特許 6854911 Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地および培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6854911

(24)【登録日】2021年3月18日

(45)【発行日】2021年4月7日

(54)【発明の名称】Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地および培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20210329BHJP

   C12P 13/06 20060101ALN20210329BHJP

   C12R 1/15 20060101ALN20210329BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   !C12P13/06 C

   C12R1:15

【請求項の数】14

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2019-549626(P2019-549626)

(86)(22)【出願日】2017年12月1日

(65)【公表番号】特表2019-536482(P2019-536482A)

(43)【公表日】2019年12月19日

(86)【国際出願番号】CN2017114198

(87)【国際公開番号】WO2018099452

(87)【国際公開日】20180607

【審査請求日】2019年7月11日

(31)【優先権主張番号】201611093973.X

(32)【優先日】2016年12月2日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】519199783

【氏名又は名称】武▲漢▼▲遠▼大弘元股▲フン▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】▲梅▼ 雪臣

(72)【発明者】

【氏名】王 炯

(72)【発明者】

【氏名】万 坤

(72)【発明者】

【氏名】宋 盟▲軍▼

(72)【発明者】

【氏名】▲シン▼ ▲パン▼▲パン▼

(72)【発明者】

【氏名】▲蘇▼ ▲海▼霞

(72)【発明者】

【氏名】李 敬

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼ ▲愛▼福

【審査官】 松浦 安紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６２−１８１７９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１６−５１９９４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第０１９１６３０８（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 特開昭６２−０６１５９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０１４２３８５１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０１２３５４０１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４８７８０５１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０１２３５４０２（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０１４５７２４３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０５８８６４３１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 米国特許第０５１６４３０７（ＵＳ，Ａ）

【文献】 KISUMI, M.，Studies on the Isoleucine Fermentation，The Journal of Biochemistry，１９６２年，Vol.52, No.6，pp.390-399

【文献】 ZOU, H. et al.，The metabolism and biotechnological application of betaine in microorganism，Appl Microbiol Biotechnol，２０１６年 ３月２３日，Vol.100，pp.3865-3876

【文献】 XU, J. et al.，An Overlooked Effect of Glycine Betaine on Fermentation: Prevents Caramelization and Increases the L-Lysine Production，J. Microbiol. Biotechnol.，２０１４年 ７月１５日，Vol.24, No.10，pp.1368-1376

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

基礎培地および成長因子を含み、前記成長因子はコリン、ベタインおよびビタミンＢ６からなり、各成分の発酵培地に占める含有量はコリン０．２〜１．０ｇ／Ｌ、ベタイン０．２５〜０．５ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．０５〜０．３ｍｇ／Ｌであることを特徴とするＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地。

【請求項2】

コリン０．３〜０．８ｇ／Ｌを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地。

【請求項3】

コリン０．４〜０．６ｇ／Ｌを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地。

【請求項4】

コリン０．３、０．４、０．５、０．６または０．８ｇ／Ｌを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地。

【請求項5】

ベタイン０．２５、０．３、０．３５、０．４または０．５ｍｇ／Ｌを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地。

【請求項6】

ビタミンＢ６ ０．０５、０．１、０．１５、０．２または０．３ｍｇ／Ｌを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地。

【請求項7】

前記基礎培地は以下の成分を含有し、各成分の発酵培地に占める含有量は、コーンスティープリカー１５〜２５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２４０〜３００ｇ／Ｌ、尿素２０〜２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．４〜０．８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．６〜０．８ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．２〜０．４ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１５〜０．０３ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油１〜５ｍｌ／Ｌ、シルクペプチド粉２〜４ｇ／Ｌ、消泡剤３０〜５０ｍｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地。

【請求項8】

前記発酵培地は、コーンスティープリカー１５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２４０ｇ／Ｌ、尿素２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．６ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１５ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油１ｍｌ／Ｌ、ベタイン０．３ｍｇ／Ｌ、シルクペプチド粉３ｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．３ｍｇ／Ｌ、コリン０．５ｇ／Ｌ、消泡剤３４ｍｌ／Ｌを含むことを特徴とする請求項７に記載のＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地。

