特許 6856618 接着性ペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6856618

(24)【登録日】2021年3月22日

(45)【発行日】2021年4月7日

(54)【発明の名称】接着性ペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20210329BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20210329BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20210329BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20210329BHJP

   C09J 189/00 20060101ALI20210329BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   C07K7/08

   C07K14/00

   C12N15/09 Z

   C09J189/00

【請求項の数】10

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2018-501837(P2018-501837)

(86)(22)【出願日】2016年3月22日

(65)【公表番号】特表2018-511344(P2018-511344A)

(43)【公表日】2018年4月26日

(86)【国際出願番号】KR2016002864

(87)【国際公開番号】WO2016153256

(87)【国際公開日】20160929

【審査請求日】2019年3月15日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0042167

(32)【優先日】2015年3月26日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】518264767

【氏名又は名称】株式会社世援生命工学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(72)【発明者】

【氏名】ユン ウォンジュン

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−３３９１８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２５２３２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 MINOURA N. et al.，Journal of Biomedical Materials Research，Vol.29 (1995)，p.1215-1221

【文献】 PATRA C. et al.，Biomaterials，33(2012)，p.2673-2680

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ ７／００−１９／００

Ｃ０９Ｊ １８９／００

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１６〜２２、２４〜２７、２９〜３７、４２〜６４、６７及び６８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。

【請求項2】

配列番号１６〜２０、２２、２４〜２７、３０〜３７、４２〜６４、６７及び６８の第１アミノ酸はリシン残基に置換され、配列番号２１の第１アミノ酸はアルギニンに置換され、配列番号２９の第１アミノ酸はアスパラギン酸に置換されている請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

配列番号１６〜２２、２４〜２７、３０〜３７、４２〜６４、６７及び６８の第１アミノ酸はアスパラギン酸又はグルタミン酸残基に置換され、配列番号２９の第１アミノ酸はリシン又はアルギニン残基に置換されている請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項4】

配列番号１６〜２０、２２、２４〜２７、３０〜３７、４２〜６４、６７又は６８のアミノ酸配列はＮ末端に１４個以下のアルギニン残基をさらに含み、配列番号２１のアミノ酸配列はＮ末端に１４個以下のリシン残基をさらに含み、配列番号２９のアミノ酸配列は１４個以下のグルタミン酸残基をさらに含む請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記ポリペプチドのＮ又はＣ−末端は、非反応性基で置き換えられたものである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項6】

請求項１乃至４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。

【請求項7】

請求項６に記載の核酸分子を含み、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する、ベクター。

【請求項8】

イン・ビトロにおける、物質の接着性の向上のための請求項１乃至４のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。

【請求項9】

請求項１乃至４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む接着用組成物。

【請求項10】

イン・ビトロにおいて、第１の生物学的若しくは非生物学的物質、及び／又は第２の生物学的若しくは非生物学的物質に請求項１に記載のポリペプチドを処理することにより、前記第１の生物学的若しくは非生物学的物質を第２の生物学的若しくは非生物学的物質に付着させる方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

タンパク質基材の生物学的物質を含む多様な表面の吸着性及び付着性を含む接着性を向上させる物質に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞または組織、またはこれらから由来する生物学的物質の接着に使用できる生体接着剤は、様々な技術分野において幅広く使用できる有用な物質である。例えば、このような物質は、医学分野で組織と組織または組織と細胞の接着、傷の治療、組織の再生または修復過程に使用できるか、または、生命工学分野において幹細胞または一般細胞の培養、薬物伝達担体、組織充鎮剤、パイオコンジュゲーションなどに使用できる。

【0003】

このような生体接着剤は、優れた接着能力及び架橋能はもちろん特に生体に使用時長期間の機能維持が必要で、副作用が少なくなければならない。

【0004】

生体接着性物質は、例えば、シアノアクリレート、フィブリン、ゼラチン、アルブミンまたはポリウレタン系接着物質が挙げられる。シアノアクリレートは、通常局所傷の縫合に使用されるが、毒性物質の放出によってその使用が制限的である。合成高分子を利用した生体接着剤は、溶液環境で接着性が弱い短所がある。米国公開特許公報第２００２−００２２５８８号及びＷＯ第９９／６６９６４号は、アルブミンがカルボジイミドで架橋されたゼラチンまたはアルブミンを開示している。しかし、架橋に使用されるカルボジイミドも毒性の問題で、特にｉｎ ｖｉｖｏでの使用が制限的であり、付着または接着の強度も充分ではない。

【0005】

従って、既存のものと比較して毒性が少ないながらも様々な環境での適用が可能な接着性が向上された新しい生体接着性物質の開発が求められる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本願は、毒性が少ないながらも様々な環境での適用が可能な新規な配列の接着性ポリペプチド及びその用途を提供しようとする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一様態で本願は下記の化学式Ｉのペプチドまたはその誘導体を提供する。

【0008】

（化Ｉ）
［Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５］_ｎ

【0009】

前記化学式Ｉにおいて、
前記Ｘ^１は任意のアミノ酸で、
Ｘ^２、Ｘ^３及びＸ^４は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｅ及びＡのうちいずれか一つのアミノ酸であり、各々同じまたは異なり、Ｘ^５は、ＫまたはＲのアミノ酸である。

【0010】

前記ｎは、１乃至５の整数であり、二つ以上含む場合、各ペプチドのアミノ酸配列は、同じまたは異なり、アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−型の天然または非天然アミノ酸またはその誘導体である。

【0011】

本願においてアミノ酸残基は、単一文字コード（singleletter code）で示し、略語は次のとおりである。

【0012】

Ａ：アラニン、Ｒ：アルギニン、Ｎ：アスパラギン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｃ：システイン、Ｅ：グルタミン酸、Ｑ：グルタミン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イドロイシン、Ｌ：ロイシン、Ｋ：リシン、Ｍ：メチオニン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｐ：プロリン、Ｓ：セリン、Ｔ：トレオニン、Ｗ：トリプトファン、Ｙ：チロシン、Ｖ：バリン、Ｂ：アスパラギン・アスパラギン酸、Ｚ：グルタミン・グルタミン酸、Ｘ：任意のアミノ酸。

【0013】

本願に係る一実施形態において、前記化学式ＩのＸ^１で任意のアミノ酸は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、ＮまたはＱであり得る。

【0014】

他の実施形態において、前記化学式ＩでＸ^２−Ｘ^３−Ｘ^４配列は、例えばＡＡＡ、ＥＥＥ、ＬＶＡ、ＬＶＬ、ＬＶＶ、ＬＬＡ、ＬＬＬ、ＬＬＶであり得る。

【0015】

他の実施形態において、本願に係る化学式Ｉのペプチドは、ＱＬＶＶＫ（配列番号１）、ＱＥＥＥＫ（配列番号２）、ＱＡＡＡＫ（配列番号３）、ＮＬＶＶＫ（配列番号４）、またはＳＬＶＶＫ（配列番号５）である。

【0016】

さらに他の実施形態において、本願に係る化学式Ｉの化合物は下記の化学式ＩＩの化合物を追加に含むことができる。

【0017】

（化ＩＩ）
［Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８−Ｘ^９−Ｘ^１０−Ｘ^１１］_ｎ

【0018】

前記化学式ＩＩにおいて、
Ｘ^６は、Ｆ、Ｙ及びＷのうちいずれか一つのアミノ酸で、
Ｘ^７は、ＫまたはＲのアミノ酸で、
Ｘ^８は、Ａ、Ｍ及びＩのうちいずれか一つのアミノ酸で、
Ｘ^９は、Ｌ、Ｍ及びＧのうちいずれか一つのアミノ酸で、
Ｘ^１０は、任意のアミノ酸で、
Ｘ^１１は、Ｃ、Ｓ及びＴのうちいずれか一つのアミノ酸である。

【0019】

前記Ｘ^７及びＸ^８または前記Ｘ^１０及びＸ^１１のうち一つ以上は欠如されてもよく、
前記化学式Ｉにおいて、前記Ｘ^２、Ｘ^３またはＸ^４のうち一つ以上は欠如されてもよい。

【0020】

前記ｎは、１または２で、前記化学式ＩＩの化合物は、前記化学式Ｉの化合物のアミノ末端（Ｎ−末端）またはカルボキシ末端（Ｃ−末端）、またはＮ−末端及びＣ−末端全てに連結されたものである。

【0021】

さらに他の実施形態において、化学式ＩＩのペプチドは、ＦＲＡＬＰＣ（配列番号６）、ＦＲＥＥＰＣ（配列番号７）、ＦＲＶＶＰＣ（配列番号８）、ＦＥＡＬＰＣ（配列番号９）、ＹＲＡＬＰＣ（配列番号１０）、ＷＲＡＬＰＣ（配列番号１１）、ＦＲＡＬＰ（配列番号１２）、ＦＲＡＬ（配列番号１３）、またはＦＲＰＣ（配列番号１４）である。

【0022】

さらに他の実施形態において、前記化学式Ｉ及び／またはＩＩの化合物は、下記の化学式ＩＩＩの化合物をＮまたはＣ末端、または、Ｎ及びＣ末端に追加で含むことができ、一実施形態において、化学式ＩＩＩ、化学式Ｉ及び化学式ＩＩの順に連結され得る。

【0023】

（化ＩＩＩ）
Ｘ^１２_１−１５

【0024】

前記Ｘ^１２は、正または負荷電された任意のアミノ酸で、一実施形態において前記正荷電されたアミノ酸は、ＫまたはＲで、前記負荷電されたアミノ酸は、ＤまたはＥである。

【0025】

本願に係るペプチドは、本願に係る接着性ペプチドが使用される具体的な目的により、例えば薬物、標識物質、または標的物質と連結されて使用され得る。

【0026】

他の様態で、本願はさらに本願に係る接着性ペプチドを含むバイオコンジュゲート用組成物を提供する。

【0027】

他の様態で、本願はさらに本願に係る接着性ペプチドを含む生体由来物質、または非生体由来物質に対する接着用組成物を提供する。

【0028】

他の様態で、本願はさらに本願に係るペプチドのバイオコンジュゲート用用途を提供する。

【0029】

さらに他の様態で、本願はさらに本願に係るペプチドの生体由来物質、または非生体由来物質に対する接着用物質を使用する用途を提供する。

【0030】

さらに他の様態で、本願はさらに本願に係るペプチドの細胞付着用用途を提供する。

【発明の効果】

【0031】

本願に係るペプチドは、生体接着性物質として作用して、細胞または組織のような生体由来の物質を様々な表面に接着させることができると共に、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質などの有機物と種々の無機物を結合させて、様々な表面に接着させることができて、これを必要とする多様な応用分野に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1A】本願の一実施形態に係るペプチド（Ａ７−１）の非生体由来物質として、ガラス、ジルコニウム、ビニール、ポリスチレンファイバー、ＰＣＬ（Polycaprolactone）、チタニウム及びコラーゲンに対する接着性を示す結果であり、本願の一実施形態に係るペプチドをガラスに接着させた後、これに二硫化結合を介して結合したビオチンの検出を介して、本願ペプチドのガラスへの接着性を調べた結果で、ビオチンの信号は、本願ペプチドがガラスに接着されたことを示し、このような結果は、ＤＴＴ（dithiothreitol）の処理で二硫化結合を分解時に消え、これは、前記結合が二硫化結合に依存することを示す。

