（たとえば、ユニバーサル塩基）を破壊しない。

【0166】

当技術分野において、ヌクレオチド親和性修飾の取り込みは、非修飾化合物と比較してより多くのミスマッチを可能にし得ることが理解される。同様に、特定のオリゴヌクレオチド配列は、他のオリゴヌクレオチド配列よりもミスマッチに対してより耐性であり得る。当業者は、オリゴヌクレオチド間、またはオリゴヌクレオチドと標的核酸との間の適切な数のミスマッチを、たとえば融解温度を決定することによって決定することができる。

【0167】

当業者には、標的mRNAへのハイブリダイゼーションは条件に依存することが知られている。“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”または“ストリンジェントな条件”とは、オリゴマー化合物がその標的配列にハイブリダイズするが、最小数の他の配列にハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況で異なり、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする“ストリンジェントな条件”は、オリゴマー化合物の性質および組成およびそれらが調査されているアッセイによって決定される。

【0168】

アンチセンス化合物またはその一部は、配列番号との定義されたパーセント同一性、または特定のアイシス数を有する化合物を有し得る。本明細書中で使用される場合、配列は、同じ核酸塩基対形成能力を有する場合、本明細書に開示される配列と同一である。たとえば、開示された配列においてチミジンの代わりにウラシルを含むRNAは、それらがアデニンと対になるので同一であると考えられる。この同一性は、オリゴマー化合物の全長にわたって、またはアンチセンス化合物の一部においてあり得る（たとえば、27塩基長のヌクレオチド1-20を20塩基長と比較して、オリゴマー化合物の配列番号に対する同一性パーセントを決定することができる）。アンチセンス化合物は、本明細書に記載のアンチセンス化合物と同様に機能するように、本明細書に記載されたものと同一の配列を有する必要はないことは、当業者には理解される。本明細書で教示されるアンチセンス化合物の短縮バージョン、または本明細書で教示されるアンチセンス化合物の非同一バージョンも考慮される。非同一バージョンは、各塩基が本明細書に開示されるアンチセンス化合物と同じ対形成活性を有さないものである。塩基は、より短いまたは少なくとも1つの無塩基部位を有することにより、同じ対形成活性を有さない。あるいは、同一でないバージョンは、異なる対形成活性を有する異なる塩基で置換された少なくとも1つの塩基を含むことができる（たとえば、GはC、A、またはTで置き換えることができる）。パーセント同一性は、それが比較される配列番号またはアンチセンス化合物に対応する同一の塩基対形成を有する塩基の数にしたがって計算される。非同一の塩基は、互いに隣接していても、オリゴヌクレオチドの中に分散していてもよく、またはその両方であってもよい。

【0169】

たとえば、20塩基長のヌクレオチド2-17と同じ配列を有する16塩基長のものは、20塩基長のものと80％同一である。あるいは、20塩基長と同一ではない4つのヌクレオチドを含む20塩基長のものは、20塩基長のものと80％同一である。18塩基長のヌクレオチド1-14と同じ配列を有する14塩基長のものは、18塩基長のものと78％同一である。そのような計算は、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0170】

パーセント同一性は、改変された配列の一部に存在する元の配列中のヌクレオチドのパーセントに基づく。したがって、20核酸塩基活性標的セグメントの相補体の完全配列を含む30核酸塩基アンチセンス化合物は、20核酸塩基活性標的セグメントの補体と100％同一性の部分を有し、さらに10核酸塩基部分をさらに含む。アクティブターゲットセグメントの補数は、単一の部分を構成することができる。本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらにより好ましくは少なくとも約90％最も好ましくは少なくとも95％同一である活性標的セグメントの少なくとも一部分を含む。

【0171】

当業者には、アンチセンス化合物の長さを増加または減少させること、および／または活性を消失させることなくミスマッチ塩基を導入することが可能であることは周知である。たとえば、Woolfらは（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7310, 1992、参照により本明細書に組み込まれる）、長さが13-25ヌクレオチドの一連のアンチセンスオリゴマー化合物を、標的RNAの切断を誘導する能力について試験した。アンチセンスオリゴマー化合物の末端近くに8または11個のミスマッチ塩基を有する長さ25ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマー化合物は、ミスマッチを含まないアンチセンスオリゴマー化合物よりも少ない程度であっても標的mRNAの特異的切断を導くことができた。同様に、標的特異的切断は、1または3ミスマッチを有するものを含む13核酸塩基アンチセンスオリゴマー化合物を用いて達成された。MaherおよびDolnick（Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988、参照により本明細書に組み込まれている）は、のタンデム14核酸塩基アンチセンスオリゴマー化合物および28および42核酸塩基アンチセンスオリゴマー化合物を試験した3つのタンデムアンチセンスオリゴマー化合物を、ウサギ網状赤血球アッセイにおいてヒトDHFRの翻訳を阻止するそれらの能力について、それぞれ試験した。3つの14核酸塩基アンチセンスオリゴマー化合物のそれぞれは、28または42核酸塩基アンチセンスオリゴマー化合物よりも穏やかなレベルではあるが、翻訳のみを阻害することができた。アンチセンス化合物は、所望の活性を維持するならば、長さおよび標的に対する相補性のパーセンテージが変化し得ることが理解される。所望の活性を決定する方法は、本明細書に開示され、当業者に周知である。本発明の好ましい態様および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴマー化合物は、標的mRNAに対して少なくとも80％の相補性を有し、より好ましくは標的mRNAに対して少なくとも85％の相補性を有し、より好ましくは標的mRNAに対して少なくとも90％の相補性を有し、より好ましくは標的mRNAに対して少なくとも95％の相補性を有し、より好ましくは標的mRNAに対して少なくとも96％の相補性を有し、より好ましくは標的mRNAに対して少なくとも97％の相補性を有し、より好ましくは標的mRNAに対して少なくとも98％の相補性を有し、より好ましくは標的mRNAに対して少なくとも99％の相補性を有し、より好ましくは標的mRNAに対して少なくとも100％相補性である。

【0172】

当技術分野で知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である（時には“核酸塩基”または単に“塩基”と呼ばれる）。このような複素環式塩基の2つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は糖の2'、3'または5'ヒドロキシル部分に結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて線状高分子化合物を形成する。オリゴヌクレオチド内では、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると呼ばれる。RNAおよびDNAの正常な結合または骨格は、3'から5'のホスホジエステル結合である。それらの活性を変化させるために化学修飾をオリゴヌクレオチドに含めることがしばしば好ましい。化学修飾は、たとえば、その標的RNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性の増加、ヌクレアーゼ耐性の増加、および／またはオリゴヌクレオチドの薬物動態の変化によって、オリゴヌクレオチド活性を変化させることができる。オリゴヌクレオチドのその標的に対する親和性を増加させる化学物質の使用は、より短いオリゴヌクレオチド化合物の使用を可能にすることができる。

【0173】

本明細書において提供されるアンチセンス化合物はまた、修飾糖部分を有する1つ以上のヌクレオシドを含み得る。ヌクレオシドのフラノシル糖環は、これに限定されるものではないが、置換基の付加、二環式核酸（BNA）を形成するための2つの非ジェミナル環原子の架橋、そして、4'-位の環酸素に対して-S-、-N(R)-または-C(R1)(R2)のような原子または基の置換を含むいくつかの方法で修飾することができる。修飾糖部分は周知であり、その標的に対するアンチセンス化合物の親和性を変化させ、典型的には増加させ、および／またはヌクレアーゼ耐性を増加させるために使用することができる。好ましい修飾糖の代表的なリストには、これに限定されるものではないが、二環式修飾糖（BNA's）、LNAおよびENA（4'-(CH2)2-O-2'架橋を含む）、および置換糖、特に2'-F、2'-OCH2または2'-O(CH2)2-OCH3置換基を有する2'-置換糖が含まれる。糖はまた、他のものの中の糖模倣基で置き換えることもできる。修飾された糖の調製のための方法は、当業者に周知である。適切な化合物は、2'位に以下の1つを含むことができる：OH; F; O-、S-またはN-アルキル; O-、S-またはN-アルケニル; O-、S-またはN-アルキニル;または、O-アルキル-O-アルキルで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のC1からC10のアルキルまたはC2からC10のアルケニルおよびアルキニルであってもよい。また、O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON((CH2)nCH3)2で、nおよびmは1から約10であるものも適している。他のオリゴヌクレオチドは、2'位に以下のうちの1つを含む：C1からC10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、N3、NH2、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、類似の性質を有する他の置換基を含む。1つの修飾には、2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOE（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、すなわちアルコキシアルコキシ基、としても知られる2'-メトキシエトキシ(2'-O-CH2CH2OCH3)が含まれる。さらなる修飾には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち2'-DMAOEとしても知られているO(CH2)2ON(CH3)2グループ、そして、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2'-DMAEOEとしても知られている）、すなわち2'-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N(CH3)2が含まれる。他の修飾には、2'-メトキシ(2'-O-CH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-アリル(2'-CH2-CH2-CH2)、2'-O-アリル(2'-O-CH2-CH2-CH2)および2'-フルオロ(2'-F)が含まれる。2'-修飾は、アラビノ（上方）位置またはリボ（下方）位置にあり得る。1つの2'-アラビノ修飾は2'-Fである。オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上または2'-5'結合オリゴヌクレオチド上の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位で同様の修飾を行うこともできる。アンチセンス化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有していてもよい。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、米国特許第4,981,957号;第5,118,800号; 第5,319,080号; 第5,359,044号; 第5,393,878号; 第5,446,137号; 第5,466,786号; 第5,514,785号; 第5,519,134号; 第5,567,811号; 第5,576,427号; 第5,591,722号; 第5,597,909号; 第5,610,300号; 第5,627,053号; 第5,639,873号; 第5,646,265号; 第5,658,873号; 第5,670,633号; 第5,792,747号; 第5,700,920号;および第6,147,200号が含まれる。

【0174】

本発明の一態様では、オリゴマー化合物は、3'-エンド糖立体配座を誘導するように修飾されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、所望の3'-エンド糖立体配座を誘導するために複素環塩基、糖部分または両方の修飾を組み込むことができる。これらの修飾されたヌクレオシドは、RNA様ヌクレオシドを模倣するために使用され、オリゴマー化合物の特定の特性が、所望の3'-エンド立体構造を維持しながら増強され得る。

【0175】

本発明においては、RNA型二本鎖（A型ヘリックス、主に3'-エンド）が好ましい。なぜなら、これらはRnasH耐性であるからである。より安定な3'-エンドヌクレオシドを使用することによって増強される特性には、これに限定されるものではないが：タンパク質結合、タンパク質オフレート、吸収およびクリアランスの修飾による薬物動態特性の調節; ヌクレアーゼ安定性ならびに化学的安定性の調節; オリゴマーの結合親和性および特異性の調節（酵素および相補的配列に対する親和性および特異性）; RNA切断の効率の増加が含まれる。

【0176】

ヌクレオシドコンフォメーションは、ペントフラノシル糖の2'、3'または '位での置換を含む種々の因子によって影響される。電気陰性置換基は一般に軸位を好むが、立体的に要求される置換基は一般に赤道位置を好む（Principles of Nucleic Acid Structure, Wolfgang Sanger, 1984, Springer-Verlag.）2'-OHを認識要素として維持しながら、3'末端配座に有利な2'位の修飾を達成することができる（Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713. Harry-O'kuru et al., J. Org. Chem., (1997), 62(6), 1754-1759 and Tang et al., J. Org. Chem. (1999), 64, 747-754.）。あるいは、軸方向位置に電気陰性フッ素原子を配置した3'-エンド立体構造をとる2'デオキシ-2'F-ヌクレオシドによって例示されるような2'-OHの欠失によって（Kawasaki et al., J. Med. Chem. (1993), 36, 831-841）、3'末端コンフォメーションに対する優先性を達成することができる。得られた二本鎖にA型立体構造特性（3 '末端）を与える本発明に従う代表的な2'-置換基は、2'-O-アルキル、2'-O-置換アルキルおよび2'-フルオロ置換基が挙げられる。他の適切な置換基は、種々のアルキルおよびアリールエーテルおよびチオエーテル、アミンおよびモノアルキルおよびジアルキル置換アミンである。

【0177】

リボース環の他の修飾、たとえば4'-F修飾ヌクレオシドを得るための4'位での置換（Guillerm et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (1995), 5, 1455-1460 and Owen et al., J. Org. Chem. (1976), 41, 3010-3017）、または、たとえばメタノカルバヌクレオシド類似体を得るための修飾（Jacobson et al., J. Med. Chem. Lett. (2000), 43, 2196-2203 and Lee et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (2001), 11, 1333-1337）もまた、3'末端コンフォメーションの選択を誘導する。同様にして、1つ以上のヌクレオシドは、コンフォメーションがC3'-末端型立体配座に固定されるように、すなわち、ロックされた核酸（LNA, Singh et al, Chem. Commun. (1998), 4, 455-456）、およびエチレン架橋核酸（ENA(TM), Morita et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2002), 12, 73-76.）改変され得る。

【0178】

糖の好ましい修飾は、2'-O-メチル2'-O-メトキシエチル、2'-フルオロ、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ、2'-グアニジニウム、2'-O-グアニジニウムエチル、2'-カルバメート、2'-アミノオキシ、2'-アセトアミドおよびロックされた核酸を含む。1つの好ましい実施形態において、糖修飾は、2'-O-メチルまたは2'-O-メトキシエチルである。

【0179】

オリゴマー化合物はまた、核酸塩基（しばしば、複素環式塩基または単に「塩基」と呼ばれる）修飾または置換を含むことができる。本明細書中で使用される場合、“未修飾”または“天然”ヌクレオチドは、プリン塩基アデニン（A）およびグアニン（G）ならびにピリミジン塩基チミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）を含む。“置換”とは、未修飾または天然塩基を別の未修飾または天然塩基と置換することである。“修飾された”ヌクレオチドは、たとえば、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、ピリミジン塩基の5-プロピニル(-C≡C-CH3)ウラシルおよびシトシンおよび他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンのような、他の合成ヌクレオチドおよび天然ヌクレオチドを意味する。さらに修飾されたヌクレオチドには、フェノキサジンシチジン(1H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、置換フェノキサジンシチジン（たとえば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)のようなG-クランプ、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド(4,5-b)インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド(3',2':4,5)ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)などの三環式ピリミジンが含まれる。修飾されたヌクレオチドはまた、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、たとえば7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンで置換されたものを含み得る。さらなるヌクレオチドとしては、米国特許第3,687,808号、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されているもの、および、Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されているものが含まれる。これらのヌクレオチドのいくつかは、本発明の化合物の結合親和性を増加させるのに適したものとして当業者に知られている。これらには、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリン、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6-1.2℃上昇させ、現在のところ適切な塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にはさらにより好ましいことが示されている。当該技術分野では、塩基の修飾は、核酸配列中に置換を生じるような化学修飾を伴わないことが理解される。

【0180】

代表的な米国特許は、上記の修飾されたヌクレオチドのあるもの、およびこれらに限定されるものではないが、米国特許第3,687,808号、それと同様に、米国特許第4,845,205号、第5,130,302号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号、第5,645,985号、第5,830,653号、第5,763,588号、第6,005,096号、第5,681,941号および第5,750,692号に示された他の修飾されたヌクレオチドの調製を教示している。

【0181】

本発明のオリゴマー化合物はまた、1つ以上の天然に存在する複素環式塩基部分の代わりに多環式複素環式化合物を含むことができる。多数の三環式複素環式化合物が以前に報告されている。これらの化合物は、修飾された鎖の標的鎖への結合特性を増加させるために、アンチセンス用途において慣例的に使用されている。最も研究された修飾は、グアノシンを標的としており、したがってそれらはGクランプまたはシチジン類似体と呼ばれている。第2の鎖においてグアノシンと3つの水素結合を形成する代表的なシトシン類似体には、1,3-ジアザフェノキサジン-2-オン（Kurchavov, et al., Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846）、1,3-ジアザフェノチアジン（Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874）および6,7,8,9-テトラフルオロ-1,3-ジオキセパン-2-オン（Wang, J.; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388）が含まれる。これらの塩基修飾は、相補的なグアニンとハイブリダイズすることが示され、後者は、アデニンとハイブリダイズし、長いスタッキング相互作用によるヘリックス熱安定性を増強することも示されている（米国特許出願公開第2003/0207804号および第2003/0175906号も参照のこと）。

【0182】

さらに、ヘリックス安定化特性は、シトシン類似体／置換体が、強固な1,3-ジアザフェノキサジン-2-オン骨格に結合したアミノエトキシ部分を有する場合に観察されている（Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532）。結合研究は、単一の取り込みが、モデル修飾オリゴヌクレオチドのその相補的標的DNAまたはRNAへの結合親和性を、単一修飾の高親和性増強である5-メチルシトシンと比較して最大18℃のΔTmで増強できることを実証した 。一方、らせん安定性の増加は、オリゴヌクレオチドの特異性を損なうものではない。