【請求項9】

前記発酵培地は、
コーンスティープリカー１５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖３００ｇ／Ｌ、尿素２０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．６ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．４ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０３ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油５ｍｌ／Ｌ、ベタイン０．４ｍｇ／Ｌ、シルクペプチド粉４ｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．２ｍｇ／Ｌ、コリン０．５ｇ／Ｌ、消泡剤５０ｍｌ／Ｌ；または、
コーンスティープリカー２５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２４０ｇ／Ｌ、尿素２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．８ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．２ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１５ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油１ｍｌ／Ｌ、ベタイン０．５ｍｇ／Ｌ、シルクペプチド粉４ｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．１ｍｇ／Ｌ、コリン０．３ｇ／Ｌ、消泡剤３０ｍｌ／Ｌ；または
コーンスティープリカー２０ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２６０ｇ／Ｌ、尿素２３ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．７ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０２ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油３ｍｌ／Ｌ、ベタイン０．２５ｍｇ／Ｌ、シルクペプチド粉３ｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．０５ｍｇ／Ｌ、コリン０．６ｇ／Ｌ、消泡剤４０ｍｌ／Ｌ；または
コーンスティープリカー１６ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２８０ｇ／Ｌ、尿素２１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．７ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０２ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油２ｍｌ／Ｌ、ベタイン０．３５ｍｇ／Ｌ、シルクペプチド粉３ｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．１５ｍｇ／Ｌ、コリン０．４ｇ／Ｌ、消泡剤４０ｍｌ／Ｌ；
を含むことを特徴とする請求項７に記載のＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地。

【請求項10】

Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムを請求項１〜９のいずれかに記載の発酵培地に接種し、発酵させることを特徴とするＬ−イソロイシン酸生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法。

【請求項11】

菌液の体積が発酵培地の体積の５〜２０％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．５〜７に調整し、溶解酸素を３０〜５０％に制御し、２５〜３０ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を１５〜２５％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３〜４％になるように５０〜８０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて６０〜７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を２９〜３３℃に制御することを特徴とする請求項１０に記載のＬ−イソロイシン酸生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法。

【請求項12】

菌液の体積が発酵培地の体積の１０〜１５％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．７〜６．８に調整し、溶解酸素を３０〜４０％に制御し、２６〜２８ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を１８〜２０％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３.５〜３．８％になるように７０〜８０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて６４〜７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３０〜３２℃に制御することを特徴とする請求項１１に記載のＬ−イソロイシン酸生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法。

【請求項13】

菌液の体積が発酵培地の体積の１０％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．８に調整し、溶解酸素を３０％に制御し、２６ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を２０％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３．５％になるように８０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３１℃に制御することを特徴とする請求項１０に記載のコリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法。

【請求項14】

菌液の体積が発酵培地の体積の５％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．５に調整し、溶解酸素を３０％に制御し、２５ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を１５％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３％になるように８０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて６０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３３℃に制御する；または、
菌液の体積が発酵培地の体積の２０％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを７に調整し、溶解酸素を５０％に制御し、３０ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を２５％に低下させ、そして発酵液に残存糖が４％になるように５０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を２９℃に制御する；または、
菌液の体積が発酵培地の体積の１５％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．７に調整し、溶解酸素を４０％に制御し、２８ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を１８％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３．８％になるように７０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて６４時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３０℃に制御する；または、
菌液の体積が発酵培地の体積の１２％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．８に調整し、溶解酸素を３０％に制御し、２７ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を２０％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３．５％になるように８０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３２℃に制御する；
ことを特徴とする請求項１０に記載のコリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は出願日が２０１６年１２月０２日の中国特許出願ＣＮ２０１６１１０９３９７３．Ｘの優先権を要求する。本願は上記中国特許出願の全文を引用する。