【図1B】本願の一実施形態に係るペプチド（Ａ７−１）の非生体由来物質として、ガラス、ジルコニウム、ビニール、ポリスチレンファイバー、ＰＣＬ（Polycaprolactone）、チタニウム及びコラーゲンに対する接着性を示す結果であり、図１Ａの実験を行うために使用された方法を図式的に示したもので、ガラス接着された本願のペプチドは、ＳＨ基を介して標識物質であるビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）と連結されて、ビオチンは、抗体で検出でき、これはビオチンをペプチドから分離させるＤＴＴの処理によって消える結果を示す。

【図1C】本願の一実施形態に係るペプチド（Ａ７−１）の非生体由来物質として、ガラス、ジルコニウム、ビニール、ポリスチレンファイバー、ＰＣＬ（Polycaprolactone）、チタニウム及びコラーゲンに対する接着性を示す結果であり、図１Ａに記載された方法と同様であるがビオチンの代わりにＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を使用して、種々の非生体由来物質の表面への接着性を分析する実験を図式的に示した。

【図1D】本願の一実施形態に係るペプチド（Ａ７−１）の非生体由来物質として、ガラス、ジルコニウム、ビニール、ポリスチレンファイバー、ＰＣＬ（Polycaprolactone）、チタニウム及びコラーゲンに対する接着性を示す結果であり、分析結果を示して、本願のペプチドが種々の非生体由来物質の表面に接着性を有することを示したもので左側からＰＢＳ（phosphatebuffer saline）、ＦＩＴＣ−コンジュゲートＡ７−１、そしてＦＩＴＣ染料を各材料に接着させた後、蛍光イメージを分析した結果である。

【図2A】本願の一実施形態に係るＦＩＴＣで標識されたペプチドの骨移植材であるＢｉｏ−ＯＳＳ（登録商標）（Geistlich Pharma,Inc）の表面に対する接着性実験を行った結果で、本願に係るペプチドの商用化骨移植材への優秀な接着性を示す。

【図2B】本願の一実施形態に係るＦＩＴＣで標識されたペプチドの骨移植材であるＭＢＣＰ（Biomatlante）の表面に対する接着性実験を行った結果で、本願に係るペプチドの商用化骨移植材への優秀な接着性を示す。使用された蛍光顕微鏡倍率は２００倍である。

【図2C】本願の一実施形態に係るＦＩＴＣで標識されたペプチドの軟骨組織／細胞への接着性実験をマウスを利用して行った結果で、軟骨組織にＰＢＳ、ＦＩＴＣ−コンジュゲートＡ７−１、またはＦＩＴＣ染料を各々注射器で注入してマウスを犠牲して組織を切開した後蛍光イメージ分析装備で蛍光を測定したもので、ペプチドが注入された軟骨だけで蛍光が検出された。これは、本願に係るペプチドがプロテオグリカンの主成分であるヘパラン硫酸（heparan sulfate）、ヘパリン（heparin）、コンドロイチン硫酸（chondroitin sulfate）等のＧＡＧ（glycoaminoglycan）を多量含有する軟骨組織（＊）組織で優秀な接着性を示し、後述する図４Ｂの実験結果と一致する。

【図2D】本願の一実施形態に係るＣｙ３で標識されたペプチドの軟骨組織／細胞への接着性実験をマウスを利用して行った結果で、軟骨組織にＰＢＳ、Ｃｙ３−コンジュゲートＡ７−１、またはＣｙ３染料を各々注射器で注入した後、マウスを犠牲して組織を切開した後、共焦点顕微鏡で蛍光を測定したもので、ペプチドが注入された軟骨（＊）及び骨（ｂｏｎｅ#）で蛍光が検出された。これは本願に係るペプチドの軟骨組織への優秀な接着性を示して、後述する図４Ｂの実験結果と一致する。

【図2E】図２Ｄと同様であるが、マウスの関節軟骨（articularcartilage）に注入した後、摘出された組織を破砕した後固定して、共焦点顕微鏡で蛍光を測定した結果で、ＧＡＧを多量含有する弾性線維（elastic fiber）または、細胞外基質（Extracellular matrix、ＥＣＭ）に優秀な接着性を示して、後述する図４Ｂの実験結果と一致する。

【図2F】図２Ｅと同様であるが、マウスの皮膚に処理した結果であり、これは弾性線維を多量含有する組織である皮膚または各組織部位（表皮及び真皮）の基質に対する優秀な接着性を示して、これは後述する図４Ｂの実験結果と一致する。

【図2G】図２Ｆと同様であるが、マウスのヘアーに処理した結果であり、これは弾性線維を多量含有する弾性組織のヘアーに対する優秀な接着性を示し、これは後述する図４Ｂの実験結果と一致する。

【図2H】図２Ｆと同様であるが、マウスの皮下脂肪注入した結果であり、本願に係るペプチドの結合組織（ＣＴ）に対する優秀な接着性を示す。

【図2I】図２Ｆと同様であるが、コラーゲン及びＧＡＧを多量含有するマウスの眼球に処理した結果、処理３０分後に観察した結果、眼球表面が強く着色されて、これは本願に係るペプチドのコラーゲンに対する優秀な接着性を示す。

【図2J】本願の一実施形態に係るＦＩＴＣで標識されたペプチドのヘパリンまたはＮ−アセチルグルコサミンへの接着性を前記物質に連結されたビーズを利用した親和性クロマトグラフィーで行った結果である。標識されないコールドペプチドを追加する場合、ＦＩＴＣ信号が急激に減少し、これは本願に係るペプチドの前記物質に対する接着性を示す。従って、本願に係るペプチドは、新規なヘパリン結合性／接着性があるペプチドとして伝達体として、またヘパリンが有する抗凝固効果をが緩和するために、または、成長因子に結合して細胞外基質に対する接近性を高めることができて、これによって細胞刺激をより亢進させるのに有用に使用できることを示す。

【図2K】本願の一実施形態に係るＣｙ３で標識されたペプチドのキチン（ＧｌｃＮＡｃ）または、ベータ（１．３）グルカンに対する接着性を示す蛍光顕微鏡観察結果で、本願に係るペプチドがＦＩＴＣ標識されたザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）粒子に蓄積されている。ザイモサン粒子は、イースト細胞壁を構成する成分で、これはキチン及びベータ（１．３）グルカンで構成されていて、キチンはＮ−アセチルグルコサミンの重合体であり、ベータ（１．３）グルカンはグルコースである。

【図2L】本願の一実施形態に係るＦＩＴＣで標識されたペプチドのＧｌｃＮＡｃ（N-acetylglucosamine）とＭｕｒＮＡｃ（N-acetylmuramicacid）で構成されたプロテオグリカンが主成分であるグラム陰性菌の細胞壁への接着性を示す結果で、対比染色はＤＡＰＩで行った後、蛍光顕微鏡で観察した。

【図2M】本願の一実施形態に係るＦＩＴＣで標識されたペプチドのＧｌｃＮＡｃ（N-acetylglucosamine）とＭｕｒＮＡｃ（N-acetylmuramicacid）で構成されたプロテオグリカンが主成分であるグラム陽性菌の細胞壁への接着性を示す結果で、対比染色はＤＡＰＩで行った後、蛍光顕微鏡で観察した。

【図3A】本願の一実施形態に係るペプチドの付着依存性細胞であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の培養皿への接着性実験を行った結果で、本願に係るペプチドを含む細胞は、顕微鏡観察結果、対照群（ＰＢＳで処理）と比較して、粗い細胞膜境界形態を示し、これは本願ペプチドによって細胞のような生体または生体由来物質の培養皿のような非生体由来物質への接着性を増加させることを示す。

【図3B】本願の一実施形態に係るペプチドの付着依存性細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）の疏水性培養皿への接着能を示した結果であり、既存の細胞接着能向上に使用される物質であるＰＬＬ（poly-L-lysin）と比較した結果で、本願に係るペプチドを含む細胞は、顕微鏡観察結果、対照群（ＰＢＳで処理及びＰＬＬ）と比較して、接着性が増加したことを示す。このような疏水性培養皿での接着能は、疏水性性質を帯びる様々な組織移植材料（ＰＣＬなど）が有する細胞接着の短所を補完できて、産業的応用価値が高いことを示す。

【図3C】本願の一実施形態に係るペプチドの付着依存性細胞（ＳＴ２）の疏水性培養皿への接着能を媒体対照群と比較した結果で、本願に係るペプチドを含む細胞は、顕微鏡観察結果、対照群と比較して、接着性が増加したことを示す。

【図3D】本願の一実施形態に係るペプチドの付着依存性細胞（Ｃ２Ｃ１２）を解凍した後、これの培養皿への接着能を媒体対照群と比較した結果で、本願に係るペプチドを含む細胞は、顕微鏡観察結果、対照群と比較して、培養皿への接着性が増加した。特に解凍直後細胞の接着能は、細胞の生存に大変重要な影響を及ぼして、前記結果は、本願に係るペプチド接着剤が解凍後細胞の死滅を最小化するために有用に使用でき、一次細胞（primarycell）の培養分野で有用に使用できて産業的応用価値が高いことを示す。

【図3E】本願の一実施形態に係るペプチドのマイトマイシン処理されたＳＴＯフィーダ（feeder）細胞の親水性培養皿への接着能を陰性対照群（Ｍｏｃｋ）及びゼラチンと比較した結果で、本願に係るペプチドを含む細胞は、顕微鏡観察結果、陰性対照群及びゼラチンと比較して、接着性が増加したことを示す。

【図3F】本願の一実施形態に係るペプチドの本図面に表示された種々の細胞（確立細胞株及び一次細胞）の疏水性培養皿への接着能を細胞代謝測定を利用して陰性対照群（Ｍｏｃｋ）と比較した結果である。前記結果は、本願に係るペプチドは、種々の細胞で陰性対照群と比較して、その接着性を増加させる可能性があることを示す。

【図4A】本願に係るペプチドの細胞接着能の機序を糾明した分析結果である。Ａ７−１による細胞接着が細胞表面の電解質（ＥＤＴＡ処理結果）や新しいタンパク質合成（ＣＨＸ処理結果）を要しない反面、血清によっては初期に阻害が起きることを示す結果で、これは血清内存在する多くの種類のＧＡＧがペプチドに一次的に結合したのが原因と判断される。

