特許 6854740 多孔質細胞足場及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6854740

(24)【登録日】2021年3月18日

(45)【発行日】2021年4月7日

(54)【発明の名称】多孔質細胞足場及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20210329BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 C

【請求項の数】13

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2017-207848(P2017-207848)

(22)【出願日】2017年10月27日

(65)【公開番号】特開2019-76070(P2019-76070A)

(43)【公開日】2019年5月23日

【審査請求日】2019年3月6日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003609

【氏名又は名称】株式会社豊田中央研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】592032636

【氏名又は名称】学校法人トヨタ学園

(74)【代理人】

【識別番号】110000110

【氏名又は名称】特許業務法人快友国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】幸田 勝典

(72)【発明者】

【氏名】平野 稔

(72)【発明者】

【氏名】岡本 正巳

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１６−５２１６１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５４１９２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１６０３０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−１１６９８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１０８５３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５１４６４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１７２５３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２３７３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０７６２５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−１３６６７３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ａ６１Ｋ ３５／００−３５／７６８

Ｃ０８Ｊ ９／００−９／４２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多孔質構造を規定し、生体適合性及び／又は生体吸収性を有するポリマーを含むマトリックスを備え、
前記マトリックスは、互いに連通する第１のサイズの第１の細孔と、少なくとも前記第１の細孔の内表面に存在する第２の細孔と、前記第１の細孔と第１の細孔の連絡孔である第３の細孔と、
を備え、
前記マトリックスの細孔連結率が７６％以上であり、前記マトリックスの吸水率が２０００％以上である、細胞培養用足場。

【請求項2】

前記マトリックスは、空孔率が９６％以上である、請求項１に記載の足場。

【請求項3】

前記第１のサイズは、最大差し渡し寸法の平均値が２００μｍ以上４００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の足場。

【請求項4】

前記第２の細孔の第２のサイズは、最大差し渡し寸法の平均値が３０μｍ以上１００μｍ未満である、請求項１〜３のいずれかに記載の足場。

【請求項5】

前記マトリックスは、前記第３の細孔を備えるフレーム及び／又はウォールを少なくとも部分的に有する、請求項１〜４のいずれかに記載の足場。

【請求項6】

前記第３の細孔が備える第３のサイズは、最大差し渡し寸法の平均値が１００μｍ以上１７０μｍ以下である、請求項５記載の足場。

【請求項7】

前記ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体及びポリカプロラクトンから選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の足場。

【請求項8】

多孔質構造を規定し、生体適合性及び／又は生体吸収性を有するポリマーを含むマトリックスを備え、
前記マトリックスは、互いに連通する第１のサイズの第１の細孔と、少なくとも前記第１の細孔の内表面に存在する第２の細孔と、前記第１の細孔と第１の細孔の連絡孔である第３の細孔と、
を備え、
前記マトリックスの細孔連結率が７６％以上であり、前記マトリックスの吸水率が２０００％以上であるか又は空孔率が９６％以上である、多孔質基材。

【請求項9】

前記多孔質基材は、以下の（ａ）〜（ｄ）；
（ａ）前記第１のサイズは、最大差し渡し寸法の平均値が２００μｍ以上４００μｍ以下である、
（ｂ）前記第２の細孔の第２のサイズは、最大差し渡し寸法の平均値が３０μｍ以上１００μｍ未満である、
（ｃ）前記マトリックスは、前記第１の細孔と第１の細孔の連絡孔である第３の細孔を備えるフレーム及び／又はウォールを少なくとも部分的に有する、及び
（ｄ）前記（ｃ）における前記第３の細孔が備える第３のサイズは、最大差し渡し寸法の平均値が１００μｍ以上１７０μｍ以下である
からなる群から選択される１種又は２種以上の特徴を備える、請求項８に記載の多孔質基材。

【請求項10】

請求項８又は９に記載の多孔質基材の製造方法であって、
水溶性固体である複数の水溶性粒子の少なくとも一部を水分を介して相互に連結して前記水溶性粒子の連結構造体を取得する工程と、
第１の液体に生体適合性及び／又は生体吸収性を有するポリマーを溶解したマトリックス原液中に前記連結構造体を備える基材原液を準備する工程と、
前記基材原液に対して、前記第１の液体及び水が凍結可能な温度条件を付与して、前記基材原液を凍結させた凍結体を得る工程と、
減圧条件下で前記凍結体から前記第１の液体及び前記第２の液体を昇華させて乾燥体を得る工程と、
前記乾燥体中の前記複数の水溶性粒子を除去する工程と、
を備える、方法。

【請求項11】

前記水溶性固体は、塩及びその誘導体並びに糖及びその誘導体からなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１０に記載の製造方法。

【請求項12】

前記水溶性固体は、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム及び塩化ナトリウムからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。

【請求項13】

前記ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体及びポリカプロラクトンからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、多孔質細胞足場及びその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、細胞による三次元構造体の作製にあたっては、生体適合性ポリマーなどからなる多孔質細胞足場が用いられている。かかる多孔質細胞足場の作成方法の1つとして、ポロ−ゲンリーチング法と呼ばれる不溶性個体粒子（ポローゲン）を用いてポローゲンに対応する細孔をポリマーマトリックス中に形成する方法がある。ポローゲンリーチング法は、ポリ乳酸などの生体適合性ポリマーをジオキサン、クロロホルム等の非水溶媒に溶解した溶液中に非水溶媒には不溶性の糖質や食塩などの粒子（ポローゲン）を予め混合しておき、非水溶媒を蒸発させた後に、ポローゲンを溶解する溶媒でポローゲンのみを溶解させてポリマーマトリックス中に多孔質構造を形成する方法である（非特許文献１）。ポロ−ゲンリーチング法は、複雑な形状に対応でき、ポロ−ゲンのサイズに応じた細孔を形成できるという利点がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Murphyら、Tissue Eng. 2002, 8, 43-56