【0183】

本発明で使用するのに適した、さらなる三環式複素環式化合物およびそれらの使用方法は、米国特許第6,028,183号および第6,007,992号に開示されている。

【0184】

フェノキサジン誘導体の増強された結合親和性は、それらの妥協のない配列特異性と共に、より強力なアンチセンスに基づく薬物の開発のための貴重な核酸塩基類似体となる。事実、有望なデータは、フェノキサジン置換を含むヘプタンヌクレオチドがRNアーゼHを活性化し、細胞取り込みを増強し、アンチセンス活性を増大させることができることを実証するインビトロ実験に由来している（Lin, K-Y; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532）。単一の置換が、20塩基対の2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのインビトロでの効力を有意に改善することが示された（Flanagan, W. M.; Wolf, J. J.; Olson, P.; Grant, D.; Lin, K.-Y.; Wagner, R. W.; Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3513-3518）。

【0185】

複素環式塩基として有用なさらに修飾された多環式複素環式化合物は、これらに限定されるものではないが、 米国特許第3,687,808号、同様に米国特許第4,845,205号、第5,130,302号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,434,257号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号、第5,645,985号、第5,646,269号、第5,750,692号、第5,830,653号、第5,763,588号、第6,005,096号、第5,681,941号、および米国特許出願公開第2003/0158403号に記載されている。

【0186】

本明細書に記載される化合物は、ヌクレオシドまたは他の方法で修飾されたモノマー単位を一緒に連結し、それによりアンチセンス化合物を形成するヌクレオシド間連結基を含み得る。ヌクレオシド間連結基の2つの主なクラスは、リン原子の存在または非存在によって定義される。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、限定されるものではないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホラミデート、およびホスホロチオエートが含まれる。代表的な非リン含有ヌクレオシド間連結基には、メチレンメチルイミノ（-CH2-N(CH3)-O-CH2-）、チオジエステル（-OC(O)-S-）、チオノカルバメート（-OC(O))(NH)-S-）;シロキサン（-O-Si(H)2-O-）; N,N'-ジメチルヒドラジン（-CH2-N(CH3-N(CH3)-）が挙げられる。修飾されたヌクレオシド間結合は、天然のホスホジエステル結合と比較して、アンチセンス化合物のヌクレアーゼ耐性を変化させる、典型的には増加させるために使用することができる。キラル原子を有するヌクレオシド間結合は、ラセミ体、キラル体、または混合物として調製することができる。代表的なキラルヌクレオシド間結合には、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートが含まれるが、これらに限定されない。リン含有および非リン含有結合の調製方法は、当業者に周知である。

【0187】

適切な修飾ヌクレオシド間連結基は、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、たとえば3'−アルキレンホスホネート、5'−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、3'−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキル−ホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホノアセテートおよびチオホスホノアセテート（Sheehan et al., Nucleic Acids Research, 2003, 31(14), 4109-4118 and Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 940-950を参照のこと）、通常の3'-5'結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、そして1つまたは複数のヌクレオチド間結合が3'から3'、5'から5'または2'から2'の結合である逆極性を有するものである。極性が反転したオリゴヌクレオチドは、3'末端ヌクレオチド間結合において単一の3'から3'への結合を含み、すなわち、塩基性であってもよい単一の逆位ヌクレオシド残基（核酸塩基は欠けているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）である。
様々な塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。

【0188】

N3'-P5'-ホスホルアミデートは、相補的RNA鎖に対する高親和性およびヌクレアーゼ耐性の両方を示すことが報告されている（Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144）。N3'-P5'-ホスホラミデートは、c-myc遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレートするためにインビボでいくらか成功して研究されている（Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 3966-3971; and Faira et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 40-44）。

【0189】

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、 米国特許第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,194,599号、第5,565,555号、第5,527,899号、第5,721,218号、第5,672,697 および第5,625,050号がある。

【0190】

本発明のいくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、特に-CH2-NH-O-CH2- であり、-CH2-N(CH3)-O-CH2-（メチレン（メチルイミノ）またはMMI骨格として知られている）、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-および-O-N(CH3)-CH2-CH2-（ここで、天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合は、-O-P(-O)(OH)-O-CH2-）で表される、1つ以上のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有することができる。MMI型ヌクレオシド間結合は、上記に参照された米国特許第5,489,677号に開示される。アミドヌクレオシド間結合は、上に引用した米国特許第5,602,240号に開示される。

【0191】

鎖中にリン原子を含まないいくつかのオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの; シロキサン骨格; スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格; ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格; メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格; リボアセチル主鎖;アルケン含有骨格; スルファメート骨格; メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格; スルホネートおよびスルホンアミド骨格; アミド骨格; N、O、SおよびCH2成分が混合されたものなどがある。

【0192】

上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、 米国特許第5,034,506号号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,610,289号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、第5,792,608号、第5,646,269号および第5,677,439号が含まれる。

【0193】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートまたはホスホロジアミダートである。

【0194】

さらに、本発明のオリゴマー化合物の1つ以上に、限定されるものではないが、選択された用途における活性などの特性を向上させるために、1つ以上のモノマーサブユニット（ヌクレオシドが適切である）および／またはヌクレオシド間結合の複数の部位に複数の修飾を施すことができることが意図される。

【0195】

本発明に従う多数の修飾されたヌクレオシドの合成は、当該分野で公知である（たとえば、Chemistry of Nucleosides and Nucleotides Vol 1-3, ed. Leroy B. Townsend, 1988, Plenum pressを参照）。修飾されたヌクレオシドおよびそのオリゴマーの立体配座は、分子動力学計算、核磁気共鳴分光法およびCD測定のような当業者に日常的な様々な方法によって推定することができる。

【0196】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、モルホリノホスホロチオエートまたはホスホロジアミダートモルホリノである。

【0197】

オリゴマー化合物の別の群には、オリゴヌクレオチド模倣物が含まれる。本明細書で使用される“模倣物”という用語は、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合の代わりになる基を指す。一般に、糖または糖−ヌクレオシド間結合の代わりに模倣物が使用され、選択された標的へのハイブリダイゼーションのために核酸塩基が維持される。糖模倣物の代表的な例としては、限定されるものではないが、シクロヘキセニルまたはモルホリノが挙げられる。糖−ヌクレオシド間結合の組み合わせの模倣物の代表的な例には、限定されるものではないが、非荷電アキラル結合によって連結されたペプチド核酸（PNA）およびモルホリノ基が含まれる。ある場合には、核酸塩基の代わりに模倣物が使用される。代表的な核酸塩基模倣物は、当該技術分野において周知であり、限定されるものではないが、三環式フェノキサジン類似体およびユニバーサル塩基を含む（Berger et al., Nuc Acid Res. 2000, 28:2911-14が本明細書に参照として組み込まれる。）。糖、ヌクレオシドおよび核酸塩基模倣物の合成方法は、当業者に周知である。複素環塩基部分または修飾複素環塩基部分は、好ましくは、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。

【0198】

本明細書に記載の化合物は、1つ以上の不斉中心を含むことができ、したがって、絶対立体化学にて、アミノ酸などの(R)または(S9)、αまたはβ、または(D)または(L)とされる鏡像異性体、ジアステレオマー、および他の立体異性形態を生じさせる。本開示は、全てのそのような可能な異性体、ならびにそれらのラセミおよび光学的に純粋な形態を含むことを意味する。

【0199】

そのようなオリゴマー化合物の1つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（PNA）と呼ばれている（Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500）。PNAは有利なハイブリダイゼーション特性、高い生物学的安定性を有し、静電的に中性の分子である。PNA化合物は、トランスジェニックマウスモデルにおいて異常なスプライシングを補正するために使用されている（Sazani et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20, 1228-1233）。PNAオリゴマー化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。ヌクレオチドは、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。PNAオリゴマー化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、米国特許第5,539,082号、第5,714,331号および第5,719,262号を参照されたい。PNA化合物は、Applied Biosystems（フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）から商業的に得ることができる。基本的なPNA骨格に対する多数の改変が当技術分野で知られている。特に有用なのは、一方または両方の末端に結合した1つ以上のアミノ酸を有するPNA化合物である。たとえば、1-8個のリジン残基またはアルギニン残基は、PNA分子の末端にコンジュゲートする場合に有用である。ポリアルギニンテールは、細胞の浸透を促進するのに適している。

【0200】

研究されたオリゴヌクレオチド模倣物の別のクラスは、モルホリノ環に結合した複素環式塩基を有する結合モルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸にモルホリノモノマー単位を結合させる多くの連結基が報告されている。連結基の1つのクラスを選択して、非イオンオリゴマー化合物を得る。モルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を起こしにくいオリゴヌクレオチドの非イオン模倣物である（Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510）。モルホリノベースのオリゴマー化合物は、ゼブラフィッシュ胚において研究されている（Genesis, volume 30, issue 3, 2001、および、Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214を参照）。モルホリノベースのオリゴマー化合物のさらなる研究も報告されている（Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220; and Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596）。モルホリノベースのオリゴマー化合物は、米国特許第5,034,506号。オリゴマー化合物のモルホリノクラスは、モノマーサブユニットに結合する種々の異なる連結基を有するように調製されている。連結基は、キラルからアキラル、および荷電からニュートラルに変化させることができる。米国特許第5,166,315号は、-O-P(=O)(N(CH3)2)-O-を含む結合を開示し、米国特許第5,034,506号は、アキラルなモルホリノ結合を開示し、そして、米国特許第5,185,444号は、キラルなモルホリノ結合を含むリンを開示している。

【0201】

オリゴヌクレオチド模倣物のさらなるクラスはシクロヘキセン核酸（CeNA）と呼ばれる。CeNAオリゴヌクレオチドでは、DNAまたはRNA分子中に通常存在するフラノース環がシクロヘキセニル環で置換される。CeNA DMT保護ホスホルアミダイトモノマーが調製され、古典的ホスホラミダイト化学の後のオリゴマー化合物合成のために使用されている。CeNAで修飾された特定の位置を有する完全修飾CeNAオリゴマー化合物およびオリゴヌクレオチドが調製され、研究されている（Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602）。一般に、DNA鎖へのCeNAモノマーの組み込みは、DNA／RNAハイブリッドのその安定性を増加させる。 CeNAオリゴアデニル酸は、RNAおよびDNA相補体と複合体を形成し、天然の複合体と同様の安定性を有する。CeNA構造を天然の核酸構造に組み込む研究は、NMRおよび円二色性によって、容易なコンホーメーション適応を進めることによって示された。さらに、RNAを標的とする配列へのCeNAの取り込みは、血清に対して安定であり、標的RNA鎖の切断をもたらす大腸菌RNアーゼHを活性化することができた。

【0202】

さらなる修飾には、リボシル糖環の2'-ヒドロキシル基が糖環の4'炭素原子に結合して2'-Cを形成する“ロックド核酸”（LNA）などの二環式糖部分が含まれ、二環式糖部分を形成するための4'-C-オキシメチレン結合の形成を可能にする（Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8 1-7; and Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243にレビューされており、米国特許第6,268,490号および第6,670,461号も参照のこと）。結合は、2'酸素原子および4'炭素原子を架橋するメチレン（-CH2-）基ででき、LNAという用語は二環式部分に使用され、この位置のエチレン基の場合には、用語ENA（登録商標）が使用される（Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; ENA(TM): Morita et al., Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2211-2226）。LNAおよび他の二環式糖類似体は、3'-エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性および良好な溶解特性を有する、相補的DNAおよびRNA（Tm =+3から+10℃）を有する非常に高い二重鎖熱安定性を示す。LNAはProLigo（パリ、フランスおよびボルダー、コロラド州、米国）から市販されている。

【0203】

研究されているLNAの異性体は、3'-エキソヌクレアーゼに対して優れた安定性を有することが示されているα-L-LNAである。アルファ-L-LNAは強力なアンチセンス活性を示すアンチセンスギャップマーおよびキメラに組み込まれた（Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372）。

【0204】

調製および研究された別の類似の二環式糖部分は、3'-ヒドロキシル基から単一のメチレン基を介して糖環の4 '炭素原子に進み、それにより3'-C、4'-C-オキシメチレン結合を形成する架橋を有する（米国特許第6,043,060号参照） 。

【0205】

LNAは非常に安定なLNA：LNA二重鎖を形成することが示されている（Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 13252-13253）。LNA：LNAハイブリダイゼーションは、最も熱的に安定な核酸型二本鎖系であることが示され、LNAのRNA模倣特性は二重鎖レベルで確立された。3つのLNAモノマー（TまたはA）の導入は、DNA相補物への融点（Tm=+15/+11℃）を有意に増加させた。LNA媒介ハイブリダイゼーションの普遍性は、非常に安定なLNA：LNA二本鎖の形成によって強調されている。LNAのRNA模倣は、モノマーのN型立体配座制限およびLNA：RNA二本鎖の二次構造に関して反映された。

【0206】

LNAはまた、相補性DNA、RNAまたはLNAと熱親和性の高い二本鎖を形成する。円形二色性（CD）スペクトルは、完全に修飾されたLNA（特にLNA：RNA）を含む二本鎖がA型RNA：RNA二本鎖に構造的に類似していることを示している。LNA：DNA二重鎖の核磁気共鳴（NMR）検査により、LNAモノマーの3'-エンド立体配座が確認された。二本鎖DNAの認識も、LNAによる鎖侵入を示唆している。 ミスマッチ配列の研究は、LNAが対応する未修飾参照鎖と比較して一般的に改善された選択性でワトソンークリック塩基対形成規則に従うことを示す。DNA-LNAキメラは、ルシフェラーゼmRNA内の様々な領域（5'-非翻訳領域、開始コドンの領域またはコード領域）に標的化された場合、遺伝子発現を効率的に阻害することが示されている（Braasch et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30, 5160-5167）。

【0207】

LNAを含有する強力かつ非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sc U.S.A., 2000, 97, 5633-5638）。著者らは、LNAがいくつかの望ましい特性を与えることを実証した。LNA／DNAコポリマーは、血清および細胞抽出物中で容易に分解されなかった。LNA／DNAコポリマーは、ラットの脳におけるGタンパク質共役受容体シグナル伝達と大腸菌におけるレポーター遺伝子の検出とは異なるアッセイ系において強力なアンチセンス活性を示した。 生きたヒト乳癌細胞へのLNAのリポフェクチン媒介性効率的送達も達成されている。LNAを含むさらなるインビボ研究では、毒性のないラットデルタオピオイド受容体のノックダウンが示され（Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 5633-5638）、別の研究では、RNAポリメラーゼIIの大きなサブユニットの翻訳の閉塞が示された（Fluiter et al., Nucleic Acids Res., 2003, 31, 953-962）。

【0208】

オリゴマー化および核酸認識特性とともに、LNAモノマーアデニン、シトシン、グアニン、5-メチル - シトシン、チミンおよびウラシルの合成および調製が記載されている（Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630）。LNAおよびその調製については、国際公開第98/39352号および国際公開第99/14226号にも記載されている。

【0209】

LNA、ホスホロチオエート-LNAおよび2'-チオ-LNAの類似体も調製されている（Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含むロックドヌクレオシド類似体の調製も記載されている（Wengel et al., 国際公開第99/14226号）。さらに、立体構造的に制限された新規の高親和性オリゴヌクレオチドアナログである2'-アミノ-LNAの合成は、当該分野において記載されている（Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039）。さらに、2'-アミノおよび2'-メチルアミノ-LNAが調製され、相補的RNAおよびDNA鎖を有するそれらの二本鎖の熱安定性が以前に報告されている。

【0210】

調製され研究された別のオリゴヌクレオチド模倣物は、核酸の三量体である。このオリゴヌクレオチド模倣物は、リボースヌクレオシドの代わりにトレオースヌクレオシドに基づいている。（3',2'）-α-L-トレオース核酸（TNA）の最初の関心は、TNAをコピーするDNAポリメラーゼが存在するかどうかの問題に向けられていた。特定のDNAポリメラーゼは、TNA鋳型の限られたストレッチをコピーすることができることが判明した（Chemical and Engineering News, 2003, 81, 9に報告された）。別の研究では、TNAが相補的DNA、RNAおよびTNAオリゴヌクレオチドとの逆平行Watson-Crick塩基対形成が可能であることが決定された（Chaput et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 856-857）。

【0211】

1つの研究（3',2'）において、α-L-スレオース核酸を調製し、2'および3'アミド化された類似体と比較した（Wu et al., Organic Letters, 2002, 4(8), 1279-1282）。アミド化された類似体は、RNA／DNAと同等の強度でRNAおよびDNAに結合することが示された。