【図4B】本願に係るペプチドの細胞接着能の機序を糾明した分析結果である。ペプチド細胞接着促進機序で、ＧＡＧまたはコラーゲンとの関連性を分析した結果で、上の図面は、コラーゲンとＧＡＧのいずれに関連している結果で、酵素処理によって暫定的標的を分解することによって現れる現象を観察したものである。コラゲナーゼ処理による細胞接着の減少は、少なくともコラーゲンとの相互作用によるものである。そしてヒアルロニダーゼ処理は少なくともヘパリンサルフェートを加水分解することによって細胞接着が減少して、これはＧＡＧ中ヘパリンサルフェートとペプチドの相互作用を示す。下の図面は、ＧＡＧとの関連性を分析した結果で、ヘパリン及びＣ−サルフェートを添加した結果、Ａ７−１を介して促進される細胞接着能が濃度依存的に顕著に減少して、このような結果は、Ａ７−１の細胞接着能とＧＡＧとの関連性を示す。ＧＡＧ濃度変化は、種々の疾患と関連性が報告されていて、本願に係るペプチドは新規な、ＧＡＧ結合性／接着性があるペプチドであり、血液内ＧＡＧを調節する新しいペプチドまたはＧＡＧを標的化する伝達体として有用に使用される可能性があることを示す。

【図4C】本願に係るペプチドの細胞接着能の機序を糾明した分析結果である。Ａ７−１と溶解性ＲＧＤＳペプチドを競争的に処理した結果で、Ａ７−１非処理群では、溶解性ＲＧＤＳを処理する場合、付着分子であるインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）に優先的に結合して底（基質に）対する接着能を有意にに減少させるが、Ａ７−１処理群ではＲＧＤＳを処理しても細胞の接着に全く影響を及ぼさないことが明らかになり、これはＡ７−１はインテグリンを介した付着依存的細胞接着とは別の細胞接着促進機序を有することを示す。

【図5A】本願に係るペプチドの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ， induced pluripotent stem cell）に対する接着能向上を測定するために製作されたレポーターシステム及びこれを利用した実験手順を図式的に示したもので、前記レポーターシステムは、人工多能性幹細胞の全分化能（Stemness）の指標でＯｃｔ４遺伝子の活性を測定できる構造を含む。

【図5B】図５Ａに係る構築水を利用してマウス人工多能性幹細胞の接着及び全分化能維持を細胞培養２日目及び３日目にＯｃｔ４の発現の有無の検出で測定した結果で、対照群としてフィーダ細胞及びゼラチンで予めコートされた培養皿を使用しており、本願の一実施形態に係るペプチドは、予めコートさ（precoated）れるか、または培養液に混合（Mixed）される方式で追加され、二つの場合共にｉＰＳＣの接着を媒介して全分化能も維持させることが明らかになった。

【図5C】図５Ｂと同様であるが、細胞培養４日目に測定した結果で、本願に係るペプチドは、ｉＰＳＣの接着を媒介して全分化能も維持させることが明らかになった。

【図6A】全分化能を示す他のマーカーであるＡｌｐ(alkalinephosphotase)遺伝子の発現を染色を介して観察した結果で、本願に係るペプチドは、予めコートまたは培養液混合される場合共に、ｉＰＳＣの接着を媒介して全分化能も維持させることが明らかになった。

【図6B】全分化能を示す他のマーカーであるＮａｎｏｇ遺伝子の発現を染色を介して観察した結果で、本願に係るペプチドは予めコートまたは培養液混合される場合共に、ｉＰＳＣの接着を媒介して全分化能も維持させることが明らかになった。

【図6C】図６Ａと同様の実験であるが、ｈＥＳＣを利用した実験結果であり、ｈＥＳＣに対してもフィーダ細胞またはマトリゲル（Matrigel）等の外部環境的変化なしでもよく成長する可能性があることを示す。

【図7A】本願に係るペプチドを利用したバイオコンジュゲーション過程を図式的に示し、ＤＳＳ（Disuccinimidylsuberate）リンカーを利用して本願の一実施形態に係るペプチドを骨形成タンパク質であるＢＭＰ２にコンジュゲーションした。

【図7B】図７ＡのようにＢＭＰ２にコンジュゲーションされた本願に係るペプチドを細胞培養皿に処理した後、Ｃ２Ｃ１２細胞を培養してから４８時間後に骨分化能遺伝子であるＡｌｐの発現を測定した結果で、組換えＢＭＰ処理群（ｒｈＢＭＰ２）または、架橋剤処理群（ＣＬ）と比較してＡｌｐ活性が増加し、これは本願のペプチド処理によって骨分化が促進されたことを示す。

【図8A】本願に係るペプチドの安定性を造骨細胞（ＭＣ３ＴＣ−Ｅ１）を利用してテストした結果である。

【図8B】本願に係るペプチドの安定性を造骨細胞（ＭＣ３ＴＣ−Ｅ１）を利用してテストした結果である。

【図8C】本願に係るペプチドの安定性を造骨細胞（ＭＣ３ＴＣ−Ｅ１）を利用してテストした結果である。

【図8D】本願に係るペプチドの安全性をテストした結果で、マウスの単核球（monocyte）を分離した後、ペプチド刺激を加えた後、炎症誘導が発生するか否かを調べた結果である。

【図9A】既存の接着性ペプチドと本願に係るペプチドの効果を比較した結果で、脊髄由来の神経細胞を既存のペプチドでラミニン(laminin)とポリ−Ｌ−オルニチン(poly-L-ornithin)でコートされた培養皿及び本願の一実施形態に係るＡ７−１でコートされた培養皿を使用して培養した後、各時間帯別にＣＣＫ−８を分析した結果である。

【図9B】既存の接着性ペプチドと本願に係るペプチドの効果を比較した結果で、培養４日後光学顕微鏡を介して比較観察した結果である。

【図9C】既存の接着性ペプチドと本願に係るペプチドの効果を比較した結果である。本願の一実施形態に係るＡ７−１でコートされた一次培養細胞が神経由来細胞であるか否かを検証した結果で、神経標識タンパク質を免疫蛍光法で染色した後、共焦点顕微鏡を介して分析した結果である。前記結果は、本願に係るペプチドが既存のものと比較して格段に優秀な接着能を有することを示す。

【図10A】ｈＭＳＣを利用して細胞の接着進行過程(adhesion progression)がＡ７−１によって促進されることを糾明する結果で、細胞培養後６時間を基準に分析した結果であり、陰性対照群は依然として接着初期段階であるアクチン−リング形成が多数をなしているが、Ａ７−１処理群の場合、すでにその段階をすぎてストレスファイバー形成が多数の細胞で観察されたことを示す。

【図10B】ｈＭＳＣを利用して細胞の接着進行過程(adhesion progression)がＡ７−１によって促進されることを糾明する結果で、細胞培養後６時間を基準に分析した結果であり、前記観察結果を定量したグラフである。

【図10C】ｈＭＳＣを利用して細胞の接着進行過程(adhesion progression)がＡ７−１によって促進されることを糾明する結果で、細胞培養後６時間を基準に分析した結果であり、細胞接着に係る幾何学的様態(geometric shape)(cellaspect ratio：細胞の横／縦の比率、１の場合完全な原形であり接着過程の最も初期状態で示す)を測定して示した結果で、Ａ７−１の処理群で格段に成熟した接着能を示す。

【図11】本願に係る様々な配列を有するペプチドとＧＡＧのような細胞外基質間の相互作用を介して現れる細胞接着能促進を測定した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

一様態で、本願は下記の化学式Ｉで表されるペプチドに関する。

【0034】

（化Ｉ）
［Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５］_ｎ

【0035】

前記化学式Ｉにおいて、
Ｘ^１は、極性の非荷電された任意のアミノ酸であり、
Ｘ^２、Ｘ^３及びＸ^４は、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｅ及びＡのうちいずれか一つのアミノ酸であり、各々同じまたは異なり、
Ｘ^５は、ＫまたはＲのアミノ酸である。

【0036】

前記ｎは１乃至５の整数であり、前記ｎが２以上である場合、各ペプチドのアミノ酸配列は、同じまたは異なり、前記アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−型の天然または非天然アミノ酸またはその誘導体である。

【0037】

本願に使用された用語「アミノ酸」とは、２０個の天然から発見されるアミノ酸及び非天然アミノ酸、生体内で翻訳後に変形されるアミノ酸、例えばホスホセリン及びホスホトレオニン；及び２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、ノルバリン、ノルロイシンのようなその他希少アミノ酸；細胞透過または生体内安定性向上のために変形されたものを含み、鏡像異性体であるＤ−及びＬ−形態をいずれも含むものである。本願で正荷電アミノ酸、負荷電されたアミノ酸、極性の非荷電されたアミノ酸及び非極性の脂肪族アミノ酸は、当業界に公示されていて、当業者なら適切なものを選択することができるはずである。

【0038】

一実施形態において、正荷電されたアミノ酸は、ＫまたはＲである。

【0039】

他の実施形態において、前記負荷電されたアミノ酸は、ＤまたはＥである。

【0040】

さらに他の実施形態において前記極性の非荷電されたアミノ酸は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、ＮまたはＱである。

【0041】

さらに他の実施形態において前記非極性の脂肪族アミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＩである。

【0042】

本願で使用された用語天然及び非天然において前者は細胞、組織または生体内で発見される形態の化合物を称し、後者はこのような化合物に様々な目的のために人為的変形が加えられたものを意味する。

【0043】

本願で使用された用語「ペプチド」、「ポリペプチド」とは、互いに交換的に使用され、アミノ酸の単位体が共有結合で連結された分子を称する。これは、元（ｎａｔｉｖｅ）アミノ酸またはその分解産物、合成ペプチド、組換え方式で製造されたペプチド、ペプチド模倣体（典型的に合成ペプチド）、及びペプトイド及びセミペプトイドのようなペプチド類似体と細胞透過または生体内安定性向上のために変形されたものを含む。このような変形は、これで制限するのではないが、Ｎ−末端変形、Ｃ−末端変形、ＣＨ_２−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｓ、ＣＨ_２−Ｓ＝Ｏ、ＣＨ_２−ＣＨ_２のようなペプチド結合変形、バックボーン変形、側鎖変形を含む。ペプチド模倣体化合物を製造する方法は、技術分野に公示されたもので、例えばQuantitative Drug Design、C.A.RamsdenGd.,Choplin Pergamon Press(1992)に記載された内容を参照することができる。

【0044】

本願で用語「接着」は、付着及び吸着を含むもので、可逆的、非可逆的接着を含み、他の側面では共有結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、水素結合などを含む一つ以上の化学的結合による接着を含む。

