特許 6854340 デノボ合成された核酸ライブラリ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6854340

(24)【登録日】2021年3月17日

(45)【発行日】2021年4月7日

(54)【発明の名称】デノボ合成された核酸ライブラリ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20210329BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20210329BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20210329BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20210329BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20210329BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20210329BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20210329BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20210329BHJP

   C12Q 1/6872 20180101ALN20210329BHJP

   C12N 1/11 20060101ALN20210329BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALN20210329BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20210329BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/11 Z

   C40B40/06ZNA

   !C12N1/21

   !C12N1/15

   !C12N1/19

   !C12N5/10

   !C12N9/16 Z

   !C12N15/63 Z

   !C12Q1/6872 Z

   !C12N1/11

   !C12Q1/6844 Z

   !C12N15/55

【請求項の数】20

【全頁数】80

(21)【出願番号】特願2019-510673(P2019-510673)

(86)(22)【出願日】2017年4月5日

(65)【公表番号】特表2019-528070(P2019-528070A)

(43)【公表日】2019年10月10日

(86)【国際出願番号】US2017026232

(87)【国際公開番号】WO2018038772

(87)【国際公開日】20180301

【審査請求日】2020年4月3日

(31)【優先権主張番号】62/378,134

(32)【優先日】2016年8月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/382,191

(32)【優先日】2016年8月31日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/393,948

(32)【優先日】2016年9月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/411,388

(32)【優先日】2016年10月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/419,881

(32)【優先日】2016年11月9日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】516040017

【氏名又は名称】ツイスト バイオサイエンス コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】コックス，アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】チェン，スーユアン

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０２１０８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１６／０１１０８０（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／１１

Ｃ４０Ｂ ４０／０６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸ライブラリであって、該核酸ライブラリは、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子を含み、各非同一のＤＮＡ分子は異なるｇＲＮＡ配列をコードし、各ｇＲＮＡ配列は哺乳類遺伝子に相補的な標的ドメインを含み、および、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子の少なくとも８０％が、核酸ライブラリ中の非同一のＤＮＡ分子の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリにそれぞれ存在する、核酸ライブラリ。

【請求項2】

各非同一のＤＮＡ分子は、２０％〜８５％のＧＣ塩基含有量を有する、請求項１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項3】

各非同一のＤＮＡ分子は、３０％〜７０％のＧＣ塩基含有量を有する、請求項１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項4】

少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子の少なくとも９０％は、核酸ライブラリ中の非同一のＤＮＡ分子の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリにそれぞれ存在する、請求項１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項5】

少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子は、少なくとも２０００の非同一のＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項6】

少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子は、少なくとも３５００の非同一のＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項7】

各非同一のＤＮＡ分子は、最大２００の塩基の長さを含む、請求項１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項8】

少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子は、生物学的経路において、遺伝子を標的とするｇＲＮＡ配列をコードする非同一のＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項9】

少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子は、全ゲノムにおいて、遺伝子を標的とするｇＲＮＡ配列をコードする非同一のＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項10】

ｇＲＮＡは単一のｇＲＮＡまたは二重のｇＲＮＡである、請求項１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項11】

核酸ライブラリであって、該核酸ライブラリは少なくとも２０００の非同一の核酸を含み、各非同一の核酸は異なるｓｇＲＮＡ配列をコードし、各ｓｇＲＮＡ配列は真核生物の遺伝子に相補的な標的ドメインを含み、および、少なくとも２０００の非同一の核酸の少なくとも８０％は、核酸ライブラリ中の非同一の核酸の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリに存在する、核酸ライブラリ。

【請求項12】

各非同一の核酸は、２０％〜８５％のＧＣ塩基含有量を有する、請求項１１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項13】

少なくとも２０００の非同一の核酸の少なくとも９０％は、核酸ライブラリ中の非同一の核酸の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリ中にそれぞれ存在する、請求項１１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項14】

各非同一の核酸は最大で２００の塩基の長さを含む、請求項１１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項15】

少なくとも２０００の非同一の核酸が、生物学的経路において、遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ配列をコードする非同一の核酸を含む、請求項１１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項16】

少なくとも２０００の非同一の核酸が、全ゲノムにおいて、遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ配列をコードする非同一の核酸を含む、請求項１１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項17】

各非同一の核酸はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含む、請求項１１に記載の核酸ライブラリ。

【請求項18】

アンプリコンライブラリであって、該アンプリコンライブラリは複数の非同一のＤＮＡ分子含み、各非同一のＤＮＡ分子は増幅産物の集団中に存在し、各非同一のＤＮＡ分子は異なるｇＲＮＡ配列をコードし、各ｇＲＮＡ配列は真核生物の遺伝子に相補的な標的ドメインを含み、および複数の非同一のＤＮＡ分子の少なくとも８０％は、アンプリコンライブラリ中の非同一のＤＮＡ分子の各々について平均頻度の２倍以内の量でアンプリコンライブラリにそれぞれ存在する、アンプリコンライブラリ。

【請求項19】

各非同一のＤＮＡ分子は、３０％〜７０％のＧＣ塩基含有量を有する、請求項１８
に記載のアンプリコンライブラリ。

【請求項20】

ｇＲＮＡは単一のｇＲＮＡまたは二重のｇＲＮＡである、請求項１８に記載のアンプリ
コンライブラリ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１６年１１月９日に出願された米国仮出願第６２／４１９，８８１号；２０１６年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／４１１，３８８号；２０１６年９月１３日に出願された米国仮出願第６２／３９３，９４８号；２０１６年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／３８２，１９１号；および、２０１６年８月２２日に出願された米国仮出願第６２／３７８，１３４号の利益を主張し、その各々は、参照によってその全体が本明細書に組込まれる。

【0002】

配列表

【0003】

本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１７年４月４日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、４４８５４−７２７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔとファイル名であり、１３，５６７バイトのサイズである。

【背景技術】

【0004】

合成生物学の基礎は設計、構築、および試験プロセス、すなわち、これらの特定用途向けの経路と生物体の迅速かつ手軽な生成と最適化のためにＤＮＡがアクセス可能であることを要求する反復するプロセスである。設計段階では、ＤＮＡを構成するＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧのヌクレオチドは、対象の領域を含む様々な配列へと組み立てられ、各配列変異体が試験される特定の仮説を表す。こうした変異体配列は、進化生物学から始まり、遺伝子、ゲノム、トランスクリプトーム、およびプロテオームを構築する配列の全体性に関係する概念である、配列空間の部分集合を表す。標的ゲノム編集の文脈において、遺伝子、遺伝子クラスタ、経路、または全ゲノムの酵素編集を特異的に方向付けるための、非常に正確かつ均一な核酸ライブラリの迅速な生成への必要性が存在する。

【0005】

＜引用による組み込み＞
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示される程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【発明の概要】

【0006】

本明細書で提供されるのは、非常に正確な核酸ライブラリの効率的なデノボ合成およびスクリーニングのためのシステム、方法、および組成物である。本明細書で記載される核酸ライブラリは、特異的に遺伝子、遺伝子クラスタ、生物学的経路、または全ゲノムを標的とし編集するための核酸を含む。

【0007】

本明細書で提供されるのは核酸ライブラリであり、ここで、核酸ライブラリは、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子を含み、各非同一のＤＮＡ分子は異なるｇＲＮＡ配列をコードし、および、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子の少なくとも約８０％が、ライブラリ中の非同一のＤＮＡ分子の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリにそれぞれ存在する。本明細書で提供されるのは、各々の非同一のＤＮＡ分子が約２０％から約８５％のＧＣ塩基含有量を有する核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、各々の非同一のＤＮＡ分子が約３０％から約７０％のＧＣ塩基含有量を有する核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、核酸ライブラリであり、ここで、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子の少なくとも約９０％は、ライブラリ中の非同一のＤＮＡ分子の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリにそれぞれ存在する。本明細書で提供されるのは、核酸ライブラリであり、ここで、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子の少なくとも９９％は、ライブラリ中の非同一のＤＮＡ分子の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリにそれぞれ存在する。本明細書で提供されるのは、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子が少なくとも２０００の非同一のＤＮＡ分子含む核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子は少なくとも３５００の非同一のＤＮＡ分子含む核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子が少なくとも１００，０００の非同一のＤＮＡ分子含む核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、各非同一のＤＮＡ分子が最大２００の塩基の長さを含む核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、各非同一のＤＮＡ分子が約１００〜約２００の塩基の長さを含む核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子は、生物学的経路において、遺伝子を標的とするｇＲＮＡ配列をコードする非同一のＤＮＡ分子を含む、核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子は、全ゲノムにおいて、遺伝子を標的とするｇＲＮＡ配列をコードする非同一のＤＮＡ分子を含む、核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡは単一のｇＲＮＡまたは二重のｇＲＮＡである核酸ライブラリである。

【0008】

本明細書で提供されるのは、核酸ライブラリあり、ここで、核酸ライブラリは少なくとも２０００の非同一の核酸を含み、各非同一の核酸は異なるｓｇＲＮＡ配列をコードし、各ｓｇＲＮＡ配列は真核生物の遺伝子に相補的な標的ドメインを含み、および、少なくとも２０００の非同一の核酸の少なくとも約８０％は、ライブラリ中の非同一の核酸の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリに存在する。本明細書で提供されるのは、各非同一の核酸が約２０％から約８５％のＧＣ塩基含有量を有する核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、各非同一の核酸が約３０％から約７０％のＧＣ塩基含有量を有する核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは核酸ライブラリであり、少なくとも２０００の非同一の核酸の少なくとも約９０％が、ライブラリ中の非同一の核酸の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリに存在する。本明細書で提供されるのは、核酸ライブラリであり、少なくとも２０００の非同一の核酸の少なくとも９９％が、ライブラリ中の非同一の核酸の各々について平均頻度の２倍以内の量で核酸ライブラリに存在する。本明細書で提供されるのは、各非同一の核酸が最大２００の塩基の長さを含む核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、各々非同一の核酸が約１００〜約２００の塩基の長さを含む核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、少なくとも２０００の非同一の核酸が、生物学的経路において、遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ配列をコードする非同一の核酸含む核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、少なくとも２０００の非同一の核酸が、全ゲノムにおいて、遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ配列をコードする非同一の核酸含む核酸ライブラリである核酸ライブラリである。本明細書で提供されるのは、各非同一の核酸がＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む核酸ライブラリである。

【0009】

本明細書で提供されるのは、アンプリコンライブラリであり、ここで、アンプリコンライブラリは複数の非同一のＤＮＡ分子含み、各非同一のＤＮＡは増幅産物の集団中に存在し、各非同一のＤＮＡ分子は異なるｇＲＮＡ配列をコードし、および複数の非同一のＤＮＡ分子の少なくとも約８０％は、ライブラリ中の非同一のＤＮＡ分子の各々について平均頻度の２倍以内の量でアンプリコンライブラリにそれぞれ存在する。本明細書で提供されるのは、各非同一のＤＮＡ分子が約３０％から約７０％のＧＣ塩基含有量を有するアンプリコンライブラリである。本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡが単一のｇＲＮＡまたは二重のｇＲＮＡであるアンプリコンライブラリである。

【0010】

本明細書で提供されるのは、細胞ライブラリであり、ここで、細胞ライブラリは複数の細胞集団含み、細胞集団の各々は異なるｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子を含み、各ｇＲＮＡ配列は、遺伝子を結合するための標的領域を含み、細胞集団の少なくとも１５％が遺伝子の発現において少なくとも２倍の枯渇を有する。本明細書で提供されるのは、少なくとも４５％の細胞集団が、遺伝子の発現において少なくとも２倍の枯渇を有する細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡが単一のｇＲＮＡまたは二重のｇＲＮＡである細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、複数の細胞集団が単一の遺伝子当たり、少なくとも３つの様々なｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、複数の細胞集団が単一の遺伝子当たり、少なくとも５つの様々なｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、複数の細胞集団が少なくとも２０００の細胞集団を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、複数の細胞集団が生物学的経路において、ｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、複数の細胞集団が全ゲノムにおいて、ｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、ゲノムが、シロイヌナズナ、線虫、イヌ科、コナミドリムシ、ゼブラフィッシュ、細胞性粘菌、キイロショウジョウバエ、大腸菌、ヒト、アカゲザル、ハツカネズミ、アナウサギ、ドブネズミ、 出芽酵母、またはイノシシである、細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、細胞集団の各々が原核細胞を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、細胞集団の各々が真核細胞を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、細胞集団の各々が哺乳類細胞を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、細胞集団の各々が外因性のヌクレアーゼ酵素をさらに含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、ＤＮＡ分子がベクター配列をさらに含む細胞ライブラリである。

【0011】

本明細書で提供されるのは、細胞ライブラリであり、ここで、細胞ライブラリは複数の細胞集団含み、細胞集団の各々は異なるｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子を含み、各ｇＲＮＡ配列は、遺伝子を結合するための標的領域を含み、および、細胞集団の最大で２０％が遺伝子の発現においてゼロまたは負の枯渇を有する。本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡが単一のｇＲＮＡまたは二重のｇＲＮＡである細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、複数の細胞集団が単一の遺伝子当たり、少なくとも３つの様々なｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、複数の細胞集団が単一の遺伝子当たり、少なくとも５つの様々なｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、複数の細胞集団が少なくとも２０００の細胞集団を含む細胞ライブラリである。本明細書で提供されるのは、複数の細胞集団が少なくとも１００００の細胞集団を含む細胞ライブラリである。

【0012】

本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法であって：その方法は、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子のために予め決められた配列を提供する工程であって、各非同一のＤＮＡ分子がｇＲＮＡをコードする工程；少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子を合成する工程；および、ｇＲＮＡライブラリを生成するために少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子を転写する工程であって、ここで、ｇＲＮＡライブラリ中のｇＲＮＡの少なくとも約７５％が、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子について予め決められた配列と比較して誤りがない工程を含む、方法。本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法であって、ここで、転写工程の前に、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子を細胞に移す工程をさらに含む。本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法であって、ここで、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子によってコードされたｇＲＮＡの少なくとも９６％が、ｇＲＮＡライブラリ中に存在する。本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法であって、ここで、ｇＲＮＡライブラリ中のｇＲＮＡの少なくとも８７％が、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子について予め決められた配列と比較して誤りがない。本明細書で提供されるのは、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子をベクターに挿入する工程をさらに含む、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。本明細書で提供されるのは、少なくとも５００の非同一のＤＮＡ分子を生物の細胞に移す工程をさらに含む、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。本明細書で提供されるのは、生物が、シロイヌナズナ、線虫、イヌ科、コナミドリムシ、ゼブラフィッシュ、細胞性粘菌、キイロショウジョウバエ、大腸菌、ヒト、アカゲザル、ハツカネズミ、アナウサギ、ドブネズミ、出芽酵母、またはイノシシである、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。本明細書で提供されるのは、各非同一のＤＮＡ分子が単一のｇＲＮＡまたは二重のｇＲＮＡをコードする、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。

【0013】

本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法であって：その方法は、複数の非同一のＤＮＡ分子について予め決められた配列を提供する工程であって、ここで、各非同一のＤＮＡ分子がｇＲＮＡをコードする工程；核酸伸長反応のための遺伝子座のクラスタを含む表面を提供する工程；各非同一のＤＮＡ分子が表面から伸長している、複数の非同一のＤＮＡ分子を合成する工程；および、複数の非同一のＤＮＡ分子を細胞に移す工程を含む、方法。本明細書で提供されるのは、各々のクラスタが約５０〜約５００の遺伝子座を含む、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。本明細書で提供されるのは、各非同一のＤＮＡ分子が最大約２００の塩基の長さを含む、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。本明細書で提供されるのは、各非同一のＤＮＡ分子が単一のｇＲＮＡまたは二重のｇＲＮＡをコードする、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。本明細書で提供されるのは、細胞が原核細胞である、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。本明細書で提供されるのは、細胞が真核細胞である、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。本明細書で提供されるのは、真核生物が哺乳動物細胞である、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。本明細書で提供されるのは、細胞の各々が外因性のヌクレアーゼ酵素である、ｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A】以下の構成要素を含んでいるクラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）複合体を例示する：ＰＡＭ、標的配列、ＣＡＳ９酵素、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびドナーＤＮＡ。

【図1B】以下の構成要素を含んでいるクラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）複合体を例示する：非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）経路のためのＰＡＭ、標的配列、ＣＡＳ９酵素、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびドナーＤＮＡ。

【図2】ｇＲＮＡライブラリの設計、合成、クローニング、パッケージング、スクリーニング、および分析を含む、ｇＲＮＡライブラリ・スクリーニング・ワークフローを例示する。

【図3】次のものを含むライブラリを構築するための、ｇＲＮＡライブラリ・スクリーニング・ワークフローを例示する：アレイ上のオリゴ核酸ライブラリを合成、オリゴ核酸を増幅およびベクター内への移動、およびｇＲＮＡ発現のための発現ライブラリの形成。

【図4A】様々なｇＲＮＡの図である。塩基対合領域、ｄＣａｓ９ハンドル（ｄＣａｓ９ ｈａｎｄｌｅ）、および化膿性連鎖球菌の終結領域を有する、ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）の図である。

【図4B】様々なｇＲＮＡの図である。ｓｇＲＮＡのみの図である。

【図4C】様々なｇＲＮＡの図である。ｄｇＲＮＡのみの図である。

【図5A】鋳型鎖標的構成におけるｓｇＲＮＡ配列の図である。

【図5B】非鋳型鎖標的構成におけるｓｇＲＮＡ配列の図である。

【図6A】転写される時、ヘアピン二次構造（ｈａｉｒｐｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成するｇＲＮＡ配列をもたらす、Ｔ７プロモーターを有するｇＲＮＡ配列の図である。

【図6B】転写される時、ヘアピン二次構造を形成しないｇＲＮＡ配列をもたらす、Ｔ７プロモーターを有するｇＲＮＡ配列の図である。

【図7】標的ＤＮＡのインビトロのＣａｓ９媒介切断のためのワークフローを示す。

【図8】コンピューターシステムの例を例示する。

【図9】コンピューターシステムの例示的構造を示すブロック図である。

【図10】複数のコンピューターシステム、複数の携帯電話および個人用携帯情報端末、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）を組み込むように構成されたネットワークを実証する図である。

【図11】共有仮想アドレスメモリ空間を用いる、マルチプロセッサコンピューターシステムのブロック図である。

【図12】４つのｓｇＲＮＡ設計を示す。図１２は、出現順に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２０、１５、２１、１５、２２、１５、４１、１５、４２、および４３をそれぞれ開示する。

【図13】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14A】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14B】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14C】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14D】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14E】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14F】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14G】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14H】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14I】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図14J】Ｘ軸上にヌクレオチド塩基およびＹ軸上に蛍光性の単位を有する、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ読み取り値のプロットである。

【図15】２５６のクラスタの画像であり、各クラスタは、そこから伸長するオリゴ核酸を有する１２１の遺伝子座を有する。

【図16A】各クラスタが１２１のオリゴ核酸を有する、２４０のクラスタからの２９，０４０の特有のオリゴ核酸の合成からのプレートにわたるオリゴ核酸の表示（オリゴ核酸の頻度ｖｓ吸収度）のプロットである。

【図16B】ボックスによって同定された対照クラスタ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ）を有する各個々のクラスタにわたるオリゴ核酸頻度ｖｓ吸収度の測定値のプロットである。

【図17】４つの個々のクラスタにわたる、オリゴ核酸頻度ｖｓ吸収度の測定値のプロットである。

【図18A】各クラスタが１２１のオリゴ核酸を有する、２４０のクラスタからの２９，０４０の特有のオリゴ核酸の合成からのプレートにわたる、エラー率ｖｓ頻度のプロットである。

【図18B】ボックスによって同定された対照クラスタを有する各個々のクラスタにわたる、オリゴ核酸エラー率ｖｓ頻度の測定値のプロットである。

【図19】４つのクラスタにわたる、オリゴ核酸エラー率ｖｓ頻度の測定値のプロットである。

【図20】オリゴ核酸当たりのパーセントの測定としてのＧＣ含有量ｖｓオリゴ核酸の数のプロットである。

【図21】２つの様々なポリメラーゼでのＰＣＲからの結果のプロットを提供する。各図は、「観察頻度」（１００，０００当たりの測定された０〜３５）ｖｓオリゴ核酸の数（０〜２０００）を示す。

【図22】記録された増幅後のオリゴ核酸の集団均一性の定量化を伴う図を提供する。

【図23】配列ドロップアウト（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｒｏｐｏｕｔｓ）に対する過度の増幅の影響のプロットを示す。

【図24】１０，０００のｓｇＲＮＡオリゴ核酸のＣＲＩＳＰＲライブラリからの、回復されたオリゴ核酸の配列決定からの結果を示す。

【図25】１０１，０００のｓｇＲＮＡ オリゴ核酸のＣＲＩＳＰＲライブラリからの、回復されたオリゴ核酸の配列決定からの結果を示す。

【図26A】少なくとも２倍の枯渇を伴うｓｇＲＮＡのパーセンテージのグラフ示す。

【図26B】ゼロまたは負の枯渇を伴うｓｇＲＮＡのパーセンテージのグラフを示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本明細書で提供されるのは、非常に正確なガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）ライブラリの効率的な合成およびスクリーニングのための、システム、方法、および組成物である。本明細書にて記載されるデノボ合成方法は、標的遺伝子編集用の酵素システムに取り込むために、ｇＲＮＡの大規模なライブラリの迅速で非常に正確な生成を提供する。