【0212】

さらなるオリゴヌクレオチド模倣物は、二環および三環ヌクレオシド類似体を含むように調製されている（teffens et al., Helv. Chim. Acta, 1997, 80, 2426-2439; Steffens et al., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 3249-3255; Renneberg et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 5993-6002; and Renneberg et al., Nucleic acids res., 2002, 30, 2751-2757を参照のこと）。これらの修飾されたヌクレオシド類似体は、ホスホルアミダイト法を用いてオリゴマー化され、DNA、RNAおよびそれ自身にハイブリダイズした場合、熱安定性（Tm's）の上昇が得られたオリゴマー化合物となっている。二環式ヌクレオシド類似体を含有するオリゴマー化合物は、DNA二本鎖に近い熱安定性を示している。

【0213】

オリゴヌクレオチド模倣物の別のクラスは、骨格にリン基を組み込んだホスホノモノエステル核酸と呼ばれる。このクラスのオリゴヌクレオチド模倣体は、遺伝子発現を阻害する領域（アンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチドおよびトリプレックス形成オリゴヌクレオチド）において有用な物理的および生物学的および薬理学的特性を有することが報告されており、核酸の検出のためのプローブとして、および分子生物学における使用のための助剤として使用することができる。本発明に従うさらなるオリゴヌクレオチド模倣体は、シクロブチル環が天然に存在するフラノシル環を置換するように調製されている。

【0214】

本発明のオリゴマー化合物の別の改変は、オリゴマー化合物の活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するなど、オリゴマー化合物の特性を増強する1つ以上の部分またはコンジュゲートをオリゴマー化合物に化学的に連結することを含む。これらの部分またはコンジュゲートは、第1級または第2級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。本発明の共役基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態特性を高める基が含まれる。ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が挙げられる。本発明の文脈において薬力学的特性を増強する基には、取り込みを改善し、分解に対する抵抗性を増強し、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明の文脈において、薬物動態特性を増強する基には、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝または排泄を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、1992年10月23日に出願された国際特許出願PCT/US92/09196、および、米国特許第6,287,860号と第6,762,169号に開示されている。

【0215】

コンジュゲート部分には、限定されるものではないが、コール酸、チオエーテル、たとえば、ヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、たとえばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、たとえばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分である、コレステロール部分などの脂質部分が含まれる。本発明のオリゴマー化合物はまた、たとえば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤または抗生物質などの薬物物質にコンジュゲートされてもよい。オリゴヌクレオチド−薬物コンジュゲートおよびそれらの調製が米国特許第6,656,730号に記載されている。

【0216】

このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、、 米国特許第4,828,979号号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717, 5,580,731号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241, 5,391,723号、第5,416,203, 5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号および第5,688,941号が含まれる。

【0217】

オリゴマー化合物はまた、オリゴマー化合物の一方または両方の末端に一般に結合されて、たとえばヌクレアーゼ安定性などの特性を向上させる1つ以上の安定化基を有するように修飾することもできる。安定化基にはキャップ構造が含まれる。“キャップ構造または末端キャップ部分”は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学修飾を意味する（たとえば、Wincott et al.の国際公開第W97/26270号を参照のこと）。これらの末端修飾は、末端核酸分子を有するオリゴマー化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内での送達および／または局在を改善することができる。キャップは、5'末端（5'キャップ）または3'末端（3'キャップ）のいずれかに存在し得るか、または単一鎖の両方の末端に存在し得るか、または両方の1つ以上の末端二本鎖化合物の二本鎖である。このキャップ構造は、天然のmRNA分子の5'末端に存在する逆メチルグアノシン“5'キャップ”と混同してはならない。非限定的な例において、5'キャップは、逆塩基性残基（部分）、4',5'-メチレンヌクレオチド;1-（β-D-エリトロフラノシル）ヌクレオチド、4'-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド; 1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド;L-ヌクレオチド; α-ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート結合;トレオ-ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3',4'-セコヌクレオチド;非環状3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド;非環式3,5-ジヒドロキシペンチルリボヌクレオチド、3'-3'逆位のヌクレオチド部分;3'-3'逆位の脱塩基の部分;3'-2'逆位のヌクレオチド部分;3'-2'逆位の脱塩基の部分;1,4-ブタンジオールホスフェート;3'-ホスホルアミデート;ヘキシルリン酸塩;アミノヘキシルホスフェート;3'-リン酸;3'-ホスホロチオエート;ホスホロジチオエート;または架橋または非架橋メチルホスホネート部分（詳細についてはWincott et al.の国際公開第97/26270号を参照のこと）を含む。

【0218】

特に好適な3'-キャップ構造には、たとえば、4',5'-メチレンヌクレオチド;1-(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド;4'-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド;5'-アミノ-アルキルホスフェート;1,3-ジアミノ-2-プロピルホスフェート、3-アミノプロピルホスフェート、 6-アミノヘキシルホスフェート; 1,2-アミノドデシルホスフェート;ヒドロキシプロピルホスフェート;1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド;L-ヌクレオチド;α-ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート;トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3',4'-セコヌクレオチド;3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド;3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5'-5'-逆位ヌクレオチド部分;5'-5'-逆位脱塩基部分;5'-ホスホルアミデート;5'-ホスホロチオエート;1,4-ブタンジオールホスフェート;5'-アミノ;架橋および／または非架橋5'-ホスホラミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネートおよび5'-メルカプト部分（詳細はBeaucage and Tyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925を参照）が含まれる。

【0219】

オリゴマー化合物の一方または両方の末端をキャップしてヌクレアーゼ安定性を付与するために使用することができるさらなる3'および5'-安定化基には、2003年1月16日公開の国際公開第03/004602号に開示されているものが含まれる。

【0220】

特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、多種多様な異なる正に帯電したポリマーとコンジュゲートすることができる。正に帯電したポリマーの例には、たとえばアルギンリッチペプチド（本発明の実施において使用され得る正に荷電したペプチドの例としては、R9F2C;(RXR)4XB（Xは任意のアミノ酸であり得る）;R5F2R4c;(RFF)3;TAT配列CYGRKKRRQRRRのようなTatタンパク質;そして(RFF)3R）ようなペプチド、カチオン性ポリマー、たとえばデンドリマーオクタグアニジンポリマー、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物へのコンジュゲーションのための当技術分野で知られている他の正電荷分子が含まれる。本発明の１態様および／またはその実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約1,000から20,000ダルトン、好ましくは約5,000から10,000ダルトンの分子量を有するポリマーを含む正荷電ポリマーとコンジュゲートされる。正に荷電したポリマーの別の例は、その分岐鎖または非分岐鎖に複数の正電荷アミン基を有するポリエチレンイミン（PEI）である。PEIは、遺伝子およびオリゴマー送達小胞として広く使用されている。

【0221】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、オリゴマー化合物は細胞浸透配列で修飾される。適切な細胞浸透配列には、TATペプチド、MPG、Pep-1、MAP、融合誘導性抗菌ペプチド（AMP）、殺菌性ペプチド、殺真菌性ペプチド、殺ウイルスペプチドなどの細胞透過性ペプチドが含まれる。

【0222】

細胞浸透性ペプチド（CPP）は、本発明の粒子の細胞取り込みを促進する短いペプチドである。本発明の粒子は、共有結合を介した化学的結合または非共有的相互作用のいずれかを介してCPPペプチドと結合している。CPPの機能は、粒子を細胞に送達することであり、これは一般に生きた哺乳動物細胞のエンドソームに送達される貨物とのエンドサイトーシスによって生じるプロセスである。CPPは、典型的には、リジンまたはアルギニンのような高い相対量の正電荷アミノ酸を含有するか、または極性/荷電アミノ酸および非極性疎水性アミノ酸の交互パターンを含む配列を有するアミノ酸組成物を有する。これらの2つのタイプの構造は、それぞれポリカチオン性または両親媒性と呼ばれる。第3のクラスのCPPは、疎水性ペプチドであり、無極性残基のみを含み、正味電荷が低く、または細胞摂取にとって重要な疎水性アミノ酸基を有する。

【0223】

例示的な細胞浸透性ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）由来のトランス活性化転写活性化因子（Tat）であり、培養中の多数の細胞型によって周囲の培地から効率的に取り込まれ得る。他の細胞浸透性ペプチドは、MPG、Pep-1、トランスポータン、ペネトラチン、CADY、TP、TP10、アルギニン八量体、ポリアルギニン配列、Arg8、VP22 HSV-1構造タンパク質、SAPプロリン豊富モチーフ、ベクトセル（Vectocell） ペプチド、hCT（9-32）、SynB、Pvec、およびPPTG1が挙げられる。細胞浸透性ペプチドはカチオン性であってもよく、基本的にポリアルギニンのクラスターを一次配列または両親媒性に含む。CPPは、一般に、天然または非天然のタンパク質またはキメラ配列に由来する30アミノ酸未満のペプチドである。

【0224】

適切な実施形態では、オリゴマー化合物は、ナノ粒子に組み込まれるか、さもなければナノ粒子と会合される。ナノ粒子は、特異的細胞を標的化するために適切に改変され得、そして浸透性細胞のために最適化され得る。当業者は、オリゴマー化合物を細胞に送達するためにナノ粒子を用いる方法を認識している。

【0225】

本発明の適切な実施形態では、オリゴマー化合物は、エンドソームエスケープ剤部分で修飾される。エンドサイトーシス経路は、細胞の主要な取り込み機構である。エンドサイトーシス経路によって取り込まれた化合物は、エンドソームに閉じ込められ、リソソーム中の特定の酵素によって分解され得る。これは、目的に応じて望ましいか望ましくないことがある。エンドソームによって取り込まれることが望ましくない場合、エンドソーム脱離剤を使用することができる。適切なエンドソームエスケープ剤は、クロロキン、TATペプチドであってもよい。

【0226】

実際、オリゴマー化合物中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には上記の修飾の1つ以上が単一の化合物に組み込まれていても、オリゴマー化合物内の単一のヌクレオシドに組み込まれていてもよい。

【0227】

本発明はまた、キメラ化合物であるオリゴマー化合物を含む。本発明の文脈において、“キメラ”オリゴマー化合物または“キメラ”は、各々が少なくとも1つのモノマー単位を含む2つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドなどの一本鎖または二本鎖のオリゴマー化合物であり、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドである。キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴマー化合物の一形態である。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増加、電荷の変化、安定性の増加および／または標的核酸に対する結合親和性の増加をオリゴヌクレオチドに付与するように改変された少なくとも1つの領域を含む。

【0228】

本発明のキメラオリゴマー化合物は、2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド模倣物、またはその領域もしくは部分の複合構造として形成することができる。 このような化合物はまた、ハイブリッドまたはギャップマーと呼ばれている。 このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第5,013,830号、第5,149,797号、第5,220,007号、第5,256,775号、第5,366,878号、第5,403,711号、第5,491,133号、第5,565,350号、第5,623,065号、第5,652,355号、第5,652,356号および第5,700,922が含まれる。

【0229】

修飾されたヌクレオシドおよび未修飾のヌクレオシドのオリゴマー化は、DNAのための文献(Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press)の手順 および／またはRNAのための文献(Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713)の手順にしたがって慣例的に行うことができる。

【0230】

本発明のオリゴマー化合物は、固相合成の周知の技術によって簡便かつ慣用的に製造することができる。そのような合成のための装置は、たとえば、Applied Biosystems（フォスターシティー、カリフォルニア州）を含むいくつかの販売業者によって販売されている。当技術分野で公知のそのような合成のための任意の他の手段を、追加的または代替的に使用してもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することは周知である。

【0231】

アミダイトおよびその中間体を含む5-メチルdCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-チミジン中間体、5-メチル-dCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-5-メチルシチジン中間体、5-メチル-c-アミダイトの5'- O-ジメトキシ酪酸-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジンの最後から2番目の中間体、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(5-メチルdCアミダイト)、2'-フルオロデオキシアデノシン、2'-フルオロデオキシグアノシン、2'-フルオロウリジン、2'-フルオロデオキシシチジン、2'-O-(2-メトキシエチル)修飾アミダイト、2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン中間体、2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン第2中間体、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE Tアミダイト)、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルシチジン中間体、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジン第二中間体、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE 5-Me-Cアミダイト)、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N6-ベンゾイルアデノシン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE Aアミダイト)、(5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N 4 - イソブチリルグアノシン-3'-O-イル)-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE Gアミダイト)、2'-O-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトおよび2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト、2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン、2'-O-((2-フタルイミドオキシ)エチル)-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-((2-ホルムキシイミノオキシ)エチル)-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-((2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト)、2'-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシン-3'-((2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルアミノ)-N'-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-ジイソプロピルホスホラミダイト)、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト、2'-O-(2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル)-5-メチルウリジン、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル))-5-メチルウリジンおよび5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル)-5-メチルウリジン-3'-O-(シアノエチル-N、N-ジイソプロピル)ホスホラミダイトなどの前駆体化合物は、当業者に日常的な方法によって調製することができる。

【0232】

このようなオリゴヌクレオチド合成のための前駆体化合物の調製は、当技術分野で日常的であり、 米国特許第6,426,220号および公開された国際公開第02/36743号に記載されている。

【0233】

2'-デオキシおよび2'-メトキシベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトは、商業的供給源（たとえば、Chemgenes、ニーダム、マサチューセッツ州またはGlen Research、Inc. スターリング、バージニア州）から購入することができる。他の2'-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトを、たとえば米国特許第5,506,351号に記載されるようにして調製することができる。

【0234】

5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-Me-C）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、公開された方法（Sanghvi, et. al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203）にしたがって、市販のホスホルアミダイト（Glen Research、スターリング、バージニア州またはChemGenes、ニーダム、マサチューセッツ州）を用いて、慣例的に合成することができる。

【0235】

2'-フルオロオリゴヌクレオチドを、(Kawasaki, et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841) と米国特許第5,670,633号に記載されているようにして、慣例的に合成することができる。

【0236】

2'-O-メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトは、Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法にしたがって、慣例的に調製することができる。

【0237】

アミノオキシエチルおよびジメチルアミノオキシエチルアミダイトは、たとえば、 米国特許第6,127,533号に記載の方法により、慣例的に調製することができる。

【0238】

ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチド（P-S）は、当業者に日常的な方法によって合成することができる（たとえば、Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Pressを参照）。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、たとえば、米国特許第5,508,270号に記載されようにして、調製することができる。

【0239】

アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第4,469,863号に記載されようにして、調製することができる。

【0240】

3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、 米国特許第5,610,289号または第5,625,050号に記載されようにして、調製することができる。

【0241】

ホスホラミダイトオリゴヌクレオチドは、 米国特許第5,256,775号または米国特許第5,366,878号に記載されようにして、調製することができる。

【0242】

アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、公開されたPCT出願のPCT/US94/00902およびPCT/US93/06976（それぞれ国際公開第94/17093号および国際公開第94/02499号として公開されている）に記載されているようにして、調製することができる。

【0243】

3'-デオキシ-3'-アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,476,925号に記載されているようにして、調製することができる。

【0244】

ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,023,243号に記載されているようにして、調製することができる。

【0245】

ボラノリン酸オリゴヌクレオチドは、米国特許第5,130,302号および第5,177,198号に記載されているようにして、調製することができる。

【0246】

4'-チオ基含有オリゴヌクレオチドは、米国特許第5,639,873号に記載されているようにして、調製することができる。

【0247】

また、MMI結合オリゴヌクレオシド、メチレンジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオシド（MDH結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド-3結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド-4結合オリゴヌクレオシド、 ならびにたとえば交互のMMIおよびPOまたはPS結合を有する混合骨格化合物は、 米国特許第5,378,825号、第5,386,023号、第5,489,677号、第5,602,240号および第5,610,289号に記載されているようにして、調製することができる。

【0248】

ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,264,562号および第5,264,564号に記載されているようにして、調製することができる。

【0249】

エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,223,618号に記載されているようにして、調製することができる。

【0250】

ペプチド核酸（PNA）は、Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23に記載されている様々な手順のいずれかにしたがって調製することができる。それらはまた、米国特許第5539082号、第5700922号、第5719262号、第6559279号および第6762281号に記載されているようにして、調製することができる。

【0251】

当該技術分野において日常的な方法により、少なくとも1つの2'-O-保護ヌクレオシドを取り込んだオリゴマー化合物。取り込みおよび適切な脱保護の後、2'-O-保護ヌクレオシドは取り込み位置でリボヌクレオシドに変換される。最終オリゴマー化合物中の2-リボヌクレオシド単位の数および位置は、いずれかの部位で1つから変化してもよく、またはストラテジーを用いて完全な2'-OH修飾オリゴマー化合物まで調製することができる。