【0045】

本願で無機物または無機質表面は、相互交換的に使用され、優秀な静電気的伝導性により電子の分布が自由な物質または炭素、シリコンまたは窒素などを含まない通常的意味での無機物であり、特に表面が疏水性である物質を含み、その例としては金属、例えば鉄、銅、金、銀及び白金を含む貴金属、チタニウムまたはアルミニウム；セラミック、例えばジルコニア；カルシウム燐灰石結晶、例えばヒドロキシアパタイト；高分子合成樹脂、例えばポリエチレン；ガラス；及びこれらの組合せを含むが、これに制限されない。

【0046】

本願に係る用語「表面」とは、最も広い範囲で解釈され２次元以上の物質に存在するもので、特定形、特定の大きさに限定されず、特定単位体または分子水準の物質に存在する表面はもちろん、これらからなる物質が有する表面を含む。例えば、ナノメートル乃至マイクロメートル水準の粒子または物質に存在するものはもちろん数ミリメートル乃至数メートルの大きさの水準も含む。

【0047】

本願に係る化学式Ｉの化合物は、第１領域として細胞膜または細胞表面との結合に関わるだけでなくペブチドの個数を多様に適用することにより、本願に開示された様々な目的に使用できる。第１領域はペプチドの２次構造に影響を与えることができる核心領域として後述する他の機能領域の分子特性を良好に維持させる。第１領域が疎水性特性を有することにより分子間疎水性結合、細胞との疎水性結合に関与し、この領域が有する疏水性特性によって組織再生のための種々のナノ構造支持体、ゲルの成分などに活用され得る。

【0048】

本願に係るペプチドで第１領域は、５個のアミノ酸で構成された単位体が一つ以上含まれることができ、二つ以上含む場合、各単位体は異なるか同一であり得る。本願に係るペプチドに含まれる単位体の数は、ペプチドの製造、保管、伝達または後述する本願に係るペプチドの効能と用途のための機能化(functionalization)により多様である。例えば１乃至１０個、１乃至９個、１乃至８個、１乃至７個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１乃至２個、または１個を含む。

【0049】

化学式ＩでＸ^１は任意のアミノ酸で、一実施形態においては、極性の非荷電されたアミノ酸、または、他の実施形態においては、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、ＮまたはＱである。

【0050】

化学式ＩでＸ^２、Ｘ^３及びＸ^４は、各々Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｅ及びＡのうちの一つで、各残基は同じまたは異なり、Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４配列は、例えばＡＡＡ、ＥＥＥ、ＬＶＡ、ＬＶＬ、ＬＶＶ、ＬＬＡ、ＬＬＬ、ＬＬＶなどであるが、これに制限されない。他の実施形態において、前記化学式ＩはＸ^１−ＬＶＶ−Ｘ^５、Ｘ１−ＡＡＡ−Ｘ^５またはＸ^１−ＥＥＥ−Ｘ^５である。

【0051】

一実施形態において化学式Ｉの配列は、ＱＬＶＶＫ（配列番号１）、ＱＥＥＥＫ（配列番号２）、ＱＡＡＡＫ（配列番号３）、ＮＬＶＶＫ（配列番号４）、またはＳＬＶＶＫ（配列番号５）で表される。

【0052】

他の側面で本願は下記の化学式ＩＩの化合物、または、前記化学式Ｉの化合物に一つ以上の下記の化学式ＩＩの化合物を追加で含むペプチドに関する。

【0053】

（化ＩＩ）
［Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８−Ｘ^９−Ｘ^１０−Ｘ１１］_ｎ

【0054】

前記化学式ＩＩにおいて、
Ｘ^６は、Ｆ、Ｙ及びＷのうちいずれか一つのアミノ酸で、
Ｘ^７は、ＫまたはＲのアミノ酸で、
Ｘ^８は、Ａ、Ｍ及びＩのうちいずれか一つのアミノ酸で、
Ｘ^９は、Ｌ、Ｍ及びＧのうちいずれか一つのアミノ酸で、
Ｘ^１０は、任意のアミノ酸で、
Ｘ^１１は、Ｃ、Ｓ及びＴのうちいずれか一つのアミノ酸である。

【0055】

前記Ｘ^７及びＸ^８または前記Ｘ^１０及びＸ^１１のうち一つ以上は欠如されてもよく、
前記ｎは１または２である。

【0056】

前記化学式ＩＩの化合物は、前記化学式Ｉの化合物のアミノ末端（Ｎ−末端）またはカルボキシ末端（Ｃ−末端）、またはＮ−末端及びＣ−末端のいずれに連結され得る。本願によると、前記化学式ＩＩの化合物は、第２領域とも呼ばれて、第１領域と共に単一分子として存在する場合αヘリックス構造を容易に作ることができ、本願に係るペプチドに親水性特性を与える。

【0057】

化学式Ｉの第１領域と化学式ＩＩの第２領域は、各々一つ以上含まれてもよく、その配列も様々なものになる。例えば、化学式Ｉ及びＩＩのペプチドが、各々一つ以上ずつ連結されて、化学式Ｉ−ＩＩのペプチド、化学式Ｉ−化学式Ｉ−化学式ＩＩ−化学式ＩＩの構造を有したりまたは、例えば化学式Ｉ及びＩＩのペプチドが各々一つずつ順次連結されて、これが再び連結されて、化学式Ｉ−化学式ＩＩ−化学式Ｉ−化学式ＩＩのような構造を包含できたり、または化学式Ｉ−化学式ＩＩ−化学式Ｉ、または、化学式ＩＩ−化学式Ｉ−化学式ＩＩのような構造を含むことができる。前記構造で化学式Ｉ及びＩＩの順番が変わってもよい。

【0058】

本願の一実施形態において、前記化学式ＩＩのペプチドは、ＦＲＡＬＰＣ（配列番号６）、ＦＲＥＥＰＣ（配列番号７）、ＦＲＶＶＰＣ（配列番号８）、ＦＥＡＬＰＣ（配列番号９）、ＹＲＡＬＰＣ（配列番号１０）、ＷＲＡＬＰＣ（配列番号１１）、ＦＲＡＬＰ（配列番号１２）、ＦＲＡＬ（配列番号１３）、またはＦＲＰＣ（配列番号１４）で表される。

【0059】

他の側面で本願の化学式Ｉのペプチド、または化学式ＩとＩＩをいずれも含むペプチドは、化学式ＩＩＩのＸ^１２_１−１５で表される第３領域をそのＮまたはＣ末端に追加で含んでもよく、前記Ｘ^１２は、陽または負荷電された任意のアミノ酸である。

【0060】

一実施形態において、前記化学式ＩＩＩで正荷電されたアミノ酸は、ＫまたはＲである。

【0061】

他の実施形態において、前記化学式ＩＩＩで前記負荷電されたアミノ酸は、ＤまたはＥである。

【0062】

さらに他の実施形態において、前記化学式ＩＩＩで前記極性の非荷電されたアミノ酸は、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、ＮまたはＱである。

【0063】

本願の一実施形態において、本願のペプチドは、例えば下記で構成される群から選択され得る：ＲＱＬＶＶＫ（配列番号１５）；ＦＲＡＬＰＣ（配列番号６）；ＦＲＡＬＰＣＲＱＬＶＶＫ（配列番号１６）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号１７）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号１８）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰ（配列番号１９）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬ（配列番号２０）；ＫＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号２１）；ＲＱＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号２２）；ＲＱＥＥＥＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号２３）；ＲＱＡＡＡＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号２４）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＰＣ（配列番号２５）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＥＥＰＣ（配列番号２６）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＶＶＰＣ（配列番号２７）；ＲＱＥＥＥＫＦＲＥＥＰＣ（配列番号２８）；ＥＱＬＶＶＥＦＥＡＬＰＣ（配列番号２９）；ＲＱＬＶＶＫＹＲＡＬＰＣ（配列番号３０）；ＲＱＬＶＶＫＷＲＡＬＰＣ（配列番号３１）；ＲＮＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号３２）；ＲＳＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号３３）；Ｒ-（ＱＬＶＶ）２-ＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号３４）；Ｒ-（ＱＬＶＶ）_３-ＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号３５）；Ｒ-（ＱＬＶＶ）_４-ＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号３６）；ＲＱＬＶＶＫ-（ＦＲＡＬＰＣ）_２（配列番号３７）；（Ｒ）_２-ＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号３８）；（Ｒ）_５-ＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号３９）；（Ｒ）_１０-ＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４０）；及び（Ｒ）_１５-ＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４１）。

【0064】

さらに他の実施形態において、本願のペプチドは、例えば下記で構成される群から選択され得る：ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号１７）；ＫＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号２１）；ＲＮＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号３２）；ＲＳＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号３３）；ＲＱＶＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４２）；ＲＱＩＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４３）；ＲＱＡＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４４）；ＲＱＥＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４５）；ＲＱＬＬＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４６）；ＲＱＬＩＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４７）；ＲＱＬＡＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４８）；ＲＱＬＥＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号４９）；ＲＱＬＶＬＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号５０）；ＲＱＬＶＩＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号５１）；ＲＱＬＶＡＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号５２）；ＲＱＬＶＥＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号５３）；ＲＱＡＡＡＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号２４）；ＲＱＥＥＥＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号２３）；ＲＱＬＶＶＲＦＲＡＬＰＣ（配列番号５４）；ＲＱＬＶＶＫＹＲＡＬＰＣ（配列番号３０）；ＲＱＬＶＶＫＷＲＡＬＰＣ（配列番号３１）；ＲＱＬＶＶＫＦＫＡＬＰＣ（配列番号５５）；ＲＱＬＶＶＥＦＥＡＬＰＣ（配列番号５６）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＬＬＰＣ（配列番号５７）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＩＬＰＣ（配列番号５８）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＶＬＰＣ（配列番号５９）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＥＬＰＣ（配列番号６０）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＡＰＣ配列番号６１）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＩＰＣ（配列番号６２）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＶＰＣ（配列番号６３）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＥＰＣ（配列番号６４）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＶＶＰＣ（配列番号２７）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＥＥＰＣ（配列番号２６）；ＲＱＥＥＥＫＦＲＥＥＰＣ（配列番号２８）；ＲＱＥＥＥＥＦＥＥＥＰＣ（配列番号６５）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＸＣ（配列番号６６）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＳ（配列番号６７）；ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＴ（配列番号６８）；及びＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＸ（配列番号６９）。前記ペプチドは、本願で合成された種々の変異を有する１２ｍｅｒの配列及び接着実験結果を基に下記の記述事項を考慮して、可能な変異を導入して生成された配列で、その効果も本願実施例に記載されたように本願で開示されたものから予測可能であり、従って本願の範囲に含まれる。

