特許 6851549 抗タウ抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6851549

(24)【登録日】2021年3月11日

(45)【発行日】2021年3月31日

(54)【発明の名称】抗タウ抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20210322BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20210322BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210322BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210322BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210322BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210322BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20210322BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20210322BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210322BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C07K16/18

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/08

   A61P25/28

   A61K39/395 N

【請求項の数】34

【全頁数】254

(21)【出願番号】特願2020-518723(P2020-518723)

(86)(22)【出願日】2018年10月16日

(65)【公表番号】特表2020-536534(P2020-536534A)

(43)【公表日】2020年12月17日

(86)【国際出願番号】IB2018058024

(87)【国際公開番号】WO2019077500

(87)【国際公開日】20190425

【審査請求日】2020年5月29日

(31)【優先権主張番号】62/572,910

(32)【優先日】2017年10月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/577,011

(32)【優先日】2017年10月25日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/697,034

(32)【優先日】2018年7月12日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-124524

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-124523

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】506137147

【氏名又は名称】エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】510133975

【氏名又は名称】ユーシーエル ビジネス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100126653

【弁理士】

【氏名又は名称】木元 克輔

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ロバーツ， マルコム イアン

(72)【発明者】

【氏名】スタッドン， ジェームズ マーティン

(72)【発明者】

【氏名】デ シルバ， ヘッティヘウェイジ アルフレッド ロハン

(72)【発明者】

【氏名】スパイデル， ジャレド

(72)【発明者】

【氏名】青柳 浩史

(72)【発明者】

【氏名】赤祖父 盛

(72)【発明者】

【氏名】橋爪 裕

(72)【発明者】

【氏名】アガルワラ， キシャン

【審査官】 水野 浩之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５３０５９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１７−５２０２５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５３０９７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１８／１５２３５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 YANAMANDRA, Kiran et al.，Neuron，２０１３年１０月１６日，Vol. 80, No. 2，pp. 402-414

【文献】 YANAMANDRA, Kiran et al.，Annals of Clinical and Translational Neurology，２０１５年 １月２３日，Vol. 2, No. 3，pp. 278-288

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖及び軽鎖を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ヒトタウに特異的に結合し、前記重鎖は、配列番号４０２に記載の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、前記軽鎖は、配列番号５７２に記載の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項2】

Ｋａｂａｔの方法に従って規定される通り、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号７３２を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号７３４を含み、前記ＨＣＤＲ３が配列番号７３６を含み、前記ＬＣＤＲ１が配列番号８４６を含み、前記ＬＣＤＲ２が配列番号８４８を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号８５０を含む；又は、
ＩＭＧＴによって規定される通り、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１００２を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１００４を含み、前記ＨＣＤＲ３が配列番号１００６を含み、前記ＬＣＤＲ１が配列番号１１１６を含み、前記ＬＣＤＲ２が配列番号１１１８を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号１１２０を含む、
請求項１に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項3】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記軽鎖の位置４９における残基がシステインではない、請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項4】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記軽鎖の位置４９における残基がセリンである、請求項３に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項5】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記重鎖の位置５７における残基がシステインではない、請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項6】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記重鎖の位置５７における残基がセリンである、請求項５に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項7】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記軽鎖の位置３４における残基がグルタミン酸である、請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項8】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記軽鎖の位置３６における残基がフェニルアラニンではない、請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項9】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記軽鎖の位置３６における残基がチロシンである、請求項８に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項10】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記軽鎖の位置４６における残基がアルギニンではない、請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項11】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記軽鎖の位置４６における残基がロイシンである、請求項１０に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項12】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記重鎖の位置９４における残基がリジンではない、請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項13】

Ｋａｂａｔの方法に従った前記重鎖の位置７１における残基がアルギニンではない、請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項14】

Ｋａｂａｔ法に従った前記重鎖の位置７１がバリンである、請求項１３に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項15】

配列番号４０２を含む重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ）及び配列番号５７２を含む軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＤ）
を含む、ヒトタウに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項16】

前記抗体はヒト化抗体である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項17】

前記抗体はＩｇＧ１である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項18】

表面プラズモン共鳴によって測定される約０．５ｎＭ未満のＫ_Ｄで、単量体野生型ヒト２Ｎ４Ｒタウに結合する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項19】

アミノ酸配列ＨＶＰＧ（配列番号１１３３）を含むエピトープでヒトタウに結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項20】

二重エピトープ性であり、反復領域２又は反復領域４内にアミノ酸配列ＨＶＰＧ（配列番号１１３３）を含むエピトープでヒトタウに結合する、請求項１９に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項21】

アミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項22】

二重エピトープ性であり、反復領域２又は反復領域４内にアミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する、請求項２１に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項23】

ペプチド結合アッセイによって決定される通り、
反復領域３内にアミノ酸配列ＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）を含むエピトープにおける結合よりも若しくは反復領域１内にアミノ酸配列ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）を含むエピトープにおける結合よりも少なくとも約１０倍大きい結合選好性で、反復領域２内にアミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する、又は
反復領域３内にアミノ酸配列ＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）を含むエピトープにおける結合よりも若しくは反復領域１内にアミノ酸配列ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）を含むエピトープにおける結合よりも少なくとも約１０倍大きい結合選好性で、反復領域４内にアミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する、
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【請求項24】

ヒトタウに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４５２４を有する細胞株によって産生される抗体のアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項25】

請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。

【請求項26】

薬学的に許容できる担体をさらに含む、請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項27】

タウオパチーの治療用である、請求項２５又は請求項２６に記載の医薬組成物。

【請求項28】

前記タウオパチーが、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、又は進行性核上性麻痺である、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項29】

前記前頭側頭型認知症がピック病である、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

請求項１〜２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。

【請求項31】

請求項３０に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項32】

請求項３０に記載の核酸分子を発現する細胞。

【請求項33】

前記抗体又は抗原結合フラグメントを産生するのに適した条件下で、請求項３２に記載の細胞を培養するステップを含む、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントを産生する方法。

【請求項34】

前記抗体又は抗原結合フラグメントを回収するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0003]本発明は、タウに特異的に結合する抗体及びその抗体を用いる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

[0004]ヒトタウは、染色体１７ｑ２１に位置する微小管関連タンパク質タウ遺伝子ＭＡＰＴによってコードされる。成人ヒト脳は、エクソン２（Ｅ２）、Ｅ３、及びＥ１０の選択的スプライシングによって作出される６つの主なタウアイソフォームを含有する。これらアイソフォームは、Ｎ末端付近の２９残基反復領域の数に応じて異なる。０、１、又は２個のインサートを含有するタウアイソフォームは、それぞれ０Ｎ、１Ｎ、及び２Ｎとして知られている。プロセシングされていないタウアイソフォームは、３個（「３Ｒ」）又は４個（「４Ｒ」）いずれかの微小管結合反復ドメインも含有する。これら反復ドメインの２番目はＥ１０によってコードされ、３Ｒタウアイソフォームには含まれない（図１）。

【0003】

[0005]タウは通常では高可溶性であるが、病的条件下において、タウは対らせん状細線維、神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）、及びタウオパチーと称される広範な神経変性疾患を規定する他の構造に凝集し得る。故に、タウオパチーとは、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含めた、微小管関連タンパク質タウの凝集を伴う神経変性疾患の１つのクラスを指す。

【0004】

[0006]タウ媒介性神経毒性の根本的メカニズムはほとんど理解されておらず、ニューロンにおけるタウ凝集の要因はまだ解明されていない。故に、タウを標的にする治療的手法が探求されているのと同時に、タウを標的にする特異的で且つ有効な治療剤の必要性が残る。

【発明の概要】

【0005】

[0007]ヒトタウアイソフォーム又はフラグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが本明細書において提供される。一部の態様において、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である。一部の実施形態において、抗体アイソタイプはＩｇＧ１である。一部の実施形態において、抗体は、配列番号１９６に記載の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、並びに配列番号４１１に記載の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）；配列番号２６８に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６５に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は配列番号４０２に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７２に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９４を含むＨＣＤＲ１、配列番号５９６を含むＨＣＤＲ２、配列番号５９８を含むＨＣＤＲ３、配列番号７３８を含むＬＣＤＲ１、配列番号７４０を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号７４２を含むＬＣＤＲ３；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６４を含むＨＣＤＲ１、配列番号８６６を含むＨＣＤＲ２、配列番号８６８を含むＨＣＤＲ３、配列番号１００８を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０１０を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１０１２を含むＬＣＤＲ３；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４２を含むＨＣＤＲ１、配列番号６４４を含むＨＣＤＲ２、配列番号６４６を含むＨＣＤＲ３、配列番号７７４を含むＬＣＤＲ１、配列番号７７６を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号７７８を含むＬＣＤＲ３；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号９１２を含むＨＣＤＲ１、配列番号９１４を含むＨＣＤＲ２、配列番号９１６を含むＨＣＤＲ３、配列番号１０４４を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０４６を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１０４８を含むＬＣＤＲ３；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３２を含むＨＣＤＲ１、配列番号７３４を含むＨＣＤＲ２、配列番号７３６を含むＨＣＤＲ３、配列番号８４６を含むＬＣＤＲ１、配列番号８４８を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８５０を含むＬＣＤＲ３；又は、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００２を含むＨＣＤＲ１、配列番号１００４を含むＨＣＤＲ２、配列番号１００６を含むＨＣＤＲ３、配列番号１１１６を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１１８を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１１２０を含むＬＣＤＲ３を含む。

【0006】

[0008]一部の態様に従って、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列改変を含む。一部の実施形態において、改変（複数可）は、Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４９がシステインではなく、Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置５７における残基がシステインではなく、Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置３４における残基がグルタミン酸であり、Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置３６における残基がフェニルアラニンではなく、Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４６における残基がアルギニンではなく、Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置９４における残基がリジンではなく、Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置７１における残基がアルギニンではなく、又はその任意の組み合わせである。Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４９における残基がシステインではない一部の実施形態において、残基はセリンである。Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置５７における残基がシステインではない一部の実施形態において、残基はセリンである。Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置３６における残基がフェニルアラニンではない一部の実施形態において、残基はチロシンである。Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４６における残基がアルギニンではない一部の実施形態において、残基はロイシンである。Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置７１における残基がアルギニンではない一部の実施形態において、残基はバリンである。

【0007】

[0009]ヒトタウに特異的に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、抗体は、配列番号２６８を含む重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ）及び配列番号４６５を含む軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＤ）；配列番号２６８を含むＨＣＶＤ及び配列番号５８１を含むＬＣＶＤ；配列番号３８４を含むＨＣＶＤ及び配列番号５４５を含むＬＣＶＤ；配列番号３９３を含むＨＣＶＤ及び配列番号５４５を含むＬＣＶＤ；配列番号４０２を含むＨＣＶＤ及び配列番号５４５を含むＬＣＶＤ；配列番号３８４を含むＨＣＶＤ及び配列番号５７２を含むＬＣＶＤ；配列番号３９３を含むＨＣＶＤ及び配列番号５７２を含むＬＣＶＤ；又は配列番号４０２を含むＨＣＶＤ及び配列番号５７２を含むＬＣＶＤを含む。

【0008】

[0010]ヒトタウに特異的に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４５２３又はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４５２４を有する細胞株によって産生される。

【0009】

[0011]一部の実施形態において、本明細書において提供される抗体又は抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定される約０．５ｎＭ未満のＫ_Ｄで、単量体野生型ヒト２Ｎ４Ｒタウに結合する。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＨＶＰＧ（配列番号１１３３）を含むエピトープでヒトタウに結合する。反復領域２又は反復領域４内にアミノ酸配列ＨＶＰＧ（配列番号１１３３）を含むエピトープでヒトタウに結合する二重エピトープ性の抗体又は抗原結合フラグメントも提供される。ある特定の態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する。反復領域２又は反復領域４内にアミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する二重エピトープ性の抗体又は抗原結合フラグメントも提供される。一部の実施形態において、モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、ペプチド結合アッセイによって決定される通り、反復領域３内にアミノ酸配列ＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）を含むエピトープにおける又は反復領域１内にアミノ酸配列ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）を含むエピトープにおける結合よりも少なくとも約１０倍大きい結合選好性で、反復領域２及び／又は反復領域４内にアミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する。一部の態様において、本明細書において提供される抗体又は抗原結合フラグメントは、反復領域２内にアミノ酸配列ＨＶＳＧＧ（配列番号１８４）を含むエピトープで又は反復領域２内にアミノ酸配列ＨＶＬＧＧ（配列番号１８５）を含むエピトープではタウに結合しない。

【0010】

[0012]一部の実施形態において、本明細書において提供されるモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは標識されている。

【0011】

[0013]記載されるモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかをコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、核酸分子を発現する細胞、及びそのような細胞の産生に適した条件下でそのような細胞を培養することによって抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントを産生する方法がさらに提供される。産生する方法は、抗体又は抗原結合フラグメントの回収をさらに伴ってもよい。

【0012】

[0014]ヒトタウに特異的に結合する記載されるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれか、及び薬学的に許容できる担体の医薬組成物も本明細書において提供される。

【0013】

[0015]ヒトタウに特異的に結合する記載されるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの使用の方法も本明細書において提供される。一部の実施形態において、ヒトタウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、医薬としての使用のためのものである。一部の態様において、ヒトタウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、タウオパチーの治療における又はタウオパチーの治療のための医薬の調製における使用のためのものである。対象におけるタウオパチーを治療する方法も提供される。一部の実施形態において、タウオパチーを治療する方法は、対象におけるタウオパチーを治療するのに有効な条件下で、ヒトタウに特異的に結合する記載されるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかを対象に投与するステップを伴う。一部の態様において、タウオパチーは、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、又は進行性核上性麻痺である。前頭側頭型認知症は、例えばピック病であってもよい。

【0014】

[0016]ヒトタウに特異的に結合する記載されるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかを対象に投与することによって、対象におけるサルコシル不溶性タウレベルを減少させるための方法がさらに提供される。ヒトタウに特異的に結合する記載されるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかを対象に投与することによって、対象におけるタウ凝集を阻害するための方法も提供される。方法は、インビトロ又はインビボで実施されてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】成人ヒト脳において発現されるタウの６つのアイソフォームを図解している：２Ｎ４Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−８）；１Ｎ４Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−７）；０Ｎ４Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−６）；２Ｎ３Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−５）；１Ｎ３Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−４）；及び０Ｎ３Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−２）（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ＆Ｇｏｅｄｅｒｔ、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ、２０１３、１２（６）：６０９〜６２２）。

【図2】本明細書において記載される抗タウ抗体を作出するために選択されたタンパク質の領域（「ペプチド抗原」）を図解している。図２は、登場の順に、それぞれ配列番号１１３７、１１３８、及び１１３８を開示している。

【図3A】マウス７Ｇ６（「ｍｓ７Ｇ６」）抗タウ抗体の精細エピトープマッピングの結果を図解している。図３Ａに関しては、野生型２Ｎ４Ｒタウ配列の翻訳される重複ペプチド（それぞれ配列番号１〜３７）を合成し、対照ＨＡタグペプチドとともにガラスチップ上にプリントした。ｍｓ７Ｇ６抗体結合（図内部のシグナル）及び対照ペプチド（図周辺部のシグナル）を、方法に記載されるように検出した。図３Ｂは、ＬＩ−ＣＯＲオデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）（商標）及びペプスライド（Ｐｅｐｓｌｉｄｅ）（商標）アナライザーソフトウェアパッケージによって定量された、ペプチドチップへの抗体結合の結果としてのスポット強度を示している。次いで、蛍光強度をペプチド配列に対してプロットして、エピトープマッピングデータを作出した。図３Ｂは、登場の順に、それぞれ配列番号１１３９〜１１４０及び１〜３７を開示している。

【図3B】マウス７Ｇ６（「ｍｓ７Ｇ６」）抗タウ抗体の精細エピトープマッピングの結果を図解している。図３Ａに関しては、野生型２Ｎ４Ｒタウ配列の翻訳される重複ペプチド（それぞれ配列番号１〜３７）を合成し、対照ＨＡタグペプチドとともにガラスチップ上にプリントした。ｍｓ７Ｇ６抗体結合（図内部のシグナル）及び対照ペプチド（図周辺部のシグナル）を、方法に記載されるように検出した。図３Ｂは、ＬＩ−ＣＯＲオデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）（商標）及びペプスライド（Ｐｅｐｓｌｉｄｅ）（商標）アナライザーソフトウェアパッケージによって定量された、ペプチドチップへの抗体結合の結果としてのスポット強度を示している。次いで、蛍光強度をペプチド配列に対してプロットして、エピトープマッピングデータを作出した。図３Ｂは、登場の順に、それぞれ配列番号１１３９〜１１４０及び１〜３７を開示している。

【図4】ヒト２Ｎ４Ｒタウタンパク質のアミノ酸２９４〜３０８に相当する、ペプチド配列ＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩ（配列番号２６）のマウス７Ｇ６抗体エピトープ置換スキャニングの結果を図解している。ペプチドの各アミノ酸位置を、考え得るあらゆる天然に存在するアミノ酸によって置き換え、ガラスチップ上にプリントし、ｍｓ７Ｇ６抗体でプローブした。図４は、選択ペプチド（それぞれ配列番号３８〜７８）に関する結果を図解している。ｍｓ７Ｇ６抗体結合は、配列番号７９の第２の位置（バリン）においていくらかの変動を許すが、抗体結合は、配列番号７９のプロリン残基に完全に依存している。ＫＤＮＩＫＨＶＳＧＧＧＳＶＱＩ（配列番号５９）への７Ｇ６抗体の結合は観察されなかった。後者は、タウＰ３０１Ｓ変異体タンパク質に存在する配列である。

【図5A】ｍｓ７Ｇ６（「７Ｇ６」）抗タウ抗体の存在及び非存在における、それぞれ野生型及びＰ３０１Ｓタウタンパク質のヘパリン誘導性凝集の程度及び速度を図解している。タウに結合することができないマウスＩｇＧが対照抗体として含まれた。

【図5B】ｍｓ７Ｇ６（「７Ｇ６」）抗タウ抗体の存在及び非存在における、それぞれ野生型及びＰ３０１Ｓタウタンパク質のヘパリン誘導性凝集の程度及び速度を図解している。タウに結合することができないマウスＩｇＧが対照抗体として含まれた。

【図6A】タウのシーディング及び凝集のインビトロ細胞系モデルにおける、それぞれビヒクル対照、ヒトＩｇＧ１ｋ、マウス７Ｇ６抗タウ抗体、及びヒト化７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の効果を図解している。

【図6B】タウのシーディング及び凝集のインビトロ細胞系モデルにおける、それぞれビヒクル対照、ヒトＩｇＧ１ｋ、マウス７Ｇ６抗タウ抗体、及びヒト化７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の効果を図解している。

【図6C】タウのシーディング及び凝集のインビトロ細胞系モデルにおける、それぞれビヒクル対照、ヒトＩｇＧ１ｋ、マウス７Ｇ６抗タウ抗体、及びヒト化７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の効果を図解している。

【図6D】タウのシーディング及び凝集のインビトロ細胞系モデルにおける、それぞれビヒクル対照、ヒトＩｇＧ１ｋ、マウス７Ｇ６抗タウ抗体、及びヒト化７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の効果を図解している。

【図7】前臨床インビボタウシーディングモデルにおける、ビヒクル、マウスＩｇＧ対照抗体、及びマウス抗タウ抗体１Ｆ１、７Ｇ６、又は８Ｅ５のいずれかとの、組み換えヒトＰ３０１Ｓタウシードのプレインキュベーションの結果を図解している。

【図8】組み換えＰ３０１ＳタウシードをＩＣＶ注射されたＰ３０１Ｓトランスジェニックマウスの海馬及び皮質における不溶性タウ発生の時間経過を図解している。

【図9】Ｐ３０１Ｓインビボシーディングモデルにおける、ｍｓ７Ｇ６抗体の末梢単回反復投薬の効果を図解している。ｍｓ７Ｇ６は、海馬及び皮質において不溶性タウレベルの低下を引き起こした。

【図10】Ｐ３０１Ｓインビボシーディングモデルにおける、ｍｓ７Ｇ６抗体の末梢複数回反復投薬の効果を図解している。７Ｇ６抗体による不溶性タウレベルの低下は用量依存的であった。

【図11】マウス抗タウ抗体ｍｓ７Ｇ６に最も近い相同なヒト生殖系列配列を図解している。ｍｓ７Ｇ６及び相同なヒト生殖系列配列を並べた。Ｖｈ及びＶＫドメインは、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ番号付けシステムによって注釈を付されている。同一残基は、ヒト生殖系列配列において「．」として表されている。図１１は、登場の順に、それぞれ配列番号１１４１〜１１４４、１１４３、１１４５、１１４３、１１４６〜１１４９、１１４８、１１５０、及び１１４８を開示している。

【図12】ｍｓ７Ｇ６抗体重鎖及び軽鎖の配列と、ヒト化７Ｇ６ Ｖｈ１及びＶｋ２バリアントとを比較している。マウス７Ｇ６及びヒト化７Ｇ６バリアントを並べた。Ｖｈ及びＶｋドメインは、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ番号付けシステムによって注釈を付されている。変異に下線が引かれている。図１２は、登場の順に、それぞれ配列番号１１５１〜１１７４を開示している。

【図13A】７Ｇ６ ＬＣｚｕ１ヒト化バリアント（図１３Ａ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ２ヒト化バリアント（図１３Ｂ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ３ヒト化バリアント（図１３Ｃ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ４ヒト化バリアント（図１３Ｄ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ５ヒト化バリアント（図１３Ｅ）、並びに軽鎖におけるＣｙｓ４９（Ｋａｂａｔに従った）及び重鎖におけるＣｙｓ５７（Ｋａｂａｔに従った）の代わりに置換されたＳｅｒを有する７Ｇ６ヒト化バリアント（図１３Ｆ）を用いた、ＥＬＩＳＡによるタウ結合を図解している。

【図13B】７Ｇ６ ＬＣｚｕ１ヒト化バリアント（図１３Ａ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ２ヒト化バリアント（図１３Ｂ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ３ヒト化バリアント（図１３Ｃ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ４ヒト化バリアント（図１３Ｄ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ５ヒト化バリアント（図１３Ｅ）、並びに軽鎖におけるＣｙｓ４９（Ｋａｂａｔに従った）及び重鎖におけるＣｙｓ５７（Ｋａｂａｔに従った）の代わりに置換されたＳｅｒを有する７Ｇ６ヒト化バリアント（図１３Ｆ）を用いた、ＥＬＩＳＡによるタウ結合を図解している。

【図13C】７Ｇ６ ＬＣｚｕ１ヒト化バリアント（図１３Ａ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ２ヒト化バリアント（図１３Ｂ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ３ヒト化バリアント（図１３Ｃ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ４ヒト化バリアント（図１３Ｄ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ５ヒト化バリアント（図１３Ｅ）、並びに軽鎖におけるＣｙｓ４９（Ｋａｂａｔに従った）及び重鎖におけるＣｙｓ５７（Ｋａｂａｔに従った）の代わりに置換されたＳｅｒを有する７Ｇ６ヒト化バリアント（図１３Ｆ）を用いた、ＥＬＩＳＡによるタウ結合を図解している。

【図13D】７Ｇ６ ＬＣｚｕ１ヒト化バリアント（図１３Ａ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ２ヒト化バリアント（図１３Ｂ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ３ヒト化バリアント（図１３Ｃ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ４ヒト化バリアント（図１３Ｄ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ５ヒト化バリアント（図１３Ｅ）、並びに軽鎖におけるＣｙｓ４９（Ｋａｂａｔに従った）及び重鎖におけるＣｙｓ５７（Ｋａｂａｔに従った）の代わりに置換されたＳｅｒを有する７Ｇ６ヒト化バリアント（図１３Ｆ）を用いた、ＥＬＩＳＡによるタウ結合を図解している。

【図13E】７Ｇ６ ＬＣｚｕ１ヒト化バリアント（図１３Ａ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ２ヒト化バリアント（図１３Ｂ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ３ヒト化バリアント（図１３Ｃ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ４ヒト化バリアント（図１３Ｄ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ５ヒト化バリアント（図１３Ｅ）、並びに軽鎖におけるＣｙｓ４９（Ｋａｂａｔに従った）及び重鎖におけるＣｙｓ５７（Ｋａｂａｔに従った）の代わりに置換されたＳｅｒを有する７Ｇ６ヒト化バリアント（図１３Ｆ）を用いた、ＥＬＩＳＡによるタウ結合を図解している。

【図13F】７Ｇ６ ＬＣｚｕ１ヒト化バリアント（図１３Ａ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ２ヒト化バリアント（図１３Ｂ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ３ヒト化バリアント（図１３Ｃ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ４ヒト化バリアント（図１３Ｄ）、７Ｇ６ ＬＣｚｕ５ヒト化バリアント（図１３Ｅ）、並びに軽鎖におけるＣｙｓ４９（Ｋａｂａｔに従った）及び重鎖におけるＣｙｓ５７（Ｋａｂａｔに従った）の代わりに置換されたＳｅｒを有する７Ｇ６ヒト化バリアント（図１３Ｆ）を用いた、ＥＬＩＳＡによるタウ結合を図解している。

【図14】直接ＥＬＩＳＡによって分析されたヒト化７Ｇ６ Ｖｈ１／Ｖｋ２バリアントによるタウ結合の結果を図解している。サンプルを、２Ｎ４Ｒタウをコーティングした９６ウェルプレートにおいて室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いでＨＲＰコンジュゲート抗マウス又は抗ヒト抗体をウェルに添加した。各ウェルにおけるＨＲＰ活性の量をクォンタブル（ＱｕａｎｔａＢｌｕ）（商標）蛍光基質によって測定し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）をスペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）Ｍ５プレートリーダーによって検出した。ｍＡｂの大多数は、直接ＥＬＩＳＡアッセイにおいてタウ結合の差をほとんど示さなかった。注目すべき例外は、最も高い濃度でさえ結合を呈しなかった７Ｇ６−ＬＣｚｕ９であった。加えて、７Ｇ６−ＬＣｚｕ２２は結合の低下を示し；Ａｒｇ４６と組み合わせたＶκ Ｔｙｒ３６は、抗原結合部位の妨害をもたらした。

【図15】Ｖｈ１及びＶκ２ヒト化７Ｇ６バリアントに対する重鎖及び軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。２マイクログラムの各ｍＡｂを、還元剤の非存在下で４×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファーと混合し、ＭＯＰＳバッファー中にて４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲルをインスタントブルー（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ）（商標）で染色し、水で脱染した。ＨＣ−ＨＣ−ＬＣ三量体（ＨＨＬ）、ＨＣ−ＨＣ二量体（ＨＨ）、及び遊離ＬＣ（Ｌ）が矢印によって示されている。マーカーの分子量はｋＤａ単位で示されている。

【図16】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／における、ヒト生殖系列データベースとのｍｓ７Ｇ６（「７Ｇ６」）抗体のＢＬＡＳＴアライメントを図解している。Ｖｈ及びＶｋドメインは、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ番号付けシステムによって注釈を付されている。図１６は、登場の順に、それぞれ配列番号１１７５〜１１７８、１１７７、１１７９、１１８０〜１１８３、１１８２、及び１１８４を開示している。

【図17】ｍｓ７Ｇ６及びヒト化７Ｇ６ Ｖｈ３／Ｖｋ１バリアントのアライメントを図解している。Ｖｈ及びＶＫドメインは、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ番号付けシステムによって注釈を付されている。マウス及びヒト化７Ｇ６バリアントを並べた。Ｖｈ及びＶＫドメインは、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ番号付けシステムによって注釈を付されている。変異に下線が引かれている。図１７は、登場の順に、それぞれ配列番号１１８５〜１２０７を開示している。

【図18】ｍｓ７Ｇ６、並びにヒト化７Ｇ６Ｖｈ３／Ｖκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１１（「ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１１」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１１（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１１」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）によるタウの直接結合を実証している。サンプルを、２Ｎ４Ｒ野生型組み換えタウタンパク質をコーティングした９６ウェルプレートにおいて室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス又は抗ヒト抗体をウェルに添加した。各ウェルにおけるＨＲＰ活性の量をクォンタブル（商標）蛍光基質によって測定し、ＲＦＵをスペクトラマックスＭ５プレートリーダーによって検出した。

【図19A】ｍｓ７Ｇ６、非タウ結合ＩｇＧ１対照Ａｂ ｍＡｂ２、及びヒト化７Ｇ６ Ｖｈ３／Ｖκ１バリアントによるタウの直接結合を実証している。図１９Ａは、ｍｓ７Ｇ６、非タウ結合ＩｇＧ１対照Ａｂ ｍＡｂ２、並びにヒト化７Ｇ６ Ｖｈ３／Ｖκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１５−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１５−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１９−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１９−ＬＣｚｕ１２」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２０−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ２０−ＬＣｚｕ１２」）によるタウの直接結合を実証している。図１９Ｂは、ｍｓ７Ｇ６、非タウ結合ＩｇＧ１対照Ａｂ ｍＡｂ２、並びにヒト化７Ｇ６ Ｖｈ３／Ｖκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７」）によるタウの直接結合を実証している。サンプルを、２Ｎ４Ｒ野生型組み換えタウタンパク質をコーティングした９６ウェルプレートにおいて室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス又は抗ヒト検出抗体をウェルに添加した。各ウェルにおけるＨＲＰ活性の量をクォンタブル（商標）蛍光基質によって測定し、ＲＦＵをスペクトラマックスＭ５プレートリーダーによって検出した。

【図19B】ｍｓ７Ｇ６、非タウ結合ＩｇＧ１対照Ａｂ ｍＡｂ２、及びヒト化７Ｇ６ Ｖｈ３／Ｖκ１バリアントによるタウの直接結合を実証している。図１９Ａは、ｍｓ７Ｇ６、非タウ結合ＩｇＧ１対照Ａｂ ｍＡｂ２、並びにヒト化７Ｇ６ Ｖｈ３／Ｖκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１５−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１５−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１９−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１９−ＬＣｚｕ１２」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２０−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ２０−ＬＣｚｕ１２」）によるタウの直接結合を実証している。図１９Ｂは、ｍｓ７Ｇ６、非タウ結合ＩｇＧ１対照Ａｂ ｍＡｂ２、並びにヒト化７Ｇ６ Ｖｈ３／Ｖκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７」）によるタウの直接結合を実証している。サンプルを、２Ｎ４Ｒ野生型組み換えタウタンパク質をコーティングした９６ウェルプレートにおいて室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス又は抗ヒト検出抗体をウェルに添加した。各ウェルにおけるＨＲＰ活性の量をクォンタブル（商標）蛍光基質によって測定し、ＲＦＵをスペクトラマックスＭ５プレートリーダーによって検出した。

【図20A】７Ｇ６抗体のＶｈ３及びＶκ１バリアントに対する重鎖／軽鎖安定性についての非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。図２０Ａは、Ｖｈ３及びＶκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１１（「ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１１」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１１（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１１」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）に対する重鎖／軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。図２０Ｂは、Ｖｈ３及びＶκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２」）に対する重鎖／軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。図２０Ｃは、Ｖｈ３及びＶκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１９（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１９」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７」）に対する重鎖／軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。２マイクログラムの各ｍＡｂを、還元剤の非存在下で４×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファーと混合し、ＭＯＰＳバッファー中にて４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲルをインスタントブルー（商標）で染色し、水で脱染した。ＨＣ−ＬＣ二量体（ＨＬ）及び遊離ＨＣが矢印によって示されている。分子量マーカーはｋＤａ単位で示されている。

