特許 6854532 電子的、標識フリーのＤＮＡおよびゲノムシークエンシング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6854532

(24)【登録日】2021年3月18日

(45)【発行日】2021年4月7日

(54)【発明の名称】電子的、標識フリーのＤＮＡおよびゲノムシークエンシング

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/02 20060101AFI20210329BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20210329BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20210329BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/02 D

   B82Y40/00

   !C12M1/00 A

【請求項の数】25

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2018-560743(P2018-560743)

(86)(22)【出願日】2017年2月9日

(65)【公表番号】特表2019-507892(P2019-507892A)

(43)【公表日】2019年3月22日

(86)【国際出願番号】US2017017231

(87)【国際公開番号】WO2017139493

(87)【国際公開日】20170817

【審査請求日】2020年2月5日

(31)【優先権主張番号】62/293,239

(32)【優先日】2016年2月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516263373

【氏名又は名称】ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】チェ， チョルミン

(72)【発明者】

【氏名】ジン， ソンホ

(72)【発明者】

【氏名】モーラ， ポール ダブリュー．

(72)【発明者】

【氏名】メリマン， バリー エル．

【審査官】 小澤 瞬

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５３１３２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０３／０８７７９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−０９０５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５００５５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０７−５０８８３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１２４４７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／００２７０３６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０６４６４８８９（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１５／００６５３５３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ８２Ｙ ５／００ − Ｂ８２Ｙ ９９／００

Ｃ１２Ｍ １／００ − Ｃ１２Ｍ ３／１０

Ｇ０１Ｎ ２７／００ − Ｇ０１Ｎ ２７／１０

Ｇ０１Ｎ ２７／１４ − Ｇ０１Ｎ ２７／２４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法であって、前記方法は、
ナノギャップにより隔てられた一対の電極を基板上に配置することと、
前記一対の電極上にレジスト層を積層することと、
前記レジスト層をパターニングして、前記ナノギャップにおいてまたは前記ナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、
前記電極をプラズマエッチングまたは金（Ａｕ）イオンビーム注入に曝露して、各露出領域内において表面を粗面化することと、
前記露出領域を生体分子に曝露することとを含み、前記生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は前記一対の電極に結合するための機能化を含み、
前記生体分子は前記ナノギャップを架橋し、前記生体分子の前記第１の末端および前記第２の末端は前記露出領域に結合している、方法。

【請求項2】

前記レジスト層が、厚さが約３ｎｍから約２０ｎｍの電気絶縁ポリマーまたは酸化物コーティングを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記電極が金（Ａｕ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記パターニングがｅビームまたはナノリソグラフィーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記プラズマエッチングが、ＲＦプラズマ、ＤＣプラズマ、またはスパッタエッチングプロセスを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記プラズマエッチングまたは前記Ａｕイオンビーム注入ステップにより、各露出領域内にある前記電極の表面積が、プラズマエッチングまたはＡｕイオンビーム注入の前の前記露出領域の表面積から少なくとも５０％増加している、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法であって、前記方法は、
ナノギャップにより隔てられた一対の電極を基板上に配置することと、
前記一対の電極上にレジスト層を積層することと、
前記レジスト層をパターニングして、前記ナノギャップにおいてまたは前記ナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、
前記電極をＡｕナノ粒子に曝露して、前記Ａｕナノ粒子を各露出領域内において電極表面に付着させることと、
アレイを約２００℃から約５００℃で焼なましして、前記Ａｕナノ粒子を前記電極表面に結合させることと、
前記露出領域を生体分子に曝露することとを含み、前記生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は前記一対の電極に結合するための機能化を含み、
各生体分子は前記ナノギャップを架橋し、前記生体分子の前記第１の末端および前記第２の末端は前記露出領域に結合している、方法。

【請求項8】

前記レジスト層が、Ａｌ_２Ｏ_３またはＳｉＯ_２を含む電気絶縁セラミック層を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記電極が金（Ａｕ）を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記パターニングがｅビームまたはナノリソグラフィーを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法であって、前記方法は、
ナノギャップにより隔てられた一対のＡｕ金属合金電極を基板上に配置することと、
前記電極対上にレジスト層を積層することと、
前記レジスト層をパターニングして、前記ナノギャップにおいてまたは前記ナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、
前記電極をエッチャント液に曝露して、各露出領域内において前記合金から非Ａｕ金属を選択的に除去することと、
前記露出領域を生体分子に曝露することとを含み、前記生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は前記一対の電極に結合するための機能化を含み、
各生体分子は前記ナノギャップを架橋し、前記生体分子の前記第１の末端および前記第２の末端は前記露出領域に結合している、方法。

【請求項12】

Ａｕ金属合金が、Ａｕ−Ｓｉ、Ａｕ−Ｇｅ、Ａｕ−Ｂｉ、Ａｕ−Ｃｏ、Ａｕ−Ｍｏ、Ａｕ−Ｒｈ、Ａｕ−Ｒｕ、およびＡｕ−Ｗからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記レジスト層が、Ａｌ_２Ｏ_３またはＳｉＯ_２を含む電気絶縁セラミック層を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

約２００℃から約６００℃で約１０分から約１２時間焼なましして、Ａｕと非Ａｕ金属との間の相分離を促進するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法であって、前記方法は、
ナノギャップにより隔てられた一対の電極を基板上に配置することと、
前記電極対上にレジスト層を積層することと、
前記レジスト層をパターニングして、前記ナノギャップにおいてまたは前記ナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、
各露出領域内において前記電極表面にＡｕ−Ａｇ合金またはＡｕ−Ｃｕ合金を積層することと、
前記電極をエッチャント液に曝露して、各露出領域内において積層された前記合金から非Ａｕ金属を選択的に除去することと、
前記露出領域を生体分子に曝露することとを含み、前記生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は前記一対の電極に結合するための機能化を含み、
各生体分子は前記ナノギャップを架橋し、前記生体分子の前記第１の末端および前記第２の末端は前記露出領域に結合している、方法。

【請求項16】

前記レジスト層が、Ａｌ_２Ｏ_３またはＳｉＯ_２を含む電気絶縁セラミック層を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記電極が金（Ａｕ）を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記パターニングが、ｅビームまたはナノリソグラフィーを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法であって、前記方法は、
ナノギャップにより隔てられた一対の電極を基板上に配置することと、
前記電極上にラッチ可能な磁気層を積層することと、
前記ラッチ可能な磁気層上にレジスト層を積層することと、
前記レジスト層をパターニングして、前記ナノギャップにおいてまたは前記ナノギャップの近くにおいて、前記ラッチ可能な磁気層が露出されている露出領域を作製することと、
前記電極を外部磁場または印加電圧に曝露して、前記ラッチ可能な磁気層を磁化することと、
前記露出領域を生体分子に曝露することとを含み、前記生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は、前記磁化されたラッチ可能な磁気層への誘引のために磁性ナノ粒子でタグ付けされており、
前記生体分子は前記ナノギャップを架橋し、各磁性ナノ粒子は前記露出領域において各電極に保持される、方法。

【請求項20】

前記ラッチ可能な磁気層が、１０Ｏｅより高いＨｃを有するＦｅＣｒＣｏまたはＦｅＣｕＮｉスピノーダル合金を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記レジスト層をパターニングする前記ステップの前に、前記ラッチ可能な磁気層上にＡｕの層を積層するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記磁気層を磁化または消磁することによって、磁性ナノ粒子タグ付け生体分子の磁気的に誘引された付着を可能とするか、または永久磁石の掃引による付着した磁性ナノ粒子タグ付け生体分子の除去および一掃を可能として、前記デバイスを複数回繰り返して作動させることができるようにする、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法であって、前記方法は、
ナノギャップにより隔てられた一対の白金（Ｐｔ）またはレニウム（Ｒｈ）電極を基板上に配置することと、
厚さが約１ｎｍから約１０ｎｍの金（Ａｕ）膜を前記電極対上に積層することと、
レジスト層をパターニングして、前記ナノギャップにおいてまたは前記ナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、
前記電極を焼なましして前記Ａｕ膜をＡｕスフェアに球状化させ、各露出領域内に１つのスフェアを配置させることと、
前記スフェアをエッチングして、前記スフェアの高さを低減することと、
前記焼なましステップおよび前記エッチングステップを２回またはそれより多く繰り返すステップと、
前記Ａｕスフェアを生体分子に曝露することとを含み、前記生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は前記Ａｕスフェアへの結合のための機能化を含み、
前記生体分子は前記ナノギャップを架橋し、前記生体分子の前記第１の末端および前記第２の末端は前記Ａｕスフェアに結合している、方法。