【0252】

現在商業的に使用されている主なRNA合成戦略には、5'-β-DMT-2'-O-t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、5'-O-DMT-2'-[1-(2-フルオロフェニル)-4-メトキシピペリジン-4-イル](FPMP)、2'-O - [(トリイソプロピルシリル)オキシ]メチル(2'-O-O-Si(iPr)3(TOM)、および、5'-O-シリルエーテル-2'-ACE（5'-O-ビス(トリメチルシロキシ)シクロドデシルオキシシリルエーテル(DOD)-2'-O-ビス(2-アセトキシエトキシ)メチル(ACE)が含まれる。現在、RNA製品を提供している企業には、Pierce Nucleic Acid Technologies（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、Dharmacon Research Inc.（Fisher Scientificの子会社、ラファイエット、コロラド州）、Integrated DNA Technologies、Inc.（コーラルビル、アイオワ州）が含まれる。企業の1つであるPrinceton Separationsは、特にTOMとTBDMSの化学反応によるカップリング時間の短縮が宣伝されるRNA合成活性化剤を販売している。そのような活性化剤はまた、本発明のオリゴマー化合物を受け入れ易いであろう。

【0253】

上記のRNA合成戦略の全ては、本発明のオリゴマー化合物に適している。上記のハイブリッドになる戦略、たとえば ある戦略の5'-保護基を別の戦略の2'-O保護で使用することといったこともまた、本明細書において考慮される。

【0254】

キメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、 米国特許第5,623,065号に記載されているようにして、調製することができる。

【0255】

増強された細胞摂取およびより大きな薬理学的活性を示すキメラオリゴマー化合物は、米国特許第8,501,703号に記載されているようにして、調製することができる。

【0256】

別の形態のオリゴマー化合物は、トリシクロ-DNA(tc-DNA)アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。トリシクロ-DNAヌクレオチドは、シクロプロパン環の導入によって改変されたヌクレオチドであり、バックボーンの配座の柔軟性を制限し、ねじれ角γの骨格の形状を最適化する。相同塩基性アデニンおよびチミン含有tc-DNAは、相補的RNAと非常に安定なA-T塩基対を形成する。長さが6-22トリシクロヌクレオチド、特に8-20トリシクロヌクレオチド、より詳細には10-18または11-18トリシクロヌクレオチドの間のアンチセンスオリゴマー化合物が適している。たとえば、トリシクロ-DNA（tc-DNA）アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は国際公開第2010/115993号に記載されている。

【0257】

修飾ヌクレオシドおよび非修飾ヌクレオシドのオリゴマー化は、DNA（Gaitら、RNA中の化学的に合成されたRNAの応用：タンパク質相互作用（Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press）および／またはRNA（Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713）のための文献の手順にしたがって慣例的に行うことができる。

【0258】

アンチセンス化合物は、固相合成の周知の技術によって簡便かつ慣用的に作製することができる。そのような合成のための装置は、たとえば、Applied Biosystems（フォスターシティー、カリフォルニア州）を含むいくつかの販売業者によって販売されている。当技術分野で公知のそのような合成のための任意の他の手段を、追加的または代替的に使用してもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することは周知である。この開示は、アンチセンス化合物合成の方法によって制限されない。

【0259】

オリゴヌクレオチド精製および分析の方法は、当業者に公知である。分析方法には、キャピラリー電気泳動（CE）およびエレクトロスプレー質量分析が含まれる。このような合成および分析方法は、マルチウェルプレートで行うことができる。本明細書に記載の方法は、オリゴマー精製の方法に限定されない。

【0260】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンス化合物は、RNアーゼH分解に対して抵抗性である。

【0261】

本発明の一態様および／またはその実施形態では、アンチセンス化合物は少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、各位置に修飾されたヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、アンチセンス化合物は各位置で一様に修飾される。

【0262】

スプライシングの調節は、当該分野で公知の様々な方法でアッセイすることができる。標的mRNAレベルは、たとえば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、またはリアルタイムPCRによって定量することができる。RNA分析は、当技術分野で公知の方法により全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAに対して行うことができる。RNA単離の方法は、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 and 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993に教示されている。

【0263】

ノーザンブロット分析は当技術分野では慣例的であり、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996で教示されている。リアルタイム定量（PCR）は、PE-Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア州から入手可能な商業的に入手可能なABI PRISM（商標）7700配列検出システムを用いて都合よく達成され、製造業者の指示にしたがって使用される。

【0264】

標的mRNAによってコードされるタンパク質のレベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ELISAまたは蛍光活性化細胞選別（FACS）など、当技術分野で周知の様々な方法で定量することができる。標的mRNAによってコードされるタンパク質に対する抗体は、抗体のMSRSカタログ（Aerie Corporation、バーミンガム、MI）のような種々の供給源から同定され得、または従来の抗体生成方法によって調製され得る。ポリクローナル抗血清の調製方法は、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997に教示されている。 モノクローナル抗体の調製方法は、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997に教示されている。

【0265】

免疫沈降法は当該分野で標準的であり、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998で見出すことができる。ウエスタンブロット（イムノブロット）分析は、当該分野で標準的であり、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997で見出すことができる。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、当該分野で標準的であり、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991で見出すことができる。

【0266】

本発明のオリゴマー化合物の効果は、RT PCT、qPCR、隣接エクソンPCR、および／または、mRNAに対応する各内部エクソン上に1つ以上の隣接するエクソン増幅産物を得て、そして、前記隣接エクソン増幅産物の存在および長さを検出し、該mRNAのエクソンをコードする各タンパク質の定量する隣接エクソンPCRを含む方法により解析できる。

【0267】

本明細書で提供されるオリゴマー化合物は、治療または研究のために利用され得る。さらに、特定の遺伝子または遺伝子産物の機能を解明するために、または生物学的経路の様々なメンバーの機能を区別するために、遺伝子発現を阻害するか、または特異性を有するスプライシングを調節することができるアンチセンス化合物を使用してもよい。本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、オリゴマー化合物はポンペ病の治療に使用される。本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、オリゴマー化合物は、GAA遺伝子の機能の研究に使用される。

【0268】

本明細書に記載の化合物は、後生動物、好ましくはヒトの哺乳動物において標的mRNAのスプライシングを調節するために使用することができる。本発明の1つの非限定的な態様および／またはその実施形態では、方法は、標的mRNAのスプライシングを調節する有効量のアンチセンス化合物を前記動物に投与する工程を含む。

【0269】

たとえば、標的mRNAのスプライシングの調節は、動物の体液、組織、細胞の器官におけるmRNAスプライシング産物のレベルを測定することによって測定することができる。体液には、限定されるものではないが、血液（血清または血漿）、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、滑液および唾液が含まれ、当業者に慣例的な方法によって得ることができる。組織、器官または細胞には、血液（たとえば、ヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、CD34+CD4+細胞のような造血細胞）、リンパ球および他の血液系細胞、皮膚、骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節、脳、脊髄、心臓、骨格筋、肝臓、結合組織、膵臓、前立腺、腎臓、肺、口腔粘膜、食道、胃、腸管、小腸、結腸、膀胱、精巣、乳腺、副腎、および（白色および褐色）脂肪が含まれる。組織、器官および細胞のサンプルは、生検によって慣例的に得ることができる。いくつかの別の状況では、組織または器官のサンプルは、死後動物から回収することができる。本発明の好ましい態様および／またはその実施形態において、スプライシングの調節は、線維芽細胞、好ましくは一次線維芽細胞、好ましくはポンペ病に罹患している患者由来の初代線維芽細胞において測定される。

【0270】

オリゴマー化合物による治療の効果は、バイオマーカーを測定することによって評価することができる当技術分野で公知の慣例的な臨床方法によって、1つまたは複数の化合物と接触させた動物から採取した前記の流体、組織または器官における標的mRNAのスプライシングの調節に関連する。これらのバイオマーカーには、限定されるものではないが、グルコース、コレステロール、リポタンパク質、トリグリセリド、遊離脂肪酸およびグルコースおよび脂質代謝の他のマーカー；肝臓トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、血液尿素窒素、クレアチンおよび腎臓および肝臓機能の他のマーカー；インターロイキン、腫瘍壊死因子、細胞内接着分子、C反応性タンパク質および他の炎症マーカー；テストステロン、エストロゲンおよび他のホルモン; 腫瘍マーカー; ビタミン、ミネラル、電解質が含まれる。本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、バイオマーカーはグリコーゲンである。

【0271】

本明細書に開示される化合物は、有効量の化合物を適切な薬学的に許容される希釈剤または担体に添加することによって、医薬組成物に利用することができる。該化合物はまた、スプライシングの変化に関連する疾患および障害の治療のための医薬品の製造に使用することができる。本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、疾患はポンペ病である。

【0272】

体液、器官または組織が有効量の1つまたは複数の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触する方法も考慮される。体液、器官または組織を、開示の化合物の1つ以上と接触させて、体液、器官または組織の細胞における標的mRNAのスプライシングの調節をもたらすことができる。有効量は、アンチセンス化合物または化合物または組成物の標的核酸またはその生成物に対するモジュレーション効果を、当業者に慣例的な方法によってモニターすることによって決定することができる。さらに細胞または組織を被験体から単離し、有効量のアンチセンス化合物または組成物と接触させ、当業者に知られている慣例的な方法によって被験体に再導入するex vivo治療法が企図される。

【0273】

投与される十分な量のアンチセンスオリゴマー化合物は、望ましくない疾患症状の改善を誘導するのに十分な量であろう。このような量は、とりわけ、性別、年齢、体重、全体的な身体的状態、患者の状態などの要因に応じて変化し得、そして場合に応じて決定され得る。その量は、処置される状態のタイプおよび（たとえば、ステロイドなどの他の薬剤の投与などの）処置プロトコルの他の成分に応じて変化し得る。その量はまた、全身または局所のような投与方法に応じて変化し得る。

【0274】

医薬製剤中のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の典型的な投与量は、約0.05から1000mg/kg体重、特に約5から500mg/kg体重の範囲であり得る。本発明の一態様および／またはその実施形態では、投与量は、約50から300mg/kg体重で、2週間に1回または週に1回または2回、または治療効果を達成するために必要な任意の頻度で投与することができる。適切な量は、3-50mg/kg、より好適には10-40mg/kg、より好適には15-25mg/kgである。

【0275】

投与される用量は、もちろん、使用および有効成分の、年齢、健康状態、および体重；症状の性質および程度、併用療法の種類、治療の頻度、および所望の効果などの、薬力学的特性のような既知の因子に依存して変化するであろう。レシピエントは、任意のタイプの哺乳動物であり得るが、好ましくはヒトである。本発明の一態様および／またはその実施形態では、本発明の医薬組成物の剤形（組成物）は、1単位あたり約1マイクログラムから50,000マイクログラム、特に約10から10,000マイクログラムの活性成分を含むことができる単位（単位が1回の注射のためにバイアルまたは1つのパッケージを意味する場合、患者の体重が50kgの場合は最大15gまで）を含む。静脈内送達の場合、医薬製剤の単位用量は、一般に、体重1kgあたり0.5から500マイクログラム、好ましくは5から300マイクログラム、特に10、15、20、30、40、50、100、200 、または300マイクログラム/ kg体重（μg/ kg体重）のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含む。好ましい静脈内投与量は、体重1kg当たり化合物10ngから2000μg、好ましくは3から300mg、より好ましくは10から100μgの範囲である。あるいは、単位用量は、2から20ミリグラムのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含み得、必要に応じて、先行する1日用量を与えるために倍数で投与され得る。これらの医薬組成物において、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、通常、組成物の総重量に基づいて約0.5-95重量％の量で存在する。

【0276】

1つの特定の実施形態では、個々の患者の反応に基づいて投薬量を増減させることができることを認識すべきである。使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の実際の量は、利用される特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド分子、処方される特定の組成物、適用の様式、および特定の投与部位によって変わることは理解されよう。

【0277】

好ましくは、化合物は毎日、2日に1回、3日に1回、週に1回、2週間に1回、または毎月1回投与される。

【0278】

別の好ましい実施形態において、たとえば ウイルスベクターを使用する場合、投与は1回のみである。

【0279】

アンチセンスオリゴマー化合物のウイルスに基づく送達が選択される場合、適切な用量は、使用されるウイルス株、送達経路（筋肉内、静脈内、動脈内または他の）などの異なる因子に依存するであろう。当業者は、そのようなパラメーターが臨床試験の間に通常行われることを認識するであろう。さらに、当業者は、疾患の症状は、本明細書に記載の治療によって完全に緩和され得るが、これはそうである必要はないことを認識するであろう。部分的または断続的な症状の緩和さえも、レシピエントにとって大きな利益となり得る。さらに、患者の治療は、通常、単一の事象ではない。むしろ、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物は、得られた結果に応じて、数日間隔、数週間間隔、または数ヶ月間隔、または数年間隔で、複数の機会に投与される可能性が高い。

【0280】

当業者であれば、たとえば 治療プロトコルに応答して、タンパク質の機能レベルを決定または測定し、かつ、機能性の増加または低下のレベルを決定する多くの方法があることを理解するであろう。このような方法には、限定されるものではないが、タンパク質の活性の測定または検出などが含まれる。このような測定は、一般に、標準または対照または“正常”サンプルと比較して行われる。さらに、タンパク質の機能性の欠如が疾患プロセスに関与する場合、疾患の症状をモニターおよび／または測定することができ、間接的に正確に機能するタンパク質の存在または非存在を検出するため、またはタンパク質の機能の欠如を改善するための治療プロトコールの成功を測定するために使用することができる。好ましい実施形態では、GAAタンパク質の機能性が測定される。これは、当業者に周知の酵素活性アッセイを用いて適切に行われる。

【0281】

本発明の特定の態様および／またはその実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボで単独で、またはベクターに関連して送達され得る。その最も広い意味において、“ベクター”は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への移入を容易にすることができる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの不在をもたらす分解の程度と比較して低下した分解を伴って核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明に有用なベクターには、裸のプラスミド、非ウイルス送達系（エレクトロポレーション、ソノポレーション、カチオントランスフェクション剤、リポソームなど）、ファージミド、ウイルス、ウイルス性またはアンチセンスオリゴヌクレオチド核酸配列の挿入または取り込みによって操作された細菌源である。ウイルスベクターは、ベクターの好ましいタイプであり、限定されるものではないが、レトロウイルス（たとえば、モロニーネズミ白血病ウイルスおよびレンチウイルス由来ベクター）などのRAウイルス、ハーベイネズミ肉腫ウイルス、ネズミ乳房腫瘍ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス; SV40型ウイルス;ポリオーマウイルス；エプスタイン−バールウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルスのウイルス由来の核酸配列を含む。当業者に知られていない他のベクターを容易に使用することができる。

【0282】

本発明による好ましいウイルスベクターには、遺伝子治療においてヒト使用のために既に承認されているDNAウイルスであるアデノウイルスおよびアデノ随伴（AAV）ウイルスが含まれる。実際には、それぞれ異なる組織向性を有する12種の異なるAAV血清型（AAV1から12）が知られている（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。組換えAAVは、依存性パルボウイルスAAVに由来する（Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07）。アデノ随伴ウイルスタイプ1から12は、複製欠損であるように操作することができ、広範囲の細胞タイプおよび種に感染することができる（Wu、Z Mol Ther 2006; 14：316-27）。さらに、熱および脂質溶媒の安定性などの利点を有する。造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い形質導入頻度;重複阻害の欠如により、複数の一連の形質導入が可能になる。さらに、選択圧が存在しない場合、野生型アデノ随伴ウイルス感染が組織培養において100継代を超えて続き、アデノ随伴ウイルスゲノム組込みが比較的安定した事象であることが示唆された。アデノ随伴ウイルスは、染色体外の様式でも機能し得る。

【0283】

他のベクターにはプラスミドベクターが含まれる。プラスミドベクターは当技術分野で広く記載されており、当業者に周知である。たとえば、Sambrook et al, 1989を参照されたい。それらは、多くのウイルスベクターと同じ安全性懸念を持たないので、これに特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合するプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で機能的にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されるプラスミドには、pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40、およびpBlueScriptが含まれる。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらに、プラスミドは、制限酵素およびライゲーション反応を使用してカスタム設計して、DNAの特定の断片を除去および付加することができる。プラスミドは、様々な非経口、粘膜および局所経路によって送達され得る。たとえば、DNAプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、または他の経路によって注射することができる。それはまた、鼻腔内スプレーまたはドロップ、直腸座薬および経口で投与することもできる。好ましくは、前記DNAプラスミドは、筋肉内または静脈内に注射される。それはまた、遺伝子銃を用いて表皮または粘膜表面に投与することもできる。プラスミドは、水溶液中で与えられ、金粒子上で乾燥され得るか、またはリポソーム、デンドリマー、渦巻状物およびマイクロカプセル化を含むがこれに限定されない別のDNA送達系に関連して、送達され得る。

【0284】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド核酸配列は、たとえば異種プロモーターのような異種調節領域の制御下にある。プロモーターはまた、たとえば、CMVプロモーターのようなウイルスプロモーターまたは任意の合成プロモーターであり得る。