【0065】

しかし、本願に係るペプチドは、前記のような配列に限定されず、これらの生物学的均等物（biologicallyequvalents）を含む。すなわち、アミノ酸配列に追加的な変形を与えることができる。このような変形は、例えばアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／または置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸の側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疏水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてできる。アミノ酸の側鎖置換体の大きさ、形及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシンとヒスチジンは、いずれも陽電荷を帯びた残基で；アラニン、グリシンとセリンは、似たような大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは類似する形を有する。従って、このようなことを考慮すると、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能均等物といえる。

【0066】

また、アミノ酸変異を導入するに当たり、アミノ酸の疏水性インデックス（hydrophobicindex）が考慮され得る。各アミノ酸は、疏水性と電荷により疏水性インデックスが与えられる：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスタイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。

【0067】

前記のような疏水性インデックスは、特にタンパク質の相互的な生物学的機能（interactivebiological function）を与えるに当たり重要である。類似の疏水性インデックスを有するアミノ酸で置き換えてこそ類似の生物学的活性を保有できることは公知の事実である。疏水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以内の疏水性インデックス差を示すアミノ酸間の置換が有利である。

【0068】

また、類似の親水性数値（hydrophilicityvalue）を有するアミノ酸の間の置換が均等な生物学的活性を有するタンパク質を招くことも周知である。

【0069】

例えば、米国特許第４，５５４，１０１号に開示された通り、次の親水性値が、各アミノ酸残基に与えられる：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。

【0070】

また、本願に係るペプチドの活性を全体的に変更させないアミノ酸置換は、当分野に公知である(H.Neurath、R.L.Hill,TheProteins,3rd Edition,Academic Press,New York,1979)。例えば、最も通常的に起きる置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ間の置換が挙げられる。

【0071】

従って、上述したような生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本願に開示されたアミノ酸配列またはこれをコードする核酸分子は、本願に開示されたものと実質的同一性を有するものも含まれる。実質的同一性とは、本願に開示された配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインして、当業界で通常的に利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合、少なくとも６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、さらに好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント法は当業界に公知である。例えば、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.(1981)2:482; Needleman andWunsch,J.Mol.Bio.(1970)48:443; Pearson and Lipman,Methods inMol.Biol.(1988)24:307-31; Higgins and Sharp,Gene(1988)73:237-44; Higgins andSharp,CABIOS(1989)5:151-3; Corpet et al.,Nuc.Acids Res.(1988)16:10881-90; Huanget al.,Comp.Appl.BioSci.(1992)8:155-65及びPearson etal.,Meth.Mol.Biol.(1994)24:307-31に開示されている。NCBI BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215:403-10)は、ＮＢＣＩなどで接近可能で、ｂｌａｓｔ、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動されて利用することができる。ＢＬＳＡＴは、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でアクセス可能で、このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlで確認することができる。

【0072】

一実施形態において、上述した本願に係るペプチドは、Ｃ−末端が非反応性基、例えばＮＨ２等のような基で置き換えられて安全性を高めることができる。

【0073】

さらに別の側面では、本発明は、また、本明細書に開示されたペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びこれを含むベクター、および前記ベクターを含む細胞に関するものである。当業者は、当該技術分野で公知されたコドンからヌクレオチド配列を決定することができ、また、ヌクレオチドのクローニングおよび形質転換に使用される適切なベクターおよび細胞を選択することができる。

【0074】

本願に係るペプチドは、種々の生体由来または非生体由来の物質またはその表面に接着でき、このような特徴を利用して、一つの物質とこれと同じまたは異なる物質間の接着を媒介することができる。例えば、本願に係るペプチドを利用する場合、イン・ビトロで培養される細胞を培養皿に接着させることができ、細胞と細胞との間の接着を媒介したり、または蛍光物質などのような標識物質と結合したペプチドを使用する場合、細胞、組織などの標識に使用でき、有用な生活性物質、例えば骨形成タンパク質などのような物質を本願のペプチドに結合させて、生活性物質が効果を示すと期待される組織に処理する場合、治療効果を高めることができる。

【0075】

本理論に制限されないが、本願に係るペプチドは、ペプチドグリカン層に対する親和度があり、さらには微生物の細胞壁成分（lipopolysaccharide成分含む）はもちろん、イーストの細胞壁成分（（１，３）−βグリカンを含む）に選択的に結合でき、様々な応用分野に使用できる。

【0076】

また、本願に係るペプチドは、種々の化合物をイプシロンアミノ基に結合させる方式で伝達体での機能を搭載して活用できる。

【0077】

本理論に制限されないが、本願に係るペプチドは、プロテオグリカンに対する高い親和力を示して、プロテオグリカンを軟骨を形成する組織構成成分として組織再生分野で応用価値が非常に広くて成形を含む様々な臨床手術に直接的に活用される物質を含む。従って、本願に係るペプチドは、軟骨を軟骨再生に、広く活用できる。本願に係るペプチドは、物質、特に生体由来物質、例えば生物に分類されるすべての動植物及び前記動植物から由来した一部を意味して、例えば、細胞、組織、器官を含む生体物質の表面を含む。

【0078】

このような側面から本願は、ペプチドは、薬物、標識物質、または標的物質を追加で含むことができる。

【0079】

さらに他の側面で本願は、本願に係るペプチドを含むバイオコンジュゲート用組成物に関する。

【0080】

他の側面で本願は、本願に係るペプチドを含む生体由来物質または非生体由来物質接着用組成物に関する。

【0081】

本願に係る一実施形態で本願に係る組成物またペプチドは細胞に適用され得る。本願に係るペプチドまたは組成物が適用され得る細胞は特に制限されず、植物、昆虫及び動物細胞に適用され、例えば動物細胞、特にヒト由来細胞に適用され得る。例えば、多分化能細胞、成体幹細胞、前駆細胞、または前駆細胞の接着に使用できる。多分化能細胞の例としては、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、及びｉＰＳ（人工多能性幹細胞）細胞を含む。成体幹細胞では、ＭＳＣ(mesenchymal stem cells)、造血幹細胞、神経幹細胞を含む。前駆細胞の例としては、皮膚、真皮、内皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、脳、上皮、心臓、腎臓、すい臓、脾臓、口腔、角膜または毛髪由来の細胞を含む。

【0082】

ヒト由来細胞の例としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、中間葉細胞、筋芽細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞、胚芽細胞、線維細胞、角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、及び造血幹細胞を含むが、これに制限されない。治療目的のために細胞は、自己、他家由来であり得る。

【0083】

本願の組成物が適用できる表面は、特に制限されず、親水性または疏水性の有機物または無機物表面をいずれも含む。一実施形態で本願の組成物が適用できる表面は、生体由来物質またはプラスチック、ガラス、高分子合成樹脂及び金属を含む非生体由来物質をいずれも含む。

【0084】

本願に係るペプチドまたは組成物の用途はこれに限定されないが、（１）水（水または塩分がある水）中にある基質間の接着；（２）骨、靭帯、筋、半月板（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）及び筋肉治療及び人工材料移植のような成形外科的治療；（３）穿孔、創傷、切開などの治療、角膜移植、人工角膜挿入のような眼科的接合；（４）補正装置、架工疑歯、歯冠取り付け、揺れる歯の固定、折れた歯の治療及び充鎮剤固定のような歯科的接合；（５）血管接合、細胞組織接合、人工材料移植、傷縫合のような外科的治療；（６）植物の移植片接合、傷治癒のような植物での接合；（７）幹細胞を含む細胞または組織培養；（８）人工臓器、歯科、外科または眼科用医療装置、例えばインプラント、骨固定剤、骨ケージ、ガイドワイヤー、カテーテル及びステントを含む医療装置の物質；（９）骨表面、チタニウム、セラミックなど；（１０）生理活性物質を含む種々の生体物質、例えば生体活性物質、薬物、標識物質、または標的物質などに対するバイオコンジュゲーションなどに利用できる。

【0085】

一実施形態においては本願のペプチドまたは組成物は、疾患の治療のための細胞または組織の移植または再建のための歯科的、眼科的または整形外科的治療に使用されて、この場合本願の接着組成物が適用できる表面はこれに制限されないが、ＰＬＧＡ、ヒドロキシアパタイト、ジルコニウム、チタニウム、鉄、ステンレススチール、チタニウム、白金、金、合金を含むか、これに制限されない。

【0086】

さらに他の実施形態において本願のペプチドまたは組成物は、支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）への細胞の接着に使用される。本願で細胞接着表面または支持体は、細胞培養皿、マイクロビーズ、基底物質、組織移植物などを含み、例えば組織または細胞の培養、特に幹細胞の培養などに使用できる。本願に係る一実施形態においては本願のペプチドを利用した場合、従来の細胞接着に使用する物質と比較して格段に高い接着力を示した（図１、２、３、４、５及び６等参照）。

【0087】

さらに他の実施形態において本願のペプチドまたは組成物は、バイオコンジュゲーションに使用される。バイオコンジュゲーションとは、二つのバイオ分子を安定した共有結合で連結する化学的方法／手段をいうもので、本願に係るペプチドは直接または低分子リンカーを使用して、様々なバイオ分子、例えば酵素、ホルモンを含むタンパク質、核酸、脂質または炭水化物に連結できる。このようなバイオコンジュゲーションは、研究用ツールとして、生化学的物質の検出、モニタリングなどに使用できたり、または、治療剤として治療用物質とコンジュゲーションされ、治療の効率性を高めたり、標的治療に使用できる。本願に係る一実施形態においては、骨形成タンパク質にコンジュゲーションされ、骨形成タンパク質の治療効果を増加させる。

【0088】

本願に係るペプチド及び組成物の使用方法は、通常の生体接着組成物の使用方法に準じて、代表的な方法は塗布法である。例えば、本願に係るペプチドまたは組成物の具体的な使用法、使用量及び台形などは、現在市販される製品であるＣｅｌｌ−Ｔａｋ(登録商標)(BD Biosciences,USA)を参照することができる。

【0089】

本願に係る組成物は溶剤型、水溶性、無溶剤型であってもよく、適用される表面の面積を基準に０．１乃至１０００ｎｇ／ｍｍ^２、特に１乃至１００ｎｇ／ｍｍ^２で使用できるが、これに限定されない。

【0090】

本願に係る組成物は、界面活性剤、酸化剤、架橋剤、または充鎮剤（ｆｉｌｌｅｒ）で処理したり、またはペプチドの濃度を調節することによって前記接着力及びこれに合わせて適用量を調節することができる。例えば、充鎮剤はコラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチンサルフェート、エラスチン、ラミニン、カゼイン、ヒドロキシアパタイト、アルブミン、またはフィブロネクチンを含むが、これに制限されない。