【請求項24】

前記焼なましが、約２００℃から約４００℃で約１０分から約１２時間行われて、球状化を引き起こす、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記エッチングが、イオンミリング、スパッタエッチング、ならびにマスキングおよび化学的溶解のうちの少なくとも１つを含む、請求項２３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０１６年２月９日に出願され、「電子的、標識フリーＤＮＡおよびゲノムシークエンシング装置、その作製の方法および応用」とのタイトルの米国仮特許出願第６２／２９３，２３９に対する優先権を主張し、その開示の全体を、本明細書に参照により援用する。

【0002】

本開示は概して、ナノ技術、ナノファブリケーション、およびナノエレクトロニクスに関し、より具体的には、ＤＮＡおよびタンパク質を含めて個々の生体分子を電子感知および分析するためのシステム、デバイス、およびプロセスに関する。

【背景技術】

【0003】

ＤＮＡの発見以来、構成する化学塩基の配列を実際に実験的に決定するための方法を開発する努力が共同してなされてきた。体系的にＤＮＡをシークエンシングするための最初の方法はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）によって１９７８年に導入された。

【0004】

この基本的な方法は、１９８０年代後半に商業的な機器プラットフォームの下で自動化され、初めてのヒトゲノムのシークエンシングを可能とした。この努力の成功が契機となり、ヒトゲノムのシークエンシングに要する費用および時間を劇的に低減することを目的として多数の「超並列」シークエンシングプラットフォームが開発された。これらの自動化された方法は一般に、非常に小型化されたマイクロ流体フォーマット内で同時に何百万から何十億ものシークエンシング反応を処理することに依拠する。

【0005】

その後、様々な他の関連技術および商業プラットフォームが現れたが、シークエンシングの質および正確性のさらなる改善、ならびに費用および時間の低減が依然として非常に望まれている。これは特に、精密医療（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）におけるゲノムシークエンシングの広範な使用を実際的なものにするために事実であり、プレシジョンメディシンにおいては、何百万もの個体のゲノムを臨床グレードの質でシークエンシングすることが望まれている。さらに、多くのＤＮＡシークエンシング技術は、蛍光レポーターを用いる光学的手段を利用する。このような方法は、面倒であり、検出速度を遅くし、また大量生産や購入を難しくさせ得る。標識フリーのＤＮＡまたはゲノムシークエンシングアプローチは、蛍光型標識プロセスおよび関連する光学システムを使用する必要がないという利点があるため、特に必要とされる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、標識フリーのＤＮＡまたはゲノムシークエンシングの方法、装置、および応用の一部分を構成する、サブ１０ｎｍのナノ電極の設計および製作の新たな、製造可能な、および高度に拡張可能な技術を開示する。

【0007】

本発明は、電子的ＤＮＡシークエンシングシステムにおいて使用するための極めて小さくかつ高密度のナノ電極アレイのための、独特の構造物、組成物、およびそれらの製造手段を提供する。そのようなナノ電極システムは、生体分子感知の標的との相互作用のためにナノ電極がどのように機能化されているのかに応じて、タンパク質などの他の種類の生体分子の分析においても使用され得る。一般に、本明細書中に開示されるナノ電極システムは、そのような生体分子分析用システムの一部分を構成し得、ナノ電極システムは生体分子に連結されて、生体分子標的を感知しかつ特徴付ける特定の応用、具体的にはＤＮＡ分子、または全ゲノムを構成するそのような分子の集合をシークエンシングする応用を持つ分子エレクトロニクスセンサーを構成する。

【0008】

本開示の様々な態様では、ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法が開示される。方法は、ナノギャップにより隔てられた一対の電極を基板上に配置することと、一対の電極上にレジスト層を積層することと、レジスト層をパターニングして、ナノギャップにおいてまたはナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、電極をプラズマエッチングまたは金（Ａｕ）イオンビーム注入に曝露して、各露出領域内において表面を粗面化することと、露出領域を生体分子に曝露することとを含み、生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は一対の電極に結合するための機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を含み、生体分子はナノギャップを架橋し、生体分子の第１の末端および第２の末端は露出領域に結合している。

【0009】

ある特定の態様では、レジスト層は、厚さが約３ｎｍから約２０ｎｍの電気絶縁ポリマーまたは酸化物コーティングであり得、電極は金（Ａｕ）電極であり得る。一部の例では、使用されるパターニングはｅビームまたはナノリソグラフィーである。

【0010】

様々な実施形態では、プラズマエッチングとしては、ＲＦプラズマ、ＤＣプラズマ、またはスパッタエッチングプロセスが挙げられる。プラズマエッチングまたはＡｕイオンビーム注入ステップにより、各露出領域内にある電極の表面積が、プラズマエッチングまたはＡｕイオンビーム注入の前の露出領域の表面積から少なくとも５０％増加している。

【0011】

本発明の様々な実施形態では、ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法が開示される。方法は、ナノギャップにより隔てられた一対の電極を基板上に配置することと、一対の電極上にレジスト層を積層することと、レジスト層をパターニングして、ナノギャップにおいてまたはナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、電極をＡｕナノ粒子に曝露して、Ａｕナノ粒子を各露出領域内において電極表面に付着させることと、アレイを約２００℃から約５００℃で焼なましして、Ａｕナノ粒子を電極表面に結合させることと、露出領域を生体分子に曝露することとを含み、生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は一対の電極に結合するための機能化を含み、各生体分子はナノギャップを架橋し、生体分子の第１の末端および第２の末端は露出領域に結合している。ある特定の例では、レジスト層は、Ａｌ_２Ｏ_３またはＳｉＯ_２などの電気絶縁セラミック層であり、電極は金（Ａｕ）である。パターニングステップはｅビームまたはナノリソグラフィーを含み得る。

【0012】

本開示の様々な実施形態では、ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法が開示される。方法は、ナノギャップにより隔てられた一対のＡｕ金属合金電極を基板上に配置することと、電極対上にレジスト層を積層することと、レジスト層をパターニングして、ナノギャップにおいてまたはナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、電極をエッチャント液に曝露して、各露出領域内において合金から非Ａｕ金属を選択的に除去することと、露出領域を生体分子に曝露することとを含み、生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は一対の電極に結合するための機能化を含み、各生体分子はナノギャップを架橋し、生体分子の第１の末端および第２の末端は露出領域に結合している。Ａｕ金属合金は、Ａｕ−Ｓｉ、Ａｕ−Ｇｅ、Ａｕ−Ｂｉ、Ａｕ−Ｃｏ、Ａｕ−Ｍｏ、Ａｕ−Ｒｈ、Ａｕ−Ｒｕ、およびＡｕ−Ｗからなる群から選択され得る。ある特定の態様では、レジスト層は、Ａｌ_２Ｏ_３またはＳｉＯ_２などの電気絶縁セラミック層である。

【0013】

ある特定の例では、方法は、約２００℃から約６００℃で約１０分から約１２時間焼なましして、Ａｕと非Ａｕ金属との間の相分離を促進するステップをさらに含み得る。

【0014】

本開示の様々な実施形態では、ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法が開示される。方法は、ナノギャップにより隔てられた一対の電極を基板上に配置することと、電極対上にレジスト層を積層することと、レジスト層をパターニングして、ナノギャップにおいてまたはナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、各露出領域内において電極表面にＡｕ−Ａｇ合金またはＡｕ−Ｃｕ合金を積層することと、電極をエッチャント液に曝露して、各露出領域内において積層された合金から非Ａｕ金属を選択的に除去することと、露出領域を生体分子に曝露することとを含み、生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は一対の電極に結合するための機能化を含み、各生体分子はナノギャップを架橋し、生体分子の第１の末端および第２の末端は露出領域に結合している。ある特定の例では、レジスト層は、Ａｌ_２Ｏ_３またはＳｉＯ_２などの電気絶縁セラミック層である。また、電極は金（Ａｕ）電極であり得る。様々な例では、パターニングプロセスはｅビームまたはナノリソグラフィーを含む。