【0285】

本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、ベクターは2つ以上のアンチセンスオリゴマー化合物をコードすることができる。各アンチセンスオリゴマー化合物は、異なる標的に向けられる。

【0286】

本明細書に記載のアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、そのようなエステルの薬学的に許容される塩、エステル、または塩、またはヒトを含む動物への投与の際に（直接または間接的に） 生物学的に活性な代謝産物またはその残渣である。したがって、たとえば、本開示はまた、アンチセンス化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的同等物にも関する。

【0287】

“プロドラッグ”という用語は、内因性酵素、化学物質、および／または状態の作用によって、体内またはその細胞内で活性形態（すなわち、薬物）に変換される、不活性またはより活性の低い形態で調製される治療剤を示す。特に、オリゴヌクレオチドのプロドラッグは、国際公開第93/24510号または国際公開第94/26764号に開示されている方法にしたがってSATE（(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート）誘導体として調製される。プロドラッグは、一方または両方の末端が、（たとえば、末端にホスホジエステル骨格結合を組み込むことによって）活性化合物を生成するために開裂されるヌクレオチドを含むアンチセンス化合物を含むこともできる。

【0288】

“薬学的に許容される塩”という用語は、化合物の生理学的および薬学的に許容される塩を指し：親化合物の所望の生物学的活性を保持し、それに望ましくない毒性効果を与えない塩を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩が有用であり、ヒトへの治療投与に十分に受け入れられている。本発明の別の態様および／またはその実施形態では、dsRNA化合物のナトリウム塩も提供される。

【0289】

本明細書に記載のアンチセンス化合物は、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合、封入、抱合または他の方法で会合させることもできる。

【0290】

本開示はまた、本明細書に記載のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤を含む。医薬組成物は、局所的または全身的治療が所望されるかどうかおよび治療される領域に応じて、多くの方法で投与され得る。本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、投与は筋肉内または静脈内である。

【0291】

便宜的に単位剤形で提示することができる医薬製剤は、製薬業界で周知の従来の技術にしたがって調製することができる。このような技術には、活性成分を医薬担体または賦形剤と会合させる工程が含まれる。一般に、製剤は、活性成分を液体担体、微粉化した固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要に応じて生成物を（たとえば、送達のために特定の粒子サイズに）成形することによって調製される。本発明の好ましい態様および／またはその実施形態では、医薬製剤は、適切な溶媒、たとえば水または生理食塩水、恐らく滅菌製剤、担体または他の薬剤での筋肉内投与のために調製される。

【0292】

“薬学的担体”または“賦形剤”は、1つまたは複数の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤または他の薬理学的に不活性なビヒクルであってよく、当該分野で公知である。賦形剤は、液体または固体であってもよく、核酸および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わせた場合に、所望のバルク、一貫性などを提供するように、計画された投与方法を考慮して選択される。

【0293】

本明細書で提供される組成物は、2つ以上のアンチセンス化合物を含み得る。別の関連する実施形態において、組成物は、第1の核酸を標的とする1つ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第2の核酸標的を標的とする1つ以上のさらなるアンチセンス化合物を含み得る。あるいは、本明細書で提供される組成物は、同じ核酸標的の異なる領域を標的とする2つ以上のアンチセンス化合物を含み得る。2つ以上の組み合わせた化合物を一緒にまたは連続して使用することができる。組成物は、他の非アンチセンス化合物治療剤と組み合わせることもできる。

【0294】

本明細書に記載のアンチセンスオリゴマー化合物は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合してもよい。そのような賦形剤は、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアラビアゴムのような懸濁剤;分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、たとえば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、たとえばステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、たとえばヘプタデカエチレンオキシセタノール、または脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分エステル、たとえばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートとの縮合生成物、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物、たとえばポリエチレンソルビタンモノオレエートである。水性懸濁液はまた、1種以上の保存剤、たとえばエチルまたはp-ヒドロキシ安息香酸n-プロピルを含有してもよい。水を添加することによって水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および1種以上の防腐剤と混合して有効成分を提供する。アンチセンスオリゴマー化合物組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液の形態であってもよい。懸濁液は、上記で言及した適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、公知の技術にしたがって処方することができる。滅菌した注射用調製物はまた、たとえば1,3-ブタンジオール中の溶液のような非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であってもよい。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の薄い不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射剤の調製に使用される。

【0295】

本開示はまた、薬学的に許容される担体または希釈剤中に薬学的有効量の所望の化合物を含む、保存または投与のために調製されたアンチセンスオリゴマー化合物組成物を含む。治療的使用のための許容される担体または希釈剤は、医薬技術において周知であり、たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co., A.R. Gennaro edit., 1985）に記載されている。たとえば、防腐剤および安定剤を提供することができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤および懸濁化剤を使用することができる。

【0296】

本開示の医薬組成物は、水中油型エマルションの形態であってもよい。油性相は、植物油または鉱油またはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然ゴム、たとえばアラビアゴムまたはトラガカントゴム、天然リン脂質、たとえば大豆、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトールから誘導されるエステルまたは部分エステル、たとえばモノオレイン酸ソルビタン、および 前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。

【0297】

本開示のアンチセンスオリゴマー化合物は、治療に適した組成物を形成するために、安定剤、緩衝剤などを伴ってまたは伴わずに、任意の標準的な手段によって患者に投与することができる。リポソーム送達機構を使用することが望ましい場合、リポソームの形成のための標準的なプロトコルに従うことができる。したがって、本開示のアンチセンスオリゴマー化合物は、任意の形態、たとえば、筋肉内または局所、全身性、または髄腔内注射によって投与され得る。

【0298】

この開示はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質（PEG改変、または長循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含有する表面改質リポソームを含むアンチセンスオリゴマー化合物組成物の使用を特徴とする。これらの製剤は、標的組織におけるアンチセンスオリゴマー化合物の蓄積を増加させる方法を提供する。このクラスの薬物担体は、単核食細胞系（MPSまたはRES）によるオプソニン作用および排除に抵抗し、それによりカプセル化されたアンチセンスオリゴマー化合物のより長い血液循環時間および組織曝露を可能にする（Lasic et al, Chem. Rev. 95:2601-2627 (1995) and Ishiwata et al, Chem. Pharm. Bull. 43:1005-1011 (1995)）。長周期循環リポソームは、特に、MPSの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、アンチセンスオリゴマー化合物の薬物動態および薬力学を増強する（Liu et al, J. Biol. Chem. 42:24864-24870 (1995); Choi et al, 国際公開第96/10391号; Ansell et al, 国際公開第96/10390号; Holland et al., 国際公開第96/10392号）。長期間循環するリポソームは、肝臓および脾臓などの代謝的に攻撃的なMPS組織における蓄積を回避する能力に基づいて、アンチセンスオリゴマー化合物をヌクレアーゼ分解からカチオン性リポソームと比較してより大きく保護する可能性もある。

【0299】

本開示の処方および方法によるアンチセンスオリゴマー化合物組成物の投与後、被験体は、プラセボ処置または他の適切な対照被験体と比較して、処置されている疾患または障害に関連する1つまたは複数の症状の約10％から約99％の減少を示す。

【実施例】

【0300】

実施例１

【0301】

pre-mRNAスプライシングに影響を及ぼす突然変異は、スプライシング調節の複雑な機構のために予測することが困難である。スプライシングに対する配列変異体の効果を全身的に検出および特徴づけるための一般的なアプローチは、現在の診断実践を改善するであろう。ここでは、そのようなアプローチが、隣接エクソンRT-PCR、PCR産物の配列分析、およびすべてのコードエクソンについてのエクソン内部定量的RT-PCRを組み合わせることによって実現可能であることを示す。これは、一元的な常染色体劣性疾患であるポンペ病を引き起こす酸性−アルファグルコシダーゼ遺伝子の特徴のない突然変異に適用されている。スプライシングに対する影響には、潜在的なスプライス部位の使用、イントロン保持およびエクソンスキッピングが含まれていた。これらはin silicoでの予測と異なり、実験的テストの必要性を強調している。漏出性野生型スプライシングの程度の定量化は、疾患の重篤度と相関する。

【0302】

材料と方法

【0303】

患者と健常対象

【0304】

患者は臨床症状およびGAA酵素活性に基づいてポンペ病と診断された。全ての患者および健康対照で、分子分析のためのインフォームドコンセントを得た。

【0305】

命名法

【0306】

記載された突然変異の位置は、GAA mRNAのコード領域の最初のヌクレオチドを示すEnsembl GAA cDNA会合番号ENST00000302262.3. c.1に対するものである。さらにナンバリングはHGVS標準[14]による。

【0307】

細胞培養およびcDNA調製

【0308】

線維芽細胞は、患者および健康な個体の皮膚生検から単離された。細胞をDMEM高グルコース（Lonza）+10％ウシ胎仔血清（HyClone、Thermo Scientific）+1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza）で培養した。RNAeasyミニプレップキット（Qiagen）を用いてRNAを単離した。iScript cDNA合成キット（Biorad）を用いて800ngのRNAをcDNAの生成に用いた。使用前にcDNAを10倍に希釈した。

【0309】

隣接エクソンPCR分析

【0310】

FastStart Taqポリメラーゼ（Roche）を用いてcDNAを増幅した。プライマーは、各dNTPはそれぞれ0.333mMで、0,333μMの最終濃度で使用した。PCRプログラムは、Biorad s1000サーマルサイクラーで実施した（96℃4分間、[96℃20秒、60℃30秒、72℃1分]を35サイクル、72℃5分）。5μlの各PCR反応物は、臭化エチジウムを含む1.5％アガロースゲル上で泳動した。ゲルは、Typhoon FLA 9000 gel imager（G＆Eヘルスケア）で撮影した。使用したプライマーを図１５に示す。

【0311】

エクソン−内部qPCR分析

【0312】

各サンプルの相対濃度を決定するために、各cDNAサンプル4μl（H₂O中で10倍希釈）をIQ Mastermix（Biorad）および各プライマー0.333μMを含有する15μlのPCR反応で処理した。各特異的プライマーセットの効率を説明するために、全てのサンプルを健常対照サンプルからの標準曲線に関連させた。すべてのサンプルを3回測定した。使用したプライマーを図１６に示す。

【0313】

サンガー法による配列決定

【0314】

ゲノムDNA突然変異は、オランダ、ロッテルダムのErasmus MCのClinical Geneticsの診断部門で同定された。隣接エクソンPCR産物の直接配列決定は、Big Dye Terminator kit v3.1（Applied Biosystems）を用いて行った。純粋なDNAサンプルを得るために、スプライシングアッセイでゲル上に見えるPCR産物を20μlのピペットチップで刺し、チップ上のDNAを10μlのH₂O中に再懸濁した。続いて、1μlを新たなPCRで使用し（スプライシングアッセイに記載）、単一鋳型からDNAを得た。過剰なプライマーおよびdNTPを、FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase（Thermo Scientific）を使用して、製造者のプロトコールにしたがって除去した。サンプルをセファデックスG-50（GE Healthcare）で精製し、配列をAB3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems、Hitachi）で測定した。

【0315】

GAA酵素活性

【0316】

線維芽細胞におけるGAAの活性は、4-メチルウンベリフェリル-α-グルクロピラノシド（4-MU）または基質としてのグリコーゲンを用いて、[15]に記載のように測定した。

【0317】

結果

【0318】

スプライシング変異を検出するための一般的なアッセイ

【0319】

アプローチは2つの部分で構成されている。最初に（図１、左）、個々の古典的なエクソン（隣接エクソンPCR）に隣接する標準プライマーを用いて、目的のmRNAの包括的なRT-PCRを実施する。生成物をアガロースゲル電気泳動により分離する。製品サイズの変化は、代替的／異常なスプライシングの指標である。スプライシング接合部は、ゲルから単離された産物の配列決定またはPCR反応の直接配列決定を用いて正確に決定することができる。次いで（図１、右）、個々のエクソン（エクソン−内部qPCR）を定量化するために標準qPCRを実施する。各エクソン内でアニールするプライマーが使用される。結果は、β-アクチンmRNAおよび健常対照における発現について標準化される。結果はエクソンのスキッピング／インクルージョンを定量化し、スプライシング変異が漏出野生型スプライシングを可能にするかどうかを示すこともできる。

【0320】

アッセイの開発と検証

【0321】

健常対象

【0322】

このアッセイは健康な対照を用いて開発された。スプライシング接合部およびエクソンサイズを検出するために、隣接エクソンにアニーリングしたプライマーを用いて、一次線維芽細胞から調製したcDNAについて、隣接エクソンPCR分析を行った（図２Ａ）。ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色は、全ての場合において正しい分子量の生成物を示した。これは、これらの細胞の全てのエクソンのための標準的スプライシングを示した。いくつかの追加の生成物が、少量、特にエクソン6および7のすぐ上に観察された。配列分析は、これらがイントロン6が保持された生成物を表すことを示した。この健常対照および多くのポンペ患者で生成物が観察され、既知の現象であるノイズの多い異常なスプライシングを示す可能性がある[16]。エクソン−内部qPCRを用いて個々のエクソンを定量した（図１Ｂ）。値はβ-アクチン発現について標準化され（qPCR分析によって測定されるように）、試験サンプルの標準化のために使用する準備が整った。

【0323】

患者1

【0324】

この患者を、十分に記載されたスプライシング突然変異が上記のアッセイを用いて初代線維芽細胞において正確に検出され得るかどうかを決定する検証に用いた。若年者／成人発症のポンペ病を引き起こす頻繁な突然変異であるため、c.-32-13T＞G (IVS1)突然変異が選択された。その変異は、エクソン2のスプライスアクセプター部位に近いイントロン1に位置し、エクソン2の異常なスプライシングを引き起こすが、漏出した野生型スプライシングも可能にする[17,18]。第2の対立遺伝子はNMDのために非常に低いレベルで発現することが知られている[19]。これは、c.1636 + 5G＞T 突然変異によって引き起こされ、これはイントロン11インクルージョンおよび早期終止コドンを導く。この理由のために、IVS1変異を含む対立遺伝子は、下記のスプライシングアッセイにおいて優勢である。

【0325】

隣接エクソンPCR分析により、エクソン2の増幅から3つの主要な生成物が得られた（図２Ａ）。これらの生成物をDNA配列決定により分析したところ、生成物1は標準的スプライシング接合部を有する完全なエクソン2を示した（図９）。生成物2は部分的にスキップされたエクソン2を含み、生成物3は完全にスキップされたエクソン2を示した（図２ＡおよびＳ２）。これらの生成物は、IVS1変異について報告された主要なスプライシング変異体に対応し、（N）（生成物1）、スプライシングバリアント（SV）1（生成物2）およびSV2（生成物3）[18]と命名された。

【0326】

エクソン−内部qPCR分析は、エクソン2および他のすべてのエクソンの10−15％の発現を示した（図２）。これは次のように説明できる。IVS1突然変異は、以前に記載されているように、エクソン2（図２Ａの生成物1）の漏出野生型スプライシングが、すべてのエクソンを含む正常なmRNAを生じることを可能にする（[18,20]）。他の2つの主要な生成物2および3の両方は、エクソン2に位置する翻訳開始点の欠失をもたらす。これはmRNA分解をもたらし、定量的エクソン−内部qPCRアッセイにおいてわずかな寄与をもたらし、IVS1対立遺伝子からの漏出野生型GAA mRNAの優勢な検出をもたらす。結論として、スプライシングに対するIVS1突然変異の既知の効果は、GAAのための一般的なスプライシングアッセイを用いて忠実に検出された。漏出野生型スプライシングは健常対照レベルの10−15％であり、ポンペ病の若年者／成人発症を説明した。ここで使用した5つのスプライシング予測プログラム（SpliceSiteFinder-like（SSF）、MaxEntScan（MES）、NNSplice（NNS）、GeneSplicer（GS）およびHuman Splicing Finder（HSF））は、スプライシングにおけるIVS1変異の発現の効果を検出できなかった（図１４Ａ）。

【0327】

患者2

【0328】

この患者は、アッセイの感度を試験するために選択された。ホモ接合性のc.525delT突然変異のために、GAA mRNA発現はNMDのために非常に低い[21]。驚くべきことに、隣接エクソンPCR分析は、減少したレベルではあるが、すべてのエクソンが正しいサイズで依然として検出され得ることを示した（図８）。より高い分子量の生成物もより低いレベルで観察された。これらは、PCR反応における競合スプライシングされたmRNAの存在量の減少のために増幅されたスプライシングされていないプレmRNA種を表している可能性がある。残留mRNAの量を定量するために、エクソン−内部qPCRを実施し、健常対照と比較して全エクソンの5-10％の発現を示した（図８Ｂ）。結論として、GAAのための一般的なスプライシングアッセイは、非常に低いmRNA発現の分析および定量化を可能にする。これは、フレーム改変を読み取った結果として分解されるmRNAに特に関連する。