【0016】

定義
本開示の全体にわたって、様々な実施形態は範囲形式で提示される。範囲形式での記載は単に利便性と簡潔さのためのものに過ぎず、任意の実施形態の範囲に対する確固たる限定として解釈されてはならないということを理解されたい。これに応じて、範囲の記載は、文脈で別段の定めのない限り、すべての可能性のある下位範囲と、下限の単位の小数第２位までのその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられなければならない。例えば、１乃至６などの範囲の記載は、１乃至３、１乃至４、１乃至５、２乃至４、２乃至６、３乃至６などの下位範囲と、例えば、１．１、２、２．３、５、および５．９のその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられなければならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。これらの介入する範囲の上限および下限は、より小さな範囲内に独立して含まれてもよく、また、定められた範囲内のあらゆる具体的に除外された限度に従って、本発明内に包含される。定められた範囲が上限および下限の１つ又はその両方を含む場合、これらの含まれた上限および下限のいずれかまたは両方を除く範囲もまた、文脈が明らかに他に指示しない限り、本発明内に包含される。

【0017】

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためにあり、任意の実施形態を制限することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味を明白に示すものでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用されるとき、明示される特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、そのおよび／またはその群の存在や添加を妨げない。本明細書で使用されるように、用語「および／または」は、関連する列挙された項目の１つ以上のあらゆる組み合わせを含む。

【0018】

別段の定めのない限り、あるいは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用されるように、数あるいは数の範囲に関連して用語「約」とは、明示された数とその数＋／−１０％、あるいはある範囲の列挙された値について列挙された下限の１０％以下と列挙された１０％以上を意味する。

【0019】

本明細書において言及される用語「ｇＲＮＡ」は、ガイドＲＮＡは配列を指し、単一および二重のガイドＲＮＡ配列の両方を包含する。本明細書では、具体的に明示されるか文脈から明らかでない限り、本明細書において言及される用語「ｄｇＲＮＡ」は二重のガイドＲＮＡ配列を指す：部分的に相補的ＲＮＡである、ｃｒＲＮＡ（標的配列への相補的なシード領域を含むスペーサー配列）および個別のｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化配列）。本明細書では、具体的に明示されるか文脈から明らかでない限り、本明細書において言及される用語「ｓｇＲＮＡ」は、縮合ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含む単一ガイドＲＮＡ配列を指す。

【0020】

本明細書では、具体的に明示されるか文脈から明らかでない限り、用語「オリゴ核酸」および「核酸」は、一本鎖の分子と同様に、二本または三本鎖の核酸も包含する。二本または三本鎖の核酸において、核酸鎖は同一の広がりをもつ必要はない（つまり、二本鎖の核酸は、両方の鎖の全長に沿って二本鎖である必要はない）。特に明記されない限り、核酸配列は提供される時、５’から３’の方向へと列挙される。本明細書に記載される方法は、単離された核酸の生成を提供する。本明細書に記載される方法はさらに、単離精製された核酸の生成を提供する。本明細書で言及される「オリゴ核酸」および「核酸」は、少なくとも、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、またはより多くの塩基の長さを含むことができる。

【0021】

本明細書では、具体的に明示されるか文脈から明らかでない限り、本明細書で言及される用語「アンプリコン」は、増幅反応物を指す。

【0022】

本開示は、別段の定めのない限り、当該技術の範囲内である従来の分子生物学的技術を採用する。別段の定めのない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的な用語は、これらの発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

【0023】

ｇＲＮＡライブラリ・スクリーニング
本明細書で提供されるのは、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−酵素複合体中での取り込みのための、非常に正確なｇＲＮＡライブラリを設計、構築、およびスクリーニングするための方法である。例えば、図１Ａ−ＡＢを参照する。本明細書に記載された方法を用いて生成されたｇＲＮＡライブラリは、ｓｇＲＮＡライブラリおよびｄｇＲＮＡライブラリの両方を含む。本明細書で提供されるのは、結果としてもたらされるライブラリで、予め決められたｇＲＮＡの高度な表示をもたらす非常に均一な合成のための方法である。設計段階では、ｇＲＮＡが設計される。図２を参照する。設計戦略は、遺伝子に及ぶｇＲＮＡの設計が挙げられるが、これに限定されない。所望のワークフローに応じて、デノボ合成された核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ塩基である。

【0024】

デノボ合成されたＤＮＡの場合、核酸を含むライブラリは合成され、ここで合成された各核酸は、転写産物としてのｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）配列をコードするＤＮＡ配列である。いくつかの例では、合成された核酸はその後、発現ベクターへと挿入される。１つの例示的なワークフローでは、合成された核酸はウイルスベクターへと挿入され、細胞へと形質導入するためにパッケージされ、続いてスクリーニングおよび分析される。図２を参照。典型的な細胞は、限定することなく、原核細胞および真核細胞を含む。典型的な真核細胞は、限定することなく、動物、植物および真菌の細胞を含む。典型的な動物細胞は、限定することなく、昆虫、魚、および哺乳動物の細胞を含む。典型的な哺乳動物細胞は、マウス、ヒト、および霊長類の細胞を含む。試験される典型的な細胞機能は、限定することなく、細胞増殖における変化、遊走／接着、代謝活性、および細胞シグナル伝達活性を含む。デノボ合成されたＲＮＡの場合、ｇＲＮＡそれ自身が合成され、細胞へのトランスフェクションなどの下流の適用に利用可能である。

【0025】

オリゴ核酸は、アレイ（３０１）上で伸長するために、クラスタ（３０３）の位置（「遺伝子座」）内で合成されることができる。図３を参照する。そのような構成は、クラスタ化された遺伝子座構成のないプレート全体にわたって合成されたオリゴ核酸の増幅産物と比較した時、合成されたオリゴ核酸のオリゴ核酸からの改善された産物のオリゴ核酸表示−“アンプリコン”と呼ばれる−を提供する。いくつかの例では、一般的に「ドリフト」と呼ばれる、重度のＧＣ含有量を有するオリゴ核酸を有する多くのオリゴ核酸集団の繰り返された合成により、増幅反応物におけるＧＣの低いまたはＧＣの高いアンプリコンの提示不足により、単一のクラスタ内で合成されたオリゴ核酸の増幅（３１０）は、表示における負の効果に対抗する。いくつかの例では、本明細書に記載される単一のクラスタは、５０−１０００、７５−９００、１００−８００、１２５−７００、１５０−６００、２００−５００、または３００−４００の別々の遺伝子座を含む。いくつかの例では、単一のクラスタは、５０−５００別々の遺伝子座を含む。いくつかの例では、遺伝子座は、スポット、ウェル、マイクロウェル、チャネル、またはポストである。いくつかの例では、各クラスタは、同一の配列を有するオリゴ核酸の伸長を支持する別個の特徴の、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはより多くの冗長性を有する。

【0026】

本明細書で提供されるのは、発現ベクターに挿入するためのｇＲＮＡライブラリである。図３におけるワークフローを続けて見ると、アレイ（３０１）は、オリゴ核酸合成および伸長のための遺伝子座の多数のクラスタ（３０３）を含む。デノボＤＮＡは合成されプレートから取り除かれて、オリゴ核酸の集団（３０５）（例えばｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）を形成し、これは、増幅（３１０）を受けてベクター（３３０）の挿入のための増幅したオリゴ核酸のライブラリ（３２０）を形成し、合成されたＤＮＡ（３３５）を含むベクターのライブラリを形成する。一旦細胞内に入ると、ＤＮＡはｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）に転写され、ゲノム編集レジーム（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅ）（例えば、Ｃａｓ９に基づいたシステム）との結合に利用可能となる。細胞は、編集酵素（例えばＣａｓ９）の自然発現または異所的発現を有してもよい。編集酵素（例えばＣａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡ切断活性、あるいは、ニッキング、塩基交換、または配列交換活性などの修飾された活性を有してもよい。ベクターへの挿入のために合成されたＤＮＡは、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはそれらの断片を含み得る。

【0027】

本明細書に開示される核酸ライブラリを挿入するための発現ベクターは、真核生物または原核生物の発現ベクターを含む。典型的な発現ベクターは、限定することなく、哺乳動物の発現ベクター：ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＮＥＯ−ＮＨ２−ＰＰＴ−３ＸＦＬＡＧ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＮＥＯ−ＣＯＯＨ−３ＸＦＬＡＧ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＰＵＲＯ−ＮＨ２−ＧＳＴ−ＴＥＶ、ｐＳＦ−ＯＸＢ２０−ＣＯＯＨ−ＴＥＶ−ＦＬＡＧ（Ｒ）−６Ｈｉｓ、ｐＣＥＰ４ ｐＤＥＳＴ２７、ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｕｂ−ＫｒＹＦＰ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＭＤＶ−ｄａＧＦＰ、ｐＥＦ１ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１ベクター、ｐＥＦ１ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏベクター、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＭＤＶ−Ｈｙｇｒｏ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ、ｐＭＣＰ−タグ（ｍ）、およびｐＳＦ−ＣＭＶ−ＰＵＲＯ−ＮＨ２−ＣＭＹＣ；細菌性の発現ベクター：ｐＳＦ−ＯＸＢ２０−ＢｅｔａＧａｌ、ｐＳＦ−ＯＸＢ２０−Ｆｌｕｃ、ｐＳＦ−ＯＸＢ２０、およびｐＳＦ−Ｔａｃ；植物の発現ベクター：ｐＲＩ １０１−ＡＮ ＤＮＡおよびｐＣａｍｂｉａ２３０１；および、酵母発現ベクター：ｐＴＹＢ２１およびｐＫＬＡＣ２、および昆虫のベクター：ｐＡｃ５．１／Ｖ５−Ｈｉｓ ＡおよびｐＤＥＳＴ８を含む。

【0028】

本明細書に記載される方法によって合成されたデノボオリゴ核酸ライブラリは、細胞内で発現され得る。いくつかの例では、細胞は疾患状態と関連している。例えば、疾患状態に関連付けられる細胞として、これらに限定されないが、被験体からの細胞株、組織サンプル、初代細胞、被験体からの増殖された培養細胞、またはモデルシステムにおける細胞が挙げられる。いくつかの例では、モデルシステムは、植物または動物のシステムである。いくつかの例では、デノボオリゴ核酸ライブラリは、細胞活動における変化について評価するために細胞内で発現され得る。典型的な細胞活性として、これらに限定されないが、増殖、周期進行、細胞死、接着、遊走、繁殖、細胞シグナル伝達、エネルギー産生、酸素利用、代謝活性、および老化、遊離基損傷に対する反応、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0029】

本明細書で提供されるのは、遺伝子あたり複数の非同一のｇＲＮＡを含むｇＲＮＡライブラリ（または、転写された時にｇＲＮＡライブラリをもたらすＤＮＡライブラリ）を合成する方法である。ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡをコードし得る。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、遺伝子あたり少なくとも、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多い非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、１以上の遺伝子を標的にする。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００よりも多い遺伝子を標的にする。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、約１−１００、２−９５、５−９０、１０−８５、１５−８０、２０−７５、２５−７０、３０−６５、３５−６０、または４０−５０の遺伝子を標的にする。いくつかの例では、本明細書に記載されるｇＲＮＡライブラリは、経路内の遺伝子を標的にする。典型的な経路として、これらに限定されないが、代謝、細胞死、細胞周期進行、免疫細胞活性化、炎症反応、血管新生、リンパ球新生、低酸素ストレス応答、酸化ストレス応答、または細胞接着、および細胞遊走経路が挙げられる。

【0030】

本明細書で記載されるようなｇＲＮＡライブラリを合成するための方法は、ゲノムの一部への相補的な塩基対合領域、ゲノム標的領域を有する非同一のｇＲＮＡの合成を提供し得る。ゲノム標的領域は、エクソン、イントロン、コーディング、または非コーディングの配列を含んでもよい。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、全ゲノム中の遺伝子の少なくともまたは約５％に相補的な塩基対合領域を相対的に有する非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、全ゲノム中の遺伝子の少なくともまたは約８０％に相補的な塩基対合領域を相対的に有する非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、全ゲノム中の遺伝子の少なくともまたは約９０％に相補的な塩基対合領域を相対的に有する非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、全ゲノム中の遺伝子の少なくともまたは約９５％に相補的な塩基対合領域を相対的に有する非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、全ゲノム中の遺伝子の少なくともまたは約１００％に相補的な塩基対合領域を相対的に有する非同一のｇＲＮＡを含む。

【0031】

本明細書で提供されるのは、様々な細胞にわたる遺伝子の少なくとも２倍の枯渇を有するｇＲＮＡをもたらす、本明細書に記載される方法によって合成されたｇＲＮＡライブラリである。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、細胞内または複数の細胞集団内に存在する時に、少なくともあるいは、約１０％、１２％、１５％、１６％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、またはより多くの少なくとも２倍の遺伝子の枯渇を提供するｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、遺伝子は必須遺伝子、つまり、細胞生存のために重大な遺伝子である。例示的な必須遺伝子は、これらに限定されないが、ＰＣＮＡ、ＰＳＭＡ７、ＲＰＰ２１、およびＳＦ３Ｂ３が挙げられる。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、細胞内に存在する時に、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、または６倍よりも多い遺伝子の枯渇を提供するｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、細胞内または複数の細胞集団内に存在する時に、最大で５％、１０％、１２％、１５％、または２０％の遺伝子のゼロまたは負の枯渇を有するｇＲＮＡ含む。いくつかの例では、複数の細胞集団は、少なくともまたは約２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１２０００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、または３００００よりも多い細胞集団を含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、複数の遺伝子について、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、または６倍よりも多い枯渇を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、複数の遺伝子について少なくとも２倍の枯渇を提供する平均で少なくともまたは約４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または９０％よりも多いｇＲＮＡを含む。そのような遺伝子欠失プロファイルを提供するｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡでありえる。

【0032】

本明細書で提供されるのは、オリゴ核酸の非常に均一なライブラリを合成する方法である。場合によっては、９０％よりも多い合成されたオリゴ核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）が、核酸ライブラリのためのオリゴ核酸表示について、平均の４倍以内で表わされる。場合によっては、９０％よりも多いオリゴ核酸が、ライブラリのためのオリゴ核酸表示について平均の２倍以内で表わされる。場合によっては、９０％よりも多いオリゴ核酸が、ライブラリのためのオリゴ核酸表示について平均の１．５倍以内で表わされる。場合によっては、８０％よりも多いオリゴ核酸が、ライブラリのためのオリゴ核酸表示について平均の１．５倍以内で表わされる。

【0033】

本明細書に記載される方法によってデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、予め決められた配列と比較して、高い割合の正確な配列を含む。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、オリゴ核酸について予め決められた配列と比較して、７０％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、オリゴ核酸について予め決められた配列と比較して、７５％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、オリゴ核酸について予め決められた配列と比較して、８０％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、オリゴ核酸について予め決められた配列と比較して、８５％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、オリゴ核酸について予め決められた配列と比較して、９０％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、オリゴ核酸について予め決められた配列と比較して、９５％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、オリゴ核酸について予め決められた配列と比較して、１００％を超える正確な配列を有する。

【0034】

いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、増幅反応後のオリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、７０％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、増幅反応後のオリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、７５％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、増幅反応後のオリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、８０％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、増幅反応後のオリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、８５％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、増幅反応後のオリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、９０％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、増幅反応後のオリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、９５％を超える正確な配列を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、増幅反応に続くオリゴ核酸のための予め決められた配列と比較すると、１００％の正確な配列を有する。

【0035】

いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、細胞内に移された時、オリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、８０％を超える正確な配列をもたらす。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、細胞内に移された時、オリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、８５％を超える正確な配列をもたらす。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、細胞内に移された時、オリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、９０％を超える正確な配列をもたらす。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、細胞内に移された時、オリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、９５％を超える正確な配列をもたらす。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、細胞内へ移された時、オリゴ核酸についての予め決められた配列と比較して、１００％正確な配列をもたらす。

【0036】

いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、細胞内へ移された時、８０％を超える配列表示をもたらす。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、細胞内へ移された時、９０％を超える配列表示をもたらす。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、細胞内へ移された時、９５％を超える配列表示をもたらす。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリは、細胞内へ移された時、１００％の配列表示をもたらす。

【0037】

本明細書に記載されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、ポリメラーゼ酵素および増幅試薬（例えば緩衝剤、リン酸塩、およびデオキシヌクレオチド三リン酸）の添加を有する増幅反応を受けてもよい。いくつかの例では、デノボオリゴ核酸ライブラリは、少なくともまたは約６、８、１０、１５、２０、または２０よりも多いサイクルのＰＣＲによって増幅される。いくつかの例では、デノボオリゴ核酸ライブラリは、約６〜２０、７〜１８、８〜１７、９〜１６または１０〜１５のサイクルの範囲でＰＣＲによって増幅される。いくつかの例では、デノボオリゴ核酸ライブラリは、約１５のサイクルのＰＣＲによって増幅される。

【0038】

いくつかの例では、デノボオリゴ核酸ライブラリの増幅は、ＤＮＡ分子のアンプリコンライブラリを提供する。いくつかの例では、アンプリコンライブラリは、ｇＲＮＡ配列をコードする非同一の核酸を含む。いくつかの実例では、ｇＲＮＡ配列はｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡである。

【0039】

いくつかの例では、デノボオリゴ核酸ライブラリは非同一の核酸を含み、各非同一の核酸はＤＮＡ分子を含む。いくつかの例では、ＤＮＡ分子の数は、約５００、２０００、３５００、または３５００より多い分子である。いくつかの例では、ＤＮＡ分子の数は、少なくともまたは約、２５０、５００、１０００、１２５０、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１５０００、２００００、５００００、１０００００、２５００００、７５００００、１００００００、または１００００００より多い分子である。いくつかの例では、ＤＮＡ分子の数は最大で、２５０、５００、１０００、１２５０、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１５０００、２００００、５００００、１０００００、２５００００、５０００００、７５００００、１００００００、または１００００００よりも多い分子である。いくつかの例では、ＤＮＡ分子はｇＲＮＡ配列をコードする。いくつかの実例では、ｇＲＮＡ配列はｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡである。

【0040】

いくつかの例では、デノボオリゴ核酸ライブラリは非同一の核酸を含み、各非同一の核酸はＲＮＡ分子を含む。いくつかの例では、ＲＮＡ分子の数が約２０００の分子である。いくつかの例では、ＲＮＡ分子の数は、少なくともまたは約、２５０、５００、１０００、１２５０、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１５０００、２００００、５００００、１０００００、２５００００、７５００００、１００００００、または１００００００よりも多い分子である。いくつかの例では、ＲＮＡ分子の数は、最大で、２５０、５００、１０００、１２５０、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１５０００、２００００、５００００、１０００００、２５００００、５０００００、７５００００、１００００００、または１００００００よりも多い分子である。いくつかの例では、ＲＮＡ分子はｇＲＮＡ配列をコードする。いくつかの実例では、ｇＲＮＡ配列はｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡである。

【0041】

本明細書で提供されるのは、増幅後の高い均一性を有するデノボオリゴ核酸ライブラリである。いくつかの例では、本明細書に記載されるデノボオリゴ核酸ライブラリ内の８０％より多くのオリゴ核酸は、増幅後のライブラリ全体について、平均表示の少なくとも約１．５倍以内で表わされる。いくつかの例では、本明細書に記載されるデノボオリゴ核酸ライブラリ内の９０％より多くのオリゴ核酸は、増幅後のライブラリ全体について、平均表示の少なくとも約１．５倍以内で表わされる。いくつかの例では、本明細書に記載されるデノボオリゴ核酸ライブラリ内の８０％より多くのオリゴ核酸は、増幅後のライブラリ全体について、平均表示の少なくとも約２倍以内で表わされる。いくつかの例では、本明細書に記載されるデノボオリゴ核酸ライブラリ内の８０％より多くのオリゴ核酸は、増幅後のライブラリ全体について、平均表示の少なくとも約２倍以内で表わされる。

【0042】

本明細書に記載され方法を用いるデノボ合成されたオリゴ核酸の非増幅集団は、非同一のオリゴ核酸配列の数を変えることができる。いくつかの例では、非同一のオリゴ核酸配列の数は、約２０００−１００００００、３０００−９０００００、４０００−８０００００、５０００−７０００００、６０００−６０００００、７０００−５０００００、８０００−４０００００、９０００−３０００００、１００００−２０００００、１１０００−１０００００、１２０００−７５０００、１４０００−６００００、および２００００−５００００の配列の範囲である。場合によっては、非同一のオリゴ核酸配列の数は、約５０−２０００、７５−１８００、１００−１７００、１５０−１６００、２００−１５００、２５０−１４００、３００−１３００、４００−１２００、５００−１１００、６００−１０００、７００−９００の配列の範囲である。いくつかの例では、非同一のオリゴ核酸配列の数は２０００の配列である。いくつかの例では、非同一のオリゴ核酸配列の数は１００００００よりも多い配列である。いくつかの例では、非同一のオリゴ核酸配列の数は、少なくとも、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、３０００、５０００、７０００、１００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、５０００００、７０００００、１００００００、１０００００００、１０００００００００、または１０００００００００より多くの配列である。いくつかの例では、非同一のオリゴ核酸配列の数は、最大で、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、３０００、５０００、７０００、１００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、５０００００、７０００００、１００００００、または１００００００より多くの配列である。いくつかの例では、非同一のオリゴ核酸配列の数は、最大で、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、３０００、５０００、７０００、１００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、５０００００、７０００００、および１００００００の配列である。