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、ポローゲンリーチング法で得られる多孔質体は、細孔がそれぞれ独立した独立気泡であることが多く連通率が低い場合が多かった。かかる多孔質体の表面に細胞を播種して場合、多孔質体の更なる内部方向への細胞の移動や増殖が妨げられやすく、意図した細胞構造体が必ずしも得られるわけではなかった。

【0005】

本明細書は、細孔の連結性に優れる多孔質細胞足場基材を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、ポローゲンリーチング法について種々検討していたところ、ポローゲンが連結することによって形成される連結体に由来するキャビティを備え、さらに、ポローゲンの表面あるいはその近傍から成長させた氷結晶に由来する細孔を備えるポリマーマトリックスを有する多孔質材料を得ることに成功した。こうした多孔質材料によれば、ポローゲンに由来する細孔、ポローゲンの連結部分に由来する細孔及びポローゲンに付随する氷結晶に由来する細孔を備えるために、高い空孔率と細孔連通率を充足できるという知見を得た。本明細書は、かかる知見に基づき以下の手段を提供する。

【0007】

（１）多孔質構造を規定し、ポリマーを含むマトリックスを備え、
前記マトリックスは、互いに連通する第１のサイズの第１の細孔と、前記第１の細孔の内表面又はその近傍に存在する第２の細孔と、を規定する、細胞培養用足場。
（２）前記マトリックスの細孔連結率が７６％以上である、（１）に記載の足場。
（３）前記マトリックスの吸水率が２０００％以上であるか又は空孔率が９６％以上である、（１）又は（２）に記載の足場。
（４）前記第１のサイズは、最大差し渡し寸法の平均値が２００μｍ以上４００μｍ以下である、（１）〜（３）のいずれかに記載の足場。
（５）前記第２の細孔の第２のサイズは、最大差し渡し寸法の平均値が３０μｍ以上１００μｍ未満である、（１）〜（４）のいずれかに記載の足場。
（６）前記マトリックスは、前記第１の細孔と第１の細孔の連絡孔である第３の細孔を規定するフレーム及び／又はウォールを少なくとも部分的に有する、（１）〜（５）のいずれかに記載の足場。
（７）前記第３のサイズは、最大差し渡し寸法の平均値が１００μｍ以上１７０μｍ以下である、（６）記載の足場。
（８）前記ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体及びポリカプロラクトンから選択される少なくとも１種を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載の足場。
（９）多孔質構造を規定し、ポリマーを含むマトリックスを備え、
前記マトリックスは、互いに連通する第１のサイズの第１の細孔と、前記第１の細孔の内表面又はその近傍に存在する第２の細孔と、を規定する、多孔質基材。
（１０）多孔質基材の製造方法であって、
水溶性固体である複数の水溶性粒子の少なくとも一部を水分を介して相互に連結して前記水溶性粒子の連結構造体を取得する工程と、
第１の液体にポリマーを溶解したマトリックス原液中に前記連結構造体を備える基材原液を準備する工程と、
前記基材原液に対して、前記第１の液体及び水が凍結可能な温度条件を付与して、前記基材原液を凍結させた凍結体を得る工程と、
減圧条件下で前記凍結体から前記第１の液体及び前記第２の液体を昇華させて乾燥体を得る工程と、
前記乾燥体中の前記複数の水溶性粒子を除去する工程と、
を備える、方法。
（１１）前記水溶性固体は、塩及びその誘導体並びに糖及びその誘導体からなる群から選択される１種又は２種以上である、（９）に記載の製造方法。
（１２）前記水溶性固体は、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム及び塩化ナトリウムからなる群から選択される１種又は２種以上である、（１０）又は（１１）に記載の製造方法。
（１３）前記ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体及びポリカプロラクトンからなる群から選択される１種又は２種以上である、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の製造方法。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】本明細書に開示される足場の一例の概要を示す図である。

【図2】足場の製造工程の一部を示す図である。

【図3】足場の製造工程の他の一部を示す図である。

【図4】実施例により得られた多孔質基材のＳＥＭ画像を示す図である。

【図5】図３に示すＳＥＭ画像に基づく画像解析結果を示す図である。

【図6】実施例で作製した多孔質基材の空孔率、吸水率についての評価結果を示す図である。

【図7】実施例で作製した多孔質基材の空孔率、吸水率及び連結率についての評価結果を示す図である。

【図8】実施例で作製した多孔質基材の細胞培養用足場としての評価結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書の開示は、多孔質細胞足場及びその利用等に関する。本明細書に開示される多孔質細胞足場（以下、単に、本足場ともいう。）は、ポリマーを含むマトリックスを有している。本足場におけるマトリックスの概要を図１に例示する。

【0010】

図１に例示するように、本足場１００のマトリックス１０は、互いに連通する第１のサイズを有する第１の細孔２０と、前記第１のサイズよりも小さい第２のサイズを有し、前記第１の細孔２０の内表面及び／又はその近傍において延在する第２の細孔６０と、を規定することができる。かかる足場によれば、第１の細孔が互いに連通して形成する連続的なキャビティと、第１の細孔２０から延在する第２の細孔６０と、を有するため、高い細孔連結率を容易に確保することができ、また、また各細孔２０、６０の内表面に細胞が接着できるほか、各細孔２０、６０を通じて細胞が走化性の発揮などに基づく移動、増殖、伸展、伸長が可能となり、細胞の培養を効果的に促進でき、例えば、移植材料などの作製に好適である。

【0011】

さらに、本足場１００のマトリックス１０は、第１の細孔２０が連結し連通して得られる連絡孔としての第３の細孔４０を備えることができる。第３の細孔４０を備えることで、連続的なキャビティが形成される。