【図20B】７Ｇ６抗体のＶｈ３及びＶκ１バリアントに対する重鎖／軽鎖安定性についての非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。図２０Ａは、Ｖｈ３及びＶκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１１（「ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１１」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１１（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１１」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）に対する重鎖／軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。図２０Ｂは、Ｖｈ３及びＶκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２」）に対する重鎖／軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。図２０Ｃは、Ｖｈ３及びＶκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１９（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１９」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７」）に対する重鎖／軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。２マイクログラムの各ｍＡｂを、還元剤の非存在下で４×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファーと混合し、ＭＯＰＳバッファー中にて４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲルをインスタントブルー（商標）で染色し、水で脱染した。ＨＣ−ＬＣ二量体（ＨＬ）及び遊離ＨＣが矢印によって示されている。分子量マーカーはｋＤａ単位で示されている。

【図20C】７Ｇ６抗体のＶｈ３及びＶκ１バリアントに対する重鎖／軽鎖安定性についての非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。図２０Ａは、Ｖｈ３及びＶκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１１（「ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１１」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１１−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１１（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１１」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）に対する重鎖／軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。図２０Ｂは、Ｖｈ３及びＶκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１３−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１４−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１６−ＬＣｚｕ１２」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１７−ＬＣｚｕ１２」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２（「ＨＣｚｕ１８−ＬＣｚｕ１２」）に対する重鎖／軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。図２０Ｃは、Ｖｈ３及びＶκ１バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１９（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１９」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１３」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１４」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１５」）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１６」）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７（「ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１７」）に対する重鎖／軽鎖安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図解している。２マイクログラムの各ｍＡｂを、還元剤の非存在下で４×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファーと混合し、ＭＯＰＳバッファー中にて４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲルをインスタントブルー（商標）で染色し、水で脱染した。ＨＣ−ＬＣ二量体（ＨＬ）及び遊離ＨＣが矢印によって示されている。分子量マーカーはｋＤａ単位で示されている。

【図21A】溶液中での抗体７Ｇ６ヒト化バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２１Ａ）及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２１Ｂ）の均質性を評価するＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を図解している。５マイクログラムのｍＡｂ ７Ｇ６ヒト化バリアントを、アドバンスバイオ（ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ）ＳＥＣ ３００Ａ ２．７ｕｍ ４．６×５０ガードカラム及びアドバンスバイオＳＥＣ ３００Ａ ２．７ｕｍ ４．６×３００ｍｍカラムを有するＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙにインジェクトした。サンプルを、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５中にて０．３５ｍＬ／分の流速で分析し、２８０ｎｍにおける吸光度を分析した。ｍＡｂ ７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６又は７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８に関する代表的なデータが示されている。

【図21B】溶液中での抗体７Ｇ６ヒト化バリアントの７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２１Ａ）及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２１Ｂ）の均質性を評価するＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を図解している。５マイクログラムのｍＡｂ ７Ｇ６ヒト化バリアントを、アドバンスバイオ（ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ）ＳＥＣ ３００Ａ ２．７ｕｍ ４．６×５０ガードカラム及びアドバンスバイオＳＥＣ ３００Ａ ２．７ｕｍ ４．６×３００ｍｍカラムを有するＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙにインジェクトした。サンプルを、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５中にて０．３５ｍＬ／分の流速で分析し、２８０ｎｍにおける吸光度を分析した。ｍＡｂ ７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６又は７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８に関する代表的なデータが示されている。

【図22A】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22B】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22C】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22D】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22E】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22F】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22G】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22H】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22I】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22J】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22K】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図22L】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントの熱融解曲線を図解している。図２２Ａ〜Ｌは、ｍＡｂ１（図２２Ａ）、ｍＡｂ２（図２２Ｂ）、キメラ（「ｘｉ」）７Ｇ６（「ｘｉ７Ｇ６」）（図２２Ｃ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｄ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１（図２２Ｅ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｆ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｇ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５（図２２Ｈ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｉ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｊ）、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（図２２Ｋ）、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２２Ｌ）に関する熱融解曲線を示している。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５〜１００℃に及ぶ熱分析に供した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）_２のプロファイルは、非タウ結合ＩｇＧ１対照ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった。

【図23A】ヒト化抗体７Ｇ６重鎖における推定ホットスポット（図２３Ａにおける配列番号８０〜９４；図２３Ｂにおける配列番号９５〜１１１）を提供する、免疫反応性Ｔ細胞エピトープ分析の結果を示している。表におけるペプチドは、ヒト生殖系列配列と５％の同一性又はそれ未満の同一性を有するとして同定された。可変ドメイン生殖系列配列に対するペプチドの相同性パーセントも考慮に入れた。可変領域生殖系列配列と約５％若しくはそれ未満の相同性を有する、及び／又は３つ若しくはそれを上回る数のＨＬＡアレルに結合すると予測されるペプチドを、より高いリスクとして同定した（灰色で強調されている）。

【図23B】ヒト化抗体７Ｇ６重鎖における推定ホットスポット（図２３Ａにおける配列番号８０〜９４；図２３Ｂにおける配列番号９５〜１１１）を提供する、免疫反応性Ｔ細胞エピトープ分析の結果を示している。表におけるペプチドは、ヒト生殖系列配列と５％の同一性又はそれ未満の同一性を有するとして同定された。可変ドメイン生殖系列配列に対するペプチドの相同性パーセントも考慮に入れた。可変領域生殖系列配列と約５％若しくはそれ未満の相同性を有する、及び／又は３つ若しくはそれを上回る数のＨＬＡアレルに結合すると予測されるペプチドを、より高いリスクとして同定した（灰色で強調されている）。

【図24A】ヒト化抗体７Ｇ６軽鎖における推定ホットスポット（図２４Ａにおける配列番号１１２〜１３０；図２４Ｂにおける配列番号１３１〜１５０；図２４Ｃにおける配列番号１５１〜１６５；及び図２４Ｄにおける配列番号１６６〜１８０）を提供する、免疫反応性Ｔ細胞エピトープ分析の結果を示している。表におけるペプチドは、ヒト生殖系列配列と５％の同一性又はそれ未満の同一性を有するとして同定された。可変ドメイン生殖系列配列に対するペプチドの相同性パーセントも考慮に入れた。可変領域生殖系列配列と約５％若しくはそれ未満の相同性を有する、及び／又は３つ若しくはそれを上回る数のＨＬＡアレルに結合すると予測されるペプチドを、より高いリスクとして同定した（灰色で強調されている）。

【図24B】ヒト化抗体７Ｇ６軽鎖における推定ホットスポット（図２４Ａにおける配列番号１１２〜１３０；図２４Ｂにおける配列番号１３１〜１５０；図２４Ｃにおける配列番号１５１〜１６５；及び図２４Ｄにおける配列番号１６６〜１８０）を提供する、免疫反応性Ｔ細胞エピトープ分析の結果を示している。表におけるペプチドは、ヒト生殖系列配列と５％の同一性又はそれ未満の同一性を有するとして同定された。可変ドメイン生殖系列配列に対するペプチドの相同性パーセントも考慮に入れた。可変領域生殖系列配列と約５％若しくはそれ未満の相同性を有する、及び／又は３つ若しくはそれを上回る数のＨＬＡアレルに結合すると予測されるペプチドを、より高いリスクとして同定した（灰色で強調されている）。

【図24C】ヒト化抗体７Ｇ６軽鎖における推定ホットスポット（図２４Ａにおける配列番号１１２〜１３０；図２４Ｂにおける配列番号１３１〜１５０；図２４Ｃにおける配列番号１５１〜１６５；及び図２４Ｄにおける配列番号１６６〜１８０）を提供する、免疫反応性Ｔ細胞エピトープ分析の結果を示している。表におけるペプチドは、ヒト生殖系列配列と５％の同一性又はそれ未満の同一性を有するとして同定された。可変ドメイン生殖系列配列に対するペプチドの相同性パーセントも考慮に入れた。可変領域生殖系列配列と約５％若しくはそれ未満の相同性を有する、及び／又は３つ若しくはそれを上回る数のＨＬＡアレルに結合すると予測されるペプチドを、より高いリスクとして同定した（灰色で強調されている）。

【図24D】ヒト化抗体７Ｇ６軽鎖における推定ホットスポット（図２４Ａにおける配列番号１１２〜１３０；図２４Ｂにおける配列番号１３１〜１５０；図２４Ｃにおける配列番号１５１〜１６５；及び図２４Ｄにおける配列番号１６６〜１８０）を提供する、免疫反応性Ｔ細胞エピトープ分析の結果を示している。表におけるペプチドは、ヒト生殖系列配列と５％の同一性又はそれ未満の同一性を有するとして同定された。可変ドメイン生殖系列配列に対するペプチドの相同性パーセントも考慮に入れた。可変領域生殖系列配列と約５％若しくはそれ未満の相同性を有する、及び／又は３つ若しくはそれを上回る数のＨＬＡアレルに結合すると予測されるペプチドを、より高いリスクとして同定した（灰色で強調されている）。

【図25】７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体を用いた、ＡＤ、ＰＳＰ、及びＰｉＤ組織サンプルの免疫組織化学染色の画像を示している。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体は、ヒト死後疾患脳における病的タウ（各画像において黒い矢印によって描かれている）を強く且つ特異的に認識する。

【図26A】それぞれ、ヒト化抗体７Ｇ６−ＨＣｚｕ８／ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５／ＬＣｚｕ１８に関する精細エピトープマッピングの結果を示している。チップの蛍光画像及び結果として生じた強度プロットは、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２６Ａ）及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５／ＬＣｚｕ１８（図２６Ｂ）抗体が両方とも、全長タウタンパク質の２つの主要な部位に結合することを示している。図２６Ａは、登場の順に、それぞれ配列番号１〜３７を開示している。図２６Ｂは、登場の順に、それぞれ配列番号１〜３７を開示している。

【図26B】それぞれ、ヒト化抗体７Ｇ６−ＨＣｚｕ８／ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５／ＬＣｚｕ１８に関する精細エピトープマッピングの結果を示している。チップの蛍光画像及び結果として生じた強度プロットは、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２６Ａ）及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５／ＬＣｚｕ１８（図２６Ｂ）抗体が両方とも、全長タウタンパク質の２つの主要な部位に結合することを示している。図２６Ａは、登場の順に、それぞれ配列番号１〜３７を開示している。図２６Ｂは、登場の順に、それぞれ配列番号１〜３７を開示している。

【図27】７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の存在及び非存在における、野生型２Ｎ４Ｒタウタンパク質に対するヘパリン誘導性凝集の程度及び速度を図解している。組み換え野生型２Ｎ４Ｒタウを、実施例１５に記載される条件下で凝集するように誘導した。反応は、抗体なし（バッファーのみ；白い三角）、ヒトＩｇＧ１対照抗体（黒い菱形）、又は７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（白い丸）のいずれかを含有した。ヘパリン添加の直後（０日目）、次いでその後１、２、５、及び６日目に、チオフラビン（ＴｈＳ）蛍光を測定した。データは、４つの独立した実験からの平均±ＳＤとして表されている。各時点に対して、統計分析（ＩｇＧ対照と７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体とを比較する多重ｔ検定）を実施した（ｐ≦０．０１^＊＊；ｐ≦０．００１^＊＊＊）。図２７は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体が、インビトロでタウ凝集を有効に阻害することを示している。３７℃でのインキュベーション後１、２、５、及び６日目に関してＩｇＧ対照と７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体とを比較した場合、効果は統計的に有意であった。ヘパリン添加後、反応を始動したすぐ後の０日目に、有意性は観察されなかった。

【図28】７Ｇ６抗体又は７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の存在及び非存在における、野生型２Ｎ４Ｒタウタンパク質に対するヘパリン誘導性凝集の程度及び速度を図解している。組み換え野生型２Ｎ４Ｒタウを、材料及び方法に記載される条件下で凝集するように誘導した。反応は、抗体なし（バッファーのみ；白い三角）；ヒトＩｇＧ１対照抗体（黒い菱形）；７Ｇ６抗体（黒い四角）；又は７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（白い丸）のいずれかを含有した。ヘパリン添加の直後（０日目）、次いでその後１、２、５、及び６日目に、チオフラビン（ＴｈＳ）蛍光を測定した。図２８は、７Ｇ６抗体及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の両方を、実施例５に提供されるアッセイ条件に従って試験した場合、両抗体ともインビトロでタウ凝集を有効に阻害したことを示している。７Ｇ６と７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体との間で同じ効果の大きさが見られた。

【図29】７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体によるサンプルの免疫枯渇後の、Ｋ１８フィブリルの細胞に基づくシーディングアッセイにおける、正規化されたＴｈＳ陽性率を示している。１．５及び１５μｇ／ｍｌの７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体は、Ｋ１８フィブリルのシーディング効果を除去した（ヒトＩｇＧ１カッパ対照に対して、＞７０％の低下）。

【図30A】ヒトＰ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける、海馬内タウシード注射によって誘導された脳サルコシル不溶性タウに対する７Ｇ６抗体の効果を図解している。タウシード又はシードなし（１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を、左海馬に定位注射した。４０ｍｇ／ｋｇの７Ｇ６又は対照ＩｇＧを、３週間週１回腹腔内投与した。対照ＩｇＧ＝マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体、７Ｇ６＝抗ヒトタウマウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体。データは、平均±ＳＥＭを表している（シードなしに関してはｎ＝６、対照ＩｇＧ、７Ｇ６に関してはｎ＝１１）。対照ＩｇＧに対して、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、^＊Ｐ＜０．０５（１元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くフィッシャーのＬＳＤ検定によって分析された）。４０ｍｇ／ｋｇでの３週間週１回の７Ｇ６の腹腔内投与は、Ｐ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける海馬内タウシード注射によって誘導された対側海馬におけるサルコシル不溶性タウの増加の有意な抑制をもたらした。

【図30B】ヒトＰ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける、海馬内タウシード注射によって誘導された脳サルコシル不溶性タウに対する７Ｇ６抗体の効果を図解している。タウシード又はシードなし（１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を、左海馬に定位注射した。４０ｍｇ／ｋｇの７Ｇ６又は対照ＩｇＧを、３週間週１回腹腔内投与した。対照ＩｇＧ＝マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体、７Ｇ６＝抗ヒトタウマウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体。データは、平均±ＳＥＭを表している（シードなしに関してはｎ＝６、対照ＩｇＧ、７Ｇ６に関してはｎ＝１１）。対照ＩｇＧに対して、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、^＊Ｐ＜０．０５（１元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くフィッシャーのＬＳＤ検定によって分析された）。４０ｍｇ／ｋｇでの３週間週１回の７Ｇ６の腹腔内投与は、Ｐ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける海馬内タウシード注射によって誘導された対側海馬におけるサルコシル不溶性タウの増加の有意な抑制をもたらした。

【図30C】ヒトＰ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける、海馬内タウシード注射によって誘導された脳サルコシル不溶性タウに対する７Ｇ６抗体の効果を図解している。タウシード又はシードなし（１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を、左海馬に定位注射した。４０ｍｇ／ｋｇの７Ｇ６又は対照ＩｇＧを、３週間週１回腹腔内投与した。対照ＩｇＧ＝マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体、７Ｇ６＝抗ヒトタウマウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体。データは、平均±ＳＥＭを表している（シードなしに関してはｎ＝６、対照ＩｇＧ、７Ｇ６に関してはｎ＝１１）。対照ＩｇＧに対して、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、^＊Ｐ＜０．０５（１元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くフィッシャーのＬＳＤ検定によって分析された）。４０ｍｇ／ｋｇでの３週間週１回の７Ｇ６の腹腔内投与は、Ｐ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける海馬内タウシード注射によって誘導された対側海馬におけるサルコシル不溶性タウの増加の有意な抑制をもたらした。

【図30D】ヒトＰ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける、海馬内タウシード注射によって誘導された脳サルコシル不溶性タウに対する７Ｇ６抗体の効果を図解している。タウシード又はシードなし（１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を、左海馬に定位注射した。４０ｍｇ／ｋｇの７Ｇ６又は対照ＩｇＧを、３週間週１回腹腔内投与した。対照ＩｇＧ＝マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体、７Ｇ６＝抗ヒトタウマウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体。データは、平均±ＳＥＭを表している（シードなしに関してはｎ＝６、対照ＩｇＧ、７Ｇ６に関してはｎ＝１１）。対照ＩｇＧに対して、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、^＊Ｐ＜０．０５（１元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くフィッシャーのＬＳＤ検定によって分析された）。４０ｍｇ／ｋｇでの３週間週１回の７Ｇ６の腹腔内投与は、Ｐ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける海馬内タウシード注射によって誘導された対側海馬におけるサルコシル不溶性タウの増加の有意な抑制をもたらした。

【図31A】７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体で処理されたカニクイザル由来の脳脊髄液におけるＭＴＢＲ−タウを示している。図３１Ａは、結合したＭＴＢＲ−タウを示している。図３１Ｂは、遊離ＭＴＢＲ−タウを示している。平均±ＳＥＭ。雄カニクイザルＮ＝３（ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ）。

【図31B】７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体で処理されたカニクイザル由来の脳脊髄液におけるＭＴＢＲ−タウを示している。図３１Ａは、結合したＭＴＢＲ−タウを示している。図３１Ｂは、遊離ＭＴＢＲ−タウを示している。平均±ＳＥＭ。雄カニクイザルＮ＝３（ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ）。

【図32】７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（１０、１００、５００、１０００、及び２０００ｎｇ／ｍＬ）でスパイクされたヒト脳脊髄液における結合したＭＴＢＲ−タウを示している。

【図33A】ＣＤ３２Ａを過剰発現するＣＨＯ細胞における、それぞれタウ単量体又はフィブリルの取り込みの効力を示している。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（３μｇ／ｍＬ）は、ヒトＩｇＧ１対照（３μｇ／ｍＬ）と比較して、タウ単量体取り込みを有意に増加させた（図３３Ａ）。同じように、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（０．３及び３μｇ／ｍＬ）は、ヒトＩｇＧ１対照（３μｇ／ｍＬ）と比較して、タウフィブリル取り込みも有意に増加させた（図３３Ｂ）。両方の場合において、ＦｃＲ阻害剤処理は、この細胞アッセイシステムにおいて、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体により誘導されたタウ取り込みを有意に遮断した。

【図33B】ＣＤ３２Ａを過剰発現するＣＨＯ細胞における、それぞれタウ単量体又はフィブリルの取り込みの効力を示している。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（３μｇ／ｍＬ）は、ヒトＩｇＧ１対照（３μｇ／ｍＬ）と比較して、タウ単量体取り込みを有意に増加させた（図３３Ａ）。同じように、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（０．３及び３μｇ／ｍＬ）は、ヒトＩｇＧ１対照（３μｇ／ｍＬ）と比較して、タウフィブリル取り込みも有意に増加させた（図３３Ｂ）。両方の場合において、ＦｃＲ阻害剤処理は、この細胞アッセイシステムにおいて、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体により誘導されたタウ取り込みを有意に遮断した。

【発明を実施するための形態】

【0016】

[0050]以下の説明は、タウに特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを特徴付ける。これらの抗体及び抗原結合フラグメントをコードし得る関連ポリヌクレオチド、抗体及び抗原結合フラグメントを発現する細胞、並びに関連するベクターも記載される。加えて、抗体及び抗原結合フラグメントを用いる方法が記載される。例えば、提供される抗体及び抗原結合フラグメントを用いて、対象におけるタウオパチーを治療することができる。

【0017】

[0051]説明の態様に関係する様々な用語が、本明細書及び特許請求の範囲を通じて用いられる。そのような用語は、別様に示されていない限り、当技術分野におけるそれら用語の通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に定義される用語は、本明細書において提供される定義と矛盾しない形で解釈されるべきである。

【0018】

[0052]本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上別様にはっきりと述べられていない限り、複数の指示対象を含む。故に、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、２個又はそれを上回る数の細胞等の組み合わせを含む。

【0019】

[0053]本明細書において用いられる「約」という用語は、量、時間的期間などの測定可能な値に言及する場合、指定された値から最高で±１０％の変動を包含することを意図され、そのようなものとして、変動は開示される方法を実施するのに適当である。別様に示されていない限り、本明細書及び特許請求の範囲において用いられる、成分の分量を表現する、分子量、反応条件などの特性を表現するすべての数は、いかなる場合も、「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。従って、それとは反対に示されていない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数的パラメーターは、本発明によって獲得されようとする所望の特性に応じて様々に異なることがある近似値である。少なくとも、特許請求の範囲への均等論（ｄｏｃｔｒｉｎｅ ｏｆ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）の適用を限定しようとする試みとしてではなく、各数的パラメーターは、報告される有効数字の数に照らし及び通常の丸め技法を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。

【0020】

[0054]広範にわたる本発明を記載する数的な値域及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、具体的な例に記載の数的な値は、できるだけ正確に報告される。しかしながら、任意の数的な値は、それらの値それぞれの試験測定結果に見出される標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含有する。

【0021】

[0055]「単離された」とは、生物学的構成要素（核酸、ペプチド、又はタンパク質など）が、構成要素が天然に存在する生物の他の生物学的構成要素、すなわち他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質から実質的に分離されている、それらから離れて産生されている、又はそれらから離れて精製されていることを意味する。故に、「単離され」ている核酸、ペプチド、及びタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は組成物の一部であり得、そのような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の天然環境の一部ではない場合、さらに単離され得る。当該用語は、宿主細胞における組み換え発現によって調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も内包する。

【0022】

[0056]「核酸分子」又は「核酸」と同義的に称される「ポリヌクレオチド」とは、修飾されていないＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、限定されることなく、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。「ポリヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」としばしば称される比較的短い核酸鎖も内包する。

【0023】

[0057]「実質的に同じ」の意味は、当該用語が用いられる文脈に応じて異なり得る。重鎖及び軽鎖、並びに重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子の間に存在する可能性がある天然の配列変動が理由で、本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントのアミノ酸配列又はそれをコードする遺伝子内に、抗体又は抗原結合フラグメントの固有の結合特性（例えば、特異性及び親和性）に対してほとんど又は全く影響なく、あるレベルの変動を見出すことが期待されるであろう。そのような期待は、遺伝子コードの縮重に、並びにコードタンパク質の性質を感知できるほどには変更しない保存的アミノ酸配列変動の進化的成功に一部には起因する。従って、核酸配列の文脈において、「実質的に同じ」とは、２つ又はそれを上回る数の配列間での少なくとも６５％の同一性を意味する。好ましくは、当該用語は、２つ又はそれを上回る数の配列間での少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９１％の同一性、より好ましくは少なくとも９２％の同一性、より好ましくは少なくとも９３％の同一性、より好ましくは少なくとも９４％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９６％の同一性、より好ましくは少なくとも９７％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％の同一性、及びより好ましくは少なくとも９９％又はそれを上回る割合の同一性を指す。そのような同一性を、ｎＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４〜８；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜７）を用いて決定することができる。

【0024】

[0058]タンパク質機能に対して実質的な効果を有することなくタンパク質のアミノ酸配列内に生じることがある変動の程度は、同じ縮重原理はアミノ酸配列には適用されないことから、核酸配列のものよりもはるかに低い。従って、抗体又は抗原結合フラグメントの文脈において、「実質的に同じ」とは、配列が「実体のない差」を有することを意味する。実体のない差とは、抗体又は抗体フラグメントアミノ酸配列における１、２、３、４、５、又は６個のアミノ酸の置換である。本明細書において開示される配列と実質的に同じアミノ酸配列も、本出願の一部である。一部の実施形態において、配列同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを上回る割合であり得る。他の実施形態は、フレームワーク、足場、或いは本明細書において記載される抗体及び抗原結合フラグメントと有意な同一性を共有しないが、１つ若しくは複数のＣＤＲ、又は本明細書において記載されるそのような配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である、結合を付与するのに必要とされる他の配列を組み入れている他の非結合領域を有する、タウ特異的抗体又は抗原結合フラグメントを含む。

【0025】

[0059]「ベクター」とは、別の核酸セグメントを、セグメントの複製又は発現を引き起こすように作動的に挿入することができるプラスミド、ファージ、コスミド、又はウイルスなどのレプリコンである。

【0026】

[0060]「発現する」及び「産生する」という用語は、本明細書において同義的に用いられ、遺伝子産物の生合成を指す。これらの用語は、ＲＮＡへの遺伝子の転写を包含する。これらの用語は、１つ又は複数のポリペプチドへのＲＮＡの翻訳も包含し、すべての天然に生じる転写後及び翻訳後修飾をさらに包含する。抗体又はその抗原結合フラグメントの発現又は産生は、細胞の細胞質内でのものであってもよく又は細胞培養の成長培地などの細胞外環境へのものであってもよい。

【0027】

[0061]「治療すること」又は「治療」という用語は、症状の軽減、緩和、縮小、若しくは病状を患者にとってより忍容できる状態にすること、変性若しくは衰退の速度の鈍化、変性の最終地点をより衰弱度の低い状態にすること、対象の身体的若しくは精神的な幸福を向上させること、又は生存期間の長さを引き延ばすことなどの任意の客観的又は主観的パラメーターを含めた、損傷、病変、又は病状の減衰又は改善における任意の成功又は成功の兆しを指す。身体検査、神経学的検査、又は精神医学的評価の結果を含めた客観的又は主観的パラメーターによって、治療を評価することができる。特定の実施形態において、タウオパチーの症状は認知の障害である。具体的な実施形態において、タウオパチーの症状は学習及び／又は記憶の障害である。具体的な実施形態において、タウオパチーの症状は長期記憶の喪失である。具体的な実施形態において、タウオパチーの症状は認知症である。一部の実施形態において、タウオパチーの症状は、精神錯乱、興奮性、攻撃性、気分変動、又は言語障害である。一部の実施形態において、タウオパチーの症状は、推論、状況判断、記憶容量、及び／又は学習など、１つ又は複数の認知機能の障害又は喪失である。

【0028】

[0062]本明細書において用いられる「抗体」という用語は、広義で意図され、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合性、ヒト化、及びキメラのモノクローナル抗体及び抗体フラグメントを含めたモノクローナル抗体を含めた、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。一般的に、抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を呈するタンパク質又はペプチド鎖である。無傷抗体とは、２本の同一の軽鎖及び２本の同一の重鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的に、各軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結されており、一方でジスルフィド連結の数は、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で様々に異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（可変領域）（ＶＨ）、それに続くいくつかの定常ドメイン（定常領域）を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）及びそのもう一方の末端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖は、それら軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２つのはっきりと区別できるタイプ、すなわちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り振られ得る。

【0029】

[0063]免疫グロブリンは、その重鎖によって所有される定常ドメインのタイプに応じて、５つの主要なクラス又はアイソタイプ、すなわち、重鎖定常ドメインアミノ酸配列に応じたＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り振られ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４としてさらに下位分類される。免疫グロブリンの種々のクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0030】

[0064]免疫グロブリン軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、３つの「抗原結合部位」によって分断された「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、以下のように様々な用語を用いて定義される：（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）という用語は、配列変動性に基づく（Ｗｕ及びＫａｂａｔ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０、１９７０）。一般的に、抗原結合部位は、６つのＣＤＲ；ＶＨにおける３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、及びＶＬにおける３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を有する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５編、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１）。Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７、２００３）によって提唱される「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」は、免疫グロブリン由来のＶドメイン及びＴ細胞受容体の比較に基づく。国際免疫遺伝情報システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、これらＣＤＲ領域の標準化された番号付け及び定義を提供する。ＣＤＲとＩＭＧＴ描写との間の対応は、Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７、２００３に記載されている。

【0031】

[0065]抗原結合フラグメントは、特定の抗原に対して結合親和性を呈することができる任意のタンパク質性構造である。一部の抗原結合フラグメントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持する、無傷抗体の一部から構成される。例えば、抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合することが公知の抗体の少なくとも１つの可変領域（重鎖又は軽鎖可変領域のいずれか）又は１つ若しくは複数のＣＤＲを含んでもよい。適切な抗原結合フラグメントの例には、限定されることなく、ダイアボディ及び一本鎖分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖又はＣＤＲと他のタンパク質との間のキメラ融合体、タンパク質足場、重鎖単量体又は二量体、軽鎖単量体又は二量体、１本の重鎖及び１本の軽鎖からなる二量体等が含まれる。抗原結合フラグメントを産生するために、すべての抗体アイソタイプを用いることができる。加えて、抗原結合フラグメントは、関心対象の所与の抗原に対する親和性を付与する配向にポリペプチドセグメントを上手く組み入れることができる、タンパク質足場など、非抗体タンパク質性フレームワークを含んでもよい。抗原結合フラグメントは、組み換えで産生されてもよく、又は無傷抗体の酵素的若しくは化学的切断によって産生されてもよい。「抗体又はその抗原結合フラグメント」という語句を用いて、所与の抗原結合フラグメントが、当該語句において言及される抗体の１つ又は複数のアミノ酸セグメントを組み入れていることを表すことができる。

【0032】

[0066]「特異的結合」又は「特異的に結合する」とは、他の抗原に対してよりも大きな親和性を有する、抗原への抗体又は抗原結合フラグメントの結合を指す。典型的に、抗体又は抗原結合フラグメントは、約５×１０^−８Ｍ若しくはそれ未満、例えば約５×１０^−９Ｍ若しくはそれ未満、約１×１０^−９Ｍ若しくはそれ未満、約１×１０^−１０Ｍ若しくはそれ未満、又は約１×１０^−１１Ｍ若しくはそれ未満の平衡解離定数Ｋ_Ｄで抗原に結合する。

【0033】

[0067]「二重エピトープ性」とは、抗体又は抗体フラグメントの文脈において用いられる場合、抗体又はフラグメントが、必ずしも同時にではないものの、同じ標的抗原分子の２つの重複しないエピトープに特異的に結合する能力を指す。

【0034】

[0068]「対象」という用語は、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類など、すべての脊椎動物、例えば哺乳類及び非哺乳類を含めた、ヒト及び非ヒト動物を指す。記載される方法についての多くの実施形態において、対象はヒトである。

【0035】

[0069]本明細書において記載される実施形態は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物学的システムに限定されるわけではなく、方法、試薬、化合物、組成物、又は生物学的システムは当然のことながら様々に異なり得る。