【0015】

本開示の様々な実施形態では、ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法が開示される。方法は、ナノギャップにより隔てられた一対の電極を基板上に配置することと、電極上にラッチ可能な磁気層を積層することと、ラッチ可能な磁気層上にレジスト層を積層することと、レジスト層をパターニングして、ナノギャップにおいてまたはナノギャップの近くにおいて、ラッチ可能な磁気層が露出されている露出領域を作製することと、電極を外部磁場または印加電圧に曝露して、ラッチ可能な磁気層を磁化することと、露出領域を生体分子に曝露することとを含み、生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端は、磁化されたラッチ可能な磁気層への誘引のために磁性ナノ粒子でタグ付けされており、生体分子はナノギャップを架橋し、各磁性ナノ粒子は露出領域において各電極に保持される。ある特定の例では、ラッチ可能な磁気層は、１０Ｏｅより高いＨｃを有するＦｅＣｒＣｏまたはＦｅＣｕＮｉのスピノーダル合金である。この方法は、レジスト層をパターニングするステップの前に、ラッチ可能な磁気層上にＡｕの層を積層するステップをさらに含み得る。さらに、磁気層を磁化または消磁することによって、磁性ナノ粒子タグ付け生体分子の磁気的に誘引された付着を可能とするか、または永久磁石の掃引による付着した磁性ナノ粒子タグ付け生体分子の除去および一掃を可能としてデバイスを複数回繰り返して作動させることができるようにしてもよい。

【0016】

本開示の様々な実施形態では、ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング用のデバイスを製造する方法が開示される。方法は、ナノギャップにより隔てられた一対の白金（Ｐｔ）またはレニウム（Ｒｈ）電極を基板上に配置することと、厚さが約１ｎｍから約１０ｎｍの金（Ａｕ）膜を電極対上に積層することと、レジスト層をパターニングして、ナノギャップにおいてまたはナノギャップの近くにおいて各電極上に露出領域を作製することと、電極を焼なまししてＡｕ膜をＡｕスフェアに球状化させ、各露出領域内に１つのスフェアを配置させることと、スフェアをエッチングして、スフェアの高さを低減することと、焼なましステップおよびエッチングステップを２回またはそれより多く繰り返すことと、Ａｕスフェアを生体分子に曝露することとを含み、生体分子は少なくとも第１の末端および第２の末端を有し、各末端はＡｕスフェアへの結合のための機能化を含み、生体分子はナノギャップを架橋し、生体分子の第１の末端および第２の末端はＡｕスフェアに結合する。この方法では、焼なましは、約２００℃から約４００℃で約１０分から約１２時間、または球状化を引き起こすのに十分な時間／温度で行うことができる。エッチングステップは、イオンミリング、スパッタエッチング、ならびにマスキングおよび化学的溶解のうちの少なくとも１つを含み得る。

【0017】

本開示の主題は、本明細書の結びの部分において具体的に指摘され、明確に主張される。しかしながら、本開示のより完全な理解は、図と関係付けて詳細な説明および特許請求の範囲を参照することにより最もよく得られ得る。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、５〜２０ｎｍのナノギャップを含む構造を持つゲノムシークエンシング適合性の電極を示し、これは、電気的測定によるヌクレオチド付着の蛍光フリー（標識フリー）の検出の目的から、タンパク質または断片化ＤＮＡなどの生体分子を付着または固定化するための一対のＡｕアイランドを有している。

【0019】

【図2】図２は、局所的に画定された超並列のＡｕアイランド電極アレイを得るために使用できるナノパターニングの一実施形態を示す。

【0020】

【図3】図３は、粒子誘発性の多孔性構造物またはエッチング誘発性の多孔性構造物の方法を通じて導入された、大きい表面積のＡｕアイランドを有する微細構造の概略図である。

【0021】

【図4】図４は、より強い、エラー低減強化型の生体分子の接着のための、大きい表面積のＡｕアイランドを示す。

【0022】

【図5】図５は、電極（Ｐｔ、Ｒｈ、またはＡｕ）上にＡｕアイランドを得るための方法を示す。

【0023】

【図6】図６は、繰返しの球状化および順次的な上部エッチングステップによる漸進的なＡｕアイランドの直径の低減を示す。

【0024】

【図7A】図７（ａ）は、全ての電極表面の選択位置に同時に生体分子（タンパク質またはＤＮＡ断片）を堅固に接着させるための磁気的誘引方法を示す。７（ａ）は、全てのＡｕベース電極表面の選択位置に同時に生体分子（タンパク質またはＤＮＡ断片）を堅固に接着させるための磁気的誘引を示す。

【0025】

【図7B】図７（ｂ）は、生体分子の堅固な接着のための磁気的誘引を示す。磁気層は、Ｐｔ、Ｐｄ、またはＲｈ型の電極表面に積層されている。

【0026】

【図8】図８は、超並列の金の先端部が露出した電極アレイを示す。（ａ）ナノインプリンティングまたは他のリソグラフィーにより作られたテーパー状または鋭い先端部のＡｕ電極領域、（ｂ）Ａｕ電極表面の他の領域上の望まれない生体分子付着を避けるために、突出する先端部の近くのアイランド位置を除いてＡｕ電極表面の殆どをマスクする構造物。

【0027】

【図9】図９は、ヌクレオチド付着または脱着事象の超並列な標識フリーの検出のための、生体分子の強い接着用の電極対のアレイ（例えば、１００×１００のデバイスアレイまたは１，０００×１，０００のアレイ）を示す。

【0028】

【図10】図１０は、アレイの片側上に共通のリード線を使用し、左側の電極を１つずつ順次的に監視することによる、順次的な電極の監視のための構成を示す。

【0029】

【図11】図１１は、分子エレクトロニクスゲノムシークエンシングプラットフォームの三次元アレイを示す。ポリマーまたは酸化物層などの電気絶縁トップコーティングが金アイランドのまさに先端部を除いて塗布されている。

【0030】

【図12】図１２は、本開示に従うゲノムまたはＤＮＡシークエンシングシステムの様々な態様を示すフローチャートを示す

【発明を実施するための形態】

【0031】

図面は本発明の概念を説明するためのものであり、縮尺通りではないことを理解するべきである。

【0032】

本明細書中の実施形態の詳細な説明では、イラストレーションによって具体的な実施形態を示す添付の図面を参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施するのを可能とするために十分に詳細に記載されているが、他の実施形態が実現され得ること、ならびに、論理的、化学的、および機械的変更が本発明の精神および範囲から離れることなくなされ得ることを理解すべきである。よって、本明細書中の詳細な説明は説明の目的で提示されるものであり、限定の原因となるものではない。例えば、別段の記載がなければ、方法またはプロセスの記載のいずれかにおいて述べるステップは、任意の順序で実行され、提示された順序に必ずしも限定されない。さらには、単数へのあらゆる言及は複数の実施形態を含み、１つより多くの構成要素またはステップへのあらゆる言及は、単数の実施形態またはステップを含み得る。また、付着した、固定された、接続されたなどのあらゆる言及は、永久的、取り外し可能、一時的、部分的、全的、および／またはあらゆる他の可能な付着の選択肢を含み得る。追加的に、接触を伴わないこと（または同様の表現）へのあらゆる言及は、低減された接触または最小の接触をも含み得る。

【0033】

定義

【0034】

明示的に定義しないあらゆる用語は、当業者に公知の通常の意味を与えられるべきである。

【0035】

本明細書中で使用される場合、「サブ１０ｎｍ」という用語は、デバイスおよびその構成要素のサイズ、ならびに方法を実行できるスケールを指す。特には、該用語は、約１０ｎｍ未満のサイズの物理的構造物、および、約１０ｎｍ未満のスケールで様々なプロセス中のステップを取り扱う能力を指す。

【0036】

本明細書中で使用される場合、「ナノギャップ」という用語は、ナノメートル範囲にある、２つの電極間または２つの導電性アイランド間などの要素間の空間または「ギャップ」を指す。同様に、「ナノギャップの」という用語は、２つの要素がそれらの間にナノメートルスケールのギャップを有することを指す。