【0012】

なお、本明細書において、「細胞」とは、特に限定するものではなく、培養し、増殖させて用いることができる公知の細胞が挙げられる。例えば、動物細胞、植物細胞等が挙げられる。動物細胞としては、ヒトを含む動物の組織や臓器を構成する細胞であってもよい。例えば、皮膚、骨、軟骨、靱帯、筋肉、気管、食道、鼻、血管、膵臓、肝臓、心臓等を構成しうるあるいはこれらに由来する細胞のほか、中枢神経及び末梢神経など各種神経細胞が挙げられる。また、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞などの各種幹細胞を含む未分化細胞が挙げられる。

【0013】

本明細書において、「多孔質細胞足場」は、細胞を培養するための足場である。多孔質細胞足場は、例えば、ヒトを含む動物の組織や臓器の少なくとも一部を置換する材や同少なくとも一部を補綴する材の構成要素（移植材料）とすることができる。多孔質細胞足場は、生体外で細胞を培養して培養細胞を保持した足場として生体内に移植されるものであってもよいし、それ自体を生体内に移植し生体内において細胞を増殖させるための足場であってもよい。

【0014】

以下、本足場、その製造方法等について詳細に説明する。

【0015】

（多孔質細胞足場）
（マトリックス）
本足場は、多孔質構造を規定し、ポリマーを含むマトリックスを備えることができる。以下、適宜図１を参照して説明する。なお、図１は、本足場を例示するものではあるが、本足場は図１に開示されるものに限定されない。

【0016】

本足場１００のマトリックス１０を構成するポリマーは、特に限定するものではないが、生体適合性及び／又は生体吸収性を有するポリマーを用いることができる。かかるポリマーとしては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン等の合成ポリマー、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ポリアルギン酸、キチン、キトサン、デンプン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン及びラミニン等の天然ポリマーが挙げられる。これらのポリマーは、いずれも、生体適合性でありかつ生体吸収性である。ポリマーは、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

【0017】

本足場１００におけるマトリックス１０は、後述する第１の細孔２０、第３の細孔４０及び第２の細孔６０を規定する周辺構造体である。また、マトリックス１０は、種々の細孔を包含し規定する、ウォール及び／又はフレームを少なくとも部分的に有する構造体を構成することができる。ウォール及びフレームの厚み及び形状等は、内包する細孔の大きさ、個数、形状等によって、種々の形態を採りうる。

【0018】

また、マトリックス１０のウォール及び／又はフレームである構造体は、それ自体多孔質体であってもよい。マトリックス１０は、第１のサイズ、第３のサイズ、及び後述する第２のサイズの２０％以下、１０％以下又は５％以下程度の孔径の微小な孔を多数備える多孔質体などとすることができる。

【0019】

（第１の細孔）
マトリックス１０は、互いに連通する第１のサイズの第１の細孔２０を規定することができる。マトリックス１０においては、少なくとも二つの隣接する第１の細孔２０が連結してキャビティ２２を構成している。典型的には、例えば、図１に示すように、３個以上あるいはさらに多数個の第１の細孔２０が連結したキャビティ２２を構成することができる。

【0020】

（第１の細孔が有する第１のサイズ）
第１の細孔２０が有する第１のサイズは、第１の細孔２０の連結部分でない部分における最大の差し渡し寸法の平均値をいう。ここで、最大の差し渡し寸法とは、例えば、第１の細孔２０が、略球状の場合には、キャビティの直径等となり、同略楕円球状の場合には、そのキャビティの最長径となり、同略立方体状又は略直方体状の形状の場合には、最大内寸等となる。なお、後述するように、これらの最大差し渡し径は、いずれも顕微鏡観察画像において確認及び計測できるものである。

【0021】

第１のサイズは、特に限定するものではないが、培養する細胞の大きさ等を考慮して決定することができる。例えば、第１のサイズは、例えば、２００μｍ以上４００μｍ以下とすることができる。かかるサイズを備えていることで、十分な空孔率を確保することができる。第１のサイズは、好ましくは、２４０μｍ以上３９０μｍ以下である。

【0022】

第１のサイズは、例えば、走査型電子顕微鏡において、１２００μｍ×８５０μｍの画像３０枚につき、第１の孔２０として確認できた細孔について、ＩｍａｇｅＪソフトウェアあるいはそれと精度及び正確性において同等である他の画像解析ソフトウェアを用いて、２点間オートスケール機能を用いて測定することができる。なお、二点間距離は、孔の長軸及び短軸を避けて中間径を測定する。

【0023】

（第３の細孔）
マトリックス２２は、そのキャビティ２２において、第１の細孔２０が連結して連通する連結部分（連絡孔）を第３の細孔４０として備えることができる。連結孔として第３の細孔４０を備えることで、高い細孔連結率、空孔率などを備えることができる。第３の細孔４０は、第１の細孔２０の連結によって概ね形成されているといえるキャビティ２２のくびれ様部分となっている。したがって、それ自体独立した細孔ではないが、本足場１００のマトリックス１０の断面構造の観察時においては、隣接する第１の細孔２０の径より小さく、隣接する第１の細孔の連絡として観察されうる。

【0024】

（第３の細孔が有する第３のサイズ）
第３の細孔４０が有する第３のサイズは、第１の細孔２０の第１のサイズを本来的に越えるものではなく、第１のサイズより小さい第３のサイズを有することができる。また、後述する第２の細孔６０の第２のサイズよりも概して大きい。第３のサイズは、第１の細孔２０の連絡孔としての第３の細孔４０の最大の差し渡し寸法の平均値をいう。ここで、最大の差し渡し寸法とは、例えば、第３の細孔４０の形態が、略円形状の場合には、その開口の直径等となり、同略楕円状の場合には、その開口の最長径となり、同略四角形状の場合には、最大内寸等となる。なお、後述するように、これらの最大差し渡し径は、いずれも顕微鏡観察画像において確認及び計測できるものである。