【0036】

[0070]タウ、好ましくはヒトタウに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント（「抗タウ抗体」）が本明細書において記載される。ヒトタウ２Ｎ４Ｒ（タウ４４１とも称される）は、本明細書において配列番号１８１
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYTMHQDQEGDTD AGLKESPLQT
PTEDGSEEPG SETSDAKSTP TAEDVTAPLVDEGAPGKQAA AQPHTEIPEG
TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG HVTQARMVSKSKDGTGSDDK KAKGADGKTK
IATPRGAAPP GQKGQANATR IPAKTPPAPKTPPSSGEPPK SGDRSGYSSP
GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAVVRTPPKSPSSAK SRLQTAPVPM
PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIINKKLDLSNVQSK CGSKDNIKHV
PGGGSVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHHKPGGGQVEVK SEKLDFKDRV
QSKIGSLDNI THVPGGGNKK IETHKLTFRENAKAKTDHGA EIVYKSPVVS
GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV DSPQLATLADEVSASLAKQG L
として記載される。
ヒトタウとは、図１に図解されるもの［２Ｎ４Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−８）；１Ｎ４Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−７）；０Ｎ４Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−６）；２Ｎ３Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−５）；１Ｎ３Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−４）；及び０Ｎ３Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−２）］を含めた、タウバリアント、例えば天然に存在するアレルバリアント、又はそれらバリアントと比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する配列も指す。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、マウスＩｇＧ又はその誘導体である。抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト、ヒト化、又はキメラであってもよいが、本明細書において例示される抗体又は抗原結合フラグメントは、マウス及びヒト化抗体である。

【0037】

[0071]本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、タウに特異的に結合する抗体は、好ましくはＩｇＧ１、より好ましくはヒトＩｇＧ１である。実施例の節において開示される、タウに特異的に結合する抗体及び抗原結合フラグメントはマウスに由来する。同様の抗体は、組み換え手段によって任意の種に由来してもよい。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、キメラのラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヒト等であってもよい。ヒトへの投与における使用のために、非ヒト由来抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト患者に投与しても抗原性が低いように遺伝子的に又は構造的に変更されてもよい。

【0038】

[0072]一部の実施形態において、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントはキメラである。本明細書において使用するとき、「キメラ」という用語は、非ヒト哺乳類、齧歯類、又は爬虫類の抗体アミノ酸配列に由来する少なくとも１つの可変ドメインの少なくとも一部分を有し、一方で抗体又はその抗原結合フラグメントの残りの部分はヒトに由来する、抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。例えば、キメラ抗体は、ヒトＦｃ又は他のそのような構造ドメインを有するマウス抗原結合ドメインを含んでもよい。キメラ抗体は、「Ｘｉ」という用語によって表される（ｒｅｎｏｔｅ）。一部の実施形態において、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はフラグメントである。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又は抗体の他の抗原結合部分配列など）であってもよい。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、フレームワーク領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろう。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも一部分を含んでもよい。ヒト化抗体重鎖又は軽鎖は、本明細書において「ｚｕ」という用語によって表される。

【0039】

[0073]本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、多様な形態で存在し得るが、表１に示される抗体可変ドメインセグメント又はＣＤＲのうちの１つ又は複数を含むであろう。

【0040】

【表1】

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【0041】

[0074]一部の実施形態において、抗タウ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１９６に記載の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、並びに配列番号４１１に記載の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態において、抗タウ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２６８に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６５に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗タウ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４０２に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７２に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。

【0042】

[0075]一部の実施形態において、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３８と実質的に同じ又は配列番号７３８と同一の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７４０と実質的に同じ又は配列番号７４０と同一の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７４２と実質的に同じ又は配列番号７４２と同一の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９４と実質的に同じ又は配列番号５９４と同一の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９６と実質的に同じ又は配列番号５９６と同一の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９８と実質的に同じ又は配列番号５９８と同一の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３８と実質的に同じ又は配列番号７３８と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７４０と実質的に同じ又は配列番号７４０と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７４２と実質的に同じ又は配列番号７４２と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９４と実質的に同じ又は配列番号５９４と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９６と実質的に同じ又は配列番号５９６と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９８と実質的に同じ又は配列番号５９８と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３８と実質的に同じ又は配列番号７３８と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７４０と実質的に同じ又は配列番号７４０と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７４２と実質的に同じ又は配列番号７４２と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９４と実質的に同じ又は配列番号５９４と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９６と実質的に同じ又は配列番号５９６と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号５９８と実質的に同じ又は配列番号５９８と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖も有してもよい。

【0043】

[0076]一部の実施形態において、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００８と実質的に同じ又は配列番号１００８と同一の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１０１０と実質的に同じ又は配列番号１０１０と同一の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１０１２と実質的に同じ又は配列番号１０１２と同一の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６４と実質的に同じ又は配列番号８６４と同一の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６６と実質的に同じ又は配列番号８６６と同一の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６８と実質的に同じ又は配列番号８６８と同一の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００８と実質的に同じ又は配列番号１００８と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１０１０と実質的に同じ又は配列番号１０１０と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴによって規定される、配列番号１０１２と実質的に同じ又は配列番号１０１２と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６４と実質的に同じ又は配列番号８６４と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６６と実質的に同じ又は配列番号８６６と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６８と実質的に同じ又は配列番号８６８と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００８と実質的に同じ又は配列番号１００８と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１０１０と実質的に同じ又は配列番号１０１０と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴによって規定される、配列番号１０１２と実質的に同じ又は配列番号１０１２と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６４と実質的に同じ又は配列番号８６４と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６６と実質的に同じ又は配列番号８６６と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴによって規定される、配列番号８６８と実質的に同じ又は配列番号８６８と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖も有してもよい。

【0044】

[0077]一部の実施形態において、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７７４と実質的に同じ又は配列番号７７４と同一の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７７６と実質的に同じ又は配列番号７７６と同一の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７７８と実質的に同じ又は配列番号７７８と同一の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４２と実質的に同じ又は配列番号６４２と同一の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４４と実質的に同じ又は配列番号６４４と同一の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４６と実質的に同じ又は配列番号６４６と同一の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７７４と実質的に同じ又は配列番号７７４と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７７６と実質的に同じ又は配列番号７７６と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７７８と実質的に同じ又は配列番号７７８と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４２と実質的に同じ又は配列番号６４２と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４４と実質的に同じ又は配列番号６４４と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４６と実質的に同じ又は配列番号６４６と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７７４と実質的に同じ又は配列番号７７４と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７７６と実質的に同じ又は配列番号７７６と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７７８と実質的に同じ又は配列番号７７８と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４２と実質的に同じ又は配列番号６４２と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４４と実質的に同じ又は配列番号６４４と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号６４６と実質的に同じ又は配列番号６４６と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖も有してもよい。

【0045】

[0078]一部の実施形態において、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号１０４４と実質的に同じ又は配列番号１０４４と同一の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号１０４６と実質的に同じ又は配列番号１０４６と同一の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号１０４８と実質的に同じ又は配列番号１０４８と同一の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号９１２と実質的に同じ又は配列番号９１２と同一の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号９１４と実質的に同じ又は配列番号９１４と同一の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号９１６と実質的に同じ又は配列番号９１６と同一の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号１０４４と実質的に同じ又は配列番号１０４４と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号１０４６と実質的に同じ又は配列番号１０４６と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号１０４８と実質的に同じ又は配列番号１０４８と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号９１２と実質的に同じ又は配列番号９１２と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号９１４と実質的に同じ又は配列番号９１４と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号９１６と実質的に同じ又は配列番号９１６と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号１０４４と実質的に同じ又は配列番号１０４４と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号１０４６と実質的に同じ又は配列番号１０４６と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号１０４８と実質的に同じ又は配列番号１０４８と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号９１２と実質的に同じ又は配列番号９１２と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号９１４と実質的に同じ又は配列番号９１４と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴの方法に従って規定される、配列番号９１６と実質的に同じ又は配列番号９１６と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖も有してもよい。

【0046】

[0079]一部の実施形態において、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号８４６と実質的に同じ又は配列番号８４６と同一の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号８４８と実質的に同じ又は配列番号８４８と同一の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号８５０と実質的に同じ又は配列番号８５０と同一の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３２と実質的に同じ又は配列番号７３２と同一の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３４と実質的に同じ又は配列番号７３４と同一の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３６と実質的に同じ又は配列番号７３６と同一の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号８４６と実質的に同じ又は配列番号８４６と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号８４８と実質的に同じ又は配列番号８４８と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号８５０と実質的に同じ又は配列番号８５０と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３２と実質的に同じ又は配列番号７３２と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３４と実質的に同じ又は配列番号７３４と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３６と実質的に同じ又は配列番号７３６と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号８４６と実質的に同じ又は配列番号８４６と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号８４８と実質的に同じ又は配列番号８４８と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号８５０と実質的に同じ又は配列番号８５０と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３２と実質的に同じ又は配列番号７３２と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｋａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３４と実質的に同じ又は配列番号７３４と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＫａｂａｔの方法に従って規定される、配列番号７３６と実質的に同じ又は配列番号７３６と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖も有してもよい。

【0047】

[0080]一部の実施形態において、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１１１６と実質的に同じ又は配列番号１１１６と同一の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１１１８と実質的に同じ又は配列番号１１１８と同一の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１１２０と実質的に同じ又は配列番号１１２０と同一の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００２と実質的に同じ又は配列番号１００２と同一の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００４と実質的に同じ又は配列番号１００４と同一の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００６と実質的に同じ又は配列番号１００６と同一の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１１１６と実質的に同じ又は配列番号１１１６と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１１１８と実質的に同じ又は配列番号１１１８と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴによって規定される、配列番号１１２０と実質的に同じ又は配列番号１１２０と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００２と実質的に同じ又は配列番号１００２と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００４と実質的に同じ又は配列番号１００４と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００６と実質的に同じ又は配列番号１００６と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１１１６と実質的に同じ又は配列番号１１１６と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１１１８と実質的に同じ又は配列番号１１１８と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴによって規定される、配列番号１１２０と実質的に同じ又は配列番号１１２０と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００２と実質的に同じ又は配列番号１００２と同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；ＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００４と実質的に同じ又は配列番号１００４と同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩＭＧＴによって規定される、配列番号１００６と実質的に同じ又は配列番号１００６と同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖も有してもよい。

【0048】

[0081]ＣＤＲの抗原結合編成を、ＣＤＲ足場として抗体様タンパク質を用いても操作することができる。そのような操作された抗原結合タンパク質は本開示の範囲内にある。

【0049】

[0082]本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、ある特定の残基を変更して、抗体又は抗原結合フラグメントの結合特徴及び／又はフォールディング特徴を向上させる。例えば、開示されるモノクローナル抗体及び抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４９における残基はシステインではない。開示されるモノクローナル抗体及び抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４９における残基はセリンである。本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置５７における残基はシステインではない。一部の実施形態において、Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置５７における残基はセリンである。本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置３４における残基はグルタミン酸である。本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置３６における残基はフェニルアラニンではない。Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置３６における残基はチロシンであってもよい。本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４６における残基はアルギニンではない。Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４６における残基はロイシンであってもよい。本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置９４における残基はリジンではない。本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントについての一部の実施形態において、Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置７１における残基はアルギニンではない。Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置７１における残基はバリンであってもよい。

【0050】

[0083]タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号４１１と実質的に同じ又は配列番号４１１と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号４１１と実質的に同じ又は配列番号４１１と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号４１０と実質的に同じ又は配列番号４１０と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４１１の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号１９６と実質的に同じ又は配列番号１９６と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号１９６と実質的に同じ又は配列番号１９６と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号１９５と実質的に同じ又は配列番号１９５と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１９６の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んでもよく、軽鎖可変ドメインは、配列番号４１１と実質的に同じ又は配列番号４１１と同一のアミノ酸配列を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号１９６と実質的に同じ又は配列番号１９６と同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、配列番号４１１と実質的に同じ又は配列番号４１１と同一の配列、及び配列番号１９６と実質的に同じ又は配列番号１９６と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号４１０と実質的に同じ又は配列番号４１０と同一の配列、及び配列番号１９５と実質的に同じ又は配列番号１９５と同一の配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0051】

[0084]タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号４６５と実質的に同じ又は配列番号４６５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号４６５と実質的に同じ又は配列番号４６５と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号４６４と実質的に同じ又は配列番号４６４と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４６５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号２６７と実質的に同じ又は配列番号２６７と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２６８の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んでもよく、軽鎖可変ドメインは、配列番号４６５と実質的に同じ又は配列番号４６５と同一のアミノ酸配列を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、配列番号４６５と実質的に同じ又は配列番号４６５と同一の配列、及び配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号４６４と実質的に同じ又は配列番号４６４と同一の配列、及び配列番号２６７と実質的に同じ又は配列番号２６７と同一の配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0052】

[0085]タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号５８１と実質的に同じ又は配列番号５８１と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号５８１と実質的に同じ又は配列番号５８１と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５８０と実質的に同じ又は配列番号５８０と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５８１の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号２６７と実質的に同じ又は配列番号２６７と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２６８の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んでもよく、軽鎖可変ドメインは、配列番号５８１と実質的に同じ又は配列番号５８１と同一のアミノ酸配列を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、配列番号５８１と実質的に同じ又は配列番号５８１と同一の配列、及び配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５８０と実質的に同じ又は配列番号５８０と同一の配列、及び配列番号２６７と実質的に同じ又は配列番号２６７と同一の配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0053】

[0086]タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５４４と実質的に同じ又は配列番号５４４と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５４５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号３８３と実質的に同じ又は配列番号３８３と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３８４の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んでもよく、軽鎖可変ドメインは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一の配列、及び配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５４４と実質的に同じ又は配列番号５４４と同一の配列、及び配列番号３８３と実質的に同じ又は配列番号３８３と同一の配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0054】

[0087]タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５４４と実質的に同じ又は配列番号５４４と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５４５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号３９２と実質的に同じ又は配列番号３９２と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３９３の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んでもよく、軽鎖可変ドメインは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一の配列、及び配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５４４と実質的に同じ又は配列番号５４４と同一の配列、及び配列番号３９２と実質的に同じ又は配列番号３９２と同一の配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0055】

[0088]タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５４４と実質的に同じ又は配列番号５４４と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５４５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号４０１と実質的に同じ又は配列番号４０１と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４０２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んでもよく、軽鎖可変ドメインは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一の配列、及び配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５４４と実質的に同じ又は配列番号５４４と同一の配列、及び配列番号４０１と実質的に同じ又は配列番号４０１と同一の配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0056】

[0089]タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５７１と実質的に同じ又は配列番号５７１と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５７２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号３８３と実質的に同じ又は配列番号３８３と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３８４の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んでもよく、軽鎖可変ドメインは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一の配列、及び配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５７１と実質的に同じ又は配列番号５７１と同一の配列、及び配列番号３８３と実質的に同じ又は配列番号３８３と同一の配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0057】

[0090]タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５７１と実質的に同じ又は配列番号５７１と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５７２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号３９２と実質的に同じ又は配列番号３９２と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３９３の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んでもよく、軽鎖可変ドメインは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一の配列、及び配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５７１と実質的に同じ又は配列番号５７１と同一の配列、及び配列番号３９２と実質的に同じ又は配列番号３９２と同一の配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0058】

[0091]タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５７１と実質的に同じ又は配列番号５７１と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５７２の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでもよい。一部の態様において、配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号４０１と実質的に同じ又は配列番号４０１と同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４０２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードしてもよい。タウに特異的に結合する記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含んでもよく、軽鎖可変ドメインは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一の配列、及び配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一の配列をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態において、配列番号５７１と実質的に同じ又は配列番号５７１と同一の配列、及び配列番号４０１と実質的に同じ又は配列番号４０１と同一の配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0059】

[0092]一部の実施形態において、タウに特異的に結合する抗体は、２０１７年１０月１１日にアメリカ培養細胞系統保存機関（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９）に寄託された抗体産生細胞によって産生され、受託番号ＰＴＡ−１２４５２３又はＰＴＡ−１２４５２４を割り振られている。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定される、寄託された抗体産生細胞によって産生された抗体の、単量体野生型２Ｎ４Ｒタウに対する結合親和性を有する。一部の実施形態において、開示される抗体又はその抗原結合フラグメントは、寄託された抗体産生細胞によって産生された抗体の軽鎖及び重鎖ＣＤＲを含む。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、寄託された抗体産生細胞によって産生された抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を含む。

【0060】

[0093]本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントには、記載される抗体又は抗原結合フラグメントの生物学的特性（例えば、結合親和性又は免疫エフェクター活性）を保持する、単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するバリアントが含まれる。当業者であれば、単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するバリアントを産生することができる。これらバリアントには、（ａ）１つ又は複数のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸で置換されているバリアント、（ｂ）１つ又は複数のアミノ酸がポリペプチドに付加されている又はポリペプチドから欠失しているバリアント、（ｃ）１つ又は複数のアミノ酸が置換基を含むバリアント、及び（ｄ）ポリペプチドが、例えば抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分など、ポリペプチドに有用な特性を付与することができる融合パートナー、タンパク質タグ、又は他の化学的部分など、別のペプチド又はポリペプチドと融合しているバリアントが含まれてもよい。本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントには、１つの種由来のアミノ酸残基が、保存された又は保存されていない位置のいずれかで、別の種における対応する残基の代わりに置換されているバリアントが含まれてもよい。他の実施形態において、保存されていない位置におけるアミノ酸残基を、保存的又は非保存的残基で置換する。遺伝子的（抑制、欠失、変異等）、化学的、及び酵素的技法を含めた、これらバリアントを獲得するための技法は当業者に公知である。

【0061】

[0094]本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定される約１×１０^−８Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）を含む、野生型単量体２Ｎ４Ｒタウに対する結合親和性（ｎＭ単位の）を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定される約０．５ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）を含む、野生型単量体２Ｎ４Ｒタウに対する結合親和性（ｎＭ単位の）を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定される約０．３ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）を含む、野生型単量体２Ｎ４Ｒタウに対する結合親和性（ｎＭ単位の）を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定される約０．２ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）を含む、野生型単量体２Ｎ４Ｒタウに対する結合親和性（ｎＭ単位の）を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定される約０．１５ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）を含む、野生型単量体２Ｎ４Ｒタウに対する結合親和性（ｎＭ単位の）を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴によって測定される約０．１ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）を含む、野生型単量体２Ｎ４Ｒタウに対する結合親和性（ｎＭ単位の）を有する。

【0062】

[0095]本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントについての実施形態のいずれかにおいて、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＨＶＰＧ（配列番号１１３３）を含むエピトープに結合することができる。一部の実施形態において、本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは二重エピトープ性である。ある特定の態様において、本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、ＨＶＰＧ（配列番号１１３３）を含むタウ内の１つ又は複数のエピトープに結合する。この配列は、ヒト２Ｎ４Ｒタウに２回出現する。第１の部位は、２Ｎ４Ｒタウにおいて、残基２９９〜３０２における第２の反復領域内に、第２の部位は、残基３６２〜３６５における第４の反復領域内にある。

【0063】

[0096]本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントについての実施形態のいずれかにおいて、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープに結合することができる。一部の実施形態において、本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは二重エピトープ性である。ある特定の態様において、本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むタウ内の１つ又は複数のエピトープに結合する。この配列は、ヒト２Ｎ４Ｒタウに２回出現する。第１の部位は、２Ｎ４Ｒタウにおいて、残基２９９〜３０３における第２の反復領域内に、第２の部位は、残基３６２〜３６６における第４の反復領域内にある。ある特定の態様において、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、ペプチド結合アッセイ（例えば、実施例３に記載されるペプチド結合アッセイ）によって決定される通り、反復領域３内にＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）を含むタウ内のエピトープへの結合よりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０倍大きいペプチド結合選好性で、反復領域２又は反復領域４内にＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むタウ内のエピトープに結合する。ある特定の態様において、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、ペプチド結合アッセイ（例えば、実施例３に記載されるペプチド結合アッセイ）によって決定される通り、反復領域１内にＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）を含むタウ内のエピトープへの結合よりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０倍大きいペプチド結合選好性で、反復領域２又は反復領域４内にＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むタウ内のエピトープに結合する。ある特定の態様において、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、ペプチド結合アッセイ（例えば、実施例３に記載されるペプチド結合アッセイ）によって決定される通り、反復領域３内にＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）を含むタウ内のエピトープへの結合よりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０倍大きく、反復領域１内にＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）を含むエピトープへの結合よりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０倍大きいペプチド結合選好性で、反復領域２又は反復領域４内にＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むタウ内のエピトープに結合する。ある特定の態様において、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、ペプチド結合アッセイ（例えば、実施例４に記載されるペプチド結合アッセイ）によって決定される通り、反復領域２内にＨＶＳＧＧ（配列番号１８４）を含む天然に存在する変異体Ｐ３０１Ｓタウ内のエピトープには結合しない。ある特定の態様において、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、ペプチド結合アッセイ（例えば、実施例４に記載されるペプチド結合アッセイ）によって決定される通り、反復領域２内にＨＶＬＧＧ（配列番号１８５）を含む天然に存在する変異体Ｐ３０１Ｌタウ内のエピトープには結合しない。アミノ酸配列ＨＶＳＧＧ（配列番号１８４）は、Ｐ３０１Ｓインビトロ及びインビボタウオパチーモデルの２Ｎ４Ｒタウ配列における残基２９９〜３０３に存在する。アミノ酸配列ＨＶＬＧＧ（配列番号１８５）は、Ｐ３０１Ｌインビトロ及びインビボタウオパチーモデルの２Ｎ４Ｒタウ配列における残基２９９〜３０３に存在する。反復領域３内にＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）又は反復領域１内にＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）を含むエピトープと比べて、反復領域２又は反復領域４内にＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むタウ内の１つ又は複数のエピトープに好んで結合し、反復領域２内にＨＶＳＧＧ（配列番号１８４）又はＨＶＬＧＧ（配列番号１８５）を含むエピトープには結合しない本明細書において提供される抗体又は抗原結合フラグメントは、残基３６２〜３６６で２Ｎ４ＲタウＰ３０１Ｓ／Ｌに結合する。驚くべきことに、本明細書において実証されるように、反復領域３内にＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）又は反復領域１内にＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）を含むエピトープと比べて、反復領域２又は反復領域４内にＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むタウ内の１つ又は複数のエピトープに好んで結合し、反復領域２内にＨＶＳＧＧ（配列番号１８４）又はＨＶＬＧＧ（配列番号１８５）を含むエピトープへの結合を呈しない記載される抗体又は抗原結合フラグメントは、インビボにおけるタウのシーディング及び伝播を低下させる。

【0064】

[0097]ある特定の実施形態において、標識された抗タウ抗体が提供される。標識には、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光性、発色性、電子密度性、化学発光性、及び放射性の標識）、並びに間接的に（例えば、酵素反応又は分子相互作用を通じて）検出される標識及び部分（例えば、酵素又はリガンド）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例示的な標識には、放射標識（例えば、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１１１Ｉ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）６４９など）、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、又は酵素が含まれるが、それらに限定されるわけではない。より具体的には、記載される標識には、ルテニウム、^１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、^１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータ−ガラクトシダーゼ、ポリヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン色素、シアニン色素、フルオロン色素、オキサジン色素、フェナントリジン色素、ローダミン色素、アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）（商標）色素等が含まれる。

【0065】

[0098]タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドも開示される。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７３７は、配列番号７３８と実質的に同じ又は配列番号７３８と同一の、Ｋａｂａｔに従って規定される軽鎖ＣＤＲ１配列を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７３９は、配列番号７４０と実質的に同じ又は配列番号７４０と同一の、Ｋａｂａｔに従って規定される軽鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７４１は、配列番号７４２と実質的に同じ又は配列番号７４２と同一の、Ｋａｂａｔに従って規定される軽鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号５９３は、配列番号５９４と実質的に同じ又は配列番号５９４と同一の、Ｋａｂａｔに従って規定される重鎖ＣＤＲ１を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号５９５は、配列番号５９６と実質的に同じ又は配列番号５９６と同一の、Ｋａｂａｔに従って規定される重鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号５９７は、配列番号５９８と実質的に同じ又は配列番号５９８と同一の、Ｋａｂａｔに従って規定される重鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。単離されたポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７３８と実質的に同じ又は配列番号７３８と同一のＣＤＲ１、例えば配列番号７３７；配列番号７４０と実質的に同じ又は配列番号７４０と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号７３９；及び配列番号７４２と実質的に同じ又は配列番号７４２と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号７４１を有する軽鎖を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号５９４と実質的に同じ又は配列番号５９４と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号５９３；配列番号５９６と実質的に同じ又は配列番号５９６と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号５９５；及び配列番号５９８と実質的に同じ又は配列番号５９８と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号５９７を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７３８と実質的に同じ又は配列番号７３８と同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号７３７；配列番号７４０と実質的に同じ又は配列番号７４０と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ２、例えば配列番号７３９；及び配列番号７４２と実質的に同じ又は配列番号７４２と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３、例えば配列番号７４１；並びに、配列番号５９４と実質的に同じ又は配列番号５９４と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号５９３；配列番号５９６と実質的に同じ又は配列番号５９６と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号５９５；及び配列番号５９８と実質的に同じ又は配列番号５９８と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号５９７を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。

【0066】

[0099]一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１００７は、配列番号１００８と実質的に同じ又は配列番号１００８と同一の、ＩＭＧＴに従って規定される軽鎖ＣＤＲ１配列を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１００９は、配列番号１０１０と実質的に同じ又は配列番号１０１０と同一の、ＩＭＧＴに従って規定される軽鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１０１１は、配列番号１０１２と実質的に同じ又は配列番号１０１２と同一の、ＩＭＧＴに従って規定される軽鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号８６３は、配列番号８６４と実質的に同じ又は配列番号８６４と同一の、ＩＭＧＴに従って規定される重鎖ＣＤＲ１を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号８６５は、配列番号８６６と実質的に同じ又は配列番号８６６と同一の、ＩＭＧＴに従って規定される重鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号８６７は、配列番号８６８と実質的に同じ又は配列番号８６８と同一の、ＩＭＧＴに従って規定される重鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。単離されたポリヌクレオチドは、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１００８と実質的に同じ又は配列番号１００８と同一のＣＤＲ１、例えば配列番号１００７；配列番号１０１０と実質的に同じ又は配列番号１０１０と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号１００９；及び配列番号１０１２と実質的に同じ又は配列番号１０１２と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号１０１１を有する軽鎖を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号８６４と実質的に同じ又は配列番号８６４と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号８６３；配列番号８６６と実質的に同じ又は配列番号８６６と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号８６５；及び配列番号８６８と実質的に同じ又は配列番号８６８と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号８６７を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１００８と実質的に同じ又は配列番号１００８と同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１００７；配列番号１０１０と実質的に同じ又は配列番号１０１０と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ２、例えば配列番号１００９；及び配列番号１０１２と実質的に同じ又は配列番号１０１２と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３、例えば配列番号１０１１；並びに、配列番号８６４と実質的に同じ又は配列番号８６４と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号８６３；配列番号８６６と実質的に同じ又は配列番号８６６と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号８６５；及び配列番号８６８と実質的に同じ又は配列番号８６８と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号８６７を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。

【0067】

[0100]一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７７３は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７７４と実質的に同じ又は配列番号７７４と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７７５は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７７６と実質的に同じ又は配列番号７７６と同一の軽鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７７７は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７７８と実質的に同じ又は配列番号７７８と同一の軽鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号６４１は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号６４２と実質的に同じ又は配列番号６４２と同一の重鎖ＣＤＲ１を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号６４３は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号６４４と実質的に同じ又は配列番号６４４と同一の重鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号６４５は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号６４６と実質的に同じ又は配列番号６４６と同一の重鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。単離されたポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７７４と実質的に同じ又は配列番号７７４と同一のＣＤＲ１、例えば配列番号７７３；配列番号７７６と実質的に同じ又は配列番号７７６と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号７７５；及び配列番号７７８と実質的に同じ又は配列番号７７８と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号７７７を有する軽鎖を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号６４２と実質的に同じ又は配列番号６４２と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号６４１；配列番号６４４と実質的に同じ又は配列番号６４４と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号６４３；及び配列番号６４６と実質的に同じ又は配列番号６４６と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号６４５を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７７４と実質的に同じ又は配列番号７７４と同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号７７３；配列番号７７６と実質的に同じ又は配列番号７７６と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ２、例えば配列番号７７５；及び配列番号７７８と実質的に同じ又は配列番号７７８と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３、例えば配列番号７７７；並びに、配列番号６４２と実質的に同じ又は配列番号６４２と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号６４１；配列番号６４４と実質的に同じ又は配列番号６４４と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号６４３；及び配列番号６４６と実質的に同じ又は配列番号６４６と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号６４５を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。

【0068】

[0101]一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１０４３は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１０４４と実質的に同じ又は配列番号１０４４と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１０４５は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１０４６と実質的に同じ又は配列番号１０４６と同一の軽鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１０４７は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１０４８と実質的に同じ又は配列番号１０４８と同一の軽鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号９１１は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号９１２と実質的に同じ又は配列番号９１２と同一の重鎖ＣＤＲ１を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号９１３は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号９１４と実質的に同じ又は配列番号９１４と同一の重鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号９１５は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号９１６と実質的に同じ又は配列番号９１６と同一の重鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。単離されたポリヌクレオチドは、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１０４４と実質的に同じ又は配列番号１０４４と同一のＣＤＲ１、例えば配列番号１０４３；配列番号１０４６と実質的に同じ又は配列番号１０４６と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号１０４５；及び配列番号１０４８と実質的に同じ又は配列番号１０４８と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号１０４７を有する軽鎖を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号９１２と実質的に同じ又は配列番号９１２と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号９１１；配列番号９１４と実質的に同じ又は配列番号９１４と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号９１３；及び配列番号９１６と実質的に同じ又は配列番号９１６と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号９１５を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１０４４と実質的に同じ又は配列番号１０４４と同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１０４３；配列番号１０４６と実質的に同じ又は配列番号１０４６と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ２、例えば配列番号１０４５；及び配列番号１０４８と実質的に同じ又は配列番号１０４８と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３、例えば配列番号１０４７；並びに、配列番号９１２と実質的に同じ又は配列番号９１２と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号９１１；配列番号９１４と実質的に同じ又は配列番号９１４と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号９１３；及び配列番号９１６と実質的に同じ又は配列番号９１６と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号９１５を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。

【0069】

[0102]一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号８４５は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号８４６と実質的に同じ又は配列番号８４６と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号８４７は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号８４８と実質的に同じ又は配列番号８４８と同一の軽鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号８４９は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号８５０と実質的に同じ又は配列番号８５０と同一の軽鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７３１は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７３２と実質的に同じ又は配列番号７３２と同一の重鎖ＣＤＲ１を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７３３は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７３４と実質的に同じ又は配列番号７３４と同一の重鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号７３５は、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７３６と実質的に同じ又は配列番号７３６と同一の重鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。単離されたポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号８４６と実質的に同じ又は配列番号８４６と同一のＣＤＲ１、例えば配列番号８４５；配列番号８４８と実質的に同じ又は配列番号８４８と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号８４７；及び配列番号８５０と実質的に同じ又は配列番号８５０と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号８４９を有する軽鎖を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号７３２と実質的に同じ又は配列番号７３２と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号７３１；配列番号７３４と実質的に同じ又は配列番号７３４と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号７３３；及び配列番号７３６と実質的に同じ又は配列番号７３６と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号７３５を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、Ｋａｂａｔに従って規定される、配列番号８４６と実質的に同じ又は配列番号８４６と同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号８４５；配列番号８４８と実質的に同じ又は配列番号８４８と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ２、例えば配列番号８４７；及び配列番号８５０と実質的に同じ又は配列番号８５０と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３、例えば配列番号８４９；並びに、配列番号７３２と実質的に同じ又は配列番号７３２と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号７３１；配列番号７３４と実質的に同じ又は配列番号７３４と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号７３３；及び配列番号７３６と実質的に同じ又は配列番号７３６と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号７３５を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。

【0070】

[0103]一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１１１５は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１１１６と実質的に同じ又は配列番号１１１６と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１１１７は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１１１８と実質的に同じ又は配列番号１１１８と同一の軽鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１１１９は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１１２０と実質的に同じ又は配列番号１１２０と同一の軽鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１００１は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１００２と実質的に同じ又は配列番号１００２と同一の重鎖ＣＤＲ１を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１００３は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１００４と実質的に同じ又は配列番号１００４と同一の重鎖ＣＤＲ２を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号１００５は、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１００６と実質的に同じ又は配列番号１００６と同一の重鎖ＣＤＲ３を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする。単離されたポリヌクレオチドは、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１１１６と実質的に同じ又は配列番号１１１６と同一のＣＤＲ１、例えば配列番号１１１５；配列番号１１１８と実質的に同じ又は配列番号１１１８と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号１１１７；及び配列番号１１２０と実質的に同じ又は配列番号１１２０と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号１１１９を有する軽鎖を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１００２と実質的に同じ又は配列番号１００２と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１００１；配列番号１００４と実質的に同じ又は配列番号１００４と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号１００３；及び配列番号１００６と実質的に同じ又は配列番号１００６と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号１００５を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、ＩＭＧＴに従って規定される、配列番号１１１６と実質的に同じ又は配列番号１１１６と同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１１１５；配列番号１１１８と実質的に同じ又は配列番号１１１８と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ２、例えば配列番号１１１７；及び配列番号１１２０と実質的に同じ又は配列番号１１２０と同一のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３、例えば配列番号１１１９；並びに、配列番号１００２と実質的に同じ又は配列番号１００２と同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１００１；配列番号１００４と実質的に同じ又は配列番号１００４と同一のＣＤＲ２、例えば配列番号１００３；及び配列番号１００６と実質的に同じ又は配列番号１００６と同一のＣＤＲ３、例えば配列番号１００５を有する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしてもよい。

【0071】

[0104]本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号４１１と実質的に同じ又は配列番号４１１と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号４１０。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１９６と実質的に同じ又は配列番号１９６と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号１９５。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４１１と実質的に同じ又は配列番号４１１と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号４１０；及び配列番号１９６と実質的に同じ又は配列番号１９６と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号１９５を有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい。本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得る単離されたポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。

【0072】

[0105]本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号４６５と実質的に同じ又は配列番号４６５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号４６４。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号２６７。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４６５と実質的に同じ又は配列番号４６５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号４６４；及び配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号２６７を有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい。本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得る単離されたポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。

【0073】

[0106]本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号５８１と実質的に同じ又は配列番号５８１と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号５８０。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号２６７。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５８１と実質的に同じ又は配列番号５８１と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号５８０；及び配列番号２６８と実質的に同じ又は配列番号２６８と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号２６７を有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい。本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得る単離されたポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。

【0074】

[0107]本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号５４４。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号３８３。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号５４４；及び配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号３８３を有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい。本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得る単離されたポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。

【0075】

[0108]本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号５４４。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号３９２。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号５４４；及び配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号３９２を有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい。本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得る単離されたポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。

【0076】

[0109]本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号５４４。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号４０１。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５４５と実質的に同じ又は配列番号５４５と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号５４４；及び配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号４０１を有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい。本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得る単離されたポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。

【0077】

[0110]本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号５７１。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号３８３。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号５７１；及び配列番号３８４と実質的に同じ又は配列番号３８４と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号３８３を有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい。本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得る単離されたポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。

【0078】

[0111]明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号５７１。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号３９２。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号５７１；及び配列番号３９３と実質的に同じ又は配列番号３９３と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号３９２を有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい。本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得る単離されたポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。

【0079】

[0112]本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号５７１。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメントを有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい、例えば配列番号４０１。一部の実施形態において、記載される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５７２と実質的に同じ又は配列番号５７２と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号５７１；及び配列番号４０２と実質的に同じ又は配列番号４０２と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインセグメント、例えば配列番号４０１を有する抗体又は抗原結合フラグメントをコードしてもよい。本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得る単離されたポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。

【0080】

[0113]本明細書において提供される可変ドメインセグメントをコードし得るポリヌクレオチドを同じ又は異なるベクターに含めて、抗体又は抗原結合フラグメントを産生することができる。操作された抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも本開示の範囲内にある。一部の実施形態において、記載されるポリヌクレオチド（及び、それらポリヌクレオチドがコードするペプチド）はリーダー配列を含む。当技術分野において公知の任意のリーダー配列を採用することができる。リーダー配列には、制限部位又は翻訳開始部位が含まれてもよいが、それらに限定されるわけではない。

【0081】

[0114]本明細書において記載されるポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。ベクターは発現ベクターであり得る。故に、関心対象のポリペプチドをコードする配列を含有する組み換え発現ベクターは、本開示の範囲内として企図される。発現ベクターは、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択マーカー、及びポリアデニル化シグナルなどであるがそれらに限定されない、１つ又は複数の追加の配列を含有してもよい。多種多様の宿主細胞を形質転換するベクターが周知であり、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びに他の細菌ベクター、酵母ベクター、及びウイルスベクターを含むが、それらに限定されるわけではない。

【0082】

[0115]本説明の範囲内にある組み換え発現ベクターは、適切な調節エレメントに作動的に連結されていてもよい少なくとも１つの組み換えタンパク質をコードする、合成由来、ゲノム由来、又はｃＤＮＡ由来の核酸フラグメントを含む。そのような調節エレメントには、転写プロモーター、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列が含まれてもよい。発現ベクター、とりわけ哺乳類発現ベクターは、複製起点、発現される対象となる遺伝子に連結された適切なプロモーター及びエンハンサー、他の５’若しくは３’隣接非転写配列、５’若しくは３’非翻訳配列（必須のリボソーム結合部位など）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、又は転写終結配列など、１つ又は複数の非転写エレメントも含んでもよい。宿主において複製する能力を付与する複製起点も組み入れられてもよい。

【0083】

[0116]脊椎動物細胞を形質転換する際に用いられる対象となる発現ベクターにおける転写及び翻訳制御配列は、ウイルス供給源によって提供されてもよい。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ、３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）によって記載されているように構築されてもよい。

【0084】

[0117]一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントをコードする配列は、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータ−アクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン等に対するプロモーターなど、強力な構成的プロモーターの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルスプロモーターは、真核細胞において構成的に機能し、記載される実施形態との使用に適している。そのようなウイルスプロモーターには、限定されることなく、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、モロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）白血病ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルス、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。１つの実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列は、メタロチオネインプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ドキシサイクリン誘導性プロモーター、１種又は複数種のインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）、例えばタンパク質キナーゼＲ、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１等を含有するプロモーターなど、誘導性プロモーターの制御下に置かれる。

【0085】

[0118]本明細書において記載されるベクターは、１つ又は複数の内部リボソーム進入部位（複数可）（ＩＲＥＳ）を含有してもよい。融合ベクターへのＩＲＥＳ配列の包含は、一部のタンパク質の発現を増強するのに有益であることがある。一部の実施形態において、ベクターシステムは、前述の核酸配列のいずれかの上流又は下流にあってもよい、１つ又は複数のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含む。ベクター構成要素は、近接して連結されていてもよく、又は遺伝子産物を発現させるための最適な間隔を提供する様式で編成されてもよく（すなわち、ＯＲＦ間への「スペーサー」ヌクレオチドの導入によって）、又は別の手段で配置されてもよい。ＩＲＥＳモチーフなどの調節エレメントを編成して、発現のための最適な間隔を提供することもできる。

【0086】

[0119]ベクターは、当技術分野において周知である選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーには、陽性及び陰性選択マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子）、グルタミン酸シンターゼ遺伝子、ガンシクロビル選択のためのＨＳＶ−ＴＫ、ＨＳＶ−ＴＫ誘導体、又は６−メチルプリン選択のための細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉら、７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７３８〜１７４３（２０００））が含まれる。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。

【0087】

[0120]本明細書において記載されるベクターを用いて、記載される抗体又は抗原結合フラグメントをコードする遺伝子で様々な細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターを用いて、抗体又は抗原結合フラグメント産生細胞を作出することができる。故に、別の態様は、本明細書において記載される及び例示される抗体又は抗原結合フラグメントなど、タウに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞を特色とする。

【0088】

[0121]細胞内への外来遺伝子の導入のための数々の技法が当技術分野において公知であり、その技法を用いて、本明細書において記載される及び例示される様々な実施形態に従って、記載される方法を実行する目的のために組み換え細胞を構築することができる。用いられる技法は、異種遺伝子配列が遺伝性であり且つ細胞子孫によって発現可能であるような、並びにレシピエント細胞の必須の発達及び生理機能が妨害されないような、宿主細胞への異種遺伝子配列の安定な移入を提供すべきである。用いることができる技法には、染色体移入（例えば、細胞融合、染色体媒介性遺伝子移入、微小核細胞（ｍｉｃｒｏ ｃｅｌｌ）媒介性遺伝子移入）、物理的方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター移入（例えば、組み換えＤＮＡウイルス、組み換えＲＮＡウイルス）等（Ｃｌｉｎｅ、２９ Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６９〜９２（１９８５）に記載されている）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。リン酸カルシウム沈殿及び細菌プロトプラストと哺乳類細胞とのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導性融合を用いても、細胞を形質転換することができる。

【0089】

[0122]本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントの発現における使用に適した細胞は、好ましくは真核細胞、より好ましくは植物、齧歯類、又はヒト起源の細胞、例えば数ある中でもＮＳ０、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ−ｔｓ１３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、及びＳｐ２／０骨髄腫細胞の細胞株であるが、それらに限定されるわけではない。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を用いて達成されてもよい。ハイブリドーマを産生するための方法は、当技術分野において十分に確立されている。

【0090】

[0123]本明細書において記載される発現ベクターで形質転換された細胞を、本明細書において記載される抗体又は抗原結合フラグメントの組み換え発現について選択する又はスクリーニングすることができる。組み換え陽性細胞を増殖させ、例えばタンパク質修飾又は変更した翻訳後修飾に起因した、高レベル発現、増強した成長特性、又は所望の生化学的特徴を有するタンパク質を産出する能力など、所望の表現型を呈するサブクローンについてスクリーニングする。これらの表現型は、所与のサブクローンの固有の特性に起因した又は変異に起因したものであってもよい。変異は、化学物質、ＵＶ波長光、放射線、ウイルス、挿入変異原、ＤＮＡミスマッチ修復の阻害、又はそのような方法の組み合わせの使用によりもたらされてもよい。

【0091】

[0124]ある特定の実施形態において、本明細書において記載される抗タウ抗体のいずれかを発現する単離された細胞株が提供される。１つの実施形態において、単離された細胞株はハイブリドーマである。１つの実施形態において、単離された細胞株は、モノクローナル抗体７Ｇ６が産生されるハイブリドーマである。１つの実施形態において、単離された細胞株は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６−ＨＥＫが産生されるフリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ）（登録商標）２９３−Ｆ細胞であり、その細胞株は、ＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−１２４５２３で２０１７年１０月１１日にアメリカ培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、ＵＳＡに寄託されている。１つの実施形態において、単離された細胞株は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８−ＨＥＫが産生されるフリースタイル（登録商標）２９３−Ｆ細胞であり、その細胞株は、ＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−１２４５２４で２０１７年１０月１１日にアメリカ培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、ＵＳＡに寄託されている。

【0092】

[0125]本明細書において提供される抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントを発現する細胞は、それぞれの抗体又は抗原結合フラグメントの発現に適した条件下で細胞を培養することによる、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントを産生する方法において採用されてもよい。一部の実施形態において、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、培養培地から回収される。

【0093】

[0126]ある特定の実施形態において、本明細書において提供される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかは、生物学的サンプルにおけるタウの存在を検出するのに有用である。本明細書において用いられる「検出すること」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。ある特定の実施形態において、生物学的サンプルは、脳脊髄液、脳の細胞若しくは組織（例えば、皮質又は海馬）、又は血液、組織学的調製物など、細胞又は組織に由来してもよい。一部の実施形態において、記載される方法は、生物学的サンプルと、
（ａ）ｍｓ７Ｇ６抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１５抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３−ＬＣｚｕ１８抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体、若しくはその抗原結合フラグメントのうちのいずれか１つ；
（ｂ）表１に記載される、ｍｓ７Ｇ６抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６抗体、若しくは７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体若しくはその抗原結合フラグメント；
（ｃ）表１に記載される、ｍｓ７Ｇ６抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８／ＬＣｚｕ６抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８／ＬＣｚｕ２１抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３／ＬＣｚｕ１５抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４／ＬＣｚｕ１５抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５／ＬＣｚｕ１５抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３／ＬＣｚｕ１８抗体、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４／ＬＣｚｕ１８抗体、若しくは７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５／ＬＣｚｕ１８抗体のいずれか１つの重鎖可変ドメインセグメント及び軽鎖可変ドメインセグメントを含む、抗体若しくはその抗原結合フラグメント；又は
（ｄ）受託番号ＰＴＡ−１２４５２３若しくはＰＴＡ−１２４５２４を有するＡＴＣＣに寄託された細胞株のいずれか１つによって産生される抗体のアミノ酸配列を有する抗体、若しくはその抗原結合フラグメント
とを接触させることによって、サンプルにおけるタウを検出するステップを含む。

【0094】

[0127]ある特定の実施形態において、方法は、生物学的サンプルと本明細書において提供される抗タウ抗体とを、タウへの抗タウ抗体の結合に寛容な条件下で接触させるステップ、及び抗タウ抗体とタウとの間で複合体が形成されるかどうかを検出するステップを含む。これらの方法についての一部の実施形態において、抗タウ抗体は検出可能なように標識されている。方法は、インビトロ又はインビボの方法であってもよい。生物学的試験サンプルにおける抗タウ抗体とタウとの間で形成された複合体を、生物学的対照サンプル（例えば、健常対象由来の生物学的サンプル）において形成された複合体と比較し得る。生物学的試験サンプルにおける抗タウ抗体とタウとの間で形成された複合体の量を定量もし得、及び生物学的対照サンプルにおいて形成された複合体の量又は健常対象において形成されることが公知の複合体の平均量と比較もし得る。

【0095】

[0128]さらなる態様において、本発明は、例えば本明細書において提供される治療法のいずれかにおける使用のための、本明細書において記載される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかを含む医薬製剤を提供する。一部の実施形態において、医薬製剤は、本明細書において提供される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントのいずれか、及び薬学的に許容できる担体を含む。

【0096】

[0129]本明細書において記載される抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントの医薬製剤は、所望の程度の純度を有するそのような抗体又は抗原結合フラグメントと、１種又は複数種の任意選択の薬学的に許容できる担体、希釈剤、及び／又は賦形剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６編、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））とを混合することによって凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容できる担体、希釈剤、及び賦形剤は、採用される投薬量及び濃度でレシピエントに一般的に非毒性であり、滅菌水、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化物質；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含めた、単糖類、二糖類、及び他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤を含むが、それらに限定されるわけではない。本明細書における例示的な薬学的に許容できる担体には、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質など、格子間（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含めた、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用の方法が、米国特許第７，８７１，６０７号及び米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様において、ｓＨＡＳＥＧＰを、コンドロイチナーゼなどの１種又は複数種の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。

【0097】

[0130]例示的な凍結乾燥抗体製剤が、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸塩バッファーを含む。

【0098】

[0131]医薬製剤における活性成分としての抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、例えばコアセルベーション技法によって若しくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）における又はマクロエマルションにおける、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに封入されてもよい。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６編、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。

【0099】

[0132]持続放出性調製物を調製してもよい。持続放出性調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは造形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態にある。

【0100】

[0133]インビボ投与に用いられる対象となる製剤は、一般的に無菌である。例えば無菌濾過膜を通した濾過によって、無菌性を容易に達成することができる。

【0101】

[0134]本明細書において提供される、タウに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメント（又はその製剤）のいずれかを、治療法において用いることができる。

【0102】

[0135]１つの態様において、医薬としての使用のための抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態において、不溶性タウの低下における使用のための抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態において、タウ凝集を阻害することにおける使用のための抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。さらなる態様において、タウオパチーを治療することにおける使用のための抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。開示される抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントを用いて治療され得る例示的なタウオパチーには、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が含まれる。治療され得る例示的なＦＴＤはピック病（ＰｉＤ）である。

【0103】

[0136]ある特定の実施形態において、治療の方法における使用のための抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態において、対象における不溶性タウを低下させる方法における使用のための抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態において、対象におけるタウ凝集を阻害する方法における使用のための抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態において、タウオパチーを有する対象を治療する方法における使用のための抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。タウオパチーの治療の方法は、タウオパチーを治療するのに有効な量の抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含む。ある特定の実施形態において、タウオパチーは、上で記載されるタウオパチーのうちの任意の１つである。好ましい実施形態において、対象は哺乳類、好ましくはヒトである。

【0104】

[0137]さらなる態様において、医薬の製造又は調製における、本明細書において記載される抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントの使用も本明細書において提供される。一部の実施形態において、医薬は、不溶性タウの低下のためのものである。一部の実施形態において、医薬は、タウ凝集の阻害のためのものである。一部の実施形態において、医薬は、タウオパチーの治療のためのものである。ある特定の実施形態において、タウオパチーは、上で記載されるタウオパチーのうちの任意の１つである。

【0105】

[0138]本明細書において記載される抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療のための必要に応じて病変内投与を含めた、任意の適切な手段によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、一部には投与が短期間又は慢性的であるかどうかに応じて、任意の適切な経路による、例えば静脈内又は皮下注射などの注射によるものであり得る。単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがそれらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書において企図される。

【0106】

[0139]本明細書において提供される抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントは、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）と矛盾しない形で製剤化され、投薬され、及び投与されるべきである。この文脈における検討の因子には、治療されている特定の疾病、治療されている特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、疾病の原因、作用物質の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師に公知の他の因子が含まれる。

【0107】

[0140]疾患の予防又は治療のために、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントの適当な投薬量は、治療される対象となる疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体又は抗原結合フラグメントが予防又は治療目的で投与されるのかどうか、以前の療法、患者の病歴及び抗体への応答、並びに主治医の裁量に依存する。抗体又は抗原結合フラグメントは、一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば１回若しくは複数回の分離した投与による又は連続注入によるかどうかにかかわらず、患者への投与の初回候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上で言及された因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれを上回る量に及ぶことがあるであろう。数日間又はより長い期間にわたる反復投与に関して、病状に応じて、治療は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで一般的に持続されるであろう。抗体又は抗原結合フラグメントの１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの値域内にあるであろう。故に、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、又は１００ｍｇ／ｋｇ（又は、その任意の組み合わせ）の１回又は複数回の投薬が患者に施されてもよい。そのような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間ごとに（例えば、患者が、抗体の約２回〜約２０回、又は例えば約６回の投薬を受けるように）投与されてもよい。初回のより高い負荷用量、それに続く１回又は複数回のより低い用量が投与されてもよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であることがある。この療法の進行を、従来の技法及びアッセイによってモニターすることができる。

【0108】

[0141]上で記載される疾病の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料（複数可）を含有する製品も本明細書において提供される。製品は、容器、及び容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。容器は、単独である、或いは病状を治療する、予防する、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わされている組成物を保ち、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静注液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであってもよい）。組成物における活性剤は、本明細書において記載される抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントである。ラベル又は添付文書は、組成物が、選定される病状を治療するために用いられることを表示する。或いは、又は加えて、製品は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液など、薬学的に許容できるバッファーを含む第２の容器をさらに含んでもよい。製品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含めた、商業的及びユーザーの視点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。

【0109】

[0142]例示的な実施形態

【0110】

[0143]開示される技術についての例示的な実施形態がここで提供される。これらの実施形態は、単なる例示であり、本開示の範囲又は本明細書に添付される特許請求の範囲を限定するわけではない。

【0111】

[0144]実施形態１．配列番号１９６に記載の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、並びに配列番号４１１に記載の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）；
配列番号２６８に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６５に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
配列番号４０２に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７２に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３
を含む、ヒトタウに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。

【0112】

[0145]実施形態２．Ｋａｂａｔの方法に従って規定される通り、ＨＣＤＲ１が、配列番号５９４を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号５９６を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号５９８を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号７３８を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号７４０を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号７４２を含む；
ＩＭＧＴによって規定される通り、ＨＣＤＲ１が、配列番号８６４を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号８６６を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号８６８を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１００８を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０１０を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号１０１２を含む；
Ｋａｂａｔの方法に従って規定される通り、ＨＣＤＲ１が、配列番号６４２を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号６４４を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号６４６を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号７７４を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号７７６を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号７７８を含む；
ＩＭＧＴによって規定される通り、ＨＣＤＲ１が、配列番号９１２を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号９１４を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号９１６を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１０４４を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０４６を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号１０４８を含む；
Ｋａｂａｔの方法に従って規定される通り、ＨＣＤＲ１が、配列番号７３２を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号７３４を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号７３６を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号８４６を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号８４８を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号８５０を含む；又は、
ＩＭＧＴによって規定される通り、ＨＣＤＲ１が、配列番号１００２を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１００４を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１００６を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１１１６を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１１１８を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号１１２０を含む、
実施形態１に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0113】

[0146]実施形態３．Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４９における残基がシステインではない、実施形態１又は２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0114】

[0147]実施形態４．Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４９における残基がセリンである、実施形態３に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0115】

[0148]実施形態５．Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置５７における残基がシステインではない、実施形態１〜４のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0116】

[0149]実施形態６．Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置５７における残基がセリンである、実施形態５に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0117】

[0150]実施形態７．Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置３４における残基がグルタミン酸である、実施形態１〜６のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0118】

[0151]実施形態８．Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置３６における残基がフェニルアラニンではない、実施形態１〜７のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0119】

[0152]実施形態９．Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置３６における残基がチロシンである、実施形態８に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0120】

[0153]実施形態１０．Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４６における残基がアルギニンではない、実施形態１〜９のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0121】

[0154]実施形態１１．Ｋａｂａｔの方法に従った軽鎖の位置４６における残基がロイシンである、実施形態１０に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0122】

[0155]実施形態１２．Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置９４における残基がリジンではない、実施形態１〜１１のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0123】

[0156]実施形態１３．Ｋａｂａｔの方法に従った重鎖の位置７１における残基がアルギニンではない、実施形態１〜１２のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0124】

[0157]実施形態１４．Ｋａｂａｔ法に従った重鎖の位置７１がバリンである、実施形態１３の方法に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0125】

[0158]実施形態１５．配列番号２６８を含む重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ）及び配列番号４６５を含む軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＤ）；
配列番号２６８を含むＨＣＶＤ及び配列番号５８１を含むＬＣＶＤ；
配列番号３８４を含むＨＣＶＤ及び配列番号５４５を含むＬＣＶＤ；
配列番号３９３を含むＨＣＶＤ及び配列番号５４５を含むＬＣＶＤ；
配列番号４０２を含むＨＣＶＤ及び配列番号５４５を含むＬＣＶＤ；
配列番号３８４を含むＨＣＶＤ及び配列番号５７２を含むＬＣＶＤ；
配列番号３９３を含むＨＣＶＤ及び配列番号５７２を含むＬＣＶＤ；又は
配列番号４０２を含むＨＣＶＤ及び配列番号５７２を含むＬＣＶＤ
を含む、実施形態１又は実施形態２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0126】

[0159]実施形態１６．ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４５２３を有する細胞株によって産生される、実施形態１〜１５のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0127】

[0160]実施形態１７．ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４５２４を有する細胞株によって産生される、実施形態１〜１５のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0128】

[0161]実施形態１８．マウス抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である、実施形態１〜１７のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0129】

[0162]実施形態１９．ＩｇＧ１である、実施形態１〜１８のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0130】

[0163]実施形態２０．表面プラズモン共鳴によって測定される約０．５ｎＭ未満のＫ_Ｄで、単量体野生型ヒト２Ｎ４Ｒタウに結合する、実施形態１〜１９のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0131】

[0164]実施形態２１．アミノ酸配列ＨＶＰＧ（配列番号１１３３）を含むエピトープでヒトタウに結合する、実施形態１〜２０のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0132】

[0165]実施形態２２．二重エピトープ性であり、反復領域２又は反復領域４内にアミノ酸配列ＨＶＰＧ（配列番号１１３３）を含むエピトープでヒトタウに結合する、実施形態２１に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0133】

[0166]実施形態２３．アミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する、実施形態１〜２０のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0134】

[0167]実施形態２４．二重エピトープ性であり、反復領域２又は反復領域４内にアミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する、実施形態２３に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0135】

[0168]実施形態２５．ペプチド結合アッセイによって決定される通り、
反復領域３内にアミノ酸配列ＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）を含むエピトープにおける結合よりも若しくは反復領域１内にアミノ酸配列ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）を含むエピトープにおける結合よりも少なくとも約１０倍大きい結合選好性で、反復領域２内にアミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する、又は
反復領域３内にアミノ酸配列ＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）を含むエピトープにおける結合よりも若しくは反復領域１内にアミノ酸配列ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）を含むエピトープにおける結合よりも少なくとも約１０倍大きい結合選好性で、反復領域４内にアミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）を含むエピトープでヒトタウに結合する、
実施形態１〜２４のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0136】

[0169]実施形態２６．反復領域２内にアミノ酸配列ＨＶＳＧＧ（配列番号１８４）を含むエピトープでは又は反復領域２内にアミノ酸配列ＨＶＬＧＧ（配列番号１８５）を含むエピトープではタウに結合しない、実施形態１〜２５のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。

【0137】

[0170]実施形態２７．実施形態１〜２６のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む、標識された抗体又は抗原結合フラグメント。

【0138】

[0171]実施形態２８．実施形態１〜２６のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。

【0139】

[0172]実施形態２９．実施形態２８に記載の核酸分子を含むベクター。

【0140】

[0173]実施形態３０．実施形態２８に記載の核酸分子を発現する細胞。

【0141】

[0174]実施形態３１．抗体又は抗原結合フラグメントを産生するのに適した条件下で、実施形態３０に記載の細胞を培養するステップを含む、抗タウ抗体又は抗原結合フラグメントを産生する方法。

【0142】

[0175]実施形態３２．抗体又は抗原結合フラグメントを回収するステップをさらに含む、実施形態３１に記載の方法。

【0143】

[0176]実施形態３３．実施形態１〜２６のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント及び薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。

【0144】

[0177]実施形態３４．医薬としての使用のための、実施形態１〜２６のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。

【0145】

[0178]実施形態３５．タウオパチーの治療における使用のための、実施形態１〜２６のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。

【0146】

[0179]実施形態３６．タウオパチーの治療のための医薬の調製における使用のための、実施形態１〜２６のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。

【0147】

[0180]実施形態３７．タウオパチーが、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、又は進行性核上性麻痺である、実施形態３５又は３６に記載の使用のための抗体。

【0148】

[0181]実施形態３８．前頭側頭型認知症がピック病である、実施形態３７に記載の使用のための抗体。

【0149】

[0182]実施形態３９．実施形態１〜２６のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含む、サルコシル不溶性タウレベルを減少させるための方法。

【0150】

[0183]実施形態４０．実施形態１〜２６のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含む、タウ凝集を阻害するための方法。

【0151】

[0184]実施形態４１．インビトロ又はインビボで実施される、実施形態３９又は４０に記載の方法。

【0152】

[0185]実施形態４２．対象におけるタウオパチーを治療するのに有効な条件下で、実施形態１〜２６のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含む、対象におけるタウオパチーを治療する方法。

【0153】

[0186]実施形態４３．タウオパチーが、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、又は進行性核上性麻痺である、実施形態４２に記載の方法。

【0154】

[0187]実施形態４４．前頭側頭型認知症がピック病である、実施形態４３に記載の方法。

【0155】

[0188]以下の実施例を提供して、先の開示を補足し及び本明細書において記載される主題のよりよい理解を提供する。これらの実施例は、記載される主題を限定すると考えられるべきではない。本明細書において記載される実施例及び実施形態は、単なる例示目的のためのものであること、並びに、本明細書において記載される実施例及び実施形態を踏まえた様々な改変又は変化は、当業者に明白であると考えられ、本発明の範囲内に含まれるべきであり、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。

【実施例】

【0156】

[0189]実施例１：モノクローナル抗体の作出
タウの微小管結合領域（ＭＴＢＲ）を認識する抗タウ抗体を作出するために、ペプチド配列ＣＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤ（配列番号１８６）（ペプチド抗原）を合成した。配列番号１８６の残基２〜２０は、タウの第２（すなわち、３Ｒアイソフォームには存在しない）と第３の反復領域間の接合点にまたがるアミノ酸配列に相当する（図２）。配列は、タウの凝集を始動する部位の１つである、ＰＨＦ６（ＶＱＩＶＹＫ）（配列番号１８７）としても知られるヘキサペプチドモチーフも含む（ｖｏｎ Ｂｅｒｇｅｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（１０）：５１２９〜５１３４）。ペプチド抗原を、全長タウ−４４１ヒトタンパク質配列に天然には存在しないＮ末端システイン残基を介して、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｈｅｍｏｃｙａｎｎｉｎ）（ＫＬＨ）担体タンパク質に共役した。ペプチド抗原コンジュゲートＫＬＨとフロイント完全アジュバントとを混合することによって（１：２（ｖ／ｖ））、最終免疫原を調製した。タウノックアウトマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ＃００７２５１）に、マウスあたり０．０８ｍＬの２．５ｍｇ／ｍＬ免疫原溶液で免疫付与した。初回注射のおよそ３週間後、マウスは、前回と同じタンパク質濃度のマウスあたり０．０５ｍＬの、アジュバントなしのペプチド抗原コンジュゲートＫＬＨによるブースト免疫付与を受けた。

【0157】

[0190]ブースト免疫付与の１カ月後、抗血清をマウスから収集し、抗体力価をＥＬＩＳＡによって評価して、元の免疫タウペプチド、並びに２Ｎ４Ｒ及び１Ｎ３Ｒ組み換えタウタンパク質の両方に対する免疫反応性を測定した。簡潔には、ＢＳＡにコンジュゲートした１５０ｎｇのペプチド抗原、又は５０ｎｇの２Ｎ４Ｒ若しくは１Ｎ３Ｒ組み換えタウタンパク質（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、それぞれカタログ番号ＢＭＬ−ＳＥ３２１及びＢＭＬ−ＳＥ３２３）のいずれかを用いて、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０中、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号２７９７）の各ウェルを３７℃で１時間コーティングした。プレートを、ＰＢＳに希釈された１％最終濃度のＢＳＡ中にて室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、同じブロッキングバッファー中の様々な希釈の抗血清をプレートに室温で１時間添加した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体の室温で３０分間の添加の前に、プレートをＰＢＳで数回洗浄した。さらなる洗浄ステップの後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質の添加によって、抗体結合を検出した。酵素反応を等量の２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させ、ウェル光学密度を４５０ｎｍの波長でプレートリーダーを用いて決定した。