【0091】

以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし下記の実施例は本発明をより簡単に理解するために提供されるだけであって、本発明が下記の実施例に限定されない。

【0092】

（実施例）
＜実施例１．接着性ペプチドの製造＞

【0093】

実験に使用されたペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)（Ｆｍｏｃ）方法を介して合成されたもので、注文制作した（ルジェンＳｃｉ、大韓民国；ペプトロン、大韓民国）。ペプチド効果の再現性検証のために、二つの会社を介して各３回（ルジェン）そして２回（ペプトロン）のペプチド合成を行っって、各合成物に対してて独立実験を介して分析を行って、合成回数別に同じ結果を収得した。

【0094】

＜実施例２．接着性ペプチドと蛍光物質のコンジュゲーション及びこれの種々のｐ非生体由来表面への接着性分析＞

【0095】

実施例１で合成されたペプチドは、Ａ７−１（ＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ；配列番号１７）（下記の表１の１２ｍｅｒ（Ａ）配列に該当）は、ビオチン(Thermo Scientific)、そしてＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）をＣｙｓにＳＨ基を介して各々コンジュゲーションさせた。続いて、これをガラス、ＰＣＬ、Ｔｉ、Ｃｏｌ、Ｚｒ、ビニール、ＰＳファイバーに処理した後（ＰＢＳ中各１０μＭ、常温で２０分吸着後ＰＢＳで１回洗浄）、接着の有無はＬＡＳ（Ｆｕｊｉ、日本）を利用したＦＩＴＣ蛍光イメージ測定を介して検出した。ペプチドに共有結合されたビオチンを遊離させるために、ＤＴＴ（ＰＢＳ中１００ｍＭ、常温で２０分処理後１回洗浄）で処理して還元反応を誘導した。対照群では染料だけを使用した。

【0096】

結果は、図１Ａ乃至図１Ｄに記載されていて、抗体の検出は、本願に係るビオチンは本願に係るペプチドを介して実験に使用された表面に強く接着されて、特にこのような効果は、ＤＴＴ処理によって消え（図１Ａ）、これはビオチンまたはＦＩＴＣが本願ペプチドを介してガラスに接着されることを示す。

【0097】

＜実施例３．本願に係る接着性ペプチドの種々の非生体及び生体由来物質に対する接着性分析＞

【0098】

実施例２と基本的に同じ実験を行って、ガラスの代わりに骨移植材で広く使用されるＢｉｏ−ＯＳＳ(登録商標)(Geistlich Pharma,Inc)及びＭＢＣＰ(Biomatlante)を使用した。処理条件は次のとおりである：Ｂｉｏ−Ｏｓｓ粒子を１０μＭ濃度のペプチド−ＦＩＴＣコンジュゲートに添加して常温で１０分間反応させて、続いて０．０５％ ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液で４８時間５回洗浄処理後、共焦点顕微鏡で分析した。(Zeiss LSM-700model with Zen 2011 software,x20)。

【0099】

またインビボ上でペプチドの接着能を検証するために、様々な組織に注入後、組織の薄切片を得て分析した。ペプチドの接着を確認するために、ＰＢＳ、Ｃｙｓ−またはＦＩＴＣ−コンジュゲートＡ７−１、またはＣｙｓまたはＦＩＴＣ染料を１０μＭ濃度でＰＢＳに溶かした後、１０〜２０μｌの水溶液を局部に塗ったり注射器で注入した。組織内接着誘導時間は２時間に固定して実験を行って、犠牲してから、組織摘出後、ＰＢＳで３０分ずつ３回洗浄後、組織の薄切片を作って共焦点顕微鏡で分析した。実験を行った組織は、マウスの軟骨、皮膚、ヘアー、皮下脂肪及び眼球を中心に行っって、軟骨の場合、コラーゲナーゼを部分的に処理してエラスティックファイバー構造を露出させた後、強い洗浄後分析した。

【0100】

結果は、図２Ａ乃至図２Ｍに記載されていて、本願に係るペプチドが非生体及び生体由来の様々な物質に接着される可能性があることを示す。本願に係るペプチドの商用化骨移植材への優秀な接着性を示して、特に、プロテオグリカン成分が多量含まれている組織、例えば弾性組織、結合組織そしてコラーゲンまたはヒアルロナン(hyaluronan)を多量含有する組織、そしてイースト、バクテリア細胞壁などに接着親和性があることを示す。

【0101】

また、本願のペプチドは、プロテオグリカンの主成分であるヘパラン硫酸(heparan sulfate)、ヘパリン(heparin)、コンドロイチン硫酸(chondroitin sulfate)等のＧＡＧ(glycoaminoglycan)を多量含有する軟骨組織（＊）で優秀な接着性を示して、後述する図４Ｂの実験結果と一致する。参考としてＧＡＧは、４種類の物質、すなわちヒアルロン酸(hyaluronic acid)、デルマタン硫酸(dermatan sulfate)、コンドロイチン硫酸(chondroitin sulfate)、ヘパリン及びヘパラン硫酸(heparin、heparan sulfates)、そしてケラチン硫酸(keratan sulfate)を含む。これらはいずれも事実上アミン基が結合したグルコースまたはガラクトースであるＮ−アセチルグルコサミン(N-acetylglucosamine)またはＮ−アセチルガラクトサミン(N-acetylgalactosamine)等で構成されるが、これは本願に係るペプチドがこのような六炭糖に高い親和性を有することを示して、これは本願発明に係るペプチドの標的特異的に作用可能であることを示す。

【0102】

＜実施例４．接着性ペプチドを利用した細胞接着性向上効果＞

【0103】

本実験に使用された材料は次のとおりである：ＰＢＳ中の１０ｍＭのペプチド溶液（保存溶液、Stock solution）；３５ｍｍ径のプラスチック疏水性細胞培養皿（細胞培養用、Corning）；ＤＭＥＭ(Dulbecco Modified Eagle Medium、細胞培養培地：Ｈｙｃｌｏｎｅ）；ウシ胎児血清(fetal bovineserum,Hyclone)；及びＣ２Ｃ１２（mouse myoblast、細胞、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７７２）；ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（Mouse Ｃ５７ＢＬ／６ calvariacell，ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２５９３）及びＳＴ２（bone marrow-derived stromacell：ＥＭＢＯ Ｊ．７：１３３７−１３４３，１９８３）；ＳＴＯ（feeder細胞：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５０３）、ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５７３）、ＳａＯＳ２（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−８５）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−２）、ＲＯＳ１７／２．８、ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６５８）、ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−７１）、ｈＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ，ＰＴ−２５０１）、ｈＰＤＬ（ＨＰＬＦ）（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ，Ｃａｔ．#２６３０）、ｈＤＰＳＣ（Cells Tissues Organs 184:105-16方法に基づいて人体組織から分離）、ｍＢＭＳＣ(Primary Bone Marrow Stromal Cell from mouse)、ＭＣ(PrimaryMouse Calvaria cell)、ＭＥＦ(Mouse EmbryonicFibroblast)

【0104】

実験方法は次のとおりである。
細胞接着には、ペプチドを予めコートする方法とコートせず細胞培養液に直接添加して培養する二種類の方法で観察し、一致する結果を示した。コート方法を取る場合、ＰＢＳまたは、ウシ胎児血清を含まない細胞培養培地に一定濃度のペプチドを添加して、常温、３０分間コートした後、溶液を除去した後、細胞を添加して多様な時間にかけて接着を測定した。また、培養培地にペプチドを添加する場合、細胞を懸濁する時、一定水準のペプチドを共に添加してよく懸濁した後培養皿に移した。細胞接着測定は次の通りに行われた。細胞接着は、ペプチドを添加しなかった場合を陰性対照群に、ＰＢＳそしてｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎをコートした場合を陽性対照群にして光学顕微鏡を介して通常の観察、アクチンフィラメント構造及び粗い細胞膜境界形態観察のために、Ｆ−ａｃｔｉｎ染色及び共焦点顕微鏡分析、そして接着に対する定量化のために細胞の消費量またはＤＮＡ量を測定した。消費量は、ＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を利用して、吸光度を測定して、ＤＮＡ量は、ピコグリーン定量キット(Picogreenassay kit(Life Technologies))を製造者の方法のとおり利用して蛍光値を測定した。接着された細胞だけを定量化するために、接着されなかった細胞は捨ててＰＢＳでさらに２回洗浄して表面に付いている細胞だけを消費量またはＤＮＡを定量に使用した。

【0105】

結果は、図３Ａ乃至３Ｆに記載されている。これに示されたように、本願に係るペプチドは、種々の由来の付着依存的細胞の接着、例えば、一次細胞、確立された細胞及び解凍された細胞、フィーダ細胞の接着に有用に使用され、既に使用された物質であるＰＬＬと比較して段違いにて優秀な効果を示した。

【0106】

＜実施例５．接着性ペプチドの接着機序究明＞

【0107】

本実施例では本願に係るペプチド接着能機序を究明しよう下記のとおり実験を行った。

【0108】

（１）タンパク質関与の有無
まず、タンパク質合成を阻害すると知られているＥＤＴＡ、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（１０μＭ、３７℃１時間）またはＧＡＧで細胞を処理した後上述したような接着能を実験した。

【0109】

結果は、図４Ａに示されたとおり、ＥＤＴＡまたはＣＨＸを処理した場合にも接着能に差がないことが明らかになった。すなわち、Ａ７−１による細胞接着が細胞表面の電解質（ＥＤＴＡ処理結果）でも新しいタンパク質合成（ＣＨＸ処理結果）を必要としない反面、血清によっては初期に阻害が起きることを示す結果で、これは血清内存在する多くの種類のＧＡＧがペプチドに一次的に結合したのが原因と判断される。血清内存在するＧＡＧの濃度変化は、様々な疾患の発生と関連性があると報告された(Volpi N.etal.,Biochim Biophys Acta.(1995)Vol.18:49-58; Komosinska-Vassev K.et al.,ClinChim Acta.(2003)Vol.331:97-102; Anttonen A.et al.,LungCancer.(2003)Vol.41:171-7; Fuster M.M.et al.,Nat RevCancer.(2005) Vol.5:526-42; Hong Lu etal.,2010.Glycobiol.Insights Vol.2:13-28; Anower-E-KhudaM.F.et al.,Glycobiology.(2013)Vol.23:865-76; IbrahimS.A.et al.,J.of Medical Lab.& Diagnosis(2013)Vol.4:8-20)。従って、本願に係るペプチドは新規な、ＧＡＧ結合性／付着性があるペプチドとして血液内ＧＡＧ濃度を調節する新しいペプチドまたはＧＡＧを標的化する伝達体として有用に使用できる可能性があることを示す。また、本願に係るペプチドは、細胞膜タンパク質との相互作用を介して接着能を増加させるのではないことを示している。