【0025】

第３のサイズは、特に限定するものではないが、例えば、９０μｍ以上とすることができる。かかるサイズを備えていることで、細胞の移動性や増殖性のほか、培地等の移動性を十分確保できるからである。より効率的な培養の観点からは、例えば、１００μｍ以上であり、また例えば１１０μｍ以上であり、また例えば１２０μｍ以上である。また、上限は、特に限定するものではないが、例えば、１８０μｍ以下であり、また例えば、１７０μｍ以下であり、また例えば、１６０μｍ以下である。第３のサイズの範囲は、これらの下限及び上限を適宜組み合わせて設定することができるが、例えば、９０μｍ以上１８０μｍ以下、１００μｍ以上１７０μｍ以下などとすることができる。

【0026】

第３のサイズは、第１の細孔における第１のサイズと同様の方法で測定することができる。

【0027】

（第２の細孔）
マトリックス１０は、また、第２の細孔６０を規定することができる。第２の細孔６０は、第１の細孔２０の内表面２４からマトリックス側１０に膨出するように存在することができる。例えば、図１に示すように、マトリックス１０は、第３の細孔４０を、第１の細孔２０、すなわち、キャビティ２２の内表面２４から連通してマトリックス１０側に延在、突出又はマトリックス１０を貫通するキャビティ６２として備えることができる。なお、第２の細孔６０は、後述するように、氷結体に基づく細孔である。

【0028】

キャビティ６２は、第１の細孔２０側から見て遠位側が狭くなった形態の錐体状のキャビティ６２や、第１の細孔２０の近位から遠位までほぼ等しい大きさの孔径を維持する柱状のキャビティ６２などであってもよい。

【0029】

また、第２の細孔６０は、第１の細孔２０の近傍に存在していてもよい。例えば、第２の細孔６０は、第１の細孔２０とは独立して存在することができる。第２の細孔６０は、第１の細孔２０とは独立して存在するが、第１の細孔２０の近傍に存在することができるし、第１の細孔２０の近傍でなくても存在することができる。いずれの形態であってもｙ、第２の細孔６０は、一方端部が狭くなった形態の錐体状のキャビティ６２や、ほぼ等しい大きさの孔径を維持する柱状のキャビティ６２であってもよい。

【0030】

（第２の細孔が有する第２のサイズ）
第２の細孔６０が有する第２のサイズは、例えば、第２の細孔６０が有するキャビティにおいて、最大の差し渡し寸法の平均値をいう。ここで、最大の差し渡し寸法とは、例えば、第２の細孔６０が、先細りする針状の場合には、そのキャビティの短手方向における最大寸法となり、第２の細孔が柱状の場合には、そのキャビティの短手方向における最大寸法となる。なお、第１の細孔２０の第１のサイズと同様、これらの最大差し渡し寸法は、いずれも顕微鏡観察画像において確認及び計測できるものである。

【0031】

第２のサイズは、第１の細孔２０の第１のサイズよりも小さく、また、概して第３の細孔４０の第３のサイズよりもまた小さく設計することができる。第２のサイズは、特に限定するものではなく、第１のサイズ等にもよるが、例えば、３０μｍ以上であり、また例えば、４０μｍ以上であり、また例えば、５０μｍ以上である。また、第２のサイズは、第１のサイズにもよるが、例えば、１００μｍ未満であり、また例えば、９０μｍ以下であり、また例えば、８０μｍ以下であり、また例えば、７０μｍ以下であり、また例えば、６０μｍ以下である。第２のサイズの範囲は、これらの下限及び上限を適宜組み合わせて設定することができるが、例えば、３０μｍ以上９０μｍ以下であり、また例えば、４０μｍ以上８０μｍ以下などとすることができる。

【0032】

第２のサイズについても、第１のサイズと同様にして測定することができる。

【0033】

（細孔連結率）
本足場１００のマトリックス１０は、高い細孔連結率を備えることができる。ここで、本明細書において細孔連結率とは、マトリックス１０の吸水率と空孔率とに基づいて得られるものであって、マトリックス１０が有する細孔の連結程度の指標である。細孔連結率は、例えば、以下の方法により取得することができる。

【0034】

（空孔率）
まず、空孔率を測定する。空孔率は、マトリックス１０の乾燥重量及びみかけ体積から、嵩密度（ρa）を算出するとともに、マトリックス１０の真密度（ρt）を取得し、嵩密度ρ＝ρa/ρtを得て、１−ｐ（ρa/ρt）を、空孔率とする。

【0035】

（吸水率）
また、本明細書において、吸水率とは、マトリックス１０の単位重量（ｇ）当たりの吸水量の百分率で表示したものである。具体的には、以下の式で求められる。水の吸収質量は、マトリックス１０を７０％エタノールに１５分間室温で浸漬し、次いで、３７℃、３時間、水に浸漬して７０％エタノールを完全に水に置き換えて水で充填した後の質量を測定する。

吸水率（％）＝（吸水後のマトリックス質量（ｇ）−乾燥時マトリックス質量（ｇ）／乾燥時のマトリックス質量（ｇ）×１００

【0036】

（連結率）
空孔率に基づいて水を吸収できるマトリックス１０の単位質量（ｇ）あたりの吸水率（理論吸水率）を算出する。さらに、この理論吸水率と実際の吸水率の比率を計算する。水の吸収質量は、マトリックス１０を７０％エタノールに１５分間室温で浸漬し、次いで、３７℃、３時間、水に浸漬して７０％エタノールを完全に水に置き換えて水で充填した後の質量を測定する。

【0037】

本足場１００のマトリックス１０は、例えば、連結率が５０％以上とすることができる。細孔連結率が５０％以上であると、従来にない高い連結率であるために、細胞の移動や細胞増殖を阻害しない足場を提供することができる。細孔連結率は、細胞増殖や移動の容易性の良好な指標であり、高い細孔連結率は、細胞培養足場としての優れた特性を表している。