【0329】

患者3

【0330】

第3の検証は、エクソン18およびその隣接配列（del ex18またはc.2481+102_2646+31del）を除く周知の欠失を有する患者に対して実施した（図２Ａ）。この場合は、エクソン18のスプライス部位が除去されるので興味深い。以前の研究では、新しいmRNAが形成され、そこでは、エクソン17が正規スプライス部位を介してエクソン19にきれいにスプライシングされていることが示されている[17]。得られたmRNAの翻訳リーディングフレームは無傷のままであり、このmRNAがNMD経路を介した分解に対して感受性でないことを示唆している（図７−表２）。この患者の第二の突然変異、c.1548G＞Aはエクソン10に終止コドンを生成する[22]。 これまでのmRNA発現に対するその効果は報告されていない。早期終止コドンは、この対立遺伝子からのmRNAの存在量が低い可能性がある。

【0331】

隣接エクソンPCRは、エクソン17、18および19の増幅の変化を示した（図３Ａ）。エクソン18の増幅により、1つではなく2つの生成物が得られた。シークエンス分析では、最も高い分子量の生成物（4番）が野生型スプライシングエクソン18を表し、より低い分子量の生成物（5番）はエクソン18全体を欠き、エクソン17およびエクソン19はその正規スプライス部位を介して結合した。（図Ｓ３Ａ）。エクソン17および19の増幅は、健常対照と比較して正しい生成物の量が少なかった。 それらの増幅に用いたプライマーはエクソン18にアニールし、その検出はdelex18対立遺伝子に由来することはできないが、c.1548G＞A対立遺伝子に由来していなければならないことを示している。これは、c.1548G＞A対立遺伝子がある程度発現していることを示しており、エクソンPCRに隣接することによって野生型スプライスエクソン18の中程度のレベルの検出を説明している。

【0332】

c.1548G＞A対立遺伝子からの発現を定量するために、エクソン内部qPCRを実施し、エクソン18の3％発現を示したが、他のすべてのエクソンは健康対照レベルの約40-50％で発現した（図3F）。これは、低レベルのエクソン18検出によって測定されるように、c.1548G＞A変異が非常に低いmRNA発現をもたらすことを示す。他のすべてのエクソンの発現は、エクソン18が正確に欠失された安定なmRNAを産生するdelex18対立遺伝子に由来する。

【0333】

まとめると、ジェネリックスプライシングアッセイは、エクソン欠失の検出および特徴付けも可能にする。隣接エクソンPCRとエクソン-内部qPCRアッセイの結果を比較することにより、2つの対立遺伝子間を精査することが可能となる。

【0334】

新規スプライシング変異の特徴付け

【0335】

次に、部分的に特徴付けられたまたは特徴付けられていない突然変異を含む多くの患者を分析した。

【0336】

患者4

【0337】

患者4は、エクソン2のスプライスアクセプター部位の近くのイントロン1に位置するc.-32-3C＞Gに新規変異を含んでいた（図３Ｄ）。この突然変異は、公開されたc.-32-3C＞A突然変異[19]との類似性に基づくエクソン2のスプライシングに影響を及ぼすことが疑われている。この研究では、エクソン2の完全なスキップが報告された。スプライシング予測プログラムは、c.-32-3C＞G突然変異が、全てではないが一部のプログラムについてエクソン2のスプライスアクセプター部位を弱めることを示した（図１４Ｃ）。第2の対立遺伝子は、エクソン10のスプライス供与部位の近くのイントロン10に位置するc.1551+1G＞Aにおいて以前に報告された[23]が特徴づけられていない突然変異を含んでいた（図３Ｅ）。公開されたc.1551+1G＞C突然変異[17,24]との類似性に基づいて、c.1551+1G＞A突然変異がエクソン10スプライシングに影響を及ぼすと思われる。スプライシング予測プログラムは、エクソン10のスプライスドナー部位の喪失を示した（図１４Ｃ）。

【0338】

隣接エクソンPCR分析の結果は、2つのエクソン：エクソン2およびエクソン10の異常なスプライシングを示した（図３Ｃ）。エクソン2の増幅は3つの主要生成物番号6-8であり、および配列分析は、これらの生成物が野生型スプライシング、エクソン2のc.486の潜在的スプライス受容部位を介したエクソン2の部分的スキップ、エクソン2であることを示している（図３Ｄおよび図１０Ｂ）。これは、イントロン1における2つの独立した突然変異が、すなわち、ポリピリミジン管に位置するc.-32-13T＞Gであり、スプライスアクセプター部位の近くに位置するc.-32-3C＞Gである突然変異が、エクソン2スプライシングに関して同じ定性的結果を有することを示す。スプライシング予測プログラムは、この結果を正確に予測するには不十分であった。 エクソン10の隣接エクソンPCR増幅は、2つの主要な生成物である9および10を生じた（図３Ｃ）。配列分析は、生成物9がエクソン9,10および11の間に野生型接合を含み、その生成物10が、読み枠が無傷のままであるエクソン10 mRNAの正確なスキッピングを示したことを示した（図３Ｅおよび図１０Ｃ）。エクソン10のスプライス供与部位の弱化の最も直接的な結果は、エクソン10のスキッピングではなくイントロン10の除去に失敗するため、これは驚くべきことであった。

【0339】

スプライシング欠陥の程度を決定するために、エクソン-内部qPCRを実施した。エクソン10は約6％で発現し、他の全てのエクソンは健常対照レベルの約50％で発現した（図３Ｆ）。これは、mRNAの大部分がエクソン10がスキップされたc.1551+1G＞A対立遺伝子に由来するという考えと一致する。より短い製品は変化しないリーディングフレームを有し、安定であると予想される。対照的に、c.-32-3C＞G対立遺伝子は、IVS1突然変異に類似したmRNA分解を生じることが知られている（部分的な）エクソン2をスキップする。c.-32-3C＞G対立遺伝子は、エクソン-内部qPCR結果にわずかに寄与するのみである。その寄与は、 c.-32-3C＞G突然変異の漏出野生型スプライシングに起因し得るエクソン10の発現から判断することができる。しかしながら、エクソン10発現の代替源は、c.1551+1G＞A対立遺伝子の漏出野生型発現である。エクソン10発現の非常に低いレベルは、c.-32-3C＞Gおよびc.1551+1G＞Aの両方が漏出野生型発現のレベルが低いかまたは存在しないことを示す。これは、IVS1突然変異が10-15％のより高いレベルの野生型スプライシングを可能にするため、c.-32-3C＞G突然変異がIVS1突然変異と比較してより重篤であり得ることを示す（図２Ｄ）。ポンペ病の臨床経過は、この患者の若年発症を示しており、成人発症患者と比較して低く、野生型GAA発現およびGAA酵素活性レベルの低レベルと一致した（図６−表１）。

【0340】

患者5

【0341】

患者5は、エクソン6の最後の塩基対に位置するp.Gly359Argミスセンス突然変異であるc.1075G＞Aについて同型接合であった（図４Ｂ）[25]。この突然変異はスプライシングに影響を及ぼす可能性があるがおそらく非病原性であると分類されている[26]。それはエクソン6のスプライスドナー部位の近くに位置し、スプライシング予測分析は、この部位の弱化および4ヌクレオチド上流の潜在スプライスドナー部位の強化を示した（図１４Ｄ）。

【0342】

隣接エクソンPCR分析は、エクソン7の生成物の欠如、他のエクソンの低発現、およびエクソン2の低分子量生成物の低発現を示した（図４Ａ）。予測およびエクソン6におけるこの突然変異の位置に基づいて、エクソン6および7周辺のスプライシング接合部が変更される可能性があると考えた。一致して、エクソン6 PCR産物（生成物11）の配列解析により、c.1071の4ヌクレオチド上流に位置するエクソン6の潜在的なスプライスドナー部位が代わりに使用されたことが示された（図４Ｂおよび図Ｓ４Ｂ）。エクソン7増幅のための順方向プライマーが変化したスプライスドナー部位のために4つのミスマッチを有するために、エクソン7のための生成物が存在しないことが説明される。注目すべきことに、隣接エクソンPCR分析は、この突然変異のための漏出性野生型スプライシングを検出することができなかった。エクソン7増幅のための野生型のバンドの存在をもたらしたために、観察されなかったと想定される。エクソン7のスプライシングをさらに調べるために、エクソン5に位置する代替の順方向プライマーを使用した。予想された生成物が得られ、生成物11の配列分析で観察されたように、エクソン6のc.1071からエクソン7の標準スプライスアクセプター部位（図１１Ａ）へのスプライシングが示された。得られたmRNAのリーディングフレームが変更され、早期終止コドンとなった（表２）。エクソン2増幅で得られた低分子量生成物はそれ以上追求されていない。これはまだ同定されていないイントロン突然変異によって引き起こされる可能性がある。あるいは、野生型GAA mRNAは漏出性エクソン2スキッピングを有することが知られており、その生成物は、c.1071突然変異に起因するmRNA分解のために優先的に増幅され得る。

【0343】

エクソン-内部qPCRアッセイを用いたGAA mRNA発現の定量化は、すべてのGAAエクソンが、IVS1変異について観察されたレベルよりもはるかに低いが、c.525delT変異について観察されたレベルよりもはるかに低い非常に低いレベルで発現されることを示した（図４Ｇ）。これは、この患者の漏出性野生型スプライシングレベルが非常に低いかまたは存在しないことを確認し、mRNAの大部分は不安定であるということを確認した。一致して、線維芽細胞における非常に低いGAA活性が測定され、この患者の診断はポンペ病の最も重篤な古典的な乳児型であった。

【0344】

患者6

【0345】

患者6は、ホモ接合のc.1552-3C＞G突然変異を有していた。この突然変異は、エクソン11に近いイントロン10に位置する（図４Ｄ）。隣接エクソンPCR分析は、3つの主要生成物（12-14;図４Ｅ）を有するエクソン10の異常なスプライシングを示した。配列分析は、生成物14において、エクソン10が完全にスキップされ、c.1552-30のエクソン11付近の新規なスプライスアクセプター部位が利用されたことを示した（図４Ｄおよび１１Ｃ）。このmRNAは、リーディングフレームをそのまま残す（表２）。生成物13は、野生型スプライシングされたmRNAとして同定された。生成物12は完全イントロン10が保持されたmRNAからなっていた。このスプライシング産物において、リーディングフレームが破壊される。生成物13および14は以前に検出されているが[27]、生成物12は新規である。興味深いことに、スプライシング予測プログラムは、エクソン11（図１４Ｆ）の古典的なスプライスアクセプター部位または潜在的スプライスアクセプター部位の利用の程度を予測することに相反するものであった。さらに、エクソン11のスプライスアクセプター部位の弱化は、エクソン10をスキップするとは予想されなかった。その代わりに、エクソン10のスプライスドナー部位がc.1552-30で潜在的受容体にスプライスされ、イントロン10の一部でエクソン11が伸長し、さらに正常なスプライシングをもたらす2つの生成物が考えられる。他の期待される生成物はエクソン11の完全なスキッピングであろう。全く異なる結果は、潜在的スプライシング変異の分子的帰結を分析するために実験的検証が必要であることを示している。

【0346】

エクソン内部qPCRアッセイを用いてスプライシング欠陥の定量化を行った。これは健常対照レベルの約20％ですべてのエクソンの発現を示した（図４Ｇ）。エクソン10の発現の余分な減少は観察されず、mRNAの大部分はエクソン10を含み、生成物12および13が好ましいことが好むことを示唆された。漏出性の野性型スプライシング（生成物13）の存在は、この患者におけるポンペ病の成人発症との残存GAA酵素活性およびより軽度の表現型と一致する（表１）。結論として、c.1552-3C＞Gは、エクソン10およびイントロン10の周りにいくつかのスプライシング欠損をもたらし、成人発症に適合する漏出野生型スプライシングを可能にする。

【0347】

患者7

【0348】

患者7は、c.1437G＞A、すなわちエクソン9のスプライスドナー部位に位置するサイレント変異（図４Ｆ）についてホモ接合であった。隣接エクソンPCR分析は、エクソン9増幅のためのものの代わりに2つの生成物を示し、エクソン8およびエクソン10増幅のための収率は低かった（図４Ｅ）。配列分析は、生成物15が野生型スプライシングされたエクソン9を表し、生成物16ではエクソン9が完全にスキップされ、読み枠が変わらない転写物がより短いことを示した（図４Ｆおよび図１１Ｄ）。その位置から予想されるように、c.1437G＞A突然変異はin silicoで予測され、エクソン9のドナー部位をスプライシングするように弱める（図１４Ｅ）。しかし、実験結果は、エクソン9のスプライスドナー部位の欠損がエクソン9のスキッピングではなくイントロン9のインクルージョンをもたらすと予想されるので、驚くべきものであった。エクソン9は逆方向PCRプライマー（エクソン8）または順方向PCRプライマー（エクソン10）のアニーリングの鋳型として機能する可能性が低いため、エクソン8およびエクソン10の増幅生成物は正しいサイズであったが収率は低かった。

【0349】

エクソン-内部qPCRを用いた定量は、健常対照のわずか5％の発現しか示さなかったエクソン9を除くすべてのエクソンについて、ほぼ正常（対照の70-80％）発現レベルを示した。この患者の若年者/成人発症は、スプライス部位突然変異の漏出性の性質と一致する（表１）。要約すると、c.1437G＞A変異は、リーディングフレームを無傷のままにしたエクソン9の正確なスキップをもたらし、漏出性野生型GAAスプライシングの低レベルを可能にする。

【0350】

複雑な症例の特徴づけ：患者8

【0351】

遺伝子型

【0352】

患者8は対立遺伝子1にミスセンス変異c.1256A＞Tを含んでいた。それはエクソン8の中央に位置し、p.Asp419Valをもたらし、軽度の病原性として分類されている（図５Ｂ）[26]。第2の対立遺伝子は、エクソン10のスプライス供与部位の近くのイントロン10に位置するc.1551+1G＞T突然変異を含んでいた[26]。これは、患者4について上述したc.1551+1G＞A突然変異に似ている。

【0353】

スプライシング生成物の解析

【0354】

隣接エクソンPCR分析は、エクソン8、9、および10の増幅からの複数のPCR産物を示した（図５Ａ）。これらの産物はすべて配列決定によって分析した（図１２）。これは、野生型エクソン8スプライシング（生成物17）の存在およびc.1256A＞T突然変異の2nt上流に位置するc.1254のエクソン8内の新規スプライスドナー部位の利用を示した（生成物18; 図５Ｂ−Ｃ）。このドナーはエクソン9の標準スプライシング受容部位にスプライシングされ、結果として得られたリーディングフレームは変化しなかった（表２）。スプライシング予測プログラムは実際にc.1256A＞T突然変異のためにc.1254がスプライス供与部位に変わったことを示した（図１４Ｇ）。エクソン8の古典的スプライスドナー部位は不変であり、2つの部位のどちらがin silico の予測より好ましいかは不明であった。生成物21はエクソン10の野生型スプライシングを表し、生成物22は完全なエクソン10のスキッピングの結果であり、読み枠は無傷のままであった（図５Ｄおよび図１２）。c.1551+1G＞T変異によるエクソン10スプライスドナー部位の消失は、スプライシング予測と一致していたが（図１４Ｇ）、エクソン10をスキップするのではなく、イントロン10を含むことが最も論理的な結果と思われたので、結果は予期されたものではなかった。

【0355】

低発現の漏出性野生型スプライシングの証拠

【0356】

以下に記載されるエクソン-内部qPCR分析と並んで、隣接エクソンPCR分析は、生成物の相対強度を介した突然変異の重症度に関する情報を提供する。これらは、スプライシング産物の同定（図５Ｂ−Ｄ）および増幅に使用されるプライマーの位置（図１３）に基づいて説明することができる。

【0357】

エクソン7

【0358】

エクソン7の検出は、エクソン6の3 '末端にアニールする順方向プライマーおよびエクソン8の5'末端にアニールする逆方向プライマーを用いて行われる（図１３）。エクソン8の5 '末端はすべての場合に保持され、3'部分はc.1256A＞T対立遺伝子にスプライシングされている。したがって、エクソン7の隣接エクソンPCR検出はこの患者において影響を受けず、これはそのとおりであった（図５Ａ）。

【0359】

エクソン8

【0360】

エクソン8の検出のために使用される隣接エクソンPCRプライマーは、エクソン7および9にアニールされる（図１３）。両方のエクソンは、エクソン8自体のすべてのスプライシング変化が半定量的に検出されるべきであると予測するこの患者において影響を受けない。確かに、対立遺伝子1では強い野生型生成物（番号17）が検出され、対立遺伝子2が支配的であり、c.1254の新規な潜在的スプライスドナー部位のために、わずかに弱いより小さい生成物18が検出された。生成物17の最大50％は対立遺伝子2に由来すると予想され、したがって生成物18と比較してより強い存在は、対立遺伝子1が漏出野生型スプライシングを有することを示唆する。