【0037】

本明細書中で使用される場合、「標識フリー」という用語は、蛍光標識を必要としない、換言すれば「蛍光フリー」のプロセスを指す。

【0038】

本明細書中で使用される場合、原子の元素記号、および関連する元素の名前は、交換可能に使用され得るか、または一緒に使用され得る。例えば、金という元素は、「Ａｕ」、「金」、または「金（Ａｕ）」と本明細書中で記され得る。

【0039】

本明細書中で使用される場合、「ラッチ可能な磁気ストライプ」（または「ラッチ可能な磁気層」）という用語は、外部磁場に応答して磁化方向を変化させる能力を有する磁化可能な材料の薄膜または層を指し、例えば、印加場または印加電圧の変化につれてプログラム可能かつ再構成可能な磁気特性を有する層などである。

【0040】

電気コンダクタンス測定によるＤＮＡまたはゲノムシークエンシングは、一対の電気的に分離された導電性アイランドを含むデバイスの使用をしばしば伴い、該導電性アイランド上に生体分子が架橋し、該導電性アイランドを通じて電流または電圧信号は検出される。図面を参照すると、図１は電極を示しており、この電極は、５〜２０ｎｍのナノギャップ、および、電気コンダクタンス測定によるヌクレオチド付着の標識フリーの検出が可能なデバイスにおいて使用するための、タンパク質または断片化ＤＮＡなどの生体分子を付着させまたは他の何らかの方法で固定化するための一対の金（Ａｕ）アイランドを有する。図１（ａ）は、電気コンダクタンス測定によるゲノム／ＤＮＡシークエンシングのために使用できるナノギャップの電極対の一実施形態の上面図を示し、図１（ｂ）はその側面図を示す。電極は高い導電性を有する安定かつ不活性の金属を含み得る。電極間のナノギャップ１０は、幅が約５〜２０ｎｍであり得る。例示的な電極金属としては、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、レニウム（Ｒｈ）、チタン（Ｔｉ）、銀（Ａｇ）、および金（Ａｕ）、またはこれらの合金が挙げられるが、これらに限定されない。金（Ａｕ）は最も広く使用される電極材料である。しかしながら、本開示の様々な実施形態によれば、電極表面への生体分子、タンパク質、またはＤＮＡの非特異的でランダムな付着を防止するために、Ａｕの代わりに、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、およびこれらの合金などを利用することができる。例えば、Ｐｔベース電極を使用することにより、生体分子がＰｔ表面に直接付着する傾向がはるかに低くなる。よって、数ナノメートルのサイズの対となるＡｕアイランドをＰｔに追加すると、生体分子、特に単一生体分子の付着を、Ｐｔ電極表面それ自体ではなく金アイランドに制限することができる。

【0041】

例えば直径約５ｎｍの金ナノ粒子などのナノスケール粒子は、Ｐｔ電極などの電極表面に直接的に正確に位置付けかつ配置することは難しい。ある特定の例では、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）または走査型プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）の方法を使用してもよく、これにより、図１（ｃ）（該図では、Ｐｔベース電極の上部に無差別に置かれたＡｕナノ粒子１１が描かれている。）に示されるものなど、個々のＡｕナノ粒子を拾い上げ、動かし、かつ電極表面に解放することで、ファンデルワールス力が意図した位置にナノ粒子を保持するのを補助する（例えば、２０１４年２月２０日に公開されたＨｕａｎｇらの米国特許出願公開第２０１４／００４８７７６号を参照）。しかしながら、ナノ粒子のそのような精巧な移動および配置は、ナノ粒子が電極表面にあまりよく接着しないことに繋がり得る。さらに、所望の位置に個々のナノ粒子を位置付けすることに再現性がない。図１（ｃ）に示されるような、あまり強く接着していないこれらのナノ粒子１１は、高い接触抵抗および低減した電気電導度を引き起こすことになる。さらに、これらのＡｕナノ粒子は、異なる位置へ容易に横方向の移動をしてしまい得るか、または例えば生体分子の洗浄もしくはマイクロ流体プロセシングの間といった取扱いの間に完全に脱着してしまい得る。したがって、ナノ粒子のそのようなＡＦＭの導きによる１つずつの配置は労力を要し、時間を消費し、かつ低コストの製造のために拡張可能ではない。

【0042】

したがって、本開示の一実施形態によれば、Ａｕナノ粒子は電極表面により強く結合し、その程度は、電極表面との結合において使用されるＡｕ粒子の接触面積が、Ａｕ粒子の直径の、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは、半球形のアイランドを示す図１（ｄ）中の一番上の例に示されるように１００％までを含むものである。この半球アイランドの例では、単一生体分子１２はアイランドと接触して示されており、電極間のギャップを架橋している。図１（ｄ）の２つ目の例は、Ｐｔベース電極上の「柱」状のアイランドを含む実施形態を示しており、このアイランドは生体分子の架橋との結合のために利用可能である。

【0043】

本開示による別の実施形態は、Ｐｔ電極上にＡｕアイランドを製作することを完全に回避し、その代わりに生体分子の結合および架橋用のＡｕ電極の露出した部分に依拠する。図１（ｄ）の３つ目の例に示されるように、ナノパターニングされたマスクを使用して、露出したままとして選択的な生体分子付着に利用可能である選択領域を除いてＡｕ電極表面のほぼ全てを塞ぐ。この概念の一変形では、例えば、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、メタクリレート系コポリマー、水素シルセスキオキサン（ＨＳＱ）、および様々なシロキサンポリマーなどのレジスト層を利用して、図１（ｄ）の４つ目の例に示されるように、電極のまさに先端部を除いてＡｕ電極の大部分を覆うことができる。レジスト層を利用するこれら２つの方法は本明細書中でより詳細に議論される。

【0044】

図２は、Ａｕ電極上の露出領域ならびに単一生体分子の結合および架橋を有する局所的に画定された電極を得るために使用可能なナノパターニングプロセスの一実施形態を示す。図２（ａ）に示されるように、一対のＡｕ電極を用いてプロセスは始まる。この切断側面図のイラストレーションは、ＳｉＯ_２絶縁体表面を有するＳｉを含む基板上の一対の電極として２つのＡｕ電極を示している。各電極対のナノギャップ２０は約５ｎｍから約２０ｎｍである。電極は「アレイ」と記されており、デバイス中に１００未満から数百、または数千、または数百万、またはそれより多くの電極対といった、複数のこのような電極対があってもよいことを強調している。図２に示されるプロセスの目標は、各露出領域内に１つの生体分子の１つの末端の結合のみを可能とする、直径約３〜１０ｎｍの各Ａｕ電極上の単一のナノ画定された露出領域を得ることである。換言すれば、各電極上の露出領域はサブ１０ｎｍである必要がある。この目的のために、図２（ｂ）に示されるように、ポジティブまたはネガティブレジスト層２３を電極対上に加える。ポジティブレジスト（例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ））、またはネガティブレジスト（例えば、水素シルセスキオキサン（ＨＳＱ）またはＳＵ−８エポキシレジスト）を使用することができ、これらのいずれもその後のｅビームまたはナノインプリントリソグラフィーと適合性がある。ある特定の例では、レジスト層２３はネガティブレジストを含む。次いで、ｅビームまたはナノインプリントリソグラフィーを使用して、図２（ｃ）に示されるような露出領域２４をパターニングする。

【0045】

代替的な実施形態では、Ａｌ_２Ｏ_３、ＳｉＯ_２、もしくはＳｉ_３Ｎ_４、または他の酸化物もしくは窒化物の層をＡｕ電極上に積層してもよく、またポリマーレジスト層を使用する代わりに、これらを絶縁層として使用してもよい。この場合、酸化物または窒化物コーティングを塗布する前に、厚さ１〜３ｎｍのＴｉ層などの非常に薄い接着層をＡｕ電極表面に積層してもよい。この保護コーティングは、ポリマーであろうとセラミックであろうと、電気絶縁体として、そしてまた、望まない位置に生体分子が接着するのを防止または最小化するコーティングとしてはたらく。

【0046】

図２（ｃ）を参照すると、露出領域２４の構成は、円形、楕円形、正方形、長方形、またはあらゆる他の幾何学形状などのいかなる形状であってもよい。Ａｕ電極上の各露出領域２４のサイズは約３ｎｍから約１５ｎｍの平均直径（または形状が円形でなければ、電極表面にわたっての水平な同等の寸法）である。ある特定の実施形態では、各露出領域２４は、約５ｎｍから約１０ｎｍの直径（または円形でなければ該領域にわたっての同等の寸法）である。