【0038】

マトリックス１０は、また例えば、細孔連結率が５５％以上であってもよいし、また例えば同６０％以上であってもよいし、６５％以上であってもよいし、同７０％以上であってもよいし、同７５％以上であってもよいし、同７６％以上であってもよいし、同７７％以上であってもよいし、同７８％以上であってもよいし、同７９％以上であってもよいし、同８０％以上であってもよいし、同８５％以上であってもよい。好ましくは、同６５％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは７５％以上である。

【0039】

マトリックス１０は、空孔率が、例えば、９０％以上であり、また例えば、９５％以上であり、また例えば、９６％以上である。マトリックス１０の吸水率は、特に限定するものではないが、例えば、１５００％以上であり、また例えば、１６００％以上であり、また例えば１７００％以上であり、また例えば、１８００％以上であり、また例えば、１９００％以上であり、また例えば、２０００％以上であり、また例えば、２１００％以上であり、また例えば、２２００％以上であり、また例えば、２３００％以上であり、また例えば、２４００％以上であり、また例えば、２５００％以上である。空孔率と空気極水率とが増大すると細孔連結率が相乗的に増大する。

【0040】

（多孔質基材）
本明細書に開示される多孔質基材のマトリックスは、新たな細孔構造を有するため、細胞培養足場としてのみならず、種々の用途の多孔質基材として用いることができる。

【0041】

本足場１００は、こうした細孔構造を有するために、細胞の移動に有利であり、細胞の移動を制限しないで促進できる細胞培養用足場を提供できる。これにより、細胞の効率的な培養が可能であるほか、高い移動性を持って増殖する細胞の培養に有利である。また、本足場１００は、こうした細孔構造を有するために、細胞播種時においても、表面のみならずその内部にまで速やかに細胞が移動できる細胞培養用足場を提供できる。

【0042】

（多孔質基材の製造方法）
本明細書に開示される多孔質基材の製造方法（以下、単に、本製造方法という。）は、本足場のマトリックスなどに適用できる多孔質基材の製造方法として好適に用いることができる。

【0043】

本製造方法は、水溶性固体である複数の水溶性粒子の少なくとも一部を水分を介して相互に連結して前記水溶性粒子の連結構造体を取得する工程と、第１の液体にポリマーを溶解したマトリックス原液中に前記連結構造体を備える基材原液を準備する工程と、前記基材原液に対して、前記第１の液体及び水が凍結可能な温度条件を付与して、前記基材原液を凍結させた凍結体を得る工程と、減圧条件下で前記凍結体から前記第１の液体及び前記第２の液体を昇華させて乾燥体を得る工程と、前記乾燥体中の前記複数の水溶性粒子を除去する工程と、を備えることができる。

【0044】

本製造方法によれば、水溶性粒子を水分を介して連結した連結構造体をある種の消失鋳型（第１の鋳型）として用いることで、水溶性固体電解質が連結した状態のキャビティをマトリックスに形成することができる。また、基材原液を凍結させることで、連結構造体が保持する水分が第１の液体中で氷結し、その後の乾燥により消失させることが可能な第２の消失鋳型をその場生成させることができる。本製造方法によれば、第２の消失鋳型のその場生成により、従来よりも多孔質で細孔連結率に優れた多孔質基材を容易に得ることができる。以下、本製造方法の一例を、図２Ａ及び図２Ｂを適宜参照して説明する。

【0045】

（連結構造体の取得工程）
本工程では、水溶性固体である複数の水溶性粒子１１０の少なくとも一部を水分Ｗを介して相互に連結して水溶性粒子１１０の連結構造体１２０を取得することができる。本工程において取得する連結構造体１２０は、既述のマトリックス１０における第１の細孔２０が連結して構造を有するキャビティ２２のための消失鋳型となる。連結構造体１２０は、三次元のネットワーク状、凝集体状の形態を採ることができる。

【0046】

本工程では、水溶性固体からなる水溶性粒子１１０を用いる。水溶性固体は、水に溶解可能な物質である。水溶性固体としては、特に限定するものではないが、例えば、塩及びその誘導体、糖及びその誘導体等が挙げられる。

【0047】

塩及びその誘導体における塩の構成イオンは、無機または有機、および単原子イオンまたは多原子イオンであり得る。例えば、塩を構成する陽イオンには、アンモニウムＮＨ₄⁺、カルシウムＣａ²⁺、鉄Ｆｅ²⁺およびＦｅ³⁺、マグネシウムＭｇ²⁺、カリウムＫ⁺、ピリジニウムＣ₅Ｈ₅ＮＨ⁺、第四アンモニウムＮＲ₄⁺、ならびにナトリウムＮａ⁺が含まれるが、これらに限定されない。また例えば、塩を構成する陰イオンは、酢酸塩ＣＨ₃ＣＯＯ^-、炭酸塩ＣＯ₃^2-、塩化物Ｃｌ^-、クエン酸塩ＨＯＣ（ＣＯＯ^-）（ＣＨ₂ＣＯＯ^-）₂、シアニドＣ≡Ｎ^-、水酸化物ＯＨ^-、硝酸塩ＮＯ₃^-、亜硝酸塩ＮＯ₂^-、酸化物Ｏ^2-、リン酸塩ＰＯ₄^3-、および硫酸塩ＳＯ₄^2-が含まれるが、これらに限定されない。塩の非限定例には、塩化コバルト６水化物、硫酸銅５水和物、ヘキサシアノ鉄酸、酢酸鉛、硫酸マグネシウム、二酸化マンガン、硫化水銀、グルタミン酸ナトリウム、塩化ニッケル６水化物、重酒石酸カリウム、塩化カリウム、二クロム酸カリウム、フッ化カリウム、過マンガン酸カリウム、アルギン酸ナトリウム、クロム酸ナトリウム、塩化ナトリウム、フッ化ナトリウム、ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、および／またはこれらの混合物が含まれる。好ましくは、水分によって潮解生じる塩であり、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム及び塩化ナトリウム等が挙げられる。好ましくは、塩化ナトリウムである。