【0043】

非増幅集団のオリゴ核酸は、様々な量で存在する。いくつかの例では、非増幅集団のオリゴ核酸は、少なくともまたは約０．２５ｆｍｏｌ／ｍｇの量で存在する。いくつかの例では、非増幅集団のオリゴ核酸は、少なくともまたは約１ｆｍｏｌ／ｍｇの量で存在する。いくつかの例では、非増幅集団のオリゴ核酸は、少なくとも０．２５、１、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、または１０００ｆｍｏｌ／ｍｇよりも多い量で存在する。いくつかの例では、非増幅集団のオリゴ核酸は、最大で、０．２５、１、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、および１０００ｆｍｏｌ／ｍｇの量で存在する。

【0044】

本明細書で提供されるのは、非同一のオリゴ核酸のライブラリを合成するための方法であり、非同一のオリゴ核酸の配列長または平均の配列長は様々である。場合によっては、非同一のオリゴ核酸の配列長または平均配列長は、最大で１５０塩基である。場合によっては、非同一のオリゴ核酸の配列長または平均配列長は、約１００〜約２００の塩基の範囲である。いくつかの例では、非同一のオリゴ核酸の配列長または平均配列長は、少なくとも、３０、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、あるいは５００よりも多い塩基である。いくつかの例では、非同一のオリゴ核酸の配列長または平均配列長は、最大で、１５０、２００、２５０の、３００、３５０、４００、４５０、あるいは５００の塩基である。非同一のオリゴ核酸の例示的な配列長は、約２５〜約１５０、あるいは約５０〜約２００の塩基の範囲である。場合によっては、非同一のオリゴ核酸の配列長または平均配列長は、約１２５〜約２００、あるいは約１５０〜約２００の塩基の範囲である。

【0045】

ガイドＲＮＡ配列

【0046】

本明細書で提供されるのは、特定の標的核酸配列にゲノム配列編集酵素（例えばＣａｓ９）を向けるための、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列である。Ｃａｓ９酵素と複合したｓｇＲＮＡの例が図４Ａで例示され、単独の例が図４Ｂで例示される。ｇＲＮＡは、図４Ｃに例示されるような二重のガイドＲＮＡであってもよい。本明細書に開示されるガイド配列は、塩基対合領域を含む。塩基対合領域は、標的配列に結合するためのシード領域、および随意にスペーサー領域を含む。塩基対合領域は、長さが変わってもよい。例えば、塩基対合領域は、約１〜１０、１〜２０、２０〜２５、または１〜３０の塩基の長さを含んでもよい。いくつかの例において、塩基対合領域は、少なくとも、１０、１５、２０、２５、３０、または３０より多くの塩基の長さを含む。いくつかの例では、塩基対合領域は、少なくとも１０の塩基の長さのシード領域を含む。シード領域は、約８〜２０の塩基の長さを含み得る。いくつかの例では、シード領域は約１２の塩基の長さである。いくつかの例では、本明細書に記載される塩基対合領域は、転写中に鋳型鎖を標的とするように設計される（図５Ａ）。いくつかの例では、本明細書に記載される塩基対合領域は、転写中に非鋳型鎖を標的とするように設計される（図５Ｂ）。

【0047】

いくつかの例では、ｓｇＲＮＡの塩基対合領域の３’は、Ｃａｓ９に結合するためのＣａｓ９ハンドル領域である。いくつかの例では、Ｃａｓ９ハンドル領域は、ｄＣａｓ９酵素に結合するためのｄＣａｓ９ハンドル領域である。ハンドル領域は、長さが変わってもよい。例えば、ハンドル領域は、約１〜５０、２０〜４５、または１５〜６０の塩基の長さを含み得る。いくつかの例において、ハンドル領域は、少なくとも、３５、４０、４５、５０、または５０より多くの塩基の長さを含む。ハンドル領域は、約４２の塩基の長さを含み得る。

【0048】

いくつかの例では、ｓｇＲＮＡのハンドル領域の３’は、終結領域である。いくつかの例では、終結領域は化膿性連鎖球菌の終結領域である。いくつかの例では、終結領域は約４０の塩基の長さを含む。いくつかの例では、終結領域は約１０〜５０、２０〜６０、または３０〜５５の塩基の長さを含む。

【0049】

本明細書に記載されるｇＲＮＡ配列のための設計スキームは、ｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター領域５’上流の包含を含み得る。例示的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター領域として、これらに限定されないが、Ｔ３およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列が挙げられる。例えば、図６Ａは、Ｔ７ プロモーター領域がｇＲＮＡの５’上流にあり、結果としての転写されたｇＲＮＡが生成され、ここで、ｇＲＮＡがヘアピンを含む構成を示す。いくつかの構成では、ｇＲＮＡは、ヘアピン二次構造を形成する配列を欠くように設計される（図６Ｂ）。ヘアピン二次構造は、Ｃａｓ９ハンドルおよび／または終結領域内で欠いていることもある。

【0050】

本明細書で提供されるのは、ゲノム配列編集酵素（例えばＣａｓ９）を特定の標的核酸配列に向けるためのｄｇＲＮＡである。いくつかの例では、ライブラリはｄｇＲＮＡのための配列をコードするオリゴ核酸配列を含む。いくつかの例では、ライブラリは核酸を含み、ここで、合成された各核酸は、転写産物としてのｄｇＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列である。いくつかの例では、ライブラリは核酸を含み、ここで、合成された各核酸はＲＮＡ配列であり、ｄｇＲＮＡ自体は合成される。いくつかの例では、ｄｇＲＮＡライブラリは、別個のオリゴ核酸として合成されるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのためのオリゴ核酸配列を含む。いくつかの例では、オリゴ核酸は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを別々にコードする。いくつかの例では、オリゴ核酸は、転写された時に個別のｃｒＲＮＡ配列および個別のｔｒａｃｒＲＮＡ配列をもたらす単一の配列をコードする。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのための例示的な配列は、表１で見られる。

【0051】

【表1】

【0052】

本明細書に記載されるｇＲＮＡライブラリは、インビトロスクリーニングおよび分析のために使用され得る。そのような構成の例が図７で示され、標的の二本鎖のＤＮＡ配列がｇＲＮＡ配列およびＣａｓ９酵素と共にインキュベートする。その混合物は、二重鎖ＤＮＡ切断をもたらす。ＤＮＡ切断は、ゲノム要素の機能または発現において測定可能な変化をもたらす。本明細書に記載されるｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、当技術分野において既知の様々な方法で細胞に加えられ、これらの方法としては、限定されないが、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションが挙げられる。

【0053】

いくつかの例では、本明細書に記載されるｇＲＮＡライブラリは、インビボまたはエクスビボのスクリーニングおよび分析のために使用される。スクリーニングのための細胞は、生物体または細胞株から取られた初代細胞を含む。細胞は、原核生物（例えば、バクテリアおよび菌類）または真核生物（例えば、動植物）からのものであってもよい。例示的な動物細胞としては、これらに限定されないが、マウス、ウサギ、霊長類、および昆虫からのものが挙げられる。いくつかの例では、本明細書に記載されるｇＲＮＡライブラリは、多細胞生物に提供されてもよい。例示的な多細胞生物としては、これらに限定されないが、植物、マウス、ウサギ、霊長類、および昆虫が挙げられる。

【0054】

ゲノム編集

【0055】

本明細書で提供されるのは、特定の標的核酸配列のヌクレアーゼ標的化のための核酸を含むライブラリである。いくつかの例では、本明細書に記載されるライブラリは合成された核酸を含み、ここで、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、任意のアナログ、またはそれらの誘導体である。いくつかの例では、標的核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、任意のアナログ、あるいはそれらの誘導体を含む。いくつかの例では、ヌクレアーゼは標的核酸配列を切断する。いくつかの例では、ヌクレアーゼは標的核酸を結合するが、それを切断しない。ヌクレアーゼの型としては、これらに限定されないが、 転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、アルゴノート、およびクラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−関連の（Ｃａｓ）タンパク質が挙げられる。いくつかの例では、ヌクレアーゼは野生型、遺伝子組換え型、または組み換え型である。

【0056】

標的遺伝子編集のためのモデルシステムは、Ｃａｓ９に基づくアプローチを含む。ｇＲＮＡと共に細胞内に発現されたか移された時、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡのクラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列との複合体を介して、遺伝子情報の標的導入または欠失を可能にする。図１Ａ−１Ｂに例示されるようなＣａｓ９複合体は、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）転写産物と係合するＣａｓ９タンパク質を含む。例示されるｇＲＮＡは、標的配列領域、ＰＡＭ領域、およびヘアピン領域を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プロセスでは、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９酵素を特異的なひと続きのＤＮＡに誘導する。示されたｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ（一本鎖のガイドＲＮＡ）であるが、複合体はｄｇＲＮＡ（二本鎖のガイドＲＮＡ）と共に形成されてもよい。その後、Ｃａｓ９は、遺伝子を不能にするか修復するためにＤＮＡを切断する。このプロセスへの例示的な修正の非限定的なリストが本明細書で記載される。ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９プロセスにおいて、不能にされたまたは「死んでいる」Ｃａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は、もはやスプライシング機能を有さないが、別の酵素活性の添加によって、異なる標的分子修正機能を果たす。例えば、シチジンデアミナーゼのｄＣａｓ９への繋留は、Ｃ−Ｇ ＤＮＡ塩基対をＴ−Ａ 塩基対へと変換する。他のｄＣａｓ９プロセスでは、ｄＣａｓ９に繋留された異なる酵素は、標的ＤＮＡ内で塩基ＣをＴへ、または塩基ＧをＡへと変更することをもたらす。あるいは、ｄＣａｓ９プロセスは、ＲＮＡポリメラーゼ活性を遮断するか活性化するために、転写因子の融合によって修飾することができ、結果として遺伝子転写の遮断（ＣＲＩＳＰＲｉ）または活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）をもたらし、したがって遺伝子発現を調節する。例えば、ｄＣａｓ９プロセスは転写抑制因子との融合によって修飾される。いくつかの例では、ｄＣａｓ９プロセスは、転写活性化因子との融合によって修飾される。いくつかの例では、ｄＣａｓ９プロセスは、複数の転写抑制因子または転写活性化因子との融合によって修飾される。他の構成では、ｇＲＮＡは切断のための複数の部位を有し、遺伝子編集のための複数の領域を有するｇＲＮＡを結果としてもたらす。Ｃａｓ９ｎ、すなわち「ニッキングＣａｓ９」の場合には、ＲｕｖＣまたはＨＮＨの切断ドメインのいずれかが不活性になるように修正される。この不活性化は、Ｃａｓ９が、二本鎖切断ではなく、ＤＮＡにおける一本鎖切断（ニック）を生成することしかできないようにさせる。いくつかの構成では、２つのＣａｓ９ｎ酵素、各鎖に１本ずつ、が二本鎖切断を生成するために使用される。それらが、切断部位の上流および下流の領域の両方を認識することができるように、オフターゲット効果が除去される。ｈｆＣａｓ９の場合には、オフターゲット効果のないＣａｓ９切断を生成するために、二重のＣａｓ９ｎタンパク質を使用する代わりに、修飾されたＣａｓ９酵素が、結合標的特異性のストリンジェンシーを緩めて酵素活性に先立って完全未満の適合を可能にする。いくつかの例では、ｄＣａｓ９プロセスは標的核酸を検知するためのラベルまたはタグとの融合によって、修飾される。例えば、ラベルは、標的核酸を検知するための蛍光性のマーカー（例えばＧＦＰ）である。いくつかの例では、ｄＣａｓ９はエピトープタグと融合し、ｇＲＮＡによって特定された標的核酸の精製のために使用される。

【0057】

本明細書で提供されるのは、ヌクレアーゼを特定の標的核酸配列に向けるための核酸を含むライブラリ。いくつかの例では、標的核酸配列はＤＮＡを含む。いくつかの例では、標的核酸配列はＲＮＡを含む。例えば、Ｃ２ｃ２を方向付けるための核酸を含むライブラリは、ＲＮＡ配列を標的とするために生成される。いくつかの例では、ＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖のまたは二本鎖である。

【0058】

本明細書で提供されるのは、特定の標的核酸配列のヌクレアーゼ標的化のための核酸を含むライブラリであり、ここで、ヌクレアーゼは、これらに限定されないが、連鎖球菌属、カンピロバクター属、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、ブドウ球菌属、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア、ナイセリア属、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、フェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、乳酸桿菌属、ユーバクテリウム属、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア菌、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属、レジオネラ属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デサルフォビブリオ属、デスルフォナトロナム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、デスルフロコッカス属（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オピトゥトゥス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、テュベリバシラス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、かん菌、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナトロノバクテリウム属（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム属、サッカロミケス属、クラミドモナス属、サーマス属、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコプラズマ属、またはアシダミノコッカス属の種に由来する。例示的なヌクレアーゼは、表２Ａにおいて列挙される。本明細書に記載されるｇＲＮＡは、上記の種のいずれかに由来のヌクレアーゼ、または酵素がゲノム編集機能を可能にするさらなる種の由来のヌクレアーゼのターミネーター配列に結合することができる。例示的なターミネーター配列は、限定されないが、表２Ｂに列挙されたものが挙げられる。例示的なＰＡＭ配列は、限定されないが、表２Ｃにおいて列挙されるものが挙げられる。

【0059】

【表2A】

【0060】

【表2B】

【0061】

【表2C】

【0062】

本明細書で提供されるのは、特定の核酸配列に１以上のヌクレアーゼを標的とするための核酸を含むライブラリである。いくつかの例では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノート、およびＣａｓタンパク質の少なくとも１つである。例えば、１を超えるヌクレアーゼは、大きなゲノム欠失を生成するため、直ちに複数の配列を修飾するため、またはニッカーゼなどの他の酵素と合わせて使用されるために多重化することができる。いくつかの例では、ヌクレアーゼの数は、標的核酸配列に対して少なくとも２のヌクレアーゼである。いくつかの例では、ヌクレアーゼの数は、標的核酸配列に対して、約２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、または２〜１０のヌクレアーゼの範囲である。

【0063】

本明細書で提供されるのは、特定の核酸配列のニッカーゼ標的化のための合成された核酸を含むライブラリである。ニッカーゼは、核酸配列内で一本鎖の切断を生成する酵素である。いくつかの例では、合成された核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、任意のアナログ、またはそれらの誘導体である。いくつかの例では、特定の核酸配列は、含むＤＮＡ、ＲＮＡ、任意のアナログ、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの例では、ニッカーゼは特定の核酸配列を切断する。いくつかの例では、ニッカーゼは特定の核酸を結合するが、それを切断しない。いくつかの例では、ニッカーゼは変更されたヌクレアーゼであり、ここで、ヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノート、またはＣａｓタンパク質である。いくつかの例では、ニッカーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノート、またはＣａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインを変更することによって生成される。いくつかの例では、ニッカーゼは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインを変更することによって生成される。

【0064】

いくつかの例では、ライブラリは、特定の核酸配列の１以上のニッカーゼ標的化のための核酸含む。いくつかの例では、ニッカーゼの数は、特定の核酸配列に対して少なくとも２つのニッカーゼである。いくつかの例では、ニッカーゼの数は、特定の核酸配列に対して、約２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、または２〜１０のニッカーゼの範囲である。いくつかの例では、ライブラリは、１以上のニッカーゼおよび１以上のヌクレアーゼを特定の核酸配列に向けるための核酸を含む。

【0065】

本明細書で提供される特定の核酸配列に対してヌクレアーゼを標的とするための核酸を含むライブラリは、特定の核酸配列の切断を結果としてもたらし得る。いくつかの例では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノート、およびＣａｓタンパク質の少なくとも１つである。いくつかの例では、ヌクレアーゼは、切断以外の、特定の核酸配列の修飾を提供するキメラヌクレアーゼである。例えば、キメラヌクレアーゼは、メチル化、脱メチル反応、ポリアデニル化、脱アデニル化、脱アミノ化、またはポリウリジニリル化（ｐｏｌｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｉｏｎ）をもたらす。

【0066】

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ
本明細書で提供されるのは、特定の核酸配列の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）標的化のための核酸を含む、核酸ライブラリを合成する方法である。ＴＡＬＥＮは、特定の標的配列で二本鎖切断を誘発するために使用することができる、操作された配列の特異的なヌクレアーゼの類である。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼの触媒ドメインに、 転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの機能部分を融合させることによって生成され得る。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、一連のＴＡＬ反復を含み、それは、各々がＲＶＤ（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）として知られる非常に可変的な１２番目と１３番目のアミノ酸を含む一般的に高度に保存された３３または３４のアミノ酸配列セグメントである。各ＲＶＤは、特異的なヌクレオチドを認識し、それに結合することができる。したがって、ＴＡＬエフェクター結合ドメインは、適切なＲＶＤを含むＴＡＬ反復を組み合わせることによってヌクレオチドの特異的なシーケンスを認識するように操作され得る。

【0067】

本明細書で提供されるのは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをコードする非同一の核酸を含む核酸ライブラリを合成する方法である。いくつかの例では、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、特定の標的核酸配列を認識し、特別の部位で二本鎖切断を誘発するようにするように設計される。いくつかの例では、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、特定の核酸配列を認識してそれに結合するように設計される多くのＴＡＬ反復を含む。いくつかの例では、ＴＡＬ反復の数は、少なくともまたは約、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、またはそれより多くのＴＡＬ反復である。

【0068】

いくつかの例では、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをコードする非同一の核酸を含む核酸ライブラリは合成される。いくつかの例では、本明細書で記載されるような核酸ライブラリは、翻訳される時にタンパク質ライブラリをコードする。いくつかの例では、核酸ライブラリが細胞内で発現し、タンパク質ライブラリが生成される。いくつかの例では、合成された核酸ライブラリは、発現ベクターへと挿入される。いくつかの例では、合成された核酸ライブラリは、発現ベクターへと挿入され、細胞内で発現する。

【0069】

本明細書に記載される方法によって生成されたＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸を含む核酸ライブラリは、ＴＡＬＥＮを生成するために用いられる。いくつかの例では、これは、クローン化され、ヌクレアーゼを有するベクター内で発現するＴＡＬエフェクター結合ドメインのライブラリを混合することによって達成される。例示的なヌクレアーゼとしては、これらに限定されないが、ＡｃｉＩ、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓＣＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉｌ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、またはＣｓｐＣＩが挙げられる。いくつかの例では、混合は、ライゲーションによって生じる。例示的なリガーゼとしては、これらに限定されないが、大腸菌リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、哺乳類のリガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ）、熱安定性リガーゼ、およびファストリガーゼ（ｆａｓｔ ｌｉｇａｓｅｓ）が挙げられる。本明細書に記載される方法で生成されたＴＡＬＥＮは、発現ベクターに挿入され得る。いくつかの例では、ＴＡＬＥＮは、発現ベクターに挿入され、細胞内で発現する。

【0070】

本明細書で提供されるのは、原核生物または真核生物のゲノム中の遺伝子について、非同一の核酸配列を含むＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリを合成するための方法である。いくつかの例では、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、遺伝子のための少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多い非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリは、ゲノムの少なくとも５％ついて、１以上の遺伝子のための非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００よりも多い遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１−１００、２−９５、５−９０、１０−８５、１５−８０、２０−７５、２５−７０、３０−６５、３５−６０、または４０−５０の遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。

【0071】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ

【0072】

本明細書で提供されるのは、特定の核酸配列のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標的化のための核酸を含む核酸ライブラリを合成する方法である。ＺＦＮは、ヌクレアーゼとＤＮＡ結合ジンクフィンガードメイン（ＺＦＤ）との融合によって生成され得る。ＺＦＤは、１以上のジンクフィンガーを介して標的核酸配列に結合することができる。いくつかの例では、ＺＦＤは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０以上のジンクフィンガーを含む。いくつかの例では、ＺＦＤは、最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０以上のジンクフィンガーを含む。いくつかの例では、ＺＦＤは、特定の標的核酸配列を認識し、特別の部位で二本鎖切断を誘発するようにするように設計される。

【0073】

本明細書で提供されるのは、転写され翻訳された時、ＺＦＤをコードする核酸を含む核酸ライブラリを合成する方法である。いくつかの例では、核酸ライブラリが翻訳される時、タンパク質ライブラリをコードする。いくつかの例では、核酸ライブラリが細胞内で発現され、タンパク質ライブラリが生成される。いくつかの例では、合成された核酸ライブラリは、発現ベクターに挿入される。いくつかの例では、合成された核酸ライブラリは、発現ベクターに挿入され、細胞内で発現する。

【0074】

本明細書に記載される方法によって生成されたＺＦＤをコードする核酸を含む核酸ライブラリは、ＺＦＮを生成するために用いられる。いくつかの例では、これは、クローン化され、ヌクレアーゼを有するベクター内で発現するＺＦＤを混合することによって達成される。例示的なヌクレアーゼとしては、これらに限定されないが、ＡｃｉＩ、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓＣＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉｌ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、またはＣｓｐＣＩが挙げられる。いくつかの例では、混合は、ライゲーションによって生じる。例示的なリガーゼとしては、これらに限定されないが、大腸菌リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、哺乳類のリガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ）、熱安定性リガーゼ、およびファストリガーゼ（ｆａｓｔ ｌｉｇａｓｅｓ）が挙げられる。本明細書に記載される方法によって生成されたＴＡＬＥＮは、発現ベクターに挿入され得る。いくつかの例では、ＺＦＮは、発現ベクターに挿入され、細胞内で発現する。

【0075】

本明細書で提供されるのは、原核生物または真核生物のゲノム中の遺伝子について、非同一の核酸配列を含むＺＦＤライブラリを合成するための方法である。いくつかの例では、ＺＦＤライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、遺伝子のための少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多い非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ＺＦＤライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、１以上の遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ＺＦＤライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００よりも多い遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ＺＦＤライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１−１００、２−９５、５−９０、１０−８５、１５−８０、２０−７５、２５−７０、３０−６５、３５−６０、または４０−５０の遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。

【0076】

メガヌクレアーゼ

【0077】

本明細書で提供されるのは、特定の核酸配列のメガヌクレアーゼ標的化のための核酸を含む核酸ライブラリを合成する方法である。メガヌクレアーゼは、塩基対の長い（例えば１２−４０の塩基対）ＤＮＡ標的を認識し切断することができる酵素である。いくつかの例では、メガヌクレアーゼは、標的核酸配列について特異性を与える他の酵素のドメインを含むように操作される。例えば、メガヌクレアーゼはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含むように操作される。

【0078】

本明細書で提供されるのは、転写され翻訳された時、メガヌクレアーゼと共に使用するための結合ドメインをコードする核酸を含む核酸ライブラリを合成する方法である。いくつかの例では、核酸ライブラリが翻訳される時、タンパク質ライブラリをコードする。いくつかの例では、核酸ライブラリが細胞内で発現され、タンパク質ライブラリが生成される。いくつかの例では、合成された核酸ライブラリは、発現ベクターに挿入される。いくつかの例では、合成された核酸ライブラリは、発現ベクターに挿入され、細胞内で発現する。

【0079】

本明細書に記載される方法によって生成されたドメインをコードする核酸を含む核酸ライブラリは、特定の核酸配列を標的とするためのメガヌクレアーゼを操作するために使用される。いくつかの例では、これは、クローン化され、メガヌクレアーゼを有するベクター内で発現するＴＡＬエフェクター結合ドメインのライブラリのような結合ドメインのライブラリを混合することによって達成される。本明細書で提供される方法と共に使用するための例示的なメガヌクレアーゼとしては、これら限定されないが、Ｉ−Ｓｃｅｌ、Ｉ−Ｓｃｅｌｌ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−Ｃｅｕｌ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−Ｃｒｅｌ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂｌｌＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−Ｔｌｉｌ、Ｉ−Ｐｐｏｌ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−Ｓｃｅｌ、Ｆ−Ｓｃｅｌｌ、Ｆ−Ｓｕｖｌ、Ｆ− ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−Ａｍａｌ、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−Ｃｈｕｌ、Ｉ−Ｃｍｏｅｌ、Ｉ−Ｃｐａｌ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−Ｃｓｍｌ、Ｉ−Ｃｖｕｌ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−Ｄｄｉｌ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−Ｄｉｒｌ、Ｉ−Ｄｍｏｌ、Ｉ−Ｈｍｕｌ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−Ｌｌａｌ、Ｉ−Ｍｓｏｌ、Ｉ−Ｎａａｌ、Ｉ−Ｎａｎｌ、Ｉ− ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−Ｎｉｔｌ、Ｉ−Ｎｊａｌ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−Ｐａｋｌ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒｌＰ、１−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−Ｐｏｒｌ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−Ｓｃａｌ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、１−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−Ｓｐｏｍｌ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−Ｔｅｖｌ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、１−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、Ｐｌ−ＰｋｏＩＩ ＰＩ− Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−Ｔｈｙｌ、ＰＩ−Ｔｌｉｌ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、またはそれらの断片が挙げられる。いくつかの例では、混合は、ライゲーションによって生じる。例示的なリガーゼとしては、これらに限定されないが、大腸菌リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、哺乳類のリガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ）、熱安定性リガーゼ、およびファストリガーゼ（ｆａｓｔ ｌｉｇａｓｅｓ）が挙げられる。本明細書に記載される方法によって操作されたメガヌクレアーゼは、発現ベクターに挿入され得る。いくつかの例では、操作されたメガヌクレアーゼは、発現ベクターに挿入され、細胞内で発現する。

【0080】

本明細書で提供されるのは、原核生物または真核生物のゲノム中の遺伝子について非同一の核酸配列を含むメガヌクレアーゼと共に使用するための結合ドメインライブラリを合成するための方法である。いくつかの例では、ドメインライブラリは、ゲノムの少なくとも５％のゲノムについて、遺伝子のための少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多い非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ドメインライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、１以上の遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ドメインライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００よりも多い遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ドメインライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１−１００、２−９５、５−９０、１０−８５、１５−８０、２０−７５、２５−７０、３０−６５、３５−６０、または４０−５０の遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。

【0081】

アルゴノート

【0082】

本明細書で提供されるのは、特定の核酸配列のメガヌクレアーゼ標的化のための核酸を含む核酸ライブラリを合成する方法である。アルゴノートは、ＲＮＡまたはＤＮＡのガイドヌクレアーゼのファミリーである。いくつかの例では、アルゴノートは、標的核酸を識別するためにガイド核酸を使用する。いくつかの例では、ガイド核酸は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの例では、ガイド核酸は、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である。例示的なアルゴノートとしては、これらに限定されないが、ＴｔＡｇｏ、ＰｆＡｇｏ、およびＮｇＡｇｏが挙げられる。いくつかの実施形態では、アルゴノートはＮｇＡｇｏである。

【0083】

本明細書で提供されるのは、原核生物または真核生物のゲノム中の遺伝子について、非同一の核酸配列を含むガイド核酸ライブラリを合成するための方法である。幾つかの事例では、ガイド核酸ライブラリはｓｇＲＮＡライブラリである。幾つかの事例では、ガイド核酸ライブラリはｄｇＲＮＡライブラリである。いくつかの例では、ガイド核酸ライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、遺伝子のための少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多い非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ガイド核酸ライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、１以上の遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ガイド核酸ライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００よりも多い遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ガイド核酸ライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１−１００、２−９５、５−９０、１０−８５、１５−８０、２０−７５、２５−７０、３０−６５、３５−６０、または４０−５０の遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。

【0084】

ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質

【0085】

本明細書で提供されるのは、特定の核酸配列のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質標的化のためのｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸ライブラリを合成する方法である。いくつかの例では、Ｃａｓタンパク質は、少なくとも、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、およびそれらの修飾バージョンの１つである。いくつかの例では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。

【0086】

本明細書で提供されるのは、原核生物または真核生物のゲノム中の遺伝子について、非同一の核酸配列を含むｇＲＮＡライブラリを合成するための方法である。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、遺伝子のための少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多い非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、１以上の遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００よりも多い遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、ゲノムの少なくとも５％について、約１−１００、２−９５、５−９０、１０−８５、１５−８０、２０−７５、２５−７０、３０−６５、３５−６０、または４０−５０の遺伝子のための、非同一の核酸配列を含む。ｇＲＮＡライブラリは、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡをコードし得る。

【0087】

変異体ライブラリ合成

【0088】

本明細書で提供されるのは、ｇＲＮＡおよびヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９酵素またはＣａｓ９変異酵素を有する、完全または一部の遺伝子配列をコードする核酸の組み合わせによって生成された変異体核酸ライブラリを合成するための方法である。断片は、遺伝子の全領域に相対的に間隔をあけてもよい。場合によっては、ライブラリがＤＮＡまたはＲＮＡをコードする。場合によっては、ライブラリが、単一の遺伝子または最大で全ゲノムをコードする。例えば、約２０，０００の遺伝子を含むゲノムについて、遺伝子あたり、５つのｇＲＮＡをコードするｇＲＮＡライブラリは、約１００，０００のｇＲＮＡを結果としてもたらす。そのようなライブラリは、単一遺伝子、遺伝子の経路、または単一ゲノム内の全遺伝子を、選択的にサイレンシングするか修飾するために使用することができる。ある構成では、ｇＲＮＡは相同配列を欠き、無作為な末端結合が生じる。そのようなプロセスは、非相同末端結合（「ＮＨＥＪ」）を結果としてもたらす。いくつかの例では、ＮＨＥＪに続いて、挿入、欠失、フレームシフト、または一塩基スワッピング（ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｓｗａｐｐｉｎｇ）が生じる。図２のＢを参照する。

【0089】

本明細書に記載される合成されたライブラリは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９機能における適用のために使用することができ、ここで、生成されたｇＲＮＡ配列が、細胞内または標的ＤＮＡおよびＣａｓ９酵素を含む混合物内で標的ＤＮＡ配列の発現を破壊するか発現産物配列を変更するために使用される。いくつかの実施形態では、各変異体は、翻訳中に異なるアミノ酸をもたらすコドンをコードする。表３は、変異部位にとって可能性のあるそれぞれのコドン（と代表的なアミノ酸）のリストを提供する。

【0090】

【表3-1】

【0091】

【表3-2】

【0092】

本明細書で提供されるのは、ヌクレアーゼを有する完全なまたは一部の遺伝子配列をコードする核酸の組み合わせによって生成された変異核酸ライブラリを合成するための方法であり、ここで、ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、または操作されたメガヌクレアーゼである。いくつかの例では、ヌクレアーゼを有するｓｇＲＮＡなどのガイド核酸を有する完全なまたは一部の遺伝子配列をコードする核酸の組み合わせによって生成された、変異体核酸ライブラリを合成するための方法であり、ここで、ヌクレアーゼはアルゴノートまたはＣａｓタンパク質である。本明細書に記載される合成されたライブラリは、ヌクレアーゼ機能における適用のために使用することができ、ここで、生成された核酸配列が、細胞内または標的ＤＮＡおよびヌクレアーゼを含む混合物内で標的ＤＮＡ配列の、発現を破壊するか発現産物配列を変更するために使用される。いくつかの実施形態では、各変異体は、翻訳中に異なるアミノ酸をもたらすコドンをコードする。

【0093】

本明細書で記載されるような変異核酸ライブラリは、合成された核酸によってコードされる後続タンパク質において、単一の残基の複数の様々な変異体が標準的な翻訳プロセスによって生成されるように、少なくとも単一のコドンをコードする標的核酸配列を変えるためのｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡを含む。いくつかの事例では、各変異体は、タンパク質ドメインの異なるアミノ酸をもたらすコドンをコードする。例えば、タンパク質ドメインは、保存ドメインまたは触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、タンパク質ドメインとしては、これらに限定されないが、キナーゼドメイン、ＡＴＰ結合ドメイン、ＧＴＰ結合ドメイン、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）ドメインＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ドメイン、ヒドロラーゼドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ホスファターゼドメイン、ホスホリパーゼドメイン、プレクストリン相同ドメイン、Ｓｒｃ相同ドメイン、およびユビキチン結合ドメインが挙げられる。いくつかの例では、変異体核酸ライブラリは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも多いタンパク質ドメインにおける変異をコードする核酸配列を標的とするために、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡを含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、変異体は、特定の活性を有するタンパク質についてアミノ酸を体コードする。例えば、変異体は、それはメチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、デプリネーション活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、レコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、ホトリアーゼ活性、グリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンテターゼ活性、または脱ミリストイル化活性を含むタンパク質をエンコードする。

【0095】

相同組換え修復（ＨＤＲ）によって生成される変異
変異核酸ライブラリ生成のための例示的なプロセスにおいて、Ｃａｓ９切断および相同組換えが、標的ＤＮＡライブラリ内に変型を生成するために組込まれる。まず、（ＲＮＡのデノボ合成またはＤＮＡのデノボ合成のいずれか、その後（インビボまたはインビトロの）転写をしてｇＲＮＡを生成することによって）ｇＲＮＡライブラリが合成され、ここで、ライブラリは、遺伝子あたり複数のｇＲＮＡ分子を含む。例えば、ｇＲＮＡライブラリは、遺伝子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのｇＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡライブラリは、Ｃａｓ９酵素および標的ＤＮＡライブラリと混合され、ここで、標的ＤＮＡライブラリは少なくとも１つの遺伝子断片または少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列を含む。例えば、標的ＤＮＡライブラリは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの遺伝子または遺伝子断片を含み得る。いくつかの例では、標的ＤＮＡライブラリは、経路内の同義遺伝子からの配列または生物体内の全遺伝子からの配列を含む。さらに、変異が標的ＤＮＡ鎖に導入されるように、相性配列および変異核酸配列を含む置換配列が混合物に加えられる。結果として生じる標的ＤＮＡライブラリは、複数の変異ＤＮＡ配列を含むだろう。いくつかの例では、変異は、欠失、フレームシフト、または標的ＤＮＡ配列への挿入を導入する。いくつかの例では、変異ＤＮＡ配列は、遺伝子または遺伝子の断片あたり、少なくとも１のコドンについての変異を結果としてもたらす。いくつかの例では、遺伝子の一部が標的ＤＮＡに挿入され、あるいは、標的ＤＮＡ配列の一部（つまり、遺伝子の断片または全遺伝子）は、標的ＤＮＡから取り除かれる。いくつかの例では、変異ＤＮＡ配列は、遺伝子または遺伝子の断片と関連付けられる少なくとも１つの転写調節配列、例えば、プロモーター、ＵＴＲ、あるいはターミネーター配列についての変異を結果としてもたらす。

【0096】

変異核酸ライブラリ生成ためのいくつかの例では、ヌクレアーゼ切断および相同組換えは、標的ＤＮＡライブラリ内に変型を生成するために組込まれ、ここで、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、Ｃａｓ、またはアルゴノートである。いくつかの例では、ヌクレアーゼがＴＡＬＥＮである場合、（ＲＮＡのデノボ合成またはＤＮＡのデノボ合成のいずれか、その後、（インビボまたはインビトロの）転写および翻訳によって）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリが合成され、ここで、ライブラリは、遺伝子あたり複数のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン分子を含む。例えば、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリは、遺伝子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン分子を含み得る。その後、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリは、ＴＡＬＥＮを生成するためにヌクレアーゼ酵素と混合され得る。いくつかの例では、ＴＡＬＥＮは標的ＤＮＡライブラリと結合され、ここで、標的ＤＮＡライブラリは、少なくとも１つの遺伝子断片または少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列を含む。例えば、標的ＤＮＡライブラリは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の遺伝子または遺伝子断片を含み得る。いくつかの例では、標的ＤＮＡライブラリは、経路内の同義遺伝子からの配列または生物体内の全遺伝子からの配列を含む。いくつかの例では、変異が標的ＤＮＡ鎖に導入されるように、相性配列および変異核酸配列を含む置換配列が混合物に加えられる。結果として生じる標的ＤＮＡライブラリは、複数の変異ＤＮＡ配列を含むだろう。いくつかの例では、変異は、欠失、フレームシフト、または標的ＤＮＡ配列への挿入を導入する。いくつかの例では、変異ＤＮＡ配列は、遺伝子または遺伝子の断片あたり、少なくとも１のコドンについての変異を結果としてもたらす。いくつかの例では、遺伝子の一部が標的ＤＮＡに挿入され、あるいは、標的ＤＮＡ配列の一部（つまり、遺伝子の断片または全遺伝子）は、標的ＤＮＡから取り除かれる。いくつかの例では、変異ＤＮＡ配列は、遺伝子または遺伝子の断片と関連付けられる少なくとも１つの転写調節配列、例えば、プロモーター、ＵＴＲ、あるいはターミネーター配列についての変異を結果としてもたらす。

【0097】

修飾されたＣａｓ９酵素によって生成される変異

【0098】

変異核酸ライブラリの生成のための２番目の例示的なプロセスは、修飾されたＣａｓ９酵素が、変異標的ＤＮＡライブラリを生成するために組込まれる。まず、（ＲＮＡのデノボ合成またはＤＮＡのデノボ合成のいずれか、その後（インビボまたはインビトロの）転写をしてｇＲＮＡを生成することによって）ｇＲＮＡライブラリが合成され、ここで、ライブラリは、遺伝子あたり複数のｇＲＮＡ分子を含む。例えば、ｇＲＮＡライブラリは、遺伝子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｇＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡライブラリは、修飾されたＣａｓ９酵素および標的ＤＮＡライブラリと混合され、ここで、標的ＤＮＡライブラリは少なくとも１つの遺伝子断片または少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列を含む。例えば、標的ＤＮＡライブラリは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の遺伝子または遺伝子断片を含み得る。いくつかの例では、標的ＤＮＡライブラリは、経路内の同義遺伝子からの配列または生物体内の全遺伝子からの配列を含む。修飾されたＣａｓ９酵素は、核酸配列修飾能力を有する別の酵素に繋留される。例示的な修飾されたＣａｓ９酵素は、ｄＣａｓ９プロセスを含み、このプロセスは、不能にされたまたは「死んでいる」Ｃａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は、もはやスプライシング機能を有しないが、別の酵素活性の添加によって、異なる標的分子修正機能を果たす。例えば、シチジンデアミナーゼのｄＣａｓ９への繋留は、Ｃ−Ｇ ＤＮＡ塩基対をＴ−Ａ 塩基対へと変換する。他のｄＣａｓ９プロセスでは、ｄＣａｓ９に繋留された異なる酵素は、標的ＤＮＡ内で塩基ＣをＴへ、または塩基ＧをＡへと変更することをもたらす。結果として生じる標的ＤＮＡライブラリは、複数の変異標的ＤＮＡ配列を含む。いくつかの例では、変異は、欠失、フレームシフト、または標的ＤＮＡ配列への挿入を導入する。いくつかの例では、変異ＤＮＡ配列は、遺伝子または遺伝子の断片あたり、少なくとも１のコドンについての変異を結果としてもたらす。いくつかの例では、変異ＤＮＡ配列は、遺伝子または遺伝子の断片と関連付けられる少なくとも１つの転写調節配列、例えば、プロモーター、ＵＴＲ、あるいはターミネーター配列についての変異を結果としてもたらす。

【0099】

修飾されたヌクレアーゼよって生成される変異

【0100】

本明細書で提供されるのは、変異標的ＤＮＡライブラリを生成するために組込まれる修飾されたヌクレアーゼ酵素を含む、変異核酸ライブラリの生成のための方法である。いくつかの例では、ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮである。いくつかの例では、（ＲＮＡのデノボ合成またはＤＮＡのデノボ合成のいずれか、その後、転写および翻訳をしてＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリを生成することによって）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリが合成され、ここで、ライブラリが遺伝子あたり複数の非同一の核酸配列を含む。例えば、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリは、遺伝子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の非同一の核酸配列を含み得る。その後、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリは、ヌクレアーゼ酵素と混合され得る。いくつかの例では、ＴＡＬＥＮは標的ＤＮＡライブラリと混合され、ここで、標的ＤＮＡライブラリは、少なくとも１つの遺伝子断片または少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列を含む。例えば、標的ＤＮＡライブラリは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の遺伝子または遺伝子断片を含み得る。いくつかの例では、標的ＤＮＡライブラリは、経路内の同義遺伝子からの配列または生物体内の全遺伝子からの配列を含む。

【0101】

いくつかの例では、ヌクレアーゼはＺＦＮである。いくつかの例では、（ＲＮＡのデノボ合成またはＤＮＡのデノボ合成のいずれか、その後、転写および翻訳をしてＺＦＤライブラリを生成することによって）ＺＦＤライブラリが合成され、ここで、ライブラリが遺伝子あたり複数の非同一の核酸配列を含む。例えば、ＺＦＤライブラリは、遺伝子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の非同一の核酸配列を含み得る。その後、ＺＦＤライブラリは、ＺＦＮを生成するためにヌクレアーゼ酵素と混合され得る。いくつかの例では、ＺＦＮは標的ＤＮＡライブラリと混合され、ここで、標的ＤＮＡライブラリは、少なくとも１つの遺伝子断片または少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列を含む。例えば、標的ＤＮＡライブラリは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の遺伝子または遺伝子断片を含み得る。いくつかの例では、標的ＤＮＡライブラリは、経路内の同義遺伝子からの配列または生物体内の全遺伝子からの配列を含む。

【0102】

いくつかの例では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである。いくつかの例では、特定の核酸配列に対してメガヌクレアーゼを標的とするための、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのライブラリのような結合ドメインライブラリは、（ＲＮＡのデノボ合成またはＤＮＡのデノボ合成のいずれか、その後、転写をして結合ドメインライブラリを生成することによって）合成され、ここで、結合ドメインライブラリは、遺伝子あたり複数の非同一の核酸配列を含む。例えば、結合ドメインライブラリは、遺伝子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの非同一の核酸配列を含み得る。その後、結合ドメインライブラリは、操作されたメガヌクレアーゼを生成するためにメガヌクレアーゼ酵素と混合され得る。いくつかの例では、操作されたメガヌクレアーゼは標的ＤＮＡライブラリと混合され、ここで、標的ＤＮＡライブラリは、少なくとも１つの遺伝子断片または少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列を含む。例えば、標的ＤＮＡライブラリは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の遺伝子または遺伝子断片を含み得る。いくつかの例では、標的ＤＮＡライブラリは、経路内の同義遺伝子からの配列または生物体内の全遺伝子からの配列を含む。

【0103】

いくつかの例では、ヌクレアーゼはアルゴノートである。いくつかの例では、（ＲＮＡのデノボ合成またはＤＮＡのデノボ合成のいずれか、その後、転写をしてガイド核酸ライブラリを生成することによって）ガイド核酸ライブラリ （ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ） が合成され、ここで、ガイド核酸ライブラリが、遺伝子あたり複数の非同一の核酸配列を含む。例えば、ガイド核酸ライブラリは、遺伝子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの非同一の核酸配列を含み得る。ガイド核酸ライブラリは、修飾されたアルゴノート酵素および標的ＤＮＡライブラリと混合され、ここで、標的ＤＮＡライブラリは少なくとも１つの遺伝子断片または少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列を含む。例えば、標的ＤＮＡライブラリは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の遺伝子または遺伝子断片を含み得る。いくつかの例では、標的ＤＮＡライブラリは、経路内の同義遺伝子からの配列または生物体内の全遺伝子からの配列を含む。

【0104】

いくつかの例では、修飾されたヌクレアーゼ酵素は、核酸配列修飾能力を有する別の酵素に繋留される。例示的な修飾能力としては、これらに限定されないが、メチル化、脱メチル化、ポリアデニル化、脱アデニル化、脱アミノ化、およびポリウリジニリル化（ｐｏｌｙｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｉｏｎ）が挙げられる。いくつかの例では、複数の変異標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡライブラリは、変異を結果としてもたらす。いくつかの例では、変異は、欠失、フレームシフト、または標的ＤＮＡ配列への挿入を導入する。いくつかの例では、変異ＤＮＡ配列は、遺伝子または遺伝子の断片あたり、少なくとも１のコドンについての変異を結果としてもたらす。いくつかの例では、変異ＤＮＡ配列は、遺伝子または遺伝子の断片と関連付けられる少なくとも１つの転写調節配列、例えば、プロモーター、ＵＴＲ、あるいはターミネーター配列についての変異を結果としてもたらす。

【0105】

モデルシステムの遺伝子を標的とするためのｇＲＮＡライブラリ合成

【0106】

本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される核酸ライブラリを有するモデルシステムをスクリーニングための方法である。いくつかの事例では、核酸ライブラリは、本明細書に記載されるｇＲＮＡライブラリである。いくつかの例では、核酸ライブラリは、転写された時にｇＲＮＡ配列の転写をもたらす本明細書に記載されるＤＮＡライブラリである。モデル生物体の非限定的で例示的なリストが、表４において提供される。

【0107】

【表4】

【0108】

（ＲＮＡのデノボ合成またはＤＮＡのデノボ合成のいずれか、その後、（インビボまたはインビトロの）転写をしてｇＲＮＡを生成することによって）ｇＲＮＡライブラリが合成され、ここで、ライブラリは、遺伝子あたり複数のｇＲＮＡ分子を含む。例えば、本明細書に記載されるライブラリは、遺伝子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、デノボ合成されたライブラリ内の核酸は、単一遺伝子あたり、少なくともまたは約３の非同一のｇＲＮＡについての配列をコードする。いくつかの例では、核酸は、単一遺伝子あたり、約１〜約１０の非同一のｇＲＮＡの範囲で配列をコード化する。いくつかの例では、核酸は、単一遺伝子あたり、少なくともまたは約１の非同一のｇＲＮＡについての配列をコードする。いくつかの例では、核酸は、単一遺伝子あたり、最大で１０の非同一のｇＲＮＡについての配列をコードする。いくつかの例では、核酸は、単一遺伝子あたり、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９または１〜１０の非同一のｇＲＮＡについての配列をコードする。いくつかの例では、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。いくつかの例では、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡである。

【0109】

いくつかの例では、本明細書に記載されるｇＲＮＡライブラリは、遺伝子または生物体あたり、１以上の非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、生物体のための遺伝子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの非同一のｇＲＮＡを含む。例示的な生物体としては、これらに限定されないが、シロイヌナズナ、線虫、イヌ科、コナミドリムシ、ゼブラフィッシュ、細胞性粘菌、キイロショウジョウバエ、大腸菌、アカゲザル、ハツカネズミ、アナウサギ、ドブネズミ、出芽酵母、イノシシ、およびヒトが挙げられる。いくつかの例では、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。いくつかの例では、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡである。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、生物体の全ゲノムの少なくともまたは約５％について、非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、生物体の全ゲノムの約５％〜約１００％について、非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、生物体の全ゲノムの少なくともまたは約８０％について、非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡライブラリは、生物体の全ゲノムの少なくともまたは約９０％について、非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、生物体の全ゲノムの少なくともまたは約９５％について、非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、生物体の全ゲノムの少なくともまたは約１００％について、非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、生物体の全ゲノムの約５％〜１０％、５％〜２０％、５％〜３０％、５％〜４０％、５％〜５０％、５％〜６０％、５％〜７０％、５％〜８０％、５％〜９０％、５％〜９５％、５％〜１００％、１０％〜２０％、１０％〜３０％、１０％〜４０％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜３０％、２０％〜４０％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、３０％〜４０％、３０％〜５０％、３０％〜６０％、３０％〜７０％、３０％〜８０％、３０％〜９０％、３０％〜９５％、３０％〜１００％、４０％〜５０％、４０％〜６０％、４０％〜７０％、４０％〜８０％、４０％〜９０％、４０％〜９５％、４０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、６０％〜７０％、６０％〜８０％、６０％〜９０％、６０％〜９５％、６０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％９０％〜９５％、９０％〜１００％、または９５％〜１００％の非同一のｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、経路内の同義遺伝子からの配列または生物体内の全遺伝子からの配列を含む。ｇＲＮＡの数は、表４列挙される生物体において、遺伝子あたり、少なくとも２倍、３倍、５倍、または１０倍を含み得る。いくつかの例では、ｇＲＮＡライブラリは、遺伝子、遺伝子の群（例えば３−１０の遺伝子）、経路（例えば１０−１００の遺伝子）、またはシャーシ（例えば１００−１０００の遺伝子）のうち少なくとも１つを標的とする。

【0110】

高度に平行なデノボ核酸合成

【0111】

本明細書に記載されるのは、革新的な合成プラットフォームを作るために、シリコン上のナノウェル内のオリゴ核酸合成から遺伝子アセンブリへの末端間プロセスの小型化、並列化、および垂直的統合を利用するプラットフォームアプローチがされる。本明細書に記載される装置は、９６ウェルのプレートと同じフットプリントを提供し、シリコン合成プラットフォームは、従来の合成方法と比較して、１００〜１，０００倍スループットを増加させることができ、単一の高度に並列されたラン（ｒｕｎ）で、およそ１，０００，０００までのオリゴ核酸を産生することができる。いくつかの例では、本明細書に記載される単一のシリコンプレートは、約６，１００の非同一のオリゴ核酸の合成を提供する。いくつかの例では、非同一のオリゴ核酸の各々は、クラスタ内に位置づけられる。クラスタは、５０〜５００の非同一のオリゴ核酸を含んでもよい。

【0112】

いくつかの例では、本明細書に記載されるｇＲＮＡライブラリをコードするＤＮＡライブラリは、ＤＮＡについて予め決められた配列と比較すると、１：５００未満のエラー率を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、ＤＮＡについて予め決められた配列と比較すると、１：５００、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：５０００以下、またはそれ未満の総エラー率を有する。いくつかの例では、ＤＮＡについて予め決められた配列と比較すると、総エラー率は１：１０００未満である。エラー率は、総エラー率または平均エラー率であり得る。

【0113】

いくつかの例では、本明細書に記載されるｇＲＮＡライブラリをコードするＲＮＡライブラリは、ＲＮＡについての予め決められた配列と比較すると、１：５００より低いエラー率を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデノボオリゴ核酸ライブラリは、核酸についての予め決められた配列と比較すると、１：５００、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００ １：５０００、１：１０，０００、またはそれより低い総エラー率を有する。いくつかの例では、ＲＮＡについての予め決められた配列と比較すると、総エラー率は１：１０００より低い。

【0114】

基質

【0115】

場合により、本明細書には、複数のクラスタを含む基質が記載され、ここで各クラスタはオリゴ核酸の付着及び合成を支持する複数の遺伝子座を含む。本明細書で使用されるような用語「遺伝子座」は、表面から伸長する単一の予め決められた配列をコードするオリゴ核酸に対する支持を提供する構造上の離散的領域を指す。幾つかの実施形態において、遺伝子座は、二次元表面、例えば、実質的に平らな表面上にある。幾つかの実施形態において、遺伝子座は、三次元表面、例えば、ウェル、微小ウェル、チャネル、又はポスト上にある。幾つかの実施形態において、遺伝子座の表面は、オリゴ核酸合成のための少なくとも１つのヌクレオチド、又は好ましくは、オリゴ核酸の集団の合成のための同一のヌクレオチドの集団に付着するために活発に官能化される物質を含む。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸は、同じ核酸配列をコードするオリゴ核酸の集団を指す。場合により、基質の表面は、基質の１つ又は複数の表面を包含する。提供されるシステム及び方法を用いてライブラリ内で合成されるオリゴ核酸に関する平均エラー率は多くの場合、１０００分の１未満、２０００分の１未満、３０００分の１未満、或いはそれよりも遥かに少ない。

【0116】

幾つかの実施形態において、基質は、共通の支持体上のアドレス可能位置に異なる予め決められた配列を有している複数のオリゴ核酸の合成を支持する表面を含む。幾つかの実施形態において、基質は、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；５０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００、又はそれ以上の非同一のオリゴ核酸の合成のための支持を提供する。場合により、基質は、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；５０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００を超える、又はそれ以上のオリゴ核酸の合成のための支持を提供する。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸の少なくとも一部は、同一の配列を有しているか、又は同一の配列で合成されるように構成されている。幾つかの実施形態において、基質は、少なくとも８０、９０、１００、１２０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、又はそれ以上の塩基を持つオリゴ核酸の成長のための表面環境を提供する。

【0117】

幾つかの実施形態において、オリゴ核酸は、基質の別々の遺伝子座上で合成され、ここで各遺伝子座はオリゴ核酸の集団の合成を支持する。場合により、各遺伝子座は、別の遺伝子座上で成長させられたオリゴ核酸の集団とは異なる配列を有するオリゴ核酸の集団の合成を支持する。幾つかの実施形態において、基質の遺伝子座は複数のクラスタ内に位置する。幾つかの例において、基質は、少なくとも１０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、又はそれ以上のクラスタを含む。幾つかの実施形態において、基質は、２，０００；５，０００；１０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，１００，０００；１，２００，０００；１，３００，０００；１，４００，０００；１，５００，０００；１，６００，０００；１，７００，０００；１，８００，０００；１，９００，０００；２，０００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；又は１０，０００，０００、或いはそれ以上の別々の遺伝子座を含む。幾つかの実施形態において、基質は約１０，０００の別々の遺伝子座を含む。単一のクラスタ内の遺伝子座の量は、異なる実施形態において変動する。場合により、各クラスタは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、又はそれ以上の遺伝子座を含む。幾つかの実施形態において、各クラスタは約５０−５００の遺伝子座を含む。幾つかの実施形態において、各クラスタは約１００−２００の遺伝子座を含む。幾つかの実施形態において、各クラスタは約１００−１５０の遺伝子座を含む。幾つかの実施形態において、各クラスタは約１０９、１２１、１３０、又は１３７の遺伝子座を含む。幾つかの実施形態において、各クラスタは約１９、２０、６１、６４、又はそれ以上の遺伝子座を含む。

【0118】

本明細書には、シリコンプレート上で非同一のオリゴ核酸を合成する方法が提供される。幾つかの例において、シリコンプレートは約１−１０、１−５０、又は５０−５００のクラスタを含む。幾つかの例において、シリコンプレートは、約５０、１００、２５０、５００、２５００、５０００、６０００、６１５０、１００００、又はそれ以上のクラスタを含む。幾つかの例において、各クラスタは１２１の遺伝子座を含む。幾つかの例において、各クラスタは、約５０−５０００、５０−２００、１００−１５０の遺伝子座を含む。幾つかの例において、各クラスタは、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、５００、１０００、又はそれ以上の遺伝子座を含む。幾つかの例において、単一のプレートは、１００、５００、１００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、５０００００、７０００００、１００００００、又はそれ以上の遺伝子座を含む。

【0119】

幾つかの実施形態において、基質上で合成された別々のオリゴ核酸の数は、基質における利用可能な別々の遺伝子座の数に左右され得る。幾つかの実施形態において、基質のクラスタ内の遺伝子座の密度は、１ｍｍ^２当たり少なくとも又は約１の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり１０の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり２５の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり５０の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり６５の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり７５の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり１００の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり１３０の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり１５０の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり１７５の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり２００の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり３００の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり４００の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり５００の遺伝子座、１ｍｍ^２当たり１，０００の遺伝子座、又はそれ以上である。場合により、基質は、１ｍｍ^２から約５００ｍｍ^２当たり約１０の遺伝子座、１ｍｍ^２から約４００ｍｍ^２当たり約２５の遺伝子座、１ｍｍ^２から約５００ｍｍ^２当たり約５０の遺伝子座、１ｍｍ^２から約５００ｍｍ^２当たり約１００の遺伝子座、１ｍｍ^２から約５００ｍｍ^２当たり約１５０の遺伝子座、１ｍｍ^２から約２５０ｍｍ^２当たり約１０の遺伝子座、１ｍｍ^２から約２５０ｍｍ^２当たり約５０の遺伝子座、１ｍｍ^２から約２００ｍｍ^２当たり約１０の遺伝子座、１ｍｍ^２から約２００ｍｍ^２当たり約５０の遺伝子座を含む。幾つかの実施形態において、クラスタ内の２つの隣接した遺伝子座の中心間の距離は、約１０μｍから約５００μｍ、約１０μｍから約２００μｍ、又は約１０μｍから約１００μｍである。場合により、隣接した遺伝子座の２つの中心間の距離は、約１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、又は１００μｍより長い。場合により、２つの隣接した遺伝子座の中心間の距離は、約２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、又は１０μｍ未満である。幾つかの例において、各遺伝子座の幅は、約０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、又は１００μｍである。場合により、各遺伝子座の幅は、約０．５μｍから１００μｍ、約０．５μｍから５０μｍ、約１０μｍから７５μｍ、又は約０．５μｍから５０μｍである。

【0120】

幾つかの実施形態において、基質内のクラスタの密度は、１００ｍｍ^２当たり少なくとも又は約１のクラスタ、１０ｍｍ^２当たり１のクラスタ、５ｍｍ^２当たり１のクラスタ、４ｍｍ^２当たり１のクラスタ、３ｍｍ^２当たり１のクラスタ、２ｍｍ^２当たり１のクラスタ、１ｍｍ^２当たり１のクラスタ、１ｍｍ^２当たり２のクラスタ、１ｍｍ^２当たり３のクラスタ、１ｍｍ^２当たり４のクラスタ、１ｍｍ^２当たり５のクラスタ、１ｍｍ^２当たり１０のクラスタ、１ｍｍ^２当たり５０のクラスタ、又はそれ以上である。幾つかの実施形態において、基質は、１０ｍｍ^２当たり約１のクラスタから１ｍｍ^２当たり約１０のクラスタを含む。幾つかの実施形態において、２つの隣接したクラスタの中心間の距離は、約５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、２０００μｍ、又は５０００μｍ未満である。場合により、２つの隣接したクラスタの中心間の距離は、約５０μｍから約１００μｍ、約５０μｍから約２００μｍ、約５０μｍから約３００μｍ、約５０μｍから約５００μｍ、及び約１００μｍから約２０００μｍである。場合により、２つの隣接したクラスタの中心間の距離は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、又は約０．５ｍｍから約２ｍｍである。場合により、各クラスタは、約０．５から２ｍｍ、約０．５から１ｍｍ、又は約１から２ｍｍの断面を有している。場合により、各クラスタは、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２ｍｍの断面を有している。場合により、各クラスタは、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．１５、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２ｍｍの内部断面を有している。

【0121】

幾つかの実施形態において、基質は、例えば、約１００〜２００ｍｍ×約５０〜１５０ｍｍの、およその標準の９６ウェルプレートのサイズであり得る。幾つかの実施形態において、基質は、約１０００ｍｍ、５００ｍｍ、４５０ｍｍ、４００ｍｍ、３００ｍｍ、２５０ｎｍ、２００ｍｍ、１５０ｍｍ、１００ｍｍ、又は５０ｍｍ以下の直径を有している。幾つかの実施形態において、基質の直径は、約２５ｍｍから１０００ｍｍ、約２５ｍｍから約８００ｍｍ、約２５ｍｍから約６００ｍｍ、約２５ｍｍから約５００ｍｍ、約２５ｍｍから約４００ｍｍ、約２５ｍｍから約３００ｍｍ、又は約２５ｍｍから約２００である。基質サイズの非限定的な例は、約３００ｍｍ、２００ｍｍ、１５０ｍｍ、１３０ｍｍ、１００ｍｍ、７６ｍｍ、５１ｍｍ、及び２５ｍｍを含む。幾つかの実施形態において、基質は、少なくとも約１００ｍｍ^２；２００ｍｍ^２；５００ｍｍ^２；１，０００ｍｍ^２；２，０００ｍｍ^２；５，０００ｍｍ^２；１０，０００ｍｍ^２；１２，０００ｍｍ^２；１５，０００ｍｍ^２；２０，０００ｍｍ^２；３０，０００ｍｍ^２；４０，０００ｍｍ^２；５０，０００ｍｍ^２又はそれ以上の平面の表面積を有している。幾つかの実施形態において、基質の厚さは、約５０ｍｍから約２０００ｍｍ、約５０ｍｍから約１０００ｍｍ、約１００ｍｍから約１０００ｍｍ、約２００ｍｍから約１０００ｍｍ、又は約２５０ｍｍから約１０００ｍｍである。基質の厚さの非限定的な例は、２７５ｍｍ、３７５ｍｍ、５２５ｍｍ、６２５ｍｍ、６７５ｍｍ、７２５ｍｍ、７７５ｍｍ、及び９２５ｍｍを含む。場合により、基質の厚さは、直径によって変わり、基質の組成物に左右される。例えば、シリコン以外の物質を含む基質は、同じ直径のシリコン基質とは異なる厚さを有している。基質の厚さは、使用される物質の機械強度によって決定され、取り扱い中に割れることなくそれ自体の重量を支えるのに十分でなければならない。

【0122】

表面物質

【0123】

本明細書に提供される基質、装置、及びリアクターは、本明細書に記載される方法及び組成物に適したあらゆる様々な物質から作り上げられる。特定の実施形態において、低レベルのヌクレオチド結合を示すために、基質物質が作り上げられる。場合により、基質物質は、高レベルのヌクレオチド結合を示す別々の表面を生成するために修正される。幾つかの実施形態において、基質物質は、可視光及び／又はＵＶ光に対して透過性である。幾つかの実施形態において、基質物質は、十分に導電性である、例えば、基質の全て又は一部にわたって均一な電場を形成することができる。幾つかの実施形態において、導電性材料は電気接地（ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｇｒｏｕｎｄ）に接続される。場合により、基質は、熱伝導性であるか又は断熱される。場合により、物質は、化学的又は生化学的な反応、例えばオリゴ核酸合成反応プロセスを支持するために耐薬品性及び耐熱性である。幾つかの実施形態において、基質は可撓性材料を含む。可撓性材料は、限定されないが、修飾ナイロン、非修飾ナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレンなどを含む。幾つかの実施形態において、基質は剛性材料を含む。剛性材料は、限定されないが、ガラス、石英ガラス（ｆｕｓｅ ｓｉｌｉｃａ）、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、プラスチック（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、及びそれらの混合物など）、及び金属（例えば、金、白金など）を含む。幾つかの実施形態において、基質は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス、又はそれらの任意の組み合わせを含む材料から作り上げられる。場合により、基質は、本明細書にリストされた材料又は当該技術分野において既知の他の適切な材料の組み合わせで製造される。

【0124】

表面のアーキテクチャ

【0125】

様々な実施形態において、基質は隆起した及び／又は沈降した特徴を含む。そのような特徴を有している１つの利点は、オリゴ核酸合成を支持する表面積の増大である。幾つかの実施形態において、隆起した及び／又は沈降した特徴を有する基質は、三次元基質と呼ばれる。場合により、三次元基質は１つ以上のチャネルを含む。場合により、１つ以上の遺伝子座はチャネルを含む。場合により、チャネルは、オリゴ核酸シンセサイザーなどの堆積装置を介した試薬の堆積に利用可能である。場合により、試薬及び／又は流体は、１つ以上のチャネルと流体連通してより大きなウェルに集まる。例えば、基質は、クラスタを有する複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、複数のチャネルは、クラスタの１つのウェルと流体連通している。
幾つかの方法において、オリゴ核酸のライブラリは、クラスタの複数の遺伝子座において合成される。

【0126】

幾つかの実施形態において、その構造は、表面上のオリゴ核酸合成に関する流れの及び物質移動経路の制御を可能にするように構成されている。幾つかの実施形態において、基質の構成は、オリゴ核酸合成中の物質移動経路、化学暴露時間、及び／又は洗浄効果の制御並びにその分布までをも可能にする。幾つかの実施形態において、基質の構成は、例えば、成長しているオリゴ核酸による排除体積が、オリゴ核酸の成長に利用可能な又は適切な最初に利用可能な体積の５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％を超えて、又はそれ以下を占めないほど十分な、オリゴ核酸の成長に対する体積を提供することによって、奏効率の増大を可能にする。幾つかの実施形態において、三次元構造は、化学暴露の急速な交換を可能にするために流体の流れの管理を可能にする。

【0127】

幾つかの実施形態において、物理構造によって隔離が達成される。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸合成に対する能動領域及び受動領域を発生させる表面の差次的な官能化によって、隔離が達成される。差次的な官能化はまた、基質表面にわたる疎水性を変え、それによって、堆積した試薬の水滴（ｂｅａｄｉｎｇ）又は湿りを引き起こす水接触角の効果を作り出すことによって達成される。より大きな構造を利用することで、飛び散り（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）及び隣接するスポットの試薬による別々のオリゴ核酸合成位置の相互汚染を減らすことができる。場合により、オリゴ核酸シンセサイザーなどの装置が、別々のオリゴ核酸合成位置のための試薬を堆積させるために使用される。三次元の特徴を有する基質は、低いエラー率（例えば、約１：５００、１：１０００、１：１５００、１：２，０００、１：３，０００、１：５，０００、又は１：１０，０００未満）で多数のオリゴ核酸（例えば約１０，０００を超える）の合成を可能にする方法で構成される。幾つかの事例では、基質は、１ｍｍ^２当たり約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００又は５００、或いはそれらを超える特徴の密度を備えた特徴を含む。

【0128】

基質のウェルは、基質の別のウェルと同じ又は異なる幅、高さ、及び／又は体積を有し得る。基質のチャネルは、基質の別のチャネルと同じ又は異なる幅、高さ、及び／又は体積を有し得る。幾つかの実施形態において、クラスタの直径、又はクラスタを含むウェルの直径、或いはその両方は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、又は約０．５ｍｍから約２ｍｍである。幾つかの実施形態において、クラスタ、ウェル、又はその両方の直径は、約５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍ又は０．０５ｍｍ、或いはそれ未満である。幾つかの実施形態において、クラスタ、ウェル、又はその両方の直径は約１．０〜１．３ｍｍである。幾つかの実施形態において、クラスタ、ウェル、又はその両方の直径は約１．１５０ｍｍである。幾つかの実施形態において、クラスタ、ウェル、又はその両方の直径は約０．０８ｍｍである。クラスタの直径は、二次元又は三次元の基質内のクラスタを指す。

【0129】

幾つかの実施形態において、ウェルの高さは、約２０μｍから約１０００μｍ、約５０μｍから約１０００μｍ、約１００μｍから約１０００μｍ、約２００μｍから約１０００μｍ、約３００μｍから約１０００μｍ、約４００μｍから約１０００μｍ、又は約５００μｍから約１０００μｍである。場合により、ウェルの高さは、約１０００μｍ未満、約９００μｍ未満、約８００μｍ未満、約７００μｍ未満、又は約６００μｍ未満である。

【0130】

幾つかの実施形態において、基質は、クラスタ内の複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、チャネルの高さ又は深さは、約５μｍから約５００μｍ、約５μｍから約４００μｍ、約５μｍから約３００μｍ、約５μｍから約２００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、約５μｍから約５０μｍ、又は約１０μｍから約５０μｍである。場合により、チャネルの高さは、１００μｍ未満、８０μｍ未満、６０μｍ未満、４０μｍ未満又は２０μｍ未満である。

【0131】

幾つかの実施形態において、チャネル、遺伝子座（例えば、実質的に平面の基板における）、又はチャネル及び遺伝子座の両方の直径（例えば、遺伝子座がチャネルに対応する三次元構造基質における）は、約１μｍから約１０００μｍ、約１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約２００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、又は約１０μｍから約１００μｍ、例えば、約９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、又は１０μｍである。幾つかの実施形態において、チャネル、遺伝子座、又はチャネル及び遺伝子座の両方の直径は、約１００μｍ、９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ又は１０μｍ未満である。幾つかの実施形態において、２つの隣接チャネル、遺伝子座、又はチャネル及び遺伝子座の中心間の距離は、約１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約２００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約５μｍから約２００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、約５μｍから約５０μｍ、又は約５μｍから約３０μｍ、例えば、約２０μｍである。

【0132】

表面修飾

【0133】

様々な実施形態において、基質表面又は基質表面の選択部位或いは領域の１つ以上の化学的及び／又は物理的な特性を変更する加算或いは減算のプロセスによる化学的及び／又は物理的な変更のために、表面修飾が利用される。例えば、表面修飾は、限定されないが、（１）表面の湿潤性を変更すること、（２）表面を官能化すること、つまり、表面官能基を提供する、修飾する、又は置換すること、（３）表面を脱官能基化すること、つまり、表面官能基を除去すること、（４）そうでなければ、例えばエッチングによって、表面の化学組成を変更すること、（５）表面粗さを増大又は低減すること、（６）表面上にコーティング、例えば、表面の湿潤性とは異なる湿潤性を示すコーティングを提供すること、及び／又は（７）表面上に粒子を堆積させることを含む。

【0134】

場合により、（接着プロモーターと呼ばれる）表面の上部の化学層の追加は、基質の表面上の遺伝子座の構造化されたパターン化を促進する。接着促進の適用のための典型的な表面は、限定されないが、ガラス、シリコン、二酸化ケイ素及び窒化ケイ素を含む。場合により、接着プロモーターは、高い表面エネルギーを有する化学物質である。幾つかの実施形態において、基質の表面上に第２の化学層が堆積される。場合により、第２の化学層は、低い表面エネルギーを有している。場合により、表面上にコーティングされた化学層の表面エネルギーは、表面上での液滴の局在化を支持する。選択されるパターン化の配置によって、遺伝子座の接近及び／又は遺伝子座での流体接触の領域は変更可能である。

【0135】

幾つかの実施形態において、例えばオリゴ核酸合成のために、核酸又は他の部分が堆積される、基質表面、或いは分解された遺伝子座は、滑らか又は実質的に平面である（例えば、二次元）か、或いは隆起した又は沈降した特徴などの不規則性を有している（例えば三次元の特徴）。幾つかの実施形態において、基質表面は、化合物の１つ以上の異なる層で修飾される。対象のそのような修飾層は、限定されないが、金属、金属酸化物、ポリマー、小さな有機分子などの無機層及び有機層を含む。非限定的なポリマー層は、ペプチド、タンパク質、核酸又はそれらの模倣物（例えば、ペプチド核酸など）、多糖類、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、及び本明細書に記載される又はそうでなければ当該技術分野に既知の他の適切な化合物を含む。場合により、ポリマーはヘテロポリマーである。場合により、ポリマーはホモポリマーである。場合により、ポリマーは、官能性部分を含むか又は結合される。

【0136】

幾つかの実施形態において、基質の分解された遺伝子座は、表面エネルギーを増大させる及び／又は低減させる１つ以上の部分で官能化される。場合により、部分は化学的に不活性である。場合により、部分は、望ましい化学反応、例えば、オリゴ核酸合成反応における１つ以上のプロセスを支持するように構成されている。表面の表面エネルギー、即ち疎水性は、表面上へと付着するヌクレオチドの親和性を決定するための因子である。幾つかの実施形態において、基質の官能化のための方法は、（ａ）二酸化ケイ素を含む表面を有する基質を提供する工程；及び（ｂ）本明細書に記載される又はそうでなければ当該技術分野で既知の適切なシラン化剤、例えば、有機官能性アルコキシシラン分子を使用して、表面をシラン処理する工程を含む。場合により、有機官能性アルコキシシラン分子は、ジメチルクロロ−オクトデシル−シラン、メチルジクロロ−オクトデシル−シラン、トリクロロ−オクトデシル−シラン、トリメチル−オクトデシル−シラン、トリエチル−オクトデシル−シラン、又はそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、基質表面は、ポリエチレン／ポリプロピレン（ヒドロキシアルキル表面へのガンマ線照射又はクロム酸酸化、及び還元によって官能化）、高度に架橋されたポリスチレン−ジビニルベンゼン（クロロメチル化によって誘導体化され、ベンジルアミン官能面にアミノ化された）、ナイロン（末端のアミノヘキシル基は直接反応性である）で官能化されるか、又は還元されたポリテトラフルオロエチレンでエッチングされる。他の方法及び官能化剤は、米国特許第５，４７４，７９６号に記載され、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0137】

幾つかの実施形態において、基質表面は、典型的に基質表面上に存在する反応性の親水性部分を介して、基質表面にシランを結合させるのに有効な反応条件下で、シランの混合物を含有している誘導体化組成物との接触によって官能化される。シラン処理は、一般に、自己組織化を介して有機官能性アルコキシシラン分子で表面を覆う。当該技術分野において現在知られているように、例えば、表面エネルギーを低下させる又は増大させるための様々なシロキサン官能化試薬が更に使用され得る。有機官能性のアルコキシシランは、その有機官能基に応じて分類される。シロキサン官能化試薬の非限定的な例は、ヒドロキシアルキルシロキサン（シリル化表面（ｓｉｌｙｌａｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ）、ジボランで官能化し、過酸化水素によりアルコールを参加させる）、ジオール（ヒドロキシアルキル）シロキサン（シリル化表面、ジオールへと加水分解）、アミノアルキルシロキサン（アミンは中間の官能化工程を必要としない）、グリシドキシシラン（３−グシリドキシプロピル−ジメチル−エトキシシラン、グリシドキシ−トリメトキシシラン、メルカプトシラン（３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、３−４エポキシシクロヘキシル−エチルトリメトキシシラン、又は３−メルカプトプロピル−メチル−ジメトキシシラン）、ビシクロヘプタヘニル−トリクロロシラン、ブチル−アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｒ）−トリメトキシシラン、又は二量体の第２のアミノアルキルシロキサンを含む。例示的なヒドロキシアルキルシロキサンは、３−ヒドロキシプロピルへと変わるアリルトリクロロクロロシラン、又は８−ヒドロキシオクチルへと変わる７−オクタ−１−エニルトリクロロクロロシランを含む。ジオール（ジヒドロキシアルキル）シロキサンは、グリシジルトリメトキシシラン由来（２，３−ジヒドロキシプロピルオキシ）プロピル（ＧＯＰＳ）を含む。アミノアルキルシロキサンは、３−アミノプロピル（３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、３−アミノプロピル−ジエトキシ−メチルシラン、３−アミノプロピル−ジメチル−エトキシシラン、又は３−アミノプロピル−トリメトキシシラン）へと変わる３−アミノプロピルトリメトキシシランを含む。例示的な二量体の第２のアミノアルキルシロキサンは、ビス（シリルオキシルプロピル）アミンへと変わるビス（３−トリメトキシシリルプロピル）アミンを含む。幾つかの実施形態において、官能化剤は、１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシラン、ｎ−デシルトリエトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン、グリシジルオキシプロピル／トリメトキシシラン、及びＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドを含む。

【0138】

オリゴ核酸合成

【0139】

オリゴ核酸合成のための方法は、様々な実施形態において、ホスホロアミダイト化学物質を含むプロセスを含む。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸合成は、塩基をホスホラミダイトと結合する工程を含む。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸合成は、結合条件下でホスホラミダイトの堆積によって塩基を結合する工程を含み、ここで同じ塩基が、１回より多く、即ち、二重の結合でホスホラミダイトと共に随意に堆積される。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸合成は、未反応部位のキャッピングを含む。場合により、キャッピングは随意である。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸合成は酸化を含む。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸合成はデブロッキング又は脱トリチル化を含む。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸合成は硫化を含む。場合により、オリゴ核酸合成は、酸化又は硫化のいずれかを含む。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸合成反応中の１つ又は各々の工程間で、基質は、例えば、テトラゾール又はアセトニトリルを使用して洗浄される。ホスホラミダイト合成方法における任意の１工程に対する時間枠は、約２分、１分、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒及び１０秒未満を含む。

【0140】

ホスホラミダイト方法を使用するオリゴ核酸合成は、亜リン酸塩トリエステル結合の形成のために成長しているオリゴ核酸鎖へのホスホラミダイト構築ブロック（例えば、ヌクレオシドホスホラミダイト）のその後の追加を含む。ホスホラミダイトオリゴ核酸合成は、３’方向から５’方向に進む。ホスホラミダイトオリゴ核酸合成は、１つの合成サイクル当たり、成長している核酸鎖への１つのヌクレオチドの追加の制御を可能にする。幾つかの実施形態において、各合成サイクルは結合工程を含む。ホスホラミダイト結合は、活性化されたヌクレオシドホスホラミダイトと、例えばリンカーを介して基質に結合されたヌクレオシドとの間の亜リン酸塩トリエステル結合の形成を含む。幾つかの実施形態において、ヌクレオシドホスホラミダイトは、活性化された基質に提供される。幾つかの実施形態において、ヌクレオシドホスホラミダイトは、活性化因子と共に基質に提供される。幾つかの実施形態において、ヌクレオシドホスホラミダイトは、基質に結合されたヌクレオシドよりも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍、又はそれ以上の過剰量で、基質に提供される。幾つかの実施形態において、ヌクレオシドホスホラミダイトの追加は、無水環境において、例えば、無水アセトニトリルにおいて実行される。ヌクレオシドホスホラミダイトの追加に続いて、基質は随意に洗浄される。幾つかの実施形態において、結合工程は、随意に、基質へのヌクレオシドホスホラミダイトの追加間の洗浄工程と共に、追加で１回以上繰り返される。幾つかの実施形態において、本明細書で使用されるオリゴ核酸合成方法は、１、２、３又はそれ以上の連続結合工程を含む。結合前に、多くの場合において、基質に結合されたヌクレオシドは、保護基の除去によって脱保護され、ここで、保護基は重合を防ぐように機能する。一般的な保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。

【0141】

結合に続いて、ホスホラミダイトオリゴ核酸合成方法は、随意にキャッピング工程を含む。キャッピング工程では、成長しているオリゴ核酸は、キャッピング剤で処置される。キャッピング工程は、更なる鎖伸長からの結合後に未反応の基質に結合した５’−ＯＨ基をブロックするのに有用であり、これによって、内部塩基欠失（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｂａｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）でのオリゴ核酸の形成を防ぐ。更に、１Ｈ−テトラゾールで活性化されたホスホラミダイトは、小さい程度まで、グアノシンのＯ６位置と反応し得る。理論に縛られることなく、Ｉ_２／水での酸化で、この副産物は、恐らくＯ６−Ｎ７遊走を介して、脱プリン化を受けることもある。脱プリン部位は、最終的に、オリゴ核酸の最終的な脱保護の間に切断され、これにより全長産物の収率が低下する。Ｏ６修飾は、Ｉ_２／水での酸化前にキャッピング試薬による処置によって除去され得る。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸合成の間にキャッピング工程を含めることで、キャッピングなしでの合成と比較して、エラー率は低下する。一例として、キャッピング工程は、無水酢酸と１−メチルイミダゾールとの混合物で、基質に結合したオリゴ核酸を処置することを含む。キャッピング工程に続いて、基質は随意に洗浄される。

【0142】

幾つかの実施形態において、ヌクレオシドホスホラミダイトの追加に続いて、及び随意にキャッピングと１以上の洗浄工程の後に、基質に結合した成長している核酸が酸化される。酸化工程は、亜リン酸塩トリエステルが、自然発生のリン酸ジエステルのヌクレオシド間の結合の保護された前駆体である、四配位リン酸塩トリエステルへと酸化される。場合により、成長しているオリゴ核酸の酸化は、随意に弱塩基（例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン）の存在下で、ヨウ素及び水による処置によって達成される。酸化は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド又は（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファースルホニル）−オキサジリジン（ＣＳＯ）を使用して、無水条件下で実行され得る。幾つかの方法では、キャッピング工程は、酸化に続いて実行される。持続し得る酸化からの残留水が、後の結合を阻害することができるため、第２のキャッピング工程は基質の乾燥を可能にする。酸化に続いて、基質及び成長しているオリゴ核酸は随意に洗浄される。幾つかの実施形態において、酸化の工程は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートを得るための硫化工程と置き換えられ、ここでキャッピング工程は硫化後に実行され得る。限定されないが、３−（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン、ＤＤＴＴ、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られている３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、及びＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を含む、多くの試薬が、効率的な硫黄移動を行うことができる。

【0143】

ヌクレオシド取り込みの後のサイクルを、結合を介して生じさせるために、基質に結合した成長しているオリゴ核酸の保護された５’末端は除去され、その結果、一次ヒドロキシル基が次のヌクレオシドホスホラミダイトと反応する。幾つかの実施形態において、保護基はＤＭＴであり、デブロッキングがジクロロメタン中でトリクロロ酢酸により生じる。長時間にわたり、又は推奨された酸の溶液よりも強力なもので、脱トリチル化を行うことは、固形支持体に結合したオリゴヌクレオチドの脱プリン化の増大につながり、故に望ましい全長産物の収率が低下することがある。本明細書に記載の本発明の方法及び組成物は、望ましくない脱プリン反応を制限する制御されたデブロッキングの条件を提供する。場合により、基質に結合したオリゴ核酸は、デブロッキング後に洗浄される。場合により、デブロッキング後の効率的な洗浄は、低いエラー率を有する合成オリゴ核酸に寄与する。

【0144】

オリゴ核酸の合成のための方法には、典型的に下記工程の一連の繰り返し（ｉｔｅｒａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が伴う：活性化された表面、リンカー、又は以前に脱保護された単量体と結合するために、保護された単量体の活発に官能化された表面（例えば遺伝子座）への適用；後に適用される保護された単量体と反応するような、適用された単量体の脱保護；及び結合のための別の保護された単量体の適用。１以上の中間工程は、酸化又は硫化を含む。場合により、１以上の洗浄工程は、工程の１つ又は全てに先行する、又はそれらに続いて行われる。

【0145】

ホスホラミダイトベースのオリゴ核酸合成のための方法は、一連の化学工程を含む。幾つかの実施形態において、合成方法の１以上の工程は、試薬のサイクリングを含み、ここで、方法の１以上の工程は、この工程に有用な試薬の基質への適用を含む。例えば、試薬は、一連の液体堆積及び真空乾燥の工程によって循環させられる。ウェル、マイクロウェル、チャネルなどの三次元の特徴を含む基質のために、試薬は、随意にウェル及び／又はチャネルを介して基質の１つ以上の領域に通される。

【0146】

本明細書に記載される方法及び／又は基質を使用して合成されたオリゴ核酸は、様々な実施形態において、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２０、１５０、又はそれ以上の塩基を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも約１ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、２０ｐｍｏｌ、３０ｐｍｏｌ、４０ｐｍｏｌ、５０ｐｍｏｌ、６０ｐｍｏｌ、７０ｐｍｏｌ、８０ｐｍｏｌ、９０ｐｍｏｌ、１００ｐｍｏｌ、１５０ｐｍｏｌ、２００ｐｍｏｌ、３００ｐｍｏｌ、４００ｐｍｏｌ、５００ｐｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ、７００ｐｍｏｌ、８００ｐｍｏｌ、９００ｐｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、５ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、１００ｎｍｏｌ、又はそれ以上のオリゴ核酸は、遺伝子座内で合成される。本明細書で提供される、表面上でのオリゴ核酸合成の方法は、高速での合成を可能にする。一例として、１時間につき少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５ ５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００のヌクレオチド、又はそれ以上が合成される。ヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウリジンの構築ブロック、又はそれらのアナログ／修飾されたバージョンを含む。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸のライブラリは基質上で平行に合成される。例えば、約又は少なくとも約１００；１，０００；１０，０００；１００，０００；１，０００，０００；２，０００，０００；３，０００，０００；４，０００，０００；又は５，０００，０００の分解された遺伝子座を含む基質は、少なくとも同じ数の別個のオリゴ核酸の合成を支援することができ、ここで、別個の配列をコードするオリゴ核酸が、分解された遺伝子座の上で合成される。幾つかの実施形態において、オリゴ核酸のライブラリは、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満で、本明細書に記載される低いエラー率を伴う基質上で合成される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される基質及び方法を用いて低いエラー率で合成されるオリゴ核酸ライブラリから組み立てられる、より大きな核酸は、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満で調製される。

【0147】

一旦、生成のためにより大きなオリゴ核酸が選択されると、オリゴ核酸の予め定められたライブラリは、デノボ合成のために設計される。高密度のオリゴ核酸アレイを生成するための様々な適切な方法が知られている。ワークフローの例において、基質表面層が提供される。この例において、表面の化学的性質（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、オリゴ核酸合成プロセスを改善するために変更される。低い表面エネルギーの領域が液体を弾くために生成され、一方で高い表面エネルギーの領域が液体を引き付けるために生成される。表面自体は、平坦な表面の形であり、又は、表面積を増大させる突起又はマイクロウェルなどの形状の変形を含み得る。ワークフローの例において、全体において参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ／２０１５／０２１０８０に開示されるように、選択された高い表面エネルギー分子は、ＤＮＡの化学的性質を支援する二元機能に役立つ。

【0148】

オリゴ核酸アレイのインサイツの調製は、固形支持体上で生成され、平行して複数のオリゴマーを伸長させるために単一のヌクレオチド伸長プロセスを利用する。オリゴ核酸シンセサイザーなどの堆積装置は、段階的な様式で試薬を放出するように設計され、その結果、複数のオリゴ核酸が平行して、一度に１つの残基を伸長させ、それにより予め定められた核酸配列を持つオリゴマーを生成する。場合により、オリゴ核酸はこの段階で表面から切断される。切断は、例えばアンモニア又はメチルアミンによる気相切断（ｇａｓ ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む。

【0149】

コンピューターシステム

【0150】

本明細書に記載されるシステムの何れかは、コンピューターに操作可能に連結され、且つコンピューターを介して局所的に又は遠隔で自動操作され得る。様々な実施形態において、本発明の方法及びシステムは更に、コンピューターシステム上のソフトウェアプログラム、及びその使用を含み得る。従って、材料堆積装置の動作、分配行為、及び減圧の作動を編成及び同期するなど、機能の分配／減圧／再充填の同期のためのコンピューター制御は、本発明の範囲内にある。コンピューターシステムは、ユーザーに指定された塩基配列と材料堆積装置の位置との間に干渉するようにプログラムされ、基質の指定された領域に正確な試薬を送達する。

【0151】

図８に例示されるコンピューターシステム（８００）は、媒体（８１１）及び／又はネットワークポート（８０５）から命令を読み出すことが可能な、論理的な装置として理解され、固定された媒体（８１２）を持つサーバー（８０９）に随意に接続され得る。図８に示されるものなどのシステムは、ＣＰＵ（８０１）、ディスクドライブ（８０３）、キーボード（８１５）及び／又はマウス（８１６）などの随意の入力装置、及び随意のモニター（８０７）を含み得る。データ通信は、局所又は遠隔の位置でサーバーに対して示された通信媒体を通じて達成され得る。通信媒体は、データを送信及び／又は受信する任意の手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、又はインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールド・ワイド・ウェブ上での通信を提供することができる。本開示に関するデータは、図８に例示されるように当事者（８２２）による受理及び／又は検討のためにそのようなネットワーク又は接続によって伝達され得ることが想定される。

【0152】

図９は、本発明の実施形態の例と関連して使用され得るコンピューターシステム（９００）の第１の例のアーキテクチャを示すブロック図である。図９に表されるように、コンピューターシステムの例は、命令を処理するためのプロセッサ（９０２）を含み得る。プロセッサの限定されない例は、以下を含む：Ｉｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサ、ＡＭＤ Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ ３２−ｂｉｔ ＲＩＳＣ ＡＲＭ １１７６ＪＺ（Ｆ）−Ｓ ｖ１．０（商標）プロセッサ、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８ Ｓａｍｓｕｎｇ Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサ、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８ Ａｐｐｌｅ Ａ４（商標）プロセッサ、Ｍａｒｖｅｌｌ ＰＸＡ ９３０（商標）プロセッサ、又は機能的に同等なプロセッサ。複数のスレッドの実行が並列処理のために使用され得る。幾つかの実施形態において、複数のプロセッサ、又は複数のコアを持つプロセッサはまた、単一のコンピューターシステム中でも、クラスタの中でも、又は、複数のコンピューター、携帯電話、及び／又は個人用携帯情報端末装置を含むネットワーク上のシステムにわたって分布されても、使用され得る。

【0153】

図９に例示されるように、高速キャッシュ（９０４）は、プロセッサ（９０２）に接続するか、又はその中に組み込まれることで、プロセッサ（９０２）により近年使用されてきた又は頻繁に使用されている命令又はデータのための高速メモリを提供することができる。プロセッサ（９０２）は、プロセッサバス（９０８）によりノースブリッジ（９０６）に接続される。ノースブリッジ（９０６）は、メモリバス（９１２）によりランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（９１０）に接続され、プロセッサ（９０２）によりＲＡＭ（９１０）へのアクセスを管理する。ノースブリッジ（９０６）はまた、チップセットバス（９１６）によりサウスブリッジ（９１４）に接続される。サウスブリッジ（９１４）は次に、周辺バス（９１８）に接続される。周辺バスは、例えばＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ、又は他の周辺バスであり得る。ノースブリッジ及びサウスブリッジは頻繁に、プロセッサチップセットと称され、周辺バス（９１８）上でプロセッサと、ＲＡＭと、周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。幾つかの代替的なアーキテクチャにおいて、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサに組み込まれ得る。幾つかの実施形態において、システム（９００）は、周辺バス（９１８）に付けられたアクセラレータカード（９２２）を含むことができる。アクセラレータは、特定の処理を促進するためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）又は他のハードウェアを含み得る。例えば、アクセラレータは、適応データの再構築のために、又は、拡張設定処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。

【0154】

ソフトウェアとデータは、外部記憶装置（９２４）に記憶され、プロセッサによる使用のためにＲＡＭ（９１０）及び／又はキャッシュ（９０４）へとロードされ得る。システム（９００）は、システムリソースの管理のためのオペレーティングシステムを含み；オペレーティングシステムの限定されない例は、以下を含む：Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、及び他の機能的に同等なＯＳ、同様に、本発明の実施形態の例に従ってデータの記憶と最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行するアプリケーションソフトウェア。この例において、システム（９００）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）などの外部記憶装置、及び分散並列処理に使用され得る他のコンピューターシステムに対するネットワークインターフェースを提供するために、周辺バスに接続されるネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（９２０）及び（９２１）を含む。

【0155】

図１０は、複数のコンピューターシステム（１００２ａ）及び（１００２ｂ）、複数の携帯電話及び個人用携帯情報端末（１００２ｃ）、並びにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１００４ａ）及び（１００４ｂ）を含むネットワーク（１０００）を示す略図である。実施形態の例において、システム（１００２ａ）、（１００２ｂ）、及び（１００２ｃ）は、データ記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１００４ａ）及び（１００４ｂ）に記憶されたデータに対するデータアクセスを最適化することができる。数学モデルはこのデータに対して使用され、コンピューターシステム（１００２ａ）及び（１００２ｂ）、並びに携帯電話及び個人用携帯情報端末システム（１００２ｃ）にわたって分散並列処理を使用して評価され得る。コンピューターシステム（１００２ａ）及び（１００２ｂ）、並びに携帯電話及び個人用携帯情報端末システム（１００２ｃ）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１００４ａ）及び（１００４ｂ）に記憶されたデータの適応データ再構築に対して並列処理を提供することができる。図１０は一例のみを例示しており、様々な他のコンピューターのアーキテクチャ及びシステムは、本発明の様々な実施形態と共に使用され得る。例えば、ブレードサーバーは並列処理を提供するために使用され得る。プロセッサブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンを通じて接続され得る。ストレージはまた、別個のネットワークインターフェースを通ってバックプレーンに、又はネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続され得る。幾つかの実施形態の例において、プロセッサは、別個のメモリ空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、又は他のプロセッサによる並列処理のための他のコネクターを通じてデータを伝達することができる。他の実施形態において、プロセッサの幾つか又は全てが、共有仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。

【0156】

図１１は、実施形態の例に従って共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサコンピューターシステムのブロック図である。システムは、共有メモリサブシステム（１１０４）にアクセス可能な複数のプロセッサ（１１０２ａ−ｆ）を含む。システムは、メモリサブシステム（１１０４）に複数のプログラマブルハードウェアのメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（１１０６ａ−ｆ）を組み込む。ＭＡＰ（１１０６ａ−ｆ）は各々、メモリ（１１０８ａ−ｆ）及び１以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（１１１０ａ−ｆ）を含み得る。ＭＡＰは設定可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズム又はその一部は、各プロセッサと密接に協働して処理を行うためにＦＰＧＡ（１１１０ａ−ｆ）に提供され得る。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価し、且つ実施形態の例における適応データの再構築を行なうために使用され得る。この例において、ＭＡＰは各々、このような目的のためのプロセッサ全てにより世界的にアクセス可能である。１つの構成において、ＭＡＰは各々、関連するメモリ（１１０８ａ−ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、それにより、各マイクロプロセッサ（１１０２ａ−ｆ）とは別個に、且つこれらから非同期的にタスクを実行することが可能となる。この構成において、ＭＡＰは、パイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）及びアルゴリズムの並列の実行のために別のＭＡＰに直接結果を供給することができる。

【0157】

上述のコンピューターのアーキテクチャ及びシステムは単なる例であり、様々な他のコンピューター、携帯電話、個人用携帯情報端末のアーキテクチャ及びシステムは、一般的なプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡ、及び他のプログラム可能論理回路の任意の組み合わせを使用するシステム、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、及び他の処理要素と論理素子を含む実施形態の例と共に使用され得る。幾つかの実施形態において、コンピューターシステムの全て又は一部は、ソフトウェア又はハードウェアに実装され得る。様々なデータ記憶媒体が、例えばランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、及び他のローカル又は分散データ記憶装置及びシステムを含む実施形態の例と共に使用され得る。

【0158】

実施形態の例において、コンピューターシステムは、上述の又は他のコンピューターのアーキテクチャ及びシステムの何れかにて実行するソフトウェアモジュールを使用して実施され得る。他の実施形態において、システムの機能は、ファームウェア、図１１で言及されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラム可能論理回路、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、又は他の処理要素及び論理素子において部分的又は完全に実施され得る。例えば、セットプロセッサ及びオプティマイザは、図９に示されるアクセラレータカード（９２２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用によるハードウェアアクセラレーションで実施され得る。

【0159】

以下の実施例は、当業者に対し本明細書に開示される実施形態の原理及び実践をより明白に示すために説明されるものであり、任意の請求された実施形態の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。他に明示されない限り、全ての部分及びパーセンテージは重量基準である。

【実施例】

【0160】

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で与えられ、あらゆる様式で本発明を制限することを意図していない。本明細書に記載される方法とともに、本実施例は、好ましい実施形態の代表例であり、典型的なものであり、且つ、本発明の範囲を限定するものとして意図されない。請求項の範囲によって定義される本発明の趣旨内に包含されるその変化及び他の使用が、当業者に想定される。

【0161】

実施例１：基質表面の機能化

【0162】

基質を機能化し、オリゴ核酸のライブラリの付着及び合成を支援した。基質表面を先ず、２０分間、９０％のＨ_２ＳＯ_４及び１０％のＨ_２Ｏ_２を含むピラニア溶液を使用して湿式洗浄した。基質を、ＤＩ水を含む幾つかのビーカーの中ですすぎ、５分間ＤＩ水のグーズネック形状の蛇口の下で保持して、Ｎ_２で乾燥させた。基質を５分間、ＮＨ_４ＯＨ（１：１００；３ｍＬ：３００ｍＬ）に浸し、ハンドガン（ｈａｎｄｇｕｎ）を使用してＤＩ水ですすぎ、ＤＩ水を含む３つの連続するビーカーの中で各々１分間浸し、その後ハンドガンを使用してＤＩ水で再びすすいだ。その後、基質表面をＯ_２にさらすことにより基質をプラズマ洗浄した。ＳＡＭＣＯ ＰＣ−３００機器を使用して、下流モードで１分間、２５０ワットでＯ_２をプラズマエッチングした。

【0163】

以下のパラメータを有するＹＥＳ−１２２４Ｐ気相蒸着オーブンシステムを使用して、清潔になった基質表面をＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドを含む溶液で活動的に官能化した：０．５から１トル、６０分、７０℃、１３５℃の気化器。Ｂｒｅｗｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００Ｘスピンコータを使用して、基質表面をレジストコートした（ｒｅｓｉｓｔ ｃｏａｔｅｄ）。ＳＰＲ（商標）３６１２フォトレジストを、４０秒間２５００ｒｐｍで基質上でスピンコートした。基質を予め、Ｂｒｅｗｅｒホットプレート上で、９０℃で３０分間焼いた。Ｋａｒｌ Ｓｕｓｓ ＭＡ６マスクアライナー機器を使用して、基質をフォトリソグラフィーにさらした。基質を２．２秒間さらし、ＭＳＦ ２６Ａの中で１分間展開させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。残りの展開物（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）をハンドガンですすぎ、基質を５分間水に浸した。基質をオーブンの中、１００℃で３０分間焼き、その後、Ｎｉｋｏｎ Ｌ２００を使用してリソグラフィーの欠損に対する目視検査を行った。洗浄処理を使用し、ＳＡＭＣＯ ＰＣ−３００機器を用いて残りのレジストを取り除き、１分間２５０ワットでＯ_２プラズマエッチングした。

【0164】

基質表面を、１０μＬの軽油と混合したパーフルオロオクチルトリクロロシランの１００μＬの溶液で受動的に官能化した。基質をチャンバに入れ、１０分間ポンプでくみ出し、その後、バルブを閉じてポンプを止め、１０分間放置した。チャンバを通気した。最大パワー（Ｃｒｅｓｔシステム上で９）での超音波処理による７０℃で５００ｍＬのＮＭＰの中で５分間の２回の浸漬を行なうことにより、基質をレジスト剥離した。その後、最大パワーでの超音波処理により室温で５００ｍＬのイソプロパノールの中で５分間、基質を浸した。基質を、３００ｍＬの２００プルーフエタノール（２００ ｐｒｏｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ）に漬けて、Ｎ_２で送風乾燥した。官能化した表面は活性化され、オリゴ核酸合成のための支持体として役立った。

【0165】

実施例２：オリゴ核酸合成装置上での５０ｍｅｒの配列の合成

【0166】

二次元オリゴ核酸合成装置をフローセルに組み入れ、フローセル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 「ＡＢＩ３９４ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」）に接続させた。Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（Ｇｅｌｅｓｔ）で二次元オリゴ核酸合成装置を均一に官能化し、これを使用して、本明細書に記載されるオリゴ核酸合成方法を用いて５０ｂｐの例示的なオリゴ核酸（「５０ｍｅｒのオリゴ核酸」）を合成した。

【0167】

５０ｍｅｒの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されている通りであった。５’ＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ここで、＃は、チミジン−スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ−２２４４）を表わし、これは、脱保護中に表面からのオリゴ核酸の放出を可能にする切断可能なリンカーである。

【0168】

表５のプロトコル及びＡＢＩシンセサイザーに従い標準ＤＮＡ合成化学（結合、キャッピング、酸化、及び非ブロック化）を使用して、合成を行った。

【0169】

【表5-1】

【0170】

【表5-2】

【0171】

【表5-3】

【0172】

ホスホラミダイト／活性化因子の組み合わせを、フローセルを通じたバルク試薬の送達と同様に送達した。環境が時間全体にわたり試薬により「湿った」ままであると、乾燥工程を行わなかった。

【0173】

フローリストリクターをＡＢＩ３９４シンセサイザーから取り除き、より速い流れを可能した。フローリストリクターなしで、アミダイト（ＡＣＮ中で０．１Ｍ）、活性化因子（ＡＣＮ中で０．２５Ｍのベンゾイルチオテトラゾール（「ＢＴＴ」；ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈの３０−３０７０−ｘｘ））、及びＯｘ（２０％のピリジン、１０％の水、及び７０％のＴＨＦ中の０．０２ＭのＩ２）の流量は、（フローリストリクターで全ての試薬に対し〜５０ｕＬ／ｓｅｃと比較して）およそ〜１００ｕＬ／ｓｅｃ、アセトニトリル（「ＡＣＮ」）及びキャッピング試薬（ＣａｐＡとＣａｐＢの１：１の混合物、ここで、ＣａｐＡはＴＨＦ／ピリジン中の無水酢酸であり、ＣａｐＢはＴＨＦ中の１６％の１−メチルイミダゾール（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ））についてはおよそ〜２００ｕＬ／ｓｅｃ、及び、Ｄｅｂｌｏｃｋ（トルエン中の３％のジクロロ酢酸）についてはおよそ〜３００ｕＬ／ｓｅｃであった。Ｏｘｉｄｉｚｅｒを完全に押し出す時間を観察し、化学フロー時間のタイミングを適宜調整し、余分なＡＣＮ洗浄を異なる化学物質間に導入した。オリゴヌクレオチド合成の後、７５ｐｓｉで一晩、ガス状のアンモニア中でチップを脱保護した。表面に水を５滴加えて、オリゴ核酸を再生した。その後、再生したオリゴ核酸を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒの小さなＲＮＡチップ上で分析した（データは示さない）。

【0174】

実施例３：オリゴ核酸合成装置上での１００ｍｅｒの配列の合成

【0175】

５０ｍｅｒの配列の合成について実施例２に記載されるのと同じプロセスを、２つの異なるシリコンチップ上で１００ｍｅｒのオリゴ核酸（「１００ｍｅｒのオリゴ核酸」；５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３、ここで、＃はチミジン−スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ−２２４４）を表わす；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の合成に使用し、一方のシリコンチップはＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドで均一に官能化され、他方のシリコンチップは１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシランとｎ−デシルトリエトキシシランの５／９５の混合物で官能化されており、表面から抽出されたオリゴ核酸を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ機器の上で分析した（データは示さない）。

【0176】

以下の熱サイクルプログラムを使用して、５０ｕＬのＰＣＲ混合物（２５ｕＬのＮＥＢ Ｑ５ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２．５ｕＬの１０ｕＭフォワードプライマー、２．５ｕＬの１０ｕＭリバースプライマー、表面から抽出した１ｕＬのオリゴ核酸、及び最大５０ｕＬの水）の中で、フォワードプライマー（５’ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びリバースプライマー（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を使用して、２つのチップからの１０のサンプル全てを更にＰＣＲ増幅した：
９８Ｃ、３０秒
９８Ｃ、１０秒；６３℃、１０秒；７２℃、１０秒；１２のサイクルを繰り返す
７２℃、２分

【0177】

ＰＣＲ産物をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上でも実行して（データは示さず）、１００ｍｅｒの位置で急なピークを実証した。次に、ＰＣＲ増幅サンプルをクローン化し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を行った（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。表６は、チップ１からのスポット１−５から得たサンプル、及びチップ２からのスポット６−１０から得たサンプルに対するＳａｎｇｅｒ配列決定から生じる結果を要約する。

【0178】

【表6】

【0179】

故に、高品質及び高均一性の合成されたオリゴ核酸を、異なる界面化学的性質を持つ２つのチップ上で繰り返した。配列決定された１００ｍｅｒの２６２のうち２３３に対応している、全体の８９％が、エラーのない完全な配列であった。

【0180】

最後に、表７は、スポット１−１０からのオリゴ核酸サンプルから得た配列に対するエラー特徴を要約する。

【0181】

【表7】

【0182】

実施例４：ｓｇＲＮＡ設計

【0183】

５’末端の可変領域を有するキメラｓｇＲＮＡ配列を、Ｃａｓ９タンパク質による直接の配列特異的な切断のために設計した。図４Ａを参照。ｓｇＲＮＡ配列は、１２の塩基の種子領域を含む特異的なＤＮＡ結合に関する２０の塩基の塩基対合領域を有していた。塩基対合領域の５’末端は、転写開始部位となるように設計された。塩基対合領域に近接する３’は、長さが４２の塩基であった、Ｃａｓ９結合のためにｄＣａｓ９処理された領域であった。ｄＣａｓ９処理された領域に近接する３’は、長さが４０の塩基であった、化膿レンサ球菌終結領域であった。ｄＣａｓ９処理された領域及び終結領域はそれぞれ、Ｕ字型の構造をもたらす配列を含むように設計された。

【0184】

ｓｇＲＮＡも、鋳型（Ｔ）又は非鋳型（ＮＴ）ＤＮＡ鎖を標的とするように設計された。図５Ａ−５Ｂを参照。鋳型ＤＮＡ鎖を標的とするために設計されたｓｇＲＮＡは、転写された配列と同じ配列同一性を持つｓｇＲＮＡの塩基対合領域を含んでいた。非鋳型ＤＮＡ鎖を標的とするために設計されたｓｇＲＮＡは、転写された配列の逆補体であるｓｇＲＮＡの塩基対合領域を含んでいた。

【0185】

追加の構成において、Ｔ７プロモーターは、可変塩基対合領域のすぐ上流に設計された。
図６Ａ−図６Ｂを参照。Ｔ７プロモーター領域を加えて、Ｔ７ポリメラーゼを有するｓｇＲＮＡのインビトロの産生を可能にした。

【0186】

実施例５：ｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡの合成 − 設計及びポリメラーゼ分析

【0187】

ＤＮＡオリゴ核酸を、接合時にｓｇＲＮＡ配列をコードする断片として設計した。図１２を参照。ｓｇＲＮＡを、可変配列領域（１２３３）のすぐ上流でのＴ７プロモーターの封入のため設計した。ＤＮＡオリゴ核酸のデノボ合成に続いて、増幅反応を行い、重なる断片を接合且つ伸長させた。

【0188】

（１２０１）におけるＤＮＡオリゴ核酸の転写は、ＤＮＡ鋳型からのＴ７ポリメラーゼを有するｓｇＲＮＡのインビトロの産生をもたらした。

【0189】

設計１（１２２０）、設計２（１２２２）、設計３（１２２４）、及び設計４（１２２６）の配列を、表８に示されるように設計した。設計１、設計２、設計３、及び設計４それぞれの配列は、Ｔ７プロモーター、可変配列部分、及び一定の配列領域（ハンドル及びターミネーター）を含む（表８）。具体的には、図１２に見られるような一定の配列領域は、塩基対領域（１２１１）、（１２１３）、（１２１５）、（１２１７）、（１２２３）、及び（１２２５）を含むＣａｓ９ハンドルヘアピン、及び、塩基対領域（１２１９）及び（１２２１）を含むターミネーターヘアピンを備えている。

【0190】

【表8】

【0191】

インビトロの分析に関しては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター領域がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによる認識のための二本鎖であるべきであることに注目されたい。アンチセンスオリゴ核酸をハイブリダイゼーションのために使用した：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）。加えて、表９は、鋳型オリゴ核酸及び増幅オリゴ核酸の４つの異なるセットの分析のために使用されたプライマーのリストを提供する。図１２を参照する。

【0192】

【表9】

【0193】

鋳型オリゴ核酸及び増幅オリゴ核酸の４つの異なるセットは、完全長の鋳型の純度及び収量を最適化する様々な条件の下で分析された。１０ｕｌのＰＣＲ反応を、１００ｆＭｏｌでの鋳型オリゴ核酸（ＳｇＲ１−Ｒ１＆ＳｇＲ１−Ｆ１、ＳｇＲ１−Ｆ２、ＳｇＲ１−Ｆ３、ＳｇＲ１−Ｆ４）、及び、６００ｎＭｏｌのポリメラーゼ−１ ＰＣＲ濃度での増幅プライマーの各セットにより実行した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ上で勾配を使用して、３つのアニーリング温度（５０℃、５５℃、６０℃）を、２つの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼ１及び３）並びに標準的なＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼ２）を使用して、２５のサイクルのＰＣＲにおいて評価した。表１０は反応条件の概要を提供し、表１１は増幅プロトコルを提供する。