【0047】

図２に順次的に描かれたプロセスは、超並列アレイシークエンシングデバイスのプロセシングに適している。ナノインプリンティング、電子ビームリソグラフィー、シャドウマスクパターニング、ＥＵＶ（極ＵＶ）リソグラフィー、Ｘ線リソグラフィー、および他の公知のパターニング方法などのナノパターニングアプローチは、少なくとも１，０００、好ましくは少なくとも１０，０００またはそれより多くの、単一電極対デバイスを同時に製作することを可能にする。シークエンシングデバイス中のそのような大きな電極アレイは、シークエンシング速度を大幅に向上させ、かつシークエンシングコストを低減させる。図２（ｄ）は、各電極上の露出領域にその末端のそれぞれにおいて付着して架橋を形成している付着した生体分子２２（例えば、タンパク質、ＤＮＡ断片など）を示す。様々な実施形態では、生体分子２２は、抗体−抗原、ビオチン−ストレプトアビジン、ペプチド結合、機能化リガンド、表面電荷、または他の生体分子固定化技術を使用して、機能化された末端によって示された位置に固定化され得る。図２（ｄ）に示される完全な電極対デバイスは、他の分子との生体分子２２の相互作用を含むシークエンシング事象の電子的監視（「ｉ」）のために使用される、各電極からの電気的接続を含んで示されている。

【0048】

タンパク質分析またはＤＮＡ／ゲノムシークエンシング用のものを含む分子エレクトロニクスデバイスのために、多くの電極対デバイスのアレイを使用する並列電子感知が望ましい。所与の空間内により多くの電気的測定デバイスおよび回路を詰め込むために、電極の寸法をミクロまたはナノの次元にまで低減しなければならない。図２に示されるものなどの幾何学形状を有するナノ電極のアレイを利用することができる。そのようなアレイは、ナノインプリントリソグラフィーなどの簡便かつ拡張可能なプロセシング方法を使用することで作ることができる。ｅビームリソグラフィー、自己アセンブル、および他の手段などの代替的な方法を利用してもよい。

【0049】

標識フリーの電子的検出を含むＤＮＡおよびゲノムシークエンシング、ならびに分子エレクトロニクスデバイスにおいては、一般に、生体分子とのヌクレオチドの相互作用の電子的監視の間に再現可能に強く、ノイズが低減された信号を得るために、強くかつ信頼できる生体分子と電極（または生体分子と導電性アイランド）との間の付着が必須である。表面を「粗面化」すれば、つまり生体分子が付着する表面積を増加させるように表面を改質すれば、表面への生体分子の付着を強化することができる。通常、既にナノ次元（例えば、５〜１０ｎｍの区画）の構造上に分岐または多孔性構造物を作ることは難しい。しかしながら、本開示によれば、この困難は解決されており、それにより電極表面への生体分子の強化された接着のためのさらに分割されたナノ構造が達成されている。電極表面に分割されたナノ構造を含む実施形態では、電極表面に積層されたＡｕ柱が、少なくとも上表面を粗面化または多孔化するように表面損傷されている。

【0050】

Ａｕ表面は、Ａｕ−硫黄結合を通じて、Ａｕ表面に生体分子を接着（固定化）させるために生体分子のチオール（−ＳＨ）基を使用する機会を可能とする。それにもかかわらず、チオール基によって与えられる基本的なＡｕ−硫黄結合を超えて生体分子接着が強化できれば、電子的な標識フリーのシークエンシングにおける信頼性および信号対ノイズ比を有意に向上させることができる。本開示によれば、Ａｕのナノアイランドの表面積の増加は、Ａｕへの生体分子の結合を増大させる。本明細書において、Ａｕのサブ１０ｎｍのアイランドのさらなる表面ナノ構造化が開示される。

【0051】

ここで図３を参照すると、大きい表面積のＡｕアイランドを有する例示的な微細構造の概略図が提供されている。本開示によれば、表面積の増加は、粒子誘発性の多孔性構造物（図３（ａ）に示される）もしくはエッチング誘発性の多孔性構造物（図３（ｂ）に示される）の結果、または他の手段によるものであり得る。粒子誘発性の多孔性構造物およびエッチング誘発性の多孔性構造物を製造する方法が本明細書において詳述される。ある特定の実施形態によれば、生体分子が接着することになるＡｕアイランドの上表面におけるまたはその近くにおける表面積の増加は、平面のＡｕアイランドに対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも１００％である。生体分子の接着強度は、平らで未改質のＡｕアイランドへの接着に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも６０％向上している。

【0052】

ここで図４を参照すると、例示的な大きい表面積のＡｕアイランド構造物、およびその製造方法が示されている。言及したように、生体分子への結合のための表面積の増加は、より強い、再現性のある、強化された生体分子接着をもたらす。図４（ａ）〜４（ｆ）では、明瞭性の目的から各電極対の左側のみが示されている。図４（ａ）は、電極４９と、アイランド位置４４が露出したレジスト層４８とを含むベース電極構造物の一実施形態を図式的に示す。アイランドの表面積が増加されるのはこの領域４４内である。ＰＭＭＡおよび他のポリマー、または酸化物層（例えば、スパッタ積層されたＳｉＯ_２またはＡｌ_２Ｏ_３など）などの絶縁コーティング４８を利用することによって導電性電極（例えば、Ａｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ａｇ、またはこれらの合金）表面にパターン画定されたＡｕアイランド領域を形成することによってプロセスは始まる。論じたように、ｅビームまたはナノリソグラフィーを使用して、電極上に露出領域４４のそれぞれを作製することができる。コーティングの性質は、望ましい電気的絶縁特性、および生体分子接着に対してコーティングが持つ抵抗性に基づいて選択される。

【0053】

レジスト層４８をパターニングしたら、露出領域４４を処理して露出領域４４内の表面積を増加させる。図４（ｂ）は、プラズマエッチングにより作られた多孔性表面構造物４０１の一例である。ある特定の実施形態では、多孔性または縦型ナノワイヤのフォレスト型表面構造物などの粗表面構造物を、より選択的には露出したＡｕアイランド領域上に、ＲＦプラズマまたはＤＣプラズマエッチング（またはスパッタエッチング）処理によって形成することができる。絶縁マスク層材料の完全なプラズマエッチングを最小化するように、プラズマエッチングの強度および継続時間を調整することができる。レジスト層の厚さは約３ｎｍから約２０ｎｍであってよく、この厚さを調整してマスク層の完全なプラズマエッチングを和らげることができる。

【0054】

表面積が増加した粗表面は、例えばＡｕイオンビームを使用することによる、イオン注入によっても作製することができる。イオンビーム注入によって形成された粗表面の一例を図４（ｃ）中の表面４４１として示している。しかしながら、加速場およびイオン注入の総量によって定められるイオンの貫通深さに応じて絶縁コーティング下のＡｕ電極ベースにイオン注入損傷が起こり得る。そのため、絶縁レジストコーティングは、イオン注入下のＡｕ表面を必ずしも保護しない。しかしながら、絶縁層は粗面化電極表面を覆ったままなので、露出したアイランド領域以外の区画にある生じた粗面化表面はシークエンシングの作動に影響しない。本開示の様々な実施形態では、事後焼なましのステップがイオン注入に後続し得る。

【0055】

図４（ｄ）に示されるように、Ａｕアイランドの表面積を増加させるために使用される別の実施形態は、露出したＡｕ領域にＡｕナノ粒子４２１を付着させることを含む。Ａｕ電極に付着したＡｕナノ粒子は表面積を増加させ、強化された生体分子付着をもたらす。様々な例では、公知の方法によって作られた直径約１ｎｍから約２ｎｍのＡｕナノ粒子は、露出領域内において生来的にＡｕ電極に優先的に付着する傾向がある。そのため、このように積層されたＡｕナノ粒子は、任意選択で、約２００から約５００℃で焼なましされ得る。絶縁層４８がセラミックベースの場合（例えば、絶縁層がＡｌ_２Ｏ_３またはＳｉＯ_２を含む場合）に限り、より高い温度を使用することができる。これらの温度での事後焼なましは、露出したＡｕ表面へのＡｕナノ粒子の接着を改善する。粒子誘発性の多孔性構造物の一例は、例えば図３（ａ）に示されている。

【0056】

図４（ｅ）は、露出したＡｕアイランド表面の表面積を増加させるプロセスの別の実施形態を表し、これは室温またはその近くにてＡｕおよびＦｅが示す非混和性を活用する。このプロセスのために、例えば、スパッタリングまたは蒸着によって約５０重量％のＡｕおよび５０重量％のＦｅを有するＡｕ−Ｆｅ合金から電極ベース層を作ることができる。室温に近付くにつれて、合金相は、析出したＦｅナノ粒子を組み込んだＡｕマトリックス中に分離する。次いで、Ｆｅナノ粒子をエッチングで取り去って多孔性のＡｕマトリックスを後に残すことができる。この種類のエッチング誘発性の多孔性構造物の一例を図３（ｂ）に示している。Ａｕ−Ｓｉ、Ａｕ−Ｇｅ、Ａｕ−Ｂｉ、Ａｕ−Ｃｏ、Ａｕ−Ｍｏ、Ａｕ−Ｒｈ、Ａｕ−Ｒｕ、Ａｕ−Ｗなどの他のＡｕベース合金はＡｕ−Ｆｅ合金と同様に振る舞うので、これらを使用することができる。高温での焼なまし（例えば、２００〜６００℃で１０分〜１２時間）は相分離を増進する。相分離を増進する別の方法は、１５０〜４００℃などの温かい基板温度にて、任意選択でバイアス電圧の印加と共に、スパッタ堆積または蒸着を行うことである。

【0057】

図４（ｆ）は、脱合金を含むＡｕアイランド表面の表面積を増加させるために使用されるプロセスの別の実施形態を示す。最初に、スパッタリングまたは蒸着などによって各露出領域４４中に、Ａｕ含有量が約２０〜８０重量％のＡｕ−Ａｇ、Ａｕ−Ｃｕ、または他のＡｕベースの合金層を積層することによってプロセスは始まる。これに続いて、３０％のＨＮＯ_３または他のエッチャントなどを使用することによって非Ａｕ金属の強い化学エッチングがなされる。このような脱合金プロセスは表面からＡｇまたはＣｕを除去し、高度に多孔性の構造物を後に残す。このような脱合金技術は、電子的シークエンシングデバイス中のＡｕナノアイランドに適用された時に、有意な表面積の増加およびこれに関連して生体分子接着の改善をもたらす。

【0058】

図４（ｇ）に、タンパク質またはＤＮＡなどの生体分子４２の強化された付着のために、表面積が増加したＡｕアイランド（例えば、図４（ｂ）〜（ｆ）に例示されるプロセスにより得られるものなど）をどのように利用できるかの一実施形態を示す。

【0059】

様々な実施形態では、平坦かつ滑らかなＡｕアイランド構造物に対して、上表面またはその近くにおけるＡｕアイランドの表面積を少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、よりいっそう好ましくは少なくとも６０％増加させるために、分岐または多孔性として特徴付けられるＡｕアイランド領域内の体積による多孔度（ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｐｏｒｏｓｉｔｙ）は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、よりいっそう好ましくは少なくとも５０％である。

【0060】

続けて図面を参照すると、図５は、Ｐｔ、Ｒｈ、またはＡｕなどの電極上にＡｕアイランドを製造する方法の３つの実施形態を示す。ナノギャップ５０により隔てられた電極対を用いてプロセスは始まる。これらのイラストレーションのそれぞれにおいて、ＳｉＯ_２絶縁体表面を有するＳｉなどのデバイスの下地基板は明瞭性の目的から示していない。第１の実施形態（１）は、生体分子（例えば、タンパク質またはＤＮＡ断片）の付着ができないＰｔベース電極を利用しているため、生体分子は電極ではなくＡｕアイランド領域のみに接着する。より小さい直径のＡｕ５０１を得るために、パターニングしたＡｕアイランド５１を加熱してより小さい直径のスフェア５０１に丸め込む。電気抵抗がより低く（Ｒｈは約４．５ｕΩ．ｃｍであるのに対し、Ｐｔは９．８ｕΩ．ｃｍ、Ａｕは２．１ｕΩ．ｃｍ）、望ましくない生体分子付着の傾向が低いため、Ｒｈ電極も有用な選択肢である。また、Ｐｔとは異なり、ＲｈはＡｕとの相互溶解性がない（または非常に小さい）ため、合金の混合が最小化される。

【0061】

第２の実施形態（２）は、全てのＡｕ電極構成を使用し、これはＡｕ電極が長方形形状に配置されるが、電極の端部のアイランド様領域を除いて大部分の表面が絶縁体コーティング５８によってマスクされる。絶縁体コーティング５８は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、もしくはこれらの組合せ、水素シルセスキオキサン（ＨＳＱ）、またはＡｌ_２Ｏ_３、ＳｉＯ_２などの様々な酸化物コーティングもしくはＳｉ_３Ｎ_４コーティングなどの窒化物コーティングを含み得る。

【0062】

第３の実施形態（３）は、鋭い先端部の幾何学形状を有するテーパー形状のＡｕ電極を製作し、次いで電極の鋭い先端部を除いて全ての他の領域において電極表面の大部分を絶縁体層５８０によってマスキングすることを含む。ＰＥＧおよびＰＤＭＳは、タンパク質および細胞に対して顕著に非接着性の特徴を有しており、これは、Ａｕアイランド以外の場所でのタンパク質接着が望ましくない電子的シークエンシングデバイスにとって追加の利点であり得る。

【0063】

生体分子の接着はＡｕアイランドのサイズに依存するため、Ａｕアイランドのサイズの制御はシークエンシングデバイス中の生体分子の固定にとって決定的に重要である。様々な実施形態では、最適なＡｕアイランドサイズは直径約５から約９ｎｍである。Ａｕアイランドの直径が大きすぎるまたは小さすぎると、生体分子の再現性のある強い接着ができない。よって、本開示の様々な態様では、Ａｕアイランドの直径を簡便に制御するために使用される技術が示される。

【0064】

続けて図面を参照すると、図６は、漸進的なＡｕアイランドの直径の低減プロセスを示す。該方法は、図６（ａ）から図６（ｆ）に進む、繰返しの「球状化」（丸め込み）および上部エッチングを含む。イラストレーション中、明瞭性の目的から各電極対の左側の電極のみを示している。さらに、下地デバイス基板は明瞭性のために示していない。繰返しの球状化およびアイランド上部エッチング除去プロセスを用いることによって、直径約５ｎｍから約９ｎｍのはるかに小さい直径のＡｕアイランド６４１をより容易に達成できる。プロセスの最初のステップでは、まず、ＰｔまたはＲｈ電極６９上に、スパッタリング、イオンビーム堆積法、蒸着、パルスレーザー堆積法、または他の方法によって薄いＡｕ膜（例えば、厚さ１〜１０ｎｍ；図示せず）を積層し、次いでそれをナノパターニング（例えば、ナノインプリンティングまたは他のリソグラフィーの方法による）して、図６（ａ）に示される画定された円形または楕円形の膜の幾何学形状６１を作製する。続いて焼なましにより、Ａｕ領域を球状に丸め込んでより小さい直径のＡｕアイランド６０１とする。焼なましは、気体タイプの還元雰囲気を作るアルゴン、窒素などの雰囲気下、約２００から約４００℃で約１０分から１２時間の時間行い得る。次いで、丸め込まれたＡｕアイランド６０１を高さの低減のために（例えば、イオンミリング、スパッタエッチング、マスキング、および化学的溶解エッチングなどによる）化学的またはプラズマエッチングに供して、より平坦なＡｕアイランドの幾何学形状６１１を作る。続いて球状化焼なましにより、Ａｕアイランドの直径をさらに低減し、Ａｕ球状アイランド６２１をもたらす。エッチングおよび球状化焼なましのステップを再び繰り返して、Ａｕアイランド６２１を６３１に、次いで６４１に変換させる。

【0065】

図面を参照すると、図７（ａ）は、磁気的誘引が全ての電極表面の選択位置に同時により堅固な生体分子（タンパク質またはＤＮＡ断片）の接着を提供する、シークエンシングデバイスを形成するためのプロセスの一実施形態を示す。図の最上部に示されるように、ナノギャップ７０により隔てられた電極を有する電極対を用いてプロセスは始まる。ラッチ可能な磁気ストライプ７８５（例えば、ＦｅＣｒＣｏもしくはＦｅＣｕＮｉのスピノーダル合金に基づく薄膜ステンレス磁性合金、または他の腐食抵抗性の磁石合金など）をＡｕ電極表面７９０上に積層する。保磁力（Ｈｃ）を伴う磁気的硬さは、浮遊磁場による偶発的な磁化に対する防護のために１０エルステッド（Ｏｅ）より高く選択されるが、磁性ナノ粒子を誘引するまたは誘引しないためのより容易な磁化または消磁のために１００Ｏｅ未満とする。次いで、絶縁体スペーサー層７８０のナノパターニングを使用して、良好な電気的接続で磁性ナノ粒子を強くかつ確実に接着できる露出区画７４を作製する。

【0066】

電子的シークエンシングデバイスの準備が整ったら、例えばフェライト磁石または電磁石を使用して、１００〜１，０００Ｏｅの場の外部印加磁場によって磁気層を磁化する。次いで、周囲のマイクロ流体チャンバーを使用して、既に磁性ナノ粒子７１でタグ付けされた生体分子７２を含む液体媒体を導入する。磁性ナノ粒子を結合した生体分子は、抗体−抗原結合、ストレプトアビジン−ビオチン結合、ペプチド結合、もしくは電荷誘引、または他の結合アプローチを含み得る。次いで、図７（ａ）の下図に示されるように、生体分子７２を付着した磁性粒子７１を磁気ストライプ７９１の露出区画に誘引し、磁気的および電気的にアンカリングする。また、任意選択で、様々な制御目的のために、生体分子に中間のＡｕナノ粒子を挿入してもよい。

【0067】

生体分子にタグ付けされる磁性ナノ粒子は、Ｆｅ_２Ｏ_３、Ｆｅ_３Ｏ_４、または、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、およびこれらの合金を含めて酸化鉄より高い磁気モーメントを有する表面保護されたもしくは表面機能化された金属磁性粒子から選択することができる。酸化物ベースの磁性ナノ粒子は化学的に安定であるが、金属ベースの磁性ナノ粒子は、２〜４倍高い磁気モーメントを有するとはいえ、ゲノムシークエンシングの液体環境中で化学的安定性を欠くことがある。酸化に対する保護コーティングとしてわずかな表面酸化は望ましい。代替的には、磁性ナノ粒子の表面をＡｕコーティングして、化学的安定性、ならびに強化された電気伝導性および生体分子へのより強い親和性を提供することができる。

【0068】

所望の磁気的誘引および生体分子付着が起こったら、マイクロ流体チャンバー中の液体媒体を洗浄して未結合の生体分子を除去し、次いでシークエンシング電子測定を行って完了することができる。このような磁気的付着技術の特色は、生体分子付着の可逆性、すなわち必要に応じて生体分子を容易に脱着することである。磁気ストライプ（電極上の磁気層の部分）は、（例えば、６０ＨｚのＡＣ場を使用して数秒のうちに２００Ｏｅから０近くの場まで徐々に磁場を減少させることによって）容易に消磁できるので、所望のシークエンシング測定が完了したら、例えば、掃引する永久磁石を使用して全ての磁性粒子および関連する生体分子を脱着および回収し、これらを廃棄することによって、全ての磁気的に付着した生体分子を完全に除去できる。このようにして、シークエンシングデバイスは再使用可能であり、例えば、該デバイスは、少なくとも１０回、少なくとも１００回、または少なくとも１，０００回さえも再使用できる。

【0069】

Ａｕベース電極の代わりにナノギャップ７００によって隔てられたＰｔ、Ｐｄ、またはＲｈベース電極対を利用する改良方法が図７（ｂ）に示されている。この方法では、薄いＡｕコーティング７８５を磁気層７９０の表面の上部に加えて生体分子のより良好な付着を可能としている。下にある磁気層は露出表面の非常に近くに位置するので、Ａｕ層は、ナノ粒子と下地の磁気ストライプとの間の磁気的誘引に著しい影響を及ぼさない。図７（ａ）に示される実施形態によると、露出領域７４０はレジスト層７８０のｅビームまたはナノパターニングによって作られる。次いで、デバイスは、磁性ナノ粒子７１０でタグ付けされた生体分子７２０の溶液で満たされ、磁性ナノ粒子７１０はＡｕ層７９１に結合し、下地の磁気ストライプに磁気的に誘引される。

【0070】

超並列Ａｕ先端部露出電極アレイを図８に示す。図８（ａ）に示されるように、最初に、テーパー状または鋭い先端部のＡｕ電極領域８９をナノインプリンティングまたは他のリソグラフィーによって作り、多くの電極対をアレイ状にする。ＳｉＯ_２表面絶縁体を有するＳｉなどの基板材料は明瞭性の目的から示していない。図８（ｂ）に示されるように、次いでＡｕ電極８９は積層されたマスク層８８０によってマスクされ、次にマスク層８８０はパターニングされて、電極の他の領域上の望まない生体分子付着を軽減するために電極のまさに先端部８９０を除いて電極表面積の大部分を覆う。この目的のための絶縁体膜は、例えば、ＰＭＭＡ、ＰＥＧ、ＰＤＭＳ、Ａｌ_２Ｏ_３、ＳｉＯ_２、またはＳｉ_３Ｎ_４を含み得る。このようにして露出したままとされたＡｕ電極先端部８９０の望ましい寸法は直径約５〜９ｎｍである。各電極はリード線８０２および８２０をさらに含む。例えば１０，０００より多くのデバイスといった、図９に詳述されるような多数のデバイスを同時に製作するために、ナノインプリンティングが可能である。様々な実施形態では、超並列電極アレイは、少なくとも１，０００、好ましくは少なくとも１０，０００、よりいっそう好ましくは少なくとも百万のデバイスを含み得る。

【0071】

ヌクレオチドの付着または脱着事象の超並列の標識フリーの検出用のＡｕナノ先端部構造化電極対９０の例示的なアレイ（例えば、１００×１００のデバイスアレイまたは１，０００×１，０００のアレイ）を図９に示しており、これは電極対ギャップ区画の近くにパターン画定された露出したＡｕ電極先端部９９０（または生体分子の固定化のために活性化された他の導体アイランド）を有する。リード線９２０は、パターニングしたトップコーティング９８を用いて絶縁されたＡｕまたは任意の他の導体（例えば、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、またはＲｈ）であり得る。ヌクレオチドの付着または脱着の標識フリーの検出用の全ての電極対は絶縁体膜９８（例えば、ＰＭＭＡ、ＰＥＧ、ＰＤＭＳ、またはＳｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、もしくはＳｉ_３Ｎ_４）によってマスクされて、図に示されるように、電極先端部９９０を除いてＡｕ電極表面を覆う。ヌクレオチド付着の監視は、示されるような個々のリード線９２０を含む図９に例示されるアレイ構造物構成を使用してリアルタイムで行うことができる。

【0072】

図１０に示されるアレイ構成を使用する電子的信号監視の代替的な実施形態が可能である。この構成では、デバイス１０００のアレイの電極対の右側からの全てのリード線は共通のリード線１０２０に短絡している。アレイは、露出したＡｕ先端部１００９を除いて電極アレイの大部分を覆う絶縁体層１００８も含む。図示した構成を使用して、ヌクレオチド付着の監視は、共通のリード１０２０に短絡した全てのリード線の右側を用いて順次的に監視すること、および次いで例えばミリ秒毎に１つずつ、対の左側に存在する個々の電気的リード線１０２１の使用に移行することを含む。この方法は、何千もの並列信号を全て一度に取り扱うよりも複雑性が小さい電子的測定をもたらす。