【0110】

（２）非タンパク質性物質関与の有無
次は、非タンパク質物質の関与の有無を調べて、その対象に細胞表面の細胞外メトリックス（Extracellualrmatrix，ＥＣＭ）に多量含まれているプロテオグリカンとの関連性を分析した。

【0111】

−プロテオグリカンに対するペプチドの分子親和力−
プロテオグリカンを構成する主な成分であるヘパラン硫酸(heparan sulfate)、ヘパリン(heparin)、コンドロイチン硫酸(chondroitin sulfate)、デルマタン硫酸(dermatansulfate)、ケラタン硫酸(keratan sulafate)等のグリコアミノグリカン(glycoaminoglycan)（ＧＡＧ）は、ＥＣＭを構成する主な成分でもあるが、ＥＣＭ構造の保存性(structuralintegrity of ECM)を維持して細胞の形態を維持すると共に、細胞の接着、細胞の極性(cellpolarity)を調節する。ＥＣＭが有するこのような機能は、環境に対する細胞の適応を誘導すると共に複雑な一連の代謝過程と直接的に関連していて、様々な生理学的役割を調節する複合的機能を有する。プロテオグリカンに対する本願ペプチドの分子親和力は、（ｉ）アフィニティークロマトグラフィー、（ｉｉ）精製されたＧＡＧ成分を利用した競争的結合を介した細胞接着調査、（ｉｉｉ）ＧＡＧ成分を含むＥＣＭを特異的に分解する酵素を処理してペプチドによる細胞接着促進の抑制調査、以上の三つの方法を介して検証した。酵素処理の場合、ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase(Sigma))、コラゲナーゼ(collagenase(Sigma))を処理した。精製されたＧＡＧは、hyaluronan(Sigma)、コンドロイチン硫酸(chondroitinsulfate(Sigma))、ヘパリン(heparin(Sigma))、ヘパラン硫酸(heparan sulfate(Sigma))を各々使用した。

【0112】

（ｉ）アフィニティークロマトグラフィーを利用したペプチド−ヘパリンまたはペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）との相互作用測定

【0113】

クロマトグラフィーのために、ヘパリン−アガロースビーズ(heparin-agarosebead(Biovision))そしてＧｌｃＮＡｃ−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を各々使用した。ＰＢＳ−Ｔ溶液に１０ｎｇのＦＩＴＣで標識されたペプチド（Ｆ−ペプチド）をＢＳＡで予めコートされたヘパリン−アガロースビーズそしてＧｌｃＮＡｃ−アガロースビーズと常温で１０分間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄後、再びＰＢＳ溶液に懸濁した後、蛍光を測定した。競争的結合を誘導するために、ＦＩＴＣが標識されないペプチド（Ｃｏｌｄ）を各々１：１、１：１０（１０倍）そして１：１００（１００倍）だけ添加した後、ビーズと反応させた後、蛍光を測定した。陰性対照群としてＦＩＴＣ染料だけを各ビーズに反応させて測定して、ビーズをＰＢＳに懸濁した後、マイクロプレートに移して測定される蛍光値をブランクとして使用した。図４Ｂに示された結果は、ヘパリンまたはＧＡＧの構成成分であるＧｌｃＮＡｃにペプチドが高い親和力を有していることを示す。

【0114】

（ｉｉ）精製されたＧＡＧ成分を利用した競争的結合を介した細胞接着能調査

【0115】

図４Ｂの結果は、競争的方式によるＧＡＧ処理した本願のペプチドの接着能阻害を示して、本願に係るペプチドの接着能は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、そしてコンドロイチン硫酸の添加により阻害された。

【0116】

（ｉｉｉ）ＧＡＧ成分を含むＥＣＭを特異的に分解する酵素を処理してペプチドによる細胞接着促進の抑制：ＥＣＭを構成するプロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）だけでなくコラーゲンなどのフィブリルタンパク質はＧＡＧを含む。ＧＡＧを含むコラーゲンを加水分解したりＧＡＧの一つであるヒアルロナンを加水分解するヒアルロニダーゼを処理してペプチドによる細胞接着促進能を調べた結果、いずれも細胞接着能力が阻害されることが明らかになった。これもペプチドによる細胞接着促進がＧＡＧとの相互関連があることを示す証拠である。

【0117】

実験方法は次のとおりである：（ｉ）精製されたＧＡＧ成分処理による競争的抑制は、トリプシンで処理された細胞懸濁液に各ＧＡＧを５ｍｇ／ｍｌになるよう添加して３７℃で１０分間反応後、ペプチドがコートされた培養皿に移してから３０分後接着された細胞に対するＤＮＡを定量化して接着程度を測定した。ＤＮＡ定量は、ピコグリーン定量キット(picogreenassay kit(Life Technologies))を利用して行った；（ｉｉ）コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ処理による細胞接着調査は、トリプシンで処理された細胞をウシ胎児血清を含まない培地に懸濁させてから各酵素を添加後３７℃で３０分間反応した。酵素は１００００ｕｎｉｔ／１０^３ｃｅｌｌ水準で処理して、酵素反応後ＥＤＴＡ及びウシ胎児血清を添加して酵素の活性を不活性化させたてから遠心分離後、新しい培地に懸濁した後、ペプチドがコートされた培養皿で２時間培養した。接着された細胞の測定は、ピコグリーン定量(picogreenassay)を行う前ＰＢＳで２回洗浄後、接着された細胞だけ回収してＤＮＡを定量化した。

【0118】

結果は、図４Ｂに記載されている。結果は、本願のペプチドがプロテオグリカンに対して高い親和力があることを示す結果で、軟骨を形成する組織構成成分は、組織再生分野で応用価値が非常に広くて成形を含む様々な臨床施術に直接的に活用される物質に対する接着能を示すものである。従って、これは本願のペプチドが軟骨を含むプロテオグリカン層との優秀な結合能は、軟骨再生、薬物伝達などに広く活用できる潜在的物質であることを示す。
（３）ＲＧＤと比較

【0119】

付着依存的細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）にＡ７−１ペプチド（１０μＭ）または、これと共に溶解性ＲＧＤｓペプチド（０、１０、１００及び１０００μＭ）を試験チューブで細胞と共に１０分間反応して競争的に処理してから培養皿に移した後、再び１０分間恒温器で接着を誘導した。１０分後再び培養液を除去してＰＢＳ溶液で２回洗浄して残っている未接着状態の細胞を除去して、ペプチドを含まない新しい培地とＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を混合して恒温器で１時間反応後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＣＣＫ−８と混合された培地をブランクにして吸光度を測定した。

【0120】

結果は、図４Ｃに記載されている。これに示されたとおり、ＲＧＤＳペプチドを単独で処理した場合、濃度依存的に接着が減少することが明らかになった。一方、Ａ７−１とＲＧＤペプチドを競争的に処理した場合、Ａ７−１非処理群では水溶性ＲＧＤを処理する場合インテグリンに結合して底に（基質に）対する接着能を有意に減少させるが、Ａ７−１処理群ではＲＧＤを処理するにもかかわらず細胞の接着に全く影響を及ぼさないことが示され、これはＡ７−１は、ＲＧＤが作用するインテグリンを介した付着依存的細胞接着とは別の細胞接着促進機序を有することを示す。

【0121】

このような結果は、ＲＧＤｓペプチドを利用した細胞接着または組織再生技術がすでに良好に確立されているが、これとは異なる機序で、技術的差別性があることを示して、またＲＧＤｓを利用した商用化技術は、効率性が良くないと知られていて、これに代わることができる優秀な技術であることを示す。

【0122】

＜実施例６．接着性ペプチドを利用した胚芽幹細胞接着性向上効果＞

【0123】

ペプチドを１００μＭ水準で培養材質にコートしたりナノ構造を製作してマウス人工多能性幹細胞とヒト胚芽幹細胞接着及び全分化能を下記のとおり調べた。

【0124】

ヒト胚芽幹細胞の場合、ｈＥＳＣ−ｍｅｄｉａ（当該分野で一般的に使用される培養液組成）、ｍＴｅＳＲ（ｈＥＳ専用培地、Stem cell technology社から購入）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（ｈＥＳ専用培地、Gibco BRL社から購入）、そして各々に対して１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦだけを添加した血清排除培養液（血清によって細胞の接着能力が抑制される現象を防止するための培養液条件）条件で培養して従来の様々な培養技法に対して相互互換性があるか否かを共に分析した。また、細胞の場合、コロニー状態の培養技法と０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを処理して単一細胞を利用した培養技法で分析した。フィーダ−フリー（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ）に対するＥＳＣまたはｉＰＳＣ培養効果を検証するために、フィーダ−フリー（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ）条件でＥＳＣまたはｉＰＳＣ培養効果を検証するために、比較のための陽性対照群としてマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ｈＥＳＣ））及びゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ（mｉＰＳＣ））が使用された。陽性対照群としての支持細胞(Feeder cell)での培養も行った。

【0125】

該当細胞を図５Ａに記載された胚芽幹細胞の全分化能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の指標でＯｃｔ４遺伝子の活性を測定できる構造を有するプラスミド(Szabo et al.,2002,Mechanismsof Development Vol.115:157-160)を利用して蛍光顕微鏡で分析した（図５）。また、全分化能を示す他のマーカーであるＡｌｐ及びＮａｎｏｇ遺伝子に対する発現を、これに特異的な抗体を使用して染色して蛍光顕微鏡で観察して、ｈＥＳ細胞培養で細胞の接着性向上の有無も調べた（図６）。

【0126】

結果は、図５及び６に記載されている。図５に記載された通り、本願のペプチドは、予めコート(precoated)されるが、または培養液に混合(Mixed)された方式で追加された、二つの場合共にｉＰＳＣの接着を媒介して全分化能も維持させることが明らかになった（図５Ｂ）。さらに、細胞培養４日目の場合も本願に係るペプチドは、ｉＰＳＣの接着を媒介して全分化能も維持させることが明らかになった（図５Ｃ）。また、図６Ａ及び図６Ｂに記載された通り、本願に係るペプチドは、予めコートまたは培養液混合される場合共に、ｉＰＳＣの接着を媒介して全分化能も維持させることが示されて、ｈＥＳＣを利用した実験でもフィーダ細胞またはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）等の外部環境的変化なくても細胞の接着を媒介して全分化能も維持させることが示された（図６Ｃ）。