【0194】

【表10】

【0195】

【表11】

【0196】

ポリメラーゼ−１のＰＣＲ反応からの結果を、収量を評価するためにＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（図示せず）上で実行し、表１２において要約した。ＤＮＡ収量をｎｇ／ｕｌで表す（表１２）。オリゴ核酸の設計３と４はそれぞれ、オリゴ核酸の設計１と２よりも高いＤＮＡ収量をもたらした。より高いアニーリング温度は同様に収量の増加をもたらし、６０℃ではより高い収量であった。

【0197】

【表12】

【0198】

ポリメラーゼ−２のＰＣＲ反応からの結果を、収量を評価するためにＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（図示せず）上で実行し、表１３において要約した。ＤＮＡ収量をｎｇ／ｕｌで表す（表１３）。再度、オリゴ核酸の設計３と４はそれぞれ、オリゴ核酸の設計１と２よりも高いＤＮＡ収量をもたらした。より高いアニーリング温度は同様に収量の増加をもたらし、６０℃ではより高い収量であった。

【0199】

【表13】

【0200】

ポリメラーゼ−３のＰＣＲ反応からの結果を、収量を評価するためにＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（図示せず）上で実行し、表１４において要約した。ＤＮＡ収量をｎｇ／ｕｌで表す（表１４）。オリゴ核酸の設計３と４はそれぞれ、オリゴ核酸の設計１と２よりも高いＤＮＡ収量をもたらした。より高いアニーリング温度は同様に収量の増加をもたらし、６０℃ではより高い収量であった。

【0201】

【表14】

【0202】

要するに、オリゴ核酸の設計３と４は、３つのポリメラーゼ全てを含むＤＮＡ収量の増加をもたらした。加えて、６０℃でのより高いアニーリング温度はＤＮＡ収量の増加をもたらした。

【0203】

実施例６：ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡの合成 − 温度分析

【0204】

実施例５からのオリゴ核酸プライマーを使用して、アニーリング温度条件の増加の影響を、実施例５に記載されるようなＰＣＲ反応の実行後に分析した。増幅産物を、収量を評価するためにＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（図示せず）で実行し、表１５において要約した。ＤＮＡ収量をｎｇ／ｕｌで表す（表１５）。要するに、ポリメラーゼ３はＤＮＡ収量の増加をもたらし、６０℃のアニーリング温度はＤＮＡ収量の増加をもたらした。

【0205】

【表15】

【0206】

実施例７：ｓｇＲＮＡの生成 − 構造の無いＲＮＡ

【0207】

２つのオリゴ核酸の集合体を設計し、Ｔ７プロモーター配列とターミネーターを用いるが、ｔｒａｃｒＲＮＡを用いることなく、修飾されたｓｇＲＮＡ鋳型（１２０ｂｐ）を生成した。表１６を参照する。

【0208】

【表16】

【0209】

オリゴ核酸の集合体を、実施例５のｓｇＲＮＡの増幅に使用される同じオリゴ核酸を用いて増幅した。使用される反応条件を表１７に要約する。

【0210】

【表17】

【0211】

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼでの転写は、二次構造を欠いた８０ｂｐのＲＮＡ産物をもたらすと推測された。増幅産物の転写をインビトロの転写キット（ＮＥＢ ＨｉＳｃｒｉｂｅ）により行った。反応混合物をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で分析した。図１３Ａ−１３Ｂを参照する。修飾されたｓｇＲＮＡ産物は、ｔｒａｃｒＲＮＡヘアピン含有配列を持つｓｇＲＮＡ（図１３Ａ）よりも、構造の無い設計により清潔であった（図１３Ｂ）。

【0212】

実施例８：ｓｇＲＮＡ配向Ｃａｓ９切断

【0213】

３つのｓｇＲＮＡ配列をＴ７プロモーター領域で設計し、各々には７２０ｂｐＧＦＰコード配列の領域のための異なる認識配列が備わっていた。ｓｇＲＮＡ配列の各々を２つのオリゴ核酸のＰＣＲから組み立てた。ｓｇＲＮＡバックボーン及びプライマーを表１８に提供する。

【0214】

【表18】

【0215】

オリゴ核酸集合体を、表１９に要約された反応条件下で増幅した。

【0216】

【表19】

【0217】

各ｓｇＲＮＡ集合体反応からのサンプルをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で分析した（図１４Ａ−１４Ｃ）。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼＰＣＲ増幅産物を使用する転写反応を行った。各反応からのサンプルをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で分析した（図１４Ｄ−１４Ｆ）。

【0218】

Ｃａｓ９消化物を、ＧＦＰ増幅産物、Ｃａｓ９、及び転写されたｓｇＲＮＡを使用して調製した。対照の単一のピークと比較して、２つのピークを３つ全ての消化物に観察した。（図１４Ｇ−１４Ｊ）。３つの合成されたｓｇＲＮＡを使用するＣａｓ９切断から予想され且つ結果として生じた断片を、表２０に列挙する。

【0219】

【表20】

【0220】

Ｃａｓ９消化サンプルを精製し、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で再び分析した（図示せず）。
精製されたサンプルからの結果を表２１に要約する。

【0221】

【表21】

【0222】

実施例９：２９，０４０の固有のオリゴ核酸の平行的な集合体

【0223】

平坦なシリコン上に各々１２の遺伝子座を含む、２５６のクラスタ（１５０５）を含む構造を、図１５に示すように製造した。クラスタの拡大図を１２１の遺伝子座と共に（１５１０）で示す。２５６のクラスタのうち２４０からの遺伝子座は、別個の配列を持つオリゴ核酸の合成の付着と支持をもたらした。オリゴ核酸合成を、実施例３の一般法を使用するホスホロアミダイト化学物質によって実行した。２５６のクラスタのうち１６からの遺伝子座は対照クラスタであった。合成された２９，０４０の固有のオリゴ核酸の全体的な分布（１つのクラスタ当たり２４０の非対照クラスタ×１２１のオリゴ核酸集団）を図１６Ａに示す。ＮＧＳ配列決定は、合成のために選択される設計されたオリゴ核酸の１００％の表示を確認した。図１６Ｂに示されるように、分布を各クラスタについて測定した。４つの代表的なクラスタにおいて合成された固有のオリゴ核酸の分布を、図１７に示す。全体的なレベルでは、合成のために設計された全てのオリゴ核酸が存在し、オリゴ核酸の９９％が平均の２倍以内にある存在量を備えており、このことは合成の高い均一性を示している。この同じ観察はクラスタ当たりのレベル上で一貫していた。

【0224】

各オリゴ核酸のエラー率を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ遺伝子シーケンサーを使用して判定した。２９，０４０の固有のオリゴ核酸に関するエラー率分布を図１８Ａに示し、平均は５００の塩基において約１であり、幾つかエラー率は８００の塩基におけるものほど低いものであった。図１８Ｂに示されるように、分布を各クラスタについて測定した。４つの代表的なクラスタにおける固有のオリゴ核酸に関するエラー率分布を図１９に示す。２９，０４０の固有のオリゴ核酸のライブラリを２０時間未満で合成した。２９，０４０の固有のオリゴ核酸の全てにわたるオリゴ核酸表示に対するＧＣ割合の分析は、合成がＧＣ含有量（１つのオリゴ核酸当たりおよそ２０％〜８５％）にもかかわらず一定であったことを示した（図２０）。

【0225】

実施例１０：ｓｇＲＮＡをコードするデノボ合成されたＤＮＡライブラリのＰＣＲ増幅分析

【0226】

２０−８０％の様々なＧＣ含有量を含む無作為化された配列の長さ１００の塩基を有する９，９９６のオリゴ核酸を設計し、実施例９に記載される同様の構成を持つ構造上で合成した。ＧＣの表示に対するＰＣＲ増幅の効果を判定するために、オリゴ核酸集団を、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼ１）を伴う６又は２０のサイクルのために増幅した。代替的に、オリゴ核酸集団を、６、８、１０、又は１５のサイクルのために他の２つの高忠実度ＰＣＲ酵素を使用して増幅し、ポリメラーゼ選択が増幅後の全体的な配列の表示に対し効果があったかどうかを判定した。ＰＣＲ増幅の後、サンプルを次世代配列決定のために調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォーム上で配列決定した。１５０の塩基対のＳＥリードを、１００Ｘのおよそのリード適用範囲に生成した。生のＦＡＳＴＱファイルを分析した。６、１０、又は１５のサイクルのために何れかのポリメラーゼによるオリゴ核酸の表示を、図２１に図示する。配列決定リードにおける表現の頻度によって測定されたオリゴ核酸の均一性を、様々な条件について評価し、表２２に要約した。

【0227】

【表22】

【0228】

増幅されたオリゴ核酸集団それぞれのドロップアウトの数を、図２２、即ち増幅サイクルｖｓ平均閾値の１０％より下の集団の分画に示されるように定量化した。ポリメラーゼ１のドロップアウトは早く成長した一方、ポリメラーゼ２のドロップアウトは比較的一定に留まった。

【0229】

ＧＣ分布に対する増幅の影響を、図２３において評価した。一般的に、３０％から７０％のＧＣ含有量を有するオリゴ核酸は、傾向線であるＹ＝Ｘに従い、より多くのサイクルにより頻度を増大させた。７０％より大きいＧＣ含有量を有するオリゴ核酸は一般的に、２０のサイクルの後にわずかに多く頻繁であったが、３０％未満のＧＣ含有量を有するオリゴ核酸は一般的に、６つのサイクルの後にわずかに多く頻繁であった。

【0230】

実施例１１：ヒトの後成的なＣＲＩＳＰＲスクリーン

【0231】

ｓｇＲＮＡスクリーンを行い、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用して機能ドメインをコードするエクソンへの突然変異を導入した。約１０，０００のＤＮＡオリゴ核酸を、実施例３に記載されるものと同様の方法を使用して、実施例１に記載されるシリコンチップ上で、実施例９に記載される同様の構成を持つ構造で、デノボ合成した。総じて、オリゴ核酸には約１：５００以下の総合エラー率があった。各オリゴ核酸は長さ最大２００の塩基であり、オリゴ核酸種１つ当たり少なくとも１ｆｍｏｌｅが生成された。オリゴ核酸をＰＣＲ増幅し、ベクターへとクローン化し、ｓｇＲＮＡ転写のために培養細胞へと電気穿孔した。核酸を細胞から単離し、次世代配列決定を使用して配列決定した。

【0232】

配列決定の結果は、ｓｇＲＮＡの最小のバイアス及び高忠実度産生と共に、非常に正確で均一なライブラリ合成を示した。下流のスクリーニングのために正確な配列を持つｓｇＲＮＡの３０％以上の最小の配列決定の回復を伴うガイド配列１つ当たりのより多くのリードが、競合プール（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ ｐｏｏｌ）と比較される。表２３を参照する。プールされた配列決定の結果は、競合プールに基づいたアレイを持つ６つの対数と比較して、ガイド配列当たりより多くのリード、及びリードのはるかにタイトな分布（４つの対数）を示した。図２４Ａ−２４Ｂを参照する。クローンの配列決定の検証は、１００％のｓｇＲＮＡ回復（図２４Ａ）、及び市販のアレイベースのプールに比べて高い配列の正確さ（図２４Ｂ）を示した。配列決定されたクローンのうち、著しく多くが正確なｓｇＲＮＡ配列により回復された。表２３を参照する。予め決められた配列の１００％がオリゴ核酸集団に表わされた。ｓｇＲＮＡクローンのＮＧＳベースの検証は、１００％のｓｇＲＮＡ回復、及び競合集団（図示せず）と比較して１３％高い１つのクローン当たりの正確さを示した。

【0233】

【表23】

【0234】

実施例１２：全体的なゲノムｓｇＲＮＡライブラリ

【0235】

ＤＮＡライブラリを、１０１，０００の異なるオリゴ核酸のためにクローンを生成するために、ｓｇＲＮＡ（２０２００の遺伝子標的当たり５つのｓｇＲＮＡｓ）をコードするＤＮＡを含むように設計した。１０１，０００のオリゴ核酸を、実施例３に記載されるものと同様の方法を使用して、実施例１に記載されるシリコンチップ上で、実施例９に記載される同様の構成を持つ構造で、デノボ合成した。合成されたオリゴ核酸をＰＣＲ増幅し、消化し、レンチウイルスベクターへとクローン化し、細胞へと形質転換した。核酸を細胞から単離し、次世代配列決定を使用して配列決定した。代替的に、合成されたオリゴ核酸をＰＣＲ増幅して、アンプリコンベースのライブラリを形成し、配列決定した。

【0236】

回復されたｓｇＲＮＡの数に対する次世代配列決定のプロットは、オリゴ核酸プールのサイズが増加すると、オリゴ核酸集団がライブラリ全体にわたりリードのより均一でタイトな分布を維持し、最小の尾部が市販のアレイベースの参照オリゴ核酸集団と比較されることを示した。図２５を参照。

【0237】

実施例１３：標的化と活性が改善したｓｇＲＮＡライブラリの設計

【0238】

ｓｇＲＮＡライブラリを設計し、実施例３に記載されるものと同様の方法を使用して、実施例１に記載されるシリコンチップ上で、実施例９に記載される同様の構成を持つ構造で、デノボ合成した。
合成されたオリゴ核酸をＰＣＲ増幅し、消化し、ベクターへとクローン化し、スクリーニング及び分析を含む下流の適用のための使用のために細胞へと転移させた。

【0239】

ＮＡＧ ＰＡＭ、ＮＧＧ ＰＡＭ、高活性、低いオフターゲットで特徴されるライブラリを含む、異なるｓｇＲＮＡ設計のパラメータを比較し、フィルタ処理した。本明細書に記載される方法により設計されるｓｇＲＮＡは、他の市販のｇＲＮＡシステムに比べて高い割合のｓｇＲＮＡをもたらし、結果として、遺伝子発現の少なくとも２倍の枯渇、約１６％のｓｇＲＮＡをもたらす。図２６Ａを参照。ｓｇＲＮＡはまた、他の市販のｇＲＮＡシステムに比べて低い割合のｓｇＲＮＡをもたらし、結果として、遺伝子発現のゼロ又は負の枯渇、約１７％をもたらす。図２６Ｂを参照。

【0240】

ｓｇＲＮＡ媒介性の枯渇を、同様に実質的な遺伝子発現レベルについて評価し、そこでは以下の遺伝子をｓｇＲＮＡにより標的化した：ＰＣＮＡ、ＰＳＭＡ７、ＲＰＰ２１、及びＳＦ３Ｂ３。少なくとも２倍の枯渇を示したｓｇＲＮＡの数を分析すると、ｓｇＲＮＡライブラリには、競合１、競合２、及び競合３と比較して高い割合の、実質的な遺伝子を枯渇するｓｇＲＮＡがあった。表２４を参照。

【0241】

【表24】

【0242】

実施例１４：ＭＳ２に関するｓｇＲＮＡライブラリ

【0243】

ｓｇＲＮＡをコードする非同一ＤＮＡ配列を含むＤＮＡライブラリを、Ｃ２ｃ２タンパク質による配列特異的な切断のために設計した。ライブラリは、バクテリオファージＭＳ２ゲノムのＣ２ｃ２標的化のための全ての可能なスペーサー配列を含んでいた。レプトトリキア・シャヒイからのＣ２ｃ２の成熟ｃｒＲＮＡが２８のヌクレオチドの最大のスペーサー長を含むため、バクテリオファージゲノムに全ての可能な２８のヌクレオチド標的部位のタイリング（ｔｉｌｉｎｇ）は結果として約３５００のスペーサー配列のライブラリをもたらした。

【0244】

約３，５００の非同一オリゴ核酸を、実施例３に記載されるものと同様の方法を使用して、実施例１に記載されるシリコンチップ上で、実施例９に記載される同様の構成を持つ構造で、デノボ合成した。約３５００の配列のライブラリをベクターへと挿入し、大腸菌に形質転換させた。大腸菌細胞を、ＭＳ２の３つの希釈を使用してＭＳ２バクテリオファージで感染させた。その後、ライブラリを、ＭＳ２感染に対する大腸菌耐性を与えた配列についてスクリーニングした。

【0245】

多数のスペーサー配列は耐性を与えることが見出された。スペーサー表現（ｃｒＲＮＡ頻度）を比較すると、多くのスペーサー配列がＭＳ２感染の３つの希釈において１．２５を超える対数２倍の富化を示したが、非標的スペーサー配列は富化されないことが分かった。

【0246】

実施例１５：ゼブラフィッシュに関するｓｇＲＮＡライブラリ

【0247】

ＤＮＡライブラリを、約１３０，０００のｓｇＲＮＡをコードする配列により設計する。平均して、約５のｓｇＲＮＡ鋳型を各ゼブラフィッシュ遺伝子のために設計する。オリゴ核酸を、実施例３に記載されるものと同様の方法を使用して、実施例１に記載されるシリコンチップ上で、実施例９に記載される同様の構成を持つ構造で、デノボ合成した。デノボ合成は、１３０，０００のオリゴ核酸を賛成し、各々、シリコンプレートの表面上で異なる遺伝子座から伸長している。オリゴ核酸をプレートから取り除き、ＰＣＲによって増幅し、発現ベクターへとクローン化した。各鋳型を配列決定にさらす。ｓｇＲＮＡライブラリをゼブラフィッシュの胚へと注入する。ゼブラフィッシュを成体まで育てる。その後、精子を凍結保存し、生殖系列伝達された挿入と欠失を同定するために配列決定することによりスクリーニングする。生殖系列のスクリーンの後、競合の対立遺伝子に特異的なＰＣＲによって精子の遺伝子型を同定する。

【0248】

実施例１６：マウスのためのｇＲＮＡライブラリ

【0249】

ＤＮＡライブラリを、約１００，０００のｓｇＲＮＡをコードする配列により設計する。平均して、約５のｓｇＲＮＡ鋳型を１つのマウス遺伝子ごとに設計する。オリゴ核酸を、実施例３に記載されるものと同様の方法を使用して、実施例１に記載されるシリコンチップ上で、実施例９に記載される同様の構成を持つ構造で、デノボ合成した。ｓｇＲＮＡ配列をコードするｓｇＲＮＡライブラリをデノボ合成して、１００，０００のオリゴ核酸を生成する。デノボ合成は、１００，０００のオリゴ核酸を産生し、各々、シリコンプレートの表面上で異なる遺伝子座から伸長している。オリゴ核酸をプレートから取り除き、ＰＣＲによって増幅し、ベクターへとクローン化した。各鋳型を配列決定にさらす。ｓｇＲＮＡのオンターゲット効率を、監督者によるヌクレアーゼアッセイ又は配列決定によって検証する。その後、望ましい遺伝的バックグラウンドを持つマウスの接合子においてｓｇＲＮＡを微量注入する。代替的に、ｓｇＲＮＡ効率の検証の後、ｓｇＲＮＡをアデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターへとパッケージングする。その後、ｓｇＲＮＡを、望ましい位置にてマウスへと定位的に送達する。予め選択された標的遺伝子の発現レベルを、マウスから採取した組織において観察する。

【0250】

実施例１７：受容体チロシンキナーゼのためのｇＲＮＡライブラリ

【0251】

ＤＮＡオリゴ核酸ライブラリを、表２５に列挙される５８のヒト受容体チロシンキナーゼのための遺伝子を標的とする５つのｓｇＲＮＡをコードする配列で設計し、異なるＤＮＡのオリゴ核酸は合計２９０であった。オリゴ核酸を、実施例３に記載されるものと同様の方法を使用して、実施例１に記載されるシリコンチップ上で、実施例９に記載される同様の構成を持つ構造で、デノボ合成した。オリゴ核酸をプレートから取り除き、ＰＣＲにより増幅し、ベクターへとクローン化し、細胞の予め選択された集団へと移入した。表２５に列挙された予め選択された遺伝子の発現レベルは、キナーゼ特異的ｓｇＲＮＡの無い対照にさらされる細胞の対照集団に対する細胞の予め選択された集団において比較される。

【0252】

【表25-1】

【0253】

【表25-2】

【0254】

実施例１８：ヒトキノームのためのｇＲＮＡライブラリ

【0255】

ＤＮＡオリゴ核酸ライブラリを、５１８のヒトキナーゼのための遺伝子を標的とする５つのｓｇＲＮＡをコードする配列で設計し、異なるＤＮＡのオリゴ核酸は合計２５９０であった。オリゴ核酸をプレートから取り除き、ＰＣＲにより増幅し、ベクターへとクローン化し、細胞の予め選択された集団へと移入した。予め選択された５１８の遺伝子の発現レベルは、キナーゼ特異的ｓｇＲＮＡの無い対照にさらされる細胞の対照集団に対する細胞の予め選択された集団において比較される。

【0256】

実施例１９：ヒトホスファトームのためのｇＲＮＡライブラリ

【0257】

ＤＮＡオリゴ核酸ライブラリを、２００のヒトホスファターゼのための遺伝子を標的とする５つのｓｇＲＮＡをコードする配列で設計し、異なるＤＮＡのオリゴ核酸は合計１０００であった。オリゴ核酸をプレートから取り除き、ＰＣＲにより増幅し、ベクターへとクローン化し、細胞の予め選択された集団へと移入した。２００の予め選択された遺伝子の発現レベルは、キナーゼ特異的ｓｇＲＮＡの無い対照にさらされる細胞の対照集団に対する細胞の予め選択された集団において比較される。

【0258】

本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され且つ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、及び置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びその同等物の範囲内の方法及び構造は、それにより包含されることが、意図されている。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図14G】

【図14H】

【図14I】

【図14J】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]