【0073】

分子エレクトロニクスゲノムシークエンシングプラットフォームの例示的な三次元アレイを図１１に示す。先行する２つの図中の実施形態の通り、ポリマーまたは酸化物層（例えば、ＰＭＭＡ、ＰＥＧ、ＰＤＭＳ、酸化アルミニウム、酸化Ｓｉ、窒化Ｓｉなど）などの電気絶縁トップコーティング１１０８を塗布およびパターニングして、電極のまさに先端部１１０９を除いて電極対１１００中の全ての電極表面を覆う。この保護コーティングは電気絶縁体としてはたらくが、望まない位置での生体分子の接着を防止または最小化するコーティングとしてもはたらく。図１０の構成の通り、右側の電極リードは共通のリード線１１２０に短絡していてもよく、左側のリード線１１２１は順次的な監視のために単独で残されてもよい。

【0074】

分子エレクトロニクスゲノムシークエンシングプラットフォームの三次元アレイを表す図１１に示されるものなど、図９または図１０の類型の空中線アレイシークエンシング構造物を三次元に堆積すれば、いっそう大きいデータを得ることができる。３Ｄアレイは、各二次元アレイ（図１１（ａ）に示されるように、１００から１，０００層であって、それぞれが約１０，０００のデバイスおよびマイクロ流体チャンバーを含む）用の付随するマイクロ流体チャンバーをさらに含み、または代替的な実施形態では、三次元アレイ全体を入れる１つもしくは複数の共通のマイクロ流体チャンバー（図１１（ｂ）に示されるように、１００から１，０００層の感知層であって、それぞれが約１０，０００のデバイスを有し、全てが１つのマイクロ流体チャンバー中に入れられる）を含む。このような３Ｄ構成では、極めて迅速なＤＮＡまたはゲノムシークエンシングのために、少なくとも百万から十億のデバイスを同時に作動できる。電子的シークエンシングペアデバイスの望ましい詰め込み密度は、少なくとも１０，０００／ｃｍ^２、好ましくは少なくとも１００，０００／ｃｍ^２、より好ましくは少なくとも１，０００，０００／ｃｍ^２、よりいっそう好ましくは少なくとも１０，０００，０００／ｃｍ^２である。

【0075】

本開示によるゲノムまたはＤＮＡシークエンシング構造物およびシステムが図１２のフローチャートにおいて説明されている。適切な制御および信号解析／統合ソフトウェアおよびコンピュータシステムが組み込まれており、マイクロ流体システムが、シークエンシングされるＤＮＡおよびヌクレオチドと共に生体分子およびカップリング剤を使用する超並列電子的検出システムに接続されている。

【0076】

追加的な実施形態

【0077】

様々な実施形態では、ＤＮＡまたはゲノムシークエンシング構造物は、電極対のアレイを含み、対中の各電極が、ナノギャップにより隔てられ、かつ接触抵抗が低減した強い接着性および高い導電性のアイランド、ならびに生体分子を含み、生体分子は、その末端のそれぞれを用いて１つの導電性アイランド上に堅固に付着してナノギャップを架橋し、導電性アイランドは、Ａｕ電極上にナノパターン画定されたＡｕを含み、Ａｕアイランドの寸法はサブ１０ｎｍであり、ヌクレオチド付着に対するＤＣ、ＲＦ、またはパルス信号を使用するが、蛍光要素を使用しないＤＮＡまたはゲノムシークエンシングの電子的手段をさらに含む。

【0078】

様々な実施形態では、非Ａｕ電極ベースのＤＮＡまたはゲノムシークエンシング構造物は、電極のアレイ、ならびに、接触抵抗が低減した強い接着性および高い導電性のＡｕまたは他の導電性アイランドを含み、生体分子は一対の導電性アイランド上に堅固に付着しており、Ａｕアイランドの寸法はサブ１０ｎｍであり、電極ベース材料は、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、およびＡｇから選択されるものであり、ＤＮＡまたはゲノムシークエンシングの電子的手段は、ヌクレオチド付着に対するＤＣ、ＲＦ、またはパルス信号を使用するが、蛍光要素を使用しない。

【0079】

様々な実施形態では、接着性導体は、Ａｕアイランドの直径の少なくとも５０％、好ましくは１００％の接触面積を電極表面に対して有するＡｕによって作られる。

【0080】

様々な実施形態では、平坦および滑らかなＡｕナノアイランド構造物に対して少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、よりいっそう好ましくは少なくとも６０％、金アイランドの上表面の表面積を増加させるために、接着性金ナノアイランドは、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、よりいっそう好ましくは少なくとも５０％の多孔度を有して分岐または多孔性である。

【0081】

様々な実施形態では、Ａｕアイランドの表面積の増加は、ｉ）プラズマエッチング、ｉｉ）イオン注入および任意選択の焼なまし熱処理、ｉｉｉ）金（Ａｕ）ナノ粒子の付着および結合、ｉｖ）ナノコンポジット構造物からの非Ａｕ成分の選択的な分解、またはｖ）脱合金プロセスというリストから選択される１つまたは複数の方法によって得られる。

【0082】

様々な実施形態では、構造物は、ナノインプリンティングリソグラフィー、シャドウマスクパターニング、電子ビームリソグラフィー、極ＵＶリソグラフィー、またはＸ線リソグラフィーなどのナノパターニングアプローチから選択される１つまたは複数の方法によって製作された少なくとも１，０００、好ましくは少なくとも１０，０００、よりいっそう好ましくは少なくとも百万のデバイスを有する並列デバイスを含む。

【0083】

様々な実施形態では、構造物は、マイクロ流体システムと組み合わせて少なくとも１０，０００、好ましくは少なくとも百万、よりいっそう好ましくは少なくとも１億のデバイスを有する多層のデバイスを含む。

【0084】

様々な実施形態では、電極の順次的な監視は、デバイスアレイのリード線の片側が共通のリード線に取り付けられた接続構造物によって可能とされる。

【0085】

様々な実施形態では、生体分子は、抗体−抗原連結、ストレプトアビジン−ビオチン連結、ペプチド結合、チオール−金結合、金結合タンパク質、または他の連結構成を使用してＡｕアイランドに付着する。

【0086】

様々な実施形態では、ゲノムまたはＤＮＡシークエンシングシステムは、本明細書中に記載の数多くの生体分子感知デバイスを含有するチャンバー、ならびに、生体分子、ヌクレオチド、ＰＢＳ、または水溶液、および他の必要な材料を供給または維持するマイクロ流体サブシステムを含む。

【0087】

様々な実施形態では、Ａｕアイランドの直径は、繰返しの球状化焼なましおよび上部エッチングによって漸進的に低減され、該プロセスでは、球状化ならびに高さおよび直径を低減するための上部エッチングの部分が少なくとも２サイクル繰り返される。

【0088】

様々な実施形態では、高さを低減するエッチングは、化学エッチングまたはプラズマエッチングを含む。

【0089】

様々な実施形態では、構造物は、磁性粒子タグ付け生体分子の付着を強化するために、追加された磁気層を含み、腐食速度が少なくとも５０％低減された抗腐食保護、および／または生体分子付着の可能性が少なくとも５０％増加した生体分子への強化された親和性のために、天然の化学的安定性を有する酸化物材料、または薄い酸化物もしくは金で表面をコーティングされた金属合金材料に基づく磁性粒子を有する。

【0090】

様々な実施形態では、磁性粒子は、Ｆｅ_２Ｏ_３、Ｆｅ_３Ｏ_４、酸化鉄より高い磁気モーメントを有する表面保護されたまたは表面機能化された金属磁性粒子（Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、およびこれらの合金が挙げられる）から選択される。

【0091】

様々な実施形態では、磁気層を磁化または消磁することによって、生体分子の磁気的に誘引された付着を可能とするか、または永久磁石の掃引による付着した生体分子の除去および一掃を可能として、少なくとも１０回、好ましくは少なくとも１，０００回、シークエンシングデバイスを複数回繰り返して作動させることができるようにする。

【0092】

様々な実施形態では、図１〜１２およびその詳細な説明に関連する組立て方法、作動方法が開示される。

【0093】

様々な実施形態では、ＤＮＡシークエンシング用のこれらのデバイス構造物はがんの検出および他の医学的用途のために使用できる。

【0094】

様々な実施形態では、これらのデバイスはヒトゲノムシークエンシングのために使用できる。

【0095】

上述の実施形態は単に本発明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の精神に従うあらゆる等価な改良または変形もまた本発明の範囲内に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】