【0002】

本発明は、微生物発酵の分野に属し、具体的に、Ｌ−イソロイシンを生産するためのコリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地および培養方法に関する。

【背景技術】

【0003】

近年、Ｌ−イソロイシンの医薬・保健、食品加工・飼料工業における応用・研究の進展につれ、市場のＬ−イソロイシンに対する需要は増えてきた。Ｌ−イソロイシンは、すでに工業的生産が実現したものの、現在、生産量はまだ需要に満足できない。現在、我が国では、Ｌ−イソロイシンの需要の不足が大きく、しかも年間需要量が年々増えている。我が国のＬ−イソロイシン生産は、酸生産量が低い、糖−酸変換率が低い、抽出率が低いなどの多くの問題に直面している。我が国では、Ｌ−イソロイシンの生産量のレベルは２５〜３０ｇ／Ｌで、抽出率は６５〜７０％で、国内で最も高い糖−酸変換率は１８〜２０％で、一般的な糖−酸変換率は１５％程度である。江南大学によって２０１４年に出願された特許ＣＮ１０４４８００５７Ａでは、糖−酸変換率は１２．４％だけで、天津科技大学によって２０１５年に出願された特許ＣＮ１０４８７８０５１Ａでは、５Ｌ発酵タンクの酸生産量は４０．０５ｇ／Ｌで、糖−酸変換率は１８．７％である。一方、日本では、Ｌ−イソロイシンの酸生産量のレベルは３０〜３５ｇ／Ｌで、抽出率は７０〜７５％である（李静ら、ＣＮ１０４４５０８１５Ａ、２０１４）。日本味の素では、Ｌ−イソロイシンの酸生産レベルは３．５％で、抽出率は７０％であることが報告された（馮珍全ら、Ｌ−イソロイシンの応用の現状およびその未来の展望、２０１３）。近年、原料の値上がりや労働コストの上昇はいずれもＬ−イソロイシンの生産にチャレンジをもたらす。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】中国特許出願ＣＮ２０１６１１０９３９７３．Ｘ号

【特許文献2】中国特許公開公報ＣＮ１０４４８００５７Ａ号

【特許文献3】中国特許公開公報ＣＮ１０４８７８０５１Ａ号

【特許文献4】中国特許公開公報ＣＮ１０４４５０８１５Ａ号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】馮珍全ら、Ｌ−イソロイシンの応用の現状およびその未来の展望、２０１３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、現在Ｌ−イソロイシンの生産効率が低いという現状に対し、大幅に糖−酸変換率を上げることによって、生産効率を向上させることができる、Ｌ−イソロイシンを生産するためのコリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地および培養方法提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明によって提供されるＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地は、基礎培地および成長因子を含み、前記成長因子はコリン、ベタインおよびビタミンＢ６からなり、各成分の発酵培地に占める含有量はコリン０．２〜１ｇ／Ｌ、ベタイン０．２５〜０．５ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．０５〜０．３ｍｇ／Ｌである。

【0008】

好ましくは、前記基礎培地は以下の成分からなり、各成分の発酵培地に占める含有量は、コーンスティープリカー１５〜２５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２４０〜３００ｇ／Ｌ、尿素２０〜２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．４〜０．８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．６〜０．８ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．２〜０．４ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１５〜０．０３ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油１〜５ｍｌ／Ｌ、シルクペプチド粉２〜４ｇ／Ｌ、消泡剤３０〜５０ｍｌ／Ｌである。

【0009】

より好ましくは、各成分の発酵培地に占める含有量は、コーンスティープリカー１５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２４０ｇ／Ｌ、尿素２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．６ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１５ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油１ｍｌ／Ｌ、ベタイン０．３ｍｇ／Ｌ、シルクペプチド粉３ｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．３ｍｇ／Ｌ、コリン０．５ｇ／Ｌ、消泡剤３４ｍｌ／Ｌである。