【0048】

また、糖及びその誘導体としては、特に限定するものではないが、例えば、１〜１０の単糖単位を含む化合物（例えば、単糖類、二糖類、三糖類、および４〜１０の単糖単位を含むオリゴ糖）をいう。親単糖に（潜在的に)カルボニル基を有する場合、単糖類は、３個以上の炭素原子を有するポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンであり、これらには、アルドース、ジアルドース、アルドケトース(aldoketose)、ケトース、およびジケトース、ならびに環状形態、デオキシ糖、およびアミノ糖とこれらの誘導体が含まれる。オリゴ糖は、グリコシド結合が少なくとも２つの単糖単位に加わる化合物である。単位の数によって、これらは、二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、六糖類(hexoaccharide)、七糖類(heptoaccharide)、八糖類(octoaccharide)、九糖類(nonoaccharide)、十糖類(decoaccharide)等と呼ばれる。オリゴ糖は、分岐していないか、分岐しているか、または環状であり得る。糖の非限定例には、例えば、グリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンのようなトリオース；エリトロース、トレオース、およびエリトルロースのようなテトロース；アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロースのようなペントース；アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、フコース、ラムノースのようなヘキソース；セドヘプツロースおよびマンノヘプツロースのようなヘプトース；オクツロース(octulose)および２‐ケト‐３‐デオキシ‐マンノ‐オクトナート(2-keto-3-deoxy-manno-octonate)のようなオクトース(octoose)；シアロース(sialose)のようなノノース；デコース(decose)等の単糖類；ならびに、例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ゲンチオビオース、コウジビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノース、およびキシロビオースのような二糖類；ラフィノース、アカルボース、マルトトリオース、およびメレジトースのような三糖類、および／またはこれらの混合物等のオリゴ糖が含まれる。また、糖には、アセスルファムカリウム、アリターム、アスパルテーム、アセスルファム、シクラマート、ズルチン、グルシン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、ネオテーム、サッカリン、およびスクラロースのような糖代替物も含まれる。

【0049】

本工程で用いる水溶性粒子１１０は、こうした水溶性固体からなる。水溶性粒子１１０は、従来のポロ−ゲンリーチング法で用いられたのと同様、ポリマーマトリックス中で最終的に除去される消失鋳型である。水溶性粒子１１０は、製造しようとする多孔質基材（マトリックス）における第１の細孔２０が有する第１のサイズを規定することになる。したがって、意図した第１のサイズに対応する平均粒子径の水溶性粒子１１０を用いることができる。かかる水溶性粒子１１０は、意図に応じて、好ましい平均粒子径のみならず粒度分布を備えるように準備することができる。

【0050】

水溶性粒子１１０の形態は、特に限定するものではないが、例えば、球状、楕円体状、多面体状、三角錐状、四角錐状、円錐状等の各種錐体状、立方体、直方体、円柱等の各種柱体状、紡錘体状等などでありうる。

【0051】

水溶性粒子１１０としては、特に限定するものではないが、例えば、平均粒子径が２００μｍ以上５００μｍ以下、また例えば、平均粒子径が２２０μｍ以上４００μｍ以下、また例えば、平均粒子径が２４０μｍ以上３９０μｍ以下などの水溶性粒子を用いることができる。なお、水溶性粒子の平均粒子径は、メッシュサイズによる篩わけや光学的手法により測定することができる。

【0052】

本工程では、例えば、図２Ａの（ｂ）に示すように、こうした複数の水溶性粒子の少なくとも一部を水分Ｗを介して相互に連結して前記水溶性粒子の連結構造体１２０を取得する。連結構造体１２０は、例えば、図２Ａの（ａ）に示すように、複数の水溶性粒子１１０を適当な型内に供給後、水溶性粒子１１０の表面に、塗布、噴霧等の方法で水分を供給して、水溶性粒子１１０の表面を一部溶解したり、あるいは、例えば、相対湿度５０％以上、また例えば、同６０％以上、また例えば、同７０％以上、また例えば、同８０％以上、また例えば、同９０％以上、同９５％以上の雰囲気下で、例えば、３０分以上、また例えば、１時間以上、また例えば１．５時間以上など、水溶性粒子１１０の表面において吸湿や潮解等を生じさせることにより、得ることができる。なお、こうした操作を行う温度条件は、特に限定しないが、例えば、１５℃以上４０℃以下、また例えば、２０℃以上４０℃以下などで実施することができる。

【0053】

本工程においては、複数の水溶性粒子１１０に供給される水分Ｗの量、水溶性粒子１１０の接触状態、水分Ｗの供給時間等により、その水溶性粒子１１０の連結状態を制御することができる。水分量が多い場合には、水溶性粒子１１０の溶解や潮解により、水溶性粒子１１０の連結部分が大きくなり、結果として、連結構造体１２０における水溶性粒子１１０の連結部分（マトリックスにおける連絡孔に対応する。）が大きくなる傾向がある。また、水溶性粒子１１０が高度に充填された状態で連結構造体１２０を作製すると、水溶性粒子１１０の連結が促進されて、連絡部分（同連絡孔）を十分に備える連結構造体１２０を得ることができる。

【0054】

本工程においては、複数の水溶性粒子１１０をランダムに配置して連結構造体１２０を作製することもできるが、複数の水溶性粒子１１０をある種のパターンに配置することで、デザインされた連結構造体１２０ひいてはキャビティ２２を作製することができるようになる。例えば、水溶性粒子１１０は、平面的に格子状に配置することもできるし、さらに、高さ方向にも、水溶性粒子１１０を積層して意図した三次元構造体に配置することもできる。

【0055】

本工程における温度等の条件は、水溶性粒子１１０が固体を維持できる温度であればよく、特に限定されない。例えば、２５℃以上４０℃以下等の温度で実施できる。また、本工程は、十分な連結状態が得られ、意図した連結構造体が得られる範囲の時間実施すればよい。特に限定するものではないが、例えば、１０分以上であり、また例えば、２０分以上であり、また例えば、３０分以上であり、また例えば、６０分以上であり、また例えば、１．５時間以上などである。

