特許 6853042 ＨＥＲ２エピトープに対するモノクローナル抗体及びその使用法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6853042

(24)【登録日】2021年3月15日

(45)【発行日】2021年3月31日

(54)【発明の名称】ＨＥＲ２エピトープに対するモノクローナル抗体及びその使用法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20210322BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210322BHJP

   C07K 17/08 20060101ALI20210322BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210322BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20210322BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210322BHJP

   A61K 47/59 20170101ALI20210322BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210322BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20210322BHJP

   A61K 38/08 20190101ALN20210322BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/30

   C12N15/13ZNA

   C07K17/08

   A61K39/395 T

   A61P35/02

   A61P35/00

   A61K47/59

   C12N15/63 Z

   C12P21/08

   !A61K38/08

【請求項の数】31

【全頁数】136

(21)【出願番号】特願2016-573519(P2016-573519)

(86)(22)【出願日】2015年6月18日

(65)【公表番号】特表2017-519759(P2017-519759A)

(43)【公表日】2017年7月20日

(86)【国際出願番号】US2015036431

(87)【国際公開番号】WO2015195917

(87)【国際公開日】20151223

【審査請求日】2018年6月18日

(31)【優先権主張番号】62/013,944

(32)【優先日】2014年6月18日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/034,489

(32)【優先日】2014年8月7日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/147,960

(32)【優先日】2015年4月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/149,444

(32)【優先日】2015年4月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】513309292

【氏名又は名称】メルサナ セラピューティクス，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100166165

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 英直

(72)【発明者】

【氏名】ネイトルヤ ディー．ボディアク

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ジェイ．デビット

(72)【発明者】

【氏名】エリック エム．クラウランド

(72)【発明者】

【氏名】ティモシー ビー．ローインガー

(72)【発明者】

【氏名】ピーター ユー．パーク

(72)【発明者】

【氏名】ビアンカ プリンツ

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンドル ブイ．ユルコベツキー

【審査官】 星 功介

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５４５３２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０３／００６５０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０７２４４８２６（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０３２１５８３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１８５７０４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４，４７／００−４７／６９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片が、以下の：
ａ）アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＳＭＮ（配列番号２５）を含む重鎖可変領域相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）を含む重鎖可変領域相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、アミノ酸配列ＧＧＨＧＹＦＤＬ（配列番号２７）を含む重鎖可変領域相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号２８）を含む軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、アミノ酸配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２１）を含む軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、およびアミノ酸配列ＱＱＹＨＨＳＰＬＴ（配列番号２９）を含む軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む、抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

前記抗体又はその抗原結合断片が、以下の：
配列番号１３のアミノ酸配列又は当該配列に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖、および配列番号１４のアミノ酸配列又は当該配列に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、又は
配列番号５のアミノ酸配列又は当該配列に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列又は当該配列に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、
を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

前記抗体又はその抗原結合断片が、トラスツズマブ又はペルツズマブ又はＦａｂ３７モノクローナル抗体又はｃｈＡ２１モノクローナル抗体と、ヒトＨＥＲ２受容体への結合について競合しない、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

前記抗体又はその抗原結合断片が、キメラ、ヒト化、または完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

前記抗体又はその抗原結合断片が、放射性リガンド結合アッセイにより測定した場合にヒトＨＥＲ２受容体に対して、１００ｎＭ未満のＫｄを示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

前記抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、又は単鎖抗体（ｓｃＡｂ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩｇＧイソタイプ又はＩｇＧ１イソタイプである、請求項1〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子。

【請求項9】

請求項８に記載の単離核酸分子を含むベクター。

【請求項10】

細胞は請求項９に記載のベクターを含み、前記抗体又はその抗原結合断片の発現を生じる条件で前記細胞を培養することにより、抗体又はその抗原結合断片を作製する方法。

【請求項11】

請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、１種以上の治療薬又は診断薬（Ｄ）とを含み、その各々が独立して、直接的又は間接的に前記抗体又はその抗原結合断片に連結される、複合体。

【請求項12】

前記抗体又はその抗原結合断片に連結された１又は複数の重合体足場材料をさらに含み、前記１種以上のＤの各々が、前記１又は複数の重合体足場材料を介して独立に前記抗体又はその抗原結合断片に連結されている、請求項１１に記載の複合体。

【請求項13】

１又は複数の重合体足場材料の各々が、独立して、分子量が２ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲のポリ（１−ヒドロキシメチルエチレン＝ヒドロキシメチル−ホルマール）（ＰＨＦ）を含む、請求項１２に記載の複合体。

【請求項14】

前記１種以上の重合体足場材料の各々は、独立して、式（Ｉｃ）で表され、

【化1】

式中、
Ｌ^D1はカルボニル含有部位であり、

【化2】

の各出現は、独立して、生分解性結合を含む第一のリンカーであり、前記結合が切れると、その意図された治療効果に合わせて活性化された形態でＤが放出され、

【化3】

でＬ^D1とＤの間の

【化4】

はＤのＬ^D1への直接又は間接的連結を示し、

【化5】

の各出現は、独立して、前記抗体又はその抗原結合断片にまだ結合していない第二のリンカーであり、Ｌ^P2は前記抗体又はその抗原結合断片の官能基と共有結合をまだ形成していない官能基を含む部位であり、Ｌ^D1とＬ^P2の間の

【化6】

はＬ^P2のＬ^D1への直接又は間接的連結を示し、前記第二のリンカーの各出現は前記第一のリンカーの各出現とは区別され、

【化7】

の各出現は、独立して、Ｄを担持する重合体足場材料をそれぞれ前記抗体又はその抗原結合断片と結合する第三のリンカーであり、Ｌ^P2と連結した末端

【化8】

は、Ｌ^P2の官能基と前記抗体又はその抗原結合断片の官能基の間に共有結合が形成される時のＬ^P2の前記抗体又はその抗原結合断片への直接又は間接的連結を示し、前記第三のリンカーの各出現は、前記第一のリンカーの各出現とは区別され、
ｍは１から３００の整数であり、
ｍ₁は１から１４０の整数であり、
ｍ₂は１から４０の整数であり、
ｍ₃は０から１８の整数であり、
ｍ₄は１から１０の整数であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計は１５から３００の範囲であり、
前記抗体又はその抗原結合断片に結合したＬ^P2の総数は１０以下である、請求項１３に記載の複合体。

【請求項15】

ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計は１５〜１５０の範囲であり、ｍ₁は１〜７０の整数であり、ｍ₂は１〜２０の整数であり、ｍ₃は０〜１０の整数であり、ＰＨＦの分子量は２ｋＤａ〜２０ｋＤａの範囲であるか、又は
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計は２０〜１１０の範囲であり、ｍ₁は２〜５０の整数であり、ｍ₂は２〜１５の整数であり、ｍ₃は０〜８の整数であり、ＰＨＦの分子量は３ｋＤａ〜１５ｋＤａの範囲であるか、又は
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計は４０〜７５の範囲であり、ｍ₁は２〜３５の整数であり、ｍ₂は２〜１０の整数であり、ｍ₃は０〜５の整数であり、ＰＨＦの分子量は、５ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲であるか、又は
Ｌ^P2の官能基は、−ＳＲ^p、−Ｓ−Ｓ−ＬＧ、

【化9】

、およびハロから選ばれ、ＬＧは脱離基であり、Ｒ^pはＨ又は硫黄保護基であり、およびＸ_aおよびＸ_bの一方はＨであり、他方は水溶性マレイミド遮断部位である、あるいは結合した炭素と共に炭素−炭素二重結合を形成するＸ_aおよびＸ_bであるか、又は
Ｌ^D1は、

【化10】

のカルボニル基に直接連結された−Ｘ−（ＣＨ₂）_v−Ｃ（＝Ｏ）−を含み、ＸはＣＨ₂、Ｏ、又はＮＨであり、ｖは１〜６の整数であるか、又は

【化11】

の各出現は独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ−（ＣＨ₂）_v−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ₂）_u−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ₂）_w−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_x−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ₂）_y−Ｍであり、ＸはＣＨ₂、Ｏ、又はＮＨであり、ｖ、ｕ、ｗ、ｘ、およびｙのそれぞれは、独立して、１〜６の整数であり、Ｍは

【化12】

であり、Ｘ_aおよびＸ_bの一方はＨであり、他方は水溶性マレイミド遮断部位であるか、あるいはＸ_aおよびＸ_bは、それらが結合する炭素と共に炭素−炭素二重結合を形成する、請求項１４に記載の複合体。

【請求項16】

ｖ、u、w、x及びyの各々が２である、請求項１５に記載の複合体。

【請求項17】

前記１種以上のDのそれぞれは、分子量が５ｋＤａ以下の治療薬である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項18】

前記１種以上の重合体足場材料のそれぞれは、独立して、式（Ｉｄ）で表され、

【化13】

式中、
ｍ_3aは０〜１７の整数であり、
ｍ_3bは１〜８の整数であり、
末端

【化14】

は、前記１種以上の重合体足場材料が前記抗体又はその抗原結合断片に直接連結していることを示す、請求項１６に記載の複合体。

【請求項19】

前記１種以上のＤの少なくとも１種は診断薬である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項20】

前記抗体又はその抗原結合断片の分子量は４０ｋＤａ以上である、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項21】

前記１種以上のＤのそれぞれは、独立して、非重合体連結部位を介して前記抗体又はその抗原結合断片に連結される、請求項１１に記載の複合体。

【請求項22】

前記１種以上の重合体足場材料のそれぞれは、独立して、式（Ｉｆ）で表され、

【化15】

式中、
ｍは１から３００の整数であり、
ｍ₁は１から１４０の整数であり、
ｍ₂は１から４０の整数であり、
ｍ_3aは０〜１７の整数であり、
ｍ_3bは１〜８の整数であり、
ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜１８の範囲であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は１５〜３００の範囲であり、
末端

【化16】

は、前記１種以上の重合体足場材料のヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合断片への連結を示し、前記ＰＨＦと前記抗体の比率は１０以下である、請求項１３に記載の複合体。

【請求項23】

式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量は２ｋＤａ〜２０ｋＤａであり、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は１５〜１５０の範囲であり、ｍ₁は１〜７０の整数であり、ｍ₂は１〜２０の整数であり、ｍ_3aは０〜９の整数であり、ｍ_3bは１〜８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜１０の範囲であり、前記ＰＨＦと前記抗ＨＥＲ２抗体の比率は２〜８の整数であるか、又は
式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量は３ｋＤａ〜１５ｋＤａの範囲であり、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は２０〜１１０の範囲であり、ｍ₁は２〜５０の整数であり、ｍ₂は２〜１５の整数であり、ｍ_3aは０〜７の整数であり、ｍ_3bは１〜８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜８の範囲であり、前記ＰＨＦとおよび前記抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片の比率は２〜８であるか、又は
式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量は５ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲であり、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は４０〜７５の範囲であり、ｍ₁は２〜３５の整数であり、ｍ₂は２〜１０の整数であり、ｍ_3aは０〜４の整数であり、ｍ_3bは１〜５の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜５の範囲であり、前記ＰＨＦと前記抗ＨＥＲ２抗体の比率は２〜８の整数であるか、又は
式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量は５ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲であり、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は４０〜７５の範囲であり、ｍ₁は２〜３５の整数であり、ｍ₂は２〜１０の整数であり、ｍ_3aは０〜４の整数であり、ｍ_3bは１〜５の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜５の範囲であり、前記ＰＨＦと前記抗ＨＥＲ２抗体の比率は２〜６の整数である、請求項２２に記載の複合体。

【請求項24】

請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の複合体を作製する方法であって、前記複合体が形成されるように、ヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合断片を式（Ｉａ）の重合体足場材料と反応させることを含み、

【化17】

式中、
Ｌ^D1はカルボニル含有部位であって、

【化18】

の各出現は、独立して、生分解性結合を含む第一のリンカーであり、前記結合が切れると、その意図された治療効果に合わせて活性化された形態でＤが放出され、

【化19】

でＬ^D1とＤの間の

【化20】

はＤのＬ^D1への直接又は間接的連結を示し、

【化21】

の各出現は、独立して、前記抗体又はその抗原結合断片にまだ結合していない第二のリンカーであり、Ｌ^P2は前記抗体又はその抗原結合断片の官能基と共有結合をまだ形成していない官能基を含む部位であり、Ｌ^D1とＬ^P2の間の

【化22】

はＬ^P2のＬ^D1への直接又は間接的連結を示し、前記第二のリンカーの各出現は前記第一のリンカーの各出現とは区別され、
ｍは１から３００の整数であり、
ｍ₁は１から１４０の整数であり、
ｍ₂は１から４０の整数であり、
ｍ₃は１〜１８の整数であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、およびｍ₃の合計は１５〜３００の範囲である、前記方法。

【請求項25】

必要とする対象において、癌の症状を軽減する方法に使用するための、請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項26】

前記対象はヒトである、請求項２５に記載の使用のための複合体。

【請求項27】

前記癌は、肛門癌、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭部および頸部癌、肝臓癌、精巣癌、頸部癌、肉腫、血管腫、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、中皮腫、皮膚癌、骨髄腫、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌、脾臓癌、腎臓癌、および胃癌からなる群から選ばれる、請求項２５に記載の使用のための複合体。

【請求項28】

前記癌は、乳癌、胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、および卵巣癌からなる群から選ばれる、請求項２５に記載の使用のための複合体。

【請求項29】

前記方法が、さらに第二薬剤を含む、請求項２５に記載の使用のための複合体。

【請求項30】

前記第二薬剤が、
（ａ）少なくともＨＥＲ２に特異的に結合する第二の抗体又はその抗原結合断片であり
（ｂ）ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ２二量化阻害剤抗体、又はＨＥＲ２抗体とＨＥＲ２二量化阻害剤抗体の組み合わせであり、
（ｃ）トラスツズマブ、ペルツズマブ、又はその組み合わせを含む、請求項２９に記載の使用のための複合体。

【請求項31】

前記対象は、細胞あたり１００，０００ＨＥＲ２分子以下を有すると同定されるか、
又は、前記対象は、試験細胞集団に対して行われた免疫組織化学（ＩＨＣ）分析により検出されたＨＥＲ２の発現のスコアが１＋又は２＋であると確認され、そして
ＨＥＲ２遺伝子は前記試験細胞集団で増幅されていないか、又は
前記対象は化学療法に対して難治性を有するか、又は
前記対象は、アド-トラツズマブエマンタシンによる治療に耐性を有するか、又は
前記対象は、アド-トラツズマブエマンタシンによる治療に耐性を有しないか、又は
前記対象は、試験細胞集団に対して行われた免疫組織化学（ＩＨＣ）分析により検出されたＨＥＲ２の発現のスコアが２＋又は３＋であると確認され、ＨＥＲ２遺伝子は前記試験細胞集団で増幅又は変異されている、請求項２５に記載の使用のための複合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般に、ヒトＨＥＲ２受容体を認識するモノクローナル抗体の生成、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域内にある特定のＨＥＲ２エピトープを認識するモノクローナル抗体、およびこれらモノクローナル抗体を治療法および／または診断法として用いる方法に関する。

【0002】

関連出願
本願は、２０１４年６月１８日に提出された米国特許仮出願第６２／０１３、９４４号、２０１４年８月７日に提出された米国特許仮出願第６２／０３４、４８９号、２０１５年４月１５日に提出された米国特許仮出願第６２／１４７、９６０号、および２０１５年４月月１７日に提出された米国特許仮出願第６２／１４９、４４４号の優先権および利益を主張するものである。これら出願の各内容は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

ＥｒｂＢ族の受容体チロシンキナーゼは、細胞の成長、分化、および生存にとって重要な媒介物である。この受容体族は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５^neu）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含む４つの受容体を含む。ＥＧＦＲ族のこれら４種の受容体はホモ二量体およびヘテロ二量体のいずれも形成する。ＨＥＲ２は、他のＥｒｂＢ受容体にとって好ましく、最も強力な二量化の相手である(Graus-Porta et al., Embo 3 1997; 16:1647-1655; Tao et al., J Cell Sci 2008; 121:3207-3217)。ＨＥＲ２のリガンドは分かってないが、ＨＥＲ２が過剰発現すると同種二量化によって活性化される、あるいは他のリガンドが結合したＥｒｂＢ受容体との異種二量化によって活性化することができる。

【0004】

ＨＥＲ２遺伝子（ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＥｒｂＢ２遺伝子としても知られている）は初期の乳癌の２０〜３０％で増幅して、細胞膜内の上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体を過剰発現させる(Bange, et al., Nature Medicine 7 (5): 548-552)。また、ＨＥＲ２の発現は、乳癌の他に、各種のその他のヒト上皮性悪性腫瘍と関連づけられており、非小細胞肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、食道癌、頭部および頸部の扁上皮細胞上皮性悪性腫瘍等が含まれる(Garcia de Palazzo et al., Int J Biol Markers 1993; 8:233-239; Ross et al., Oncologist 2003; 8:307-325; Osman et al., J Urol 2005; 174:2174-2177; Kapitanovic et al., Gastroenterology 1997; 112:1103-1113; Turken et al., Neoplasma 2003; 50:257-261; and Oshima et al., Int J Biol Markers 2001; 16:250-254)。

【0005】

トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））は、ＨＥＲ２タンパク質の領域ＩＶを標的にした組み換えヒト化モノクローナル抗体であり、リガンドから独立したＨＥＲ２の同種二量化を阻害して、ＨＥＲ２過剰発現が高い細胞内でＨＥＲ２が他の同族体と異種二量化する度合いを下げる(Cho et al., Nature 2003; 421:756-760 and Wehrman et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:19063-19068)。ハーセプチン（登録商標）は、化学療法と組み合わせて、あるいは１つ以上の化学療法計画の後の単剤としての使用がＨＥＲ２を過剰発現している転移性乳癌の最良のアジュバント治療として認められてきた。トラスツズマブは、ＨＥＲ２が過剰発現している胸部腫瘍患者の２０〜５０％にのみ有効であることが分かっており、初期応答した患者の多くで数ヶ月後に再発が見られる(Dinh et al., Clin Adv Hematol Oncol 2007; 5:707-717)。

【0006】

ペルツズマブ（オムニターグ／パージェタ（登録商標）、２Ｃ４とも言う）は、ＨＥＲ２タンパク質の領域ＩＩを標的とした別のヒト化モノクローナル抗体であり、リガンドによって誘発される異種二量化（すなわち、リガンドが結合したＥｒｂＢ族の他の受容体とＨＥＲ２の二量化）を阻害する。その反応機構は、高ＨＥＲ２発現量を厳密には必要としないという報告がある(Franklin et al., Cancer Cell 2004; 5:317-328)。ペルツズマブは、トラスツズマブおよびドセタキセルと組み合わせたＨＥＲ２陽性の転移性乳癌の治療に承認されている。

【0007】

ＨＥＲ２抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）、トラスツズマブエムタンシン（アド−トラスツズマブエムタンシン、カドサイラ（登録商標））は、細胞毒性薬メルタンシン（ＤＭ１）に結合したモノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）からなる抗体−薬物複合体である。単剤としてカドサイラは、ＨＥＲ２陽性の（ＨＥＲ２＋）の患者や、以前にトラスツズマブおよびタキサンを別々あるいは組み合わせて投与された転移性乳癌（ＭＢＣ）患者の治療に承認されてきた。

【0008】

ＨＥＲ２標的治療に好適な抗体の選択には多くの因子が含まれるが、一般に、抗体の結合時にＨＥＲ２−抗体複合体が効果的に内部移行する場合はＡＤＣの手法に利点がある。しかしながら、ＥＧＦＲと比べてＨＥＲ２の内部移行は劣っている。

【0009】

ＨＥＲ２の機能を調節するこの複合体の反応機構は、癌原遺伝子に対する新規で最適な治療方法についてさらなる研究を是認するものである。

【0010】

したがって、ＨＥＲ２の生物活性を標的とする治療法に対する必要性が存在する。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、ｐ１８５^neu、および／またはＨＥＲ２／ｎｅｕとしても知られる）を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。本明細書で開示される抗体は、リン酸化ＡＫＴの量を減らして細胞の生存を促進するＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を調節する（例えば、阻止、阻害、低下、拮抗、中和、あるいは干渉）することができ、かつ有用である。本明細書で開示される抗体はまた、ＨＥＲ２のリガンドから独立した同種二量化および／または異種二量化を調節する（例えば、阻止、阻害、低下、拮抗、中和、あるいは干渉）することができ、かつ有用である。本明細書で開示される抗体はまた、可溶性ＨＥＲ２と結合する抗体を含む。

【0012】

本発明の抗体は、当該分野で記述される抗体とは異なるＨＥＲ２結合特性を示す。特に、本明細書で開示される抗体は、ＨＥＲ２の異なるエピトープに結合する。というのは、これらの抗体はＨＥＲ２への結合を互いに交差阻害するが、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｆａｂ３７、またはｃｈＡ２１がＨＥＲ２に結合することを交差阻害しないからである。さらに、周知の抗体とは反対に、本明細書で開示される抗体は、細胞増殖を促進せずにＨＥＲ２が発現している細胞に効果的に内部移行することができる。

【0013】

本明細書で開示される抗体は、新規なエピトープに結合する完全ヒトモノクローナル抗体であり、かつ／または治療での使用に好ましい他の特性を有する。そのような特性としては、例えば、高濃度または低濃度でヒトＨＥＲ２を発現している癌細胞への好ましい結合特性、組み換えヒトおよびカニクイザルＨＥＲ２への特異的結合、ＨＥＲ２への結合時における効率的内部移行、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）として投与した場合の高濃度または低濃度でＨＥＲ２を発現している癌細胞を殺傷する高い能力、ＨＥＲ２を発現している癌細胞の増殖に及ぼす作動薬効果が実質的にないこと、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）が媒介するＨＥＲ２を発現している細胞の有効な殺傷、およびこれらの特性の任意の組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0014】

本明細書で開示される抗体はまた、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域の残基４５２〜５３１（例えば、配列番号３８の残基４７４〜５５３または配列番号３９の残基４５２〜５３１）を含む、ヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0015】

本明細書で開示される抗体はまた、ヒトＨＥＲ２受容体の領域ＩＶのＮ末端の少なくとも一部と結合するがヒトＨＥＲ２受容体のエピトープ４Ｄ５と結合する抗体とは交差競合しない単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で記載される抗体または抗原結合断片は、ヒトＨＥＲ２受容体への結合でトラスツズマブと交差競合しない。というのは、トラスツズマブはヒトＨＥＲ２受容体のエピトープ４Ｄ５に結合することが分かっているからである。本明細書における用語「ヒトＨＥＲ２受容体のエピトープ４Ｄ５」は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基５２９〜６２７（例えば、配列番号３８の残基５５１〜６４９、または配列番号３９の残基５２９〜６２７）を指す。また、いくつかの態様では、前記単離抗体またはその抗原結合断片は、カニクイザルＨＥＲ２受容体の少なくとも１つのエピトープに結合する。

【0016】

本明細書で開示される抗体はまた、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域の残基４５２〜５００（例えば、配列番号３８の残基４７４〜５２２、または配列番号３９の残基４５２〜５００）を含むヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0017】

本明細書で開示される抗体はまた、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｅ５２１、Ｌ５２５、およびＲ５３０（例えば、配列番号３８の残基５４３、５４７、および５５２、および配列番号３９の残基５２１、５２５、および５３０）からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｅ５２１、Ｌ５２５、およびＲ５３０からなる群から選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。本明細書で開示される抗体はまた、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域の少なくともアミノ酸残基Ｅ５２１、Ｌ５２５、およびＲ５３０を含むヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、また、これら単離抗体またはその抗原結合断片のいずれかまたは全ては、カニクイザルＨＥＲ２受容体の少なくとも１つのエピトープに結合する。

【0018】

本明細書で開示される抗体はまた、ヒトＨＥＲ２受容体の領域ＩＩＩの少なくとも一部および領域ＩＶのＮ末端の少なくとも一部と結合するが、Ｆａｂ３７モノクローナル抗体またはヒトＨＥＲ２受容体のエピトープ４Ｄ５に結合する抗体と交差競合しない、単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＨＥＲ２受容体への結合でＦａｂ３７モノクローナル抗体および／またはトラスツズマブと交差競合しない。いくつかの態様では、単離抗体またはその抗原結合断片はまた、カニクイザルＨＥＲ２受容体の少なくとも１つのエピトープを含む。

【0019】

本明細書で開示される抗体はまた、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域の残基５２０〜５３１（例えば、配列番号３８の残基５４２〜５５３または配列番号３９の残基５２０〜５３１）を含むヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0020】

本明細書で開示される抗体はまた、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域の残基Ｃ４５３、Ｈ４５６、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｇ４９６、Ｈ４９７、およびＷ４９９（例えば、配列番号３８の残基４７５、４７８、４９５、４９８、５１７、５１８、５１９、および５２１、または配列番号３９の残基４５３、４５６、４７３、４７６、４９５、４９６、４９７、および４９９）からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４５６、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｇ４９６、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも２個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４５６、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｇ４９６、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４５６、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｇ４９６、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも４個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４５６、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｇ４９６、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも５個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４５６、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｇ４９６、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも６個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域の少なくともアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４５６、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｇ４９６、Ｈ４９７、およびＷ４９９を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、また、これら単離抗体またはその抗原結合断片のいずれかまたは全ては、カニクイザルＨＥＲ２受容体の少なくとも１個のエピトープと結合する。

【0021】

本明細書で開示される抗体はまた、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域の残基Ｃ４５３、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｈ４９７、およびＷ４９９（例えば、配列番号３８の残基４７５、４９５、４９８、５１７、５１９、および５２１、または配列番号３９の残基４５３、４７３、４７６、４９５、４９７、および４９９）からなる群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも２個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも４個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも５個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｈ４９７、およびＷ４９９からなる群から選ばれる少なくとも６個のアミノ酸残基を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体は、ヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域の少なくともアミノ酸残基Ｃ４５３、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｈ４９７、およびＷ４９９を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、これら単離抗体またはその抗原結合断片のいずれかまたは全ては、カニクイザルＨＥＲ２受容体の少なくとも１個のエピトープに結合する。

【0022】

以下に、本発明のこれらおよび他の側面をさらに詳細に記載する。

【0023】

モノクローナル本明細書で開示される抗体としては、例えば、本明細書で記載されるＸＭＴ１５１７抗体、ＸＭＴ１５１８抗体、ＸＭＴ１５１９抗体、およびＸＭＴ１５２０抗体が挙げられる。あるいは、前記モノクローナル抗体は、互いに交差阻止するが、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｆａｂ３７、またはｃｈＡ２１（それぞれ、ＨＥＲ２の領域ＩＶ、領域ＩＩ、領域ＩＩＩ、および領域Ｉにある特定のエピトープと結合する）またはそのバイオ後続品と同じエピトープに結合しない。本明細書では、これらの抗体は、それぞれ「ＨＥＲ２」抗体と言う。ＨＥＲ２抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、およびキメラ抗体を含む。これらの抗体は、ヒトＨＥＲ２に対する特異性を示し、リン酸化ＡＫＴの量を減らして細胞の生存を促進するＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を調節する（例えば、阻止、阻害、低下、拮抗、中和、あるいは干渉）することが示されている。これら抗体は、トラスツズマブまたはそのバイオ後続品の内部移行と同じまたは実質的に同程度の割合でＨＥＲ２を発現している細胞の表面から内部移行する。例えば、これら抗体および抗原結合断片は、（細胞に）結合（０時間）してから４時間までに内部移行する内部移行率が全表面の約５０％である。

【0024】

本明細書で開示される抗体は、配列番号１、３、５、および７からなる群から選ばれる配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２、４、６、および８からなる群から選ばれる配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。

【0025】

本明細書で開示される抗体は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖アミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖アミノ酸配列、および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖アミノ酸配列、および配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖アミノ酸配列、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖アミノ酸配列からなる群から選ばれる重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0026】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖アミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0027】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖アミノ酸配列、および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0028】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖アミノ酸配列、および配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0029】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖アミノ酸配列、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0030】

本明細書で開示される抗体は、配列番号１、３、５、および７からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２、４、６、および８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。

【0031】

本明細書で開示される抗体は、（ｉ）前記配列番号１の重鎖アミノ酸配列および前記配列番号２の軽鎖アミノ酸配列、（ｉｉ）前記配列番号３の重鎖アミノ酸配列および前記配列番号４の軽鎖アミノ酸配列、（ｉｉｉ）前記配列番号５の重鎖アミノ酸配列および前記配列番号６の軽鎖アミノ酸配列、および（ｉｖ）前記配列番号７の重鎖アミノ酸配列および前記配列番号８の軽鎖アミノ酸配列からなる群から選ばれる重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0032】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、前記配列番号１の重鎖アミノ酸配列および前記配列番号２の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0033】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、前記配列番号３の重鎖アミノ酸配列および前記配列番号４の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0034】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、前記配列番号５の重鎖アミノ酸配列および前記配列番号６の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0035】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、前記配列番号７の重鎖アミノ酸配列および前記配列番号８の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0036】

本明細書で開示される抗体は、配列番号９、１１、１３、および１５からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１０、１２、１４、および１６からなる群から選ばれる配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0037】

本明細書で開示される抗体は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列からなる群から選ばれる重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0038】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。

【0039】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。

【0040】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。

【0041】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。

【0042】

本明細書で開示される抗体は、配列番号９、１１、１３、および１５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１０、１２、１４、および１６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0043】

本明細書で開示される抗体は、（ｉ）配列番号９の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１０の軽鎖可変領域アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１１の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１２の軽鎖可変領域アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１３の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１４の軽鎖可変領域アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号１５の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１６の軽鎖可変領域アミノ酸配列からなる群から選ばれる重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0044】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、前記配列番号９の重鎖可変領域アミノ酸配列、および前記配列番号１０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。

【0045】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、前記配列番号１１の重鎖可変領域アミノ酸配列および前記配列番号１２の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。

【0046】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、前記配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および前記配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0047】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、前記配列番号１５の重鎖可変領域アミノ酸配列、および前記配列番号１６の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。

【0048】

本明細書で開示される抗体の３つの重鎖ＣＤＲは、配列番号１７、２５、および３０からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、配列番号１８、２３、２６、および３１からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および配列番号１９および２７からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）を含むアミノ酸配列を含む。

【0049】

本明細書で開示される抗体の３つの軽鎖ＣＤＲは、配列番号２０および２８からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１および２４からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および配列番号２２および２９からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む。

【0050】

前記抗体は、配列番号１７、２５、および３０からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１８、２３、２６、および３１からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号１９および２７からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号２０および２８からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１および２４からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号２２および２９からなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む、重鎖ＣＤＲ配列および軽鎖ＣＤＲ配列の組み合わせを含む。

【0051】

本明細書で開示される抗体の３つの重鎖ＣＤＲは、配列番号１７、２５、および３０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１８、２３、２６、および３１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１９および２７からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む。

【0052】

本明細書で開示される抗体の３つの軽鎖ＣＤＲは、配列番号２０および２８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１および２４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号２２および２９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む。

【0053】

本明細書で開示される抗体は、配列番号１７、２５、および３０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１８、２３、２６、および３１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号１９および２７からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、配列番号２０および２８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１および２４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号２２および２９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む重鎖ＣＤＲ配列および軽鎖ＣＤＲ配列の組み合わせを含む。

【0054】

本明細書で開示される抗体は、（ｉ）配列番号１７のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号１８のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号１９のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号２０のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、および配列番号２２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１７のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２３のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号１９のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号２０のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２４のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、および配列番号２２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２５のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２６のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号２７のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号２８のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、および配列番号２９のＣＤＲＬ３アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号３０のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号２７のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号２８のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、および配列番号２９のＣＤＲＬ３アミノ酸配列からなる群から選ばれる重鎖相補性決定領域アミノ酸配列および軽鎖相補性決定領域アミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0055】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号１７のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号１８のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号１９のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号２０のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、および配列番号２２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号１７のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２３のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号１９のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号２０のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２４のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、および配列番号２２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。

【0057】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号２５のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２６のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号２７のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号２８のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、および配列番号２９のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。

【0058】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体は、配列番号３０のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号２７のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号２８のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、および配列番号２９のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。

【0059】

いくつかの態様では、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体はまた、前記抗体に結合した薬剤を含む。いくつかの態様では、前記薬剤は治療薬である。いくつかの態様では、前記薬剤は抗腫瘍薬である。いくつかの態様では、前記薬剤は、毒素またはその断片である。いくつかの態様では、前記薬剤は（ａ）オーリスタチン化合物、（ｂ）カリケアマイシン化合物、（ｃ）デュオカルマイシン化合物、（ｄ）ＳＮ３８、（ｅ）ピロロベンゾジアゼピン、（ｆ）ビンカ化合物、（ｇ）ツブリシン化合物、（ｈ）非天然のカンプトセシン化合物、（ｉ）メイタンシノイド化合物、（ｊ）ＤＮＡ結合薬物、（ｋ）キナーゼ阻害剤、（ｌ）ＭＥＫ阻害剤、（ｍ） ＫＳＰ阻害剤、（ｎ）トポイソメラーゼ阻害剤、およびこれらの類縁体またはその類似物である。いくつかの態様では、前記薬剤は、リンカーを介してＨＥＲ２抗体に結合している。いくつかの態様では、前記リンカーは開裂可能なリンカーである。いくつかの態様では、前記リンカーは開裂不能なリンカーである。いくつかの態様では、前記薬剤は本明細書で記載される任意のいずれかである。

【0060】

一側面では、本明細書で記載されるＨＥＲ２抗体複合体(conjugate)は、１種以上の治療薬または診断薬（Ｄ）に直接または関節に結合した単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、前記ＨＥＲ２抗体複合体はまた、前記抗体またはその抗原結合断片に結合した１種以上の重合体足場材料を含み、前記１種以上の治療薬または診断薬Ｄのそれぞれは、前記１種以上の重合体足場材料を介して前記抗体またはその抗原結合断片に独立して結合している。

【0061】

いくつかの態様では、前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片に結合した１種以上の重合体足場材料は、それぞれ独立に、分子量が約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲のポリ（１−ヒドロキシメチルエチレン＝ヒドロキシメチル−ホルマール）（ＰＨＦ）を含む。

【0062】

いくつかの態様では、それぞれの１種以上の重合体足場材料は、独立に式（Ｉｃ）で表される：

【化1】

式中、
Ｌ^D1はカルボニルを含む部位であり、

【化2】

の各出現は、独立して、生分解性結合を含む第一のリンカーであり、前記結合が切れると、その意図された治療効果に合わせて活性化された形態でＤが放出され、

【化3】

はＤのＬ^D1への直接または間接的連結を示し、

【化4】

の各出現は、独立して、前記単離抗体またはその抗原結合断片にまだ結合していない第二のリンカーであり、Ｌ^P2は前記単離抗体またはその抗原結合断片の官能基と共有結合をまだ形成していない官能基を含む部位であり、Ｌ^D1とＬ^P2の間の

【化5】

はＬ^P2のＬ^D1への直接または間接的連結を示し、前記第二のリンカーの各出現は前記第一のリンカーの各出現とは区別され、

【化6】

の各出現は、独立して、各Ｄ担持重合体足場材料を前記単離抗体またはその抗原結合断片と結合する第三のリンカーであり、Ｌ^P2と連結した末端

【化7】

は、Ｌ^P2の官能基と前記単離抗体またはその抗原結合断片の官能基の間に共有結合が形成される時のＬ^P2の前記単離抗体またはその抗原結合断片への直接または間接的連結を示し、前記第三のリンカーの各出現は、前記第一のリンカーの各出現とは区別され、
ｍは１から約３００の整数であり、
ｍ₁は１から約１４０の整数であり、
ｍ₂は１から約４０の整数であり、
ｍ₃は０から約１８の整数であり、
ｍ₄は１から約１０の整数であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計は約１５から約３００の範囲であり、
前記単離抗体またはその抗原結合断片に結合したＬ^P2の総数は１０以下である。

【0063】

本明細書で記載される複合体は、以下の特徴事項を１つ以上含む。

【0064】

例えば、式（Ｉｃ）で、前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片は、分子量が４０ｋＤａ以上（例えば、６０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１６０ｋＤａ以上、１８０ｋＤａ以上、または２００ｋＤａ以上、または約４０〜２００ｋＤａ、４０〜１８０ｋＤａ、４０〜１４０ｋＤａ、６０〜２００ｋＤａ、６０〜１８０ｋＤａ、６０〜１４０ｋＤａ、８０〜２００ｋＤａ、８０〜１８０ｋＤａ、８０〜１４０ｋＤａ、１００〜２００ｋＤａ、１００〜１８０ｋＤａ、１００〜１４０ｋＤａ、または１４０〜１５０ｋＤａ）である。いくつかの態様では、前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片は本開示の抗体または抗原結合断片のいずれかである。その例としては、例えば、本明細書で記載されるＸＭＴ１５１７抗体、ＸＭＴ１５１８抗体、ＸＭＴ１５１９抗体、およびＸＭＴ１５２０抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

例えば、式（Ｉｃ）で、ｍ₁は１〜約１２０の整数（例えば、約１〜９０）、かつ／またはｍ₃は１〜約１０の整数（例えば、約１〜８）である。

【0066】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約６ｋＤａ〜約２０ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約４５〜約１５０）の範囲である場合、ｍ₂は２〜約２０の整数であり、ｍ₃は０〜約９の整数であり、ｍ₄は１〜約１０の整数であり、かつ／またはｍ₁は１〜約７５の整数（例えば、ｍ₁は約４〜４５）である。

【0067】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約８ｋＤａ〜約１５ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約６０〜約１１０）の範囲である場合、ｍ₂は２〜約１５の整数、ｍ₃は０〜約７の整数、ｍ₄は１〜約１０の整数、かつ／またはｍ₁は１〜約５５の整数（例えば、ｍ₁は約４〜３０）である。

【0068】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約２ｋＤａ〜約２０ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約１５〜約１５０）の範囲である場合、ｍ₂は１〜約２０の整数であり、ｍ₃は０〜約１０（例えば、ｍ₃は０〜約９の範囲）の整数であり、ｍ₄は１〜約８の整数であり、かつ／またはｍ₁は１〜約７０の整数であり、前記単離抗体またはその抗原結合断片に結合したＬ^P2の総数は、約２〜約８の範囲（例えば、約２、３、４、５、６、７、または８）である。

【0069】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約３ｋＤａ〜約１５ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約２０〜約１１０）の範囲である場合、ｍ₂は２〜約１５の整数であり、ｍ₃は０〜約８（例えば、ｍ₃は０〜約７の範囲）の整数であり、ｍ₄は１〜約８の整数であり、かつ／またはｍ₁は２〜約５０の整数であり、前記単離抗体またはその抗原結合断片に結合したＬ^P2の総数は、約２〜約８の範囲（例えば、約２、３、４、５、６、７、または８）である。

【0070】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａ（すなわちｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約４０〜約７５）の範囲である場合、ｍ₂は約２〜約１０の整数（例えば、ｍ₂は約３〜１０）であり、ｍ₃は０〜約５（例えば、ｍ₃は０〜約４の範囲）の整数であり、ｍ₄は１〜約８（例えば、ｍ₄は１〜約５の範囲）の整数であり、かつ／またはｍ₁は約２〜約３５（例えば、ｍ₁は約５〜３５）の整数であり、前記単離抗体またはその抗原結合断片に結合したＬ^P2の総数は約２〜約８の範囲（例えば、約２、３、４、５、６、７、または８）である。

【0071】

例えば、Ｄの各出現は、独立して、分子量が５ｋＤａ以下の治療薬である。

【0072】

例えば、Ｄの各出現は、独立して、例えばビンカアルカロイド、オーリスタチン、ツブリシン、デュオカルマイシン、非天然のカンプトセシン化合物、メイタンシノイド、カリケアマイシン化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ結合薬物、キナーゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＫＳＰ阻害剤、およびこれらの類縁体から選ばれる抗癌剤である。

【0073】

例えば、単離抗体またはその抗原結合断片に結合していない場合、各

【化8】

は、独立して末端基Ｗ^Pを含み、各Ｗ^Pは独立して以下のものである。

【化9】

式中Ｒ^1Kは脱離基（例えば、ハロゲンまたはＲＣ（Ｏ）Ｏ−（Ｒは水素、脂肪族部位、複素脂肪族部位、炭素環部位、またはヘテロシクロアルキル部位））であり、Ｒ^1Aは硫黄保護基であり、および環Ａはシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｒ^1Jは水素、脂肪族部位、複素脂肪族部位、炭素環部位、またはヘテロシクロアルキル部位である。

【0074】

例えば、Ｒ^1Aはそれぞれ独立して、

【化10】

（ｒは１または２）であり、Ｒ^s1、Ｒ^s2、およびＲ^s3は、それぞれ水素、脂肪族部位、複素脂肪族部位、炭素環部位、またはヘテロシクロアルキル部位である。

【0075】

例えば、前記単離抗体またはその抗原結合断片の官能基と共有結合をまだ形成していないＬ^P2の官能基は、
−ＳＲ^p、−Ｓ−Ｓ−ＬＧ、

【化11】

、およびハロ（ここでＬＧは脱離基であり、Ｒ^pはＨまたは硫黄保護基であり、Ｘ_aおよびＸ_bの一方はＨであり、他方は水溶性マレイミド遮断部位である、あるいはＸ_aおよびＸ_bは、結合した炭素と共に炭素−炭素二重結合を形成する）から選ばれる。例えば、前記共有結合まだ形成していないＬ^P2の官能基は、前記単離抗体またはその抗原結合断片の官能基と反応しない官能基（例えば、Ｌ^P2の官能基としての

【化12】

（ここでＸ_aおよびＸ_bの一方はＨであり、他方は水溶性マレイミド遮断部位である、またはＸ_aおよびＸ_bである）である。

【0076】

例えば、Ｌ^D1は、

【化13】

のカルボニル基に直接結合したＸを有する−Ｘ−（ＣＨ₂）_v−Ｃ（＝Ｏ）−を含み、ここでＸはＣＨ₂、Ｏ、またはＮＨであり、ｖは１〜６の整数である。

【0077】

例えば、

【化14】

の各出現は、独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ−（ＣＨ₂）_v−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ₂）_u−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ₂）_w−（ＯＣＨ₂）_x−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ₂）_y−Ｍである（ここでＸはＣＨ₂、Ｏ、またはＮＨであり、ｖ、ｕ、ｗ、ｘ、およびｙのそれぞれは独立して１〜６の整数であり、Ｍは

【化15】

（Ｘ_aおよびＸ_bの一方はＨであり、他方は水溶性マレイミド遮断部位である、あるいはＸ_aおよびＸ_bは、結合した炭素と共に炭素−炭素二重結合を形成する））である。

【0078】

例えば、ｖ、ｕ、ｗ、ｘ、およびｙのそれぞれは２である。

【0079】

例えば、Ｄと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１である。

【0080】

例えば、Ｄと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約２０：１、１５：１、１０：１、５：１、２：１、または１：１である。

【0081】

例えば、Ｄと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、または１０：１である。

【0082】

例えば、Ｄと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、または１１：１である。

【0083】

例えば、Ｄと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約１５：１、１４：１、１３：１、または１２：１である。

【0084】

例えば、Ｄと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は約６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１である。

【0085】

例えば、前記１種以上のＤ担持重合体足場材料のそれぞれは、独立して式（Ｉｄ）で表される。

【化16】

式中、
ｍ_3aは０〜約１７の整数であり、
ｍ_3bは１〜約８の整数であり、
末端

【化17】

は、前記１種以上の重合体足場材料が分子量４０ｋＤａ以上の前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片に直接連結していることを示す。

【0086】

式（Ｉｄ）の足場材料は、以下の特徴事項を１つ以上含むことができる。

【0087】

ｍ_3aとｍ_3bの合計が１〜１８である。

【0088】

式（Ｉｄ）のＰＨＦの分子量が約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約１５〜約３００の範囲であり、ｍ₁は１〜約１４０の整数であり、ｍ₂は１〜約４０の整数であり、ｍ_3aは０〜約１７の整数であり、ｍ_3bは１〜約８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約１８の範囲であり、ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比率は１０以下である。

【0089】

式（Ｉｄ）のＰＨＦの分子量が約２ｋＤａ〜約２０ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約１５〜約１５０の範囲であり、ｍ₁は１〜約７０の整数であり、ｍ₂は１〜約２０の整数であり、ｍ_3aは０〜約９の整数であり、ｍ_3bは１〜約８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約１０の範囲であり、ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比率は２〜約８の整数である。

【0090】

式（Ｉｄ）のＰＨＦの分子量が約３ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約２０〜約１１０の範囲であり、ｍ₁は２〜約５０の整数であり、ｍ₂は２〜約１５の整数であり、ｍ_3aは０〜約７の整数であり、ｍ_3bは１〜約８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約８の範囲であり、ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比率は２〜約８（例えば、約２〜約６または約２〜約４）である。

【0091】

式（Ｉｄ）のＰＨＦの分子量が約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａである場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約４０〜約７５の範囲であり、ｍ₁は約２〜約３５の整数であり、ｍ₂は約２〜約１０の整数であり、ｍ_3aは０〜約４の整数であり、ｍ_3bは１〜約５の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約５の範囲であり、ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比率は２〜約８の整数（例えば、約２〜約６または約２〜約４）である。

【0092】

特定の態様では、オーリスタチンＦヒドロキシルプロピルアミド（「ＡＦ ＨＰＡ」）と前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、または６：１であってもよい。

【0093】

特定の態様では、ＡＦ ＨＰＡおよび 前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、または６：１であってもよい。

【0094】

他の態様では、前記ＡＦ ＨＰＡと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、または６：１であってもよい。

【0095】

いくつかの態様では、前記ＡＦ ＨＰＡと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、または１０：１であってもよい。

【0096】

いくつかの態様では、前記ＡＦ ＨＰＡと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、または１１：１であってもよい。

【0097】

いくつかの態様では、前記ＡＦ ＨＰＡと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約１５：１、１４：１、１３：１、または１２：１であってもよい。

【0098】

特定の態様では、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１であってもよい。

【0099】

特定の態様では、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、または２：１であってもよい。

【0100】

他の態様では、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１であってもよい。

【0101】

他の態様では、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約６：１、５：１、４：１、３：１、または２：１であってもよい。

【0102】

他の態様では、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約６：１、５：１、４：１、または３：１であってもよい。

【0103】

いくつかの態様では、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約５：１、４：１、または３：１であってもよい。

【0104】

いくつかの態様では、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比は、約４：１、３：１、または２：１であってもよい。

【0105】

前記水溶性マレイミド遮断部位（例えば、Ｘ_aまたはＸ_b）は、式（ＩＩ）のチオール含有化合物とマレイミド基の反応でオレフィンの炭素の２個のうちの１個に共有結合することができる部位である。
Ｒ₉₀−（ＣＨ₂）_d−ＳＨ （ＩＩ）
式中、
Ｒ₉₀は、ＮＨＲ₉₁、ＯＨ、ＣＯＯＲ₉₃、ＣＨ（ＮＨＲ₉₁）ＣＯＯＲ₉₃、または置換されたフェニル基であり、
Ｒ₉₃は水素またはＣ_1-4アルキルであり、
Ｒ₉₁は水素、ＣＨ₃、またはＣＨ₃ＣＯであり、
ｄは１〜３の整数である。

【0106】

一態様では、式（ＩＩ）の水溶性マレイミド遮断化合物は、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、システインメチルエステル、Ｎ−メチルシステイン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパン酸、２−メルカプト酢酸、メルカプトメタノール（すなわち、ＨＯＣＨ₂ＳＨ）、ベンジルチオール（フェニル基は１個以上の親水性置換基で置換されている）、または３−アミノプロパン−１−チオールであってもよい。フェニル基の１個以上の親水性置換基としては、ＯＨ、ＳＨ、メトキシ、エトキシ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＣ_1-4アルキル、ＮＨ₂、Ｆ、シアノ、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ等が挙げられる。

【0107】

他の側面では、水溶性マレイミド遮断基は−Ｓ−（ＣＨ₂）_d−Ｒ₉₀であり、
Ｒ₉₀はＯＨ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ（ＮＨＲ₉₁）ＣＯＯＲ₉₃であり、
Ｒ₉₃は水素またはＣＨ₃であり、
Ｒ₉₁は水素またはＣＨ₃ＣＯであり、
ｄは１または２である。

【0108】

他の態様では、前記水溶性マレイミド遮断基は−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯＯＨである。

【0109】

特定の態様では、本明細書で記載される複合体は１種以上のＤ担持ＰＨＦを含む。前記１種以上のＤ担持ＰＨＦはそれぞれ式（Ｉｆ）で表され、約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲の分子量を有する。

【化18】

式中、
ｍは１〜約３００の整数であり、
ｍ₁は１〜約１４０の整数であり、
ｍ₂は１〜約４０の整数であり、
ｍ_3aは０〜約１７の整数であり、
ｍ_3bは１〜約８の整数であり、
ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約１８の範囲であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約１５〜約３００の範囲であり、
末端

【化19】

は、１つ以上のＰＨＦ重合体足場材料の、前記ヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片への連結を示し、アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＳＭＮ（配列番号２５）を含む重鎖可変領域相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）を含む重鎖可変領域相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、アミノ酸配列ＧＧＨＧＹＦＤＬ（配列番号２７）を含む重鎖可変領域相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号２８）を含む軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、アミノ酸配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２１）を含む軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、およびアミノ酸配列ＱＱＹＨＨＳＰＬＴ（配列番号２９）を含む軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含み、
前記ＰＨＦと前記抗体の比率は１０以下である。

【0110】

式（Ｉｆ）の足場材料は、以下の特徴事項を１つ以上含んでいてもよい。

【0111】

式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量が約２ｋＤａ〜約２０ｋＤａである場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約１５〜約１５０の範囲であり、ｍ₁は１〜約７０の整数であり、ｍ₂は１〜約２０の整数であり、ｍ_3aは０〜約９の整数であり、ｍ_3bは１〜約８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約１０の範囲であり、前記ＰＨＦと前記抗体の比率は２〜約８の整数である。

【0112】

式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量が約３ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約２０〜約１１０の範囲であり、ｍ₁は２〜約５０の整数であり、ｍ₂は２〜約１５の整数であり、ｍ_3aは０〜約７の整数であり、ｍ_3bは１〜約８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約８の範囲であり、前記ＰＨＦと前記抗体の比率は２〜約８（例えば、約２〜約６または約２〜約４）の整数である。

【0113】

式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量が約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約４０〜約７５の範囲であり、ｍ₁は約２〜約３５の整数であり、ｍ₂は約２〜約１０の整数であり、ｍ_3aは０〜約４の整数であり、ｍ_3bは１〜約５の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約５の範囲であり、前記ＰＨＦと前記抗体の比率は２〜約８の整数（例えば、約２〜約６または約２〜約４）である。

【0114】

特定の態様では、オーリスタチンＦヒドロキシルプロピルアミド（「ＡＦ ＨＰＡ」）と前記抗体の比は、約３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、または６：１であってもよい。

【0115】

特定の態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、または６：１であってもよい。

【0116】

他の態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、または６：１であってもよい。

【0117】

いくつかの態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、または１０：１であってもよい。

【0118】

いくつかの態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、または１１：１であってもよい。

【0119】

いくつかの態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約１５：１、１４：１、１３：１、または１２：１であってもよい。

【0120】

特定の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１であってもよい。

【0121】

特定の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、または２：１であってもよい。

【0122】

他の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１であってもよい。

【0123】

他の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約６：１、５：１、４：１、３：１、または２：１であってもよい。

【0124】

他の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比率は、約６：１、５：１、４：１、または３：１であってもよい。

【0125】

いくつかの態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は約５：１、４：１、または３：１であってもよい。

【0126】

いくつかの態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は約４：１、３：１、または２：１であってもよい。

【0127】

他の側面では、本明細書で記載される複合体は式（Ｉｂ）で表される。

【化20】

式中、
ＨＥＲ２抗体は、本明細書で記載される単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片を示し、
Ｌ^P2とＨＥＲ２抗体の間の

【化21】

はＨＥＲ２抗体のＬ^P2への直接または間接的連結を示し、
ＨＥＲ２抗体の各出現は、独立して分子量が２００ｋＤａ未満であり、
ｍは１〜約２２００の整数であり、
ｍ₁は１〜約６６０の整数であり、
ｍ₂は３〜約３００の整数であり、
ｍ₃は０〜約１１０の整数であり、
ｍ₄は１〜約６０の整数であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計は約１５０〜約２２００の範囲である。

【0128】

式（Ｉｂ）では、ｍ₁は約１０〜約６６０（例えば、約１０〜２５０）の整数である。

【0129】

式（Ｉｂ）のＰＨＦの分子量が約５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約３７０〜約７４０の範囲）である場合、ｍ₂は５〜約１００の整数であり、ｍ₃は１〜約４０の整数であり、ｍ₄は１〜約２０の整数であり、かつ／またはｍ₁は１〜約２２０（例えば、ｍ₁約１５〜８０）である。

【0130】

式（Ｉｂ）では、ＨＥＲ２抗体の分子量は、それぞれ独立して、１２０ｋＤａ以下、８０ｋＤａ以下、７０ｋＤａ以下、６０ｋＤａ以下、５０ｋＤａ以下、４０ｋＤａ以下、３０ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以下、１０ｋＤａ以下、または約４ｋＤａ〜８０ｋＤａ（例えば、４〜２０ｋＤａ、２０〜３０ｋＤａ、または３０〜７０ｋＤａ）である。

【0131】

本発明の他の側面は、本明細書で記載される複合体を調製する方法を特徴とする。前記方法は、前記複合体が形成されるように前記単離抗体またはその抗原結合断片を式（Ｉａ）の重合体足場材料と反応させることを含む。

【化22】

式中、
Ｌ^D1はカルボニル含有部位であり、

【化23】

の各出現は、独立して、生分解性結合を含む第一のリンカーであり、前記結合が切れると、その意図された治療効果に合わせて活性化された形態でＤが放出され、

【化24】

はＤのＬ^D1への直接または間接的連結を示し、

【化25】

の各出現は、独立して、前記単離抗体またはその抗原結合断片にまだ結合していない第二のリンカーであり、Ｌ^P2は前記単離抗体またはその抗原結合断片の官能基と共有結合をまだ形成していない官能基を含む部位であり、Ｌ^D1とＬ^P2の間の

【化26】

はＬ^P2のＬ^D1への直接または間接的連結を示し、前記第二のリンカーの各出現は前記第一のリンカーの各出現とは区別され、
ｍは１〜約３００の整数であり、
ｍ₁は１〜約１４０の整数であり、
ｍ₂は１〜約４０の整数であり、
ｍ₃は１〜約１８の整数であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、およびｍ₃の合計は約１５〜約３００の範囲である。

【0132】

本明細書で開示される重合体足場材料の式で、ポリアセタール単位間の非結合部分、すなわち切れ目は任意の順で互いに結合してもよい。言い換えると、例えば、Ｄ、Ｌ^P2、および前記単離抗体またはその抗原結合断片を含む付加基は、重合体の主鎖に沿って無作為に分布していてもよい。

【0133】

本発明はまた、治療または予防を必要とする対象に本明細書で開示されるモノクローナル抗体、その断片、および／またはその複合体を投与して、ＨＥＲ２の異常な発現、機能および／または活性化に関連づけられた１つ以上の病状の進行を治療、予防、遅延、あるいは前記病状の症状を改善する、または前記病状の症状を緩和する方法を提供する。治療される対象は例えばヒトである。前記モノクローナル抗体、その断片、および／またはその複合体は、前記病状に関連づけられた症状を治療、予防、または軽減するのに十分な量で投与される。

【0134】

本発明はまた、治療または予防を必要とする対象に本明細書で開示されるモノクローナル抗体、その断片、および／またはその複合体を投与して、ＨＥＲ２の発現、機能および／または活性化に関連づけられた１つ以上の病状の症状の進行を治療、予防、遅延、あるいは改善する、または前記病状に関連づけられた症状を緩和する方法を提供する。治療される対象は例えばヒトである。前記モノクローナル抗体、その断片、および／またはその複合体は、前記病状に関連づけられた症状を治療、予防、または軽減するのに十分な量で投与される。

【0135】

本明細書で開示されるモノクローナル抗体、その断片、および／またはその複合体を用いて治療および／または予防される病状としては、例えば癌が挙げられる。例えば、本明細書で開示されるモノクローナル抗体、その断片、および／またはその複合体は、肛門癌、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭部および頸部癌、肝臓癌、精巣癌、頸部癌、肉腫、血管腫、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、中皮腫、皮膚癌、骨髄腫、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌、脾臓癌、腎臓癌、および胃癌からなる群から選ばれる癌の進行を治療、予防、遅延、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0136】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片および／またはＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体は、乳癌の進行を治療、予防、遅延する、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0137】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片および／またはＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体は、胃癌の進行を治療、予防、遅延する、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0138】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片および／またはＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の進行を治療、予防、遅延する、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0139】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片および／またはＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体は、卵巣癌の進行を治療、予防、遅延する、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0140】

いくつかの態様では、癌（例えば、肛門癌、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭部および頸部癌、肝臓癌、精巣癌、頸部癌、肉腫、血管腫、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、中皮腫、皮膚癌、骨髄腫、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌、脾臓癌、腎臓癌、および胃癌からなる群から選ばれる癌）の進行を治療、予防、遅延する、あるいはその症状を改善するのに用いられるＨｅｒ２抗体またはその抗原結合断片は、Ｈｅｒ−２の同じエピトープへの結合に関して、以下のものを含む抗体と競合する：（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＳＭＮ（配列番号２５）を含む重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）を含むＣＤＲＨ２、アミノ酸配列ＧＧＨＧＹＦＤＬ（配列番号２７）を含むＣＤＲＨ３と、軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１を含むアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号２８）、アミノ酸配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＹＨＨＳＰＬＴ（配列番号２９）を含むＣＤＲＬ３、（２）アミノ酸配列ＦＴＦＳＧＲＳＭＮ（配列番号３０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＤＳＲＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１）を含むＣＤＲＨ２、アミノ酸配列ＧＧＨＧＹＦＤＬ（配列番号２７）を含むＣＤＲＨ３、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号２８）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＹＨＨＳＰＬＴ（配列番号２９）を含むＣＤＲＬ３、（３）アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号１７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８）を含むＣＤＲＨ２、アミノ酸配列ＥＡＰＹＹＡＫＤＹＭＤＶ（配列番号１９）を含むＣＤＲＨ３、およびアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＤＹＬＡ（配列番号２０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＹＶＳＹＷＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲＬ３、または（４）アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号１７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＧＩＷＷＤＧＳＮＥＫＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３）を含むＣＤＲＨ２、アミノ酸配列ＥＡＰＹＹＡＫＤＹＭＤＶ（配列番号１９）を含むＣＤＲＨ３、とアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＤＹＬＡ（配列番号２０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＧＡＳＲＲＡＴ（配列番号２４）を含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＹＶＳＹＷＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲＬ３。

【0141】

他の態様では、癌（例えば、肛門癌、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭部および頸部癌、肝臓癌、精巣癌、頸部癌、肉腫、血管腫、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、中皮腫、皮膚癌、骨髄腫、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌、脾臓癌、腎臓癌、および胃癌からなる群から選ばれる癌）の進行を治療、予防、遅延、あるいはその症状を改善するのに用いられるＨｅｒ２抗体またはその抗原結合その断片は、Ｈｅｒ−２の同じエピトープへの結合に関して、以下のものを含む抗体と競合する：（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＳＭＮ（配列番号２５）を含む重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）を含むＣＤＲＨ２、アミノ酸配列ＧＧＨＧＹＦＤＬ（配列番号２７）を含むＣＤＲＨ３、およびアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号２８）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＹＨＨＳＰＬＴ（配列番号２９）を含むＣＤＲＬ３、（２）アミノ酸配列ＦＴＦＳＧＲＳＭＮ（配列番号３０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＹＩＳＳＤＳＲＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１）を含むＣＤＲＨ２、アミノ酸配列ＧＧＨＧＹＦＤＬ（配列番号２７）を含むＣＤＲＨ３、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号２８）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＹＨＨＳＰＬＴ（配列番号２９）を含むＣＤＲＬ３、（３）アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号１７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８）を含むＣＤＲＨ２、アミノ酸配列ＥＡＰＹＹＡＫＤＹＭＤＶ（配列番号１９）を含むＣＤＲＨ３、およびアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＤＹＬＡ（配列番号２０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＹＶＳＹＷＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲＬ３、（４）アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号１７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＧＩＷＷＤＧＳＮＥＫＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３）を含むＣＤＲＨ２、アミノ酸配列ＥＡＰＹＹＡＫＤＹＭＤＶ（配列番号１９）を含むＣＤＲＨ３、およびアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＤＹＬＡ（配列番号２０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＧＡＳＲＲＡＴ（配列番号２４）を含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＹＶＳＹＷＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲＬ３。ここで、前記Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合その断片は少なくとも１種の治療薬に直接または間接に結合し、前記治療薬は、分子量が約５ｋＤａ以下、約４ｋＤａ以下、約３ｋＤａ以下、約１．５ｋＤａ以下、または約１ｋＤａ以下の小分子である。本発明はまた、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片、および／またはその複合体での治療の前にＨＥＲ２の発現量が低い患者を識別して、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片および／またはそのＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体治療としての投与に好適な患者集団を識別するか精緻化（例えば、階層化）するためのキットおよび／または方法を提供する。低ＨＥＲ２発現量とは、例えば、試験細胞集団を測定して細胞あたりＨＥＲ２分子が１００，０００個以下、９０，０００個以下、または８０，０００個以下の患者を指す。ＨＥＲ２の発現量、すなわち、細胞あたりのＨＥＲ２分子数は、従来の技術で認められた任意の方法（本明細書に提供される実施例（例えば、実施例１８を参照）に示される細胞基準生存性アッセイを含むが、これらに限定されない）を用いて測定することができる。

【0142】

本発明はまた、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片、および／またはその複合体での治療の前に対象のＨＥＲ２スコアを識別して、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片、および／またはその複合体の治療としての投与に好適な患者集団を識別するか精緻化（例えば、階層化）するためのキットおよび／または方法を提供する。いくつかの態様では、前記対象は、ＨＥＲ２の発現について１＋または２＋のスコアを有すると確認される。いくつかの態様では、前記対象は、試験細胞集団に対して行われた免疫組織化学（ＩＨＣ）分析により検出されたＨＥＲ２の発現のスコアが１＋または２＋であると確認され、前記ＨＥＲ２遺伝子は前記試験細胞集団では増幅されない。いくつかの態様では、前記試験細胞集団は、生検材料試料に由来する新鮮で冷凍していない組織に由来する。いくつかの態様では、前記試験細胞集団は、生検材料試料に由来する冷凍組織に由来する。

【0143】

ＩＨＣ試験では、癌組織試料（例えば、乳癌組織試料または胃癌試料）中の細胞表面にあるＨＥＲ２受容体タンパク質の量を測定し、細胞表面のＨＥＲ２受容体の検出量に対してＨＥＲ２スコア０、１＋、２＋、または３＋を付与する。対象のＨＥＲ２スコアが０〜１＋の範囲内である場合、前記癌は「ＨＥＲ２陰性」であると考えられる。前記スコアが２＋である場合、前記癌は「境界線」とされる。スコア３＋は、前記癌が「ＨＥＲ２陽性」であることを意味する。

【0144】

いくつかの態様では、前記対象は、ＨＥＲ２の発現についてスコアが１＋または２＋であると確認され、標準最先端化学療法薬を含む化学療法に難治性を示す。本明細書を通して、用語「対象」はヒトおよび他の哺乳類を含む。いくつかの態様では、前記対象は、ＨＥＲ２の発現についてスコアが１＋または２＋であると確認され、乳癌、胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、または卵巣癌を患っている。

【0145】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片および／またはＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体は、遺伝子増幅がない（例えば、ＦＩＳＨ−（すなわち、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション陰性）HER2 IHC 1+またはHER2 IHC 2+である患者の乳癌の進行を治療、予防、遅延、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0146】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片および／またはＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体は、進行したＨＥＲ２陽性乳癌の患者およびカドサイラで以前に治療を受けたことがある患者の乳癌の進行を治療、予防、遅延、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0147】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片および／またはＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体は、進行したＨＥＲ２陽性乳癌の患者およびカドサイラで以前に治療を受けたことがある患者の乳癌の進行を治療、予防、遅延、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0148】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片および／またはＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体は、遺伝子増幅がない（例えば、ＦＩＳＨ−）ＨＥＲ２ ＩＨＣ １＋またはＨＥＲ２ ＩＨＣ ２＋である患者の胃癌の進行を治療、予防、遅延、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0149】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片および／またはＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体は、ＨＥＲ２ ＩＨＣ ２＋、ＨＥＲ２ ＩＨＣ ３＋、任意のＨＥＲ２遺伝子増幅、または変異状態を有する患者の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の進行を治療、予防、遅延、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0150】

いくつかの態様では、前記対象は、標準最先端化学療法薬を含む化学療法に難治性を示す。いくつかの態様では、前記対象はカドサイラを用いた治療に抵抗性を示す。

【0151】

本明細書で提供される方法および使用の態様のいずれかで用いられるＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片、および／または結合ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片は、前記病気のいずれの段階で投与してもよい。例えば、このようなＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体は、初期から転移期の任意の段階の癌を患っている患者に投与してもよい。

【0152】

これら方法および使用の態様のいずれかで用いられるＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体は、単独または１種以上の化学療法薬またはその他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。いくつかの態様では、前記薬剤は、本明細書で記載される毒素のいずれかである。いくつかの態様では、前記薬剤は、（１）ＨＥＲ２阻害剤、（２）ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤または標的抗ＥＧＦＲ抗体）、（３）ＢＲＡＦ阻害剤、（４）ＡＬＫ阻害剤、（５）ホルモン受容体阻害剤、（６）ｍＴＯＲ阻害剤、（７）ＶＥＧＦ阻害剤、または（８）癌ワクチンである。いくつかの態様では、前記薬剤は、標準最先端化学療法薬、例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アドトラスツズマブエムタンシン（カドサイラ）、ラパチニブ、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、フルベストラント、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メゲストロール、フルオキシメステロン、エチニルエストラジオール、パクリタキセル、カペシタビン、ゲムシタビン、エリブリン、ビノレルビン、シクロホスファミド、カルボプラチン、ドセタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、シスプラチン、エピルビシン、イクサベピロン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、オキサリプラチン、フルオロピリミジン、イリノテカン、ラムシルマブ、マイトマイシン、ロイコボリン、セツキシマブ、ベバシズマブ、エルロチニブ、アファチニブ、クリゾチニブ、ペメトレキセド、セリチニブ、エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、イホスファミド、リポソームドキソルビシン、トポテカン、アルトレタミン、メルファラン、または酢酸ロイプロリドである。いくつかの態様では、第二の薬剤はカドサイラである。

【0153】

いくつかの態様では、前記薬剤は、少なくともＨＥＲ２に特異的に結合する第二の抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、前記ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ２二量化阻害剤抗体、あるいはＨＥＲ２抗体とＨＥＲ２二量化阻害剤抗体の組み合わせ（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、あるいはこれらの組み合わせ）との組み合わせで投与される。いくつかの態様では、前記ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブのバイオ後続品、ペルツズマブのバイオ後続品、あるいはこれらの組み合わせと組み合わせて投与される。

【0154】

ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体のこれらの組み合わせは、癌等の病状の治療に有用である。例えば、ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体、例えば、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片および／または結合ＨＥＲ２抗体（例えば、ＨＥＲ２抗体−重合体−薬物複合体）のこれらの組み合わせをトラスツズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブとペルツズマブの両方、またはトラスツズマブのバイオ後続品、ペルツズマブのバイオ後続品、またはこれらバイオ後続品の両方と組み合わせることは、癌（例えば、肛門癌、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭部および頸部癌、肝臓癌、精巣癌、頸部癌、肉腫、血管腫、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、中皮腫、皮膚癌、骨髄腫、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌、脾臓癌、腎臓癌、および胃癌）からなる群から選ばれる癌の症状の進行を治療、予防、遅延する、あるいはその症状を改善するのに有用である。

【0155】

これらの組み合わせはまた、ＨＥＲ２発現細胞をこれらの組み合わせと接触させた場合にＨＥＲ２の分解を増加させるのに有用である。ＨＥＲ２の分解量は、ＨＥＲ２の分解を検出する、従来の技術で認められたいずれかの方法を用いて検出される。例えば、本明細書で提供される実施例で示されるように（例えば、実施例１４を参照のこと）、各ＨＥＲ２抗体（またはそのバイオ後続品）の組み合わせの存在下および非存在下でＨＥＲ２の分解量を検出する方法が挙げられるが、これに限定されない。例えば、ＨＥＲ２抗体の組み合わせで治療したＨＥＲ２発現細胞の溶菌液をＨＥＲ２抗体の組み合わせで治療しなかったＨＥＲ２発現細胞内のＨＥＲ２の分解量と比べるウェスタン分析を用いて、ＨＥＲ２の分解量を求める。

【0156】

いくつかの態様では、前記ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体および追加の薬剤は、単一の治療用組成物に製剤されて、前記ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体および追加の薬剤は同時に投与される。あるいは、前記ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体および追加の薬剤は互いに独立している。例えば、それぞれが個別の治療用組成物に製剤されて、ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体および追加の薬剤が同時に投与される。あるいは、ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体および追加の薬剤は、治療計画の間、異なる時間に投与される。例えば、前記ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体は、追加の薬剤の投与前に投与される。あるいは、前記ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体は、追加の薬剤の投与後に投与される。または、前記ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体および追加の薬剤は交互に投与される。本明細書で記載されるように、前記ＨＥＲ２抗体および／または結合ＨＥＲ２抗体および追加の薬剤は、単一投与量または複数の投与量で投与される。

【0157】

本発明による医薬品組成物は、本明細書で開示される抗体、その断片、および／またはその複合体と好適な担体を含んでいてもよい。これら医薬品組成物は、キット（例えば、診断キット）に含まれていてもよい。

【0158】

当業者には自明であるが、本明細書で開示される抗体は様々な使途がある。例えば、本明細書で開示されるタンパク質は、治療薬として用いられる。本明細書で開示される抗体はまた、診断キットの試薬または診断ツールとして用いられる。あるいは、治療試薬を生成するためにこれら抗体を競合アッセイで用いてもよい。

【0159】

特に断りがなければ、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書では、特に明記されていない限り、単数形は複数形をも含む。本明細書で記載される方法および材料に類似または等価である方法および材料は本発明の実行または試験に用いることができるが、好適な方法および材料は以下で記載される。矛盾があった場合は、定義を含む本明細書により調整される。また、これら材料、方法、および実施例は、例示のためのみのものであり、限定を意図するものではない。

【0160】

本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および請求項から分かる。

【図面の簡単な説明】

【0161】

【図1a】Octet Red384 Epitope Binningによる抗体ＸＭＴ１５１７およびＸＭＴ１５１８に対するエピトープのビニングを示す。

【0162】

【図1b】Octet Red384 Epitope Binningによる抗体ＸＭＴ１５１９およびＸＭＴ１５２０に対するエピトープのビニングを示す。

【0163】

【図2】抗体ＸＭＴ１５１７、ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９、およびＸＭＴ１５２０のＪＩＭＴ−１細胞の表面への結合を示す。

【0164】

【図3a】抗体ＸＭＴ１５１７、ＸＭＴ１５１８の組み換えヒトＨＥＲ２およびカニクイザルＨＥＲ２に対する結合親和性を示す。

【0165】

【図3b】抗体ＸＭＴ１５１９、ＸＭＴ１５２０の組み換えヒトＨＥＲ２およびカニクイザルＨＥＲ２に対する結合親和性を示す。

【0166】

【図3c-3d】図３ｃは、ＸＭＴ１５１９および実施例１６Ｈの組み換えヒトＨＥＲ２に対する結合親和性を示す。図３ｄは、ＸＭＴ１５１９および実施例１６ＨのカニクイザルＨＥＲ２に対する結合親和性を示す。

【0167】

【図4】ＨＥＲ２との結合について抗体ＸＭＴ１５１８およびＸＭＴ１５１９が競合することを示す。

【0168】

【図5】トラスツズマブ、抗体ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９、およびＸＭＴ１５２０の抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を示す。

【0169】

【図6】トラスツズマブ、抗体ＨＴ ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９、およびＸＭＴ１５２０の内部移行率を示す。

【0170】

【図7】ＳＫＢＲ３細胞におけるＨＥＲ２抗体の内部移行を示す。

【0171】

【図8】抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせによって誘発されるＨＥＲ２の分解を示す。

【0172】

【図9】ＮＣＩ−Ｎ８７マウス腫瘍異種移植モデルで測定された実施例１６Ａのトラスツズマブ−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））および実施例１６ＤのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0173】

【図10】ＪＩＭＴ−１マウス腫瘍異種移植モデルで測定されたカドサイラ、実施例１６Ａのトラスツズマブ−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））、および実施例１６ＤのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0174】

【図11】ＪＩＭＴ−１マウス腫瘍異種移植モデルで測定されたカドサイラ、ペルツズマブ、カドサイラとペルツズマブの組み合わせ、および実施例１６ＤのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0175】

【図12】ＮＣＩ−Ｎ８７マウス腫瘍異種移植モデルで測定された実施例１６ＦのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ、またはトラスツズマブ、ペルツズマブ、および実施例１６ＦのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の３つの組み合わせの抗腫瘍有効性を示す。

【0176】

【図13】ＳＮＵ５マウス腫瘍異種移植モデルで測定されたカドサイラ、実施例１６ＥのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））、および実施例１７Ｂのリツキシマブ−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0177】

【図14】ＴＯＶ−２１Ｇマウス腫瘍異種移植モデルで測定されたカドサイラおよび実施例１６ＥのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0178】

【図15】Ｈ５２２マウス腫瘍異種移植モデルで測定されたカドサイラ、実施例１６ＥのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））、および実施例１７Ｂのリツキシマブ−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0179】

【図16】ＳＫＯＶ３マウス腫瘍異種移植モデルで測定されたカドサイラ、実施例１６ＥのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））、および実施例１７Ｂのリツキシマブ−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0180】

【図17】Ｃａｌｕ−３マウス腫瘍異種移植モデルで測定された実施例１６ＦのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0181】

【図18】ＢＲＥ−０３３３ ＨＥＲ２ １＋の患者に由来する異種移植モデルで測定されたカドサイラ、実施例１６ＨのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））、および実施例１７Ｂのリツキシマブ−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0182】

【図19】ＭＡＸＦ＿１１６２ ＨＥＲ２ ３＋の患者に由来する異種移植モデルで測定されたカドサイラ、実施例１６ＨのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））、および実施例１７Ｂのリツキシマブ−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【0183】

【図20】ＢＴ４７４マウス腫瘍異種移植モデルで測定されたカドサイラ、実施例１６ＨのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））、および実施例１７Ｃのリツキシマブ−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））の抗腫瘍有効性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0184】

本発明は、可溶な形態または膜に結合した（すなわち、細胞表面で発現した場合）のヒトＨＥＲ２に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明はさらに、ＨＥＲ２に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。本明細書では、これらの抗体をまとめて「ＨＥＲ２」抗体と言う。

【0185】

本発明の抗体は、１μＭ以下、例えば１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下の平衡解離定数（Ｋ_dまたはＫ_D）を有するＨＥＲ２エピトープに結合する。例えば、本明細書で提供されるＨＥＲ２抗体は、Ｋ_dが約１ｎＭ〜約１ｐＭの範囲である。

【0186】

本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２の機能活性を調節、阻止、阻害、低下、拮抗、中和、あるいは干渉する働きをする。ＨＥＲ２の機能活性は、例えば、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路活性の調節を含む。例えば、前記ＨＥＲ２抗体は、部分的にまたは完全にＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路活性を調節、阻止、阻害、低下、拮抗、中和、あるいは干渉してＨＥＲ２機能活性を完全または部分的に阻害する。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路活性は、従来の技術で認められた任意のＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路活性を検出する方法を用いて評価される。そのような方法は、本明細書で開示される抗体または抗原結合断片の存在下および非存在下でリン酸化Ａｋｔ量を検出する方法を含むが、これに限定されない。

【0187】

本明細書で記載されるＨＥＲ２抗体との結合の非存在下でのＨＥＲ２機能活性度と比べてＨＥＲ２抗体の存在下のＨＥＲ２機能活性度が少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％低下している場合は、前記ＨＥＲ２抗体はＨＥＲ２機能活性を完全に調節、阻止、阻害、低下、拮抗、中和、あるいは干渉すると見なされる。本明細書で記載されるＨＥＲ２抗体との結合の非存在下でのＨＥＲ２活性度と比べてＨＥＲ２抗体の存在下でのＨＥＲ２活性度が９５％未満、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、または９０％低下している場合は、前記ＨＥＲ２抗体はＨＥＲ２機能活性を部分的に調節、阻止、阻害、低下、拮抗、中和、あるいは干渉すると見なされる。
定義

【0188】

特に断りがなければ、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から必要とされなければ、用語の単数形は複数を含み、用語の複数形は単数を含むものとする。一般に、本明細書で記載される細胞および組織培養、分子生物学、タンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学、およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる用語、ならびにこれらの技術において用いられる用語は当該分野で周知であり、一般に用いられる。組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション法）には一般的な技術が用いられる。製造者の仕様書に従って、あるいは当該分野で一般に確立している、または本明細書で記載されるように酵素反応および精製技術が実行される。以下の技術および手順は、当該分野で周知の従来の方法に従って、また本明細書で引用され、議論される一般的およびより特定の各種参考文献で記載されているように行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照のこと。本明細書で記載される分析化学、合成有機化学、および医薬品化学に関連して用いられる用語、ならびにその実験手順および技術の用語は、当該分野で周知であり、一般に用いられる。化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤、および供給、および患者の治療については一般的な技術が用いられる。

【0189】

本開示によって用いられるように、特に断りがなければ、以下の用語は以下の意味を持つものとする。

【0190】

本明細書を通して、本明細書で用いる場合、用語「ＨＥＲ２」（ＥｒｂＢ−２、ＮＥＵ、ＨＥＲ−２、およびＣＤ３４０としても知られる）はヒト上皮成長因子受容体２(SwissProt P04626)を指し、細胞（腫瘍細胞を含む）によって天然に発現した、あるいはＨＥＲ２遺伝子で形質移入した細胞で発現したＨＥＲ２の任意の多様体、イソ型、および種の相同体を含む。種の相同体としては、アカゲザル(macaca mulatta)ＨＥＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ：１０９１１４８９７）が挙げられる。これらの用語は同義であり、お互いに言い換え可能である。

【0191】

本明細書を通して、用語「ＨＥＲ２抗体」または「抗ＨＥＲ２抗体」は、抗原ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体である。

【0192】

本明細書を通して、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫的活性部分、すなわち、抗原に特異的に結合（抗体反応）する抗原結合部位を含む分子を指す。「特異的に結合する」、「抗体反応する」、または「に対して作られる」という用語は、抗体が所望の抗原の１つ以上のエピトープと反応するが、より親和性の低い（Ｋ_d＞１０^-6）他のポリペプチドとは反応しない、すなわち結合しないことを意味する。抗体としては、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖抗体、Ｆ_ab、Ｆ_ab’およびＦ_(ab’)2断片、ｓｃＦｖ、およびＦ_ab発現ライブラリー等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0193】

塩基性抗体の構成単位は四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の同一の２つの対からなり、各対は１本の「軽」（約２５ｋＤａ）鎖と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ端末部位は、主に抗原の認識に関わる約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ端末部位は、主に効果または機能に関わる定常領域を規定する。一般に、ヒト由来の抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかに関する。これらは、抗体分子に存在する重鎖の性質により互いに異なっている。特定のクラスは、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂等の下位クラスを含む。さらに、ヒトでは、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であってもよい。

【0194】

本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、固有の軽鎖遺伝子産物と固有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の分子種を１種のみ含む抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、前記集団の分子のすべてにおいて同一である。ｍＡｂは、その固有の結合親和性により特徴づけられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。

【0195】

一般に、ヒト由来の抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかに関する。これらは、抗体分子に存在する重鎖の性質により互いに異なっている。特定のクラスは、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂等の下位クラスを有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であってもよい。

【0196】

用語「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原の結合に参加する免疫グロブリン分子の部品を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ−末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域」と言われる重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの非常に多様な伸長部は、「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」として知られるより保存された隣接する伸長部の間に介在している。したがって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域間とそれらに隣接して天然に見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、抗原結合表面を形成する三次元空間で互いに交互に配置されている。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」と呼ばれる。アミノ酸の各領域への付与は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest（国立衛生研究所、メリーランド州ベセツダ(1987 and 1991)）またはChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)の定義に従っている。

【0197】

用語「断片」、「抗体断片」、「抗原結合断片」、および「抗原結合断片」は、特に断りのない限りお互いに言い換え可能に用いられる。

【0198】

本明細書を通して、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはその断片、またはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質を含む。用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープは、一般的に分子（例えば、アミノ酸または糖側鎖）の化学的活性表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。解離定数が１μＭ以下、例えば、１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下である場合に、抗体は抗原に特異的に結合すると言う。

【0199】

本明細書において２種以上の抗体の関連で用いられる場合、用語「競合する」または「交差競合する」は、２つ以上の抗体がＨＥＲ２への結合について競合する、例えば、実施例５または８に記載されるアッセイでのＨＥＲ２結合について競合することを指す。抗体が２５％以上、１つ以上の他の抗体と競合する（好ましくは実施例５および８のアッセイを用いて決定されるが、２５％〜７４％は「部分阻害」を表し、７５％〜４００％は「完全阻害」を表す）場合、その抗体は、１つ以上の他の抗体がＨＥＲ２と結合するのを「阻害する」または「交差阻害する」。抗体のいくつかの対では、実施例５または８のアッセイにおける競合または阻害は、１つの抗体をプレート上に塗布して、他の抗体を競合に用いる、あるいはその反対の場合にのみ観察される。また、特に文脈で定義されない、あるいは否定されない限り、本明細書で用いられる用語「競合する」または「交差競合する」、「阻害する」または「交差阻害する」はこのような抗体対をも含むことを意図するものである。

【0200】

本明細書を通して、「ＨＥＲ二量化を阻害する」抗体は、ＨＥＲ二量体の形成を阻害または干渉する抗体を意味するものとする。そのような抗体は、ＨＥＲ２の異種二量体結合部位で結合することが好ましい。一態様では、本明細書の二量化阻害抗体は、ペルツズマブすなわちＭＡｂ−２Ｃ４である。ＨＥＲ二量化を阻害する抗体の他の例としては、ＥＧＦＲに結合して１つ以上の他のＨＥＲ受容体との二量化を阻害する抗体（例えば、活性化すなわち「非係留」ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、ＭＡｂ ８０６（Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)を参照のこと）、ＨＥＲ３に結合して１つ以上の他のＨＥＲ受容体との二量化を阻害する抗体、およびＨＥＲ４に結合して１つ以上の他のＨＥＲ受容体との二量化を阻害する抗体等が挙げられる。

【0201】

本明細書で用いられる用語「ＨＥＲ２二量化阻害剤」は、ＨＥＲ２を含む二量体または異種二量体の形成を阻害する薬剤を意味するものとする。

【0202】

本明細書を通して、ＨＥＲ２抗体の文脈で用いられる場合の用語「内部移行」は、抗体が、例えば、飲食作用により細胞表面および／または周囲の培地からＨＥＲ２発現細胞に内部移行する任意の反応機構を含む。

【0203】

本明細書を通して、用語「免疫結合」および「免疫結合性」は、免疫グロブリン分子と、その免疫グロブリンに特異的な抗原との間に生じる種類の非共有結合性相互作用を指す。免疫結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋ_d）で表すことができ、Ｋ_dが小さいと親和性が大きいことを表す。選択されたポリペプチドの免疫結合性は、当該分野で周知の方法を用いて定量化することができる。そのような方法の一つに、抗原結合部位／抗原の複合体形成および解離率の測定が含まれる。この測定では、複合体形成および解離率は複合体を形成する相手の濃度、相互作用の親和性、および両方向で複合体形成・解離速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。従って、「会合速度(on rate)定数」（Ｋ_on）および「解離速度(off rate)定数」（Ｋ_off）はいずれも、濃度と実際の会合・解離速度を計算して求めることができる（Nature 361:186-87 (1993)を参照のこと）。Ｋ_off／Ｋ_onの比率により親和性に関係しないすべてのパラメータを相殺することができ、この比率は解離定数Ｋ_dと等しい（一般に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。アッセイ（例えば、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に周知の同様のアッセイ）により測定された平衡解離定数（Ｋ_dまたはＫ_D）が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗体は、ＨＥＲ２に特異的に結合すると言う。

【0204】

本明細書で用いられる用語「単離ポリヌクレオチド」はゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、または合成起源、あるいはこれらの組み合わせのポリヌクレオチドを意味するものとする。その起源を理由に、「単離ポリヌクレオチド」は（１）天然に見られるポリヌクレオチドのすべてまたは部分と関連づけられない、（２）天然には結合されないポリヌクレオチドと操作により結合される、または（３）より大きな配列の一部として天然には出現しない。本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号３４および３６の核酸配列、配列番号１、３、５、および７に提示される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、配列番号３５および３７の核酸配列、ならびに配列番号２、４、６、および８に表される軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。

【0205】

本明細書で用いられる用語「単離タンパク質」は、ｃＤＮＡ、組み換えＲＮＡ、または合成起源、あるいはこれらのある組み合わせのタンパク質を意味する。その起源を理由に、「単離タンパク質」は、（１）天然に見られるタンパク質とは関連づけられない、（２）同じ源に由来する他のタンパク質を含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）天然には出現しない。

【0206】

本明細書では、用語「ポリペプチド」は、あるポリペプチド配列の天然のタンパク質、断片、または類縁体を指す総称として用いられる。よって、天然のタンパク質、断片および類縁体はポリペプチド属の種である。本発明によるポリペプチドは、配列番号１、３、５、および７で表される重鎖免疫グロブリン分子、配列番号２、４、６、および８で表される軽鎖免疫グロブリン分子、軽鎖免疫グロブリン分子（例えば、κ軽鎖免疫グロブリン分子）を有する重鎖免疫グロブリン分子、およびその逆を含む組み合わせによって形成される抗体分子、ならびにそれらの断片および類縁体を含む。

【0207】

本明細書で用いられる用語「天然出現」は、ある物質が天然に見られるという事実を指す。例えば、天然源から単離することができ、人により実験室等で意図的に修飾されていない有機体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然出現である。

【0208】

本明細書で用いられる用語「操作により結合した」は、上記成分の位置が意図されたように機能するような関係にあることを指す。コード配列に「操作により結合した」制御配列は、制御配列と相性がいい条件でコード配列が発現するようにライゲートされる。

【0209】

本明細書で用いられる用語「制御配列」は、ライゲート対象のコード配列の発現と処理を達成するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、原核生物中のホスト有機体により異なる。一般に、そのような制御配列は、真核生物のプロモーター、リポソーム結合部位、および転写終結配列を含む。一般に、そのような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、少なくともその存在が発現および処理に必須であるすべての成分を含むことが意図される。また、その存在が有益である追加の成分（例えば、リーダー配列、融合パートナー配列等）を含んでいてもよい。本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの重合体ホウ素を意味する。「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、あるいはいずれかのヌクレオチドの修飾形態である。この用語は、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を含む。

【0210】

本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、天然出現オリゴヌクレオチド連鎖および非天然出現オリゴヌクレオチド連鎖により結合した天然出現のヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に長さが２００塩基以下のポリヌクレオチドの下位群である。オリゴヌクレオチドは長さが１０〜６０塩基であることが好ましく、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基であることが最も好ましい。オリゴヌクレオチドは、通常、例えば、プローブの場合、一本鎖であるが、例えば、遺伝子変異体の構築物に用いる場合は二本鎖であってもよい。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0211】

本明細書で用いられる用語「天然出現ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で用いられる用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾基または置換基の糖を有するヌクレオチドを含む。本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド連鎖」は、オリゴヌクレオチド連鎖、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレロエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロンミデート等を含む。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach（オリゴヌクレオチドと類縁体、実践的手法）, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. 米国特許公開第5,151,510号; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照のこと。オリゴヌクレオチドは必要に応じて検出用の標識を含んでいてもよい。

【0212】

本明細書で用いられる用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびその断片は、非特異的核酸への検出可能な結合の感知可能量を最少にするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。非常に厳密な条件を用いて、当該分野で周知の、および本明細書で述べる選択可能なハイブリダイゼーション条件を達成することができる。一般に、本明細書で開示されるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびその断片と目的の核酸配列の核酸配列相同性は少なくとも８０％であり、より一般的には相同性が少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％まで高められていることが好ましい。２つのアミノ酸配列が部分的あるいは完全に同一である場合は、これらの配列は相同である。例えば、８５％の相同性とは、２つの配列を最大一致に対して並べてアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。（一致している２つの配列のいずれかにおける）ギャップは、最大一致ギャップ長が５以下であることが好ましく、２以下であることがより好ましい。あるいは、好ましくは、変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティを有するプログラムＡＬＩＧＮを用いたアライメントスコアが（標準偏差単位で）５超である場合、２つのタンパク質配列（または長さが少なくとも３０個のアミノ酸に由来するポリペプチド配列）は相同である。Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972))およびこの巻のSupplement 2, pp. 1-10を参照のこと。より好ましいのは、プログラムＡＬＩＧＮを用いて最適に並べた際に２つの配列のアミノ酸が５０％以上同一である場合、これら２つの配列またはその部分は相同である。本明細書で用いられる用語「対応する」は、ポリヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同である（すなわち、同一であるが、厳密には進化的に関連していない）、またはポリペプチド配列が基準ポリペプチド配列と同一であることを意味する。これに対して、本明細書で用いられる用語「と相補する」は、相補配列が基準ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同であることを意味する。例えば、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は配列「ＴＡＴＡＣ」と対応し、かつ基準配列「ＧＴＡＴＡ」と相補する。

【0213】

２個以上のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の配列関係を記述するのに、以下の用語「基準配列」、「比較窓」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」、および「実質的同一性」が用いられる。「基準配列」は、配列比較の基礎として用いられる規定された配列である。基準配列は、例えば、配列リストで与えられる完全な長さのｃＤＮＡまたは遺伝子配列の分節としてより大きな配列の下位部分であってもよい。あるいは、完全なｃＤＮＡ配列または遺伝子配列を含んでいてもよい。一般に、基準配列の長さは、少なくとも１８個のヌクレオチドまたは６個のアミノ酸であり、少なくとも２４個のヌクレオチドまたは８個のアミノ酸、少なくとも４８個のヌクレオチドまたは１６個のアミノ酸であることが多い。２個のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、それぞれ（１）２個の分子の間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の部分）を含み、かつ（２）さらに前記２個のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間で異なる配列を含んでいてもよいので、一般に、２個の分子配列を「比較窓」と比較して局所領域の配列の類似性を同定し、比較してこれら２個（またはそれ以上）の分子配列の比較が行われる。本明細書で用いられる用語「比較窓」は、少なくとも１８個の近接するヌクレオチド位置または６個のアミノ酸を指す。ここで、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、少なくとも１８個の近接するヌクレオチドまたは６個のアミノ酸配列の基準配列と比較されてもよく、比較窓中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントについて基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下の付加、欠失、置換等（すなわち、ギャップを含んでいてもよい。比較窓を並べるための配列の最適なアライメントは、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)の類似性検索方法、これら算法（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ575), Geneworks, またはMacVectorソフトウェアパッケージ）のコンピュータによる実行、または検査によって行われてもよく、各種方法で生成した最高アライメント（すなわち、比較窓に対する相同性の百分率が最も高い）が選択される。

【0214】

用語「配列同一性」は、比較窓に対して２個のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたは残基対残基で）同一であることを意味する。用語「配列同一性の百分率」は、比較窓に対して２つの最適に並べた配列を比較し、位置の数を決定し（ここで同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）または残基が両方の配列で出現して一致した位置の数を生成する）、一致した位置の数を比較窓の位置の総数（すなわち、窓の大きさ）で除して、１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることで算出される。本明細書で用いられる「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の一特性を指す。ここで、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８個のヌクレオチド（６個のアミノ酸）位置、しばしば少なくとも２４〜４８個のヌクレオチド（８〜１６個のアミノ酸）位置の比較窓に対して比べて配列同一性が少なくとも８５パーセント、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセント、より一般的には少なくとも９９パーセントである配列を含む。配列同一性の百分率は、比較窓に対して基準配列の合計２０パーセント以下である欠失または付加を含む可能性がある配列と基準配列を比較して算出される。基準配列は、より大きな配列の下位部分であってもよい。

【0215】

本明細書を通して、２０種の従来のアミノ酸およびその略語は慣例的な用法に従う。Immunology - A Synthesis（免疫学：合成）(2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸、非天然のアミノ酸（例えば、α−，α−二置換アミノ酸等）、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、およびその他の特殊アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた、本発明のポリペプチドの好適な成分である可能性がある。特殊アミノ酸としては、例えば、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、およびその他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で用いられるポリペプチドの表記では、標準的用法および慣例に従って左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。

【0216】

同様に、特に断りがなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手側末端は５’方向として言及される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’の付加の方向は、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖の転写方向配列領域と言われる。このＤＮＡ鎖の転写方向配列領域は、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’末端が「上流配列」と言われる。ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖の配列領域で、ＲＮＡ転写物の３’末端に対応する３’末端は「下流配列」と言われる。

【0217】

ポリペプチドに用いられる用語「実質的同一性」は、規定値のギャップ重みを用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ等を用いて最適に並べられた２個のペプチド配列が、少なくとも８０パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント、より好ましくは少なくとも９５パーセント、最も好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。

【0218】

同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なることが好ましい。

【0219】

用語「保存的アミノ酸置換」は、類似する側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである。脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンである。アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンである。芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである。塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリシン、アルギニン、およびヒスチジンである。硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。

【0220】

本明細書で述べるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列中の小さな変異は本発明に包含されるものとするが、アミノ酸配列の変異は少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％を維持している。特に、保存的アミノ酸置換体が企図される。保存的置換体は、側鎖に関連したアミノ酸族内で出現する。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般に次のように分けられる。（１）酸性のアミノ酸はアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩である。（２）塩基性アミノ酸はリシン、アルギニン、ヒスチジンである。（３）非極性アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである。（４）非荷電性極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リシン、セリン、およびトレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンが挙げられる。他のアミノ酸族としては、（ｉ）脂肪族ヒドロキシ族のセリンおよびトレオニン、（ｉｉ）アミド含有族のアスパラギンおよびグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族のアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、および（ｉｖ）芳香族のフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン等が挙げられる。例えば、特に単離されたロイシンのイソロイシンまたはバリンとの置換体、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩との置換体、トレオニンのセリンとの置換体、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似の置換体が読み枠部位内にアミノ酸を含んでいない場合、これら置換体が得られる分子の結合または特性に大きな効果を及ぼさないことは理にかなっている。アミノ酸の変化が機能的ペプチドになるかどうかは、ポリペプチド誘導体の特定の活性を検定することで容易に決定することができる。本明細書では、アッセイは詳細に記述される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類縁体は、当業者により容易に準備することができる。断片または類縁体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能領域の境界付近で出現する。構造領域および機能領域は、ヌクレオチド配列データおよび／またはアミノ酸配列データを公開の、または独占所有権のある配列データベースと比較して識別することができる。コンピュータによる比較方法を用いて配列モチーフ、または周知の構造および／または機能を有する他のタンパク質で出現する予測されたタンパク質形態領域を識別することができることが好ましい。周知の三次元構造に折りたたまれたタンパク質配列を同定する方法は周知である。Bowie et al. Science 253:164 (1991)。従って、以下の実施例は、本発明による構造領域および機能領域を規定するのに用いてもよい配列モチーフおよび構造的形態を当業者が認識することができることを示している。

【0221】

好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を下げるアミノ酸置換、（２）酸化に対する感受性を下げるアミノ酸置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させるアミノ酸置換、（４）結合親和性を変化させるアミノ酸置換、および（４）そのような類縁体の他の物理化学特性または機能特性を付与または変性するアミノ酸置換である。類縁体としては、天然に出現するペプチド配列の以外の配列の各種変異タンパク質が挙げられる。例えば、天然に出現する配列では（好ましくは分子間接触を形成する領域外にあるポリペプチドの部分において）単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）が起きてもよい。保存的アミノ酸置換は親配列の構造特性を実質的に変化させることがない（例えば、置換体アミノ酸は、親配列で出現するらせん体を壊さない、または親配列を特徴づけるその他の種類の二次的構造を阻害しない傾向がある）。従来の技術で認められたポリペプチドの二次的および三次的構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles（タンパク質、構造と分子原理）(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))、およびThornton et at. Nature 354:105 (1991)で記載されている。

【0222】

本明細書で用いられる用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、例えば完全な長さｃＤＮＡ配列から推定される天然に出現する配列の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。一般に、断片は長さが少なくとも５、６、８、または１０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１４個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、通常少なくとも５０個のアミノ酸、およびより好ましいくは少なくとも７０個のアミノ酸である。本明細書で用いられる用語「類縁体」は、推定されるアミノ酸配列の部分と実質的同一性を有し、好適な結合条件でＨＥＲ２と特異的結合をする少なくとも２５個のアミノ酸の分節を含むポリペプチドを指す。通常、ポリペプチド類縁体は、天然に出現する配列に対して保存的アミノ酸置換（または付加あるいは欠失）を含む。類縁体は通常、長さが少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個以上のアミノ酸であり、完全な長さの天然に出現するポリペプチドと同じ長さであってもよい場合が多い。

【0223】

ペプチド類縁体は、鋳型ペプチドの特性と類似した特性を有する非ペプチド薬物として医薬品工業で一般に用いられている。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」または「ペプチド模倣薬」と言われる。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)、およびEvans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)。このような化合物は、コンピュータによる分子モデルの補助により開発されることが多い。治療に有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣物を用いて等価な治療効果または予防効果を得てもよい。一般に、ペプチド模倣薬は、典型（paradigm）ポリペプチド（すなわち、生化学特性または薬理活性を有するポリペプチド（例えばヒト抗体等））と構造的に類似するが、当該分野で周知の方法により以下からなる群から選ばれる連鎖で置換されてもよい１つ以上のペプチド連鎖を有する：−−ＣＨ₂ＮＨ−−、−−ＣＨ₂Ｓ−、−−ＣＨ₂−ＣＨ₂−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ₂−−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−−、および−ＣＨ₂ＳＯ−−。共通配列の１つ以上のアミノ酸の、同種のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンに代わってＤ−リシン）による体系的置換を用いて、より安定したペプチドを生成してもよい。また、当該分野で周知の方法（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)）、例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加して、共通配列または実質的に同一の共通配列多様体を含む抑制ペプチドを生成してもよい。

【0224】

本明細書で、用語「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生体材料からの抽出物を指すのに用いられる。

【0225】

本明細書で用いられる用語「標識」または「標識された」は、例えば、放射線標識アミノ酸の組み込み、あるいはマーカー付きのアビジン（例えば、光学的方法または熱量測定法で検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン等）で検出可能なビオチニル部位のポリペプチドへの付加等による、検出可能なマーカーの組み込みを指す。特定の状況では、標識またはマーカーは治療目的であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は当該分野で周知であり、用いてもよい。ポリペプチド用の標識としては、例えば、放射性同位体または放射性核種（例えば、³Ｈ、¹⁴Ｃ、¹⁵Ｎ、³⁵Ｓ、⁹⁰Ｙ、⁹⁹Ｔｃ、¹¹¹Ｉｎ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタノイド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光体、ビオチニル基、二次的レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体用の結合部位、金属結合領域、エピトープタグ等）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、起こりうる立体障害を低減するために標識は様々な長さのスペーサーアームで付加される。本明細書で用いられる用語「医薬品薬剤または薬物」は、患者に適切に投与されると所望の治療効果を誘発することができる化合物または組成物を指す。

【0226】

本明細書では、他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms（マクグローヒル化学用語辞典）(Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))等に例示されるように当該分野での慣例用法に従って用いられる。

【0227】

本明細書で用いられる用語「実質的に純粋」は、対象種が顕著に存在する種である（すなわち、モル基準で、組成物中の他のいずれの個体種よりも多い）ことを意味する。実質的に精製された画分は、前記対象種が存在するすべてのマクロ分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準で）を含む組成物であることが好ましい。

【0228】

一般に、実質的に純粋な組成物は、前記組成物中に存在するすべてのマクロ分子種の約８０パーセント超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を含む。前記対象種は、本質的に均一になるまで精製される（従来の検出方法で組成物中に汚染種を検出することができない）ことがより好ましい。ここで、前記組成物は本質的に単一のマクロ分子種からなる。

【0229】

以下の記述および請求項のいずれにおいても、特に断りがない、あるいは文脈で明らかな矛盾がなければ、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の用法は、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「の」（「化学式の」）、「備える」、および「含有する」は、特に断りがなければ、オープンエンドの用語と解釈される（すなわち、「含むが限定されない」を意味する）。例えば、特定の式の重合体足場材料は、その式で示される単量体単位のすべてを含み、その式で示されない追加の単量体単位をも含んでいてもよい。また、自明であるが、ある態様で「含む」またはその他の非制限語句を用いる場合は常に、中間的な語句「本質的に〜からなる」あるいは制限語句「からなる」を用いて同じ態様の範囲をより狭めることができる。

【0230】

数値に関連して用いられる用語「約」、「おおよそ」、または「近似する」は、値の集合または範囲が含まれることを意味する。例えば、「約Ｘ」（Ｘは数値）は、Ｘの±２０％、±１０％、±５％、±２％、±１％、±０．５％、±０．２％、または±０．１％の値の範囲を含む。一態様では、用語「約」は、指定された値の５％超または５％未満の値の範囲を指す。他の態様では、用語「約」は、指定された値の２％超または２％未満の値の範囲を指す。他の態様では、用語「約」は、指定された値の１％超または１％未満の値の範囲を指す。

【0231】

特に断りがなければ、値の範囲の記述は、その範囲内の個別の値を個々に言及する短縮した方法としての役目を果たすことのみが意図されており、各個別の値は、本明細書に個々に引用されたものとして本明細書に組み込まれる。特に断りのない限り、本明細書で用いられる範囲は、その範囲の２つの限界を含む。例えば、「ｘは１から６の間の整数」および「ｘは１〜６の整数」という表現はいずれも、「ｘは１、２、３、４、５、または６」であることを意味する。すなわち、用語「ＸとＹの間」および「ＸからＹの範囲」は、ＸおよびＹ、ならびにその間の整数を含む。

【0232】

特に断りがない、あるいは文脈で明らかな矛盾がなければ、本明細書で記載されるすべての方法は、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書で提供されるいずれかの、およびすべての例、または例示的言語（例えば、「等」）は、本発明をよりよく説明するためのみに用いられることが意図されており、明示的に主張されなければ、請求項の範囲の限定と解釈されるべきではない。本明細書のいかなる言語も、特許請求されていない任意の要素が特許請求されているものに必須であることを示すと解釈されるべきではない。

【0233】

「タンパク質系認識分子」すなわち「ＰＢＲＭ」は、細胞表面マーカーまたは受容体（例えば、トランス膜タンパク質、表面に固定化されたタンパク質、またはプロテオグリカン等）を認識して結合する分子を指す。ＰＢＲＭとしては、例えば、本明細書で記載されるＸＭＴ１５１７抗体、ＸＭＴ１５１８抗体、ＸＭＴ１５１９抗体、およびＸＭＴ１５２０抗体、ならびに他の抗体（例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、エプラツズマブ、ベルツズマブ、ラベツズマブ、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ３、ＣＡ１２５、ＣＤ３３、ＣＸＣＲ２、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＨＥＲ２、ＮａＰｉ２ｂ、ｃ−Ｍｅｔ、ＭＵＣ−１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＤ−Ｌ１、および抗５Ｔ４）、および本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片）あるいはペプチド（ＬＨＲＨ受容体標的ペプチド、ＥＣ−１ペプチド）、リポカリン（例えば、アンチカリン）、タンパク質（インターフェロン）、リンホカイン、成長因子、コロニー刺激因子、ペプチドまたはペプチド模倣物等が挙げられるが、これらに限定されない。また、特定の細胞、組織または位置への修飾重合体複合体を標的にすることに加えて、タンパク質系認識分子は、標的細胞または経路に対する抗増殖（細胞分裂阻害性および／または細胞毒性）活性等の特定の治療効果を有していてもよい。このタンパク質系認識分子は、少なくとも１つの化学反応性基（例えば、−ＣＯＯＨ、一級アミン、二級アミン−ＮＨＲ、−ＳＨ等）、あるいは化学反応性アミノ酸部位または側鎖（例えば、チロシン、ヒスチジン、システイン、またはリシン等）を含む、あるいは含むように設計されてもよい。

【0234】

本明細書で用いられる用語「生体適合性」は、体液、あるいは生きている細胞または組織との接触時に最少の破壊効果あるいは宿主応答効果を及ぼす化合物を記述することが意図される。したがて、本明細書で用いられる生体適合性基は、脂肪族、シクロアルキル、複素脂肪族、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール部位を指す。これらは、上記および本明細書で定義した用語生体適合性の定義に含まれる。本明細書で用いられる用語「生体適合性」はまた、認識タンパク質（例えば、天然出現抗体、細胞タンパク質、細胞、および生物系のその他の成分）との相互作用が特に望ましくなければ、化合物は最小限のそのような相互作用を示すことを意味すると解釈される。従って、このような最少の相互作用を引き起こすことが特に意図される物質および官能基（例えば、薬物およびプロドラッグ）は、生体適合性を有すると見なされる。好ましくは（細胞毒性を有することが意図される化合物（例えば、抗腫瘍薬等）は例外として）、意図された全身性生体内濃度と同程度の濃度で生体外の正常細胞に加えると、生体内でのその化合物の半減期に相当する時間（例えば、生体内で投与された化合物の５０％が除去される／消失するのに必要な期間）での細胞の死亡が１％以下であり、生体内への投与が最少かつ医学的に容認可能な炎症、異物反応、免疫毒性、化学毒性、および／またはその他の有害効果を誘発する場合、その化合物は「生体適合性」である。上の文で、用語「正常細胞」は、破壊されることが意図されていない細胞、あるいは試験中の化合物により大きく影響されない細胞を指す。

【0235】

「生分解性」：本明細書で用いられる用語「生分解性」重合体は、生体内での生物学的処理の影響を受けやすい重合体である。本明細書で用いられる用語「生分解性」化合物または部位は、細胞に取り入れられると、リソソーム機構または他の化学機構、あるいは加水分解により、細胞に大きな毒性効果を及ぼすことなく細胞が再利用または破棄することができる成分に分解することができるものである。本明細書で用いられる用語「生物切断可能性」は「生分解性」と同じ意味を有する。分解断片は、臓器または細胞への過負荷、あるいは過負荷あるいは生体内での他の有害効果によって生じる病的過程をほとんど、あるいはまったく誘発しないことが好ましい。生分解過程としては、例えば、酵素加水分解、非酵素加水分解、酸化還元が挙げられる。本明細書で記載される生分解性タンパク質−重合体−薬物複合体（またはその成分、例えば、生分解性重合体担体や、担体と抗体または薬物分子のリンカー等）の非酵素加水分解に適した条件としては、例えば、リソソーム細胞内成分の温度およびｐＨで生分解性複合体を水に暴露することが挙げられる。また、いくつかの生分解性タンパク質−重合体−薬物複合体（またはその成分、例えば、生分解性重合体担体や、担体と抗体または薬物分子のリンカー等）の生分解は、活性化マクロファージまたは分解促進因子を放出する他の細胞の近くで細胞外（例えば、動物の体の低ｐＨ域（例えば、炎症部位））で高めることができる。特定の好ましい態様では、ｐＨが約７．５の重合体担体の有効サイズは、１日から７日間は検出可能な程変化せず、少なくとも数週間は重合体の元のサイズの５０％以内のままである。一方、ｐＨが約５では、前記重合体担体は、１日から５日間で検出可能な程度に分解し、２週間から数ヶ月以内に低分子量断片に完全に変換されることが好ましい。このような検査での重合体の完全性は、例えばサイズ排除ＨＰＬＣにより測定することができる。いくつかの場合では分解が速いほうが好ましいが、一般には、細胞による重合体断片の代謝または排出の速度を超えない速度で重合体が細胞内で分解することがより望ましい場合がある。好ましい態様では、重合体および重合体生分解副生物は生体適合性を有する。

【0236】

本明細書で用いられる用語「マレイミド遮断化合物」は、マレイミドと反応してマレイミドをコハク酸イミドに転化することができる化合物を指し、「マレイミド遮断部位」は、転化時にコハク酸イミドに付加される化学部位を指す。特定の態様では、前記マレイミド遮断化合物は、マレイミドと反応する末端チオール基を有する化合物である。一態様では、前記マレイミド遮断化合物は、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、システインメチルエステル、Ｎ−メチルシステイン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパン酸、２−メルカプト酢酸、メルカプトメタノール（すなわち、ＨＯＣＨ₂ＳＨ）、ベンジルチオール（ここでフェニル基は１個以上の親水性置換基で置換されている）、または３−アミノプロパン−１−チオールである。

【0237】

「親水性」：例えば、重合体単量体単位またはマレイミド遮断部位の置換基が親水性または水溶性であるという場合の用語「親水性」は、当該分野のこの用語の意味と本質的に異なるものではなく、イオン性原子、極性原子、または分極性原子を含む化学部位、または水分子によって溶媒和されてもよい化学部位を指す。したがって、本明細書で用いられる親水性基は、上で定義した用語「親水性」の定義に含まれる脂肪族部位、シクロアルキル部位、複素脂肪族部位、ヘテロシクロアルキル部位、アリール部位、またはヘテロアリール部位を指す。好適な特定の親水性有機部位としては、例えば、約１個から１２個の範囲の原子の分子鎖を含む脂肪族基または複素脂肪族基、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アミン、カルボキシル、アミド、カルボキシルエステル、チオエステル、アルデヒド、ニトリル、イソニトリル、ニトロソ、ヒドロキシルアミン、メルカプトアルキル、複素環、カルバミン酸塩、カルボン酸およびその塩、スルホン酸およびその塩、スルホン酸エステル、リン酸およびその塩、リン酸エステル、ポリグリコールエーテル、ポリアミン、ポリカルボン酸塩、ポリエステル、およびポリチオエステル等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、親水性置換基としては、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、アルデヒド基（ＣＨＯ）、ケトン基（ＣＯＣ_1-4アルキル）、メチロール（ＣＨ₂ＯＨ）、またはグリコール（例えば、ＣＨＯＨ−ＣＨ₂ＯＨまたはＣＨ−（ＣＨ₂ＯＨ）₂）、ＮＨ₂、Ｆ、シアノ、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ等が挙げられる。

【0238】

本明細書で開示される重合体に関する用語「親水性」は、一般に、当該分野でのこの用語の用法と異なるものではなく、上で定義した親水性官能基を含む重合体を指す。好ましい態様では、親水性重合体は水溶性高分子である。重合体の親水性は、水和エネルギーを求めて直接測定してもよく、あるいは２つの液相の調査または疎水度が分かっている固相（例えばＣ４またはＣ１８）を用いるクロマトグラフィーにより決定してもよい。

【0239】

「重合体担体」：本明細書で用いられる用語「重合体担体」は、指定されたリンカーを有する１種以上の薬物分子および／または指定されたリンカーを有する１種以上のＰＢＲＭに共有結合するのに好適な、あるいは共有結合させることができる重合体または変性重合体を指す。

【0240】

「生理条件」：本明細書で用いられる用語「生理条件」は、生体組織の細胞外液で生じるような化学的（例えば、ｐＨ、イオン強度）条件および生化学的（例えば、酵素濃度）条件の範囲に関する。大部分の正常な組織では、生理ｐＨは約７．０〜７．４の範囲である。循環する血漿および正常な間隙液は、正常な生理条件の典型例である。

【0241】

「薬物」：本明細書で用いられる用語「薬物」は、生物学的に活性であって、それを必要とする対象に投与すると所望の生理的効果をもたらす化合物（例えば、活性医薬品成分）を指す。

【0242】

「細胞毒性」：本明細書で用いられる用語「細胞毒性」は、細胞または選択された細胞集団（例えば、癌細胞）に対する毒性を意味する。毒性効果は、細胞死および／または溶解を引き起こす場合がある。特定の例では、毒性効果は、細胞に対する亜致死的破壊効果（例えば、細胞の成長を遅らせるか止める）である可能性がある。細胞毒性効果を達成するために、薬物またはプロドラッグは、その他のうち、ＤＮＡ損傷剤、微小管破壊剤、または細胞毒性タンパク質またはポリペプチドからなる群から選ばれてもよい。

【0243】

「細胞分裂阻害」：本明細書で用いられる用語「細胞分裂阻害」は、細胞の成長および／または増殖を阻害あるいは停止させる薬物または他の化合物を指す。

【0244】

「小分子」：本明細書で用いられる用語「小分子」は、天然に出現する、あるいは（例えば化学合成により）人工的に作られた比較的低い分子量を有する分子を指す。好ましい小分子は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトで局所効果または全身性効果をもたらすという点において生物学的に活性である。特定の好ましい態様では、小分子は薬物であり、「薬物分子」、「薬物」、または「治療薬」と言われる。特定の態様では、薬物分子は、ＭＷが約５ｋＤａ以下である。他の態様では、薬物分子は、ＭＷが約１．５ｋＤａ以下である。いくつかの態様では、薬物分子は、ビンカアルカロイド、オーリスタチン、デュオカルマイシン、ツブリシン、非天然のカンプトセシン化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ結合薬物、キナーゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＫＳＰ阻害剤、カリケアマイシン、ＳＮ３８、ピロロベンゾジアゼピン、およびこれらの類縁体から選ばれる。必ずしも必要ではないが、前記薬物は、適切な政府機関または行政体（例えば、食品医薬品局（ＦＤＡ））により使用について既に安全かつ有効であることが認められていることが好ましい。例えば、ＦＤＡにより２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§３３０．５、３３１〜３６１、および４４０〜４６０に示されたヒト用途の薬物、ＦＤＡにより２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§５００〜５８９で示された獣医学用途の薬物（参照により本明細書に組み込まれる）はすべて、本明細書の親水性重合体との使用に好適であると見なされる。

【0245】

本明細書で用いられる用語「薬物誘導体」または「修飾薬物」は、本明細書で開示される複合体により供給される薬物分子と、その薬物分子を重合体担体に付加することができる官能基を含む化合物を指す。

【0246】

本明細書で用いられる用語「活性形態」は、生体内または生体外で意図された医薬品有効性を示す化合物の形態を指す。特に、本明細書で開示される複合体により供給されることが意図された薬物分子が複合体から放出される場合、活性形態は、意図された治療特性を示す薬物自体あるいはその誘導体であってもよい。薬物を重合体担体に付加しているリンカーの生分解性結合が開裂して、薬物を複合体から放出させることができる。したがって、活性薬物誘導体はリンカーの部分を含んでいてもよい。

【0247】

「ＰＨＦ」はポリ（１−ヒドロキシメチルエチレン＝ヒドロキシメチル−ホルマール）を指す。

【0248】

本明細書で用いられる用語「重合体単位」、「単量体単位」、「単量体」、「モノマー体単位」、「単位」はすべて、重合体の繰り返し可能な構成単位を指す。

【0249】

本明細書で用いられる用語重合体、重合体担体／足場材料、または重合体複合体の「分子量」または「ＭＷ」は、特に断りのない限り、無変性重合体の重量平均分子量を指す。

【0250】

本発明は、本明細書の化合物に出現する原子のすべての同位体を含むものとする。同位体は、原子番号が同じで異なる質量数を有する原子を含む。これに限定されないが、一般的な例として、水素の同位体は三重水素および重水素を含む。炭素の同位体はＣ−１３およびＣ−１４を含む。

【0251】

本発明は、光学異性体および互変異性体を指して含む化合物のすべての異性体を含むものとする。ここで、光学異性体は、エナンチオマーおよびジアステレオマー、キラル異性体、および非キラル異性体を含む。また、光学異性体は、単離された光学異性体、光学異性体の混合物（ラセミ体と非ラセミ体の混合物を含む）を含む。ここで、異性体は単離された形態、あるいは１種以上の他の異性体の混合物であってもよい。
ＨＥＲ２抗体

【0252】

本明細書で開示されるモノクローナル抗体は、ＨＥＲ２媒介ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路活性を阻害する能力を有する。

【0253】

本明細書で開示される抗体としては、例えば、ＸＭＴ１５１７抗体、ＸＭＴ１５１８抗体、ＸＭＴ１５１９抗体、およびＸＭＴ１５２０抗体が挙げられる。これらの抗体は、ヒトＨＥＲ２に対する特異性を示し、生体外でのＨＥＲ２の機能活性を阻害することが示されている。

【0254】

本明細書で記載されるＨＥＲ２モノクローナル抗体はそれぞれ、アミノ酸および以下の示される対応する核酸配列に示される重鎖（ＨＣ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖（ＬＣ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。各抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列では網掛けされている。重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、以下で示されるアミノ酸配列で下線が引かれている。相補性決定領域（ＣＤＲ）を囲むアミノ酸は、E.A. Kabat et al. (See Kabat, E.A., et al., Sequences of Protein of immunological interest（免疫学的目的のタンパク質配列）, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991))に定義された通りである。
＞ＸＭＴ１５１７重鎖アミノ酸配列（重鎖可変領域（配列番号９）＋ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号３２））

【化27】

ＣＤＲＨ１：FTFSSYGMH（配列番号１７）
ＣＤＲＨ２：VIWYDGSNKYYADSVKG（配列番号１８）
ＣＤＲＨ３：EAPYYAKDYMDV（配列番号１９）
＞ＸＭＴ１５１７重鎖可変領域核酸配列

【化28】

＞ＸＭＴ１５１７軽鎖アミノ酸配列（軽鎖可変領域（配列番号１０）＋軽鎖定常領域（配列番号３３））

【化29】

ＣＤＲＬ１：RASQSVSSDYLA（配列番号２０）
ＣＤＲＬ２：GASSRAT（配列番号２１）
ＣＤＲＬ３：QQYVSYWT（配列番号２２）
＞ＸＭＴ１５１７軽鎖可変領域核酸配列

【化30】

＞ＸＭＴ１５１８重鎖アミノ酸配列（重鎖可変領域（配列番号１１）＋ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号３２））

【化31】

ＣＤＲＨ１：FTFSSYGMH（配列番号１７）
ＣＤＲＨ２：GIWWDGSNEKYADSVKG（配列番号２３）
ＣＤＲＨ３：EAPYYAKDYMDV（配列番号１９）
＞ＸＭＴ１５１８軽鎖アミノ酸配列（軽鎖可変領域（配列番号１２）＋軽鎖定常領域（配列番号３３））

【化32】

ＣＤＲＬ１：RASQSVSSDYLA（配列番号２０）
ＣＤＲＬ２：GASRRAT（配列番号２４）
ＣＤＲＬ３：QQYVSYWT（配列番号２２）
＞ＸＭＴ１５１９重鎖アミノ酸配列（重鎖可変領域（配列番号１３）＋ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号３２））

【化33】

ＣＤＲＨ１：FTFSSYSMN（配列番号２５）
ＣＤＲＨ２：YISSSSSTIYYADSVKG（配列番号２６）
ＣＤＲＨ３：GGHGYFDL（配列番号２７）
＞ＸＭＴ１５１９重鎖可変領域核酸配列

【化34】

＞ＸＭＴ１５１９軽鎖アミノ酸配列（軽鎖可変領域（配列番号１４）＋軽鎖定常領域（配列番号３３））

【化35】

ＣＤＲＬ１：RASQSVSSSYLA（配列番号２８）
ＣＤＲＬ２：GASSRAT（配列番号２１）
ＣＤＲＬ３：QQYHHSPLT（配列番号２９）
＞ＸＭＴ１５１９軽鎖可変領域核酸配列

【化36】

＞ＸＭＴ１５２０重鎖アミノ酸配列（重鎖可変領域（配列番号１５）＋ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号３２））

【化37】

ＣＤＲＨ１：FTFSGRSMN（配列番号３０）
ＣＤＲＨ２：YISSDSRTIYYADSVKG（配列番号３１）
ＣＤＲＨ３：GGHGYFDL（配列番号２７）
＞ＸＭＴ１５２０軽鎖アミノ酸配列（軽鎖可変領域（配列番号１６）＋軽鎖定常領域（配列番号３３））

【化38】

ＣＤＲＬ１：RASQSVSSSYLA（配列番号２８）
ＣＤＲＬ２：GASSRAT（配列番号２１）
ＣＤＲＬ３：QQYHHSPLT（配列番号２９）

【0255】

また、本発明は、本明細書で記載される抗体およびその抗原結合断片と同じエピトープに結合する、あるいはその同じエピトープへの結合について競合する抗体およびその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書で開示される抗体および抗原結合断片は特異的にＨＥＲ２に結合する。ここで、前記抗体またはその断片は、ヒトＨＥＲ２の１つ以上のアミノ酸残基（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０４６２６．１）を含むエピトープに結合する。

【0256】

本明細書で開示される抗体およびその抗原結合断片は、以下のアミノ酸配列を含む完全な長さのヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する。

【化39】

【0257】

本明細書で開示される抗体およびその抗原結合断片は、以下のアミノ酸配列を含むヒトＨＥＲ２受容体の細胞外領域（ＥＣＤ）のエピトープに特異的に結合する。

【化40】

【0258】

当業者には自明であるが、必要以上に実験をしなくても、本明細書で開示されるモノクローナル抗体（例えば、ＸＭＴ１５１７、ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９、およびＸＭＴ１５２０）が天然の結合相手またはＨＥＲ２と関連づけられることが分かっている他の分子と結合をするのをあるモノクローナル抗体が妨げるかどうかを確かめることで、両方のモノクローナル抗体が同じ特異性を有するかどうかを決定することができる。検査対象のモノクローナル抗体が本明細書で開示されるモノクローナル抗体と競合する場合、本明細書で開示されるモノクローナル抗体による結合が減少し、これら２つのモノクローナル抗体は同じまたは密接に関連したエピトープに結合することが示される。

【0259】

あるモノクローナル抗体が本明細書で開示されるモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定する別の方法では、本明細書で開示されるモノクローナル抗体を（通常、そのモノクローナル抗体が反応性を有する）可溶性ＨＥＲ２を用いて予備培養し、検査対象のモノクローナル抗体を加えて、検査対象のモノクローナル抗体がＨＥＲ２に結合する能力が阻害されるかどうかを決定する。検査対象のモノクローナル抗体が阻害された場合、このモノクローナル抗体が本明細書で開示されるモノクローナル抗体と同じまたは機能的に等価なエピトープ特異性を有することはほぼ確実である。

【0260】

あるいは、例えば、ＨＥＲ２媒介ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路活性を測定して、モノクローナル抗体がＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路活性を調節、阻止、阻害、低下、拮抗、中和、または干渉することができるかどうかを決定して、本明細書で開示されるモノクローナル抗体をスクリーニングしてもよい。

【0261】

ＨＥＲ２抗体は、例えば、本明細書で提供される実施例で記載される方法を用いて生成される。この方法に代えて、あるいは追加して、当該分野で周知の様々な手順を用いて、ＨＥＲ２あるいはその誘導体、断片、類縁体、相同体、または相同分子種（orthologs）に対して作られたモノクローナル抗体を産生してもよい。（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual（抗体：実験マニュアル）, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、参照により本明細書に組み込まれる）。完全ヒト抗体とは、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子に由来する抗体分子である。本明細書では、このような抗体を「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と言う。ヒトモノクローナル抗体は、例えば、以下に提供される実施例で記載される手順を用いて作製される。ヒトモノクローナル抗体はまた、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞融合細胞技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照のこと）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ融合細胞技術（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY（モノクローナル抗体と癌治療）, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと）を用いて作製してもよい。ヒトモノクローナル抗体を利用してヒト融合細胞を用いて（Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照のこと）あるいはエプスタイン・バール・ウイルスを用いて生体外でヒトＢ細胞を形質転換して（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY（モノクローナル抗体と癌治療）, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと）産生されてもよい。

【0262】

抗体は、周知の技術、例えば、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供するタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇを用いた親和性クロマトグラフィーにより精製される。この精製の後またはこの精製の代わりに、得られた免疫グロブリンの標的である特異的な抗原またはそのエピトープをカラムに固定して、免疫親和性クロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製してもよい。免疫グロブリンの精製については、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, The Scientist, Inc. により発行, Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)に記載されている。

【0263】

ＨＥＲ２媒介ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路活性を調節、阻止、阻害、低下、拮抗、中和、または干渉するモノクローナル抗体は、例えば、膜結合および／または可溶性ＨＥＲ２（例えば、マウス、ラット、またはヒトＨＥＲ２）あるいは免疫原性断片、誘導体、またはその変異体を用いて動物を免疫化して生成される。あるいは、ＨＥＲ２が形質移入された細胞の表面で発現してその細胞表面と関連づけられるようにＨＥＲ２をコードする核酸分子を含むベクターを用いて形質移入された細胞で動物を免疫化する。あるいは、抗体は、抗体またはＨＥＲ２に結合するための抗原結合領域配列を含むライブラリーをスクリーニングして得られる。このライブラリーは、例えば、会合させたファージ粒子の表面で発現させたバクテリオファージ被覆タンパク質へのタンパク質またはペプチド融合、およびファージ粒子内に含まれたコードＤＮＡ配列（すなわち、「ファージ提示ライブラリー」）としてバクテリオファージの範疇に整備されている。骨髄腫／Ｂ細胞融合から得られる融合細胞はＨＥＲ２に対する反応性で選別される。また、抗体は、例えば、以下に記載される酵母菌抗体提示ライブラリーおよび酵母菌ライブラリー提示システムから選ばれ、任意で最適化される。Blaise L, Wehnert A, Steukers MP, van den Beucken T, Hoogenboom HR, Hufton SE. Construction and diversification of yeast cell surface displayed libraries by yeast mating: application to the affinity maturation of Fab antibody fragments（酵母菌の交配による酵母細胞表面提示ライブラリーの構築と多様化：Ｆａｂ抗体断片の親和性成熟化への応用）。Gene. 2004 Nov 24;342(2):211-8; Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries（組み合わせポリペプチドライブラリーを選別するための酵母表面提示）。Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7; Kuroda K, Ueda M. Cell surface engineering of yeast for applications in white biotechnology（ホワイトバイオテクノロジーに応用される酵母の細胞表面工学）。Biotechnol Lett. 2011 Jan;33(1):1-9. doi: 10.1007/s10529-010-0403-9.Review; Lauer TM, Agrawal NJ, Chennamsetty N, Egodage K, Helk B, Trout BL. Developability index: a rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity（発達性の指標：抗体凝集傾向のスクリーニングのための高速コンピュータツール）。J Pharm Sci. 2012 Jan;101(1):102-15; Orcutt K.D. and Wittrup K.D. (2010), 207-233 doi: 10.1007/978-3-642-01144-3_15; Rakestraw JA, Aird D, Aha PM, Baynes BM, Lipovsek D. Secretion-and-capture cell-surface display for selection of target-binding proteins（標的結合タンパク質の選択のための分泌捕獲型細胞表面提示）。Protein Eng Des Sel. 2011 Jun;24(6):525-30; US 8,258,082; US 6,300,064; US 6,696,248; US 6,165,718; US 6,500,644; US 6,291,158; US 6,291,159; US 6,096,551; US 6,368,805; US 6,500,644。酵母菌ライブラリー提示システムは、例えば、ＷＯ２００８１１８４７６号、ＷＯ２００９／０３６３７９号、ＷＯ２０１０１０５２５６号、およびＷＯ２０１２００９５６８号で記載されている。特定の態様では、このような酵母菌抗体提示ライブラリーまたは酵母菌ライブラリー提示システムは、ヒト免疫前抗体レパトアの多様性特性を模倣または反映するように設計される。特定の態様では、このような酵母菌抗体提示ライブラリーまたは酵母菌ライブラリー提示システムの多様性は、コンピュータにより生成される。特定の態様では、このような酵母菌抗体提示ライブラリーまたは酵母菌ライブラリー提示システムは、サッカロミケス酵母菌細胞（例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae）細胞）を含む。特定の態様では、このような酵母菌抗体提示ライブラリーまたは酵母菌ライブラリー提示システムはピキア（Pichia）細胞を含む。

【0264】

モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)で記載される融合細胞法を用いて作製される。融合細胞法では、一般に、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を免疫化剤で免疫化して、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は生体外で免疫化されてもよい。

【0265】

一般に、免疫化剤としては、タンパク質抗原、その断片、またはその融合タンパク質が挙げられる。一般に、ヒト由来の細胞が望ましい場合は末梢血リンパ球が用いられ、ヒト以外の哺乳類に由来の細胞が望ましい場合は脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。リンパ球は、次いで、好適な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて不死化細胞株と融合させて、融合細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice（モノクローナル抗体：原理と実践）, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は、通常、形質変換した哺乳類の細胞、特に齧歯類、ウシ、およびヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が用いられる。融合細胞は、好ましくは未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する１種以上の物質を含む好適な培地で培養することができる。例えば、親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）がない場合、融合細胞用の培地は、通常、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含む。

【0266】

好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高発現量を支持し、ＨＡＴ培地等の培地に感度の高い不死化細胞株である。より好ましい不死化細胞株は、例えば、サーク研究所細胞配布センター（カリフォルニア州サンディエゴ）およびアメリカ培養細胞系統保存機関（ヴァージニア州マナサス）から入手することができるマウス骨髄腫細胞株である。モノクローナル抗体の産生に関しては、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている。(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications（モノクローナル抗体の産生技術と応用）, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)を参照のこと)。

【0267】

次いで、融合細胞が培養される培地を、抗原に対して作られるモノクローナル抗体の存在について検査してもよい。融合細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈殿または生体外結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））で決定されることが好ましい。このような技術およびアッセイは当該分野で周知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析により決定することができる。また、モノクローナル抗体の治療用途では、標的抗原に対する高い特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。

【0268】

所望の融合細胞を同定した後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングして、標準的な方法で成長させてもよい（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice（モノクローナル抗体：原理と応用）, Academic Press, (1986) pp. 59-103)）。この目的に好適な培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ１６４０培地が挙げられる。あるいは、融合細胞を哺乳類の腹水等、生体内で成長させてもよい。

【0269】

サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、従来の免疫グロブリン精製法（例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、または親和性クロマトグラフィー）により培地または腹水から単離あるいは精製してもよい。

【0270】

また、モノクローナル抗体を、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組み換えＤＮＡ法で作製してもよい。本明細書で開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いる）従来の方法で容易に単離し、配列決定することができる。本明細書で開示される融合細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として作用する。一旦単離されると、このＤＮＡは発現ベクターに入れることができる。次いで、その発現ベクターを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）に形質移入して、組み換え宿主細胞内でモノクローナル抗体を合成する。また、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖定常領域のコード配列を相同性マウス配列と置換して（米国特許第４，８１６，５６７号、Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させてＤＮＡを修飾してもよい。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本明細書で開示される抗体の定常領域と置換して、または本明細書で開示される抗体の１つの抗原結合部位の可変領域と置換して、２価のキメラ抗体を作製することができる。

【0271】

本明細書で開示されるモノクローナル抗体は、完全ヒト抗体またはヒト化抗体を含む。これらの抗体は、ヒトが投与された免疫グロブリンに対する免疫応答を発生させることなく、ヒトに投与するのに好適である。

【0272】

ヒト化ＨＥＲ２抗体または完全ヒトＨＥＲ２抗体は、例えば、以下に提供される実施例で記載される手順を用いて生成される。

【0273】

他の別の方法では、ＨＥＲ２抗体は、例えば、ヒト配列のみを含む抗体を用いるファージ提示法を用いて開発される。そのような手法は当該分野、例えば、ＷＯ９２／０１０４７号および米国特許第６，５２１，４０４号（引用により本明細書に組み込まれる）で周知である。この手法では、ＨＥＲ２またはその断片の天然源または組み換え源を用いて、軽鎖および重鎖の無作為な対を担持するファージの組み合わせライブラリーがスクリーニングされる。他の手法では、少なくとも１つの工程が遺伝子導入非ヒト動物をヒトＨＥＲ２タンパク質で免疫化することを含む過程によってＨＥＲ２抗体を産生してもよい。この手法では、この異種間非ヒト動物の内因性重鎖座位および／またはκ軽鎖座位のいくつかは、抗原に応答して免疫グロブリンをコードする遺伝子を生成するのに必要な再構成が機能しない、あるいは再構成することができなくしてある。また、少なくとも１個のヒト重鎖座位および少なくとも１個のヒト軽鎖座位は、安定して動物に形質移入されている。従って、投与された抗原に応答して、ヒトの座位は再編成し、その抗原に免疫特異的な、ヒト可変領域コード遺伝子をもたらす。したがって、免疫化の際には、ゼノマウス（xenomouse）は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。

【0274】

異種間非ヒト動物を生み出す様々な技術が当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号および６，１５０，５８４号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。この一般的な方法は、１９９４年に出版された最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）血統に関して実証された。Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。また、米国特許第６，１６２，９６３号、６，１５０，５８４号、６，１１４，５９８号、６，０７５，１８１号、および５，９３９，５９８号、日本特許第３０６８１８０Ｂ２号、３０６８５０６Ｂ２号、および３０６８５０７Ｂ２号、欧州特許ＥＰ第０４６３１５１Ｂ１号、ならびに国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０およびこれらの対応特許を参照のこと。

【0275】

別の手法では、Ｉｇ座位に由来する断片（個々の遺伝子）を封入して外因性Ｉｇ座位を模倣する「ミニ座位」法が用いられている。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤ_H遺伝子、１つ以上のＪ_H遺伝子、ミュー定常領域、および第二の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）が、動物に挿入するための構築物として形成される。例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、５，５４５，８０７号、５，５９１，６６９号、５，６１２，２０５号、５，６２５，８２５号、５，６２５，１２６号、５，６３３，４２５号、５，６４３，７６３号、５，６６１，０１６号、５，７２１，３６７号、５，７７０，４２９号、５，７８９，２１５号、５，７８９，６５０号、５，８１４，３１８号、５，８７７，３９７号、５，８７４，２９９号、６，０２３，０１０号、６，２５５，４５８号、および欧州特許第０５４６０７３Ｂ１号、ならびに国際特許出願ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７号、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６，ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびこれらの対応特許を参照のこと。

【0276】

また、微小核融合により染色体の大きな断片または染色体全体を導入したマウスからのヒト抗体の生成が示されている。欧州特許出願第７７３２８８号および８４３９６１を参照のこと。

【0277】

ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答により、産業界ではキメラ抗体またはヒト化抗体が作製されている。キメラ抗体はヒト定常領域および免疫可変領域を有するが、特に抗体の慢性投与または複数回投与で用いた場合は特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が観察されると予測される。したがって、ＨＡＭＡ応答またはＨＡＣＡ応答の恐れおよび／または効果を低下あるいは緩和させるために、ＨＥＲ２に対する完全ヒト抗体を提供することが望ましい。

【0278】

また、免疫原性を抑制した抗体は、ヒト化、キメラ化、および適切なライブラリーを用いた提示技術により産生される。自明であるが、当該分野で周知の技術を用いてマウス抗体または他の種に由来する抗体をヒト化あるいは霊長類化することができる。例えば、Winter and Harris Immunol Today 14:43 46 (1993)、およびWright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)を参照のこと。目的の抗体を組み換えＤＮＡ技術により設計して、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ領域、および／またはフレームワーク領域を対応するヒト配列で置換してもよい（ＷＯ９２１０２１９０、および米国特許第５，５３０，１０１号、５，５８５，０８９号、５，６９３，７６１号、５，６９３，７９２号、５，７１４，３５０号、および５，７７７，０８５号を参照のこと）。また、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためにIg cDNAを用いることが当該分野で周知である(Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) and J. Immunol. 139:3521 (1987))。ｃＤＮＡの作製に、抗体を産生する融合細胞または他の細胞からｍＲＮＡを単離して用いる。特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によりこの目的のｃＤＮＡを増幅してもよい（米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号）。あるいは、ライブラリーを作製して、スクリーニングを行って目的の配列を単離する。次いで、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列をヒト定常領域配列に融合する。ヒト定常領域の遺伝子配列は、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest、国立衛生研究所公開番号９１−３２４２で見つけることができる。ヒトＣ領域遺伝子は、周知のクローンから容易に入手可能である。イソタイプの選択は、所望のエフェクター機能（例えば、補体結合、または抗体依存性細胞毒性の活性等）により誘導される。好ましいイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域κまたはλのいずれかを用いてもよい。そして、従来の方法でキメラヒト化抗体を発現させる。

【0279】

変化しないタンパク質（例えば、プロテアーゼ）による切断または化学的な切断により抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦａｂを調製してもよい。あるいは、切断遺伝子を設計する。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ１領域およびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列と、その後ろに切断分子を作るための翻訳終止コドンを含む。

【0280】

重鎖および軽鎖のＪ領域の共通配列を用いてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドを設計し、有用な制限部位をＪ領域に導入し、その後でＶ領域分節とヒトＣ領域分節とを結合してもよい。Ｃ領域のｃＤＮＡを部位特異的変異により修飾して、ヒト配列の類似位置に制限部位を置いてもよい。

【0281】

発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来の遺伝子副体等が挙げられる。使いやすいベクターは、機能的に完全ヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入かつ発現することができるように設計された適切な制限部位を有するものである。このようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域のスプライス供与部位とヒトＣ領域の前のスプライス受容部位との間、およびヒトＣＨエクソン内に発生するスプライス領域でスプライシングが起こる。コード領域下流の天然の染色体部位ではポリアデニル化および転写終結が起こる。得られたキメラ抗体を任意の強いプロモーターに接合してもよい。そのようなプロモーターとしては、レトロウイルスＬＴＲ（例えば、ＳＶ−４０初期プロモーター(Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983))、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ (Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982))、およびモロニ−マウス白血病ウイルスＬＴＲ(Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985))が挙げられる。また、自明であるが、天然のＩｇプロモーターを用いてもよい。

【0282】

さらに、ヒト抗体またはその他の種に由来する抗体を提示技術により生成してもよい。そのような技術としては、ファージ提示法、レトロウイルス提示法、リポソーム提示法、および当該分野で周知の技術を用いた他の技術等が挙げられるが、これらに限定されない。得られた分子を親和性成熟等、当該分野で周知の技術でさらに成熟させてもよい。Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes and Pluckthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997)（リポソーム提示法）、Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988)（ファージ提示法）、Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992)、および米国特許第５，７３３，７４３号。提示技術を用いてヒトではない抗体を産生する場合は、そのような抗体は上記のようにヒト化することができる。

【0283】

これらの技術を用いて、ＨＥＲ２発現細胞、ＨＥＲ２の溶解性形態、エピトープまたはそのペプチド、およびそれに対する発現ライブラリーに対して抗体を生成して（例えば、米国特許第５，７０３，０５７号を参照のこと）、その後、本明細書で記載される活性について上述のようにスクリーニングを行ってもよい。

【0284】

本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体は、上述の単鎖抗体をコードするＤＮＡ分節を含むベクターにより発現させてもよい。

【0285】

これらは、ベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテル等を含む。ベクターは、ＷＯ９３／６４７０１に記載の標的部位（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）、および核酸結合部位（例えば、ポリリシン）を有する化学複合体、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２２６１８）に記載の標的部位（例えば、標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部位（例えば、プロタミン）を含む融合タンパク質である融合タンパク質、プラスミド、ファージ等を含む。ベクターは、染色体由来、非染色体由来、または合成したものであってもよい。

【0286】

好ましいベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学複合体が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、モロニ−マウス白血病ウイルスが挙げられる。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターとしては、ポックスベクター（例えば、オルソポックスまたはトリポックスベクター）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクター（Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems（ＤＮＡクローニング：哺乳類系）, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990), Adenovirus Vectors（アデノウイルスベクター）(LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995) and Adeno-associated Virus Vectors（アデノ随伴ウイルスベクター）(Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994))を参照のこと）が挙げられる。

【0287】

ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。トリポックスウイルスベクターは、核酸の短期発現のみが得られる。核酸を神経細胞に導入するのにはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターが好ましい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約４ヶ月）よりも発現期間が短く（約２ヶ月）、これはＨＳＶベクターよりも短い。選択した特定のベクターは、標的細胞および処理条件に依存する。導入は、一般的な技術（例えば、感染、形質移入、形質導入、または形質転換）により行うことができる。遺伝子導入法としては、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ₄沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、原形質体融合、リポフェクション法、細胞微量注入法、およびウイルスベクター等が挙げられる。

【0288】

ベクターを用いて、本質的にいずれの所望の標的細胞をも標的することができる。例えば、定位注入法を用いてベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に向けることができる。また、ミニポンプ注入システム（例えば、SynchroMed Infusion System）を用いた脳室内（ｉｃｖ）注入により粒子を送達してもよい。また、対流という総体流に基づく方法も大きい分子を脳の広い領域に送達するのに有効であることが証明されており、ベクターを標的細胞に送達するのに有用な場合がある（Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)を参照のこと）。用いることのできる他の方法としては、カテーテル、静脈内投与、非経口投与、腹腔内注射および皮下注射、経口投与、またはその他の周知の投与経路が挙げられる。

【0289】

これらのベクターを用いて、様々な方法で用いることができる抗体を大量に発現させることができる。例えば、試料のＨＥＲ２の存在を検出するのに用いることができる。また、抗体を用いて、ＨＥＲ２関連信号伝達への結合およびその阻害を試みることができる。

【0290】

本明細書で開示される抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体を産生するための技術を採用することができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。また、Ｆ_ab発現ライブラリーを構築する方法（例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281）を用いてもよい。これにより、タンパク質、あるいはその誘導体、断片、類縁体または相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦ_ab断片を高速かつ有効に同定することができる。当該分野で周知の技術によりタンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体断片を産生してもよい。そのような断片としては、（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されたＦ_(ab’)2断片、（ｉｉ）Ｆ_(ab’)2断片のジスルフィド架橋を還元して生成されたＦ_ab断片、（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤で抗体分子を処理して生成されたＦ_ab断片、および（ｉｖ）Ｆ_v断片が挙げられるが、これらに限定されない。

【0291】

本発明はまた、Ｆ_v、Ｆ_ab、Ｆ_ab’およびＦ_(ab’)2抗ＨＥＲ２断片または抗ＨＥＲ２断片、単鎖抗ＨＥＲ２抗体、少なくとも１本の腕がＨＥＲ２に結合する多特異性抗体、およびヘテロ複合体抗ＨＥＲ２抗体を含む。

【0292】

二重特異性抗体は、少なくとも２種の異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体である。この場合、結合特異性の１つは、ＨＥＲ２に対するものである。第二の結合標的は任意の他の抗原であり、細胞表面タンパク質、受容体、または受容体下位単位を含む。

【0293】

二重特異性抗体を作製する方法は当該分野で周知である。従来、二重特異性抗体の組み換え産生は免疫グロブリンの重鎖と軽鎖との２つの対に基づいており、ここで２本の重鎖は異なる特異性を有する(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖および軽鎖を無作為に分類するため、これら融合細胞（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があるが、そのうちの１種のみが正しい二重特異性構造を有する。この正しい分子は、通常親和性クロマトグラフィー工程により精製される。同様の手順が１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)で開示されている。

【0294】

所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変領域を免疫グロブリン定常領域配列と融合させてもよい。少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の一部を有する免疫グロブリン重鎖定常領域との融合が好ましい。前記融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入して、好適な宿主有機体に共形質移入する。二重特異性抗体の生成についてのさらなる詳細は、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。

【0295】

ＷＯ９６／２７０１１に記載の他の手法によると、抗体分子対の界面を設計して、組み換え細胞培地から回収される異種二量体の百分率を最大にしてもよい。好ましい界面は、少なくとも抗体定常領域のＣＨ３領域の一部を含む。この方法では、第一の抗体分子の界面に由来する１つ以上の小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換する。大きいアミノ酸側鎖を小さい側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換して、大きい側鎖と同じまたは類似した大きさの補償「空洞」を第二の抗体分子の界面に作製する。これにより、他の望ましくない最終生成物（例えば、同種二量体等）に対して異種二量体の歩留まりを増加させる反応機構が提供される。

【0296】

二重特異性抗体を完全な長さの抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）₂二重特異性抗体）として作製してもよい。抗体断片から二重特異性抗体を生成する技術が文献に記載されている。例えば、化学結合を用いて二重特異性抗体を作製してもよい。Brennan et al., Science 229:81 (1985)には、無傷の抗体をタンパク分解的に開裂してＦ（ａｂ’）₂断片を生成する手順が記載されている。これらの断片を、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、近接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィドの形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転化する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンで還元してＦａｂ’−チオールに再転化し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択可能な固定化のための薬剤として用いることができる。

【0297】

また、Ｆａｂ’断片を大腸菌から直接回収して、化学的に結合して二重特異性抗体を形成してもよい。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）₂分子の産生が記載されている。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から個別に分泌されて、生体外で直接化学結合して二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘発することができる。

【0298】

また、二重特異性抗体断片を組み換え細胞培地から直接作製して単離する様々な技術が記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて産生される。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。遺伝子融合により、Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを２種の異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。この抗体同種二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、再度酸化して抗体異種二量体が形成された。また、この方法を抗体同種二量体の産生に用いてもよい。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に記載の「二重特異性抗体」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための別の反応機構を提供している。この断片は、短すぎて同じ鎖の２つの領域間で対を形成することができないリンカーによって軽鎖可変領域（Ｖ_L）に結合した重鎖可変領域（Ｖ_H）を含む。したがって、１つの断片のＶ_HおよびＶ_L領域を他の断片の相補性Ｖ_LおよびＶ_H領域と無理に対にして、２つの抗原−結合部位を形成する。また、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いて二重特異性抗体断片を作製する他の方法が報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。

【0299】

結合価が２を超える抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を作製してもよい。Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。

【0300】

例示的な二重特異性抗体は、少なくとも１つは本明細書で開示されるタンパク質抗原に由来する、２種の異なるエピトープに結合することができる。あるいは、細胞防御反応機構を特定の抗原を発現している細胞に注目させるように白血球のトリガー分子（例えば、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７））、またはＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））に結合している腕に免疫グロブリン分子の抗抗原腕を結合してもよい。また、二重特異性抗体を用いて、特定の抗原を発現している細胞に細胞毒性薬を向けてもよい。これらの抗体は、抗原結合腕と、細胞毒性薬または放射性核種キレート剤（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ等）に結合する腕を有する。他の目的とする二重特異性抗体は、本明細書で記載されるタンパク質抗原に結合し、さらに組織因子（ＴＦ）と結合する。

【0301】

また、異種複合体抗体も本発明の範囲内である。異種複合体抗体は、２種の共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的する（米国特許第４、６７６，９８０号を参照のこと）ため、およびＨＩＶ感染の治療（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９を参照のこと）のために提案されている。合成タンパク質化学で周知の方法（架橋剤を含む方法を含む）を用いて抗体を生体外で作製することが企図される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いてまたはチオエーテル結合を形成して免疫毒素を構築することができる。この目的のために好適な試薬としては、例えば、イミノチオレート、メチル−４−ブチリミデート、および例えば、米国特許第４、６７６，９８０号に開示される試薬が挙げられる。

【0302】

本明細書で開示される抗体の効果または機能を変更することが望ましい場合がある。例えば、ＨＥＲ２の異常発現および／または活性に関連づけられた病気および障害の治療に関して抗体の有効性の高めてもよい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。このように生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能および／または高められた補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を有することができる。(Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191−1195 (1992)、およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと)。あるいは、二重のＦｃ領域を有する抗体を設計して、これにより補体溶解およびＡＤＣＣ能を高めることができる(Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照のこと)。
ＨＥＲ２抗体複合体

【0303】

本発明はまた、毒素（例えば、バクテリア、真菌、植物、または動物由来の酵素活性毒素、またはその断片）等の細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（すなわち、放射性複合体）に結合した抗体を含む免疫複合体に関する。

【0304】

用いることができる酵素活性毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−八連球菌、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヤマシュゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン等が挙げられる。放射性複合体抗体の産生に様々な放射性核種が利用可能である。例えば²¹²Ｂｉ、¹³¹Ｉ、¹³¹Ｉｎ、⁹⁰Ｙ、および¹⁸⁶Ｒｅが挙げられる。

【0305】

抗体と細胞毒性薬の複合体は様々な二官能タンパク質結合剤を用いて作製される。そのような結合剤としては、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアン酸塩（例えば、２，６−ジイソシアン酸トルエン）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）等が挙げられる。例えば、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載されたようにリシン免疫毒素を調製することができる。放射性ヌクレオチドを抗体に結合させるためのキレート剤としては、例えば炭素１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）である（ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと）。

【0306】

当業者には自明であるが、様々な可能性のある部位を本明細書で開示される抗体に結合することができる（例えば、“Conjugate Vaccines（複合体ワクチン）", Contributions to Microbiology and Immunology（微生物学と免疫学への貢献）, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと。その全内容は引用により本明細書に組み込まれる）。

【0307】

抗体と他の部位がそれぞれの活性を保持している限り、２個の分子を結合するいずれかの化学反応によって結合を行ってもよい。この結合は、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、および錯体化等、多くの化学反応機構を含む。しかしながら、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、存在する側鎖の直接縮合あるいは外部架橋分子の組み込みにより得ることができる。タンパク質分子（例えば本発明の抗体）を他の分子に結合させるのに多くの２価または多価の結合剤が有用である。例えば、典型的な結合剤としては、チオエステル、カルボジイミド、コハク酸イミドエステル、二イソシアン酸塩、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミン等の有機化合物が挙げられる。このリストは、当該分野で周知の様々な結合剤の範疇を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的な結合剤を例示することを意図するものである（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); およびVitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照のこと）。

【0308】

文献に好ましいリンカーが記載されている（例えば、Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)にはＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル）の使用が記載されている）。また、米国特許第５，０３０，７１９号には、オリゴペプチドリンカーにより抗体に結合されたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用が記載されている。特に好ましいリンカーとしては、（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩）、（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン(Pierce Chem. Co., Cat. (21558G))、（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサン酸スクシンイミジル(Pierce Chem. Co., Cat.# 21651G)）、（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオナミド］ヘキサン酸スルホスクシンイミジル(Pierce Chem. Co. Cat.# ２１６５-G)）、および（ｖ）ＥＤＣに結合したスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−コハク酸イミド(Pierce Chem. Co., Cat.# 24510)）が挙げられる。

【0309】

上述のリンカーは異なる属性を有し、したがって異なる物理化学特性を有する複合体を生成する成分を含む。例えば、カルボン酸アルキルのスルホ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボン酸塩のスルホ−ＮＨＳエステルよりも安定している。リンカーを含むＮＨＳ−エステルは、スルホ−ＮＨＳエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは立体障害ジスルフィド結合を含み、安定性が高められた複合体を形成することができる。ジスルフィド結合は、一般に、他の結合に比べて不安定である。これは、ジスルフィド結合が生体外で開裂するためで、その結果、利用可能な複合体が減少する。スルホ−ＮＨＳは、特にカルボジイミド結合の安定性を高めることができる。スルホ−ＮＨＳとの結合に用いられるカルボジイミド結合（例えば、ＥＤＣ）は、カルボジイミド結合反応のみよりも加水分解耐性があるエステルを形成する。

【0310】

また、本明細書で開示される抗体は免疫リポソームとして処方することができる。前記抗体を含むリポソームは、例えば、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)、および米国特許第４，４８５，０４５号および４，５４４，５４５号などに記載の当該分野で周知の方法により作製される。循環時間の向上したリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。

【0311】

特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成してもよい。リポソームを所定の孔サイズの濾過器から押し出して、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)等に記載されているように、ジスルフィド交換反応によりリポソームに結合させることができる。

【0312】

一側面では、本明細書で記載される複合体は、１種以上のＤ担持重合体足場材料に直接または間接に結合した単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合その断片を含む。この１種以上のＤ担持重合体足場材料は、それぞれ独立に、分子量が約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲のポリ（１−ヒドロキシメチルエチレン＝ヒドロキシメチル−ホルマール）（ＰＨＦ）を含み、それぞれのＤ担持重合体足場材料は、独立して、式（Ｉｃ）で表される。

【化41】

式中、
Ｄの各出現は、独立して、治療薬または診断薬であり、
Ｌ^D1はカルボニル含有部位であり、

【化42】

の各出現は、独立して、生分解性結合を含む第一のリンカーであり、この結合が切れると、その意図された治療効果に合わせて活性化された形態でＤが放出され、

【化43】

はＤのＬ^D1への直接または間接的連結を示し、

【化44】

の各出現は、独立して、前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片にまだ結合していない第二のリンカーであり、Ｌ^P2は、単離抗体またはその抗原結合断片の官能基と共有結合をまだ形成していない官能基を含む部位であり、Ｌ^D1とＬ^P2の間の

【化45】

はＬ^P2のＬ^D1への直接または間接的連結を示し、第二のリンカーの各出現は前記第一のリンカーの各出現とは区別され、

【化46】

の各出現は、各Ｄ担持重合体足場材料を単離抗体またはその抗原結合断片に結合する第三のリンカーであり、Ｌ^P2と連結した末端

【化47】

は、Ｌ^P2の官能基と単離抗体またはその抗原結合断片の官能基との間に共有結合が形成される時のＬ^P2の単離抗体またはその抗原結合断片への直接または間接的連結を示し、前記第三のリンカーの各出現は、前記第一のリンカーの各出現とは区別され、
ｍは１から約３００の整数であり、
ｍ₁は１から約１４０の整数であり、
ｍ₂は１から約４０の整数であり、
ｍ₃は０から約１８の整数であり、
ｍ₄は１から約１０の整数であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計は約１５から約３００の範囲であり、前記単離抗体またはその抗原結合断片に結合したＬ^P2の総数は１０以下である。

【0313】

前記複合体は、以下の特徴事項を１つ以上含んでいてもよい。

【0314】

例えば、式（Ｉｃ）で、ｍ₁は１〜約１２０（例えば、約１〜９０）の整数であり、かつ／またはｍ₃は１〜約１０（例えば、約１〜８）の整数である。

【0315】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約６ｋＤａ〜約２０ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約４５〜約１５０の範囲）である場合、ｍ₂は２〜約２０の整数であり、ｍ₃は０〜約９の整数であり、ｍ₄は１〜約１０の整数であり、かつ／またはｍ₁は１〜約７５の整数（例えば、ｍ₁は約４〜４５）である。

【0316】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約８ｋＤａ〜約１５ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約６０〜約１１０の範囲）である場合、ｍ₂は２〜約１５の整数であり、ｍ₃は０〜約７の整数であり、ｍ₄は１〜約１０の整数であり、かつ／またはｍ₁は１〜約５５の整数（例えば、ｍ₁は約４〜３０）である。

【0317】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約２ｋＤａ〜約２０ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約１５〜約１５０の範囲）である場合、ｍ₂は１〜約２０の整数であり、ｍ₃は０〜約１０の整数（例えば、ｍ₃は０〜約９の範囲）であり、ｍ₄は１〜約８の整数であり、かつ／またはｍ₁ は１〜約７０の整数であり、単離抗体またはその抗原結合断片に結合したＬ^P2の総数は約２〜約８の範囲（例えば、約２、３、４、５、６，７、または８）である。

【0318】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約３ｋＤａ〜約１５ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約２０〜約１１０の範囲）である場合、ｍ₂は２〜約１５の整数であり、ｍ₃は０〜約８の整数（例えば、ｍ₃は０〜約７の範囲）であり、ｍ₄は１〜約８の整数であり、かつ／または ｍ₁は２〜約５０の整数であり、単離抗体またはその抗原結合断片に結合したＬ^P2の総数が約２〜約８の範囲（例えば、約２、３、４、５、６，７、または８）である。

【0319】

例えば、式（Ｉｃ）のＰＨＦの分子量が約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａ（すなわち、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ₃、およびｍ₄の合計が約４０〜約７５の範囲）である場合、ｍ₂は約２〜約１０の整数（例えば、ｍ₂は約３〜１０）であり、ｍ₃は０〜約５の整数（例えば、ｍ₃は０〜約４の範囲）であり、ｍ₄は１〜約８の整数（例えば、ｍ₄は１〜約５の範囲）であり、かつ／またはｍ₁は約２〜約３５の整数（例えば、ｍ₁は約５〜３５）であり、単離抗体またはその抗原結合断片に結合したＬ^P2の総数は約２〜約８の範囲（例えば、約２、３、４、５、６，７、または８）である。

【0320】

例えば、ＰＨＦの分子量が２ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲（例えば、約６〜２０ｋＤａ、約８〜１５ｋＤａ、約２〜２０ｋＤａ、約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）である場合、ＰＨＦあたりの薬物の数（例えば、ｍ₂）は１〜約４０の整数（例えば、約１〜２０、約２〜１５、約３〜１０、または約２〜１０）である。この足場材料は、例えば、分子量が４０ｋＤａ以上（例えば、６０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１６０ｋＤａ以上、１８０ｋＤａ以上、または２００ｋＤａ以上、または約４０〜２００ｋＤａ、４０〜１８０ｋＤａ、４０〜１４０ｋＤａ、６０〜２００ｋＤａ、６０〜１８０ｋＤａ、６０〜１４０ｋＤａ、８０〜２００ｋＤａ、８０〜１８０ｋＤａ、８０〜１４０ｋＤａ、１００〜２００ｋＤａ、１００〜１８０ｋＤａ、１００〜１４０ｋＤａ、または１４０〜１５０ｋＤａ）の単離抗体またはその抗原結合断片の結合に用いることができる。この態様では、前記単離抗体またはその抗原結合断片のＰＨＦに対する比は、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：９、約１：１〜約１：８、約１：１〜約１：７、約１：１〜約１：６、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：４、約１：１〜約１：３、約１：１〜約１：２、約１：２〜約１：４、約１：２〜約１：３、約１：３〜約１：４、または約１：３〜約１：５である。

【0321】

例えば、ＰＨＦの分子量が２ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲（例えば、約６〜２０ｋＤａ，約８〜１５ｋＤａ、約２〜２０ｋＤａ、約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）である場合、ＰＨＦあたりの薬物の数（例えば、ｍ₂）は１〜約４０の整数（例えば、約１〜２０、約２〜１５、約３〜１０、または約２〜１０）である。この足場材料は、例えば分子量が１４０ｋＤａ〜１８０ｋＤａまたは１４０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの単離抗体またはその抗原結合断片の結合に用いることができる。この態様では、前記単離抗体またはその抗原結合断片のＰＨＦに対する比は、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：９、約１：１〜約１：８、約１：１〜約１：７、約１：１〜約１：６、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：４、約１：１〜約１：３、約１：１〜約１：２、約１：２〜約１：４、約１：２〜約１：３、約１：３〜約１：４、または約１：３〜約１：５である。

【0322】

この範囲の分子量を有する単離抗体またはその抗原結合断片としては、完全な長さの抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0323】

例えば、ＰＨＦの分子量が２ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲である場合、ＰＨＦあたりの薬物の数（例えば、ｍ₂）は１〜約４０の整数（例えば、約１〜２０、約２〜１５、約３〜１０、または約２〜１０）である。この足場材料は、例えば、分子量が６０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの単離抗体またはその抗原結合断片の結合に用いることができる。この態様では、前記単離抗体またはその抗原結合断片のＰＨＦに対する比は、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：９、約１：１〜約１：８、約１：１〜約１：７、約１：１〜約１：６、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：４、約１：１〜約１：３、約１：１〜約１：２、約１：２〜約１：４、約１：２〜約１：３、約１：３〜約１：４、または約１：３〜約１：５である。

【0324】

この範囲の分子量を有する単離抗体またはその抗原結合断片としては、抗体断片（例えば、Ｆａｂ２およびラクダ科の動物由来の抗体）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0325】

特定の態様では、Ｄは治療薬である。特定の態様では、前記治療薬は分子量が約５ｋＤａ以下、約４ｋＤａ以下、約３ｋＤａ以下、約１．５ｋＤａ以下、または約１ｋＤａ以下の小分子である。

【0326】

特定の態様では、前記治療薬は、５０％阻害濃度ＩＣ₅₀が約１ｎＭ未満である

【0327】

他の態様では、前記治療薬は、ＩＣ₅₀が１ｎＭ超である。例えば、前記治療薬は、ＩＣ₅₀が約１〜５０ｎＭである。

【0328】

ＩＣ₅₀が約１ｎＭを超える治療薬（例えば、「作用の弱い薬物」）には、従来認められている結合技術を用いる抗体との結合には不適切なものもある。特定の理論に拘束されるものではないが、そのような治療薬の有効性は、従来技術を用いた標的抗体−薬物複合体に用いるには不十分である。というのも、従来認められている技術を用いて、複合体の薬物動態特性および物理化学特性を損なうことなく薬物の十分な複製（すなわち、８超）を結合させることはできないからである。しかしながら、本明細書で記載される結合方法を用いて、望ましい薬物動態特性および物理化学特性を維持しつつ、これら作用の弱い薬物を十分に高く充填して、高充填治療薬を得ることができる。したがって、本発明はまた、単離抗体またはその抗原結合断片、ＰＨＦ、および少なくとも８個の治療薬部位を含む抗体−重合体−薬物複合体に関し、ここでＤはオーリスタチン、ドラスタチン、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、オーリスタチンＦ、ＡＦ ＨＰＡ、フェニレンジアミン（ＡＦＰ）である。

【0329】

例えば、デュオカルマイシンまたはその類縁体はデュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、ＣＣ−１０６５、アドゼレシン、ビゼレシン、またはカルゼルシンである。

【0330】

Ｄの他の例としては、米国出願公開第２０１３−０１０１５４６号および米国特許第８，８１５，２２６号、および同時継続出願の２０１４年１０月１０日に提出された米国仮出願第１４／５１２，３１６号、２０１４年５月２日に提出された６１／９８８，０１１号、および２０１４年６月１１日に提出された６２／０１０，９７２号に記載のものが挙げられる。これらの開示は、それぞれ、その全内容が本明細書に組み込まれる。

【0331】

いくつかの態様では、抗体に結合させることができるＤ担持重合体足場材料の数は、遊離システイン残基の数により制限される。いくつかの態様では、本明細書で記載される方法により遊離システイン残基が抗体アミノ酸配列に導入される。本明細書で開示される複合体としては、例えば、１、２、３、または４個の遺伝子操作されたシステインアミノ酸を有する抗体が挙げられる(Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138)。いくつかの態様では、遺伝子操作を用いずに１個以上の遊離システイン残基が既に抗体内に存在する。この場合、この存在する遊離システイン残基を用いて前記抗体をＤ担持重合体足場材料に結合させてもよい。いくつかの態様では、１個以上の遊離システイン残基を生成するために、抗体を結合する前にその抗体を還元条件に暴露する。

【0332】

特定の態様では、本明細書で記載される複合体で、式（Ｉｃ）で表されるＤ担持重合体足場材料は、式（Ｉｅ）で表される。

【化48】

式中、
ＰＨＦの分子量は約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲であり、
Ｄの各出現は、独立して、分子量が５ｋＤａ以下の治療薬であり、Ｄとカルボニル基の間の

【化49】

はＤのカルボニル基への直接または間接的連結を示し、
ＸはＣＨ₂、Ｏ、またはＮＨであり、
Ｘ_aおよびＸ_bの一方はＨであり、他方は水溶性マレイミド遮断部位である、あるいはＸ_aおよびＸ_bは結合した炭素と共に炭素−炭素二重結合を形成し、ｍ₁は１から約１４０の整数であり、
ｍ₇は１〜約４０の整数であり、ｍ₁とｍ₇の合計は約２〜約１８０であり、
ｍは１から約３００の整数であり、
ｍ_3aは０〜約１７の整数であり、
ｍ_3bは１〜約８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜１８であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₇、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約１５〜約３００の範囲である。

【0333】

特定の態様では、本明細書で記載される複合体で、式（Ｉｅ）で表されるＤ担持重合体足場材料は式（Ｉｄ）で表される。

【化50】

式中、
Ｘ_aおよびＸ_bの一方はＨであり、他方は水溶性マレイミド遮断部位である、あるいはＸ_aおよびＸ_bは、結合した炭素と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
ｍ_3aは０〜約１７の整数であり、
ｍ_3bは１〜約８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜１８であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約１５〜約３００の範囲である。

【0334】

例えば、ｍ₂とｍ_3bの比は１：１より大きく、１０：１以下である。

【0335】

例えば、ｍ₂とｍ_3bの比は約９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、または２：１である。

【0336】

例えば、ｍ₂とｍ_3bの比は、２：１から８：１である。

【0337】

例えば、ｍ₂とｍ_3bの比は、約８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、または２：１である。

【0338】

例えば、ｍ₂とｍ_3bの比は、２：１から４：１である。

【0339】

例えば、ｍ₂とｍ_3bの比は、約４：１、３：１、または２：１である。

【0340】

例えば、ｍ₂とｍ_3bの比は、約３：１から５：１である。

【0341】

例えば、ｍ₂とｍ_3bの比は約３：１、４：１、または５：１である。

【0342】

例えば、式（Ｉｄ）のＰＨＦの分子量が約２ｋＤａ〜約２０ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約１５〜約１５０の範囲であり、ｍ₁は１〜約７０の整数であり、ｍ₂は１〜約２０の整数であり、ｍ_3aは０〜約９の整数であり、ｍ_3bは１〜約８の整数であり、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比率は２〜約８である。

【0343】

例えば、式（Ｉｄ）のＰＨＦの分子量が約３ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約２０〜約１１０の範囲であり、ｍ₁は２〜約５０の整数であり、ｍ₂は２〜約１５の整数であり、ｍ_3aは０〜約７の整数であり、ｍ_3bは１〜約８の整数であり、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比率は２〜約８の整数（例えば、２〜約６の整数または２〜約４の整数）である。

【0344】

例えば、式（Ｉｄ）のＰＨＦの分子量が約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約４０〜約７５の範囲であり、ｍ₁は約２〜約３５の整数であり、ｍ₂は約２〜約１０の整数であり、ｍ_3aは０〜約４の整数であり、ｍ_3bは１〜約５の整数であり、前記ＰＨＦと前記単離ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片の比率は２〜約８の整数（例えば、２〜約６の整数または２〜約４の整数）である。

【0345】

例えば、前記水溶性マレイミド遮断部位は、マレイミド基が式（ＩＩ）のチオール含有化合物と反応する際にオレフィンの炭素の２個のうちの１個と共有結合することができる部位である。
Ｒ₉₀−（ＣＨ₂）_d−ＳＨ
（ＩＩ）
式中、
Ｒ₉₀はＮＨＲ₉₁、ＯＨ、ＣＯＯＲ₉₃、ＣＨ（ＮＨＲ₉₁）ＣＯＯＲ₉₃、または置換されたフェニル基であり、
Ｒ₉₃は水素またはＣ_1-4アルキルであり、
Ｒ₉₁は水素、ＣＨ₃ ｏｒ ＣＨ₃ＣＯであり、かつ
ｄは１〜３の整数である。

【0346】

例えば、式（ＩＩ）の水溶性マレイミド遮断化合物は、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、システインメチエステル、Ｎ−メチルシステイン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパン酸、２−メルカプト酢酸、メルカプトメタノール（すなわち、ＨＯＣＨ₂ＳＨ）、フェニル基が１個以上の親水性置換基で置換されたベンジルチオール、または３−アミノプロパン−１−チオールであってもよい。フェニル基の１個以上の親水性置換基としては、ＯＨ、ＳＨ、メトキシ、エトキシ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＣ_1-4アルキル、ＮＨ₂、Ｆ、シアノ、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ等が挙げられる。

【0347】

例えば、前記水溶性マレイミド遮断基は−Ｓ−（ＣＨ₂）_d−Ｒ₉₀であり、ここでＲ₉₀はＯＨ、ＣＯＯＨ、またはＣＨ（ＮＨＲ₉₁）ＣＯＯＲ₉₃であり、
Ｒ₉₃は水素またはＣＨ₃であり、
Ｒ₉₁は水素またはＣＨ₃ＣＯであり、かつ
ｄは１または２である。

【0348】

例えば、前記水溶性マレイミド遮断基は−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯＯＨである。

【0349】

例えば、ＰＨＦの分子量が２ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲（例えば、約２〜２０ｋＤａ、約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）である場合、ＰＨＦあたりの薬物の数（例えば、ｍ₂）は１〜約４０の整数（例えば、約１〜２０、約２〜１５、約３〜１０、または約２〜１０）である。この足場材料は、例えば、分子量が４０ｋＤａ以上（例えば、６０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１６０ｋＤａ以上、１８０ｋＤａ以上、または２００ｋＤａ以上、約４０〜２００ｋＤａ、４０〜１８０ｋＤａ、４０〜１４０ｋＤａ、６０〜２００ｋＤａ、６０〜１８０ｋＤａ、６０〜１４０ｋＤａ、８０〜２００ｋＤａ、８０〜１８０ｋＤａ、８０〜１４０ｋＤａ、１００〜２００ｋＤａ、１００〜１８０ｋＤａ、１００〜１４０ｋＤａ、または１４０〜１５０ｋＤａ）の単離抗体またはその抗原結合断片の結合に用いることができる。この態様では、前記単離抗体またはその抗原結合断片のＰＨＦに対する比は、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：９、約１：１〜約１：８、約１：１〜約１：７、約１：１〜約１：６、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：４、約１：１〜約１：３、約１：１〜約１：２、約１：２〜約１：８、約１：２〜約１：６、約１：２〜約１：５、約１：２〜約１：４、約１：２〜約１：３、約１：３〜約１：４、または約１：３〜約１：５である。

【0350】

例えば、ＰＨＦの分子量が２ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲（例えば、約２〜２０ｋＤａ、約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）である場合、ＰＨＦあたりの薬物の数（例えば、ｍ₂）は１〜約４０の整数（例えば、約１〜２０、約２〜１５、約３〜１０、または約２〜１０）である。この足場材料は、例えば、分子量が１４０ｋＤａ〜１８０ｋＤａまたは１４０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの単離抗体またはその抗原結合断片の結合に用いることができる。この態様では、前記単離抗体またはその抗原結合断片のＰＨＦに対する比は、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：９、約１：１〜約１：８、約１：１〜約１：７、約１：１〜約１：６、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：４、約１：１〜約１：３、約１：１〜約１：２、約１：２〜約１：８、約１：２〜約１：６、約１：２〜約１：５、約１：２〜約１：４、約１：２〜約１：３、約１：３〜約１：４、または約１：３〜約１：５である。

【0351】

この範囲の分子量の単離抗体またはその抗原結合断片としては、完全な長さの抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0352】

例えば、ＰＨＦの分子量が２ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲（例えば、約２〜２０ｋＤａ、または約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）である場合、ＰＨＦあたりの薬物の数（例えば、ｍ₂）は１〜約４０の整数（例えば、約１〜２０、約２〜１５、約３〜１０、または２〜１０）である。この足場材料は、例えば、分子量が６０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの単離抗体またはその抗原結合断片の結合に用いることができる。この態様では、前記単離抗体またはその抗原結合断片のＰＨＦに対する比は、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：９、約１：１〜約１：８、約１：１〜約１：７、約１：１〜約１：６、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：４、約１：１〜約１：３、約１：１〜約１：２、約１：２〜約１：８、約１：２〜約１：６、約１：２〜約１：５、約１：２〜約１：４、約１：２〜約１：３、約１：３〜約１：４、または約１：３〜約１：５である。

【0353】

この範囲の分子量の単離抗体またはその抗原結合断片としては、抗体断片（例えば、Ｆａｂ２、ｓｃＦｃＦｖ、およびラクダ科の動物由来の抗体）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0354】

例えば、ＰＨＦの分子量が２ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲（例えば、約２〜２０ｋＤａ、約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）である場合、ＰＨＦあたりの薬物の数（例えば、ｍ₂）は１〜約４０の整数（例えば、約１〜２０、約２〜１５、約３〜１０、または２〜１０）である。この足場材料は、例えば、分子量が４０ｋＤａ〜８０ｋＤａの単離抗体またはその抗原結合断片の結合に用いることができる。この態様では、前記単離抗体またはその抗原結合断片のＰＨＦに対する比は、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：９、約１：１〜約１：８、約１：１〜約１：７、約１：１〜約１：６、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：４、約１：１〜約１：３、約１：１〜約１：２、約１：２〜約１：８、約１：２〜約１：６、約１：２〜約１：５、約１：２〜約１：４、約１：２〜約１：３、約１：３〜約１：４、または約１：３〜約１：５である。

【0355】

この範囲の分子量、すなわち、約４０ｋＤａ〜約８０ｋＤａの単離抗体またはその抗原結合断片としては、抗体断片（例えば、Ｆａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0356】

特定の態様では、本明細書で記載される複合体で、式（Ｉｅ）で表されるＤ担持重合体足場材料は、式（Ｉｆ）で表され、ここで、重合体は、分子量が約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲のＰＨＦである。

【化51】

式中、
ｍは１から約３００の整数であり、
ｍ₁は１から約１４０の整数であり、
ｍ₂は１から約４０の整数であり、
ｍ_3aは０〜約１７の整数であり、
ｍ_3bは１〜約８の整数であり、
ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約１８の範囲であり、
ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約１５〜約３００の範囲であり、
末端

【化52】

は、１種以上の重合体足場材料の、ヒトＨＥＲ２受容体のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片との連結を示し、アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＳＭＮ（配列番号２５）を含む重鎖可変領域相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、アミノ酸配列ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）を含む重鎖可変領域相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、アミノ酸配列ＧＧＨＧＹＦＤＬ（配列番号２７）を含む重鎖可変領域相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号２８）を含む軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、アミノ酸配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２１）を含む軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、およびアミノ酸配列ＱＱＹＨＨＳＰＬＴ（配列番号２９）を含む軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含み、かつ
前記ＰＨＦと前記抗体の比率は１０以下である。

【0357】

式（Ｉｆ）の足場材料は、以下の特徴事項を１つ以上含む。

【0358】

式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量が約２ｋＤａ〜約２０ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約１５〜約１５０の範囲であり、ｍ₁は１〜約７０の整数であり、ｍ₂は１〜約２０の整数であり、ｍ_3aは０〜約９の整数であり、ｍ_3bは１〜約８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約１０の範囲であり、前記ＰＨＦと前記抗体の比率は２〜約８の整数である。

【0359】

式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量が約３ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約２０〜約１１０の範囲であり、ｍ₁は２〜約５０の整数であり、ｍ₂は２〜約１５の整数であり、ｍ_3aは０〜約７の整数であり、ｍ_3bは１〜約８の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約８の範囲であり、前記ＰＨＦと前記抗体の比率は２〜約８の整数（例えば、約２〜約６または約２〜約４）である。

【0360】

式（Ｉｆ）のＰＨＦの分子量が約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である場合、ｍ、ｍ₁、ｍ₂、ｍ_3a、およびｍ_3bの合計は約４０〜約７５の範囲であり、ｍ₁は約２〜約３５の整数であり、ｍ₂は約２〜約１０の整数であり、ｍ_3aは０〜約４の整数であり、ｍ_3bは１〜約５の整数であり、ｍ_3aおよびｍ_3bの合計は１〜約５の範囲であり、前記ＰＨＦと前記抗体の比率は２〜約８の整数（例えば、約２〜約６または約２〜約４）である。

【0361】

特定の態様では、オーリスタチンＦヒドロキシルプロピルアミド（「ＡＦ ＨＰＡ」）と抗体の比は、約３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、または６：１であってもよい。

【0362】

特定の態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、または６：１であってもよい。

【0363】

他の態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、または６：１であってもよい。

【0364】

いくつかの態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、または１０：１であってもよい。

【0365】

いくつかの態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、または１１：１であってもよい。

【0366】

いくつかの態様では、ＡＦ ＨＰＡと前記抗体の比は、約１５：１、１４：１、１３：１、または１２：１であってもよい。

【0367】

特定の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１であってもよい。

【0368】

特定の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、または２：１であってもよい。

【0369】

他の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１であってもよい。

【0370】

他の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約６：１、５：１、４：１、３：１、または２：１であってもよい。

【0371】

他の態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約６：１、５：１、４：１、または３：１であってもよい。

【0372】

いくつかの態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約５：１、４：１、または３：１であってもよい。

【0373】

いくつかの態様では、ＰＨＦと前記抗体の比は、約４：１、３：１、または２：１であってもよい。

【0374】

この範囲の分子量の単離抗体またはその抗原結合断片としては、抗体断片（例えば、Ｆａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0375】

抗体−重合体薬物複合体の他の態様は、例えば、米国特許第８，８１５，２２６号、および２０１４年１０月１０日に提出された米国仮出願第１４／５１２，３１６号、および２０１４年５月２日に提出された６１／９８８，０１１号に記載されている。これらの開示は、それぞれ、その全内容が本明細書に組み込まれる。

【0376】

本発明はまた、重合体担体を有しない抗体またはその抗原結合断片に直接結合することができるように修飾された薬物誘導体、およびその薬物−抗体複合体に関する。

【0377】

いくつかの態様では、前記抗体−薬物複合体は、薬物部位に結合、すなわち共有結合した抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、前記抗体またはその抗原結合断片は、リンカー、例えば、非重合体リンカーを介して薬物部位に共有結合している。

【0378】

抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）の薬物部位（Ｄ）は、本明細書で定義した細胞毒性または細胞分裂阻害効果を有する任意の化合物、部位、または基を含んでいてもよい。特定の態様では、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、腫瘍細胞を標的する抗体（Ａｂ）、薬物部位薬物部位（Ｄ）、およびＡｂをＤに結合するリンカー部位（Ｌ）を含む。いくつかの態様では、前記抗体は、１個以上のアミノ酸残基（例えば、リシンおよび／またはシステイン）を介してリンカー部位（Ｌ）に結合する。

【0379】

特定の態様では、ＡＤＣは式（Ｉｇ）で表される。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_p
（Ｉｇ）
式中、ｐは１〜約２０である。

【0380】

いくつかの態様では、抗体に結合することができる薬物部位の数は、遊離システイン残基の数により制限される。いくつかの態様では、遊離システイン残基は、本明細書で記載される方法により抗体アミノ酸配列に導入される。式（Ｉｇ）のＡＤＣとしては、例えば、１、２、３、または４個の遺伝子操作されたシステインアミノ酸を有する抗体(Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、遺伝子操作を用いずに１個以上の遊離システイン残基が既に抗体に存在している。この場合、存在する遊離システイン残基を用いて前記抗体を薬物に結合させてもよい。いくつかの態様では、１個以上の遊離システイン残基を生成するために、抗体を結合させる前にその抗体を還元条件に暴露する。

【0381】

いくつかの態様では、前記「リンカー」（Ｌ）は、１個以上の薬物部位（Ｄ）を抗体（Ａｂ）に結合して式（Ｉｇ）の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するのに用いることができる二官能または多官能部位である。いくつかの態様では、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、前記薬物および前記抗体に共有結合するための反応性官能基を有するリンカーを用いて作製してもよい。例えば、ある態様では、抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカーまたは薬物−リンカー中間体の反応性官能基と結合を形成してＡＤＣを作製することができる。

【0382】

一側面では、リンカーは、抗体に存在する遊離システインと反応して共有結合を形成することができる官能基を有する。このような反応性官能基としては、例えば、マレイミド、ハロアセトアミド、α−ハロアセチル、活性化エステル（例えば、コハク酸イミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステルなど）、無水物、酸塩化物、スルホニル塩化物、イソシアン酸塩、およびイソチオシアン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773の７６６ページの接合方法、および本明細書の実施例を参照のこと。

【0383】

いくつかの態様では、リンカーは、抗体に存在する求電子性基と反応することができる官能基を有する。そのような求電子性基としては、例えば、アルデヒド基およびケトンカルボニル基が挙げられる。いくつかの態様では、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子は、抗体の求電子性基と反応して、抗体単位と共有結合を形成することができる。このような反応性官能基としては、例えば、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシラート、およびアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0384】

リンカーは１種以上のリンカー成分を含んでいてもよい。リンカー成分としては、例えば６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」または「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル（「ＳＰＰ」）、およびカルボン酸４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１（「ＭＣＣ」）が挙げられる。様々なリンカー成分が当該分野で周知であり、そのうちのいくつかについては以下で記述する。

【0385】

リンカーは、薬物の放出を促進する「開裂可能なリンカー」であってもよい。そのような開裂可能なリンカーとしては、例えば、（例えば、ヒドラゾンを含む）酸に不安定なリンカー、タンパク質分解酵素に高感度の（例えば、ペプチダーゼに高感度の）リンカー、光解離性リンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); 米国特許第５，２０８，０２０号）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0386】

特定の態様では、リンカーは以下の式（ＩＩｇ）で表される。
−Ａ_a−Ｗ_w−Ｙ_y
（ＩＩｇ）
式中、
Ａは「伸長単位」であり、ａは０〜１の整数であり、
Ｗは「アミノ酸単位」であり、ｗは０〜１２の整数であり、
Ｙは「スペーサー単位」であり、ｙは０、１、または２の整数である。式（ＩＩｇ）のリンカーを含むＡＤＣは、式Ｉ（Ａ）：Ａｂ−（Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ−Ｄ）ｐで表され、式中Ａｂ、Ｄ、およびｐは、上述の式（Ｉｇ）で定義されたとおりである。そのようなリンカーの例示的態様は、米国特許第７，４９８，２９８号（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0387】

いくつかの態様では、リンカー成分は、抗体を他のリンカー成分または薬物部位に結合させる「伸長単位」（Ａ）を含む。伸長単位の非限定的例を以下に示す（式中、波線は抗体、薬物、または追加のリンカー成分との共有結合部位を示す）。

【化53】

【0388】

いくつかの態様では、リンカー成分は「アミノ酸単位」（Ｗ）を含む。そのようないくつかの態様では、アミノ酸単位により、リンカーをタンパク質分解酵素で開裂させることができる。これにより、細胞内タンパク質分解酵素（例えば、リソソーム酵素）に暴露すると免疫複合体から薬物が容易に放出される(Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784)。アミノ酸単位としては、例えばジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、およびペンタペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ジペプチドとしては、例えばバリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）、フェニルアラニン−リシン（ｆｋまたはｐｈｅ−ｌｙｓ）、フェニルアラニン−ホモリシン（ｐｈｅ−ｈｏｍｏｌｙｓ）、およびＮ−メチル−バリン−シトルリン（Ｍｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。トリペプチドとしては、例えばグリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）、およびグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸単位は、天然に出現するアミノ酸残基、および／または小さいアミノ酸、および／または非天然出現アミノ酸類縁体（例えば、シトルリン）を含んでいてもよい。アミノ酸単位は、特定の酵素（例えば、腫瘍に関連づけられたタンパク質分解酵素、カテプシンＢ、Ｃ、およびＤ、またはプラスミンタンパク質分解酵素）による酵素開裂に最適であるように設計することができる。

【0389】

通常、ペプチド型リンカーは、２個以上のアミノ酸および／またはペプチド断片のペプチド結合を形成して作製することができる。このようなペプチド結合は、例えば、液相合成方法（例えば、E. Schrider and K. Lubke (1965) “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, Academic Press）によって形成することができる。

【0390】

いくつかの態様では、リンカー成分は、直接または伸長単位および／またはアミノ酸単位を介して前記抗体を薬物部位に結合する「スペーサー」単位を含む。スペーサー単位は「自己犠牲型」または「非自己犠牲型」であってもよい。「非自己犠牲型」スペーサー単位は、ＡＤＣの開裂時にスペーサー単位の一部または全部が薬物部位に結合したまま残る。非自己犠牲型スペーサー単位としては、例えば、グリシンスペーサー単位およびグリシン−グリシンスペーサー単位が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、グリシン−グリシンスペーサー単位を含むＡＤＣが腫瘍細胞に関連づけられたタンパク質分解酵素によって酵素開裂されると、ＡＤＣの残部からグリシン−グリシン−薬物部位が放出される。いくつかのそのような態様では、グリシン−グリシン−薬物部位は、腫瘍細胞内で加水分解され、それにより前記薬物部位からグリシン−グリシンスペーサー単位が開裂する。

【0391】

「自己犠牲型」スペーサー単位は、薬物部位の放出を可能にする。特定の態様では、リンカーのスペーサー単位はｐ−アミノベンジル単位を含む。いくつかのそのような態様では、ｐ−アミノベンジルアルコールはアミド結合を介してアミノ酸単位に結合され、ベンジルアルコールと前記薬物の間でカルバミン酸塩、メチルカルバミン酸塩、またはカルボン酸塩が形成される(Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103)。いくつかの態様では、前記スペーサー単位はｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）を含む。いくつかの態様では、自己犠牲型リンカーを含むＡＤＣは以下の構造を有する。

【化54】

式中、
Ｑは−Ｃ₁−Ｃ₈アルキル、−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₈アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり、
ｎ₆は０〜４の整数であり、
Ｘ_aは、１つ以上の追加のスペーサー単位であってもよく、あるいはなくてもよく、かつ
ｐは１〜約２０の整数である。

【0392】

いくつかの態様では、ｐは１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜４の整数である。非限定的例として、Ｘ_aスペーサー単位は以下のものを含む。

【化55】

式中、Ｒ₁₀₁およびＲ₁₀₂は、独立して、ＨおよびＣ₁−Ｃ₆アルキルから選択される。いくつかの態様では、Ｒ₁₀₁およびＲ₁₀₂はそれぞれ−ＣＨ₃である。

【0393】

他の自己犠牲型スペーサーの例としては、ＰＡＢに電子的に類似した芳香族化合物（例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（米国特許第７，３７５，０７８号、Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237）、およびオルトまたはパラアミノベンジルアセタールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、置換および無置換の４−アミノ酪酸アミド(Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223)、適切に置換されたビシクロ[２．２．１］環系およびビシクロ［２．２．２］環系(Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815)、および２−アミノフェニルプロピオン酸アミド(Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867)などのアミド結合の加水分解時に環化するスペーサーを用いてもよい。ＡＤＣに有用な可能性がある自己犠牲型スペーサーのその他の例としては、グリシン残基のα−炭素に薬物が結合したものが挙げられる(Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447)。