【0010】

本発明によって提供されるＬ−イソロイシン酸生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法は、Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムを前記の発酵培地に菌液の体積が発酵培地の体積の５〜２０％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．５〜７に調整し、溶解酸素を３０〜５０％に制御し、２５〜３０ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を１５〜２５％制御し、そして発酵液に残存糖が３〜４％になるように５０〜８０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて６０〜７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を２９〜３３℃に制御する。

【0011】

発酵培養方法は、好ましくは、Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムを請求項１〜３のいずれかに記載の発酵培地に菌液の体積が発酵培地の体積の１０％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．８に調整し、溶解酸素を３０％に制御し、２６ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を２０％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３．５％になるように８０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３１℃に制御する。

【発明の効果】

【0012】

本発明の有益な効果は、本発明は培地にコリン、ベタイン、ビタミンＢ６といった３種類の成長因子を添加することによって、コリネバクテリウムグルタミカムに成長因子を提供し、その細胞内外の浸透圧のバランスを維持し、アミノ酸の合成・代謝を促進することで、Ｌ−イソロイシンの生産量および糖−酸変換率を向上させることができることである。本発明によって提供される培地および培養方法は生産効率が高い、生産周期が短いといった利点がある。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
実施例１
Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の発酵培地は、基礎培地および成長因子からなり、各成分の発酵培地における含有量は以下の通りである。

【0014】

基礎培地：コーンスティープリカー１５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２４０ｇ／Ｌ、尿素２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．６ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１５ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油１ｍｌ／Ｌ、シルクペプチド粉３ｇ／Ｌ、消泡剤３４ｍｌ／Ｌ。
成長因子：ベタイン０．３ｍｇ／Ｌ、コリン０．５ｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．３ｍｇ／Ｌ。

【0015】

混合後、１２１℃で２５ｍｉｎ滅菌した。
液体シード培地：ブドウ糖一水和物１７ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１０ｍｌ／Ｌ、尿素１ｇ／Ｌ、無水硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、シルクペプチド粉０．１ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．１ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油０．１ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム２ｍｇ／１００ｍｌ。ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、１２１℃で２０ｍｉｎ滅菌した。

【0016】

試験管の斜面におけるＬ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムを接種リングで１回取り、シード培地に接種し、往復式シェーカーで３１℃、１０５ｒｐｍで２４ｈ培養してシード培地菌液を得た。

【0017】

コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法：コリネバクテリウムグルタミカムを上記発酵培地に菌液の体積が発酵培地の体積の１０％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．８に調整し、溶解酸素を３０％に制御し、２６ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を２０％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３．５％（重量含有量）になるように重量含有量が８０％のブドウ糖溶液を流し込み、続いて７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３１℃に制御した。

【0018】

実施例２
Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地は、基礎培地および成長因子からなり、各成分の発酵培地における含有量は以下の通りである。

【0019】

コーンスティープリカー１５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖３００ｇ／Ｌ、尿素２０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．６ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．４ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０３ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油５ｍｌ／Ｌ、シルクペプチド粉２ｇ／Ｌ、消泡剤５０ｍｌ／Ｌ、コリン０．８ｇ／Ｌ、ベタイン０．４ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．２ｍｇ／Ｌ。

【0020】

コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法：コリネバクテリウムグルタミカムを発酵培地に菌液の体積が発酵培地の体積の５％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．５に調整し、溶解酸素を３０％に制御し、２５ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を１５％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３％になるように８０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて６０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３３℃に制御した。

【0021】

実施例３
Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地は、基礎培地および成長因子からなり、各成分の発酵培地における含有量は以下の通りである。

【0022】

コーンスティープリカー２５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２４０ｇ／Ｌ、尿素２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．８ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．２ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１５ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油１ｍｌ／Ｌ、シルクペプチド粉４ｇ／Ｌ、消泡剤３０ｍｌ／Ｌ、コリン０．３ｇ／Ｌ、ベタイン０．５ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．１ｍｇ／Ｌ。