【0056】

本工程は、複数の水溶性粒子１１０は、得ようとするマトリックス１０意図する三次元形状を備えることができるように、予め当該三次元形状を有するキャビティを有する型に配置して実施することもできる。なお、型としては、冷却された型及び／又は熱伝導性の高い金属などの材料であることが好ましい。

【0057】

（基材原液の準備工程）
本工程は、第１の液体にポリマーを溶解したマトリックス原液１３０中に連結構造体１２０を備える基材原液１４０を準備することができる。この工程で得られる基材原液１４０は、既述の多孔質基材であるマトリックス１０を得るための原材料となる。本工程の一例を図２Ａの（ｃ）に示す。

【0058】

ポリマーとしては、既に記載した各種のポリマーであって、好適には生体適合性又は生体吸収性ポリマーを用いることができる。第１の液体は、こうしたポリマーを溶解できる液体を用いることができる。第１の液体は、後段の凍結工程及び乾燥工程を考慮すると、例えば、凝固点が−２０℃以下の液体であって、少なくとも第１の液体を凍結するまでの間、水溶性粒子１１０の連結構造体１２０をその状態で維持して保持できる程度に、水溶性粒子１１０を溶解しない液体であることが好ましい。

【0059】

水溶性粒子１１０を塩又はその誘導体や糖又はその誘導体とする場合、第１の液体としては、例えば、１，４−ジオキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、ｔ−ブタノール、キシレン等が挙げられる。

【0060】

基材原液１４０を得るのに際して、連結構造体１２０がマトリックス原液１３０に溶解・混和したり、マトリックス原液１３０において連結状態が解除したりしないように、連結構造体１２０及び／又はマトリックス原液１３０を、低温に維持してあるいは低温条件で、連結構造体１２０とマトリックス原液１３０とを接触させるか、あるいは、接触後直ちに凍結工程を実施することが好ましい。連結構造体１２０とマトリックス原液１３０とを、例えば、−２０℃以下の条件で接触させて、基材原液１４０を調製することが好ましい。

【0061】

（凍結体を得る工程）
本工程は、例えば、図２Ｂの（ｄ）に示すように、基材原液１４０に対して、第１の液体及び水が凍結可能な温度条件を付与して、基材原液１４０を凍結させた凍結体１５０を得ることができる。この工程によれば、連結構造体１２０が保持する水分Ｗ、例えば、水溶性粒子１１０の表面に存在する水分Ｗをマトリックス原液１３０中で氷結させて、乾燥工程によって昇華させることができる第２の消失鋳型である氷結体１６０を凍結体１５０中にその場生成させることができる。氷結体１６０は、連結構造体１２０に連結した状態で形成される場合もあり、連結構造体１２０の近傍又は近傍でないところで形成される場合もある。なお、マトリックス原液１３０中において連結構造体１２０に付随していた水分Ｗが氷結体１６０となることで、固体である水溶性粒子１１０と氷結体１６０とに分離することができる。なお、水溶性粒子１１０は固体の状態を維持している。

【0062】

また、本工程によれば、基材原液１４０中のポリマー以外の第１の液体も凍結する。凍結により、マトリックス原液１３０中において固体であるポリマーは析出するため、ポリマーと第１の液体とを分離することができる。

【0063】

本工程における凍結のための条件は、基材原液１４０が凍結するものであれば特に限定するものではないが、例えば、０℃以下であり、また例えば、−５℃以下であり、また例えば、−１０℃以下であり、また例えば、−２０℃以下であり、また例えば、−３０℃以下である。また、凍結のための時間も、特に限定するものではないが、例えば、１時間以上であり、また例えば、２時間以上であり、また例えば、３時間以上であり、また例えば、４時間以上であり、また例えば、５時間以上であり、また例えば６時間以上であり、また例えば、７時間以上であり、また例えば、８時間以上である。

【0064】

（乾燥体を得る工程）
本工程は、例えば、図２Ｂの（ｅ）に示すように、減圧条件下で凍結体１５０において凍結した第１の液体及び氷結体１６０を昇華させて乾燥体を得ることができる。本工程によれば、凍結体１５０から氷結体１６０と第１の液体の凍結体を昇華させて、これらの部分に対応するキャビティを有する乾燥した多孔質体１７０を得ることができる。この多孔質体１７０は、依然として水溶性固体である水溶性粒子１１０を包含している。

【0065】

本工程は、いわゆる凍結乾燥工程であり、公知の減圧乾燥方法に準じて実施することができる。乾燥条件は、特に限定するものではないが、例えば、２時間以上、また例えば、３時間以上、また例えば、４時間以上、また例えば、５時間以上、また例えば、６時間以上、また例えば、８時間以上、また例えば、１０時間以上、また例えば、１２時間以上とすることができる。

【0066】

（水溶性粒子の除去工程）
本工程は、例えば、図２Ｂの（ｆ）に示すように、乾燥体１７０中の複数の水溶性粒子１１０を除去することができる。本工程によれば、連結構造体１２０を構成する水溶性粒子１１０を除去することで、連結構造体１２０に対応するキャビティ２２を有する多孔質基材１８０を得ることができる。

【0067】

水溶性粒子１１０を除去するには、当該水溶性粒子１１０を溶解する水性媒体を用いて水溶性粒子１１０を溶解抽出する方法を用いることができる。典型的には、水であり、あるいはアルカリや酸などを含んで水溶性粒子の溶解性が調整された水であり、さらには、こうした水と、水と混和するアルコールやアセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの有機溶媒との混液が挙げられる。