【0394】

いくつかの態様では、リンカーＬは分岐多官能リンカー部位を介して２個以上の薬物部位を抗体に共有結合するための樹状リンカーであってもよい(Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹状リンカーは、薬物の抗体に対するモル比、すなわち充填量（ＡＤＣの有効性に関連する）を高めることができる。したがって、抗体が反応性システインチオール基を１個のみ有する場合は、樹状リンカーを介して多数の薬物部位を結合させてもよい。

【0395】

式（Ｉｇ）で表されるＡＤＣのリンカーの非限定的例を以下に示す。

【化56】

式中、Ｒ₁₀₁およびＲ₁₀₂は、独立して、ＨおよびＣ₁−Ｃ₆アルキルから選択され、
ｎ₅は０〜１２の整数である。

【0396】

いくつかの態様では、ｎは２〜１０の整数である。いくつかの態様では、ｎは４〜８の整数である。

【0397】

いくつかの態様では、Ｒ₁₀₁およびＲ₁₀₂は、それぞれ−ＣＨ₃である。

【0398】

さらに、非限定的例としてのＡＤＣは、以下の構造を含む。

【化57】

式中、Ｘａは

【化58】

であり、
Ｙは

【化59】

であり、
各Ｒ₁₀₃は、独立して、ＨまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルであり、ｎ７は１〜１２の整数である。

【0399】

いくつかの態様では、リンカーは、溶解度および／または反応性を調節する基で置換されている。非限定的例として、電荷を帯びた置換基（例えば、スルホン酸塩（−ＳＯ₃^-））またはアンモニウムは、リンカー試薬の水に対する溶解度を高めて、リンカー試薬と抗体および／または薬物部位との結合反応を容易にする可能性がある。あるいは、ＡＤＣの作製に用いられる合成経路に応じて、Ａｂ−Ｌ（抗体−リンカー中間体）とＤまたはＤ−Ｌ（薬物−リンカー中間体）とＡｂの結合反応を容易にする可能性がある。いくつかの態様では、前記リンカーの一部は、前記抗体に結合し、前記リンカーの別の一部は薬物に結合し、次いで前記Ａｂ−（リンカー部分）^aは薬物−（リンカー部分）^bに結合して、式（Ｉｇ）のＡＤＣを形成する。

【0400】

本明細書で開示される化合物は、以下のリンカー試薬を用いて作製されるＡＤＣを明らかに企図するものであるが、これらに限定されない。前記リンカー試薬は、ビスマレイミド−トリオキシエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＢＭＰＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミドエステル（ＥＭＣＳ）、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］コハク酸イミドエステル（ＧＭＢＳ）、１，６−ヘキサン−ビス（ビニルスルホン）（ＨＢＶＳ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸）スクシンイミジル（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＭＢＳ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＢＡＰ）、ヨード酢酸スクシンイミジル（ＳＩＡ）、（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸スクシンイミジル（ＳＩＡＢ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＰ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミジル（ＳＭＰＢ）、６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサン酸］スクシンイミジル（ＳＭＰＨ）、イミノチオラン（ＩＴ）、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、および（４−ビニルスルホン）安息香酸スクシンイミジル（ＳＶＳＢ）である。また、以下のビスマレイミド試薬を含む：ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４−ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、ＢＭ（ＰＥＧ）₂（以下に示す）、およびＢＭ（ＰＥＧ）₃（以下に示す）；イミドエステルの二官能誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、二イソシアン酸（例えば、２，６−イソシアン酸トルエン）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）。いくつかの態様では、ビスマレイミド試薬により、抗体中のシステインのチオール基をチオール含有薬物部位、リンカー、またはリンカー−薬物中間体に結合することができる。チオール基との反応性を有する他の官能基としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアン酸塩、およびイソチオシアン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。

【化60】

【0401】

特定の有用なリンカー試薬は、様々な商業的供給源（例えば、Pierce Biotechnology, Inc.（イリノイ州ロックフォード）、Molecular Biosciences Inc.（コロラド州ボルダー）から得てもよい。あるいは、Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M. A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; 米国特許公開第６，２１４，３４５号、ＷＯ０２／０８８１７２、ＵＳ２００３１３０１８９、ＵＳ２００３０９６７４３、ＷＯ０３／０２６５７７、ＷＯ０３／０４３５８３、およびＷＯ０４／０３２８２８など、当該分野で記載の方法により製造してもよい。

【0402】

放射性ヌクレオチドを抗体に接合するためのキレート剤としては、炭素１４で標識したトリアミン五酢酸１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が挙げられる。例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
ＨＥＲ２抗体複合体の作製方法

【0403】

特定の態様では、前記複合体はいくつかの工程で形成される。これらの工程は、（１）薬物またはその誘導体の官能基と反応することができる官能基を含むように重合体を修飾すること、（２）前記薬物が前記重合体に結合するように修飾済み重合体を前記薬物またはその誘導体と反応させること、（３）前記重合体が単離抗体、その抗原結合断片、またはその誘導体の官能基と反応することができる官能基を含むように前記重合体−薬物複合体を修飾すること、および（４）前記修飾済み重合体−薬物複合体を前記抗体またはその抗原結合断片と反応させて本明細書で開示される複合体を形成することを含む。工程（１）で生成された修飾済み重合体が抗体またはその抗原結合断片の官能基と反応することができる官能基を含む場合は工程（３）を省いてもよい。

【0404】

他の態様では、前記複合体はいくつかの工程で形成される。これらの工程は、（１）重合体が第一の薬物またはその誘導体の官能基と反応することができる官能基を含むように前記重合体を修飾すること、（２）前記第一の薬物が前記重合体に結合するように修飾済み重合体を前記第一の薬物またはその誘導体と反応させること、（３）第二の薬物またはその誘導体の官能基と反応することができる別の官能基を含むように前記重合体−薬物複合体を修飾すること、（４）前記第二の薬物が前記重合体−薬物複合体に結合するように前記修飾済み重合体−薬物複合体と前記第二の薬物またはその誘導体を反応させること、（５）前記重合体が前記抗体またはその抗原結合断片の官能基と反応することができる官能基を含むように、２種類の異なる薬物を含む重合体−薬物複合体を修飾すること、および（６）工程（５）の修飾済み重合体−薬物複合体を単離抗体、その抗原結合断片、またはその誘導体と反応させて本明細書で開示される複合体を形成することを含む。２種類の異なる単離抗体、その抗原結合断片、またはその誘導体を接合して２種類の異なる薬物および２種類の異なる抗体またはその抗原結合断片を含む重合体−薬物複合体を形成する場合は、工程（５）および（６）を繰り返してもよい。

【0405】

他の態様では、前記複合体はいくつかの工程で形成される。これらの工程は、（１）薬物またはその誘導体の官能基と反応することができる官能基を含むように重合体を修飾すること、（２）抗体またはその抗原結合断片の官能基と反応することができる官能基を含むように前記重合体をさらに修飾すること、（３）前記薬物が前記重合体に結合するように前記修飾済み重合体を前記薬物またはその誘導体と反応させること、および（４）前記修飾済み重合体−薬物複合体を前記抗体またはその抗原結合断片と反応させて本明細書で開示される複合体を形成することを含む。工程（１）および（２）の順序または工程（３）および（４）の順序は入れ替えてもよい。さらに、修飾済み重合体が前記薬物またはその誘導体の官能基および前記抗体またはその抗原結合断片の官能基の両方と反応することができる官能基を含む場合は、工程（１）または工程（２）のいずれかを省いてもよい。

【0406】

他の態様では、前記複合体はいくつかの工程で形成される。これらの工程は、（１）第一の薬物またはその誘導体の官能基と反応することができる官能基を含むように重合体を修飾すること、（２）抗体またはその抗原結合断片の官能基と反応することができる官能基を含むように重合体をさらに修飾すること、（３）前記第一の薬物が前記重合体に結合するように前記修飾済み重合体を前記第一の薬物またはその誘導体と反応させること、（４）第二の薬物またはその誘導体の官能基と反応することができる別の官能基を含むように重合体−薬物複合体を修飾すること、（５）前記第二の薬物が前記重合体−薬物複合体に結合するように前記修飾済み重合体−薬物複合体を前記第二の薬物またはその誘導体と反応させること、および（６）２種類の異なる薬物を含む修飾済み重合体−薬物複合体を前記単離抗体、その抗原結合断片、または誘導体と反応させて本明細書で開示される複合体を形成することを含む。２種類の異なる単離抗体、その抗原結合断片、またはその誘導体を接合して、２種類の異なる薬物および２種類の異なる抗体またはその抗原結合断片を含む重合体−薬物複合体を形成する場合は、工程（６）を繰り返してもよい。前記修飾済み重合体が２種類の異なる薬物またはその誘導体の２個の異なる官能基を含むように、工程（４）を工程（１）の後に行ってもよい。この態様では、２種類の異なる薬物またはその誘導体と反応することができる２個の異なる官能基を含む修飾済み重合体を２種類の異なる薬物（工程（３）および工程（５））または抗体またはその抗原結合断片（工程（６））のいずれかと反応させる前に、前記抗体またはその抗原結合断片の官能基と反応することができる官能基を含むように前記修飾済み重合体をさらに修飾してもよい。

【0407】

特定の例示的態様では、本明細書で開示される複合体は、生物医学用途（例えば、薬物送達および組織工学）で用いられ、前記重合体担体は生体適合性および生分解性を有する。特定の態様では、前記担体は溶解性重合体、ナノ粒子、ゲル、リポソーム、ミセル、縫合、移植片、などである。特定の態様では、用語「溶解性重合体」は、生分解性生体適合性重合体、例えば、ポリアール（例えば、親水性ポリアセタールまたはポリケタール）を包含する。特定の他の態様では、前記担体は、全合成重合体、半合成重合体、または天然に出現する重合体である。特定の他の態様では、前記担体は親水性である。本明細書で開示される複合体を作製するのに好適な重合体担体の例は、米国特許第８，８１５，２２６号に記載されており、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【0408】

一態様では、前記重合体担体は式（ＩＶ）の単位を含む。

【化61】

式中、Ｘ’は重合体主鎖の水酸基の置換基を示す。式（ＩＶ）および本明細書で記載される他の式で示されるように、各ポリアセタール単位は、グリセリン部位に結合した１個の水酸基およびグリコールアルデヒド部位に結合したＸ’基を有する。これは簡便さのためのみであり、式（ＩＶ）および本明細書で記載される他の式の単位を有する重合体は、グリコールアルデヒド部位に結合したＸ’基（またはマレイミド末端を含むリンカーなど、他の置換基）を有する単位、グリセリン部位に結合した単一のＸ’基（またはマレイミド末端を含むリンカーなど、他の置換基）を有する単位、および一方がグリコールアルデヒド部位に結合し、他方がグリセリン部位に結合した２個のＸ’基（またはマレイミド末端を含むリンカーなど、他の置換基）を有する単位の無作為な分布を含む可能性があると解釈すべきである。

【0409】

一態様では、本発明を実行するのに好適な生分解性生体適合性ポリアールの分子量は、約０．５〜約３００ｋＤａである。例えば、生分解性生体適合性ポリアールの分子量は、約１〜約３００ｋＤａ（例えば、約１〜約２００ｋＤａ、約２〜約３００ｋＤａ、約２〜約２００ｋＤａ、約５〜約１００ｋＤａ、約１０〜約７０ｋＤａ、約２０〜約５０ｋＤａ、約２０〜約３００ｋＤａ、約４０〜約１５０ｋＤａ、約５０〜約１００ｋＤａ、約２〜約４０ｋＤａ、約６〜約２０ｋＤａ、または約８〜約１５ｋＤａ）である。例えば、本明細書で開示される重合体足場材料または複合体に用いられる生分解性生体適合性ポリアールは、分子量が約２〜約４０ｋＤａ（例えば、約２〜２０ｋＤａ、３〜１５ｋＤａ、または５〜１０ｋＤａ）のＰＨＦである。

【0410】

修飾剤に接合するのに好適な重合体担体（例えば、生体適合性生分解性重合体担体）を調製する方法は当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，８１１，５１０号、５，８６３，９９０号、５，９５８，３９８号、７，８３８，６１９号、７，７９０，１５０号、および８，６８５，３８３号に合成の指針が見いだせる。これらの方法を用いて本発明の実行に用いる重合体担体を作製する方法は当業者には自明である。

【0411】

一態様では、本発明の生分解性生体適合性ポリアール複合体を形成する方法は、好適な多糖を効率的な量のグリコールに特異的な酸化剤と結合させてアルデヒド中間体を形成する過程を含む。アルデヒド中間体はポリアールそのものであるが、これを対応するポリオールに還元して、コハク酸化し、１種以上の好適な修飾剤を結合させて、スクシンアミド含有結合を含む生分解性生体適合性ポリアール複合体を形成してもよい。

【0412】

他の好ましい態様では、本発明で用いられる全合成生分解性生体適合性ポリアールは、好適な開始剤を好適な前駆体化合物と反応させて調製することができる。

【0413】

例えば、完全合成ポリアールは、保護された置換ジオールでビニルエーテルを縮合して調製してもよい。開環重合など、他の方法を用いてもよい。その場合は、その方法の有効性は置換度および保護基の嵩高さに依存することがある。

【化62】

【0414】

当業者には自明であるが、溶媒系、触媒、および他の因子を最適にして高分子量生成物を得てもよい。

【0415】

特定の態様では、前記担体はＰＨＦである。

【0416】

複数の態様では、前記重合体担体は、多分散指数（ＰＤＩ）が１．５以下（例えば、＜１．４、＜１．３、＜１．２、または＜１．１）のＰＨＦである。

【0417】

例えば、分子量が４０ｋＤａ〜２００ｋＤａの単離抗体またはその抗原結合断片を接合するために、足場材料の重合体担体は、ポリアセタール、例えば、分子量（すなわち、非修飾ＰＨＦのＭＷ）が約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａ（例えば、約２〜２０ｋＤａ、または約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）の範囲のＰＨＦである。

【0418】

例えば、分子量が４０ｋＤａ〜８０ｋＤａの抗体またはその抗原結合断片を接合するために、本明細書で開示される足場材料の重合体担体はポリアセタール、例えば、分子量（すなわち、非修飾ＰＨＦのＭＷ）が約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａ（例えば、約２〜２０ｋＤａ、または約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）の範囲のＰＨＦである。例えば、前記ＰＨＦの分子量は、約５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、または１５ｋＤａである。

【0419】

この範囲の分子量の抗体またはその抗原結合断片としては、例えば、抗体断片（例えば、Ｆａｂ）が挙げられるが、これに限定されない。

【0420】

例えば、分子量が６０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの抗体またはその抗原結合断片を接合するために、本明細書で開示される足場材料の重合体担体はポリアセタール、例えば、分子量（すなわち、非修飾ＰＨＦのＭＷ）が約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａ（例えば、約２〜２０ｋＤａ、または約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）の範囲のＰＨＦである。例えば、前記ＰＨＦの分子量は、約５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、または１５ｋＤａである。

【0421】

この範囲の分子量の抗体またはその抗原結合断片としては、例えば、ラクダ科の動物由来の抗体、Ｆａｂ２、ｓｃＦｖＦｃなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0422】

例えば、分子量が１４０ｋＤａ〜１８０ｋＤａまたは１４０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの抗体またはその抗原結合断片を接合するために、本明細書で開示される足場材料の重合体担体はポリアセタール、例えば、分子量（すなわち、非修飾ＰＨＦのＭＷ）が約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａ（例えば、約２〜２０ｋＤａ、または約３〜１５ｋＤａ、または約５〜１０ｋＤａ）の範囲のＰＨＦである。例えば、前記ＰＨＦの分子量は、約５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、または１５ｋＤａである。

【0423】

この範囲の分子量の抗体またはその抗原結合断片としては、例えば、完全な長さの抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0424】

本明細書で開示される生分解性生体適合性複合体は、所望の要件である生分解性および親水性を満たすように調製することができる。例えば、生理学的条件で生分解性と安定性のバランスをとってもよい。例えば、特定の閾値（一般に、分子の物理形状に応じて４０〜１００ｋＤａ超）を超える分子量を有する分子は、小分子とは異なり、腎臓から排出されず、細胞による吸収および細胞内区画（とりわけ、リソソーム）での分解によってのみ体から除去することができることが周知である。この観察は、一般的な生理条件（ｐＨ＝７．５±０．５）およびリソソームのｐＨ（ｐＨは５付近）での安定性を調節して機能的に安定した生分解性材料をどのように設計するかという可能性を例示している。例えば、アセタールおよびケタール群の加水分解は酸によって触媒されることが分かっており、したがって、一般に、ポリアールは、例えば血漿中に比べて酸性のリソソーム環境では不安定になる。例えば、３７℃のｐＨ＝５およびｐＨ＝７．５の水性溶媒中での重合体の分解データを比較し、通常の生理的環境および細胞による吸収後の「消化作用を持つ」リソソーム区画での重合体の安定性の予測バランスを決定する試験を設計してもよい。このような試験での重合体の完全性は、例えば、サイズ排除ＨＰＬＣにより測定してもよい。当業者であれば、本明細書で開示される分解した複合体の様々な断片を調べるための他の好適な方法を選択することができる。

【0425】

ｐＨ＝７．５での重合体の有効サイズが１日から７日間、検出可能な程に変化せず、少なくとも数週間は元のサイズの５０％以内をとどめることが好ましい場合が多い。一方、ｐＨ＝５では、重合体は１日から５日かけて検出可能な程度に分解されて、２週間から数ヶ月以内に低分子量断片に完全に変換されることが好ましい。分解が速いほうが好ましい場合もあるが、一般に、重合体は、細胞内で細胞による重合体断片の代謝速度または排出速度を超えない速度で分解することがより望ましい場合がある。したがって、特定の態様では、本発明の複合体は、特に細胞による吸収時に生分解性であり、生物系に関して比較的「不活性」であることが期待される。担体の分解物は、電荷を帯びておらず、環境のｐＨを大きく変化させないことが好ましい。多量のアルコール群は、細胞受容体、特に食細胞の細胞受容体による重合体の認識率を低下させる場合があることが提案されている。本発明の重合体主鎖は、一般に、（例えば数種の多糖およびポリペプチドに特徴的な）エピトープをほとんど含まず、一般に、鍵穴が望ましくなければ生体内で「鍵と鍵穴」型の相互作用に関与することができる固定した構造を含まない。したがって、本明細書で開示される可溶性架橋固体複合体は、毒性および生体付着性が低いと予測され、いくつかの生物医学用途に好適なものとなっている。

【0426】

本発明の特定の態様では、生分解性生体適合性複合体は、線状または分岐構造を形成していてもよい。例えば、本発明の生分解性生体適合性ポリアール複合体は対掌性（光学的に活性）であってもよい。必要なら本発明の生分解性生体適合性ポリアール複合体はスケールミック（scalemic＝異なった比率のエナンチオマーの混合物）であってもよい。

【0427】

特定の態様では、本明細書で開示される複合体は水溶性である。特定の態様では、本明細書で開示される複合体は水不溶性である。特定の態様では、本発明の複合体は固体の形態である。特定の態様では、本明細書で開示される複合体はコロイドである。特定の態様では、本明細書で開示される複合体は粒子の形態である。特定の態様では、本明細書で開示される複合体はゲルの形態である。

【0428】

以下のスキーム１は、本明細書で開示される重合体薬物足場材料を作製するための合成スキームを示す。一態様では、前記複合体はいくつかの工程で形成される。これらの工程は、（１）ＣＯＯＨ部位（例えば、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ）を含むように重合体ＰＨＦを修飾すること、（２）ＰＢＲＭの官能基と反応することができるマレイミド部位（例えば、ＥＧ２−ＭＩ）を含むように前記重合体をさらに修飾すること、（３）２個の異なる官能基を含む修飾済み重合体を薬物またはその誘導体（例えば、ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）の官能基と反応させて、重合体−薬物複合体を形成すること、（４）ＰＢＲＭのジスルフィド結合を還元すること、（５）還元されたＰＢＲＭを重合体−薬物複合体と反応させて生分解性タンパク質−重合体−薬物複合体を形成すること、および（６）残ったマレイミド部位を任意でマレイミド遮断化合物（例えば、システイン）と反応させることを含む。

【0429】

他の態様では、工程（２）および（３）の順序は、以下のスキーム１の右側の経路に示すように、逆にしてもよい。

【化63】

【化64】

【0430】

他の態様では、上記の工程（２）および（３）は、以下のスキーム２で示すように同時に行われる。

【化65】

【化66】

【0431】

ＨＥＲ２に対する抗体の使用
自明であるが、本発明による治療物質の投与は、配合物に組み込んで輸送、送達、耐性などを向上させるのに好適な担体、賦形剤、およびその他の薬剤を用いて行われる。多数の適切な配合物が、すべての医薬化学者に周知の処方で見いだせる：Remington's Pharmaceutical Sciences（レミントンの医薬品の科学）(15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))、特にBlaug, Seymourによる87章。これら配合物としては、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、媒体を含む（陽イオン性または陰イオン性）脂質（例えば、リポフェクチン（登録商標））、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油乳液および油中水乳液、乳化カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物などが挙げられる。配合物の薬効成分が配合物によって非活性化されず、配合物が生理的に相溶性であり、投与経路での耐性があれば、上記の混合物のいずれも本発明による処置および治療で適切なものであり得る。また、Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.（医薬賦形剤の開発：臨床前指針の必要性）" Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.（固形タンパク質薬剤の凍結乾燥と開発）" Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.（脂質、親油性薬物と、経口薬物送達―新概念）" J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations（非経口投与製剤のための賦形剤の概要）" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、および医薬化学者に周知のの配合物、賦形剤、および担体に関するさらなる情報については本明細書の引用文献を参照のこと。

【0432】

一態様では、本明細書で開示されるモノクローナル抗体、その断片、および／またはその複合体は治療薬として用いてもよい。一般に、このような薬剤を用いて、例えば、対象のＨＥＲ２の異常活性および／または異常発現に関連づけられた病気または病状の進行を診断、予知、監視、治療、軽減、予防、および／または遅延してもよい。治療計画は、ＨＥＲ２の異常活性および／または異常発現に関連づけられた病気または障害（例えば、癌）を患っている（あるいはその発症の危険性を有する）対象、例えば、ヒト患者を標準的な方法を用いて同定して実行される。抗体製剤、好ましくは標的抗原に対する高い特異性と高い親和性を有する抗体製剤は、対象に投与され、一般にその標的との結合による効果を有する。抗体を投与して、標的の信号伝達機能を無効化、阻害、または干渉してもよい。抗体を投与して、天然に結合する内因性リガンドと標的との結合を無効化、阻害、または干渉してもよい。例えば、抗体は、標的に結合して、ＨＥＲ２活性および／または発現を調節、遮断、阻害、低減、拮抗、中和、または干渉する。

【0433】

ＨＥＲ２の異常活性および／または異常発現に関する病気または障害としては、癌が挙げられるが、これに限定されない。標的の癌は、肛門癌、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭部および頸部癌、肝臓癌、精巣癌、頸部癌、肉腫、血管腫、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、中皮腫、皮膚癌、骨髄腫、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、または胃癌であってもよい。

【0434】

他の側面では、病気または障害は乳癌、胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、および卵巣癌からなる群から選ばれる癌である。

【0435】

一般に、病気または障害の緩和または治療は、その病気または障害に関連づけられた１つ以上の症状または医学的問題を低減することを含む。例えば、癌の場合、薬物の治療有効量は、以下のことの１つ、あるいは組み合わせを達成することができる。すなわち、癌細胞数の減少、腫瘍サイズの低下、周辺臓器への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減少および／または停止）、腫瘍の転移の阻害、ある程度の腫瘍の成長の阻害、および／または癌に関連づけられた症状の１つ以上のある程度の緩和である。いくつかの態様では、本明細書で開示される組成物を用いて対象の病気または障害の発症または再発を予防してもよい。

【0436】

本明細書で開示される抗体、その断片、および／またはその複合体の治療有効量は、一般に、治療目的を達成するのに必要な量に関する。上述のように、これは、抗体と標的抗原との結合相互作用であってもよく、特定の場合に標的の機能を阻害する。さらに、投与に必要な量は、抗体とその抗体に特異的な抗原の結合親和性に依存し、また、投与される抗体が他の投与対象の自由体積から使い切られる速度にも依存する。本明細書で開示される抗体、その抗体断片、および／またはその複合体の治療有効投与量の一般的な範囲は、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、または約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）であってもよいが、これらに限定されない。一般的な投与頻度は、例えば、１日２回から１ヶ月に１回の範囲（例えば、１日１回、１週間に１回、隔週１回、３週間または１ヶ月に１回）であってもよい。例えば、本明細書で開示されるＸＭＴ１５１９の複合体、例えば、ＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））複合体またはＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））複合体を（例えば、単回投与量として毎週、隔週、３週間毎、あるは毎月）約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６７ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇ）投与してもよい。例えば、本明細書で開示されるＸＭＴ１５１９の複合体、例えば、ＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））複合体またはＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））複合体を、ＨＥＲ２発現量の少ない乳癌またはＨＥＲ２発現量の少ない胃癌の治療のために（例えば、単回投与量として毎週、隔週、３週間毎、あるは毎月）約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６７ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇ）投与してもよい。

【0437】

治療の有効性は、特定のＨＥＲ２に関連した障害を診断または治療するための任意の周知の方法との関連で決定される。ＨＥＲ２関連障害の１つ以上の症状の軽減は、抗体が臨床的恩恵をもたらすことを示す。

【0438】

所望の特異性を有する抗体のスクリーニング方法としては、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および当該分野で周知の他の免疫媒介技術が挙げられるが、これらに限定されない。

【0439】

他の態様では、ＨＥＲ２に対して作られた抗体を、（例えば、適切な生理学的試料中のＨＥＲ２量の測定、タンパク質などの画像処理などでの使用など）当該分野で周知の、ＨＥＲ２の局所化および／または定量化に関する方法で用いてもよい。ある態様では、ＨＥＲ２に特異的な抗体、またはその抗体由来の抗原結合領域を含む誘導体、断片、類縁体、あるいは相同体は、薬理活性化合物（以後、「治療薬物」と言う）として用いられる。

【0440】

他の態様では、ＨＥＲ２に特異的な抗体を用いて、標準的な技術（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、クロマトグラフィー、または免疫沈殿など）によりＨＥＲ２ポリペプチドを単離してもよい。ＨＥＲ２タンパク質（またはその断片）に対して作られた抗体を診断に用いて、例えば、ある治療投薬計画の有効性を決定するための臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質量を監視することができる。抗体を検出可能な物質に結合（すなわち、物理的に結合）させることで容易に検出することができる。検出可能な物質としては、例えば、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射性活性材料などが挙げられる。好適な酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエストラーゼなどが挙げられる。好適な補欠分子族複合体としては、例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンなどが挙げられる。好適な蛍光材料としては、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリスリンなどが挙げられる。発光材料としては、例えばルミノールなどが挙げられる。生物発光材料としては、例えばルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリンなどが挙げられる。好適な放射性活性材料としては、例えば、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ、または³Ｈなどが挙げられる。

【0441】

他の態様では、本発明による抗体を、試料中のＨＥＲ２タンパク質（またはその断片）の存在を検出するための薬剤として用いてもよい。いくつかの態様では、前記抗体は検出可能な標識を含む。抗体はポリクロナール、またはより好ましくはモノクローナルである。損傷のない抗体、またはその断片（例えば、Ｆ_ab、ｓｃＦｖ、またはＦ_(ab)2）が用いられる。プローブまたは抗体に関する用語「標識化」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合（すなわち、物理的に結合）することによるプローブまたは抗体の直接標識、および直接標識された他の試薬との反応性を用いたプローブまたは抗体の間接標識を包含することを意図する。間接標識としては、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンで検出することができるようにビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識などが挙げられる。用語「生体試料」は、対象から単離された組織、細胞、および体液、ならびに対象内の組織、細胞、および体液を含むことを意図する。したがって、血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液の画分または成分が用語「生体試料」の用法の範囲内に含まれる。すなわち、本明細書で開示される検出方法を用いて、生体外および生体内の生体試料中の検体ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出することができる。例えば、検体ｍＲＮＡを検出するための生体外技術としては、ノーザンハイブリダイゼーション、およびその場ハイブリダイゼーションが挙げられる。検体タンパク質を検出するための生体外技術としては、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈殿、および免疫蛍光が挙げられる。検体ゲノムＤＮＡを検出するための生体外技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。免疫アッセイを行う手順は、例えば、“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology（ELISA:理論と実践：分子生物学における方法）”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay（免疫アッセイ）”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays（酵素免疫アッセイの実践と理論）”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985などで記載されている。さらに、検体タンパク質を検出するための生体内技術としては、標識抗検体タンパク質抗体の対象への導入が挙げられる。例えば、一般的な画像処理技術対象中の存在および位置を検出することができる放射性活性マーカーで抗体を標識してもよい。
ＨＥＲ２抗体の治療投与および製剤

【0442】

本明細書で開示される抗体、その誘導体、断片、類縁体、相同体、および／またはその複合体（以後、「活性化合物」とも言う）を投与に好適な医薬品組成物に組み込んでもよい。そのような組成物の調製に関する原理および考察、ならびに成分選択の指針は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.（レミントンの医薬品の科学：調剤学の科学と実践１９版） (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends（薬物の吸収の増加：概念、可能性、限界と傾向）, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4)（ペプチドおよびタンパク質薬物の送達（非経口投与科学の発展））, 1991, M. Dekker, New Yorkなどで提供される。

【0443】

そのような組成物は、一般に、抗体、その断片、および／またはその複合体、および薬学的に容認可能な担体を含む。抗体断片を用いる場合は、標的タンパク質の結合領域に特異的に結合する最も小さい阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計してもよい。そのようなペプチドは、化学的に合成および／または組み換えＤＮＡ技術により産生することができる（例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。

【0444】

本明細書で用いられる用語「薬学的に容認可能な担体」は、医薬品投与に相性がよい任意およびすべての溶媒、分散媒体、被覆物、抗菌剤、抗真菌剤、等張および吸収遅延剤を含むことを意図する。適切な担体は、当該分野での標準的教科書である Remington’s Pharmaceutical Science（レミントンの医薬品の科学）の最新版（参照により本明細書に組み込まれる）で記載されている。好ましいそのような担体または希釈剤としては、例えば、水、生理食塩水、リンガー液、ブドウ糖液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性媒体（例えば、固定油など）を用いてもよい。薬学的活性物質にそのような媒体および薬剤を用いることは当該分野で周知である。従来の媒体または薬剤のいずれかが活性化合物と非相溶性でない限り、上記媒体または薬剤を前記組成物に用いることが企図される。

【0445】

生体内投与に用いられる製剤は、殺菌されていなければならない。これは、殺菌濾過膜で濾過することで容易に達成される。

【0446】

本明細書で開示される医薬品組成物は、意図された投与経路と相性がよくなるように製剤される。投与経路としては、例えば、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与など）、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（すなわち、局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口投与、皮内投与、または皮下投与に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分、すなわち、殺菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、その他の合成溶媒など）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベンなど）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウムなど）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩など）、および毒性を調節するための薬剤（例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖など）を含んでいてもよい。酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨを調節してもよい。非経口投与製剤は、アンプル、使い捨ての注射器、またはガラスやプラスチック製の複数回投与用バイアル瓶に封入してもよい。

【0447】

注射可能な用途に好適な医薬品組成物は、殺菌液（水溶性の場合）、または殺菌された注射可能溶液または分散体の即時調製用の分散体および殺菌粉末を含む。静脈内投与に好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（登録商標、BASF、ニュージャージー州パーシパニー）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、前記組成物は殺菌されていなければならず、容易に注射できる程度に液状でなければならいない。前記組成物は、製造条件および貯蔵条件で安定していなければならない。また、細菌（例えば、バクテリアおよび菌類など）の汚染作用から保護されていなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。被覆物（例えば、レシチンなど）の使用、分散体の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により適切な流動性を維持することができる。細菌の作用は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）により防止することができる。組成物に等張剤（例えば、糖）、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウムを含むことが好ましい場合が多い。注射可能組成物の吸収は、前記組成物中に吸収遅延剤（例えば、一ステアリン酸アルミニウム、およびゼラチンなど）を含有させて遅らせることができる。

【0448】

殺菌された注射可能溶液は、適切な溶媒に必要量の活性化合物を上で列挙した成分の１種またはその組み合わせと共に組み込み、濾過殺菌して調製することができる。一般に、塩基性分散媒と、上で列挙した成分から必要なその他の成分を含む殺菌媒体に活性化合物を組み込んで分散体を調製する。殺菌された注射可能溶液の調製に殺菌粉末が用いられる場合、調製方法は真空乾燥および冷凍乾燥である。これにより、事前に殺菌濾過した薬効成分液から薬効成分の粉末と任意の追加の所望の成分が得られる。

【0449】

経口投与組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口投与組成物は、ゼラチンカプセルに封入する、あるいは圧縮して錠剤にしてもよい。治療のための経口投与では、前記活性化合物は賦形剤と共に組み込まれていてもよく、かつ錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で用いてもよい。また、流体担体を用いて経口投与組成物を口内洗浄液の用途として調製してもよい。ここで、流体担体中の化合物は、口から入れて、口内をすすぎ、はき出される、あるいは飲み込まれる。医薬的に相溶性がある結合剤、および／またはアジュバント材料を前記組成物の一部として含んでいてもよい。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含んでいてもよい：結着剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガム、ゼラチンなど）、賦形剤（例えば、澱粉、ラクトースなど）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、Ｓｔｅｒｏｔｅｓなど）、流動促進剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素など）、甘味剤（例えば、ショ糖、サッカリンなど）、または風味剤（例えば、ペッパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ風味剤など）。

【0450】

吸入による投与の場合、前記化合物は、好適な推進剤（例えば、二酸化炭素などの気体）を含む加圧容器または散布器、あるいは噴霧器からのエアロゾルスプレーという形態で送達される。

【0451】

全身性投与は、経粘膜投与手段または経皮投与手段であってもよい。経粘膜投与または経皮投与の場合、製剤には浸透させる障壁に適切な浸透剤が用いられる。そのような浸透剤は、一般に当該分野で周知であり、例えば、経粘膜投与の場合では、清浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは尿道坐薬を用いて行うことができる。経皮投与の場合、前記活性化合物は、一般に当該分野で周知の軟膏、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤される。

【0452】

前記化合物はまた、（例えば、従来のココアバターおよび他のグリセリドなど、尿道座薬基剤を含む）尿道坐薬、あるいは直腸送達用の停留かん腸の形態で調製してもよい。

【0453】

一態様では、前記活性化合物は、前記化合物が体から急速に排泄されるのを保護する担体、例えば、埋め込みおよびマイクロカプセル化送達システムを含む徐放／放出制御剤と共に調製される。生分解性生体適合性重合体、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを用いることができる。そのような製剤を調製する方法は当業者には自明である。

【0454】

例えば、前記薬効成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、およびポリメチルメタクリル酸のマイクロカプセル）中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳液、ナノ粒子、およびナノカプセルなど）、またはマクロ乳液中にそれぞれ取り込むことができる。

【0455】

徐放剤を調製してもよい。好適な徐放剤としては、例えば、マトリックスが成形品（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の形態である、抗体を含む固体疎水性重合体の半透過性マトリクスが挙げられる。徐放マトリックスとしては、例えば、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共重合体、非分解性酢酸エチレンビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）、乳酸−グリコール酸共重合体とおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸などの重合体は、１００日以上にわたって分子を放出することができるが、特定のヒドロゲルはそれよりも短い期間にタンパク質を放出する。

【0456】

また、前記材料をAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals社からリポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的したリポソームを含む）として商業的に入手することができ、薬学的に容認可能な担体としても用いることができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法など、当業者に周知の方法により調製することができる。

【0457】

投与を容易にし、投与量を均一にするため、経口投与組成物または非経口投与組成物を投与量単位の形態で製剤することが特に有用である。本明細書で用いられる「投与量単位の形態」は、治療される対象に対する単一投与量に合わせた物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な医薬品担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。本明細書で開示される投与量単位の形態の仕様は、活性化合物に特有の特性、達成される特定の治療効果、および個体の治療のためにそのような活性化合物を配合する技術に固有の限界により決定され、かつこれらに直接依存する。

【0458】

前記医薬品組成物は、投与の指示と共に容器、パック、または散布器に含まれていてもよい。

【0459】

また、前記製剤は、治療される特定の兆候に必要な、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補性活性を有する２種以上の活性化合物を含んでいてもよい。これに代えて、あるいはこれに加えて、前記組成物はその機能を高める薬剤（例えば、細胞毒性薬、サイトカイン、化学療法薬、または成長阻害剤など）を含んでいてもよい。そのような分子は、意図された目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。

【0460】

一態様では、前記活性化合物は、併用療法で、すなわち、他の薬剤、例えば、病態または障害（例えば、癌、自己免疫疾患、および炎症性疾患などの様々形態）を治療するのに有用な治療薬と組み合わせて投与される。この文脈の用語「組み合わせ」は、前記薬剤が実質的に同時、あるいは同時または順次のいずれかで投与されることを意味する。順次に投与される場合、２種の化合物のうち、第二の化合物の投与の開始時に第一の化合物が治療部位において有効濃度で検出可能であることが好ましい。

【0461】

前記併用療法としては、例えば、１種以上の本明細書で開示されるモノクローナル抗体、その断片、および／またはその複合体を１種以上の追加の抗体（例えば、ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ２二量化阻害剤抗体、またはＨＥＲ２抗体とＨＥＲ２二量化阻害剤抗の組み合わせ（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、またはトラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ、またはトラスツズマブのバイオ後続品および／またはペルツズマブ、またはバイオ後続品の組み合わせ）と共製剤および／または共投与することが挙げられる。

【0462】

前記併用療法としては、例えば、１種以上の本明細書で開示されるモノクローナル抗体、その断片、および／またはその複合体を１種以上の追加の治療薬、例えば、タキサン（パクリタキセル、またはドセタキセル）、アントラサイクリン（ドキソルビシン、またはエピルビシン）、シクロホスファミド、カペシタビン、タモキシフェン、レトロゾール、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、エルロチニブ、イリノテカン、フルオロウラシル、またはオキサリプラチンと共製剤および／または共投与することが挙げられる。そのような併用療法は、投与される治療薬の投与量を減らすのに有用に用いられて、様々な単剤療法に関連づけられた起こりうる毒性または合併症を回避することができる。

【0463】

いくつかの態様では、本明細書で開示される抗体、その断片、および／またはその複合体と組み合わせて用いられる追加の治療薬は、免疫応答および／または炎症性応答の異なる段階に干渉する薬剤である。一態様では、本明細書で記載される１種以上の抗体を１種以上の追加の薬剤と共製剤および／または共投与してもよい。
診断薬および予防薬

【0464】

本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体、その抗原結合断片、および／またはその複合体は、診断薬および予防薬に用いられる。一態様では、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体、その抗原結合断片、および／またはその複合体は、前記病気（これに限定されないが、例えば、癌）の１つ以上を発症する危険性がある患者に投与される。患者または臓器の前記兆候の１つ以上の傾向を遺伝子型標識、血清学的標識、または生化学標識を用いて決定することができる。

【0465】

本発明の他の態様では、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体、その抗原結合断片、および／またはその複合体は、前記病気（これに限定されないが、例えば、癌）の１つ以上と関連づけられた臨床兆候と診断されたヒト個体に投与される。診断時に、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体、その抗原結合断片、および／またはその複合体は、前記病気の１つ以上と関連づけられた臨床兆候の効果を軽減または好転させるために投与される。

【0466】

本発明の他の態様では、本明細書で開示される複合体で治療するのに適している乳癌患者を識別する方法は、前記患者に由来する腫瘍試料中の特定の特性の状態を測定すること、および前記腫瘍試料中の特定の特性の状態に基づいて治療する患者を識別することを含む。

【0467】

また、本明細書で開示される抗体は、患者の試料中のＨＥＲ２の検出に有用であり、したがって、診断法として有用である。例えば、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体は、患者試料中のＨＥＲ２量を検出するための生体外アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）に用いられる。

【0468】

一態様では、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体は、固体支持体（例えば、マイクロ滴定器のプレートのウェル）に固定化されている。この固定化された抗体は、試験試料に存在する可能性がある任意のＨＥＲ２を拿捕する抗体として働く。固定化された抗体を患者試料と接触させる前に、固体支持体を阻害剤（例えば、乳タンパク質またはアルブミン）で洗浄および処理して、検体の非特異的吸着を防止する。

【0469】

その後、ウェルを、抗原を含むと疑われる試験試料、または標準量の抗原を含む溶液で処理する。そのような試料は、例えば、病態の診断に役立つと見なされる循環抗原量を有すると疑われる対象由来の血清試料である。試験試料または標準液を洗浄した後、検出可能に標識された第二の抗体で固体支持体を処理する。標識された第二の抗体は、検出抗体として作用する。検出可能な標識の量を測定し、標準試料から作成した標準曲線と比較して試験試料中のＨＥＲ２抗原濃度を決定する。

【0470】

自明であるが、本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体を用いて生体外診断アッセイで得られた結果に基づいて、対象の病気をＨＥＲ２抗原の発現量に基づいて段階付けすることができる。ある病気では、血液試料は、病気の進行の様々な段階および／または病気の治療の様々な時点にあると診断された対象者から採取される。進行または治療の各段階で統計的に有意な結果を提供する試料集団を用いて、各段階に特徴的と見なされる可能性がある抗原濃度の範囲が設計される。

【0471】

本明細書で引用したすべての出版物および特許文献は、それぞれ具体的に、また、個々に参照により本明細書に組み込まれることが示されたように、参照により本明細書に組み込まれる。出版物および特許文献の引用は、いずれかが従来の技術に関連することを認める意図ではなく、また、引用の内容または日付について何らかの承認を与えるものでもない。本発明を記述により説明してきたが、本発明は、様々な態様で実行することができ、上記の記述および以下の実施例は例示目的であり、続く請求項に対する限定ではないことは当業者には自明である。

【実施例】

【0472】

以下の実施例は、リンカー、薬物分子、およびＰＢＲＭ、およびこれらを調製する方法の例示である。これらは限定を意図するものではなく、当業者には自明であるが、他の試薬または方法を用いてもよい。
略語

【0473】

以下の反応スキームおよび合成例では以下の略語が用いられる。このリストは、有機合成の当業者には自明であるが、追加の標準的略語として本願で用いられる略語の包括的リストであることを意味するものではく、合成スキームおよび実施例にも用いることができる。
ＡＦ−ＨＰＡ オーリスタチンＦ−ヒドロキシプロピルアミド
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＤＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル培地
ＦＢＳ ウシ胎児血清
ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水、０．９％のＮａＣｌ
ＴＭＢ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
一般情報

【0474】

Genentech社によって製造される注射用カドサイラ（登録商標）（アド−トラスツズマブエムタンシン）を購入した。

【0475】

ＣＤＲはＫａｂａｔ番号付けスキームにより同定された。

【0476】

腫瘍増殖抑制度（％ＴＧＩ）は、治療群と対照群の腫瘍体積中央値（ＭＴＶ）の差を百分率として定義した。

【0477】

治療の有効性は、試験中に観察された腫瘍サイズの退縮応答の出現数とその程度から決定した。治療により、動物の腫瘍が部分退縮（ＰＲ）または完全体縮（ＣＲ）する可能性がある。ＰＲ応答では、腫瘍体積は、試験中に行った３回の連続測定での体積が１日目の体積の５０％以下であり、これら３回の測定うちの少なくとも１回で１３．５ｍｍ³以上であった。ＣＲ応答では、腫瘍体積は試験中に行った３回の連続測定で１３．５ｍｍ³未満であった。試験の終わりにＣＲ応答を有する動物をさらに無腫瘍生存体（ＴＦＳ）として分類した。動物を退縮応答について監視した。

【0478】

ＨＰＬＣ精製をPhenomenex Gemini、粒径５μｍ、孔径１１０Å、２５０×１０ｍｍ、５ミクロン、半調製カラムで行った。

【0479】

ＳＥＣを東ソー・バイオサイエンスTSK gel G5000カラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、１０ｕｍ）またはSuperose 12カラム（ＧＥヘルスケア）で行った。

【0480】

弱酸性陽イオン交換（ＷＣＸ）をProPac WCX-10（９４ｍｍ×２５０ｍｍ）カラム（サーモフィッシャー）で行った。

【0481】

可能な場合は常に、複合体の薬物含有量を分光光度分析により決定した。そうでない場合は、ＬＣ／ＭＳまたは¹Ｈ−ＮＭＲを行って薬物含有量を定量した。

【0482】

タンパク質−重合体−薬物複合体のタンパク質含有量を分光光度分析（２８０ｎｍ）またはＥＬＩＳＡで決定した。

【0483】

多糖またはタンパク質の分子量標準のいずれかを用いてＳＥＣにより重合体複合体の分子量（見かけの重量平均分子量またはピーク分子量として報告された）を決定した。より具体的には、前記重合体または重合体−薬物複合体については多糖の分子量標準を用いて、タンパク質−薬物−重合体複合体についてはタンパク質の分子量標準を用いる。特に断りがなければ、報告された重合体担体分子量はＰＨＦの重量平均分子量であり、重合体−薬物複合体の分子量およびタンパク質−重合体−薬物複合体はピーク分子量である。ＨＥＲ２−重合体−薬物複合体のピーク分子量は約１７０ｋＤａ〜約２３０ｋＤａである。製造／測定された重合体および重合体複合体は、典型的には多分散度が１．５以下である。

【0484】

大量透析濾過によりＨｅｒ２−重合体−薬物複合体を未反応の薬物−重合体複合体の残留物から分離した。必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィー、ＷＣＸクロマトグラフィーの一方あるいは両方で追加の精製を行って任意の凝集したＨｅｒ２−重合体−薬物複合体を除去した。一般に、前記Ｈｅｒ２−重合体−薬物複合体は、典型的には、５％（ｗ／ｗ）未満（例えば、２％（ｗ／ｗ）未満）（ＳＥＣにより決定）の凝集画分、０．５％（ｗ／ｗ）未満（例えば、０．１％（ｗ／ｗ）未満）（ＲＰ−ＨＰＬＣまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定）の遊離（未接合）薬物、１％（ｗ／ｗ）未満（ＳＥＣおよび／またはＲＰ−ＨＰＬＣにより決定）の遊離重合体−薬物複合体、および２％（ｗ／ｗ）未満（例えば、１％（ｗ／ｗ）未満）（ＨＩＣ−ＨＰＬＣおよび／またはＷＣＸ ＨＰＬＣにより決定）の未接合Ｈｅｒ２を含んでいた。還元または部分的に還元された抗体を文献に記載された手順を用いて作製した。例えば、Francisco et al., Blood 102 (4): 1458-1465 (2003)を参照のこと。総（接合および未接合）薬物濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定した。
一般的な手順
一般的な手順Ａ．重合体とリンカーまたは薬物との接合

【0485】

一般に、活性化剤（例えば、ＥＤＣ．ＨＣｌなど）の存在下、水性溶媒または１０〜９０％の有機溶媒／水性溶媒の混合物中で前記重合体（ＰＨＦ−ＢＡまたはＰＨＦ−ＧＡ）をアミン含有リンカー（例えば、ＥＧ２−マレイミド）またはアミン含有リンカー薬物（例えば、ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ、ＨＰＡ−Ａｌａ）と接合する。典型的な有機溶媒としては、水と相溶性を有する溶媒、例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＮＭＰ、およびＡＣＮなどが挙げられるが、これらに限定されない。結合を速めるために、共活性剤、例えば、ＮＨＳを添加する。まず、重合体をアミノ含有化合物と混合し、共活性剤（ＮＨＳ）、次いで活性剤（ＥＤＣ．ＨＣｌ）を添加する。反応を周囲温度で０〜１０℃、ｐＨ４．５〜７．５で１時間〜２４時間行う。得られた重合体複合体を透析濾過またはＳＥＣにより精製する。この生成物を２〜５０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、ｐＨを４．５〜６．５に調整して、薬物−重合体リンカーの安定性を確保し、さらに用いるまで−２０℃から−８０℃で複合体を冷凍保存する。

【0486】

重合体とアミン含有リンカーまたは薬物の接合は、順次、任意の順序で行っても同時に行ってもよい。
一般的な手順Ｂ．タンパク質（ＨＥＲ２抗体）の部分的に選択可能な還元

【0487】

重合体−薬物複合体との接合の前に、適切なＨＥＲ２抗体の鎖間ジスルフィド基または不対ジスルフィドの部分的に選択可能な還元を還元剤（例えば、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、またはβ−メルカプトエタノール）を用いて行う。過剰な還元剤を用いて還元を行う場合、接合の前にＳＥＣにより還元剤を除去する。ＨＥＲ２ジスルフィド基の反応性スルフヒドリル基への転化度は、ＨＥＲ２の化学量論、還元剤、ｐＨ、温度、および／または反応の継続期間に依存する。ＰＢＲＭのジスルフィド基のすべてではないがいくつかを還元する場合、還元されたＰＢＲＭは部分的に還元されたＨＥＲ２である。
一般的な手順Ｃ．部分的に還元したＨＥＲ２と重合体薬物複合体との接合

【0488】

部分的に還元されたＰＢＲＭの重合体−薬物複合体への接合は、中性またはわずかに塩基性の条件（ｐＨ：６．５〜８．５）でＰＢＲＭ濃度が１〜１０ｍｇ／ｍＬ、重合体−薬物複合体濃度が０．５〜１０ｍｇ／ｍＬで行われる。前記重合体−薬物複合体は典型的に、所望の生分解性タンパク質−重合体−薬物複合体の化学量論に対して１〜５．０倍過剰で用いられる。前記ＰＢＲＭを前記重合体−薬物複合体のマレイミド基に接合する場合、任意で水溶性マレイミド遮断化合物（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、システインメチルエステル、Ｎ−メチルシステイン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパン酸、２−メルカプト酢酸、メルカプトメタノール（すなわち、ＨＯＣＨ₂ＳＨ）、ベンジルチオールなど）を添加して接合を終了させる。

【0489】

得られたＨＥＲ２−重合体−薬物複合体は、典型的には透析濾過により精製して、任意の未接合重合体−薬物複合体、未接合薬物、および小分子不純物を除去する。これに代えて、あるいはこれに加えて、適切なクロマトグラフィーによる分離手順を用いてＨＥＲ２−重合体−薬物複合体を精製してもよい。そのような分離手順としては、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー（例えば、ＷＣＸクロマトグラフィー）、逆相クロマトグラフィー、水酸燐灰石クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせが挙げられる。精製されたＨＥＲ２−重合体−薬物複合体は、典型的にはｐＨが５．０〜６．５の緩衝剤中で製剤される。
実施例１：ＨＥＲ２抗体のためのＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）による選別

【0490】

本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体のうちの２つ、ＸＭＴ１５１７およびＸＭＴ１５１９を以下で記載する手順を用いて選別した。それぞれ約１０⁹の多様性を有する８個の未処理ヒト合成酵母菌ライブラリーを上述のように伝播させた（例えば、ＷＯ２００９０３６３７９、ＷＯ２０１０１０５２５６、ＷＯ２０１２／００９５６８、およびXu et al., Protein Eng Des Sel. 2013 Oct;26(10):663-70を参照のこと）。選別の最初の２回は、（Siegel et al., J Immunol Methods. 2004 Mar;286(1-2):141-53）に記載のように、Miltenyi MACSシステムを用いた磁性ビーズ選別技術を行った。簡単に説明すると、０．１％ＢＳＡ（EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit、サーモサイエンティフィック、Cat.# 21425を用いてビオチン化した）を含むＦＡＣＳ洗浄緩衝ＰＢＳ中で、酵母菌細胞（約１０¹⁰細胞／ライブラリー）を２００ｎＭのビオチン化単量体ＨＥＲ２抗原または１０ｎＭのビオチン化ＨＥＲ２−Ｆｃ融合抗原３ｍｌと共に室温で１５分間インキュベートした。５０ｍｌの氷冷した洗浄緩衝剤で１回洗浄した後、細胞ペレットを４０ｍＬの洗浄緩衝剤中に懸濁させて、５００μｌのStreptavidin MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach、独国、Cat.# 130-048-101)を酵母菌に加え、４℃で１５分間インキュベートした。次いで、この酵母菌をペレット化して、５ｍＬの洗浄緩衝剤に再懸濁させ、MACS LSカラム（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach、独国、Cat.# 130-042-401）に充填した。５ｍＬを充填した後、カラムを３ｍｌのＦＡＣＳ洗浄緩衝剤で３回洗浄した。次いで、カラムを磁界から取り除き、酵母菌を５ｍＬの増殖媒体で溶出して、一晩増殖した。選別の以下の３回はフローサイトメトリーにより行った。約１×１０⁸の酵母菌をペレット化して、洗浄緩衝剤で３回洗浄し、室温で１０分間、それぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭのビオチン化ＨＥＲ２と共にインキュベートした。ついて、酵母菌を２回洗浄して、１：１００で希釈したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂κ−ＦＩＴＣ(Southern Biotech、アラバマ州バーミンガム、Cat.# 2062-02)と、１：５００で希釈したストレプトアビジンAlexa Fluor633（Life Technologies, Grand Island, NY, Cat.# S21375）または１：５０で希釈したＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ−フェコエリスリン（シグマアルドリッチ社、セントルイス、Cat.# E4011）のいずれかと、二次試薬を用いて４℃で１５分間染色した。氷冷した洗浄緩衝剤で２回洗浄した後、細胞ペレットを０．４ｍＬの洗浄緩衝剤に再懸濁させ、濾過器と栓付きの選別管に移した。FACS ARIA選別器(BD Biosciences)を用いて選別を行い、２つの選別分について選別ゲートを決定してＨＥＲ２結合クローンのみを選別し、３つ目の選別分については試薬結着剤を低減する陰性選別を行った。選別の最終回の後、酵母菌を蒔いて、個々のコロニーを性質決定のために採集した。
実施例２：ＨＥＲ２抗体の親和性成熟

【0491】

以下で記載する手順を用いて、親和性成熟させた本明細書で開示されるＨＥＲ２抗体ＸＭＴ１５１８およびＸＭＴ１５２０を作製した。軽鎖バッチ多様化（ＬＣＢＤ）に５つ目の選別分の結合集団を用いた。重鎖プラスミドを抽出して、１×１０⁶の多様性を有する軽鎖ライブラリーに形質変換した。上述のように、選別は、一度のＭＡＣＳ選別と、それぞれ１０ｎＭまたは１ｎＭのビオチン化抗原を用いた二度のＦＡＣＳ選別により行った。

【0492】

さらに、ＬＣＢＤから最もよいクローンに親和性成熟を行った。これらクローン由来の重鎖のＣＤＲＨ３をそれぞれ、個々に予め作製しておいた１×１０⁸の多様性を有する多様体のライブラリーに組み換えた。選別は上述のように行った。様々な時間で抗原抗体酵母菌複合体と親Ｆａｂをインキュベートして親和性圧力を加えて、親和性が最も高い抗体を選別した。

【0493】

親和性成熟の三度目の選別分は、重鎖および軽鎖のエラープローンＰＣＲを含んでいた。３つのすべての選別分についてＦＡＣＳ選別を用いて上述のサイクルと同様に、またＦａｂ圧力については時間を長くして選別を行った。
実施例３：抗体の産生および精製

【0494】

酵母菌クローンを飽和状態まで増殖させて、振とうしながら３０℃で４８時間誘導した。誘導後、酵母菌細胞をペレット化して、上澄みを精製用に採取した。タンパク質Ａカラムを用いてＩｇＧを精製して、酢酸（ｐＨ：２．０）で溶出した。パパインで消化してＦａｂ断片を生成し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス社、Ｃａｔ．＃１７−５４５８−０１）で精製した。

【0495】

抗体を新しい発現ベクターにサブクローニングして、ＨＥＫに一過性形質移入および発現させてＩｇＧの哺乳類発現を行った。簡単に説明すると、形質移入は以下のように行う。目的の抗体を含む発現ベクターを形質移入試薬と複合化して、１時間ＨＥＫ細胞に暴露し、細胞の最終密度が４００万個／ｍＬになるまで培地を希釈する。次いで、４８時間毎に新しい培地と取り替えながら細胞を７日間培養する。７日後に、上澄みを回収して遠心分離し、タンパク質Ａカラムを用いて、さらに必要に応じてＣＨＴカラムを用いて精製し、９５％超の単量体を得る。
実施例４：ＨＥＲ２抗体の親和性の測定

【0496】

ＦｏｒｔｅＢｉｏまたはＭＳＤ−ＳＥＴによりＫ_Dを測定してＨＥＲ２抗体の親和性を決定した。上述のように一般にＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を行った(Estep et al., MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):270-8)。簡単に説明すると、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、オンラインのＩｇＧをＡＨＱセンサに充填して行った。アッセイ緩衝剤中で３０分間、センサをオフラインで平衡にし、ベースラインを確立するためにオンラインで６０秒間監視した。ＩｇＧを充填したセンサを５分間１００ｎＭの抗原に暴露し、その後、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）測定のため５分間アッセイ緩衝剤に移した。１：１の結合モデルを用いて動態を分析した。

【0497】

上述のように(Estep et al., 2013)、平衡親和性測定を行った。抗原を５０ｐＭで一定に保ち、１０ｎＭから３〜５倍に連続希釈した抗体と共にインキュベートして溶液平衡滴定（ＳＥＴ）をＰＢＳとＩｇＧを含まない０．１％のＢＳＡ（ＰＢＳＦ）中で行った。４℃で一晩、または室温で３０分間、標準結合ＭＳＤ−ＥＣＬプレートを抗体（ＰＢＳ中２０ｎＭ）で被覆した。次いで、プレートを７００ｒｐｍで振とうしながら３０分間ブロックし、その後、洗浄緩衝剤（ＰＢＳＦ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。ＳＥＴ試料をプレートに入れて、７００ｒｐｍで振とうしながら１５０秒間インキュベートした。その後、１回洗浄した。プレートに拿捕された抗原をプレート上で３分間インキュベートして、ＰＢＳＦ中で２５０ｎｇ／ｍＬのスルホタグ標識ストレプトアビジンを用いて検出した。プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄して、界面活性剤を含む１×Read Buffer Tを用いてMSD SECtor Imager2400装置で読み取った。Ｐｒｉｓｍを用いて、滴定した抗体の関数としてパーセントなしの抗原をプロットし、二次方程式に適合させてＫ_Dを抽出した。処理量を向上させるため、ＳＥＴ試料の調製を含むＭＳＤ−ＳＥＴ実験を通して液体処理ロボットを用いた。表ＩにＦｏｒｔｅＢｉｏおよびＭＳＤ−ＳＥＴ親和性測定の結果を示す。

【表1】

実施例５：Octet Red384によるエピトープのビニング

【0498】

Forte Bio Octet Red384システム（Pall Forte Bio社、カリフォルニア州メンロパーク）で標準サンドイッチ方式ビニングアッセイにより抗体のエピトープビニングを行った。対照の抗標的ＩｇＧをＡＨＱセンサに充填し、センサ上の空いているＦｃ結合部位を関連のないヒトＩｇＧ１抗体でブロックした。次いで、センサを１００ｎＭの標的抗原に暴露して、その後、二次抗標的抗体に暴露した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ社のData Analysis Software7.0を用いてデータを処理した。抗原の会合後にさらに二次抗体が結合した場合は空いているエピトープ（非競合体）を示し、そのような結合がない場合はエピトープがブロックされたこと（競合体）を示す。この過程を４種の対照抗体について繰り返した。（ｉ）ＨＥＲ２の領域ＩＶに結合するトラスツズマブ(Cho et al., Nature. 2003 Feb 13;421(6924):756-60)、（ｉｉ）ＨＥＲ２の領域ＩＩに結合するペルツズマブ(Franklin et al., Cancer Cell. 2004 Apr; 5(4):317-28)、（ｉｉｉ）ＨＥＲ２の領域ＩＩＩに結合するＦａｂ３７(Fisher et al., J Mol Biol. 2010 Sep 10;402(1):217-29)、および（ｉｖ）ＨＥＲ２の領域Ｉに結合するｃｈＡ２１(Zhou et al., J Biol Chem. 2011 Sep 9;286(36):31676-83.; Cheng et al., Cell Res. 2003 Feb;13(1):35-48)。対照抗体の配列を以下に示す。
＞トラスツズマブ重鎖可変領域アミノ酸配列

【化67】

（配列番号４０）
＞トラスツズマブ軽鎖可変領域アミノ酸配列

【化68】

（配列番号４１）
＞ペルツズマブ重鎖可変領域アミノ酸配列

【化69】

（配列番号４２）
＞ペルツズマブ軽鎖可変領域アミノ酸配列

【化70】

（配列番号４３）
＞Ｆａｂ３７重鎖可変領域アミノ酸配列

【化71】

＞Ｆａｂ３７軽鎖可変領域アミノ酸配列

【化72】

＞chＡ２１重鎖可変領域アミノ酸配列

【化73】

＞ｃｈＡ２１軽鎖可変領域アミノ酸配列

【化74】

【0499】

これら４種の対照抗体と競合しない、最も高い親和性を有する抗体ＸＭＴ１５１９、ＸＭＴ１５２０、ＸＭＴ１５１７、ＸＭＴ１５１８を選別した。

【0500】

図１Ａに示すＸＭＴ１５１７抗体、ＸＭＴ１５１８抗体、および図１Ｂに示すＸＭＴ１５１９抗体、ＸＭＴ１５２０抗体が４種の対照抗体と競合しなかった。
実施例６：ＪＩＭＴ−１細胞を用いた抗体結合定数の測定

【0501】

Ｍａｃｓｑｕａｎｔフローサイトメーター（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach、独国）を用いてＨＥＲ２抗体のＪＩＭＴ−１細胞への細胞表面結合を評価した。ＪＩＭＴ−１細胞を１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド）を含むＤＭＥＭ媒地（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）で一晩約９０％の集密培養物になるまで培養して、Ａｃｃｕｔａｓｅ細胞剥離液（Innovative Cell Technologies、カリフォルニア州サンディエゴ）で処理してプレート表面から剥離した。この剥離した細胞を６％のヤギ血清を含む氷冷した培地で１回洗浄して、同じ媒体中に再懸濁させた。１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートのＶ字型の底部を有するウェルに分けて、６％のヤギ血清を含む１５０μｌのＤＭＥＭ中、ＨＥＲ２抗体濃度を０．０５〜１００ｎＭの範囲にして、氷上で３時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷したＰＢＳで１回洗浄して、氷上で１時間、２％のヤギ血清と、６μｇ／ｍｌの二次蛍光標識化抗体Alexa Fluor（登録商標）６４７で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Life Technologies Cat.#A-21445）を含む１００μｌのＤＭＥＭに再懸濁させた。この細胞を氷冷したＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Life Technologies, Cat.# 10010049）で１回洗浄して、１％のパラホルムアルデヒドを含む２００μｌの氷冷したＰＢＳで再懸濁させた。フローサイトメーターの各処理につき５０００個の細胞を用いて細胞あたりの結合した蛍光体の量を決定した。処理毎の中央蛍光値をグラフ化して、Graphpad Prismソフトウェアを用いて、単一部位特異的結合モデルを用いた非直線回帰により抗体毎に解離定数Ｋ_dを算出した。図２は、ＨＥＲ２抗体のＪＩＭＴ−１細胞への結合を示している。算出されたＫ_d値は、３．４ｎＭ（ＸＭＴ１５１７）、０．４ｎＭ（ＸＭＴ１５１８）、１．２ｎＭ（ＸＭＴ１５１９）、および１．１ｎＭ（ＸＭＴ１５２０）であった。
実施例７：ＥＬＩＳＡによる抗体親和性の測定

【0502】

組み換えヒトおよびカニクイザルＨＥＲ２に対する前記抗体の親和性をＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。各ウェルで５０ｍＭの重炭酸塩緩衝剤の１μｇ／ｍｌ溶液（ｐＨ：９．０）５０μｌを用いて室温で２時間インキュベートして、９６ウェルプレートの表面をヒト由来（アミノ酸２３−６５２、Acro Biosystems Cat.# HE2-H5225）またはカニクイザル由来（アミノ酸１−６５２、Sino Biological, Cat.# 90295-C08H）のいずれかの精製した組み換えＨＥＲ２細胞外領域で被覆した。ウェルをＴＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ：７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。５％のウシ血清アルブミンを含む５０μｌのＴＴＢＳで１時間インキュベートしてウェルをブロックした。次いで、３％のＢＳＡを含むＴＴＢＳ５０μｌに各試験抗体または実施例１６Ｈの希釈したもの（０．００５〜１０ｎＭの範囲、３倍に連続希釈）を室温で２時間添加した。未結合の試験抗体をＴＴＢＳ洗浄（４×）で除去した。濃度が３％のＢＳＡを含むＴＴＢＳ中に０．２μｇ／ｍｌのＨＲＰに接合した二次抗ヒトＩｇＧ（Bethyl Laboratories, #A80-115Pを各ウェルで１時間インキュベートした。未結合の二次抗体を４回のＴＴＢＳ洗浄で除去した。ＨＲＰ基質ＴＭＢ（Bethyl Laboratories #E102）を各ウェルに加えて、黄色になるまでインキュベートした。０．２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー (Molecular Devices, Spectramax M5)測定した。GraphPad Prismソフトウェアを用いてその値をプロットした。単一部位特異的結合モデルを用いた非直線回帰によりＫ_dを決定した。

【0503】

図３ａは、抗ＨＥＲ２抗体ＸＭＴ１５１７、ＸＭＴ１５１８のヒトＨＥＲ２およびカニクイザルＨＥＲ２への結合結果を示す。図３ｂは、抗ＨＥＲ２抗体ＸＭＴ１５１９、ＸＭＴ１５２９のヒトＨＥＲ２およびカニクイザルＨＥＲ２への結合結果を示す。算出したＫ_d値を表ＩＩに示す。

【表2】

【0504】

これら４種の試験抗体のヒトＨＥＲ２およびカニクイザルＨＥＲ２への結合親和性は同様であった。

【0505】

図３ｃおよび図３ｄは、それぞれ、抗ＨＥＲ２抗体ＸＭＴ１５１９および実施例１６ＨのヒトＨＥＲ２およびカニクイザルＨＥＲ２への結合結果を示す。算出されたＫ_d値を以下の表ＩＩＡに示す。

【表3】

【0506】

ＸＭＴ１５１９および実施例１６ＨのヒトＨＥＲ２およびカニクイザルＨＥＲ２への結合親和性は同様であった。
実施例８：ＪＩＭＴ−１細胞を用いた抗体競合アッセイ

【0507】

ＸＭＴ１５１８およびＸＭＴ１５１９抗体が重なり合うエピトープに結合することを確かめるために、前記抗体をＪＩＭＴ−１細胞への競合結合アッセイで分析した。実施例６で記載したようにＪＩＭＴ−１細胞を培養した。５０μｌ中の５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートのＶ字型底部を有するウェルに分けた。次いで、２５μｌの媒体中３０ｎＭのAlexa Fluor（登録商標）６４７と接合した抗体ＸＭＴ１５１９を単独で、または濃度を０．０５〜１００ｎＭの範囲に希釈した未標識の二次抗体（ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９、またはトラスツズマブ）と混合して、氷上で３時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷したＰＢＳで１回洗浄して、氷上で１時間、２％のヤギ血清と、６μｇ／ｍｌのヤギAlexa Fluor（登録商標）６４７標識抗ヒトＩｇＧ(Life Technologies, Cat.# A-21445)を含む１００μｌのＤＭＥＭで再懸濁させた。細胞を氷冷したＰＢＳで１回洗浄して、１％パラホルムアルデヒドを含む２００μｌの氷冷したＰＢＳで懸濁させた。ＭａｃｓＱｕａｎｔフローサイトメーター（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach、独国）の各処理に５０００個の細胞を用いて、細胞あたりの結合した蛍光体の量を決定した。処理毎の中央蛍光値をグラフ化して、Graphpad Prismを用いて、単一部位特異的結合モデルを用いた非直線回帰により抗体毎に解離定数Ｋ_dを算出した。図４に示すように、抗体ＸＭＴ１５１８は、未標識ＸＭＴ１５１９と同程度、Alexa Fluor（登録商標）６４７標識ＸＭＴ１５１９の結合と競合した。このことは、両方の抗体がＨＥＲ２の重なり合うエピトープを認識することを示している。一方、トラスツズマブは、Alexa Fluor（登録商標）６４７標識化ＸＭＴ１５１９の結合と競合しなかった。
実施例９：抗体依存性細胞媒介細胞毒性アッセイ

【0508】

抗ＨＥＲ２抗体の抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性をＢＴ４７４細胞で定量化した。１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中、９６ウェルプレートの各ウェルに５０００個の細胞を蒔いて、５％のＣＯ₂中３７℃で一晩培養した。抗体濃度を０．００１〜１００ｎＭ（８連続で５倍に希釈）の範囲にしてＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９、ＸＭＴ１５２０、またはトラスツズマブを細胞に加えて、ＡＤＣＣ活性をプロメガ社のバイオアッセイキット（Ｃａｔ．＃Ｇ７０１８）で測定した。このキットは、ＡＤＣＣ活性のレポーターとしてルシフェラーゼ酵素を産生するように遺伝子操作したエフェクター細胞を用いている。ルシフェラーゼ活性を分光光度計(Molecular Devices, Spectramax M5)で測定した。Graphpad Prismソフトウェアを用いて、作動薬の対数と応答、可変勾配、４パラメータモデルを用いた非直線回帰により値（抗体で処理した細胞の各試料のルシフェラーゼ活性の、抗体で処理していない細胞の各試料のルシフェラーゼ活性に対する比）をプロットした。

【0509】

図５はＡＤＣＣ値を示すグラフである。ＸＭＴ１５１９およびＸＭＴ１５２０は、トラスツズマブと同程度の最大活性を示している。抗体を含む信号の、抗体を含まない信号に対する比は、ＸＭＴ１５１９が３０．１、ＸＭＴ１５２０が２９．７であり、トラスツズマブでは３４．６である。ＸＭＴ１５１８の最大活性は１１．０である。ＡＤＣＣ活性のＥＣ₅₀（半数結合）値は、それぞれ、０．１６ｎＭ（ＸＭＴ１５１８）、０．１８ｎＭ（ＸＭＴ１５１９）、０．５４ｎＭ（ＸＭＴ１５２０）、および０．０７ｎＭ（トラスツズマブ）である。
実施例１０：ＭＣＦ７細胞でのリガンド依存ＨＥＲ２信号伝達

【0510】

ＨＥＲ３リガンドであるニューレグリンβ１で細胞を処理した後、リン酸化ＡＫＴの量を測定してＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２２）での抗ＨＥＲ２抗体のリガンド依存ＨＥＲ２信号伝達に及ぼす効果を決定した。６ウェル培養皿の各ウェルに３００，０００個のＭＣＦ７細胞を０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリンおよび１０％のＦＢＳを含むＭＥＭ培地に蒔いて、５％のＣＯ₂雰囲気中３７℃で一晩培養した。培地を除いて、１０μｇ／ｍｌの試験抗体を含む新しい培地と交換し、１時間インキュベートした。その後、４０ｐＭのニューレグリンβ１(R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス、Cat.# 377-HB-050)で１５分間処理した。細胞を氷冷したＰＢＳで１回洗浄して、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ：７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）、およびＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）を含む洗浄緩衝剤２００μｌを添加して、溶解した。溶解物を１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、不溶性の残骸を除去した。製造者の指示に従ってCell Signaling Technology PathScan（登録商標） Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Kitを用いてリン酸化ＡＫＴの量を決定した。

【0511】

表ＩＩＩは、ＭＣＦ７細胞のニューレグリン処理によって誘導されたＡＫＴリン酸化反応の増加を示し、未刺激の細胞で測定したＡＫＴリン酸化反応の増加に対する百分率として表している。

【表4】

【0512】

ニューレグリンで処理するとリン酸化ＡＫＴ量が５倍（未刺激の細胞に対して５２２％）に増加した。ＸＭＴ１５１７、ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９、およびＸＭＴ１５２０では、ＡＫＴリン酸化反応でのニューレグリンによって誘導される増加は、それぞれ５６４％、４４１％、３８１％、および４３９％であり、増加率はほとんどあるいは全く下がらなかった。トラスツズマブでも増加率は同程度（３６９％）であった。ペルツズマブは、リガンド依存信号伝達を阻害することが示されている(Franklin et al., Cancer Cell. 2004 April 19; 5:317-28)が、未刺激の細胞の増加率付近（１２７％）までニューレグリンによる刺激を低減した。これらの結果は、ニューレグリンにより促進され、ペルツズマブにより阻害されるＨＥＲ２およびＨＥＲ３の異種二量化を阻害することで試験抗体が作用しないことを示唆している。
実施例１１：ＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３、およびＪＩＭＴ−１細胞でのリガンド独立ＨＥＲ２信号伝達

【0513】

抗体で４時間処理した後、リン酸化ＡＫＴ量の変化を測定して、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２２）、ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−３０）、ＪＩＭＴ−１（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−３０）細胞における抗ＨＥＲ２抗体のＨＥＲ２信号伝達に及ぼす効果を決定した。細胞を６ウェル培養皿の各ウェル中の１０％のＦＢＳを含むそれらの細胞に特異的な培地に蒔いて、５％のＣＯ₂雰囲気中３７℃で一晩培養した。培地を除いて、１０μｇ／ｍｌの試験抗体を含む新しい培地と交換し、４時間インキュベートした。細胞を氷冷したＰＢＳで１回洗浄して、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ：７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）、およびＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）を含む緩衝剤２００μｌを添加して、溶解した。溶解物を１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、不溶性の残骸を除去した。製造者の指示に従ってCell Signaling Technology PathScan(登録商標) Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Kitを用いてリン酸化ＡＫＴの量を決定した。

【0514】

表ＩＶから、ＡＫＴリン酸化反応の量により示されるように、ＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３、およびＪＩＭＴ−１細胞のリガンド独立ＨＥＲ２信号伝達を阻害することが分かる。結果を未処理細胞に対する百分率として表す。

【表5】

【0515】

試験抗ＨＥＲ２抗体は、ＳＫＢＲ３細胞でのＨＥＲ２信号伝達を大きく阻害した。ＸＭＴ１５１７、ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９およびＸＭＴ１５２０は、未処理細胞で出現するリン酸化ＡＫＴ量の４３％、５９％、３４％、および２９％までリン酸化ＡＫＴ量低下させた。これに対して、トラスツズマブによる低下は未処理細胞で出現するリン酸化ＡＫＴ量の６４％であった。

【0516】

前記抗ＨＥＲ２抗体は、リン酸化ＡＫＴ量の低下に示されるように、ＪＩＭＴ−１細胞でのＨＥＲ２信号伝達を阻害した。ＸＭＴ１５１７、ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９およびＸＭＴ１５２０では、未処理細胞で出現するリン酸化ＡＫＴ量の６６％、６２％、８４％、および６９％まで、リン酸化ＡＫＴ量が低下した。同様に、トラスツズマブによる低下は、未処理細胞で出現するリン酸化ＡＫＴ量の５６％であった。

【0517】

ＭＣＦ７細胞は、ＸＭＴ１５１８は、トラスツズマブ同様、ＨＥＲ２信号伝達を阻害しなかったが、ＸＭＴ１５１７、ＸＭＴ１５１９、およびＸＭＴ１５２０は信号伝達を穏やかに低下させ、未処理細胞で起こるＡＫＴリン酸化反応の７９％、７６％、および６６％までＡＫＴリン酸化反応を低下させた。
実施例１２：ＢＴ４７４細胞でのリガンド独立ＨＥＲ２信号伝達

【0518】

４時間抗体で処理した後、リン酸化ＡＫＴ量の変化を測定して、ＢＴ４７４細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２０）における抗ＨＥＲ２抗体のＨＥＲ２信号伝達に及ぼす効果を決定した。ＢＴ４７４細胞（３００，０００個の細胞）を６ウェル培養皿の各ウェル中の１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に蒔いて、５％のＣＯ₂雰囲気中３７℃で一晩培養した。培地を除いて、１０μｇ／ｍｌの試験抗体を含む新しい培地と交換して、４時間インキュベートした。細胞を氷冷したＰＢＳで１回洗浄して、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ：７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）、およびＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）を含む緩衝剤２００μｌを添加して、溶解した。溶解物を１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、不溶性の残骸を除去した。リン酸化ＡＫＴの量をウェスタン分析により分析した。各２０μｌの抽出物を７μｌのＮＵＰＡＧＥ充填色素(Life Technologies, Cat.#NP0007)および２μｌの１０×還元剤(Life Technologies, Cat.#NP0341)と混合して、４〜１２％のビス−トリスポリアクリルアミドゲル(Life Technologies, Cat.#NP0341)に充填した。これをＭＯＰＳランニング緩衝剤(Life Technologies Cat.#NP000102)に９０分間１２０ボルトで流した。分離したタンパク質を、半乾燥式電気泳動転写システム(Bio-Rad、Transblotシステム）を用いて１０％のメタノールを含む転写緩衝剤(Life Technologies, Cat.#NP0006)中、１０ボルトで３０分間ニトロセルロース膜に転写した。この膜をブロッキング緩衝剤(Li-cor, Cat.#927-40000)中で１時間インキュベートして、次いで、１：１０００に希釈した、ＡＫＴタンパク質を認識するマウス抗体(Cell Signaling Technology,#2920)、セリン４７３でリン酸化したＡＫＴを認識するウサギ抗体(Cell Signaling Technology,#4060)、および１：５，０００に希釈した、アクチンを認識するウサギ抗体(LiCor,Cat.#926-42210)と共に同じブロッキング緩衝剤中で１時間インキュベートした。インキュベーション後、膜１０ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄し、二次抗体、すなわち、ＩＲ色素（登録商標）８００ＣＷに接合したヤギ抗ウサギＩｇＧ(Li-Cor,Cat.#926-32211)、およびＩＲ色素（登録商標）６８０ＲＤに接合したヤギ抗マウスＩｇＧ(Li-Cor,Cat.#926-68070)（いずれも１：１０，０００に希釈）と共にブロッキング緩衝剤中で１時間インキュベートした。膜を再度、１０ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄して、Li-Cor Odysseyスキャナでスキャンした。スキャナのソフトウェアを用いてＡＫＴ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ、およびアクチンに対応するバンドを定量化した。各ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴバンドを総ＡＫＴバンドに対して正規化して、いずれの抗ＨＥＲ２抗体でも処理していない細胞由来のｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴタンパク質の百分率として表した。

【0519】

また、同じ実験で、抗ＨＥＲ２抗体のＨＥＲ３リン酸化反応に及ぼす効果も調べた。上述のニトロセルロースブロットも、ブロッキング緩衝剤中１時間、１：１０００で希釈した、チロシン１２８９のＨＥＲ３リン酸化を認識するウサギ抗体(Cell Signaling Technolog,#4791)でプローブした。インキュベーション後、膜を１０ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄して、ブロッキング緩衝剤中１：１０，０００に希釈したＩＲ色素（登録商標）８００ＣＷに接合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉ−Ｃｏｒ、Ｃａｔ．＃９２６−３２２１１）と共に１時間インキュベートした。膜を再度、１０ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄して、Li-Cor Odysseyスキャナでスキャンした。スキャナのソフトウェアを用いてｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３およびアクチンに対応するバンドを定量化した。各ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３のバンドを総ＡＫＴバンドに対して正規化して、いずれの抗ＨＥＲ２抗体でも処理していない細胞由来のｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３タンパク質の百分率として表した。

【0520】

表Ｖに、ＡＫＴリン酸化反応またはＨＥＲ３リン酸化反応の量により決定されたＢＴ４７４細胞でのリガンド独立ＨＥＲ２信号伝達の阻害を示す。結果は、未刺激の細胞に対する百分率として示す。

【表6】

【0521】

抗ＨＥＲ２抗体ＸＭＴ１５１９は、ＢＴ４７４の未処理細胞で見られるＡＫＴリン酸化反応の約２１％までＡＫＴリン酸化反応を低下させ、ＨＴ１９Ｂは、約３０％まで低下させた。これに対して、トラスツズマブは、未処理細胞で見られるＡＫＴリン酸化反応の約３１％まで、ペルツズマブは約４４％まで低下させた。ＨＥＲ３リン酸化反応はすべての抗体により穏やかに影響された。ＸＭＴ１５１９、ＸＭＴ１５２０、トラスツズマブ、およびペルツズマブで、それぞれ、未処理細胞で見られるＡＫＴリン酸化反応の７１％、７６％、８０％、および８５％までＡＫＴリン酸化反応が低下した。
実施例１３：内部移行率の測定

【0522】

抗体ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９、ＸＭＴ１５２０、およびトラスツズマブがそれぞれ、ＳＫＢＲ３細胞の細胞表面から内部移行する速度を、９６ウェルに基づくアッセイ(96-well based assay)で蛍光により決定した。ＳＫＢＲ３細胞を９６ウェルプレートに播種して、５％のＣＯ₂中３７℃で１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド、Cat.# 16140-071）を含むＤＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス、Ｃａｔ．＃３０〜２００２）で一晩培養した。細胞を氷上で１時間、１０μｇ／ｍｌの抗体を含む培地でインキュベートして、氷冷した培地で洗浄し、Alexa Fluor（登録商標）−６４７と接合した１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−１価Ｆａｂ断片（Rockland Immunochemicals、ペンシルベニア州ギルバーツヴィル、Ｃａｔ．＃８０９−１１０２）を含む媒体７５μｌと共に氷上で１時間インキュベートした。洗浄後、細胞を３７℃のインキュベーターに移して、様々な時点で内部移行させた。７００ｎｍチャネルを用いたＯｄｙｓｓｅｙスキャナ（Li-Cor Biosciences、ネブラスカ州リンカーン）でプレートをスキャンした。次いで、プレートを氷上で１００ｍＭのグリシン、２０ｍＭのＭｇＳＯ₄、５０ｍＭのＫＣｌと共にｐＨ２．２でインキュベートして酸洗浄し、細胞表面に結合した抗体を除去し、氷冷したＰＢＳで洗浄し、再度スキャンして、細胞により内部移行した蛍光体の量を決定した。図６は、４時間に渡る抗体の内部移行率を示している。すべての抗体の内部移行率は、トラスツズマブの内部移行率とほぼ同じで、０時間で結合した総表面の約５０％が４時間で内部移行した（図６）。
実施例１３Ａ：ＳＫＢＲ３細胞でのＨＥＲ２内部移行

【0523】

ＳＫＢＲ３細胞での抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせのＨＥＲ２内部移行に及ぼす効果を蛍光顕微鏡法で調べた。トラスツズマブをAlexa Fluor-647と接合して、細胞内のトラスツズマブの位置と、ＨＥＲ２と思われる位置を視覚化した。ＳＫＢＲ３細胞を４チャンバー顕微鏡スライドに播種して、装着し、５％のＣＯ₂中３７℃で１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド、Ｃａｔ．＃１６１４０−０７１）を含むＤＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス、Ｃａｔ．＃３０−２００２）で一晩培養した。ＳＫＢＲ３細胞を、（ｉ）トラスツズマブ−Ａｌｅｘａ−６４７とペルツズマブの組み合わせ、または（ｉｉ）トラスツズマブ−Ａｌｅｘａ−６４７、ペルツズマブ、ＨＥＲ２抗体ＸＭＴ１５１９の組み合わせのいずれかを含む培地で９０分間インキュベートした。トラスツズマブの位置を蛍光顕微鏡で視覚化した。図７に示すように、ペルツズマブ単独と組み合わせたトラスツズマブ−Alexa Fluor-627の大部分は、細胞膜の位置を示唆するオレンジ色の細胞マスクと共局所化された。ペルツズマブおよびＸＭＴ１５１９の両方と組み合わせたトラスツズマブ−Alexa Fluor−６４７の大部分は、リソソームの位置を示唆するＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒと共局所化された。この結果は、トラスツズマブとペルツズマブと組み合わせたＸＭＴ１５１９の存在は内部移行およびＨＥＲ２のリソソームへの輸送を促進することを示唆している。
実施例１３Ｂ：抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせを用いた内部移行率の測定

【0524】

異なるエピトープを認識する複数の抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせのＨＥＲ２内部移行率に及ぼす効果を、実施例１３に記載したのと同様の９６ウェルプレートに基づくアッセイにより決定した。この実験では、細胞を試験ＨＥＲ２抗体単独、試験ＨＥＲ２抗体とトラスツズマブ、またはトラスツズマブおよびペルツズマブとの組み合わせで処理して、様々な時点の内部移行した抗ＨＥＲ２抗体量を測定した。

【0525】

このアッセイでは、４０，０００個のＳＫＢＲ３細胞を３個の９６ウェルプレート（透明な底部のウェルを有する黒色のプレート）の各ウェル中の１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に蒔いて、５％のＣＯ₂中３７℃で一晩付着させた。翌日、以下のように細胞を抗体で処理した。各ウェルの培地を、試験ＨＥＲ２抗体またはトラスツズマブの１つを５μｇ／ｍｌ含む氷冷した新しい培地と交換して、氷上で１時間インキュベートした。氷冷した培地で２回細胞を洗浄して未結合の抗体を除去した。検出では、５μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ６４７標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片を各ウェルの氷冷した培地に加えて、氷上で１時間インキュベートした。氷冷した培地で各ウェルを２回洗浄して、未結合の二次抗体を除去した。次いで、トラスツズマブを５μｇ／ｍｌ含む培地、またはトラスツズマブとペルツズマブをそれぞれ５μｇ／ｍｌを含む培地、あるいは追加の抗体なしの培地を各ウェルに加えた。各処理は、同じ試料を３つずつ用意して行った。ウェルの１セットをＡｌｅｘａ６４７標識抗ヒトＩｇＧ１価Ｆａｂ断片単独で処理して、これらウェルで測定された蛍光を用いてバックグラウンドの蛍光を減じた。

【0526】

１個のプレートを氷上に残して、処理毎の０時間での値を決定した。他のプレートは３７℃でインキュベートした。１．５時間後、３７℃から１つのプレート、および０時間のプレートを氷冷したＰＢＳで２回洗浄して、６８０ｎｍチャネルのLicor Odysseyスキャナを用いてスキャンした。各ウェルで測定された蛍光体量を処理毎の総蛍光体量として用いた。次いで、１００ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＫＣｌ、および２０ｍＭのＭｇＳＯ₄、ｐＨ２．２で細胞を２回酸洗浄し、氷冷したＰＢＳで２回洗浄して表面に結合した抗体を除去した。プレートを再度スキャンして、各ウェルで内部移行した蛍光体の量を決定した。翌日、同様にして２４時間プレートを分析した。

【0527】

内部移行した各ＨＥＲ２抗体（または対照ウェルのトラスツズマブの）百分率を、バックグラウンドを減じて、３つの同じ試料のそれぞれを平均して、処理毎の総蛍光体量で内部移行した蛍光体量を除して、１００を乗じて算出した。

【0528】

表ＶＡに示すように、トラスツズマブおよびペルツズマブの両方と組み合わせると、ＸＭＴ１５１８、ＸＭＴ１５１９、およびＸＭＴ１５２０の８０〜９０％は、１．５時間以内に内部移行する。ＸＭＴ１５１７は、６０％が内部移行したが、これはおそらくその非常に高い解離速度によるもので、それによってインキュベーション中に細胞から拡散したと思われる。トラスツズマブと組み合わせると各試験抗体の２０〜４０％が１．５時間以内に内部移行した。各試験抗体が単独で存在する場合は約１５％が内部移行した。トラスツズマブ単独では１．５時間以内に約１５％が内部移行し、ペルツズマブと組み合わせると約３０％が内部移行したことが示された。

【0529】

したがって、３種のＨＥＲ２抗体、すなわち、試験ＨＥＲ２抗体のいずれか１種と、トラスツズマブ、およびペルツズマブのの組み合わせは、ＨＥＲ２飲食作用率を高めると思われ、それによって抗体の内部移行率を高める。

【表7】

【表8】

実施例１４：ＨＥＲ２の分解

【0530】

ＳＫＢＲ３細胞での抗ＨＥＲ２抗体のＨＥＲ２分解に及ぼす効果を、抗体の処理後にウェスタン分析により決定した。３００，０００個のＳＫＢＲ３細胞を６ウェル培養皿の各ウェル中の１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に蒔いて、５％のＣＯ₂雰囲気中３７℃で一晩培養した。培地を除いて、各抗体を１０μｇ／ｍｌ含む新しい培地と交換し、４時間インキュベートした。細胞を氷冷したＰＢＳで１回洗浄して、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ：７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）、およびＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）を含む緩衝剤２００μｌを添加して、溶解した。溶解物を１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、不溶性の残骸を除去した。各２０μｌの抽出物を７μｌのＮＵＰＡＧＥ充填色素(Life Technologies, Cat.#NP0007)および２μｌの１０×還元剤(Life Technologies, Cat.#NP0341)と混合して、４〜１２％のビス−トリスポリアクリルアミドゲル(Life Technologies, Cat.#NP0341)に充填した。これをＭＯＰＳランニング緩衝剤(Life Technologies Cat.#NP000102)に９０分間１２０ボルトで流した。分離したタンパク質を、半乾燥式電気泳動転写システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｔｒａｎｓｂｌｏｔシステム）を用いて１０％のメタノールを含む転写緩衝剤(Life Technologies, Cat.#NP0006)中で、１０ボルトで３０分間ニトロセルロース膜に転写した。この膜をブロッキング緩衝剤(Li-cor, Cat.#927-40000)中で１時間インキュベートして、次いで、１：１，０００で希釈した、ＨＥＲ２タンパク質を識別するウサギ抗体(Cell Signaling Technology, Cat.#2165)、および１：５，０００で希釈したアクチンを識別するウサギ抗体(LiCor, Cat.#926-42210)と共に同じブロッキング緩衝剤中で１時間インキュベートした。インキュベーション後、膜を１０ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄し、二次抗体、すなわち、ＩＲ色素（登録商標）８００ＣＷに接合したヤギ抗ウサギＩｇＧ(Li-Cor,Cat.#926-32211)、およびＩＲ色素（登録商標）６８０ＲＤに接合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｃａｔ．＃９２６−６８０７０）（いずれも１：１０，０００に希釈）と共にブロッキング緩衝剤中で１時間インキュベートした。膜を再度、１０ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄して、Li-Cor Odysseyスキャナでスキャンした。スキャナのソフトウェアを用いて完全な長さのＨＥＲ２タンパク質およびアクチンに対応するバンドを定量化した。各ＨＥＲ２バンドをアクチンのバンドに対して正規化して、いずれの抗ＨＥＲ２抗体でも処理していない細胞由来のＨＥＲ２タンパク質の百分率として表した。

【0531】

図８は、試験抗体単独またはトラスツズマブと組み合わせてＳＫＢＲ３細胞を処理したところ、 ＨＥＲ２量にはほとんどあるいは全く効果がなかったが、ＸＭＴ１５１８およびＸＭＴ１５２０は例外で、完全な長さのＨＥＲ２をそれぞれ７８％および６８％まで減少させ、低分子量の分解物を生じたと思われることを示している。しかしながら、トラスツズマブ、ペルツズマブ、および試験ＨＥＲ２抗体の１種の３つの組み合わせは、ＨＥＲ２を大きく分解して、ＨＥＲ２分解物が生じたと思われる。ＸＭＴ１５１８またはＸＭＴ１５２０をトラスツズマブおよびペルツズマブと組み合わせると、最大の低下が見られ、２０％または３１％のＨＥＲ２が残留した。抗体ＸＭＴ１５１７またはＸＭＴ１５１９をトラスツズマブおよびペルツズマブと組み合わせると、それぞれＨＥＲ２の通常量の４０％または４２％が残留した。
実施例１５：エピトープマッピング

【0532】

Integral Molecular Inc.（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア、マーケットストリート３７１１スイート９００）によりShotgun Mutagenesis Technologyを用いて抗体ＸＭＴ１５１７およびＸＭＴ１５１９のエピトープマッピングが行われた。Shotgun Mutagenesisは、真核細胞内の変異させた標的タンパク質の大型ライブラリーを発現および分析することが可能な、独占所有権のある高処理細胞発現技術を採用している。機能の変化をアッセイするため、タンパク質の各残基を個々に変異させて、通常、他の複数のアミノ酸にする。タンパク質は標準哺乳類細胞株内で発現するので、真核翻訳処理または翻訳後処理を必要とする難しいタンパク質でもマッピングすることができる。

【0533】

Shotgun Mutagenesisマッピングにより、ＸＭＴ１５１７結合について６種の重要なアミノ酸（Ｃ４５３、Ｈ４７３、Ｎ４７６、Ｒ４９５、Ｈ４９７、およびＷ４９９）が同定された。このことは、ＸＭＴ１５１７が、ＨＥＲ２のＩＩＩ領域のＣ末端および領域ＩＶのＮ末端の領域に結合することを示している。また、Ｈ４５６およびＧ４９６の２つの二次的に重要な突然変異も、ＸＭＴ１５１７のＨＥＲ２との結合に関わる可能性がある。

【0534】

ＸＭＴ１５１９結合について３種の重要なアミノ酸（Ｅ５２１、Ｌ５２５、およびＲ５３０）が同定された。このことは、ＸＭＴ１５１９がＨＥＲ２の領域ＩＶのＮ末端の領域に結合することを示している。
実施例１６：ＨＥＲ２−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))の合成

【化75】

【0535】

２０１４年１０月１０日に提出された米国継続出願１４／５１２，３１６号に記載の手順を用いてＨＥＲ２−（ＥＧ２−ＭＩ−（１０ｋＤａ ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））複合体を作製した。表ＶＩに、それら抗体−重合体薬物複合体の詳細を示す。

【表9】

【0536】

前記ＨＥＲ２−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体のピーク分子量は約１７０ｋＤａ〜約２３０ｋＤａであった。製造・測定した重合体および重合体複合体は、典型的には多分散度が１．５以下であった。重合体−薬物複合体（すなわち、抗体に付加した薬物担持重合体鎖）は、約２７モル％〜約３３モル％のβ−アラニン、約６．４モル％〜約９．６モル％のＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ、および約１．５モル％〜約４モル％のＥＧ２−ＭＩを含んでいた。
実施例１７：リツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))の合成

【化76】

【0537】

２０１４年１０月１０日に提出された米国継続出願１４／５１２，３１６号に記載の手順を用いてリツキシマブ−（ＥＧ２−ＭＩ−(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala))）複合体（非結合の対照）を作製した。表ＶＩＩに、これら抗体−重合体薬物複合体の詳細を示す。

【表10】

【0538】

ＨＥＲ２−（ＥＧ２−ＭＩ−(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala))）複合体のピーク分子量は約１７０ｋＤａ〜約２３０ｋＤａであった。製造・測定した重合体および重合体複合体は、典型的には多分散度が１．５以下であった。重合体−薬物複合体（すなわち、抗体に付加した薬物担持重合体鎖）は、約２７モル％〜約３３モル％のβ−アラニン、約６．４モル％〜約９．６モル％のＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ、および約１．５モル％〜約４モル％のＥＧ２−ＭＩを含んでいた。
実施例１８：ＨＥＲ２−（ＥＧ２−ＭＩ−(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala))）複合体の細胞毒性アッセイ

【0539】

Cell Titer-Glo（プロメガ社）を用いて、HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体を生体外の腫瘍細胞株での抗増殖性について評価した。ＪＩＭＴ−１（ＨＥＲ２培地発現細胞、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、独国、Ｃａｔ．＃ＡＣＣ５８９）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＨＥＲ２培地発現ヒト乳癌細胞、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−２７）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（３種陰性乳癌細胞株、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−１３１）を１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド、Ｃａｔ．＃１６１４０−０７１）を含むＤＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス、Ｃａｔ．＃３０−２００２）で培養した。ＮＣＩ−Ｈ５２２（非小細胞肺上皮悪性腫瘍細胞株、増幅せず、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−５８１０）、およびＮＣＩ−Ｈ２１７０（非小細胞肺上皮悪性腫瘍細胞株、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−５９２８）細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃３０−２００１）で培養した。ＮＣＩ−Ｈ１５８１（非小細胞肺上皮悪性腫瘍培地発現細胞株、増幅せず、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−５８７８）細胞をＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃３０−２００６）で培養した。ＳＮＵ５（胃上皮悪性腫瘍細胞株、増幅せず、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−５９７３）を２０％のＦＢＳを含むＩｓｃｏｖｅダルベッコ改変イーグル培地(Invitrogen Life Technologies、Cat.#12440053)で培養した。ＯＶＣＡＲ３（卵巣腺癌細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−１６１）を２０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ（ヒト乳癌細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−２５）を２０％のＦＢＳを含むLeibovitz L-15培地で培養した。ＣＡＭＡ−１（ヒト乳癌細胞株、増幅せず、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−２１）を９０％のＡＴＣＣ処方イーグル最小必須培地で培養した。ＺＲ７５−１（ヒト乳癌細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−１５００）をＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＨＣＣ１１８７（ヒト乳癌細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−２３２２）をＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＨＣＣ３８（ヒト乳癌細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−２３１４）をＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。Ｔ４７Ｄ（ヒト乳癌細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−１３３）をＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＨＣＣ７０（ヒト乳癌細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−２３１５）をＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−２６）をＤＭＥＭ培地で培養した。ＣＡＬＵ３（ヒト肺腺癌細胞株ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−５５）をＡＴＣＣ処方イーグル最小必須培地で培養した。Ａ５４９（ヒト肺上皮性悪性腫瘍細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＣＬ−１８５）をＦ１２Ｋ培地で培養した。ＮＣＩ−Ｈ２１２２（ヒト肺腺癌細胞株、増幅せず、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−５９８５）をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃３０−２００１）で培養した。ＮＣＩ−Ｈ４６０（ヒト肺上皮性悪性腫瘍細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−１７７）をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃３０−２００１）で培養した。ＳＨＰ−７７（ヒト小細胞肺癌細胞株、増幅せずＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−２１９５）をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃３０−２００１）で培養した。KATO III（ヒト胃上皮悪性腫瘍細胞株、増幅せず、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−１０３）を２０％のＦＢＳを含むＩｓｃｏｖｅダルベッコ改変イーグル培地で培養した。MKN-45 III（ヒト胃腺癌細胞株、増幅せず、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、独国、Ｃａｔ．＃ＡＣＣ４０９）をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃３０−２００１）で培養した。ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣腺癌細胞株、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−７７）をＭｃＣｏｙの５ａ培地で培養した。ＴＯＶ−２１Ｇ（ヒト卵巣腺癌細胞株、増幅せず、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−１１７３０）を、最終濃度が１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含むMCDB 105培地および最終濃度が２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含む培地１９９の１：１の混合物中で培養した。ＢＴ４７４（ＨＥＲ２高発現ヒト乳癌細胞、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−２０）を１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。ＮＣＩ−Ｎ８７（ＨＥＲ２高発現胃癌細胞株、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−５８２２）を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。

【0540】

細胞毒性アッセイでは、９６ウェルプレートのウェルあたり３０００個の細胞密度で細胞を播種して、５％のＣＯ₂の存在下３７℃で一晩インキュベートしながら付着させた。培地を、HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体（１００ｎＭ〜０．１ｐＭの範囲で）またはカドサイラ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含む新しい培地と交換し、５％のＣＯ₂の存在下３７℃で細胞を７２時間または６日間インキュベートした。CellTiter-Glo(登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）を用いて、キットの指示に従って細胞生存率を測定した。細胞生存率を未処理の対照に対して正規化して、百分率として表した。値をプロットして、Graphpad Prismソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて４パラメータ、可変勾配、投与反応曲線適合アルゴリズムによりＩＣ₅₀値を算出した。表ＶＩＩＩに、HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体およびカドサイラの細胞毒性の例示的な結果を示す。

【表11】

【0541】

表ＶＩＩＩに示すように、すべての試験した細胞株ですべてのＨＥＲ２抗体−重合体−薬物複合体は、カドサイラよりも高い有効性を示した。
実施例１９：変異体ＨＥＲ２を有する細胞株でのHER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体の細胞毒性アッセイ

【0542】

Cell Titer-Glo（プロメガ社）を用いて、HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体を生体外の腫瘍細胞株での抗増殖性について評価した。ＮＣＩ−Ｈ１７８１（ＨＥＲ２変異体発現ヒト肺癌細胞、ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．＃ＣＲＬ−５８９４）を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。

【0543】

細胞毒性アッセイでは、９６ウェルプレートのウェルあたり３０００個の細胞密度で細胞を播種して、５％のＣＯ₂の存在下３７℃で一晩インキュベートしながら付着させた。次いで、培地を、HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体（１００ｎＭ〜０．１ｐＭの範囲で）、実施例１７Ａ（リツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala))）、またはカドサイラ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含む新しい培地と交換して、５％のＣＯ₂の存在下３７℃で細胞を７２時間インキュベートした。CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）を用いて、キットの指示に従って細胞生存率を測定した。細胞生存率を未処理の対照に対して正規化して、百分率として表した。値をプロットして、Graphpad Prismソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて４パラメータ、可変勾配、投与反応曲線適合アルゴリズムによりＩＣ₅₀値を算出した。表ＩＸに、これらアッセイの結果を示す。

【表12】

【0544】

表ＩＸで示されるように、試験した細胞株で、すべてのＨＥＲ２抗体−重合体−薬物複合体は、リツキシマブ抗体−重合体−薬物複合体またはカドサイラよりも高い有効性を示した。
実施例２０：ＰＢＲＭ−重合体−薬物複合体の投与に対する腫瘍成長応答

【0545】

メスのCB-17 SCIDマウスに対して、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（群あたりｎ＝１０）、ＪＩＭＴ−１細胞（群あたりｎ＝１０）、ＳＮＵ−５細胞（群あたりｎ＝１０）、Ｈ５２２細胞（群あたりｎ＝１０）、ＳＫＯＶ３細胞（群あたりｎ＝１０）、Ｃａｌｕ−３細胞（群あたりｎ＝１０）、ＮＣＩ−Ｎ８７カドサイラ耐性細胞（群あたりｎ＝１０）、ＮＣＩ−Ｎ８７−ＭＳＡカドサイラ耐性細胞（群あたりｎ＝１０）、またはＢＴ４７４腫瘍断片（群あたりｎ＝１０）を皮下接種した。メスのNCr nu/nuに対して、ＴＯＶ−２１Ｇ細胞（群あたりｎ＝１０）を皮下接種した。１日目または示したように、試験化合物または媒体を単回投与量として静脈内投与した。デジタルカリパスを用いて図８〜図１８に示した時間に腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積を算出して、その体積から腫瘍の成長の遅延を決定した。腫瘍のサイズが８００〜１５００ｍｍ³になったら、マウスを犠牲にした。群毎に、腫瘍体積を平均±標準誤差（ＳＥＭ）として報告した。

【0546】

図９は、１日目の単回投与量として媒体、実施例１６Ａのトラスツズマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（０．６７ｍｇ／ｋｇ）、または実施例１６ＤのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（０．６７ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を皮下接種したマウス（群あたりｎ＝１０）における腫瘍応答の結果を示す。媒体およびトラスツズマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))では、腫瘍体積の増加が見られた。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))では、６０％の部分退縮が見られ、２９日目に腫瘍成長阻害分析に基づく可能な治療活性（ＴＧＩ：８８％）が得られた。

【0547】

図１０は、１日目の単回投与量として媒体、カドサイラを２０ｍｇ／ｋｇ、実施例１６Ａのトラスツズマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（０．６７ｍｇ／ｋｇ）、または実施例１６ＤのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（０．６７ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、ＪＩＭＴ−１細胞（群あたりｎ＝１０）を皮下接種したマウスにおける腫瘍応答の結果を示す。媒体およびカドサイラでは、腫瘍体積の増加が見られた。トラスツズマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体およびXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体では、それぞれ、治療可能性が示され、４０％および７０％退縮があった。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))では、５つの部分退縮および２つの完全退縮があり、６９日目の試験終了時で腫瘍がなく生存していた。

【0548】

図１１は、媒体、カドサイラ（１日目の単回投与量として１０ｍｇ／ｋｇ）、カドサイラ１０ｍｇ／ｋｇとペルツズマブ１５ｍｇ／ｋｇの組み合わせ（３週間、毎週投与）、または実施例１６Ｄ、XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として０．６７ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、ＪＩＭＴ−１細胞を皮下接種したマウス（群あたりｎ＝１０）における腫瘍応答の結果を示す。媒体、カドサイラ、およびカドサイラとペルツズマブの組み合わせすべてで、腫瘍体積の増加が見られた。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体では６０％の部分退縮が見られ、最も高い有効性を示した。

【0549】

図１２は、媒体、実施例１６ＦのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として０．６７ｍｇ／ｋｇ）、１５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブと１５ｍｇ／ｋｇのペルツズマブの組み合わせ（３週間、毎週、すなわち、１日目、８日目、および１５日目に投与）、または１５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブと１５ｍｇ／ｋｇのペルツズマブ（それぞれ、３週間、毎週、すなわち、１日目、８日目、および１５日目に投与）と実施例１６ＦのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として０．６７ｍｇ／ｋｇ）の３種の組み合わせを静脈内投与した後の、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（群あたりｎ＝１０）を皮下接種したマウスにおける腫瘍応答の結果を示す。媒体では、腫瘍体積の増加が見られた。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))単独またはその組み合わせではすべて、腫瘍の縮小が見られ、トラスツズマブ、ペルツズマブと実施例１６Ｆの３種の組み合わせが最も効果が高く、１００％の部分退縮があった。実施例１６Ｆ単独、またはトラスツズマブとペルツズマブの組み合わせは、それぞれ、１０個のうち１個が部分応答を示した。３種の組み合わせは、実施例１６Ｆ単独治療、またはトラスツズマブとペルツズマブの２種の組み合わせに比べて部分応答率の数値がより高く、腫瘍体積の縮小が有意に大きかった（ｐ＜．０５、マン・ホイットニー試験）。部分応答は、少なくとも３回の一連の腫瘍測定で維持されたベースライン腫瘍体積の５０％未満までの退縮として定義される。

【0550】

ペルツズマブおよびトラスツズマブと組み合わせたXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))の総生存利益は、XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))のみの投与と比べて大きく異なっており（Ｐ＜０．０１１、ログランク検定）、ペルツズマブとトラスツズマブの組み合わせによって得られた転帰（Ｐ＜０．２７３、ログランク検定）またはＸＭＴ１５１９抗体、ペルツズマブ、およびトラスツズマブの３種の組み合わせによって得られた転帰（Ｐ＜０．０５、ログランク検定）よりも勝っていた。

【0551】

図１３は、媒体、カドサイラ（単回投与量として１０ｍｇ／ｋｇ）、実施例１６ＥのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（単回投与量として５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、または０．６７ｍｇ／ｋｇ）、または実施例１７Ｂのリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量としてとして５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、ＳＮＵ−５細胞（群あたりｎ＝１０）を皮下接種したマウスにおける腫瘍応答の結果を示す。１８日目に媒体では腫瘍体積の増加が見られた。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体では腫瘍の縮小が見られ、カドサイラまたはリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))に比べて高い有効性を示した。また、投与量５ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇでは腫瘍のない生存者１００％、投与量０．６７ｍｇ／ｋｇでは腫瘍のない生存者が９０％という結果が得られた。

【0552】

図１４は、媒体、カドサイラ（単回投与量として１０ｍｇ／ｋｇ）、実施例１６ＥのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として５ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、ＴＯＶ−２１Ｇ細胞（群あたりｎ＝１０）を皮下接種したマウスにおける腫瘍応答の結果を示す。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体では、腫瘍の遅延が見られた。また、カドサイラよりも高い有効性を示した。カドサイラは治療活性の閾値を得られなかった。

【0553】

図１５は、媒体、カドサイラ（単回投与量として１０ｍｇ／ｋｇ）、実施例１６ＥのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（単回投与量として５ｍｇ／ｋｇ）、または実施例１７Ｂのリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、Ｈ５２２細胞（群あたりｎ＝１０）を皮下接種したマウスにおける腫瘍応答の結果を示す。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体では、腫瘍の遅延が見られた。また、カドサイラおよびリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))よりも高い有効性を示した。これらは治療活性の閾値を得られなかった。

【0554】

図１６は、媒体、カドサイラ（単回投与量として１０ｍｇ／ｋｇ）、実施例１６ＥのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（単回投与量として５ｍｇ／ｋｇ）、実施例１７Ｂのリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、ＳＫＯＶ３細胞（群あたりｎ＝１０）を皮下接種したマウスにおける腫瘍応答の結果を示す。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))では、１０個の完全応答からなる１００％退縮という結果が得られた。また、カドサイラまたはリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)よりも高い有効性を示した。これらは治療活性の閾値を得られなかった。

【0555】

図１７は、媒体、または実施例１６ＦのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、Ｃａｌｕ−３細胞（群あたりｎ＝１０）を皮下接種したマウスにおける腫瘍応答の結果を示す。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))では、２個の部分応答および８個の完全応答からなる１００％の退縮応答という結果が得られた。このうち、６個は６０日目に腫瘍がなくなった。

【0556】

図１８は、媒体、カドサイラ（単回投与量として１０ｍｇ／ｋｇ）、実施例１６ＨのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（単回投与量として３ｍｇ／ｋｇ）、または実施例１７Ｂのリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目に３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、患者由来の異種移植モデルBRE-0333 HER2 1+（群あたりｎ＝８）における腫瘍応答の結果を示す。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体では、腫瘍の遅延が見られた。また、カドサイラまたはリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))よりも高い有効性を示した。

【0557】

図１９は、媒体、カドサイラ（単回投与量として１０ｍｇ／ｋｇ）、実施例１６ＨのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ）、または実施例１７Ｂのリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、患者由来の異種移植モデルMAXF_1162 HER2 3+（群あたりｎ＝１０）における腫瘍応答の結果を示す。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))では、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのいずれの場合も、１００％の退縮応答と腫瘍のない生存者という結果が得られた。また、カドサイラまたは、リツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（３ｍｇ／ｋｇ）よりも高い有効性を示した。

【0558】

図２０は、媒体、カドサイラ（単回投与量として５ｍｇ／ｋｇ）、実施例１６ＨのXMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として５ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇ）、実施例１７Ｃのリツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))（１日目の単回投与量として５ｍｇ／ｋｇ）、またはＸＭＴ１５１９（単回投与量として５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した後の、ＢＴ４７４腫瘍断片（群あたりｎ＝１０）を皮下接種したマウスにおける腫瘍応答の結果を示す。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))複合体では、完全腫瘍退縮が見られた。また、カドサイラ、リツキシマブ−(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))、またはＸＭＴ１５１９よりも高い有効性を示した。

【0559】

単回投与量１ｍｇ／ｋｇまたは０．６７ｍｇ／ｋｇのＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））複合体では、低ＨＥＲ２発現乳癌および胃癌モデルで完全退縮が見られたが、アド−トラスツズマブエムタンシン（カドサイラ）は投与量が１０ｍｇ／ｋｇ以上では不活性であった。ＨＥＲ２駆動性腫瘍モデルでは、ＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））複合体は広く用いられる抗ＨＥＲ２治療薬トラスツズマブおよびペルツズマブとの組み合わせで相乗効果を示した。ＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））複合体は、優れた薬物動態プロファイルを示し、非ヒト霊長類では治療投与量での忍容性が優れていた。

【0560】

臨床前データは、ＸＭＴ１５１９−（ＥＧ２−ＭＩ−（ＰＨＦ−ＢＡ−（ＡＦ−ＨＰＡ−Ａｌａ）））複合体が、ＨＥＲ２標的治療薬から恩恵を受ける可能性のある患者数を大きく拡大する可能性があることを示唆している。前記複合体は、ＨＥＲ２受容体がわずか１０，０００個で他の治療薬は不活性である癌に効率的な薬物送達を行う。
その他の実施形態

【0561】

本発明はその詳細な説明と合わせて記載されたが、上述の記載は例示を意図するものであって、添付の請求項の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。その他の側面、利点、および変形は、以下の請求項の範囲内である。

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図3c-3d】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]