【0127】

＜実施例７．接着性ペプチドとタンパク質のバイオコンジュゲーション＞

【0128】

本実験に使用された材料は下記のとおりである。

【0129】

実施例１で合成されたペプチドは、１０μＭ（ＰＢＳ中）濃度で使用；１．９ｃｍ^２面積のプラスチック細胞培養皿（24-well plate、Corning社製品）；ＤＳＳ（Disuccinimidyl suberate，Ｃ_１６Ｈ_２０Ｎ_２Ｏ_８，Thermo Scientific Inc.）；組換えヒトＢＭＰ２（ｒｈＢＭＰ２，BDbioscience）；ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide、ＤＳＳを溶かす溶媒、Sigma-Aldrich社）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０(Stopsolution)；ＰＢＳ(phosphate buffered saline,reactionsolution)。

【0130】

分析概念は、図式的に図７Ａに図示されている。図７Ａを参照すると、架橋剤を使用して本願のペプチドに目的する生活性を有する様々な物質、例えばＢＭＰのような治療用タンパク質を連結して使用すると、本願ペプチドの接着性により、処理した部位に治療用タンパク質の濃度を高めることができて、治療効果を最大化することができる。

【0131】

実験方法は次のとおりである。ペプチド−ｒｈＢＭＰ２共有結合（Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）反応は、基本的に使用された架橋連結子（Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）製造社の方法に従って行われ、要約するとその過程は次のとおりである：（ｉ）ペプチドコート：細胞培養皿に２００μｌのペプチド溶液（ＰＢＳ溶液中の１０μＭの前記実施例１のペプチド）を分注して４℃で１８時間吸着させた；（ｉｉ）ＤＳＳ−ＢＭＰ２複合体形成：ｒｈＢＭＰ２に対して２０ｍｏｌａｒ過量のＤＳＳを１００μｌの反応溶液で１時間共有結合を誘導した。１．９ｃｍ^２面積当たりｒｈＢＭＰ２は３００ｎｇ水準になるべく調整して、この時対照群で各々ＤＳＳ、ｒｈＢＭＰ２、ＤＳＳ−ｒｈＢＭＰ２をコートして使用したところ、この場合いずれも培養皿表面材質に吸着力がないため、洗浄過程で相当量消失することを観察し、従ってこの場合陰性対照群として使用された；（ｉｉｉ）ペプチド−ＤＳＳ−ＢＭＰ２複合体形成：１００μｌのＤＳＳ−ＢＭＰ２複合体を予めペプチドでコートされた皿に注意して添加した後（ｏｖｅｒｌａｙ）、４℃で２４時間反応；（ｉｖ）反応停止：１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液を２００μｌ添加して常温で１５分放置することによって共有結合後残存するＤＳＳを全て中和させた；（ｖ）洗浄：ＰＢＳ溶液で１０回洗浄後、細胞添加前までウシ胎児血清が含まれないＤＭＥＭ培地を添加した後３７℃に予め放置した；（ｖｉ）Ｃ２Ｃ１２懸濁液準備及び造骨細胞分化：４ｘ１０^５個のＣ２Ｃ１２細胞を３００μｌの２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁した後、細胞を準備した。ペプチド−ＤＳＳ−ＢＭＰ２複合体がコートされた皿に予め含まれていたＤＭＥＭは除去して、３００μｌの細胞培養液を添加して、５％ＣＯ_２／３７℃条件の培養器で４８時間細胞の分化を誘導した；（ｖｉｉ）細胞分化測定：Ｃ２Ｃ１２細胞の造骨細胞への分化能はアルカリホスファターゼ(Alkaline phosphotase)の活性を細胞染色法で測定した。

【0132】

結果は図７Ｂに記載されている。これに示された通り、組換えＢＭＰ処理群（ｒｈＢＭＰ２）または架橋剤処理群（ＣＬ）と比較してＡｌｐ活性が増加して、これは本願のペプチド処理によって骨分化が促進されたことを示す。

【0133】

＜実施例８．本願に係るペプチドの安全性分析＞

【0134】

本願に係るペプチドの安全性を造骨細胞（ＭＣ３ＴＣ−Ｅ１）を利用してテストした。実施例１で合成した本願に係るペプチドＡ７−１を造骨細胞に０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ及び１００μＭの濃度で処理した後、増殖（図８Ａ）、生存（図８Ｂ）及び分化能（図８Ｃ）に及ぼす影響を測定したもので、分化能の場合、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株またはＣ２Ｃ１２細胞株を使用して、前記細胞株を骨形成分化培地（６日間処理）とＢＭＰ２（ｒｈＢＭＰ２、１０ｎｇ／ｍｌ、３日間処理）で刺激を与えて分化を誘導して、分化効果は、細胞染色を介して行われた。結果は図８Ａ乃至８Ｃにあり、濃度に応じた増殖率、生存率、分化の可否に影響を及ぼさないことが明らかになった。

【0135】

また、本願に係るペプチドの安全性をマウスの単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）を利用してテストした。マウスの骨髄から分離した単核球に本願に係るペプチドで処理してから加えた後、炎症誘導が発生するか否かを調べた。陽性対照群でＬＰＳを処理して、２４時間後炎症誘発因子マーカーであるＩＬ−１β(interleukin-1β)、Ｔｎｆ−α(Tumor necrosis factor-α)、ｉＮｏｓ(Induciblenitric oxide synthase)、Ｃｏｘ−２(cyclooxygenase-2)を各々リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ方法を使用して測定した。その結果、本願に係るペプチドは炎症を誘発しないことを確認した。結果は図８Ｄにあり、本願に係るペプチドは炎症を誘発しないので、生体内使用が安全した物質と判断された。

【0136】

＜実施例９．接着性ペプチドを利用した一次神経細胞接着能向上及び培養＞

【0137】

本実施例では、神経細胞接着及び培養に及ぼす影響を既存の接着性ペプチドと効果を比較した。ペプチドを１００μＭ水準で培養材質にコートしたりナノ構造を製作してマウス胚芽脳組織とラットの脊髄から神経由来細胞を得て接着された細胞を光学顕微鏡で分析してＣＣＫ−８を介した代謝を測定して分析した。この時、陽性対照群としてLamininとpoly-L-ornithin(Sigma)を混用して製造者の濃度及び方法の通りコートして使用して、細胞接着を定量化するために（各時間に対して）接着しなかった細胞は、ＰＢＳで洗浄して除去して、培養培地と細胞の代謝を測定するＣＣＫ−８溶液(Dojindo)を混合して添加した後、１時間培養後４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0138】

結果は図９に記載されている。図９Ａは、脊髄由来の神経細胞を既存のペプチドでラミニン(laminin)とポリ−Ｌ−オルニチン(poly-L-ornithin)とでコートされた培養皿及び本願の一実施形態に係るＡ７−１でコートされた培養皿を使用して培養した後、各時間帯別にＣＣＫ−８を分析した結果であり、Ａ７−１がコート（吸着）された条件で接着能が大幅の差を示した。図９Ｂは、培養４日後光学顕微鏡を介して比較観察した結果であり、同じ量の細胞を使用したが、接着の程度はＡ７−１で最も優れている。図９Ｃは、本願の一実施形態に係るＡ７−１でコートされた皿で培養された一次培養細胞が神経由来細胞であることを神経細胞に特異的マーカーを利用して検証した結果で、神経標識タンパク質（ＧＦＡＰ、ＭＡＰ２及びＮｅｓｔｉｎ）を免疫蛍光法で染色した後、共焦点顕微鏡を介して分析した結果である。前記結果は、本願に係るペプチドが既存のものと比較して格段に優秀な接着能を有することを示す。

【0139】

＜実施例１０．ヒトＭＳＣ(MesenchymalStem Cell)の接着能向上効果＞

【0140】

Ａ７−１ペプチドを１００μＭ水準でガラス材質の滅菌されたカバースリップ(coverslip)コートした後、ＭＳＣ細胞(MesenchymalStem cell)を６時間培養した後、細胞の接着進行過程(adhesion progression)をアクチン繊維に対する蛍光染色試薬であるローダミンファロイジン(RhodaminePhalloidin)染色剤(Life TechnologyCat.#R415)と細胞の核（ＤＮＡ）を染色するＤＡＰＩ(Sigma D9542)染色剤を各々使用して細胞を染色した後、共焦点顕微鏡で分析した。この時、陰性対照群でＡ７−１ペプチドをコートしなかったカバースリップ(coverslip)に細胞を接着して比較した。結果は、図１０に記載されている。図１０Ａで陰性対照群は、依然として接着初期段階であるアクチンリング(actin-ring)形成が多数をなしているが、Ａ７−１処理群の場合、既にその段階をすぎてストレスファイバー形成が多数の細胞で観察され、図１０Ｂは、このような観察結果を定量したグラフであり、図１０Ｃは、細胞接着に係る幾何学的様態(geometric shape)（cellaspect ratio：細胞の横／縦の比、１の場合完全な原形であり接着過程の最も初期状態で示す。Prager-Khoutorskyet al.,2011.Nature Cell Biology 13,1457-1465参考）を測定して示した結果であり、Ａ７−１の処理群で格段に成熟した接着能を示す。

【0141】

＜実施例１１．様々な配列のペプチドを利用した接着能実験＞

【0142】

下記表１のような配列及び名称を有するペプチドを実施例１で共に合成した後、ヘパリンまたはＮ−アセチルグルコサミン（ＧＡＧ）に対する接着能を実施例４に記載された方法と同じ方法を利用して測定した。

【0143】

【表1】

【0144】

結果は、図１１に記載されている。これに示されたように本願のペプチドは、第１領域（化学式）、第２領域（化学式）及び第３領域（化学式）が様々な組み合わせで並べられたり、または各領域の配列が本願に定義されたようなアミノ酸で置き換えられた場合にも効果を示すことが分かる。

【0145】

＜実施例１２．様々な配列のペプチドを利用した接着能実験ＩＩ＞

【0146】

表１にＡ配列と命名されたＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣ（配列番号１７）配列を基準に置き換えられる残基の側鎖の化学的性質、大きさ、電荷的特性及び／または表１の実験結果等を考慮して、次の表２のような配列を生成してその結果を横のカラムに表示した。太字で表示された部分が置き換えられた部分であり、実施例１１のＲＱＬＶＶＫＦＲＡＬＰＣを利用した実験結果と比較して予測される効果の程度を＋の個数で表現した。

【0147】

【表2】

【0148】

前記表２の配列のカラムで太字で表示された部分がＡ配列と比較して置き換えられた部分で、接着能カラムでボールド体で表示されなかった結果は、実施例１２及び図１１の結果を根拠に表示したもので、ボールド体で表示された文字は置き換えられる残基の特徴及び本願に開示された実験結果を根拠に予測された結果である。

【0149】

以上、本願の例示的な実施例に対して詳細に説明したが、本願の権利範囲はこれに限定されず次の請求範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の種々の変形及び改良形態も本願の権利範囲に属する。

【0150】

本発明で使用されるすべての技術用語は、特に定義されない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解できるような意味として使用される。本明細書に参考文献と記載されるすべての刊行物の内容は本発明に導入される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図2M】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]