【0361】

エクソン9

【0362】

隣接エクソンPCRによるエクソン9の検出のためのPCRプライマーは、対立遺伝子1でスキップされていない部分であるエクソン8の5'部分と対立遺伝子2で完全にスキップされているエクソン10とにアニールする（図１２）。これは、これらの2つの対立遺伝子からのエクソン9の検出を複雑にする：対立遺伝子1の生成物は、エクソン8の部分的なスキッピングのために、正常よりも短くなる。対立遺伝子2由来の生成物は、エクソン10の正確なスキッピングのために不可能であるが、このエクソンはプライマーアニーリングに必要である。得られた優勢な生成物は、対立遺伝子1に由来する、より短い生成物番号20であった。しかしながら、少量の野生型生成物番号19も観察された。これは、2つの対立遺伝子の少なくとも1つが漏出野生型スプライシングを可能にすることを示す。

【0363】

エクソン10

【0364】

エクソン10の隣接エクソンPCR分析は、エクソン9およびエクソン11にアニーリングするプライマーを用いて行われ、両方とも影響を受けない。したがって、結果は、エクソン10のスプライシング変化を半定量的方法で反映する。野生型スプライシングを示す生成物21が最も豊富であったが、エクソン10が完全にスキップされた生成物22はわずかに豊富であった。対立遺伝子1のエクソン10スプライシングは影響を受けず、野生型生成物の50％を占める可能性があるので、この結果は、対立遺伝子2も、対立遺伝子1と同様に漏出性野生型スプライシングを有することを示唆する。

【0365】

エクソン-内部qPCR分析を用いた定量

【0366】

各エクソンのmRNA発現の定量化により、エクソン8および10を除くすべてのエクソンは、健常対照と比較して約2倍高い存在量を示した。エクソン8および10は、他のエクソンに関して2倍低いレベルの発現であったが、依然として健常対照の80-120％のレベルで発現していた。これは、この患者における異常に高いmRNA発現を示す。対立遺伝子（1256A＞T）は、エクソン8の部分的なスキップを受けるので、qPCR産物の検出に失敗する。したがって、エクソン8の残存検出は、50％寄与すると予想される対立遺伝子2（c.1551+1G＞T）に由来し、残りの発現はおそらく対立遺伝子1からの漏出野生型スプライシングに由来する。この場合、発現は他のエクソン比較して50％に近く、c.1551+1G＞T変異が野生型スプライシングのレベルをはるかに低くすることができたことを示唆している。なぜこの患者が健常対照と比較して2倍高いGAA発現を示すのか、そしてこの増加が両方の対立遺伝子に同様の程度に当てはまるかどうかは不明であることに留意すべきである。この患者は、小児期/若年性疾患発症を有するが、古典的な乳児ポンペ患者と比較して明らかに影響が少なく、GAAの残存野生型発現の低レベルと一致する（表１）。

【0367】

要約すると、患者8は2つのスプライシング変異を含んでいた。c.1256A＞Tはp.Asp419Valを引き起こすエクソン8のミスセンス変異であり、さらにc.1254に新規なスプライスドナー部位を生成し、エクソン8の部分的スキップおよび漏出野生型スプライシングを生じる。c.1551+1G＞Tはイントロン10に位置し、エクソン10の完全なスキッピングおよび漏出性野生型スプライシングを引き起こす。ポンペ病の幼児／若年者の発症は、両方の変異が中程度から重度の病原性であることを示唆している。これは、成人発症患者と比較してGAA酵素活性レベルが低いことと一致する。

【0368】

ムコ多糖症VI型（マロテウス・ラミ症候群）は、N-アセチルガラクトサミン4-スルファターゼ（アリールスルファターゼB; ARSB）をコードする遺伝子の欠損により引き起こされる常染色体劣性単離疾患である。スプライシングアッセイの一般的な性質を実証するために、このアッセイをMPSVIに適合させた。この目的のために、隣接エクソンプライマーは、ARSB遺伝子の全てのコードエクソンについて設計された（エクソン2-7;最初と最後のエクソンは隣接していない）。以下のプライマー配列および予想される生成物の大きさ（カラム「WT生成物の大きさ」）を使用した：

【0369】

健常対照由来の初代線維芽細胞を増殖させ、全RNAを採取し、cDNAを合成し、エクソン2-7をPCRにより増幅した（図３４参照）。生成物をアガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムを用いて可視化した。図３４は、全てのエクソンが予想されるサイズで優勢な単一バンドを与えたことを示す（サイズマーカーは左側に示し、数字はbpのサイズを示す）。次に、線維芽細胞を、ARSB変種c.1142+2T＞Cについてホモ接合性の患者から増殖させた。この患者は以前にBrandsらに記載されている（Orphanet J Rare Dis. 2013 Apr 4;8:51）。スプライシング欠陥は疑わしいが、それは実証されていない。さらに、潜在的なスプライシング欠陥がどれほど深刻であるかは知られていなかった。この変異体の性質を分析するためのスプライシングアッセイの適用は、図３５の左部分：1）に示されるように、2つの主要な結果を伴う重度のスプライシング欠陥を明らかにした。エクソン5の増幅産物は健常対照と比較して低く、361bpの代わりに117bpの単一産物が得られ、これはエクソン5のスキッピングおよびmRNA中の244ヌクレオチドの欠失と一致するすべての製品は、健常対照と比較してより少ない存在量を有していた。これは、244ヌクレオチドの欠失が、ナンセンス媒介性崩壊経路の活性化およびmRNAの分解をもたらすリーディングフレームシフトをもたらすという考えと一致する。興味深いことに、漏出性野生型スプライシングは検出されなかった。これは、Brandsらに記載（Orphanet J Rare Dis. 2013 Apr 4;8:51）されているように、この患者における重症および急速な疾患の進行と一致する。まとめると、発現およびスプライシングアッセイは、MPSVIに首尾よく適用され、その結果、c.1142+2T＞C ARSB変異体によって引き起こされるスプライシング欠陥の同定がもたらされる。漏出野生型スプライシングの欠如は、関与する患者の重度の表現型と一致していた。

【0370】

実施例２

【0371】

1 SF-U7 snRNAアンチセンスベクターの作製

【0372】

プロモーターを有するU7snRNA遺伝子は、PCR増幅において、PstIおよびSalIオーバーハング（太字の通常のレタータイプで示される）を有するFw-GCGCctgcagTAACAACATAGGAGCTGTG（配列番号1602）およびRv-GCGCgtcgacCAGATACGCGTTTCCTAGGA（配列番号1603）プライマーを使用して、雌のマウスゲノムDNAから得た。全PCR反応物を1％ゲルに負荷し、PCR断片（425bp）を製造元のマニュアル（Invitrogen）にしたがってTopo-IIベクターにクローニングした。SMoptおよびStuI部位は、Fw-(GCTCTTTTAGAATTTTTGGAGCAGGTTTTCTGACTTCG（配列番号1604）とRV-U7snRNA-SmOPT（CGAAGTCAGAAAACCTGCTCCAAAAATTCTAAAAGAGC（SEQ ID NO：1605）、または、Fw-(CCTGGCTCGCTACAGAGGCCTTTCCGCAAGTGTTACAGC（配列番号1606）とRv-U7snRNA-StuI（GCTGTAACACTTGCGGAAAGGCCTCTGTAGCGAGCCAGG（配列番号1607）を内側のプライマーとし、そして、Fw-M13（GTAAAACGACGGCCAG）（配列番号1608）とRv-M13（CAGGAAACAGCTATGAC）（配列番号1609）をアウタープライマーとする内外のプライマー設計にしたがって部位特異的突然変異誘発を用いて生成された [Heckman, K.L. and L.R. Pease, Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc, 2007. 2(4): p. 924-32]。改変されたU7 snRNA配列を、pRRL.PPT.SF.preベクターにクローニングし [Warlich E et al., Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 2011 Apr;19(4):782-9.]、PstIおよびSalI部位を使用することにより、そして元のSFFVプロモーターを置換した。これは、SF_U7snRNAベクターを作製するための手順である。

【0373】

2 ハイスループットスクリーニングのためのSF-U7 snRNAアンチセンスベクターの最適化

【0374】

最初に使用されたStuI部位は、Warlichらのレンチウイルスベクターにおいて独特ではなく、Fw-cctggctcgctacagatgcaTaggaggacggaggacg（配列番号1610）とびRv-cgtcctccgtcctcctAtgcatctgtagcgagccagg（配列番号1611）プライマーを使用して、部位特異的突然変異誘発によってNsiI制限部位により置換された。大文字は突然変異した残基を示す。

【0375】

3 アンチセンス配列の挿入

【0376】

新しいアンチセンス配列を、所望のアンチセンス配列（gcgcATGCAT-アンチセンス配列-ttggagcagg）（配列番号1612）を含むオーバーハング順方向プライマーを用いてオーバーハングPCRで挿入した。太字の大文字はNsiI制限サイトを示す。逆方向プライマーRv_ms_U7snRNA_SalIは（GCGCgtcgacCAGATACGCGTTTCCTAGGA）（配列番号1613）であり、すべての構築物について同じであった。小文字はSalI制限部位を示す。オーバーハングPCRは、PfuUltra HF（Agilent Technologies）を用いて修飾ベクター（SF_U7snRNA_NSI）について行われた。PCRプログラムは、95℃で30秒間の初期変性ステップ、95℃で10秒間、60℃で30秒間および72℃で10秒間で35サイクルからなっていた。最終伸長工程は72℃で10分間であった。所望のアンチセンス配列およびU7 snRNAを含むPCR反応物を、0.2％エチジウムブロマイド染色を伴う2％アガロースゲルに載せた。次にバンドをトランスイルミネーター（UVP、LLC）下で可視化し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ）を用いて切り出し、抽出した。

【0377】

ゲル抽出後、16μlの精製産物をSalIおよびNsiI（Roche）を用いて37℃で1時間消化し、QIAquick PCR精製キット（Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製した。

【0378】

一方、元のベクターをSalIおよびNsiIで37℃で1時間消化し、アンチセンス配列を持たないベクターを得た。消化したベクターをエチジウムブロマイド染色を伴う1％アガロースゲルに載せた。バンドをトランスイルミネーター下で視覚化し、消化されたベクター（6358bp）に対応するバンドを切出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製した。

【0379】

精製消化したベクターおよび消化したPCR産物を、ATP（New England BioLabs）を含むT4 DNAリガーゼとで、室温で1時間連結した。

【0380】

ライゲーション産物を大腸菌（TOP10）で形質転換し、100μg/mlアンピシリン（Sigma）を含有するLB寒天プレートに接種した。一晩のインキュベーションの後、ミニプレップ培養のためにライゲーション産物当たり3つのコロニーを採取した。採取したコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを含有する2mlのLB中、37℃で一晩増殖させた。プラスミドの精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ）を用いて行った。抽出後、DNA濃度をNanovue分光光度計で測定した。

【0381】

新しく生成した構築物の配列を、配列反応のためにBigDye Terminator v3.1（Applied Biosystems）を用いたSanger Sequencingで検証し、次いでSephadex G-50（Sigma）で製造者のプロトコールにしたがって精製した。

【0382】

配列番号41-97の配列は、U7スクリーニングで同定されたアンチセンス化合物である。上記のアンチセンス配列は、ベクターにクローニングされたときにDNAとして示されるが、細胞内ではRNA分子として転写される。当業者は、TがUであることを知っている。

【0383】

図２２は、不偏イントロン1およびエクソン2のスクリーンに対するGAAを標的とするアンチセンス配列の位置の例を示す。

【0384】

酵素活性アッセイ

【0385】

4-メチルウンベリフェロンアッセイを用いて酵素活性を測定した。12日間の形質導入後に試料を収穫した。溶解緩衝液は、50mMトリス（pH7.5）、100mM NaCl、50mM NaF、1％Tx-100およびEDTAを含む1錠のプロテアーゼ阻害剤（Roche）から調整された。回収に先立ち、溶解緩衝液は形質導入した線維芽細胞と氷上で5分間インキュベートした。サンプルはそのまま使用するか、もしくは、液体窒素を用いて急速凍結して-80℃で保存した。さもなければ、4-メチルウンベリフェロンアッセイでのさらなる使用のためにサンプルを氷上にて保持した。

【0386】

本質的に蛍光発生性である基質4-メチルウンベリフェリル-α-D-グルコピラノシドを用いてGAA活性を測定した。試料のタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce、Thermo Scientific）を用いたLowryタンパク質法によって決定した。ウシ血清アルブミン（BSA）標準は、0、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、1.0、2.0mg/mlであった。吸光度は、BCAタンパク質アッセイについて562nmで測定し、4-メチルウンベリフェロンアッセイでは、Varioskan（Thermo Scientific）マイクロプレートリーダーを用いて、365nmで励起し、448nmで発光させた。GAA酵素活性は、全タンパク質1ミリグラム当たり1時間当たり加水分解された基質のナノモルとして表した。

【0387】

レンチウイルスベクター生産

【0388】

レンチウイルスベクター産生のために、10cm培養皿上で増殖する90％コンフルエントな293T細胞を、10cm培養皿に1/8播種した。16-24時間後、合計3μgのU7 snRNA構築物、2μgのPax2および1μgのVSVを、Fugene 6トランスフェクション剤（Promega）を用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後にウイルス上清（9ml）を採取し、0.45μmフィルター（MillexHV、Millipore）でろ過し、Beckman Ultracentrifuge（Beckman Coulter）で20,000rpm、4℃で2時間超遠心分離して濃縮した 。ウイルスペレットを100μlのダルベッコ改変イーグル培地低グルコース（Gibco、ペイズリー、英国）に再懸濁し、CryoTubes（Thermo Scientific）に等分し、-80℃で保存した。レンチウイルス力価を、HIV p24抗原ELISAキット（Retrotek、ZeptroMetrix Corporation）を用いた超遠心分離による濃縮後に決定した。アッセイは、Varioskanマイクロプレートリーダー（Thermo Scientific）を用いて測定した。

【0389】

細胞の形質導入

【0390】

培養培地を、播種24時間後に6ng/mlの硫酸プロタミン（シグマ）を含む新しい培養培地と交換した。細胞は、等しい力価のレンチウイルスで形質導入された（上記参照）。

【0391】

患者由来の一次線維芽細胞に形質導入し、U7snRNA AON構築物を含むレンチウイルスで上記を参照し、スプライシングを生じさせた。線維芽細胞のスクリーニングは、一次線維芽細胞を含む個々のウェルに単一タイプのU7 snRNA AONを発現するレンチウイルスを感染させることによって行った。感染の5日後にRNAを分析した。スプライシング産物をRT-qPCRで分析した。GAA酵素活性を感染12日後に分析した（上記を参照：酵素活性アッセイ）。図１９は、異なるAONによるエクソン2のインクルージョンの変化を示す。U7小型核RNAシステムを用いたアンチセンス配列を有するGAAのイントロン1およびエクソン2上のスクリーニングのRT-qPCRを用いたRNA発現解析。数字は、表１によるアンチセンス配列位置を示す。対照は、AONベクターを添加していない患者線維芽細胞である。

【0392】

図２０は、U7小型核RNA系で使用されるアンチセンス配列を有するGAAのイントロン1およびエクソン2上のスクリーニングのRT-PCRによるRNA分析を示す。数字は、表１によるアンチセンス配列位置を示す。GAA RT-PCRでは、3つの主要な生成物が観察される。上の生成物は、エクソン2のインクルージョンを表し、下の二重項は、エクソン2の部分的スキップ（二重線の上のバンド）と、完全な二次のエクソン2（二重線の下のバンド）のスキップを表す。β-アクチンRT-PCRをローディングコントロールとして用いた。

【0393】

図２１は、U7小型核RNA系におけるアンチセンス配列を有するGAAのイントロン1およびエクソン2上のスクリーニングのGAA酵素活性を示す。数字は、表１によるアンチセンス配列位置を示す。対照は、AONベクターを添加していない患者線維芽細胞である。

【0394】

いくつかのクローンがエクソン2の含有を有意に増加させ、それによってIVS1変異を有するポンペ患者の治療の候補となる候補を提供することは明らかである。図２３は、同定された配列がエンハンサーおよびサイレンサーモチーフの両方として同定されたため、
同定された配列を予測することができなかったことを示している。

【0395】

実施例３

【0396】

ポンペ病を引き起こす最も一般的な突然変異は、c.-32-13T＞G (IVS1) 突然変異である。GAA遺伝子におけるこの突然変異は、エクソン2の上流のイントロン13塩基対に位置し、エクソン2はGAA mRNAの翻訳のための開始コドンを含む。IVS1変異は、エクソン2スプライスアクセプター部位の強度を低下させるポリピリミジン領域を破壊するので、GAA転写産物の約90％においてエクソン2のミススプライシングを引き起こす。

【0397】

スプライス部位のこの減少した強度に対抗するために、我々はGAAエクソン2のスプライシングに負の効果を有するスプライシング因子に結合する配列を同定したい。エクソン2およびその周辺のランダム変異の組み込みにより、これらの配列を見出すことができた。

【0398】

多数の突然変異を迅速にスクリーニングするために、我々はGAAエクソン1、イントロン1、エクソン2、イントロン2、エクソン3およびイントロン3の一部を含むミニ遺伝子を生成した（図24、パート1）。2つのユニークな制限部位を統合することにより、エクソン2を取り巻くミニ遺伝子の一部を突然変異配列と迅速に交換することができる（図２４、パート２）。PCR産物中のランダム突然変異を組み込むために、準最適条件下でPCRを実施する（図２４、パート３）。エクソン2の周辺に位置する制限部位も含むこれらのPCR産物は、次いで、目的ベクターに直接連結することができる。連結産物の形質転換後、クローンを拾い、ランダム変異を含むクローンからプラスミドを単離することができる（図２４、パート４）。これらのクローンのHEK293細胞への別々のトランスフェクションは、対照と比較して異なるスプライシングを生じるGAAミニ遺伝子からRNA転写物を生成する。例は図５に示され、隣接するエクソンRT-PCRであり、3つのクローンから生成されたcDNAに対してエクソン内部qPCRが行われる（図２４、パート５に示されている）。エクソン2のより高いインクルージョンをもたらすプラスミドの配列決定は、スプライシングに負の影響を与える重要な配列の同定をもたらす。これらの配列は、アンチセンス療法の潜在的な標的として試験するために、またはこの領域に結合する化合物をスクリーニングするために、順次使用することができる。

【0399】

図２５は、2つのクローンの結果を示す。クローン115およびクローン97は、IVS1突然変異と比較して、エクソン2インクルージョンのそれぞれ118％および297％の増加を示す。クローン115は、突然変異：c.17C＞T、c.469C＞Tおよびc.546+23C＞Aを含む。野生型スプライシング（バンド1）が増加し、完全なスキッピング（バンド3）が減少する。クローン97は、突然変異：c.-32-102T＞C、c.-32-56C＞T、c.11G＞A、c.112G＞Aおよびc.137C＞Tを含む。このクローンはまた、c.-32-553からc.-32-122も欠けているが、しかしながら、これはエクソン2排除に影響を及ぼさない（この領域を含むまたは含まないミニ遺伝子構築物からのスプライシングを比較することによって決定される）。野生型スプライシング（バンド3）は強く増加し、部分（バンド2）および完全（バンド3）スキッピングは減少する。

【0400】

エクソン1−エクソン3のミニ遺伝子とは別に、GAAエクソン5からGAAエクソン8までのゲノム領域を含むミニ遺伝子も作製した。このミニ遺伝子を用いて、IVS1変異と同様にスプライシングに影響を及ぼす他の変異を試験することができる。

【0401】

図36は、GAA mRNAのイントロン6を含める際のナンセンス媒介性崩壊（NMD）経路の阻害の結果を示す。健常対照（上部ゲル）、遺伝子型c.-32-13T＞G、c.525delT（中央部ゲル）を有するポンペ患者および遺伝子型c.525delTを有するポンペ患者のシクロヘキサミド治療c.525delT、c.525delT（下部ゲル）を行った。NMD経路（0時間で標識されたレーン）の阻害なしに、強いバンドが、エクソン6およびエクソン7の標準スプライシングを表すRT-PCRを用いて検出された。かすかなバンドが古典的なエクソンのバンドの真上に観察された。このバンドは、イントロン6のインクルージョンを表すDNA配列分析によって決定した。そのような産物はリーディングフレームを変化させてNMD経路の活性化を引き起こすので、イントロン6のインクルージョンは、実際には適切な検出を免れる頻繁な事象であると推測した。この考えは、NMD経路の阻害によって確認された：これは、イントロン6インクルージョンを表す強いバンドの検出をもたらした。これは、多くのGAAプレmRNA種が健常対照およびポンペ患者の両方で標準的スプライシングを免れることを示した。上記のGAAエクソン5-8およびU7 snRNAスクリーニングを含むミニ遺伝子は、エクソン6/7スプライシングのリプレッサーをブロックすることによってイントロン6が最終mRNAに含まれないようにする配列を同定するために使用される。これは、エクソン6/7の正しいスプライシングが増強され、漏出性の野生型スプライシングのレベルを高めるので、ポンペ病を引き起こす漏出野生型スプライシングを伴う全てのスプライシング突然変異のためのジェネリック治療を表すであろう。

【0402】

以下の突然変異は、増加したRNA発現を与える：c.17C＞T、c.469C＞Tおよびc.546+23C＞A、c.32-102T＞C、c.32-56C＞T、c.11G＞A、c.112G＞A、およびc.137C＞T。これらの突然変異が位置するmRNA配列を標的とするAONは、患者の治療に有用であり得る。配列番号98-540は、ミニ遺伝子アプローチで見出された例示的な配列である。上記の表は、配列番号98-540およびそれが標的とする突然変異またはゲノム配列を示す。

【0403】

図２６は、配列番号12（AON1）（上パネル）および配列番号33（AON2）（下パネル）についての用量−応答曲線を示す。対立遺伝子上の遺伝子型c.-32-13T＞G（IVS1）および他方の対立遺伝子上のc.525delTを有する患者由来線維芽細胞は、未処理（‘トランスフェクションなし’）とするか、または0-20μMでアンチセンスオリゴマー化合物と共にインキュベートした。c.525delTはナンセンス媒介性崩壊を受け、なぜRNAレベルでの効果が主にIVS1対立遺伝子に由来するのかを説明することに注意してください。細胞を、RNA分析のため3日後（A、C）に、および、タンパク質分析のため5日後（B、D）に採取した。配列番号12 AON1および配列番号33（AON2）の両方は、U7 snRNAアッセイを用いて同定されたGAAプレ-mRNAのイントロン1に存在する配列に結合する。これは、エクソンン2の封入の促進をもたらし、野生型GAA mRNAのより高い発現を生じる。これは、mRNAレベルで（野生型GAAを特異的に検出するプライマーを使用して）、および、タンパク質レベルで（GAA酵素活性のアッセイを使用して）測定される。

【0404】

RNA分析：全RNAを単離し、cDNAを合成し、RT-qPCR分析を行ってGAAエクソン2インクルージョンを検出した（エクソン1に特異的な順方向プライマーおよびエクソン2に特異的な逆方向プライマーを使用）。

【0405】

タンパク質分析：GAA酵素活性を、4-MUアッセイを用いて測定した。活性はBCAアッセイを用いて測定したときに全タンパク質について標準化した。

【0406】

アンチセンスオリゴマー化合物処理：本明細書で使用されるアンチセンスオリゴマー化合物は、遺伝子ツールから得られるモルホリノである。アンチセンスオリゴマー化合物を、製造者の指示にしたがってendoporter（gene tools）を用いて細胞にトランスフェクトした。

【0407】

この後の実験は、患者線維芽細胞株1（図２６）のそれと同様であり、アンチセンスオリゴマー化合物が別の患者由来の独立した細胞株2においても機能することを実証した。この場合、遺伝子型は1つの対立遺伝子上のIVS1および他の対立遺伝子上のミスセンス変異体（c.923A＞C）であった。c.923A＞C対立遺伝子はナンセンス媒介性崩壊を受けず、mRNAレベルは両方の対立遺伝子の混合物を表し、IVS1対立遺伝子に対する影響を患者1と比較してあまり顕著にしないことに注意されたい。図２７は、配列番号12（AON1）（上パネル）および配列番号33（AON2）（下パネル）についての用量反応曲線を示す。

【0408】

図２８は、エクソン2インクルージョンを促進するためのアンチセンスオリゴマー化合物配列番号12（AON1）および配列番号33（AON2）の特異性を示す。

【0409】

配列番号35（対照AON2）および配列番号36（対照AON3）は、GAAのイントロン1の別の領域を標的とするが、エクソン2インクルージョンの促進には効果がない。CypA mRNAを標的とする無関係のAON（対照AON1;配列番号34）は、GAAエクソン2インクルージョンに影響しない。RT-qPCR分析（A）および付随するGAA酵素活性アッセイ（B）によって示されるように、配列番号12（AON1）および配列番号33（AON2）はGAAエクソン2のインクルージョンを効率的に促進する。これは、配列番号12（AON1）および配列番号33（AON2）のように、イントロンスプライスサイレンシング（ISS）配列が標的化されていることをU7 snRNAアッセイで確認した場合にのみ、GAAエクソン2インクルージョンが促進される。

* CypA cDNA配列は、RefseqエントリーのNM_021130.4である。
** GAA cDNA配列は、RefseqエントリーのNM_000152.3である。

【0410】

図３２は、患者線維芽細胞株1に対する配列番号33（AON 2）の効果の時間経過を示す。細胞を、アンチセンスオリゴマー化合物の添加後3−7日でGAA活性についてアッセイした。アンチセンスオリゴマー化合物は実験中ずっと培地中に連続的に存在していた。

【0411】

この図は、GAA活性に対する効果が3日後に始まり、AON添加後5日で最大に達することを示す。

【0412】

参考文献
1. Boycott, K.M., et al., Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nat Rev Genet, 2013. 14(10): p. 681-91.
2. Havens, M.A., D.M. Duelli, and M.L. Hastings, Targeting RNA splicing for disease therapy. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2013. 4(3): p. 247-66.
3. Desmet, F.O., et al., Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals. Nucleic Acids Res, 2009. 37(9): p. e67.
4. Yeo, G. and C.B. Burge, Maximum entropy modeling of short sequence motifs with applications to RNA splicing signals. J Comput Biol, 2004. 11(2-3): p. 377-94.
5. Reese, M.G., et al., Improved splice site detection in Genie. J Comput Biol, 1997. 4(3): p. 311-23.
6. Pertea, M., X. Lin, and S.L. Salzberg, GeneSplicer: a new computational method for splice site prediction. Nucleic Acids Res, 2001. 29(5): p. 1185-90.
7. Palacios, I.M., Nonsense-mediated mRNA decay: from mechanistic insights to impacts on human health. Brief Funct Genomics, 2013. 12(1): p. 25-36.
8. van der Ploeg, A.T. and A.J. Reuser, Pompe's disease. Lancet, 2008. 372(9646): p. 1342-53.
9. Umapathysivam, K., J.J. Hopwood, and P.J. Meikle, Correlation of acid alpha-glucosidase and glycogen content in skin fibroblasts with age of onset in Pompe disease. Clin Chim Acta, 2005. 361(1-2): p. 191-8.
10. Van den Hout, H., et al., Recombinant human alpha-glucosidase from rabbit milk in Pompe patients. Lancet, 2000. 356(9227): p. 397-8.
11. Kishnani, P., et al., Enzyme replacement therapy with recombinant human acid alpha glucosidase (rhGAA) in infantile Pompe disease (IPD): Results from a Phase 2 study. Pediatric Research, 2003. 53(4): p. 259a-259a.
12. Kishnani, P.S., et al., Recombinant human acid alpha-glucosidase - Major clinical benefits in infantile-onset Pompe disease. Neurology, 2007. 68(2): p. 99-109.
13. Gungor, D., et al., Impact of enzyme replacement therapy on survival in adults with Pompe disease: results from a prospective international observational study. Orphanet Journal of Rare Diseases, 2013. 8.
14. den Dunnen, J.T. and S.E. Antonarakis, Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: A discussion. Human Mutation, 2000. 15(1): p. 7-12.
15. Butterworth, J. and D.M. Droadhead, Diagnosis of Pompe's disease in cultured skin fibroblasts and primary amniotic fluid cells using 4-methylumbelliferyl-alpha-D-glucopyranoside as substrate. Clin Chim Acta, 1977. 78(2): p. 335-42.
16. Pickrell, J.K., et al., Noisy splicing drives mRNA isoform diversity in human cells. PLoS Genet, 2010. 6(12): p. e1001236.
17. Huie, M.L., et al., Aberrant splicing in adult onset glycogen storage disease type II (GSDII): molecular identification of an IVS1 (-13T--＞G) mutation in a majority of patients and a novel IVS10 (+1GT--＞CT) mutation. Hum Mol Genet, 1994. 3(12): p. 2231-6.
18. Boerkoel, C.F., et al., Leaky splicing mutation in the acid maltase gene is associated with delayed onset of glycogenosis type II. Am J Hum Genet, 1995. 56(4): p. 887-97.
19. Pittis, M.G., et al., Molecular and functional characterization of eight novel GAA mutations in Italian infants with Pompe disease. Hum Mutat, 2008. 29(6): p. E27-36.
20. Dardis, A., et al., Functional characterization of the common c.-32-13T＞G mutation of GAA gene: identification of potential therapeutic agents. Nucleic Acids Res, 2014. 42(2): p. 1291-302.
21. Hermans, M.M., et al., The effect of a single base pair deletion (delta T525) and a C1634T missense mutation (pro545leu) on the expression of lysosomal alpha-glucosidase in patients with glycogen storage disease type II. Hum Mol Genet, 1994. 3(12): p. 2213-8.
22. Hermans, M.M., et al., Twenty-two novel mutations in the lysosomal alpha-glucosidase gene (GAA) underscore the genotype-phenotype correlation in glycogen storage disease type II. Hum Mutat, 2004. 23(1): p. 47-56.
23. Orlikowski, D., et al., Recombinant human acid alpha-glucosidase (rhGAA) in adult patients with severe respiratory failure due to Pompe disease. Neuromuscul Disord, 2011. 21(7): p. 477-82.
24. Stroppiano, M., et al., Aberrant splicing at catalytic site as cause of infantile onset glycogen storage disease type II (GSDII): molecular identification of a novel IVS9 (+2GT--＞GC) in combination with rare IVS10 (+1GT--＞CT). Am J Med Genet, 2001. 101(1): p. 55-8.
25. Muller-Felber, W., et al., Late onset Pompe disease: clinical and neurophysiological spectrum of 38 patients including long-term follow-up in 18 patients. Neuromuscul Disord, 2007. 17(9-10): p. 698-706.
26. Kroos, M., et al., Update of the pompe disease mutation database with 60 novel GAA sequence variants and additional studies on the functional effect of 34 previously reported variants. Hum Mutat, 2012. 33(8): p. 1161-5.
27. Kroos, M., et al., Seven cases of Pompe disease from Greece. J Inherit Metab Dis, 2006. 29(4): p. 556-63.
28. Barbosa-Morais, N.L., et al., The evolutionary landscape of alternative splicing in vertebrate species. Science, 2012. 338(6114): p. 1587-93.
29. Wang, G.S. and T.A. Cooper, Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet, 2007. 8(10): p. 749-61.
30. Kwan, T., et al., Genome-wide analysis of transcript isoform variation in humans. Nat Genet, 2008. 40(2): p. 225-31.
31. Castle, J.C., et al., Expression of 24,426 human alternative splicing events and predicted cis regulation in 48 tissues and cell lines. Nat Genet, 2008. 40(12): p. 1416-25.
32. Wang, E.T., et al., Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature, 2008. 456(7221): p. 470-6.
33. Lappalainen, T., et al., Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans. Nature, 2013. 501(7468): p. 506-11.
34. Lalonde, E., et al., RNA sequencing reveals the role of splicing polymorphisms in regulating human gene expression. Genome Res, 2011. 21(4): p. 545-54.
35. Wokke, J.H., et al., Genotype-phenotype correlation in adult-onset acid maltase deficiency. Ann Neurol, 1995. 38(3): p. 450-4.
36. Kishnani, P.S., et al., Cross-reactive immunologic material status affects treatment outcomes in Pompe disease infants. Mol Genet Metab, 2010. 99(1): p. 26-33.
37. Lim, K.H., et al., Using positional distribution to identify splicing elements and predict pre-mRNA processing defects in human genes. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(27): p. 11093-8.
38. Fan, L., et al., Sudemycins, novel small molecule analogues of FR901464, induce alternative gene splicing. ACS Chem Biol, 2011. 6(6): p. 582-9.
39. Webb, T.R., A.S. Joyner, and P.M. Potter, The development and application of small molecule modulators of SF3b as therapeutic agents for cancer. Drug Discov Today, 2013. 18(1-2): p. 43-9.
40. Warlich, E., et al., Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther, 2011. 19(4): p. 782-9.

【図1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4】

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【図4-3】

【図4-4】

【図5】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

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【図8】

【図8-2】

【図9】

【図10】

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【図10-3】

【図11】

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【図12】

【図13】

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【図14-2】

【図14-3】

【図14-4】

【図14-5】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図24-2】

【図24-3】

【図25】

【図25-2】

【図26】

【図27】

【図28】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図36-2】