【0158】

[0191]高い抗体力価を有するマウスが決定されると、細胞を内側腸骨リンパ節から単離し、ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫ＳＰ２細胞と融合させて、ハイブリドーマを作出した。融合細胞を９６ウェルプレートに播種し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択培地中で培養した。培養上清を、標準ペプチド及び前の段落に詳述される組み換えタウＥＬＩＳＡアッセイを用いてタウ結合について最初にスクリーニングした。相対的結合の概算を与えるために、ペプチドＥＬＩＳＡにおいて陽性であった培養上清、及び組み換えタンパク質２Ｎ４Ｒ若しくは１Ｎ３Ｒのいずれか又はその両方を、次いで競合ＥＬＩＳＡシステムにおいて評価した。前回の通り、９６ウェルプレートを２Ｎ４Ｒ組み換えタウでコーティングし、ブロッキングし、洗浄した。一次抗体ステップで、培養上清を１０中１に希釈し、プレートへの添加前に、種々の希釈の遊離抗原（２Ｎ４Ｒタウ）とともに室温で１時間インキュベートした。抗体／抗原複合体をプレートに添加したら、アッセイの残りに対するプロトコールは標準的ＥＬＩＳＡ手順と同一であった。単一細胞クローンを、段階希釈及び顕微鏡法によって確認した。結果として生じた最終ハイブリドーマを、血清不含培地中で凍結保存した。

【0159】

[0192]ハイブリドーマからの抗体精製
１％ＦＢＳ、１ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中でハイブリドーマを成長させた。培養物を１００ｍＬにスケールアップし、細胞が高密度に達し且つおよそ３０％生存可能である時点で上清を収穫した。抗体をプロテインＧカラムを用いて精製し、グリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．５で溶出し、直ちに中和した。精製された抗体を、次いで、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に透析し、等分し、−８０℃で保管した。

【0160】

[0193]元の免疫付与ペプチド及び全長組み換え２Ｎ４Ｒタウタンパク質を認識する抗体を作出するハイブリドーマクローンを産生した（表２）。

【0161】

[0194]実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現した組み換え単量体タウタンパク質に対するマウス抗体の親和性
実施例１において作出された抗タウマウスモノクローナル抗体とヒト野生型タウ（２Ｎ４Ｒ）及び等価のＰ３０１Ｓ変異体タウタンパク質との相互作用についての動態分析を、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（商標）Ｔ１００機器を用いて行った。組み換えヒト全長タウタンパク質を大腸菌において発現させ、次いで、セルファイン（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）（商標）ホスフェート親和性クロマトグラフィー、それに続く硫酸アンモニウム沈殿及び逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製した。

【0162】

[0195]ハイブリドーマ由来の精製された抗体を、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化されたプロテインＡ／Ｇによって捕捉した。次いで、野生型及びＰ３０１Ｓタウタンパク質を５つの異なる濃度でセンサーチップ上にインジェクトし、親和性（平衡解離定数、Ｋ_Ｄ）をメーカーの取扱説明書に従って算出した。結果は表２に示されている。

【0163】

【表2】

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【0164】

[0196]実施例３：ｍｓ７Ｇ６抗体の精細エピトープマッピング
全長野生型２Ｎ４Ｒヒトタウタンパク質配列（タウ４４１）に対するマウス７Ｇ６（「ｍｓ７Ｇ６」又は「７Ｇ６」）抗体の認識配列を、ペプチドチップマイクロアレイを用いて精細エピトープマッピングした。

【0165】

[0197]すべての手順は、ＰＥＰｐｅｒＰｒｉｎｔ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙによって実施された。全長２Ｎ４Ｒ野生型ヒトタウ配列を、Ｃ末端において中性ＧＳＧＳＧＳＧリンカー配列（配列番号１８８）で伸長させ、重複する１５ｍｅｒペプチドに翻訳した。４４１種の異なるペプチドを含有する結果として生じたペプチドマイクロアレイを、追加のＨＡタグ対照ペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧ）（配列番号１８９）の８２個のスポットとともにガラスチップ上に二つ組でプリントした。

【0166】

[0198]ｍｓ７Ｇ６抗タウ抗体を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１０％Ｒｏｃｋｌａｎｄブロッキングバッファー（ＭＢ−０７０）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。希釈された抗体を、１４０ｒｐｍで振とうしながら、チップ上で４℃にて１６時間インキュベートした。一次抗体を除去し、チップをＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。洗浄バッファーを除去し、次いで、一次抗体と同じバッファー中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）６８０（１：５０００）及び抗ＨＡタグＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００（１：２０００）をチップ上で室温にて４５分間インキュベートした。検出抗体を除去し、チップを前の通りもう一度洗浄した。蛍光画像をＬＩ−ＣＯＲオデッセイ（商標）イメージングシステムで取得し、マイクロアレイデータをペプスライド（商標）アナライザーソフトウェアを用いて最終的に分析した。

【0167】

[0199]チップの蛍光画像（図３Ａ）及び結果として生じた強度プロット（図３Ｂ）は、ｍｓ７Ｇ６が全長タウタンパク質の２つの主要な部位に結合することを示している。両部位におけるｍｓ７Ｇ６結合のための最小要求配列は、アミノ酸位置２９９〜３０３（第２の反復）及び３６２〜３６６（第４の反復）に見出されるＨＶＰＧＧ（配列番号７９）であることも見出された。２つのさらなる部位：アミノ酸位置２６８〜２７２におけるＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）及び位置３３０〜３３４におけるＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）において微量の結合が観察された。平均シグナル強度の算出により、マウス７Ｇ６抗体は、ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）（反復領域１）又はＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）（反復領域３）配列と比較して、全長４Ｒタウの第２の反復領域内に通常含有されるＨＶＰＧＧ（配列番号７９）部位への結合において、それぞれ４１倍又は３８倍の選好性を示すことが実証された。同様に、ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）（反復領域１）又はＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）（反復領域３）配列と比較して、全長４Ｒタウの第４の反復領域内に通常含有されるＨＶＰＧＧ（配列番号７９）部位への結合において、それぞれ３５倍又は３３倍の選好性が観察された。

【0168】

[0200]実施例４：７Ｇ６エピトープ置換スキャニング
ｍｓ７Ｇ６抗体によって認識されるエピトープのアミノ酸ストリンジェンシーを決定するために、天然に存在するタウペプチド配列^１ＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩ^１５（配列番号２６）の置換スキャニングを実施した。すべての手順は、ＰＥＰｐｅｒＰｒｉｎｔ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙによって請け負われ、２０種の天然に存在するアミノ酸のそれぞれを有する開始ペプチドにおける全箇所の交換に基づいた。

【0169】

[0201]考え得るあらゆる１５ｍｅｒペプチドを合成し、ガラスチップ上に三つ組でプリントして、９００個のペプチドスポットを含有するマイクロアレイを与えた。野生型ペプチド並びにＨＡタグ対照ペプチドの追加のコピーも、対照としてチップ上にスポットした。次いで、ペプチドチップを、実施例３（ｍｓ７Ｇ６抗体の精細エピトープマッピング）に記載されるのと同じ条件下でｍｓ７Ｇ６でプローブし、結果として生じたデータをペプスライド（商標）アナライザーソフトウェアを用いて分析した（配列番号３８〜７８に関する結果を図解した図４）。置換スキャニングは、^１ＨＶＰＧＧ^５（配列番号７９）のペプチドエピトープ内で、ｍｓ７Ｇ６抗体が、いくつかの考え得る残基による第２の位置におけるいくらかの柔軟性を示すことを示した。５番目のアミノ酸（グリシン）がアラニン又はセリンのいずれかに置換される場合にも、いくらかの結合がある。中央のプロリン残基は抗体結合に必要とされ、他の任意の天然に存在するアミノ酸で置換することはできない。このアミノ酸は、Ｐ３０１残基（タウ４４１のアミノ酸２９９〜３０３内、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ１０６３６−８）に相当し得、この残基を一般にセリン又はロイシン残基に変異させて、いくつかの前臨床インビトロ及びインビボモデルにおいてヒトタウオパチーを模倣する。置換スキャニングデータは、ｍｓ７Ｇ６抗体が、変異体Ｐ３０１Ｓタンパク質におけるアミノ酸３６２〜３６６でアミノ酸配列ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）結合部位を選好的に認識することを示す。

【0170】

[0202]実施例５：インビトロでのタウ凝集
ｍｓ７Ｇ６抗体がインビトロでタウ凝集を機能的に阻害し得るかどうかを決定するために、組み換えタウタンパク質を用いて凝集アッセイを実施した。

【0171】

[0203]野生型又はＰ３０１Ｓ変異体タウタンパク質を、２０μｌの最終容量で、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．５ｍＭ ＴＣＥＰを含有するバッファー中６０μＭの濃度に希釈した。混合物をサーマルサイクラーにて９８℃で３０分間加熱し、次いで室温まで冷却させた。マウスＩｇＧ２ｂ対照又はｍｓ７Ｇ６抗体を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、並びにＨＡＬＴプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤中８．３μＭの最終濃度に希釈した。希釈された抗体又はバッファー対照をタウタンパク質と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。タウ凝集を誘導するために、ヘパリンを、１００μｌの最終容量で１２μＭ最終濃度まで各反応液に添加した。最終反応条件は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４／１００ｍＭ ＮａＣｌバッファー中、１２μＭタウ、８．３μＭ抗体、０．１ｍＭ ＴＣＥＰ、及び１２μＭヘパリンであった。最終反応混合物を、期間を通じてサンプリングしながら少なくとも６日間３７℃でインキュベートして、タウ凝集を測定した。

【0172】

[0204]反応混合物のうちの１０μＬを取り出し、３８４ウェル黒色底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に入れることによって、タウの凝集を０、１、２、５、及び６日目に測定した。チオフラビンＳ色素を１５μＭの最終濃度まで各ウェルに添加し、プレートを暗所にて室温で３０分間インキュベートした。蛍光を、それぞれ４８５ｎｍ及び５２０ｎｍにおける励起及び発光波長を用いてフェラスター（Ｐｈｅｒａｓｔａｒ）（商標）プレートリーダーで測定した。

【0173】

[0205]図５Ａ及び５Ｂに示されるように、ヘパリン誘導性凝集の程度及び速度は、野生型と比較して、Ｐ３０１Ｓタウタンパク質に関して高かった。ｍｓ７Ｇ６抗体は、生み出された蛍光のより低い量によって示されるように、ＩｇＧと比較して、Ｐ３０１Ｓタウ及び野生型タウの両方のインビトロでの凝集を実質的に低下させた。このことは、Ｐ３０１Ｓタンパク質に関してさえ、残基３６２〜３６６へのｍｓ７Ｇ６結合単独で、これらの条件下での凝集を阻害し得るであろうことを示唆する。

【0174】

[0206]実施例６：インビトロ細胞シーディングモデル
ｍｓ７Ｇ６、又は７Ｇ６−ｚｕＨＣ２５−ｚｕＬＣ１８として知られるヒト化型（実施例１０を参照されたい）が細胞に対して効果を有するかどうかを決定するために、タウのシーディング及び凝集のインビトロ細胞系モデルにおいて各抗体を試験した。

【0175】

[0207]ヒト野生型タウの２Ｎ４Ｒアイソフォームを大腸菌において発現させ、次いで、以前に記載されるように精製した（Ｓｏｅｄａら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５、６：１０２１６）。組み換えタウ（４０μＭ）をヘパリン（２４０μｇ／ｍＬ）と混合し、２ｍＭ ＤＴＴを含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０中にて３７℃で４８〜９６時間インキュベートした。凝集したタウタンパク質を超遠心分離によって収集し、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ７．０又はＰＢＳに再懸濁した。次いで、溶液を超音波処理して、組み換えタウシードを産生した。

【0176】

[0208]Ｎｅｕｒｏ−２ａ（ＡＴＣＣ）細胞に、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、０Ｎ４Ｒ Ｐ３０１ＳタウをコードするｃＤＮＡ発現プラスミドを浮遊状態でトランスフェクトし、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中９６ウェルプレートにウェルあたり１．５×１０^４個細胞の密度で播いた。タウシードを添加する前に、細胞を放置して３７℃で一晩付着させた。並行して、様々な濃度の抗タウ抗体を１μｇ／ｍＬのタウシードと混合し、また３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培養培地を除去し、抗タウ抗体とシードとの混合物を含有する培地を添加した。プレートを再度３７℃で一晩培養した。

【0177】

[0209]細胞を、４％最終濃度のパラホルムアルデヒドで固定し、Ｈ−１５０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−５５８７）、チオフラビンＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ−１８９２）、及びＤＡＰＩ（Ｗａｋｏ、３４０−０７９７１）によって免疫染色した。インセルアナライザー（ＩｎＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ）２２００及びツールボックス（Ｔｏｏｌｂｏｘ）を用いて、画像を撮り、分析した。

【0178】

[0210]図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、及び６Ｄに示されるように、ｍｓ７Ｇ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８処理の両方に応答して、チオフラビンＳ染色（凝集したタウ）の有意な減少が観察された。このことは、両抗体が、これらのアッセイ条件下でのこの細胞系モデルにおいてタウシーディング効果を遮断し得たことを示す。

【0179】

[0211]実施例７：組み換えＰ３０１Ｓタウシードと抗体とをプレインキュベートすることによる、タウオパチーの前臨床インビボモデルにおける効力
ｍｓ７Ｇ６を含めた３つの新たな抗体の効果を、関連抗体と組み換えＰ３０１Ｓタウシードとをプレインキュベートすることによって、タウ沈着の短期間インビボモデルにおいて試験した。次いで、抗体の有り又は無しでのシードを、Ｐ３０１Ｓトランスジェニックマウスの脳に注射した。

【0180】

[0212]タウシードの脳室内（ＩＣＶ）注射
組み換え２Ｎ４Ｒ Ｐ３０１Ｓタウ（４０μＭ）とヘパリン（２４０μｇ／ｍＬ）とを混合し、その後に、２ｍＭ ＤＴＴを含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０中にて３７℃で４８〜９６時間のインキュベーションステップが続くことによって、既形成原線維（Ｐｒｅ−ｆｏｒｍｅｄ ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）（ＰＦＦ）タウを作出した。凝集したタウを超遠心分離によって収集し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０に再懸濁した。結果として生じたフィブリルを超音波処理し、注射用のシードとして用いた。０．８３ｍｇ／ｍＬの濃度のタウシードを、１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ_１又は２ｍｇ／ｍＬの抗タウ抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。タウシード／抗体混合物、対照（すなわち、タウ単独）、又はビヒクルを、２〜３．５カ月齢のＰ３０１Ｓトランスジェニックマウス（ＭＲＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の脳室内（ＩＣＶ）ゾーンに注射した。これらのマウスは、ＣＢＡ×Ｃ５７／ｂｌ６バックグラウンドにおけるマウスニューロン特異的Ｔｈｙ−１プロモーターの制御下でヒト０Ｎ４Ｒ Ｐ３０１Ｓタウを過剰発現する。

【0181】

[0213]これらの動物は、治療されない場合、５〜６カ月齢の時点で、重大な運動欠損を有して脳及び脊髄において広範囲のタウ病変を発症することが以前に報告されている（Ａｌｌｅｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２、２２（２１）：９３４０〜５１）。より若齢のＰ３０１Ｓマウスを用いた本実験では、動物をＩＣＶ注射の２週間後に屠殺し、脳を取り出し、関心対象の組織領域を収集した。次いで、組織サンプルを、下で記載されるようにサルコシル可溶性及び不溶性タウに分画した（Ｓａｈａｒａら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００２ Ｄｅｃ；８３（６）：１４９８〜５０８）。

【0182】

[0214]シードを注射されたＰ３０１Ｓマウス脳からのサルコシル不溶性タウの抽出
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）、１ｍＭ ＥＧＴＡ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、１％ＮＰ−４０（Ｆｌｕｋａ）、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１×ＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｃｈｗｅｉｚ）、及び１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ（−）（Ｒｏｃｈｅ）を含有する１９容量（組織重量／容量）の抽出バッファー中で組織をホモジナイズした。ホモジネートを１６３，０００ｇにて４℃で２０分間遠心分離し、結果として生じた上清を収集し、Ｔｒｉｓバッファー可溶性画分として保持した。ペレットを、超音波処理の前に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％スクロース（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、及び１％サルコシルを含有する約１０容量（組織重量／容量）のバッファーに再懸濁した。サルコシル処理したサンプルを３７℃で６０分間インキュベートし、次いで１６３，０００ｇにて４℃でさらに２０分間遠心分離した。上清をサルコシル可溶性画分として収集した。最後に、約１０容量のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）をペレットに添加し、次いでそれを超音波処理した。この操作により、サルコシル不溶性画分が形成された。

【0183】

[0215]ウェスタンブロッティングによるサルコシル不溶性タウの検出
サルコシル不溶性画分を、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファー及びＮｕＰＡＧＥ（商標）サンプル還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で可溶化し、７０℃で１０分間加熱し、１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ）を用いて分離した。タンパク質を０．２μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に転写し、ブロットを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を含有するＴＢＳ（Ｔａｋａｒａ）中の２．５％スキムミルク（Ｙｕｋｉｋｉｒｕｓｈｉ）中で室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキングの後、ブロットを、ブロッキングバッファー中ヒト特異的モノクローナル抗タウ抗体ＨＴ７（１：１０００又は１：２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で室温にて１時間プローブした。ブロットをＴＢＳ−Ｔで３０分間洗浄し、次いで、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（１：２０００、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともに室温でさらに１時間インキュベートした。二次抗体を除去し、ブロットを上で記載されるように洗浄した。タウタンパク質を化学発光ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって検出し、フュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）ＦＸ（Ｖｉｌｂｅｒ−Ｌｏｕｒｍａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）アナライザーを用いて定量した。タウの量を決定するために、Ｐ３０１Ｓ脊髄の起源元サルコシル不溶性画分に由来する標準物質タウの段階希釈を各ゲルにロードした。

【0184】

[0216]図７に示されるように、Ｐ３０１Ｓシードとｍｓ７Ｇ６とのプレインキュベーションは、ビヒクルと比較して、サルコシル不溶性タウレベルの有意な減少を示したが、対照ＩｇＧ、８Ｅ５、又は１Ｆ１とはそうではなかった。このことは、ｍｓ７Ｇ６が、作出された他の抗タウ抗体と比較して、この枠組みにおいて優れた抗体であることを示唆した。

【0185】

[0217]実施例８：インビボモデルにおけるＰ３０１Ｓシーディング及び伝播の検証
齧歯類前臨床モデルにおいて、病的タウの一方の脳領域から別の領域への任意の伝播が生じ得るかどうかを決定するために、同じシーディング実験を、実施例７に記載されるように、しかし一部の改変を有して、Ｐ３０１Ｓトランスジェニックマウスにおいて実施した。この場合、０．９ｍｇ／ｍＬの濃度の２０μＬの組み換えＰ３０１Ｓタウシードを、２．５〜３カ月齢のマウスの脳にＩＣＶ注射した。初回シード注射の２、４、又は６週間後のいずれかにマウスを屠殺し、脳を取り出し、海馬及び皮質の両方を保持した。上で記載されるように、サルコシル不溶性タウを調製し及び検出した。

【0186】

[0218]図８に示されるように、海馬では、シード注射後２〜４週間の間に不溶性タウレベルの急増が観察されたが、皮質では同じ時点でほんの低いレベルの不溶性タウしか観察されなかった。しかしながら、シード注射後４〜６週間の間に、シードなし対照群と比較して、不溶性タウのより大きな増加が皮質において観察された。このことは、このモデルにおいて、不溶性タウが皮質に先立って海馬において形成され得ることを示しており、二次的な伝播事象を示唆する。

【0187】

[0219]実施例９：Ｐ３０１Ｓシード注射インビボモデルにおける７Ｇ６の週１回末梢投薬の効果
ａ）実験１
Ｐ３０１ＳトランスジェニックマウスへのＰ３０１Ｓタウシード注射を、わずかな改変を有して実施例８に記載されるように実施した。タウシード注射の約７〜約４時間前に、マウスは、４０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ２ｂ対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）又はｍｓ７Ｇ６抗体のいずれかの投薬を腹腔内に受けた。各抗体は、１５０ｍＭ ＮａＣｌを有する２５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中に製剤化された。バッファーのみを受けた、ビヒクル処理対照群も含まれた。脳へのタウシード注射の後、マウスは、６週間の期間、抗体又はバッファーのさらなる投薬を週１回受けた。次いで、動物を屠殺し、脳組織を単離し、実施例７に記載されるように不溶性タウを調製し及び測定した。
ｂ）実験２
実験１（実施例９ａ）の精確な反復を実施した。

【0188】

[0220]ｃ）実験３
ｍｓ７Ｇ６の２つの投薬レベル２０及び４０ｍｇ／ｋｇが投与されるということを除いて、実験１（実施例９ａ）の反復を再度実施し、先の２つの実験にあるような６週間ではなく、シード注射の８週間後に動物を屠殺した。

【0189】

[0221]図９及び１０に示されるように、これら３つの実験は、ｍｓ７Ｇ６が、Ｐ３０１ＳトランスジェニックマウスにおけるＰ３０１Ｓ組み換えタウシードを用いたこのシード注射モデルにおいて、不溶性タウレベルの低下を引き起こし得ることを実証している。皮質において観察された低下は、抗体が病的タウ伝播を遅らせることができることを示唆する。ｍｓ７Ｇ６抗体は、変異体タンパク質のＰ３０１Ｓ部位に存在するＨＶＳＧＧ配列（配列番号１８４）（ａａ２９９〜３０３）には結合し得ないことが実施例４において確かめられた。まとめると、このことは、このインビボモデルにおけるｍｓ７Ｇ６のインビボ効果が、第４の反復領域（ａａ３６２〜３６６）内の残りのＨＶＰＧＧ（配列番号７９）エピトープにおけるタウへの結合によって推進されることを意味する。

【0190】

[0222]実施例１０：抗体のヒト化
１０Ａ． 材料＆方法
１０Ａ．ａ． インシリコモデリング
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ４．５を用いて、ｍｓ７Ｇ６ Ｆｖ領域の分子モデルを作出した。ｍｓ７Ｇ６可変重鎖（ＶＨ）及び可変カッパ（ＶＫ）ドメインに対して最も相同なタンパク質配列を有する上位１〜３の結晶構造を、「Ｃｒｅａｔｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｍｏｄｅｌｓ」機能を用いて２５個の相同モデルを作出するための鋳型として用いた。最も低いエネルギースコアを有するモデルを選択し、まず水素だけに対して、次いですべての原子に対してエネルギーを最小化した。マウス配列間で異なるフレームワーク残基（ＨＣｚｕ１及びＬＣｚｕ１）を強調し、ＣＤＲに最も近いもの又はＶＨ／ＶＫ界面におけるものを、ＣＤＲによるタウ結合を維持するために又は抗体安定性のために重要であることがある残基としてそれぞれ同定した。マウス配列間で異なるＣＤＲ残基（ＨＣｚｕ１及びＬＣｚｕ１）を強調し、ＣＤＲによるタウ結合を維持するために重要でなくてもよい残基を同定した。

【0191】

[0223]１０Ａ．ｂ． 遺伝子合成及びクローニング
１０Ａ．ｂ．１． インフュージョン（ＩｎＦｕｓｉｏｎ）（商標）クローニング
ヒト化重鎖及び軽鎖可変ドメインを、ＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。可変ドメインは、コザック翻訳開始配列及びＩｇ分泌リーダー配列を有して合成され、サブクローニングベクター内のクローニング部位に相同な１５塩基対を５’及び３’末端に含んだ。ＧｅｎｅＡｒｔによって合成されたＰＣＲフラグメントを、インフュージョン（商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ヒトガンマ又はカッパ定常領域を含有する発現プラスミドにサブクローニングした。すべてのクローンをシーケンスして、インサートの存在及び忠実度を確認した。

【0192】

[0224]１０Ａ．ｂ．２． クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）（商標）
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のクイックチェンジ（商標）ＸＬをメーカーのプロトコールに従って用いて、点変異を行った。すべてのクローンをシーケンスして、変異の存在を確認した。

【0193】

[0225]１０Ａ．ｃ． 細胞培養
１０Ａ．ｃ．１． ＨＥＫ一過性ｍＡｂ産生
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてトランスフェクトされる対象となる３×１０^６個細胞の各ミリリットルに対して、３３３．３ｎｇのＨＣプラスミド及び３３３．３ｎｇのＬＣプラスミドを５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）中で５〜１０分間インキュベートした。同じように、２．６７μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中でインキュベートした。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）溶液をＤＮＡ混合物に添加し、室温で２０〜３０分間インキュベートした。ＤＮＡ：ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）混合物を旋回させながら細胞に添加し、１２５ｒｐｍで振とうしながら３７℃、８％ＣＯ_２でインキュベートした。翌日、細胞のｍＬあたり５μＬのエンハンサー１及び５０μＬのエンハンサー２をトランスフェクションに添加し、もう７〜１０日間インキュベーションを続けた。４８〜７２時間後、細胞に１０ｇ／Ｌのイーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｍＭの吉草酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び１：１００のＣＤ脂質濃縮物（Ｔｈｅｒｍｏ）を最終濃度で供給した。

【0194】

[0226]１０Ａ．ｃ．２． ＣＨＯ一過性ｍＡｂ産生
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてトランスフェクトされる対象となる６×１０^６個細胞の各ミリリットルに対して、５００ｎｇのＨＣプラスミド及び５００ｎｇのＬＣプラスミドを４０μＬの総容量でＯｐｔｉ−ＰＲＯ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）中で混合した。同じように、３．２μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯを３６．８μＬのＯｐｔｉ−ＰＲＯ中で混合した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ溶液をＤＮＡ混合物に添加し、室温で１〜５分間インキュベートした。ＤＮＡ：ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ混合物を旋回させながら細胞に添加し、１２５ｒｐｍで振とうしながら３７℃、８％ＣＯ_２でインキュベートした。翌日、細胞のｍＬあたり６μＬのエンハンサー及び１６０μＬのフィードをトランスフェクションに添加し、細胞を３２℃、５％ＣＯ_２に移した。５日目に、細胞のｍＬあたりさらなる１６０μＬのフィードを添加した。１２〜１４日目に、上清を収穫した。

【0195】

[0227]１０Ａ．ｄ． ＭＡｂ精製
１０Ａ．ｄ．１． バッチ精製
プロセップ（Ｐｒｏｓｅｐ）（商標）−ｖＡ Ｈｉｇｈ ＣａｐａｃｉｔｙプロテインＡ樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はキャプチャーセレクト（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）（商標）カッパセレクト（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ）ＬＣ−カッパ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ）をＤＰＢＳで平衡化し、５０μＬを２ｍＬのサンプルに添加した。室温で１時間のインキュベーション後、培地及び樹脂をフィルタープレートに添加し、１ｍＬのＤＰＢＳで２回洗浄した。４００μＬの０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．９の添加、それに続く１５，０００×ｇで３０秒間の遠心分離によって、サンプルを樹脂から溶出した。サンプルを２０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。サンプルを、０．５ｍＬのアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）（商標）Ｕｌｔｒａ、１０ｋカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１５，０００×ｇで５分間遠心分離することによって約１００μＬに濃縮し、メーカーのプロトコールに従って０．５ｍＬのゼバ（Ｚｅｂａ）（商標）脱塩カラム７Ｋ ＭＷＣＯを用いてＤＰＢＳにバッファー交換した。

【0196】

[0228]１０Ａ．ｄ．２． カラム精製
ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓ精製プラットフォーム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製を実施した。最高１Ｌの馴化培地を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化された５ｍＬのマブセレクト（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）（商標）ＳＵＲＥカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ロードした後、安定したベースラインが観察されるまで、カラムを平衡化バッファーで大規模に洗浄した。結合した材料を、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．９を用いて溶出した。溶出された材料を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化された２６／１０ ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直ちにインジェクトし、同じバッファーに溶出した。ピーク画分をプールした。ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ）によってタンパク質含有量について、並びに還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について、材料を分析した。

【0197】

[0229]１０Ａ．ｅ． ２Ｎ４Ｒタウ結合ＥＬＩＳＡ
黒色Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレートを、ＤＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ（別様に示されていない限り）の組み換え野生型２Ｎ４Ｒタウで４℃にて一晩コーティングした。翌日、プレートを吸引し、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。ウェルを、アッセイバッファー（１％ｗ／ｖ ＢＳＡ［熱ショック画分、Ｓｉｇｍａ］、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０［ＢｉｏＲａｄ］、ＤＰＢＳ）とともに室温で１時間インキュベートした。アッセイバッファーを吸引し、上記のようにウェルを３回洗浄した。マイクロタイタープレートシェーカーで振とうしながら、ＤＰＢＳ中様々な濃度のｍＡｂを各ウェルに室温で１時間添加した。サンプルを吸引し、上記のようにウェルを３回洗浄した。ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪＩＲＬ １１５−０３５−１４６）、ｇｔ抗−ｈｕ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪＩＲＬ １０９−０３５−１２７）、又はストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＪＩＲＬ ０１６−０３０−０８４）を、アッセイバッファー中１：５０００に希釈し、ウェルに添加した。室温で１時間のインキュベーション及び振とうの後、サンプルを吸引し、上記のようにウェルを３回洗浄した。クォンタブル（Ｔｈｅｒｍｏ）を各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした。スペクトラマックス（商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、それぞれ３２０及び４６０ｎｍに設定された励起及び発光波長で相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定した。

【0198】

[0230]１０Ａ．ｆ． 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析
１０Ａ．ｆ．１． 抗ヒト／抗マウス捕捉単量体タウ結合アッセイ
１０Ａ．ｆ．１．ｉ． チップ調製
すべての実験を、ビアコア（商標）Ｔ−１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からの１０μＬの抗ヒトＩｇＧ（モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ）を、２００μＬの最終固定化バッファー（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中２５μＬ／ｍＬに希釈した。流速を５μＬ／分、流路１に設定した。５０μＬのＮ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）及び５０μＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ｃａｒｂｉｄｉｉｍｉｄｅ）（ＥＤＣ）を混合し、４２０秒間インジェクトしてＣＭ５チップ表面を活性化した。希釈された抗体を３６０秒間、それに続いて１Ｍエタノールアミンを４２０秒間インジェクトした。次いで、流路を流路２に切り替えた。新たなＥＤＣ／ＮＨＳ混合物を調製し、手順をフローセル２に対して反復した。３Ｍ ＭｇＣｌ_２の３０μＬ／分での流路１、２を用いた３０秒間の２回のインジェクションによって、表面を馴化した。抗マウス表面に関しては、マウス抗体捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からの１０μＬの抗マウスＩｇＧ（ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ）を、３２４μＬの最終固定化バッファー（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中３０μＬ／ｍＬに希釈した。流速を５μＬ／分、流路３に設定した。５０μＬのＮＨＳ及び５０μＬのＥＤＣを混合し、４２０秒間インジェクトしてチップ表面を活性化した。希釈された抗体を４２０秒間インジェクトした。１Ｍエタノールアミンを４２０秒間インジェクトした。流路を流路４に切り替えた。新たなＥＤＣ／ＮＨＳ混合物を調製し、手順をフローセル４に対して反復した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７の３０μＬ／分での流路３、４を用いた３０秒間の２回のインジェクションによって、表面を馴化した。
最終固定化レベルは、
フローセル１−１０，０００ＲＵ（抗ヒト）
フローセル２−１０，０９２ＲＵ（抗ヒト）
フローセル３−１１，８２４ＲＵ（抗マウス）
フローセル４−１１，２１６ＲＵ（抗マウス）
であった。

【0199】

[0231]１０Ａ．ｆ．１．ｉｉ． 結合アッセイ
結合アッセイに用いられたランニングバッファーはＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡであった。すべての抗体を、ＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡ（ランニングバッファーに用いられたものと同じ調製）中１μｇ／ｍＬに希釈し、１４，０００ｇにて室温で５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。分析物（タウ単量体２Ｎ４Ｒ ｗｔ、２．１５ｍｇ／ｍＬ、４７μＭ）をＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡ中１００ｎＭに希釈し、１４，０００ｇにて室温で５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。１００ｎＭ溶液をＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡに５倍段階希釈した。最終濃度は、１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．０３２ｎＭ、及び０ｎＭであった。ヒト化抗体を、６０秒間の添加時間（ｃｏｎｔａｃｔ ｔｉｍｅ）の間、１０μＬ／分の流速でフローセル２に捕捉した。マウス抗体を、６０秒間の添加時間の間、１０μＬ／分の流速でフローセル４に捕捉した。タウタンパク質の希釈液を、２４０秒間の添加時間の間、３０μＬ／分の流速で４つすべてのフローセルにわたってインジェクトした。その後に解離が９００秒間続いた。各サイクルの後、３Ｍ ＭｇＣｌ_２の３０μＬ／分での３０秒間のインジェクション（流路１、２）、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７の３０μＬ／分での３０秒間のインジェクション（流路３、４）、３Ｍ ＭｇＣｌ_２の３０μＬ／分での３０秒間のインジェクション（流路１、２）、それに続く１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７の３０μＬ／分での２回の３０秒間のインジェクション（流路３、４）によって、表面を再生した。ランの後、収集されたデータを、ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎを用いて、全濃度を用いた定常状態の結合モデルにフィットさせた。動態データフィッティングを、１００ｎＭトレースを除外した１：１ラングミュアモデルを用いて実施した（１００ｎＭトレースの包含は、許容できないほどに高いＸ^２値をもたらした）。２状態モデルを用いて、抗体結合データの部分集合も分析した。

【0200】

[0232]１０Ａ．ｆ．２． 抗ヒト捕捉単量体タウ結合アッセイ
１０Ａ．ｆ．２．ｉ． チップ調製
チップ調製を、ビアコア（商標）Ｔ−１００機器を用いて実施した。チップ調製を、固定化のための方法ウィザードを用いて実施した。ランニングバッファーはＨＢＳ−Ｐ＋であった。ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からの１５μＬの抗ヒトＩｇＧ（モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ）を、３００μＬの最終固定化バッファー（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中２５μＬ／ｍＬに希釈した。流速を５μＬ／分に設定した。３６０秒間のリガンド添加時間を用いて、４つすべてのフローセルに固定化を実施した。３Ｍ ＭｇＣｌ_２の３０μＬ／分での流路１、２、３，４を用いた３０秒間の２回のインジェクションによって、表面を馴化した。
最終固定化レベルは、
フローセル１−７３４１ＲＵ
フローセル２−７６８３ＲＵ
フローセル３−７５３０ＲＵ
フローセル４−６３０３ＲＵ
であった。

【0201】

[0233]１０Ａ．ｆ．２．ｉｉ． 結合アッセイ
結合実験を、ビオコア（ＢＩＯｃｏｒｅ）（商標）Ｔ−１００機器又はＴ−２００機器を用いて実施した。結合アッセイに用いられたランニングバッファーはＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡであった。すべての抗体を、ＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡ（ランニングバッファーに用いられたものと同じ調製）中２μｇ／ｍＬに希釈し、１４，０００ｇにて室温で５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。分析物（タウ単量体２Ｎ４Ｒ ｗｔ、２．１５ｍｇ／ｍＬ、４７μＭ）をＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡ中１００ｎＭに希釈し、１４，０００ｇにて室温で５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。１００ｎＭ溶液をＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡに５倍段階希釈した。最終濃度は、１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．０３２ｎＭ、及び０ｎＭであった。ヒト化抗体を、６０秒間の添加時間の間、１０μＬ／分の流速でフローセル２、３、及び４に逐次的に捕捉した。タウタンパク質の希釈液を、２４０秒間の添加時間の間、３０μＬ／分の流速で４つすべてのフローセルにわたってインジェクトした。その後に解離が９００秒間続いた。各サイクルの後、４つすべてのフローセルにわたる３Ｍ ＭｇＣｌ_２の３０μＬ／分で３０秒間の２回の逐次的インジェクションによって、表面を再生した。ランの後、動態データフィッティングを、１００ｎＭトレースを除外した１：１ラングミュアモデルを用いて実施した（１００ｎＭトレースの包含は、許容できないほどに高いＸ２値をもたらした）。

【0202】

[0234]１０Ａ．ｆ．３． ストレプトアビジン捕捉単量体タウ結合アッセイ
１０Ａ．ｆ．３．ｉ． 抗体調製
４００μｇの各抗体を２ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．５ｍＬのゼバ（商標）４０ｋＤａ ＭＷＣＯ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３にバッファー交換した。２０ｍＭ最終ストック濃度まで水に溶解することによって使用直前に調製されたＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンを、５：１モル比（ビオチン：ＭＡｂ）で抗体に添加し、室温で１時間コンジュゲートした。０．５ｍＬのゼバ（商標）４０ｋＤａ ＭＷＣＯ脱塩カラムを用いた、１×ＤＰＢＳへの２回の逐次的バッファー交換によって、過剰なビオチンを除去した。ビアコア（商標）アッセイに関しては、抗体を、ＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡ（ランニングバッファーに用いられたものと同じ調製）中２μｇ／ｍＬに希釈し、１４，０００ｇにて室温で５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。その後、インジェクション時間を、約２２５ＲＵの捕捉レベルを達成するように各抗体に対して決定した。

【0203】

[0235]野生型２Ｎ４Ｒタウタンパク質（２．１５ｍｇ／ｍＬ、４７μＭ）をＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡ中１００ｎＭに希釈し、１４，０００ｇにて室温で５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。２０ｎＭ溶液をＰＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡに５倍段階希釈した。最終濃度は、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、及び０ｎＭであった。

【0204】

[0236]１０Ａ．ｆ．３．ｉｉ． 結合アッセイ
用いられたバイオセンサーチップは、ビオチンキャプチャー（ＣＡＰｔｕｒｅ）（商標）キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ２８−９２０２−３４）からのＣＡＰチップであった。すべての実験を、Ｔ−１００機器を用いて実施した。ＣＡＰ試薬を、２μＬ／分の流速で５分間４つすべてのフローセル（流路１、２、３、４）に固定化した（最終ストレプトアビジンレベルは約３５００ＲＵであった）。ビオチン化ヒト化抗体、ビオチン化キメラ７Ｇ６、又はビオチン化マウスｍｓ７Ｇ６を、８０秒間〜１４６秒間の添加時間の間、１０μＬ／分の流速でフローセル２、３、及び４に逐次的に捕捉した（ビオチン化キメラ抗体添加時間は２４０秒間であった）。タウタンパク質の希釈液を、０ｎＭから２０ｎＭの順序で１８０秒間の添加時間の間、３０μＬ／分の流速で４つすべてのフローセルにわたってインジェクトした。最後のインジェクション（２０ｎＭタウ）の後、解離が９００秒間続いた。各サイクルの後、４つすべてのフローセルにわたる６ＭグアニジンＨＣｌ、０．２５Ｍ ＮａＯＨの１２０秒間の１０μＬ／分の１回のインジェクションによって、表面を再生した。２つの別個のフローセルにて二つ組で分析されたマウス７Ｇ６及び７Ｇ６−ｚｕＨＣ２５−ｚｕＬＣ１８（それぞれに対して合計４つの分析物）を除いて、サンプルを二つ組でアッセイした。ランの後、動態データフィッティングを、シングルサイクル動態を用いた１：１ラングミュアモデルを用いて実施した。

【0205】

[0237]１０Ａ．ｇ． サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
ＳＥＣ−ＨＰＬＣを、アドバンスバイオ（商標）ＳＥＣ ３００Ａ、２．７μｍ、４．６ｍｍ ＩＤ×５０ｍｍガードカラム、及びアドバンスバイオ（商標）ＳＥＣ ３００Ａ、２．７μｍ、４．６ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０クォータナリポンプＨＰＬＣシステムで実施した。０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）からなる移動相のアイソクラティックフローは０．３５ｍＬ／分であった。分離を周囲温度で行った。カラム流出物を２８０ｎｍでモニターした。各ランに対して、５０μｇのサンプル（１０μＬの５ｍｇ／ｍＬサンプル）をインジェクトし；各サンプルを２回分析した。ピーク積分をＡｇｉｌｅｎｔ ＯｐｅｎＬＡＢソフトウェアを用いて実施した。保持時間、ピーク高、ピーク面積、ピーク幅、及びピーク対称性が報告された。凝集体及び単量体のパーセンテージは、ピーク面積に基づいて算出された。

【0206】

[0238]１０Ａ．ｈ． 示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析
ＶＰキャピラリー示差走査熱量測定器（ＶＰ−ＣａｐＤＳＣ；Ｏｒｉｇｉｎ−７グラフ及びＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣソフトウェアｖ．２．０を有する、ＭｉｃｒｏＣａｌ、ＶＰ−ＣａｐＤＳＣ、ｓ／ｎ １２−０７−１４９）を用いて、様々なＦ（ａｂ’）_２フラグメント及び対照の高次構造及び熱安定性を解読し及び比較した。サンプルを周囲温度に３０分間順化させ、その後にボルテックスが続いた。サンプル全体（０．４〜０．５ｍＬ）を、アッセイプレート（Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ、９６ウェル、５００μＬ、丸いウェル及び底、カタログ＃０７−２１００；Ｓｕｎ Ｓｕｒｉプレートカバー、カタログ＃３００−００５）の適当なウェルに添加した。０．５ｍＬの２０％コントラッド溶液及び０．５ｍＬの水を、アッセイプレートの適当なウェルに添加した。密封されたプレートを１０℃のオートサンプラーに入れた。

【0207】

[0239]ランはプログラム化され、以下のアッセイパラメーターを用いて始動された。
ＤＳＣ対照：
開始温度＝２５℃
最終温度＝１００℃
走査速度＝１００℃／時間
再スキャンの数＝０
再スキャン冷却速度＝ＥＸＰ
プレスキャンサーモスタット＝１０分間
ポストスキャンサーモスタット＝５分間
ポストサイクルサーモスタット＝２５℃
濾過時間＝１０秒間
セル自動充填＝３０℃
フィードバックモード／ゲイン＝なし
固有のスキャン
サンプルパラメーター：
濃度＝ｍＭ
ファイルパラメーター＝オート＃
リンスステーション＝ウォッシュ２を選択（従って、ウォッシュ２（１×ＰＢＳ）、次いでウォッシュ１（水）を選択する）
サーモスタット対照設定点＝２５℃
パルス対照：
パルスサイズ＝−３
継続時間＝６００
パルスオフ
Ｙ軸目盛単位＝ｍＣａｌ／分
２５〜７０℃、１００℃／時間でコントラッド／コントラッドを用いたインラインクリーニング、それに続く２回のバッファー／バッファーインジェクション

【0208】

[0240]１０Ｂ． 結果
１０Ｂ．ａ． ＩＧＨＶ１／ＩＧＫＶ２ヒト化
１０Ｂ．ａ．１ ７Ｇ６インシリコモデリング
マウスｍｓ７Ｇ６ ｍＡｂに最も相同なヒト生殖系列可変ドメインタンパク質配列を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉでＢＬＡＳＴを用いて検索した。ＩＧＨＶ１−４６^＊０３及びＩＧＫＶ２−３０^＊０２可変ドメインファミリーが、ｍｓ７Ｇ６に最も相同な配列であった（図１１）。マウスフレームワーク配列を、最も近い相同なヒト生殖系列配列で置き換えて、ＣＤＲ移植ヒト化バリアントを作出した。

【0209】

[0241]マウス配列及びＣＤＲ移植配列を用いて、可変ドメインのインシリコモデルを作出した。マウス及びヒト化モデルの理論構造を重ね合わせ、ＣＤＲに近接している残基を、ＣＤＲループの全体構造に対する潜在的な構造的影響について分析した。種々の残基のほとんどは、二量体界面に位置していない又はＣＤＲの遠位にあるものの、いくつかの残基は、ＣＤＲに近接している（５Å以内）ことが見い出された。

【0210】

[0242]Ｖκドメインにおいて、マウスＴｙｒ３６におけるヒドロキシル基は、ＣＤＲＨ３におけるＴｒｐ１００と潜在的水素結合を形成した。ヒトＰｈｅ３６はこの水素結合を喪失しており、この喪失はＣＤＲＨ３の構造完全性に影響を及ぼすことがある。ヒトＡｇｒ４６はマウスＬｅｕ４６よりもはるかに大きく、Ａｒｇ４６はＣＤＲの適正なフォールディングを立体的に妨げることがある。同様に、Ｖｈドメインにおいて、位置７１はＣＤＲを背にして配置した。ヒトＡｒｇ７１は、マウスＶａｌ７１と比較して、ＣＤＲの適正なフォールディングを立体的に妨げることがある。ヒトＶａｌ７８は同様に配置し、マウスＡｌａ７８よりも大きい。したがって、Ｖａｌ７８はＣＤＲの完全性に影響を及ぼすことがあるが、その可能性は低かった。

【0211】

[0243]マウスｍｓ７Ｇ６抗体は、凝集、酸化、システイニル化（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、又はグルタチオン化をもたらすことに寄与し得るであろう遊離チオールの存在に起因してｍＡｂの開発において問題のあることがある２つの不対システインを含有した。１つのＣｙｓはＣＤＲＨ２における位置５７に、２つ目はＦＷＲＬ２における位置４９に位置した。

【0212】

[0244]ＣＤＲＨ２のＫａｂａｔ定義は、ＩＭＧＴ定義よりも８個長くＣ末端アミノ酸を伸ばす。終わりの８個のアミノ酸を、それらの近接性及び抗原結合への潜在的寄与について分析した。Ａｓｎ５８は、可変ドメインの上部にある潜在的ＣＤＲ−抗原界面における潜在的抗原結合部位内にあった。マウス及びヒト生殖系列配列の間で異なる残基６０、６１、６４、及び６５は、潜在的抗原結合部位の外側にあり、抗原と直接接触する又は適正なＣＤＲフォールディングのための構造的支持を提供する可能性が低かった。

【0213】

[0245]１０Ｂ．ａ．２． ヒト化Ｖｈ１及びＶκ２バリアント、並びにＥＬＩＳＡによるタウ結合についての分析
生殖系列可変ドメインＶｈ１及びＶκ２ファミリーを用いて一連のヒト化変異体を作出して、ＣＤＲ−抗原相互作用に重要であるとインシリコモデリングによって予測された位置におけるマウス残基の重要性を評価した（図１２）。ヒト化及びマウス７Ｇ６残基を、様々な組み合わせ（７Ｇ６−ＨＣｚｕ１〜４）並びにＣ５７Ｓ変異（７Ｇ６−ＨＣｚｕ５）におけるＶｈ位置６０、６１、６４、６５、７１、及び７８で分析した。ｍｓ７Ｇ６ Ｖκにおける位置３６、４６、及び４９におけるヒト及びマウス残基の組み合わせ（７Ｇ６−ＬＣｚｕ１〜５）、並びにＣ４９Ｓ変異（７Ｇ６−ＬＣｚｕ６）も分析した。ｍＡｂを行列形式で発現させ、それにより、７Ｇ６−ＨＣｚｕ５は７Ｇ６−ＬＣｚｕ２とのみ共発現させ及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ６は７Ｇ６−ＨＣｚｕ３とのみ共発現させたことを除いて、ヒト化ＨＣ及びＬＣのあらゆる組み合わせを共トランスフェクトした。

【0214】

[0246]タウへの直接結合を試験するために、２Ｎ４Ｒタウを９６ウェルプレートにコーティングし、様々な濃度のヒト化ｍＡｂをウェルに添加した。タウに結合したｍＡｂを、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体（マウス［ｍｓ］７Ｇ６）又は抗ヒト抗体（残りのサンプル）のいずれかで検出した。サンプルを、２Ｎ４Ｒタウをコーティングした９６ウェルプレート中で室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス又は抗ヒト検出抗体をウェルに添加した。抗マウス抗体を用いてｍｓ７Ｇ６を検出した。各ウェルにおけるＨＲＰ活性の量をクォンタブル蛍光基質によって測定し、ＲＦＵをスペクトラマックスＭ５プレートリーダーによって検出した。

【0215】

[0247]一番下のグラフにグループ分けされているシステイン変異体を除いて、ＬＣバリアントに従ってグループ分けされたサンプルからのデータが、図１３Ａ〜１３Ｆに示されている。７Ｇ６ ＨＣ及びＬＣバリアントのすべての間で、タウ結合の差はほとんどなかった（図１３Ａ〜Ｆ；表３）。ｍｓ７Ｇ６はヒト化バリアントよりも良好な結合を示したが、この結果は、マウス及びヒトサンプル間の異なる検出抗体に起因した誤解を与えるものである可能性があることに留意すべきである。ｍＡｂ２は、タウに結合しない対照ＩｇＧ抗体に相当する。

【0216】

【表3】

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【0217】

[0248]任意の潜在的免疫原性を低下させるために、ヒト残基の数を増加させながらもう一連の変異体を作出した（７Ｇ６−ＨＣｚｕ６、７Ｇ６−ＨＣｚｕ７、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８；図１２）。Ｖｈ Ｓｅｒ５７はＣｙｓ５７への結合の差をほとんど示さなかったことから、変異体のほとんどはＳｅｒ５７を含有した。セリンが位置５７におけるシステインに対する実行可能な置換であることをさらに確認するために、位置５７のみで異なる２組の変異体ペアを作出した（７Ｇ６−ＨＣｚｕ７と７Ｇ６−ＨＣｚｕ９、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８と７Ｇ６−ＨＣｚｕ１０；図１２）。

【0218】

[0249]ヒト残基Ｔｙｒ４９がＣｙｓ４９に対する実行可能な置換であるかどうかを決定するために作製された７Ｇ６−ＬＣｚｕ１０を除いて、すべてのＶκバリアントをＳｅｒ４９を有して操作した。７Ｇ６−ＬＣｚｕ７は、Ｓｅｒ４９を有することを除いて、７Ｇ６−ＬＣｚｕ１及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ３に類似していた。またＳｅｒ４９を有して、７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１は７Ｇ６−ＬＣｚｕ５に類似しており、７Ｇ６−ＬＣｚｕ２２は７Ｇ６−ＬＣｚｕ４に類似していた。７Ｇ６−ＬＣｚｕ８は、位置３０におけるヒト残基がタウ結合を保持するかどうかを決定するために、位置３０にバリンを有した。位置３４は構造内にいくらか埋め込まれており、位置３４は抗原結合に寄与しない可能性があり、したがって、ＣＤＲＬ１の末端におけるヒト残基Ａｓｎ３４を７Ｇ６−ＬＣｚｕ９内に操作した。すべてのＨＣバリアントを７Ｇ６−ＬＣｚｕ６と共発現させ、すべてのＬＣバリアントを７Ｇ６−ＨＣｚｕ５と共発現させた。

【0219】

[0250]タウ結合を、上記のように直接ＥＬＩＳＡによって分析した。サンプルを、野生型２Ｎ４Ｒタウをコーティングした９６ウェルプレート中で室温にて１時間インキュベートした。洗浄ステップの後、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス又は抗ヒト検出抗体をウェルに添加した。抗マウス抗体を用いてｍｓ７Ｇ６を検出した。各ウェルにおけるＨＲＰ活性の量をクォンタブル蛍光基質によって測定し、ＲＦＵをスペクトラマックスＭ５プレートリーダーによって検出した。ｍＡｂの大多数は、直接ＥＬＩＳＡアッセイにおいてタウ結合の差をほとんど示さなかった（図１４；表４）。注目すべき例外は、最も高い濃度でさえ結合を呈しなかったＬＣｚｕ９であった。したがって、Ｖκ Ｇｌｕ３４は抗原結合に重大であった。加えて、ＬＣｚｕ２２は結合の低下を示し；Ａｒｇ４６と組み合わせたＶκ Ｔｙｒ３６は、抗原結合部位の妨害をもたらした。

【0220】

【表4】

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【0221】

[0251]ヒト化及びマウス抗体の結合を、表面プラズモン共鳴（ビアコア（商標））によって分析して、それら抗体の相対的会合速度（ｋ_ａ）、解離速度（ｋ_ｄ）、及び平衡結合定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。抗マウス又は抗ヒト抗体をＣＭ５チップに固定化し、サンプルｍＡｂをチップに捕捉した。２Ｎ４Ｒタウをチップにわたって流し、結合を観察した。１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いて、結合定数ｋ_ａ、ｋ_ｄ、及びＫ_Ｄを決定した。ハイブリドーマに由来するｍｓ７Ｇ６抗体、又はＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂ組み換え材料は、会合又は解離速度の差を示さなかった（表５）。７Ｇ６ ＨＣバリアントの間で、ほんのわずかな差しかなく、システインからセリンへの変異はタウ結合に影響を及ぼさなかった。７Ｇ６−ＬＣｚｕ２、ＬＣｚｕ６、ＬＣｚｕ７、ＬＣｚｕ８、及びＬＣｚｕ２１はタウに同程度に結合し、これらｍＡｂの間で異なるアミノ酸が結合にほとんど影響を与えないことを実証した。ヒト化サンプルは、マウスｍＡｂよりもタウへの良好な結合を示したが、これは、このアッセイ形式において異なる捕捉抗体を用いる必要性に起因する可能性が最も高かった。

【0222】

【表5】

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【0223】

[0252]これらのデータは、ＥＬＩＳＡアッセイからのデータとともに、７Ｇ６ Ｖκ Ｇｌｕ３４の要求、並びに７Ｇ６ Ｖκ Ｔｙｒ３６及びＡｒｇ４６の有害な組み合わせを実証した。ＬＣｚｕ６における７Ｇ６ Ｖκ残基Ｔｙｒ３６及びＬｅｕ４６は、７Ｇ６−ＬＣｚｕ７及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ８におけるヒトＰｈｅ３６及びＡｒｇ４６残基よりもわずかに好まれたが、これらの位置においてヒト残基を保持することは、ｋ_ｄのわずかな低下よりも価値があった。７Ｇ６−ＬＣｚｕ１０におけるヒトＶκ Ｔｙｒ５７は、ｋ_ｄに対して有意な影響を有した。

【0224】

[0253]１０Ｂ．ａ．３． Ｖｈ１及びＶκ２バリアントに対するＨＣ／ＬＣ安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
２マイクログラムの各ｍＡｂを４×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファーと混合し、ＭＯＰＳバッファー中にて非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。ゲルをインスタントブルー（商標）で染色し、水で脱染した。ＬＣにおいてＣｙｓ４９を有するすべてのｍＡｂ（７Ｇ６−ＬＣｚｕ２、７Ｇ６−ＬＣｚｕ３、７Ｇ６−ＬＣｚｕ４、及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ５）は安定ではなく、非還元条件下で、ＨＣ−ＨＣ−ＬＣ三量体、ＨＣ−ＨＣ二量体、及び遊離ＬＣがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された（図１５）。７Ｇ６−ＬＣｚｕ２は、Ｖｈ−Ｖκ相互作用を安定化する２つの追加のマウス残基Ｔｙｒ３６及びＬｅｕ４６を有するこのＶκにおそらく起因して、より少ないより低分子量の種を有した。７Ｇ６−ＬＣｚｕ３、７Ｇ６−ＬＣｚｕ４、及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ５は、ヒトＰｈｅ３６及び／又はＡｒｇ４６に変化したこれらの残基の一方又は両方を有した。最も安定でないｍＡｂは、両方のヒト残基を有するＬＣｚｕ３バリアントであった。７Ｇ６−ＬＣｚｕ７、７Ｇ６−ＬＣｚｕ８、７Ｇ６−ＬＣｚｕ９、及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ２２は、少量の遊離軽鎖を有し、これらのサンプルにおけるＨＣとＬＣとの相互作用が最適ではないことがあり、ＨＣ−ＬＣ鎖間ジスルフィド結合を形成しない少量の抗体をもたらすことを示唆した。７Ｇ６−ＬＣｚｕ３と同様に、これらＬＣバリアントは、一方又は両方の位置３６及び４６にヒト残基を有する。７Ｇ６−ＬＣｚｕ１０及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１も、これらの位置にヒト残基を有するが、おそらくインスタントブルー（商標）染色による不完全な染色の結果、遊離ＬＣは見られなかった。

【0225】

[0254]１０Ｂ．ｂ ＩＧＨＶ３／ＩＧＫＶ１ヒト化
１０Ｂ．ｂ．１ ヒト化Ｖｈ３及びＶκ１バリアント、並びにＥＬＩＳＡによるタウ結合についての分析
上で述べられたヒト化７Ｇ６バリアントは、ｍｓ７Ｇ６へのそれらの類似性に基づいて選定されたヒト生殖系列可変ドメインファミリーＩＧＨＶ１及びＩＧＫＶ２を利用した。しかしながら、これらのファミリーはヒト集団において過小評価されており、それによって、ヒト化バリアントが患者において免疫原性であろう機会を増加させている（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋ ＨＰ、Ｆｏｓｔｅｒ ＳＪ、Ｄｏｒｎｅｒ Ｔ、Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋ ＲＩ、Ｌｉｐｓｋｙ ＰＥ．Ｐａｉｒｉｎｇ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｋａｐｐａ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｎａｉｖｅ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８年５月１５日；１６０（１０）：４７６２〜７；Ｊａｙａｒａｍ Ｎ、Ｂｈｏｗｍｉｃｋ Ｐ、Ｍａｒｔｉｎ ＡＣ．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｖｈ／ＶＫ ｐａｉｒｉｎｇ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１２年１０月；２５（１０）：５２３〜９；Ｔｉｌｌｅｒ Ｔ、Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ｉ、Ｄｅｐｐｅ Ｄ、Ｓｉｅｇｅｒｓ Ｋ、Ｓｔｒｏｈｎｅｒ Ｒ、Ｈｅｒｒｍａｎｎ Ｔ、Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒ Ｍ、Ｐｏｕｊｏｌ Ｄ、Ｓｔｅｈｌｅ Ｊ、Ｓｔａｒｋ Ｙ、Ｈｅβｌｉｎｇ Ｍ、Ｄａｕｂｅｒｔ Ｄ、Ｆｅｌｄｅｒｅｒ Ｋ、Ｋａｄｅｎ Ｓ、Ｋｏｌｌｎ Ｊ、Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒ Ｍ、Ｕｒｌｉｎｇｅｒ Ｓ．Ａ ｆｕｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｆｉｘｅｄ Ｖｈ／ＶＫ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｐａｉｒｉｎｇｓ ｗｉｔｈ ｆａｖｏｒａｂｌｅ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ＭＡｂｓ．２０１３年５月〜６月；５（３）：４４５〜７０）。したがって、ｍｓ７Ｇ６ ＣＤＲを、より共通したＩＧＨＶ３及びＩＧＫＶ１ファミリーに移植した（図１６）。

【0226】

[0255]前述のｍｓ７Ｇ６のインシリコモデルを、ＣＤＲに近接している（５Å）ヒト残基について、上記のように分析した。Ｖｈにおける位置４９、７１、７６、７８、及び９４での、並びにＶκにおける位置２及び５７でのヒト残基は、潜在的に重大なフレームワーク残基として同定された。Ｖｈ及びＶκの２つのヒト化バリアントを作出し、一方はすべてのヒトフレームワーク残基を有し（７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１；７Ｇ６−ＬＣｚｕ１１）、及び一方は復帰突然変異した潜在的に重大な残基を有した（７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２；７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２）（図１７）。両ＨＣを両ＬＣと共発現させた。

【0227】

[0256]上記のように、２Ｎ４Ｒタウを９６ウェルプレートにコーティングし、様々な濃度のヒト化ｍＡｂをウェルに添加した。タウに結合したｍＡｂを、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体（ｍｓ７Ｇ６）又は抗ヒト抗体（残りのサンプル）のいずれかで検出した。すべてのヒト化ｍＡｂはタウに同程度に結合したが、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２−ＬＣｚｕ１２ ｍＡｂは、最低のＥＣ５０を有した（図１８＆表６）。両マウスｍＡｂは、マウス及びヒトサンプル間で用いられた異なる検出抗体におそらく起因して、ヒト化バリアントよりも良好な結合を示した。これらのデータは、ＣＤＲに近接しているヒト残基の少なくとも一部が、抗原結合に負の影響を及ぼすことを示唆する。

【0228】

【表6】

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【0229】

[0257]潜在的免疫原性を低下させるために、ヒト残基の数を増加させながらもう一連の変異体を作出した。ＣＤＲＨ２のＣ末端半分における残基は、Ｖｈ１に基づくバリアント７Ｇ６−ＨＣｚｕ４においてタウ結合にほとんど影響を有しなかった。したがって、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１３、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１４、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１９、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２０において、これらの残基をＶｈ３生殖系列残基に変化させた（図１７）。インシリコｍｓ７Ｇ６モデルに基づき、抗原結合に対する重要性が増加すると思われる順序で、マウス残基をヒトと置き換えるように、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２のバリアントを作製した。例えば、Ｓｅｒ７６の側鎖は、ＣＤＲから見て外側に向いているループにあり、ＣＤＲ−抗原相互作用に影響を与える可能性が最も低い残基であった。したがって、Ｓｅｒ７６は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１５においてヒト残基Ａｓｎ７６に変化させる対象となる第１の残基であった。次に残基４９（７Ｇ６−ＨＣｚｕ１６）、次いで７８（７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７）、７１（７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８）、及び最後に９４（７Ｇ６−ＨＣｚｕ２０）を変異させた。

【0230】

[0258]７Ｇ６−ＬＣｚｕ１１と７Ｇ６−ＬＣｚｕ１２との間にほとんど差はなく、位置２及び５７におけるヒト残基は抗原結合にほとんど影響を有しないであろうと予想された。したがって、これら残基のそれぞれを一度に１つずつ変異させた。位置５７に関しては、チロシン及びセリン置換を分析した。位置３０におけるバリンを、７Ｇ６−ＬＣｚｕ１６及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ１７に導入した。ＣＤＲＬ１の末端におけるヒト残基Ａｓｎ３４を７Ｇ６−ＬＣｚｕ１７内に操作した。すべてのＨＣバリアントを７Ｇ６−ＬＣｚｕ１２と共発現させ、すべてのＬＣバリアントを７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２と共発現させた。

【0231】

[0259]ｍＡｂの大多数は、直接ＥＬＩＳＡアッセイにおいてタウ結合の差をほとんど示さなかった（図１９＆表７）。注目すべき例外は、最も高い濃度でさえ結合を呈しなかったＬＣｚｕ１７であった。したがって、Ｖκ Ｇｌｕ３４は抗原結合に重大であった。

【0232】

【表7】

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【0233】

[0260]１０Ｂ．ｂ．２ Ｖｈ３及びＶκ１バリアントに対するタウ親和性についてのビアコア（商標）分析
ヒト化及びマウス抗体の結合を、ビアコア（商標）によって分析して、それら抗体の相対的会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び平衡結合定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。抗マウス又は抗ヒト抗体をＣＭ５チップに固定化し、サンプルｍＡｂをチップに捕捉した。２Ｎ４Ｒタウをチップにわたって流し、結合を観察した。１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いて、結合定数ｋ_ａ、ｋ_ｄ、及びＫ_Ｄを決定した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２に基づく両ｍＡｂは、同程度のｋ_ａ及びｋ_ｄ値を有した（表８）。しかしながら、ｋ_ｄは影響を受けなかったものの、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１のｋ_ａは減少した。したがって、Ｖｈ３フレームワークにおけるヒト残基は、タウへの結合に影響を与える。ＥＬＩＳＡアッセイと同様に、７Ｇ６−ＬＣｚｕ１７はタウに結合しなかった。７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１３、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１４の間でのｋ_ｄの差は、ＣＤＲＨ２ Ｃ末端ヒト残基が、抗原結合に負の影響を有することを示唆する。ｋ_ｄの減少は、また当該領域においてヒト残基を有する７Ｇ６−ＨＣｚｕ１９及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２０に対して観察されなかったが、しかしながらこれらのｍＡｂはｋ_ａの減少を有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ１５はチップにあまりよく結合せず、このｍＡｂからのデータは疑問の余地があった。単一のＳ７６Ｎ変異に関する特異的なデータは入手不能であったものの、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１６、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８に対するｋ_ａ及びｋ_ｄ値は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２と同程度であり、Ｓ７６Ｎ変異がタウ結合に影響を及ぼさないであろうことを示唆した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２０に対するｋ_ａは７Ｇ６−ＨＣｚｕ１９よりも低く、Ｋ９４Ｒ変異の結果であることもある。したがって、位置４９、７１、７６、及び７８におけるヒト残基は、タウ結合に影響を及ぼさないように見えた。ヒト化サンプルは、マウスｍＡｂよりもタウへの良好な結合を示したが、これは、このアッセイ形式において異なる捕捉抗体を用いる必要性に起因する可能性が最も高かった。

【0234】

【表8】

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【0235】

[0261]Ａｓｎ３４に起因してタウに結合しなかった７Ｇ６−ＬＣｚｕ１７を除いて、いずれの７Ｇ６ ＬＣバリアントに対するｋ_ａ又はｋ_ｄ値の間にもほとんど差はなかった。したがって、ヒトＩｌｅ２は、抗原結合に対して効果を有しなかった。システイン、セリン、及びチロシンのすべては、位置５７において許容されるように見えた。位置３０におけるバリンは、タウ結合に影響を有しなかった。

【0236】

[0262]１０Ｂ．ｂ．３ Ｖｈ３及びＶκ１バリアントに対するＨＣ／ＬＣ安定性についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
２マイクログラムの各ｍＡｂを４×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファーと混合し、ＭＯＰＳバッファー中にて非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。ゲルをインスタントブルーで染色し、水で脱染した。より多くのヒト７Ｇ６−ＨＣｚｕ１１が、とりわけより少ないヒト７Ｇ６−ＬＣｚｕ１２と対合した場合に、ＨＣ−ＬＣ二量体及び遊離ＨＣをもたらした（図２０Ａ）。さらに、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１９は、意味のあるフラグメントを示した（図２０Ｂ及び２０Ｃ）。これら２つの抗体は、位置７１において他と異なる。したがって、ヒト残基Ａｒｇ４１は、タウ結合には影響を与えないものの、ＨＣ−ＬＣ相互作用の不安定化に寄与した。すべてのＬＣバリアントは、抗体フラグメントを示さなかった。上で分析されたＶｈ１−Ｖκ２とは対照的に、Ｃｙｓ４９は、ＨＣ−ＨＣ−ＬＣ三量体、ＨＣ−ＨＣ二量体、又は遊離ＬＣをもたらさなかった。

【0237】

[0263]１０Ｂ．ｃ． ヒト化抗体のスクリーニング
配列のヒト性、ビアコア（商標）親和性データ、及びＩＧＨＶ１／ＩＧＫＶ２ヒト化からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ安定性データに基づき、タウに対する最も高い親和性を有する最もヒト性の高い配列として、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８を選定した。７Ｇ６−ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける同等の安定性及びタウに対する親和性を有したが、位置３６において１つのアミノ酸だけ異なった。両軽鎖を７Ｇ６−ＨＣｚｕ８と共発現させる対象として選定して、ＩＧＨＶ１／ＩＧＫＶ２に基づく最良のｍＡｂを決定した。

【0238】

[0264]最もヒト性の高い、最も高い親和性の、且つ最も安定なＩＧＨＶ３及びＩＧＫＶ１バリアントに対して別ラウンドの突然変異誘発を実施して、それぞれ位置５７及び４９における不対システインを除去した。最も高い親和性を有する最もヒト性の高いフレームワーク残基として、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８を選定した。ＣＤＲＨ２のＣ末端部分にヒト残基を導入することによって７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８を超ヒト化して７Ｇ６−ＨＣｚｕ２１を作出したが、親和性は決して分析されなかった。７Ｇ６−ＨＣｚｕ１８、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２１、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７はすべて、位置５７においてシステインを含有しており、３つすべてのバリアントにおける位置５７にセリンを導入して、それぞれ７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５を作出した（図１７）。７Ｇ６−ＬＣｚｕ１４及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ１５は、最も高い親和性を有する最もヒト性の高いＶκ配列であった。７Ｇ６−ＬＣｚｕ１４はＣｙｓ４９を保持し、したがって変異させて不対システインを除去し、７Ｇ６−ＬＣｚｕ１８と命名した。各ＩＧＨＶ３ ＨＣを、各ＩＧＫＶ１ ＬＣと対合させた。

【0239】

[0265]１０Ｂ．ｃ．１ インタクト質量分析
各ｍＡｂの質量をＥＳＩ−ＭＳによって分析して、理論的質量が、観測された質量と合致することを確認した。ｍＡｂをＩｄｅＳで消化してＦ（ａｂ’）_２フラグメントを作出し、その後に、２ｍＭ ＤＴＴを用いた還元、及び６０℃で３分間の加熱が続いた。Ｆｄ（Ｖｈ−ＣＨ１）及びＬＣフラグメントの質量をＥＳＩ−ＭＳによって分析した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８は、Ｎ末端グルタミンの典型的な翻訳後修飾であるＮ末端ピログルタミン酸を含有した。すべての観測された質量は、予測された質量の３ダルトン以内であった（表９）。

【0240】

【表9】

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【0241】

[0266]１０Ｂ．ｃ．２ タウ結合ビアコア（商標）アッセイ
ヒト化ｍＡｂに対するタウ結合を、２つの異なる形式のビアコア（商標）によって分析した。第１の形式は上記のように実施され、すなわちｍＡｂを、固定化された種特異的抗Ｆｃ抗体で捕捉した。この形式の限界は表５及び８に見られ、親マウス及びヒト化ｍＡｂの親和性は、捕捉抗体の違いに起因して直接比較され得ない。第２の形式では、ビオチン化ｍＡｂを、ストレプトアビジンがコーティングされたチップに捕捉した。この後者の形式は、捕捉方法が同一であることから、ヒト化及び親マウス抗体の間のタウ結合親和性の直接比較を可能にした。

【0242】

[0267]１０Ｂ．ｃ．２．ｉ Ｆｃ特異的補足
最終的なヒト化ｍＡｂをビアコア（商標）によって分析して、上記のようにタウへの結合に関するｋ_ａ、ｋ_ｄ、及びＫ_Ｄを決定した（表１０）。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３から７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４にオフ速度（ｋ_ｄ）の有意な変化があったが、一方で７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５と同程度であり、このことは全体的親和性Ｋ_Ｄにおいても同様に見られた。このことは、上記の表７に見られるように、ＣＤＲＨ２においてマウス残基を保持することの重要性を裏付けた。

【0243】

【表10】

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【0244】

[0268]１０Ｂ．ｃ．２．ｉｉ ストレプトアビジン捕捉
ビオチン化されたヒト化及びマウスｍＡｂを、ストレプトアビジンがコーティングされたチップに捕捉し、ｋ_ａ、ｋ_ｄ、及びＫ_Ｄをタウへの結合について決定した（表１１）。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６と比較して親和性のわずかな下降（＜２倍）を示した。同様に、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３バリアントは、表１１に見られるように、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ ｍＡｂと比較して親和性の約２倍の下降を有した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１５、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４−ＬＣｚｕ１８、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の親和性は、すべて同程度であった。全体として、これらの抗体は、ｍｓ７Ｇ６と比較して親和性の約１．４倍の下降を示し、ヒト化形態に対するわずかにより速いオフ速度に主に反映した。

【0245】

【表11】

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【0246】

[0269]１０Ｂ．ｃ．３ ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる均質性及び凝集についての分析
各ｍＡｂをＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析して、溶液中でのｍＡｂの均質性を決定した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１ ｍＡｂのプロファイルは同一であり、１４．５分の時点に主たるピーク、及び１６分を超えて考え得る産物不均質性を示唆する幅広のショルダーを有した（図２１Ａ）。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ ｍＡｂのプロファイルは同一であり、１４．７分辺りにタイトなピークを有した（図２１Ｂ）。

【0247】

[0270]１０Ｂ．ｃ．４ ＤＳＣ分析
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの熱融解曲線を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析した。キメラ、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ Ｆ（ａｂ’）２のプロファイルは、対照の非タウ結合ヒトＩｇＧ１抗体ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似していた。しかしながら、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの不安定性、おそらくＨＣ−ＬＣ相互作用の解離を示す、第２のピークを含有した（図２２Ａ〜Ｌ）。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ２１、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１５、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の転移中点は同程度であり、７７．４〜７７．６℃に及んだ。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６の中点は、７８．６℃で１度高かった（表１２）。

【0248】

【表12】

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【0249】

[0271]１０Ｂ．ｄ Ｔ細胞エピトープ分析
ヒト化配列は、潜在的な免疫反応性Ｔ細胞エピトープについてＳｔｅａｌｔｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによってインシリコで分析された。各可変領域生殖系列ファミリーに対する２つの配列を分析し、それぞれは種々の量のヒト及びマウス残基を含有した。ｍＡｂ１−２ａ及びｍＡｂ１−２ｂはＩＧＨＶ１−４６ａ／ＩＧＫＶ２−３０ａを表し、ｍＡｂ３−１ａ及びｍＡｂ３−１ｂはＩＧＨＶ３−２３ｂ／ＩＧＫＶ１−３９ｂを表した。各可変ドメインに対して４つの配列のみが分析されたが、試験されたヒト化ｍＡｂに存在するすべての潜在的Ｔ細胞エピトープが表された。ヒト生殖系列配列の５％を上回る割合との同一性を有するペプチドエピトープを、１つのみ又は２つのＨＬＡアレルに結合するペプチドがそうであるように、より低いリスクと考えた。

【0250】

[0272]図２３及び２４は、ｍＡｂに存在するエピトープについての分析を要約している。表におけるペプチドは、ヒト生殖系列配列と５％又はそれ未満の同一性を有するとして同定された。可変ドメイン生殖系列配列に対するペプチドの相同性パーセントも考慮に入れた。可変領域生殖系列配列と約５％若しくはそれ未満の相同性を有する、及び／又は３つ若しくはそれを上回る数のＨＬＡアレルに結合すると予測されるペプチドを、より高いリスクとして同定した（灰色で強調されている）。

【0251】

[0273]７Ｇ６−ＨＣｚｕ８及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５は両方とも、３つのアレルに結合する生殖系列配列との相同性を有しない、位置３２における共通の低リスクペプチドを含有した（図２３Ａ及び２３Ｂ）。ペプチド２は７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５において低リスクであると予測されたが、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８ペプチド２はそうではなかった。ペプチド６４は、３つのアレルに予測上結合する、両ＨＣにおけるリスクとして存在した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８におけるペプチド配列は、その配列が生殖系列可変ドメインといくらかの相同性を有することから、それほどリスクではなく存在することができる。７Ｇ６−ＨＣｚｕ８においてペプチド７０は、わずかなリスクをもたらすが、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ではそうではなかった。

【0252】

[0274]７Ｇ６−ＬＣｚｕ６と７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１との間には１つの差があり、７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１におけるペプチド３８は、１つのＨＬＡアレルに結合すると予測され、非常に低いリスクを提示した（図２４Ａ〜２４Ｄ）。７Ｇ６−ＬＣｚｕ１５と７Ｇ６−ＬＣｚｕ１８との間には、ペプチド２に関する１つのみの差があり、可変ドメイン生殖系列配列との相同性がほとんどから全くないことから、その差が７Ｇ６−ＬＣｚｕ１８よりも７Ｇ６−ＬＣｚｕ１５においてより高いリスクをもたらした。７Ｇ６−ＬＣｚｕ６／７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１と７Ｇ６−ＬＣｚｕ１５／７Ｇ６−ＬＣｚｕ１８とを比較すると、７Ｇ６−ＬＣｚｕ６／７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１配列は９個の潜在的な免疫原性ペプチドを含有し、一方で７Ｇ６−ＬＣｚｕ１５／７Ｇ６−ＬＣｚｕ１８は６個を含有した。ペプチド５１及び５２はすべてのＬＣ間で同じであり、ペプチド８８〜９４は、７Ｇ６−ＬＣｚｕ１５／７Ｇ６−ＬＣｚｕ１８には存在しないペプチド９０が７Ｇ６−ＬＣｚｕ６／７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１には存在するという例外を有して、同じ又は類似していた。ペプチド２及び３は、７Ｇ６−ＬＣｚｕ１５／７Ｇ６−ＬＣｚｕ１８においてよりも７Ｇ６−ＬＣｚｕ６／７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１においてリスクが高かった。

【0253】

[0275]１０Ｃ． 要約
要約すると、ｍｓ７Ｇ６を、ｍｓ７Ｇ６と同程度の親和性を有する２つの異なるヒト生殖系列可変ドメインファミリーでヒト化した。

【0254】

[0276]マウス配列に最も近いヒト生殖系列は、ＩＧＨＶ１−４６及びＩＧＫＶ２−３０であった。抗原結合を維持するためにはいくつかのマウスフレームワーク残基が要されると疑われたにもかかわらず、タウ結合はヒトフレームワーク残基によって影響を受けなかった（７Ｇ６−ＨＣｚｕ１／７Ｇ６−ＨＣｚｕ８）。さらに、タウ結合は、不対Ｃｙｓ５７のセリンへの変異（７Ｇ６−ＨＣｚｕ５／７Ｇ６−ＨＣｚｕ８）、又は残基６０、６１、６４、及び６５におけるＣＤＲＨ２の超ヒト化（７Ｇ６−ＨＣｚｕ４／７Ｇ６−ＨＣｚｕ８）によって影響を受けなかった。ＩＧＫＶ２にＶκ ＣＤＲを移植することは、タウ結合の劇的な減少をもたらさなかったが、１つ又は２つのマウスフレームワーク残基の付加は、ＨＣ−ＬＣ相互作用を安定させた。Ｌｅｕ４６は、Ｔｙｒ３６の有無にかかわらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析されるようにＶｈ−Ｖκ相互作用の安定性を増加させ、Ｔｙｒ３６−Ｌｅｕ４６（７Ｇ６−ＬＣｚｕ２／７Ｇ６−ＬＣｚｕ６）の組み合わせは、Ｌｅｕ４６又はＴｙｒ３６単独に関してよりも、タウへのわずかに高い親和性を有する抗体をもたらした（それぞれ７Ｇ６−ＬＣｚｕ／７Ｇ６−ＬＣｚｕ２１及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ４／７Ｇ６−ＬＣｚｕ２２）。位置４６におけるロイシンに関して免疫原性のわずかなリスクがあったものの、リスクは低かった。不対Ｃｙｓ４９はセリンで置換され得たが、チロシン置換は解離速度の増加をもたらした。

【0255】

[0277]より共通して発現されるＩＧＨＶ３及びＩＧＫＶ１ファミリーを利用することによってヒト化ｍＡｂの免疫原性を潜在的に低下させることに、ヒト生殖系列可変ドメインファミリーＩＧＨＶ３−２３及びＩＧＫＶ１−３９を選定した。ＩＧＨＶ３生殖系列にＣＤＲを移植することは、１つ又は複数のマウス残基を要した。Ａｒｇ９４はヒトリジン残基ではあり得なかった。位置６０、６１、６２、６３、及び６５におけるマウス残基は、最適な抗原結合に要された。７１におけるアルギニンは抗原結合に影響を及ぼさなかったが、Ｖｈ−Ｖκ相互作用の安定性に要された（７Ｇ６−ＨＣｚｕ１２、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１３、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１４、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１５、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１６、７Ｇ６−ＨＣｚｕ１７、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５）。Ｖａｌ７１は、Ｐｈｅ６３及びＳｅｒ６５とペアにした場合に潜在的な免疫原性ペプチドをもたらしたものの、リスクは低かった。タウ結合は、不対Ｃｙｓ５７のセリンへの変異によって影響を受けなかった（７Ｇ６−ＨＣｚｕ２３、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２４、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５）。ＩＧＫＶ１フレームワーク全体にわたるヒト残基は、抗原結合又は安定性に影響を及ぼさなかった（７Ｇ６−ＬＣｚｕ１８）。

【0256】

[0278]試験されたすべての抗体に関して、ｐＩ及び熱安定性の差はほとんどなかった。

【0257】

[0279]実施例１１：ヒト疾患脳に対する７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５／ＬＣｚｕ１８を用いた免疫組織化学
パラフィン包埋された固定されたヒト脳切片（８μｍ）をキシレンの複数回の交換で脱パラフィン（ｄｅｗａｘ）し、次いで１００％工業用変性アルコール（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｓｐｉｒｉｔ）（ＩＭＳ）で徹底的に（ｔｈｒｏｒｏｕｇｈｌｙ）に洗浄した。切片を過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）及びメタノール（１００ｍＬのメタノールあたり２ｍＬの過酸化水素）中に室温で１０分間置いて、内因性ペルオキシダーゼを遮断し、次いで流れている水道水の下でさらに１０分間洗浄した。次いで、各切片を９８％ギ酸で室温にて１０分間処理し、その後に、流れている水道水でもう１０分間の洗浄が続いた。次いで、切片をクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で圧力をかけて１０分間熱し、次いで流れている水道水で再度、その後にＴＢＳで洗浄した。脱イオン水でリンスした後、各スライドを慎重に取り外し、組織端周辺を乾燥させた。乾燥させ次第、プロテイナーゼＫ溶液を室温で１０分間適用する前に、ワックスペンを用いて切片周辺に印を付けた。

【0258】

[0280]組織切片が調製され次第、種々の濃度の７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体を用いた染色を、メーカーの取扱説明書の通りにＫｌｅａｒ Ｈｕｍａｎ ＨＲＰ−Ｐｏｌｙｍｅｒ ＤＡＢ検出キット（ＧＢＩ Ｌａｂｓ、Ｂｏｔｈｗｅｌｌ、ＷＡ；カタログ番号Ｄ１０３−１８）を用いて行った。図２５に示されるように、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体は、免疫組織化学により、アルツハイマー病（神経原線維変化及び神経絨毛糸（ｎｅｕｒｏｐｉｌ ｔｈｒｅａｄ））、ＰＳＰ（もつれ、房状アストロサイト、及びコイル小体）、及びピック病（ピック小体）由来の脳における病的タウを強く且つ特異的に認識する。抗体は、また、試験されたすべての組織において、非常に低いレベルのバックグラウンド染色しか示さなかった。

【0259】

[0281]実施例１２：２Ｎ４Ｒ野生型タウに対する７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の親和性
１２Ａ． 材料＆方法
１２Ａ．ｃ．２． ＣＨＯ一過性ｍＡｂ産生
メーカーの手順に従い、Ｌｏｎｚａバージョン７プラットフォームを用いて７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体を産生した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５及び７Ｇ６−ＬＣｚｕ１８をコードするＤＮＡフラグメントを、Ｌｏｎｚａからのグルタミンシンターゼをコードする発現プラスミドにクローニングした。ＭＳＸ耐性細胞株を選択するためのＬｏｎｚａのプロトコールに従い、ＣＨＯ−Ｋ１ｓｖ細胞に７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８発現プラスミドをエレクトロポレーションし、それに続いて、２５又は５０μＭのＭＳＸの存在下で、グルタミン不含培地中９６ウェルプレートにウェルあたり２５００個細胞を播種した。ＭＳＸ耐性細胞を含有するウェルを、様々な細胞培養容量で、抗体発現についての数ラウンドのスクリーニングに供した。最も高い７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体力価を産生する９６Ｅ７細胞株をさらなる進展に選定し、−８０℃で凍結し、液体窒素中気相に保管した。

【0260】

[0282]９６Ｅ７細胞株のバイアルを融解し、３６．５℃及び５％ＣＯ_２でディスポーザブル振とうフラスコ中にて培養し、その後に、３６．５℃及び５％ＣＯ_２でより大きなサイズのディスポーザブル揺動バッグ中にて３〜４日ごとのさらなる増殖が続いた。１０００Ｌのステンレス鋼フェッドバッチ産生バイオリアクターの接種前に、２００Ｌのステンレス鋼シードバイオリアクターを、制御ｐＨ及び溶存酸素を有する３６．５℃での最終増殖に採用した。フェッドバッチモードで且つ制御ｐＨ及び溶存酸素を有する３６．５℃での１５日後、上清をデプス濾過を通して収穫した。

【0261】

[0283]１２Ａ．ｄ． ＭＡｂ精製
ＡＫＴＡｐｒｏｃｅｓｓ精製プラットフォーム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製を実施した。精製工程は以下のステップからなった：プロテインＡ捕捉クロマトグラフィー、ウイルス不活性化、デプス濾過、アニオン交換フロースルークロマトグラフィー、ウイルス低減濾過、濃縮、及び最終バッファー交換。

【0262】

[0284]最初の捕捉ステップを、Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３プロテインＡ樹脂（ＪＳＲ）を用いて実施した。５０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて１４．１Ｌのカラムを平衡化し、次いで、サイクルあたり樹脂１リットルあたり最高で４５ｇのタンパク質をロードした。ロードした後、ＵＶがベースラインに戻るまで、カラムを平衡化バッファー、それに続く２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で洗浄した。結合した材料を、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．４を用いてカラムから溶出した。低ｐＨウイルス不活性化のために、溶出液のｐＨを、２Ｍ酢酸を用いてｐＨ３．６に調整した。最低３０分間の静置の後、溶出液を、２Ｍ Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅを用いてｐＨ６．８に中和した。Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ Ｄ０ＨＣ及びＸ０ＨＣボッドフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、デプス濾過を直ちに実施した。２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で平衡化された６．７ＬのＣａｐｔｏ Ｑ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アニオン交換カラムを用いて、濾液をさらに処理した。カラムに、非結合モードで樹脂１リットルあたり最高で１５０ｇのタンパク質をロードした。フロースルー産物を、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ Ｐｒｏウイルス低減フィルターを用いて濾過し、次いで２５ｇ／Ｌに濃縮した。材料をバッファーにバッファー交換した。２つの異なるモノクローナル抗体産生ランに対して精製手順を実施し、１７−０１９０及び１８−０１４６ロットと指定した。１７−０１９０ロットからのいくつかのバイアルを、参照標準としての使用のために１７−０１９０ＡＲＳと指定した。

【0263】

[0285]１２Ａ．ｆ． 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析
１２Ａ．ｆ．２． 抗ヒト捕捉単量体タウ結合アッセイ
１２Ａ．ｆ．２．ｉ． チップ調製
試薬調製。ＥＤＣ［１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］及びＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を、１０．０ｍｌのミリ−Ｑ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水を各バイアルに添加することによって溶解した。バイアルにきつく蓋を締め、固体が完全に溶解するまでボルテックスした。ＥＤＣ、ＮＨＳ、及びエタノールアミン溶液を、７ｍｍプラスチックバイアル中０．５ｍｌアリコートに別個に等分し、蓋を締め、−２０℃で凍結して保管した。キットからの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）を微量遠心機で短時間遠心分離して、チューブの底に抗体を収集した。１５μＬの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）を新たな１．５ｍＬ微量遠心機チューブに取り出し、２８５μＬの固定化バッファーで３００μＬに希釈した。サンプルを短時間ボルテックスして混合し、次いで７０μＬを４本の別個の７ｍｍチューブに等分し、蓋を締めた。ＥＤＣ、ＮＨＳ、及びエタノールアミンのそれぞれについての４本のアリコートを融解し、短時間ボルテックスして混合し、チューブ壁にトラップされたいかなる気泡をも除き、試薬ラック２に置いた。

【0264】

[0286]１Ｌパイレックス（Ｐｙｒｅｘ）ボトル中にて５０ｍＬの１０×ＨＢＳ−Ｐ＋を４５０ｍＬのミリ−Ｑ（登録商標）水で０．５Ｌに希釈することによって、０．５Ｌの１×ＨＢＳ−Ｐ＋（アッセイランニングバッファー）を調製した。

【0265】

[0287]アッセイ用機器の準備。アッセイランニングバッファーの１Ｌボトルをビアコア（登録商標）Ｔ−１００のバッファーＡラインに、空の２Ｌパイレックスボトルをビアコア（登録商標）Ｔ−１００廃液ラインに、及び新鮮な１Ｌのミリ−Ｑ（登録商標）水で満たされた１Ｌパイレックスボトルを水ラインに取り付けた。新たなＣＭ５チップを機器にドッキングした。

【0266】

[0288]捕捉抗体固定化。ビアコア（登録商標）Ｔ−１００制御ソフトウェアにおいて、新たなウィザードテンプレートを開き、「固定化」を選択した。チップタイプを「ＣＭ５」に設定した。方法を「アミン」に設定した。リガンドブランクを「抗ヒト」と記入した。添加時間を各フローセルに対して３６０秒間に、流速を５μＬ／分に設定した。これらのステップの完了後、アッセイをランした。

【0267】

[0289]１２Ａ．ｆ．２．ｉｉ． 結合アッセイ
結合実験を、ビアコア（商標）Ｔ−１００機器又はＴ−２００機器を用いて実施した。結合アッセイに用いられたランニングバッファーはＨＢＳ−Ｐ＋／０．２％ＢＳＡであった。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ＬＣｚｕ１８サンプルを、アッセイランニングバッファー中最終１００μｇ／ｍＬ、１００μＬに希釈し、次いで微量遠心機において１８，０００×ｇにて周囲温度で１０分間遠心分離した。４０μＬの上清を取り出し、ラベルされた５ｍＬチューブ中アッセイランニングバッファーで４．０ｍＬに希釈することによって、１μｇ／ｍＬへの希釈を行った。１μｇ／ｍＬの抗体溶液を、ラベルされた１．５ｍＬの蓋なしプラスチックバイアルに移し、タイプ３のキャップで蓋を締めた。バイアルを短時間ボルテックスして、チューブの壁又は底に付着したいかなる気泡をも除去し、サンプル及び試薬ラック１に置いた。希釈された参照標準抗体の２００μＬの１μｇ／ｍＬ溶液を７ｍｍプラスチックバイアルに移し、蓋を締め、短時間ボルテックスして、付着した気泡を取り除き、サンプル及び試薬ラック１に置いた（チップ馴化サイクルのため）。組み換えヒト野生型２Ｎ４Ｒタウタンパク質を、アッセイランニングバッファー中最終１μＭ、０．５ｍＬに希釈した（１ｍｇ／ｍＬストックは２１．７μＭである）。サンプルを、微量遠心機において１８，０００×ｇにて周囲温度で１０分間遠心分離し、４００μＬの上清を取り出し、ラベルされた５ｍＬチューブ中アッセイランニングバッファーで４．０ｍＬに希釈することによって、１００ｎＭに希釈した。１３３３μＬの１００ｎＭ溶液を取り出し、２６６７μＬのアッセイランニングバッファーで４．０ｍＬの最終容量に希釈することによって、１００ｎＭ溶液を３倍段階希釈した（３３．３μＬ）。合計８つの希釈のために、段階希釈を６回反復した（１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７０ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．４１ｎＭ、０．１４ｎＭ、及び０．０４６ｎＭのタウ）。３ｍＬのアッセイランニングバッファーを、ラベルされた５ｍＬチューブに添加することによって、０ｎＭタウタンパク質溶液を調製した。分析物希釈液を、ラベルされた４ｍＬプラスチックバイアルに移し、タイプ５のキャップで蓋を締め、短時間ボルテックスして、チューブの壁又は底に付着したいかなる気泡をも除去し、サンプル及び試薬ラック１に置いた。チップを馴化する分析物サンプルに関しては、５μＬの１μＭタウタンパク質溶液上清を取り出し、７ｍｍプラスチックバイアル中アッセイバッファーで５００μＬに希釈し、蓋を締め、短時間ボルテックスして、付着した気泡を取り除き、サンプル及び試薬ラック１に置いた。ヒト化抗体を、３６秒間の添加時間の間、１０μＬ／分の流速でフローセル２、３、及び４に逐次的に捕捉した。タウタンパク質の希釈液を、３００秒間の添加時間の間、３０μＬ／分の流速で４つすべてのフローセルにわたってインジェクトした。その後に解離が１８００秒間続いた。各サイクルの後、４つすべてのフローセルにわたる３Ｍ ＭｇＣｌ_２の３０μＬ／分で３０秒間の２回の逐次的インジェクションによって、表面を再生した。ランの後、動態データフィッティングを、１：１ラングミュアモデルを用いて実施した。

【0268】

[0290]１２Ｂ． 結果
７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ＬＣｚｕ１８抗体への組み換えヒト野生型２Ｎ４Ｒタウタンパク質の親和性を、抗体捕捉形式アッセイを用いて決定した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ＬＣｚｕ１８抗体の捕捉後、ヒトタウタンパク質をリガンド表面にわたって３００秒間インジェクトし、その後に１８００秒間の解離の観察及び測定が続いた。各抗体捕捉、タウタンパク質結合、及び解離サイクルの後、メーカーによって要求されているように、３Ｍ ＭｇＣｌ_２を用いて、チップ表面を抗ヒト抗体捕捉表面に再生した。タウタンパク質を、１００ｎＭ〜０．０４６ｎＭ（３倍希釈された）の濃度域で分析した。解離が各タウタンパク質インジェクションに対して実施されるように、アッセイをマルチサイクルモードで実施した。各リガンドを３つすべてのフローセル（ｆｃ２、ｆｃ３、及びｆｃ４）にて三つ組で分析して、いかなるフローセル特異的効果をも排除した。

【0269】

[0291]各フローセルへの各リガンドの捕捉レベル（ｆｃ１と比べた）を決定した。これらの結果は表１３に列挙されている。

【0270】

【表13】

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【0271】

[0292]捕捉されたリガンド平均レベルはすべて、１５８ＲＵ〜１９６ＲＵの間にあった。所与のリガンド内では、フローセル間でほんのわずかな差しか観察されなかった。

【0272】

[0293]結合データは二重参照され、リガンド結合なしのｆｃ１及びバッファー分析物インジェクション（０ｎＭタウタンパク質）の両方に参照されたことを意味する。結合データを、１：１ラングミュア結合モデルにフィットさせた。抗体の２価性及び結果として生じた結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）効果は抗体捕捉形式において関連性がないことから、このモデルは当該アッセイ形式に適当である。個々のフローセル上の各リガンドに対する親和性データを平均化し、標準偏差を決定した。これらの結果は表１４に列挙されている。

【0273】

【表14】

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【0274】

[0294]２つの７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ＬＣｚｕ１８原薬ロットと７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５ＬＣｚｕ１８参照標準との間に、オン速度、オフ速度、又は親和性の有意な差は観察されなかった。

【0275】

[0295]実施例１３：７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の精細エピトープマッピング
精細エピトープマッピングを、実施例３に記載されるように、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体に対して実施した。

【0276】

[0296]チップの蛍光画像及び結果として生じた強度プロットは、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６（図２６Ａ）及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５／ＬＣｚｕ１８（図２６Ｂ）抗体が両方とも、マウス７Ｇ６抗体と同様に（図３を参照されたい）、全長タウタンパク質の２つの主要な部位に結合することを示している。概して７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８に対してチップ上のより強い蛍光強度が観察され、シグナル飽和の何らかの兆候、及びしたがって、ペプチドのすべてではないが一部に対する真の定量の欠如をもたらした。この実験において、データ分析ソフトウェア（ペプスライド（商標）アナライザー）は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６に対する最小結合配列を、２Ｎ４Ｒタンパク質の第２の反復（位置２９８〜３０４）内の部位に対してＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号１１３５）、及び第４の反復（位置３６２〜３６６）内の部位に対してＨＶＰＧＧ（配列番号７９）と同定した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８に関して、ソフトウェアは、最小要求配列を、両結合部位に対してＨＶＰＧ（配列番号１１３３）と同定した。

【0277】

[0297]マウス７Ｇ６と同様に、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の両方に対して、２つのさらなる部位：アミノ酸位置２６８〜２７２におけるＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）及び位置３３０〜３３４におけるＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）において微量の結合が観察された。ＨＸＰＧＧ配列（配列番号１１３６）を含有するペプチドに対する平均シグナル強度の算出により、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６ヒト抗体が、ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）（反復領域１）又はＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）（反復領域３）配列と比較して、全長２Ｎ４Ｒタウの第２の反復領域内に通常含有されるＨＶＰＧＧ部位（配列番号７９）への結合において、それぞれ１０８倍又は１０４倍の選好性を示すことが実証された。同様に、ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）（反復領域１）又はＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）（反復領域３）配列と比較して、全長２Ｎ４Ｒタウの第４の反復領域内に通常含有されるＨＶＰＧＧ（配列番号７９）部位への７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６結合において、それぞれ９９倍又は９５倍の選好性が観察された。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８に対する同一のデータ分析は、ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）（反復領域１）又はＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）（反復領域３）配列と比較して、全長４Ｒタウの第２の反復領域内に通常含有されるＨＶＰＧＧ（配列番号７９）部位への結合において、それぞれ６５倍又は１００倍の選好性を実証した。同じように、ＨＱＰＧＧ（配列番号１８３）（反復領域１）又はＨＫＰＧＧ（配列番号１８２）（反復領域３）配列と比較して、全長４Ｒタウの第４の反復領域内に通常含有されるＨＶＰＧＧ（配列番号７９）部位への７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８結合において、それぞれ７７倍又は１１９倍の選好性が観察された。

【0278】

[0298]実施例１４：７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８のエピトープ置換スキャニング
実施例４に記載されるように、エピトープ置換スキャニングを７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体に対して実施した。

【0279】

[0299]置換スキャニングは、７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の両方とも、^１ＨＶＰＧＧ^５（配列番号７９）配列が、ペプチド結合のために、^１Ｈ、^３Ｐ、及び^４Ｇ残基を要し、^２Ｖではいくらかの置換忍容性を有することを示した。これらの知見は、マウス７Ｇ６抗体に対して観察されたもの（実施例４を参照されたい）と同様であった。置換に対するいくらかの忍容性は、この場合、^１ＨＶＰＧＧ^５（配列番号７９）配列の第２のグリシン残基（^５Ｇ）でも観察された。しかしながら、この残基は、より長い野生型ペプチド配列への７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６抗体の結合に対して依然としてかなりの影響を及ぼし得た。実施例１３と合わせると、これらの結果は、ＨＶＰＧＧ（配列番号７９）配列が、第２及び第４の反復内のそれぞれ位置２９９〜３０３及び３６２〜３６６での、２Ｎ４Ｒタウへの７Ｇ６、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８、及び７Ｇ６−ＨＣｚｕ８−ＬＣｚｕ６抗体の効率的な結合を促すことを示す。

【0280】

[0300]実施例１５：７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８を用いたインビトロタウ凝集
実験１
７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体がインビトロでタウ凝集を阻害し得るかどうかを決定するために、野生型タウタンパク質を用いて、わずかな改変を有して実施例５に記載されるアッセイにおいて抗体を試験した。唯一の違いは、この場合に用いられた対照ＩｇＧはヒトＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ０２９７）であることであった。

【0281】

[0301]このアッセイでは、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体を数日間の時間経過にわたって試験した。図２７は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８が、インビトロでタウ凝集を有効に阻害し得たことを示している。３７℃でのインキュベーション後１、２、５、及び６日目に関して、ＩｇＧ対照と７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８とを比較した場合、効果は統計的に有意であった（ｔ検定）。ヘパリン添加後、反応を始動したすぐ後の０日目に、有意性は観察されなかった。

【0282】

[0302]実験２
ヒト化７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体が、インビトロでタウ凝集を阻害することにおいてマウス７Ｇ６抗体に匹敵することを確認するために、両抗体を同じインビトロタウ凝集アッセイにおいて比較した。用いられた条件は、実施例５に記載されるのと同じマウスＩｇＧ２ｂ対照抗体が用いられたということを除いて、本実施例の実験１におけるものと同一であった。

【0283】

[0303]マウス抗体７Ｇ６及びヒト化抗体７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８の両方を、実施例５に提供されるアッセイ条件に従って試験した場合、両抗体ともインビトロでタウ凝集を有効に阻害した。図２８に示されるように、マウス７Ｇ６と７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体との間で同じ効果の大きさが見られた。

【0284】

[0304]実施例１６：７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８による免疫枯渇後の、Ｋ１８タウフィブリルを用いた、細胞に基づくシーディングアッセイ
細胞培養培地からのタウシードの免疫枯渇が、細胞内のさらなるタウ凝集を防止し得るかどうかを決定するために、実施例６に記載されるのと同じＨＥＫ２９３アッセイシステムを用いた。しかしながら、本例では、以前に記載される全長タンパク質ではなく、タウ（Ｋ１８）フィブリルの強力な短縮型をタウシードとして用いた。Ｋ１８フラグメントは広く研究されており、通常、全長２Ｎ４Ｒタウタンパク質の残基２４４〜３７２として組み換えで発現される。このフラグメントはタウの微小管結合領域をコードし、全長タンパク質よりも凝集傾向が高く（Ｓｈａｍｍａｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｓ．、６、論文番号：７０２５（２０１５））、並びに細胞に基づくアッセイにおいて強力なシードを形成する能力を有すると報告されている（Ｋｆｏｕｒｙら、２０１２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７：１９４４０〜１９４５１）。

【0285】

[0305]材料及び方法：
Ｋ１８フィブリルの調製。組み換えヒトタウ−４４１（２４４〜３７２；「Ｋ１８」）（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ）を超純水に溶解した。４０μｍｏｌ／Ｌ Ｋ１８タンパク質、１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ７）、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、及び２４０μｇ／ｍＬヘパリンの最終濃度を一緒に混合することによって、フィブリルを作出した。反応液を３７℃で３日間撹拌した。インキュベーション後、溶液を１３５，０００ｇにて室温で２０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ７）に再懸濁した。凝集したタンパク質を短時間超音波処理し、次いでＤ−ＰＢＳ（−）で５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、−８０℃で保管した。

【0286】

[0306]免疫枯渇及び免疫沈降サンプルの調製。調製されたＫ１８フィブリルの免疫沈降を、メーカーの取扱説明書の通りに免疫沈降ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）プロテインＧキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０００７Ｄ）を用いて実施した。簡潔には、各免疫沈降は、３又は０．３μｇの７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体のいずれかに結合した１．５ｍｇのダイナビーズを用いた。ビヒクル（抗体なし）又は３μｇの市販のヒトＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号ＨＣＡ１９２）が対照として含まれた。抗体に結合した（又は、ビヒクルで処理した）ビーズを、０．２％ＢＳＡを含有する１７０μＬのバッファーに再懸濁した。次いで、Ｋ１８フィブリル溶液を融解し、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬに希釈し、抗体に結合したビーズに添加して２００μＬの最終容量を与えた（合計で３００ｎｇのＫ１８を含有する）。この操作は、各免疫沈降反応液中に１５又は１．５μｇ／ｍＬの抗体のいずれかの最終濃度を与えた。ビーズをＫ１８フィブリルと室温で２０分間撹拌しながらインキュベートし、結合していない材料を免疫枯渇（ＩＤ）サンプルとして保持した。抗体に結合した材料を、キットに提供された２０μＬのバッファー中に溶出し、また保持して免疫沈降（ＩＰ）サンプルを用意した。

【0287】

[0307]細胞に基づくアッセイ。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液を精製水中０．１％の最終濃度に希釈し、次いでそれを用いて９６ウェル組織培養プレートを３７℃で少なくとも一晩コーティングした。次いで、アッセイを行うのに先立って、１０％胎仔ウシ血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（「ＤＭＥＭ（＋ＦＢＳ、Ｐ／Ｓ）」）培地を含有する１５０μｌのダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）を各ウェルに添加する前に、プレートを水で２回洗浄した。

【0288】

[0308]タウシード添加前に、５％ＣＯ_２を有する３７℃でＤ−ＭＥＭ（＋ＦＢＳ、Ｐ／Ｓ）中にルーチン的に維持されたＬｅｎｔｉ−Ｘ ２９３Ｔ（Ｔａｋａｒ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）細胞に、抗生物質なしの同じ培地中にて浮遊状態でトランスフェクトした。トランスフェクションに関しては、メーカーの推奨どおりに、変異体Ｐ３０１Ｓ ０Ｎ４ＲタウアイソフォームをコードするｃＤＮＡを含有する７μｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）哺乳類発現ベクターと、ＬＴＸ ａｎｄ Ｐｌｕｓ（商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５２２８−１００）とを混合した。結果として生じた混合物を、１．０×１０^５個細胞／ｍＬの密度で６．０×１０^６個のＬｅｎｔｉ−Ｘ ２９３Ｔ細胞の懸濁液に直接添加する前に、室温で少なくとも２５分間インキュベートした。あらかじめコーティングされたプレートから培地を除去し、処理された細胞懸濁液をウェルあたり１５０μＬ（１．５×１０^４個細胞／ウェル）で分配し、５％ＣＯ_２大気中３７℃で１９時間インキュベートした。

【0289】

[0309]氷上で融解し次第、３０μＬの各ＩＤサンプルを４２０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１９８５−０６２）に希釈した。ＩＰサンプルに関しては、溶液をまた氷上で融解し、２μＬのそれぞれを５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ培地に希釈した。次いで、２．５μＬのＰ３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３０００−００８）を添加した。別個のチューブで、２２μＬのリポフェクタミン（登録商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３０００−００８）を５５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ培地に希釈した。次いで、５２μＬの希釈されたリポフェクタミン３０００溶液を、Ｐ３０００試薬を含有する各ＩＰサンプルに添加した。

【0290】

[0310]播かれた細胞を２回洗浄し、７５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に放置した。上で記載されるように、等量の希釈されたＩＤ又はＩＰサンプルを各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２大気中３７℃で４４時間インキュベートした。実験を四つ組で実施した。

【0291】

[0311]免疫細胞化学。インキュベーションの２日後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で室温にて３０分間固定した。各ウェルを１００μＬの精製水で３回洗浄し、次いで、７０μＬの透過／ブロッキング／ＤＡＰＩ染色バッファー（ＴＢＳ中５％ＢＳＡ中に希釈されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液（最終濃度：０．２％）及びセルステイン（Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ）（登録商標）ＤＡＰＩ溶液（最終濃度：０．１％；Ｄｏｊｉｎｄｏ））を各ウェルに添加した。プレートにカバーをし、光から保護しながら室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、透過／ブロッキング／ＤＡＰＩ染色バッファーを除去し、８０μＬのチオフラビンＳ（ＴｈＳ）染色バッファー（０．０００３％の最終濃度まで５０％エタノールに溶解されたチオフラビンＳ）を各ウェルに添加し、室温で４０分間インキュベートした。次いで、各ウェルを５０％エタノールで２回洗浄し、２５０μＬの精製水で置き換えた。

【0292】

[0312]イメージングアッセイ。各ウェルの蛍光画像をインセル（登録商標）アナライザー２２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（ＴｈＳ：励起［Ｅｘ］／発光［Ｅｍ］＝４７５／５１１ｎｍ、ＤＡＰＩ：Ｅｘ／Ｅｍ＝３９０／４３５ｎｍ）によって獲得した。次いで、各ウェルにおけるＴｈＳ及びＤＡＰＩ陽性シグナルの数を、インセルディベロッパー（ＩｎＣｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。

【0293】

[0313]データ分析。ＴｈＳ陽性率を、以下の式：
ＴｈＳ陽性率＝ＴｈＳ／ＤＡＰＩ
＝ＴｈＳ陽性シグナルの数／ＤＡＰＩ陽性シグナルの数
を用いて算出した。次いで、ＩＤ又はＩＰサンプルのシーディング効果を、以下の式（ソフトウェア：ＴＩＢＣＯスポットファイア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ））：
ＩＤサンプルのシーディング効果（対照についての％）＝Ｔ_１／Ｃ_１×１００
式中、Ｔ_１：抗体で処理されたＩＤサンプルにおけるＴｈＳ陽性率の平均、及び
Ｃ_１：バッファーで処理されたＩＤサンプルにおけるＴｈＳ陽性率の平均
ＩＰサンプルのシーディング効果（対照についての％）＝Ｔ_２／Ｃ_２×１００
式中、Ｔ_２：抗体で処理されたＩＰサンプルにおけるＴｈＳ陽性率の平均、及び
Ｃ_２：７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（１５μｇ／ｍＬ）で処理されたＩＰサンプルにおけるＴｈＳ陽性率の平均
を用いて算出した。

【0294】

[0314]図２９は、ＩＤサンプルの処理後の、細胞に基づくシーディングアッセイにおける、正規化されたＴｈＳ陽性率を示している。１．５及び１５μｇ／ｍｌの７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体は、Ｋ１８フィブリルのシーディング効果を除去した（ヒトＩｇＧ１カッパ対照に対して、＞７０％の低下）。ＩＰサンプルに関して、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体は、濃度依存的様式でシーディング効果を効率的に誘導した（データ示さず）。

【0295】

[0315]実施例１７：７Ｇ６を用いた、海馬内Ｐ３０１Ｓタウシード注射モデル
材料及び方法：
組み換えヒト２Ｎ４Ｒ Ｐ３０１Ｓタウ（４０μｍｏｌ／Ｌ）とヘパリン（２４０μｇ／ｍＬ）とを混合し、その後に、２ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０中での３７℃で４８〜９６時間のインキュベーションステップが続くことによって、タウシードを作出した。凝集したタウを超遠心分離によって収集し、１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０に再懸濁した。結果として生じたフィブリルを超音波処理し、注射用のシードとして用いた。

【0296】

[0316]３μＬのタウシード（１．５ｍｇ／ｍＬ）又はシードなし（１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を、ウルトラマイクロポンプ（ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ）ＩＩＩ及びＭｉｃｒｏ４コントローラー（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、３〜４カ月齢のマウス／Ｔｈｙ−１ｈＴａｕ．Ｐ３０１Ｓ（ＣＢＡ．Ｃ５７ＢＬ／６）マウス［以前に作出されたホモ接合型ヒトＰ３０１Ｓタウトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（Ａｌｌｅｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２；２２：９３４０〜５１）］の左海馬に０．５μＬ／分で６分間定位注射した（Ａ：＋２．５、Ｌ：２．０、Ｖ：１．５）（Ｆｒａｎｋｌｉｎ及びＰａｘｉｎｏｓ、Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、第３編、２００７、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＵＳＡ）。マウスを、表１５に示される群に無作為に分けた。製剤化バッファー（２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）中の抗ヒトタウマウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体、クローン７Ｇ６、又はマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体（クローンＭＰＣ１１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を、シードを受けていた群において４０ｍｇ／ｋｇの用量に達するように腹腔内（ｉｎｔｒｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）投与した。同じ製剤化バッファーをシードなし群に投与した。タウシード注射の６〜１６時間前、並びに１及び２週間後に投薬を実施した（合計３回）。投与前に、投与容量（１０ｍＬ／ｋｇ）を体重から算出した。

【0297】

【表15】

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【0298】

[0317]すべてのマウスに混合麻酔薬（Ｍ／Ｍ／Ｂ：０．３／４／５；０．９ｍｇ／ｋｇのメデトミジン、１２．０ｍｇ／ｋｇのミダゾラム、及び１５ｍｇ／ｋｇのブトルファノールで調製された）で深く麻酔をかけ、血漿及び脳脊髄液（ＣＳＦ）を収集した。次いで、生理食塩水を用いた心腔内灌流の後に、両側（同側及び対側）からの皮質及び海馬を別個に解剖した。脳組織を液体窒素中で直ちに凍結し、−８０℃で保管した。

【0299】

[0318]５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、１％ＮＰ−４０ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｂｉｏ ｗｏｒｌｄ）、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１×ＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）、及び１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ（−）（Ｒｏｃｈｅ）を含有する１９容量（組織重量／容量）の抽出バッファー（「ＲＩＰＡバッファー」）中で、解剖した脳組織をホモジナイズした。ホモジネートを１６３，０００ｇにて４℃で２０分間遠心分離し、ペレットを、超音波処理の前に、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ、１０％スクロース（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、及び１％サルコシルを含有する１０容量（組織重量／容量）のバッファーに再懸濁した。サルコシル処理したサンプルを３７℃で６０分間インキュベートし、次いで１６３，０００ｇにて４℃でさらに２０分間遠心分離した。最後に、１０容量のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）をペレットに添加し、その後それを超音波処理した。この操作により、サルコシル不溶性画分が形成された。

【0300】

[0319]サルコシル不溶性画分におけるタウタンパク質の量をウェスタンブロット分析によって定量した。サルコシル不溶性画分を、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファー（Ｎｏｖｅｘ）及びＮｕＰＡＧＥ（商標）サンプル還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で可溶化し、８０℃で１０分間加熱し、１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ）を用いて分離した。タンパク質を０．２μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写し、ブロットを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を含有するＴＢＳ（Ｔａｋａｒａ）中の２．５％スキムミルク（Ｙｕｋｉｊｉｒｕｓｈｉ）中で室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキングの後、ブロットを、ブロッキングバッファー中ヒト特異的モノクローナル抗タウ抗体ＨＴ７（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で室温にて１時間プローブした。ブロットをＴＢＳ−Ｔで３０分間洗浄し、次いで、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（１：２０００、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともに室温でさらに１時間インキュベートした。二次抗体を除去し、ブロットを上で記載されるように洗浄した。タウタンパク質を化学発光ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって検出し、フュージョンＦＸ及びフュージョンキャプト（ＦｕｓｉｏｎＣａｐｔ）バージョン１６．１５（Ｖｉｌｂｅｒ−Ｌｏｕｒｍａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて定量した。タウの量を決定するために、Ｐ３０１Ｓ脊髄の起源元サルコシル不溶性画分に由来するタウ標準物質の段階希釈（１、２、５、１０、２０任意単位［ＡＵ］、１ＡＵは、７μｇの脊髄由来のサルコシル不溶性画分においてＨＴ７抗体によって検出されるヒトタウタンパク質のバンド密度と等価である）を各ゲルにロードした。１ＡＵ（検出限界）未満として算出されたデータを、０．５ＡＵとして表現した。

【0301】

[0320]データは、平均±ＳＥＭとして表現されている。シードなし、対照ＩｇＧ処理群、及び７Ｇ６処理群の間のサルコシル不溶性タウの差を、１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、それに続くフィッシャーのＬＳＤ検定によって分析した。Ｐ＜０．０５の値（両側）を統計的に有意と考えた。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施された。

【0302】

[0321]結果
海馬内タウシード注射によって誘導されたサルコシル不溶性タウに対する７Ｇ６の効果を、同側（注射側）及び対側の両方の皮質及び海馬において別個に検討した。図３０Ａ〜３０Ｄに示されるように、７Ｇ６は、対照ＩｇＧと比較して、対側海馬においてサルコシル不溶性タウの増加を有意に抑制したが（図３０Ａ）、他の領域において有意な効果は示さなかった（図３０Ｂ、３０Ｃ、及び３０Ｄ）。このことは、７Ｇ６が、このインビボモデルにおいてタウ伝播を防止し得たことを示唆する。

【0303】

[0322]実施例１８：７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８トランスレーショナルバイオマーカーデータ
雄カニクイザルを、４週間週１回、腹腔内間欠投与によってビヒクル又は７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇ：３匹の動物／用量）で処理した。各サルから収集された脳脊髄液（「ＣＳＦ」）における、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体に結合したＭＴＢＲ−タウ（ＭＴＢＲを含有する全長又は短縮型タウの任意のアイソフォーム）（「結合したＭＴＢＲ−タウ」）及び非結合形態（「遊離ＭＴＢＲ−タウ」）をプロテインＡカラムによって分離し、質量分析と連動した液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）によって分析した。ニードルカラム（３μｍ Ｃ１８粒子、１５０ｍｍ長、１００μｍ内径）を有する、オービトラップフュージョン（Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ）（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）トライブリッド（Ｔｒｉｂｒｉｄ）（商標）質量分析計と連動したアルティメット（ＵｌｔｉＭａｔｅ）（商標）３０００ Ｎａｎｏ ＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて、ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。２０００Ｖのスプレー電圧を金属製Ｔ字コネクターを通して適用した。流速は５００ｎＬ／分であった。移動相は、（Ａ）４％アセトニトリル中０．５％酢酸、及び（Ｂ）８０％アセトニトリル中０．５％酢酸からなり、１％〜１％Ｂを５分間、１％〜３７％Ｂを１５分間、３７％〜６８％Ｂを５分間、６８％〜９９％Ｂを１分間、及び９９％〜９９％Ｂを４分間という多段階線形勾配を採用して分析物を溶出し、次いで初回条件１％Ｂによって平衡化した。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体エピトープを含有する特異的ペプチドを、ＭＴＢＲ−タウの代理としてＬＣ／ＭＳによって測定した。ＭＴＢＲ−タウの量は、指定されたペプチド（軽）と、その内部標準（重）であるアイソトープ標識されたペプチドとのクロマトグラフピーク面積比として表現された。

【0304】

[0323]図３１Ａに示されるように、ＣＳＦにおける結合したＭＴＢＲ−タウの量は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の処理により用量依存的様式で増加したが、一方でサルＣＳＦにおける遊離ＭＴＢＲ−タウの量は、また用量依存的に減少した（図３１Ｂ）。このことは、サルＣＳＦにおける７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体のインビボ標的関与を示唆する。

【0305】

[0324]７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体を、１０、１００、５００、１０００、又は２０００ｎｇ／ｍＬでヒトＣＳＦにもスパイクした。次いで、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８によって結合されたＭＴＢＲ−タウを、上で記載されるのと同じ手段で、質量分析と連動した液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）によってアッセイした。図３２に示されるように、ヒトＣＳＦにおける結合したＭＴＢＲ−タウの量は、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の処理によって用量依存的に増加した。このデータも、ヒトＣＳＦにおけるＭＴＢＲ−タウに対する７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体の標的関与を示す。

【0306】

[0325]実施例１９：ＣＤ３２Ａ過剰発現ＣＨＯ細胞におけるタウ取り込みの測定
標識されたタウ単量体及びフィブリルの調製。野生型組み換え全長ヒト２Ｎ４Ｒタウ凝集体を、実施例１７におけるＰ３０１Ｓタンパク質に関して記載される単量体から調製した。標識化の前に、凝集体を超音波処理して、アッセイに用いられるフィブリルを作出した。タウフィブリル及び単量体の両方を、２つの形態のタンパク質間でわずかな違いを有して、メーカーの取扱説明書に従ってＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８ ＮＨＳ−エステルキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃４６４０３）を用いて蛍光標識した：１５０μＬのタウ単量体（１００μＭ）を１００μＬのＤｙＬｉｇｈｔ ＮＨＳエステル溶液と混合し、一方で３００μＬのタウー−４４１フィブリル（５８７μｇ／ｍＬ）を６６μＬのＤｙＬｉｇｈｔ ＮＨＳエステル溶液と混合した。標識化を室温で１時間実施した。１２５μＬの標識されたタウ単量体又は１２２μＬの標識されたフィブリルを用いて、コンジュゲートしていない過剰な色素を、メーカーのプロトコールに従ってＰｉｅｒｃｅ（商標）色素除去カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃２２８５８、ロット＃ＳＬ２６００９９）で除去した。標識されたタウ単量体及びフィブリルの最終濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって測定し、−８０℃で保管した。

【0307】

[0326]細胞に基づくアッセイ。ＣＤ３２ａ（ＦｃガンマＲＩＩＡ）を安定に発現する凍結されたＣＨＯ細胞を３７℃の水槽で迅速に融解し、ＣＨＯ培地（１０％胎仔ウシ血清、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びペニシリン／ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ １６４０培地）に入れた。細胞を９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６０３）に１×１０^４個細胞／ウェル（１００μＬ／ウェル）で播種し、５％ＣＯ_２大気中３７℃で２４時間インキュベートした。標識されたタウ単量体及びフィブリルを氷上で融解し、アッセイバッファー（ＲＰＭＩ １６４０培地）（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２１８７５−０３４）中にそれぞれ１．５μｇ／ｍＬ又は０．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。次いで、６０μＬの総容量で、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（最終濃度：０．３又は３μｇ／ｍＬ）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ０２９７）（最終濃度：３μｇ／ｍＬ）、又はビヒクル（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５）をタンパク質のいずれかの形態に添加し、光から保護して室温で１時間インキュベートした。ＣＨＯ培地をプレートから除去し、９０μｌのアッセイバッファー、又はこれもまたアッセイバッファー中１００μｇ／ｍＬに希釈されたポリクローナル抗体Ｆｃ受容体結合阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１６−９１６１−７１）で細胞を前処理した。次いで、細胞を５％ＣＯ_２大気中３７℃で３０分間インキュベートした。次に、関連するウェルは、抗体の有り又は無しで、１０μＬの標識されたタウ単量体又はタウフィブリル混合物を受け、プレートを再度５％ＣＯ_２大気中３７℃でさらに６０分間インキュベートした。各処理を五つ組ウェルで実施した。６つの独立した実験をタウ単量体取り込みアッセイに関して実施し、５つの独立した実験を完了してタウフィブリル取り込みを測定した。

【0308】

[0327]細胞の固定及び染色。最後のインキュベーション期間の後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中にて室温で３０分間固定した。次いで、各ウェルを１００μＬの水で洗浄し、７０μＬのＨｏｅｃｈｓｔ染色バッファー（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液（最終濃度：０．２％）及びＨｏｅｃｈｓｔ溶液（最終濃度：０．０２％））によって置き換えた。プレートにカバーをし、光から保護しながら室温で３０分間インキュベートした。次いで、染色バッファーを除去し、各ウェルを１００μＬの水で２回を上回る回数洗浄した。

【0309】

[0328]細胞イメージング。各ウェルの蛍光画像をセロミクス（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）ハイコンテントイメージングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて獲得した。各ウェルにおける標識されたタウの総強度及びＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞の数を記録し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＣＳ Ｓｔｕｄｉｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ソフトウェアを用いて分析した。

【0310】

[0329]データ分析。細胞あたりのタウシグナルの総強度の平均を測定し、タウ取り込み効果を、ＴＩＢＣＯスポットファイアソフトウェアプログラムにおいて以下の式を用いて算出した。
タウ取り込み効果（対照についての％）＝Ｔ_１／Ｃ_１×１００
式中、Ｔ_１：抗体で処理されたサンプルにおける細胞あたりのＤｙＬｉｇｈｔ４８８ ＮＨＳコンジュゲートタウシグナルの総強度、及び
Ｃ_１：７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８（３０μｇ／ｍＬ）で処理されたサンプルにおける細胞あたりのＤｙＬｉｇｈｔ４８８ ＮＨＳコンジュゲートタウシグナルの総強度。

【0311】

[0330]統計分析。データは、平均±ＳＥＭとして表現されている。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において一元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて実施された。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。

【0312】

[0331]図３３Ａ及び３３Ｂは、ＣＤ３２Ａを過剰発現するＣＨＯ細胞における、それぞれタウ単量体又はフィブリルの取り込みの効力を示している。７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（３μｇ／ｍＬ）は、ヒトＩｇＧ１対照（３μｇ／ｍＬ）と比較して、タウ単量体取り込みを有意に増加させた（図３３Ａ）。同じように、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体（０．３及び３μｇ／ｍＬ）は、ヒトＩｇＧ１対照（３μｇ／ｍＬ）と比較して、タウフィブリル取り込みも有意に増加させた（図３３Ｂ）。両方の場合において、ＦｃＲ阻害剤処理は、この細胞アッセイシステムにおいて、７Ｇ６−ＨＣｚｕ２５−ＬＣｚｕ１８抗体により誘導されたタウ取り込みの効果を有意に遮断した。

【0313】

［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、２０１７年１０月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／５７２，９１０号；２０１７年１０月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／５７７，０１１号；及び２０１８年７月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／６９７，０３４号の利益を主張するものである。これらの出願のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0314】

［配列表］
[0002]本出願は、９１６，０５３バイトのサイズを有する、２０１８年９月１７日に作成された、「１０４０１８＿００１０２５＿ＳＬ．ｔｘｔ」と名付けられたテキストファイルとして電子的に提出された配列表を含む。配列表は、参照により本明細書に組み入れられる。

【図1】

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【図2】

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【図3A】

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【図3B】

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【図4】

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【図5A】

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【図5B】

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【図6A】

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【図6B】

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【図6C】

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【図6D】

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【図7】

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【図8】

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【図9】

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【図10】

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【図11】

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【図12】

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【図13A】

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【図13B】

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【図13C】

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【図13D】

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【図13E】

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【図13F】

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【図14】

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【図15】

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【図16】

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【図17】

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【図18】

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【図19A】

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【図19B】

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【図20A】

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【図20B-20C】

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【図21A】

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【図21B】

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【図22A】

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【図22B】

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【図22C】

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【図22D】

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【図22E】

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【図22F】

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【図22G】

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【図22H】

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【図22I】

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【図22J】

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【図22K】

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【図22L】

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【図23A】

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【図23B】

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【図24A】

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【図24B】

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【図24C】

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【図24D】

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【図25】

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【図26A】

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【図26B】

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【図27】

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【図28】

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【図29】

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【図30A】

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【図30B】

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【図30C】

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【図30D】

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【図31A】

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【図31B】

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【図32】

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【図33A】

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【図33B】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]