【0068】

本工程は、例えば、乾燥体１７０をこうした水性媒体で１回以上洗浄することによって実施できる。

【0069】

必要に応じて、こうした除去工程後に、得られた多孔質基材１８０を乾燥する工程を実施できる。また、必要に応じて、除去工程後又は乾燥工程後に、マトリックス１０を構成するポリマーを架橋するなどの工程を実施することもできる。架橋工程は、放射線による方法、紫外線照射による方法、加熱架橋、架橋剤を用いる方法など公知の方法を採用できる。

【0070】

さらに、必要に応じて、得られた多孔質基材１８０に対して、細胞培養のための各種の薬剤、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板成長由来因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、骨形成誘導タンパク質（ＢＭＰ）、血管細胞成長因子又は神経細胞成長因子のいずれか１種以上を含浸させることもできる。

【0071】

本製造方法によって得られる多孔質基材１８０は、連結構造体１２０である第１の消失鋳型、連結構造体１２０に付随する水分Ｗの氷結体１６０である第２の消失鋳型に基づく細孔を有する多孔質基材１８０を容易に得ることができる。かかる多孔質基材１８０は、第２の消失鋳型に基づく細孔、すなわち、第３の細孔４０を有していることから、十分な多孔質性と細孔連通性とを備える多孔質基材１８０となっている。さらに、本製造方法によって得られる多孔質基材１８０は、第１の液体の凍結体が昇華して得られる多孔質ポリマーマトリックスを備えるものとなっている。

【実施例】

【0072】

以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を原知恵するものではない。

【実施例1】

【0073】

（多孔質基材の作製）
（１）ポリマー濃度が５％（w/w）になるようにPLLA（ポリＬ−乳酸）と１，４−ジオキサンをバイアル瓶に入れた後、スターラーで６時間撹拌しPLLAを溶解させた。PLLAが溶解した後、超音波処理を３０分間行い、マトリックス原液を調製した。

【0074】

（２）多孔質基材を得るための型として、ポリプロピレンの２４ウェルプレート（５００μｌ／ウェル）を用いて、ＮａＣｌ１ｇを各ウェルに投入した。その後、このウェルプレートを相対湿度９５％以上、温度３７℃のインキュベーターに入れ１．５時間加湿した。これにより、ウェル内にＮａＣｌ結晶の連結構造体を作製した。

【0075】

（３）インキュベータからウェルプレートを取り出した後、各ウェルに、５００μｌのマトリックス原液を供給し、ウェル内に基材原液を調製した。

【0076】

（４）このウェルプレートを、冷凍庫（-20℃）に入れ、５時間程度冷却して、ウェル内の基材原液を凍結した。その後、このウェルプレートを凍結乾燥装置に投入して１２時間乾燥させた。乾燥後、ウェルプレートのウェルから乾燥体を取り出し、超純水で３回洗浄して多孔質基材を得た。

【0077】

対照として、上記（１）で得たマトリックス原液をそのまま上記（４）と同一条件で凍結乾燥して対照例１の多孔質基材を得た。また、上記（１）で得たマトリックス原液をそのまま５０℃で２４時間乾燥して、対照例２の多孔質基材を得た。

【0078】

（ＳＥＭ画像による観察）
実施例の多孔質基材及び対照例１の多孔質基材のＳＥＭ観察画像を図３に示す。図３に示すように、実施例の多孔質基材は、細孔、細孔の連通孔及び細孔近傍における小径の細孔を多数確認できた。これに対して、対照例１の多孔質基材では、細胞が通過できる程度の細孔を確認できなかった。

【0079】

（ＳＥＭ観察像からの解析）
図４に、図３のＳＥＭ観察画像を用いたＩｍａｇｅＪによる構造解析結果を示す。図４に示すように、ＮａＣｌ結晶に基づく細孔と、ＮａＣｌ結晶の連結に基づく連絡孔と、氷結体に基づく細孔と、ジオキサン基づく細孔とを観察することができた。

【0080】

（空孔率、吸水率及び連結率の評価）
図５Ａ及び図５Ｂに、実施例の多孔質基材、対照例１及び２の多孔質基材の空孔率、吸水率及び連結率についての評価結果を示す。なお、これらの評価は、以下の方法によって行った。

【0081】

（１）空孔率
空孔率は、マトリックス１０の乾燥重量及びみかけ体積から、嵩密度（ρa）を算出するとともに、マトリックス１０の真密度（ρt）を取得し、嵩密度ρ＝ρa/ρtを得て、１−ｐ（ρa/ρt）を、空孔率とした。
（２）吸水率
各多孔質基材の重量を測定後、十分に水を吸収させた後、重量を測定した。結果を、以下の式に当てはめて吸水率を取得した。吸水後重量は、予め、多孔質基材を７０％エタノール１５分間浸漬後、超純水で十分に置換して、３７℃、３時間静置した後の重量を吸水後重量とした。

吸水率（％）＝（吸水後の多孔質材料重量−乾燥時の多孔質材料重量）／乾燥時の多孔湿重量×１００
（３）連結率
空孔率に基づいて水を吸収できるマトリックス１０の単位質量（ｇ）あたりの吸水率（理論吸水率）を算出した。さらに、この理論吸水率と実際の吸水率の比率を計算した。水の吸収質量は、マトリックス１０を７０％エタノールに１５分間室温で浸漬し、次いで、３７℃、３時間、水に浸漬して７０％エタノールを完全に水に置き換えて水で充填した後の質量を測定した。

【0082】

図５Ａ及び図５Ｂに示すように、実施例の多孔質基材は、格段の空孔率、吸水率及び連結率を備えていることがわかった。

【0083】

（細胞播種及び浸潤の評価）
実施例の多孔質基材及び対照例の多孔質基材（それぞれ直径１４ｍｍ×厚さ６ｍｍ）に吸水させた後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液（２×１０⁵cells/ml）を１ｍｌ播種した。翌日、多孔質基材を切断して、Calcein-AMにて、基材内の生細胞の評価を行った。結果を図６に示す。図６に示すように、実施例の多孔質基材によれば、１２時間以内であっても、細胞が基材内部まで浸潤していることがわかった。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】