【0023】

コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法：コリネバクテリウムグルタミカムを発酵培地に菌液の体積が発酵培地の体積の２０％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを７に調整し、溶解酸素を５０％に制御し、３０ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を２５％に低下させ、そして発酵液に残存糖が４％になるように５０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を２９℃に制御した。

【0024】

実施例４
Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地は、基礎培地および成長因子からなり、各成分の発酵培地における含有量は以下の通りである。

【0025】

コーンスティープリカー２０ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２６０ｇ／Ｌ、尿素２３ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．７ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０２ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油３ｍｌ／Ｌ、シルクペプチド粉３ｇ／Ｌ、消泡剤４０ｍｌ／Ｌ、コリン０．６ｇ／Ｌ、ベタイン０．２５ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．０５ｍｇ／Ｌ。

【0026】

コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法：コリネバクテリウムグルタミカムを発酵培地に菌液の体積が発酵培地の体積の１５％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．７に調整し、溶解酸素を４０％に制御し、２８ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を１８％に低下させ、そして発酵液に残存糖が３．８％になるように７０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて６４時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３０℃に制御した。

【0027】

実施例５
Ｌ−イソロイシン生産コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培地は、基礎培地および成長因子からなり、各成分の発酵培地における含有量は以下の通りである。

【0028】

コーンスティープリカー１６ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２８０ｇ／Ｌ、尿素２１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．７ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０２ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油２ｍｌ／Ｌ、シルクペプチド粉３ｇ／Ｌ、消泡剤４０ｍｌ／Ｌ、コリン０．４ｇ／Ｌ、ベタイン０．３５ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ６ ０．１５ｍｇ／Ｌ。

【0029】

コリネバクテリウムグルタミカムの発酵培養方法：コリネバクテリウムグルタミカムを発酵培地に菌液の体積が発酵培地の体積の１２％を占めるように接種し、アンモニア水でｐＨを６．８に調整し、溶解酸素を３０％に制御し、２７ｈ発酵させ、その後、溶解酸素を２０％制御し、そして発酵液に残存糖が３．５％になるように８０％ブドウ糖溶液を流し込み、続いて７０時間まで発酵させて発酵を停止し、発酵全体の過程の温度を３２℃に制御した。

【0030】

試験例
比較例１
コーンスティープリカー１５ｍｌ／Ｌ、ブドウ糖２４０ｇ／Ｌ、尿素２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．６ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１ ０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１５ｍｇ／Ｌ、トウモロコシ油１ｍｌ／Ｌ、シルクペプチド粉３ｇ／Ｌ、消泡剤３４ｍｌ／Ｌ。

【0031】

発酵培養方法は実施例１と同様である。

【0032】

比較例２
比較例１に基づいてベタイン０．３ｍｇ／Ｌを加えた。発酵培養方法は実施例１と同様である。

【0033】

比較例３
比較例１に基づいてコリン０．５ｇ／Ｌを加えた。発酵培養方法は実施例１と同様である。

【0034】

比較例４
比較例１に基づいてビタミンＢ６ ０．３ｍｇ／Ｌを加えた。発酵培養方法は実施例１と同様である。

【0035】

発酵液におけるＬ−イソロイシンの含有量を検出し（検出方法は唐涛、「アミノ酸プレカラム誘導体化のＨＰＬＣ方法の発展および応用」修士論文、南京理工大学、２００６．５を参照する）、Ｌ−イソロイシンの生産量を計算し、培地における糖含有量から糖−酸変換率を算出し、結果を下記表１に示す。

【0036】

【表1】

【0037】

以上の結果から、基礎培地に２種類の成長因子を添加すると、Ｌ−イソロイシン含有量および糖−酸変換率を向上させることができ、同時に添加する場合、生産量および変換率の増加が最も顕著であったことがわかる。

【0038】

以上、本発明の具体的な実施形態を記述したが、当業者にとって、これらは例示の説明にすぎず、本発明の原理と実質に反しないという前提下で、これらの実施形態に対して様々な変更や修正をすることができる。そのため、本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲によって限定される。