特許 6857237 ハイブリッドモード刺激を伴う電圧モードを用いたナノポアベースの配列決定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6857237

(24)【登録日】2021年3月23日

(45)【発行日】2021年4月14日

(54)【発明の名称】ハイブリッドモード刺激を伴う電圧モードを用いたナノポアベースの配列決定

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/00 20060101AFI20210405BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20210405BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20210405BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/00 Z

   C12Q1/6869 Z

   C12M1/00 A

【請求項の数】15

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2019-514075(P2019-514075)

(86)(22)【出願日】2017年9月14日

(65)【公表番号】特表2019-530861(P2019-530861A)

(43)【公表日】2019年10月24日

(86)【国際出願番号】EP2017073095

(87)【国際公開番号】WO2018050730

(87)【国際公開日】20180322

【審査請求日】2019年4月19日

(31)【優先権主張番号】62/394,903

(32)【優先日】2016年9月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ロジャー・ジェイ・エイ

(72)【発明者】

【氏名】ティエン，フゥイ

(72)【発明者】

【氏名】メイニー，ジェイ・ウィリアム，ジュニア

【審査官】 村田 顕一郎

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１６／０９９６７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１９−５３１５３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１９−５２６０４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１８−５０１４８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１７／２２０７３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１９−５２７８１９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２７／００−２７／１０

Ｇ０１Ｎ ２７／１４−２７／２４

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

Ｃ１２Ｍ １／００−１／４２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナノポアで分子を分析するための方法であって、
液体電圧を脂質二重層の第１面側の電解質に印加するステップであって、前記液体電圧が、前記分子のタグまたは前記分子の一部を前記脂質二重層内のナノポア内に捕捉する傾向を有するタグ読取り電圧レベルを伴うタグ読取り期間と、前記分子の前記タグまたは前記一部を前記脂質二重層内の前記ナノポアから放出する傾向を有する開放チャネル電圧レベルを伴う開放チャネル期間とを含む、前記ステップ、
予備充電期間中、予備充電電圧源を、積分コンデンサと、前記脂質二重層の第２面側の作用電極とに接続するステップであって、それにより前記積分コンデンサおよび前記作用電極が、予備充電電圧に充電される前記ステップ、ならびに、
積分期間中、前記予備充電電圧源を、前記積分コンデンサおよび前記作用電極から切断するステップであって、それにより前記積分コンデンサの電圧および前記作用電極の電圧は、電流が前記脂質二重層内の前記ナノポアを通って流れるとき変化し得る前記ステップ、
を含み、
前記予備充電期間が、前記タグ読取り期間の開始部分と重複する、
前記方法。

【請求項2】

前記予備充電期間が、前記開放チャネル期間の終了部分と重複する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記予備充電期間が、前記開放チャネル期間から前記タグ読取り期間への遷移全体に及ぶ、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記予備充電期間が、前記開放チャネル期間の開始部分と重複する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記予備充電期間が、前記タグ読取り期間の終了部分と重複する、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記予備充電期間が、前記タグ読取り期間から前記開放チャネル期間への遷移全体に及ぶ、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記予備充電期間が、１００マイクロ秒〜５０ミリ秒の持続時間を有する、請求項３または６に記載の方法。

【請求項8】

前記予備充電期間が、５０マイクロ秒〜２５ミリ秒の持続時間を有する、請求項１、２、４、または５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

分子を分析するためのシステム、機器、またはデバイスであって、
電圧源、
前記電圧源に結合された対電極、
予備充電電圧源、
前記予備充電電圧源と接続するように構成可能である積分コンデンサ、
前記予備充電電圧源と接続するように構成可能である作用電極、および、
コントローラ、
を備え、
前記コントローラは、液体電圧を、前記対電極を介して、脂質二重層の第１面側の電解質に印加するために前記電圧源を制御するように構成され、前記液体電圧が、前記分子のタグまたは前記分子の一部を前記脂質二重層内のナノポア内に捕捉する傾向を有するタグ読取り電圧レベルを伴うタグ読取り期間と、前記分子の前記タグまたは前記一部を前記脂質二重層内の前記ナノポアから放出する傾向を有する開放チャネル電圧レベルを伴う開放チャネル期間とを含み、
前記コントローラは、予備充電期間中、予備充電電圧源を、前記積分コンデンサと、前記脂質二重層の第２の側面上の前記作用電極とに接続し、その結果前記積分コンデンサおよび前記作用電極が、予備充電電圧に充電されるように構成され、
前記コントローラは、積分期間中、前記予備充電電圧源を、前記積分コンデンサおよび前記作用電極から切断し、その結果前記積分コンデンサの電圧および前記作用電極の電圧は、電流が前記脂質二重層内の前記ナノポアを通って流れるとき変化し得るように構成され、
前記予備充電期間が、前記タグ読取り期間の開始部分と重複し、
さらに、前記コントローラに結合され、前記コントローラに命令を供給するように構成されたメモリを備える、
前記システム、機器、またはデバイス。

【請求項10】

前記予備充電期間が、前記開放チャネル期間の終了部分と重複する、請求項９に記載のシステム、機器、またはデバイス。

【請求項11】

前記予備充電期間が、前記開放チャネル期間から前記タグ読取り期間への遷移全体に及ぶ、請求項９に記載のシステム、機器、またはデバイス。

【請求項12】

前記予備充電期間が、前記開放チャネル期間の開始部分と重複する、請求項９に記載のシステム、機器、またはデバイス。

【請求項13】

前記予備充電期間が、前記タグ読取り期間の終了部分と重複する、請求項９に記載のシステム、機器、またはデバイス。

【請求項14】

前記予備充電期間が、前記タグ読取り期間から前記開放チャネル期間への遷移全体に及ぶ、請求項９に記載のシステム、機器、またはデバイス。

【請求項15】

前記予備充電期間が、１００マイクロ秒〜２５ミリ秒の持続時間を有する、請求項９〜１４のいずれかに記載のシステム、機器、またはデバイス。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

[0001]近年の半導体産業における超小型化の進歩によって、生物工学者は、従来の大きな検出ツールをますます小さいフォームファクタに、いわゆるバイオチップ上にパッケージングすることを始められるようになった。バイオチップをより頑丈に、効率的にかつ費用効果的にするバイオチップの技術を開発することが、望ましいであろう。

【発明の概要】

【0002】

[0002]本発明の各種実施形態は、以下の詳細な説明および添付の図面において開示される。

【図面の簡単な説明】

【0003】

【図1】[0003]ナノポアベースの配列決定チップ内のセル１００の一実施形態を示す図である。

【図2】[0004]ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するセル２００の一実施形態を示す図である。

【図3】[0005]予め装填されたタグを用いたヌクレオチド配列決定を実行しようとしているセルの一実施形態を示す図である。

【図4】[0006]予め装填されたタグを用いた核酸配列決定のためのプロセス４００の一実施形態を示す図である。

【図5】[0007]ナノポアベースの配列決定チップ内のセル５００の一実施形態を示す図である。

【図6】[0008]ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００の一実施形態を示す図である。

【図7A】[0009]ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路７００の実施形態を示す図であり、ナノポア全体に印加される電圧は、ナノポアが特定の検出可能な状態にある期間にわたり変化するように構成可能である。

【図7B】[0010]ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路７００の追加の実施形態を示す図であり、ナノポア全体に印加される電圧は、ナノポアが特定の検出可能な状態にある期間にわたり変化するように構成可能である。

【図8】[0011]膜内に挿入されているナノポア内の分子を分析するプロセス８００の一実施形態を示す図である。

【図9】[0012]プロセス８００が実行され、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間内で３回繰り返される時間に対する、積分コンデンサ（Ｖ_ｎｃａｐ）における電圧のプロットの一実施形態を示す図である。

【図10】[0013]ナノポアが異なる状態にある時間に対する、積分コンデンサにおける電圧のプロットの一実施形態を示す図である。

【図11】[0014]ナノポアベースの配列決定チップのセルにおける複数の信号の時間信号プロットの一実施形態を示す図である。

【図12】[0015]電圧源をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜に接続し、または膜から切断する、スイッチの制御に用いられるリセット信号の別の実施形態を示す図である。

【図13】[0016]電圧源をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜に接続し、または膜から切断する、スイッチの制御に用いられるリセット信号の別の実施形態を示す図である。

【図14】[0017]電圧源をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜に接続し、または膜から切断する、スイッチの制御に用いられるリセット信号のさらに別の実施形態を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0004】

[0018]本発明は、多数の方法で実装可能であり、多数の方法は、プロセス、装置、システム、組成物、コンピュータ可読記憶媒体上で具現化されるコンピュータプログラム製品、および／または、プロセッサ、例えばプロセッサに結合されたメモリに記憶されるおよび／またはメモリによって提供される命令を実行するように構成されたプロセッサを含む。この明細書では、これらの実施態様または本発明がとり得る他の任意の形は、技術と称されることがある。一般に、開示されたプロセスのステップの順序は、本発明の範囲内で変更されてもよい。別途記載されていない限り、タスクを実行するように構成されたものとして記載されるプロセッサまたはメモリのような構成要素は、そのタスクを所定の時間に実行するように一時的に構成される一般的な構成要素またはそのタスクを実行するために製造された特定の構成要素として実施されてもよい。本明細書において、「プロセッサ」という用語は、データ、例えばコンピュータプログラム命令を処理するように構成された１つまたは複数の装置、回路および／または処理コアを意味する。

【0005】

[0019]以下、本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細な説明が、本発明の原理を示す添付の図面とともに提供される。本発明は、この種の実施形態に関連して記載されているが、本発明は、任意の実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定され、本発明は、多数の代替物、変更物および均等物を包含する。多数の具体的な詳細は、以下の説明に記載され、本発明の完全な理解を提供する。これらの詳細は、例のために提供され、本発明は、これらの具体的な詳細の一部または全部を用いずに特許請求の範囲に従って実施され得る。明確性のために、本発明に関連する技術分野において公知である技術的な材料は、本発明が不必要に不明瞭にならないように詳述されていない。

【0006】

[0020]内径が１ナノメートル程度のポアサイズを有するナノポア膜装置は、迅速なヌクレオチド配列決定において見込みを示してきた。電位が導電性流体に浸漬されたナノポア全体に印加されたとき、ナノポアを通過するイオンの伝導に起因するわずかなイオン電流が観察可能である。電流の量は、ポアサイズに影響される。

【0007】

[0021]ナノポアベースの配列決定チップは、核酸（例えば、ＤＮＡ）配列決定のために用いられてもよい。ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成される多数のセンサセルを組み込む。例えば、１００万個のセルのアレイは、１０００行×１０００列のセルを含み得る。

【0008】

[0022]図１はナノポアベースの配列決定チップ内のセル１００の一実施形態を示す図である。膜１０２は、セルの表面にわたって形成される。いくつかの実施形態では、膜１０２は、脂質二重層である。可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含むバルク電解質１１４は、セルの表面上に直接配置される。ある実施形態では、単一のＰＮＴＭＣ１０４は、電気穿孔法によって膜１０２内に挿入される。アレイ内の個々の膜は、化学的にも電気的にも互いに接続されていない。それゆえ、アレイ内の各セルは、独立した配列決定機械であり、ＰＮＴＭＣと結合した単一のポリマー分子に固有のデータを生成する。ＰＮＴＭＣ１０４は、分析物上で作用し、そうでなければ不透過性の二重層を介してイオン電流を調節する。

【0009】

[0023]図１を続けて参照すると、アナログ測定回路１１２は、電解質の体積１０８によって覆われた金属電極１１０に接続されている。電解質の体積１０８は、イオン不浸透性膜１０２によって、バルク電解質１１４から分離される。ＰＮＴＭＣ１０４は、膜１０２を横切り、イオン電流がバルク液体から作用電極１１０へと流れるための唯一の経路を提供する。セルは、バルク電解質１１４と電気的に接している対電極（ＣＥ）１１６も含む。セルは、参照電極１１７も含み得る。

【0010】

[0024]いくつかの実施形態では、ナノポアアレイは、合成による単分子ナノポアベースの配列決定（ナノ−ＳＢＳ）技術を用いる並行配列決定を可能にする。図２は、ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するセル２００の一実施形態を示す。ナノ−ＳＢＳ技術では、配列決定されるべき鋳型２０２およびプライマーは、セル２００に導入される。この鋳型−プライマー複合体に対して、異なってタグ付けされた４つのヌクレオチド２０８は、バルク水相に添加される。正しくタグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼ２０４と複合体を形成すると、タグの尾部は、ナノポア２０６の筒内に位置決めされる。ナノポア２０６の筒内に保たれるタグは、固有のイオン遮断信号２１０を生成し、それにより、付加された塩基を、タグの異なる化学構造により電子的に同定する。

【0011】

[0025]図３は、予め装填されたタグを用いたヌクレオチド配列決定を実行しようとしているセルの一実施形態を示す。ナノポア３０１は、膜３０２内に形成される。酵素３０３（例えば、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼ）は、ナノポアと結合している。いくつかの場合では、ポリメラーゼ３０３は、ナノポア３０１に共有結合している。ポリメラーゼ３０３は、配列決定されるべき核酸分子３０４と結合している。いくつかの実施形態では、核酸分子３０４は環状である。いくつかの場合では、核酸分子３０４は線状である。いくつかの実施形態では、核酸プライマー３０５は、核酸分子３０４の一部にハイブリダイズしている。ポリメラーゼ３０３は、ヌクレオチド３０６のプライマー３０５上への、一本鎖核酸分子３０４を鋳型として用いる取り込みを触媒する。ヌクレオチド３０６は、タグ種（「タグ」）３０７を備える。

【0012】

[0026]図４は、予め装填されたタグを用いた核酸配列決定のためのプロセス４００の一実施形態を示す。段階Ａは、図３において説明したような構成要素を示す。段階Ｃは、ナノポア内に装填されるタグを示す。「装填された」タグは、認識可能な長さの時間、例えば、０．１ミリ秒（ｍｓ）から１０，０００ｍｓの間、ナノポア内に位置決めされる、および／または、ナノポア内または近くに留まるタグでもよい。いくつかの場合では、予め装填されるタグは、ヌクレオチドから放出される前に、ナノポア内に装填される。いくつかの例では、タグが、ヌクレオチド組み込み事象の際に放出された後にナノポアを通過する（および／またはナノポアにより検出される）確率が適度に高い、例えば９０％から９９％である場合、タグは予め装填される。

【0013】

[0037]段階Ａにおいて、タグ付けされたヌクレオチド（４つの異なるタイプ：Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのうちの１つ）は、ポリメラーゼと結合していない。段階Ｂにおいて、タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼと結合している。段階Ｃにおいて、ポリメラーゼは、ナノポアにドッキングする。タグは、ドッキングの間、電気的な力、例えば、膜および／またはナノポア全体に印加される電圧により生成される電界の存在下で生成される力によってナノポア内に引き込まれる。

【0014】

[0028]結合したタグ付けされたヌクレオチドのいくつかは、核酸分子と塩基対合しない。これらの塩基対合しなかったヌクレオチドは、典型的には、正しく対合したヌクレオチドがポリメラーゼと結合したままである時間スケールより短い時間スケール内で、ポリメラーゼによって拒絶される。対合しなかったヌクレオチドは、一時的にのみポリメラーゼと結合するので、図４に示すプロセス４００は、典型的には、段階Ｄを越えて進行しない。例えば、対合しなかったヌクレオチドは、段階Ｂにおいて、または、プロセスが段階Ｃに入った少し後に、ポリメラーゼによって拒絶される。

【0015】

[0029]ポリメラーゼがナノポアにドッキングする前、ナノポアのコンダクタンスは、約３００ピコジーメンス（３００ｐＳ）である。段階Ｃにおいて、ナノポアのコンダクタンスは、約６０ｐＳ、８０ｐＳ、１００ｐＳまたは１２０ｐＳであり、それぞれは、タグ付けされたヌクレオチドの４つのタイプのうちの１つに対応する。ポリメラーゼは、異性化およびリン酸基転移反応を経て、ヌクレオチドを成長している核酸分子内に組み込み、タグ分子を放出する。特に、タグがナノポア内に保たれるとき、固有のコンダクタンス信号（例えば、図２の信号２１０を参照）は、タグの異なる化学構造により生成され、それにより、付加された塩基を電子的に同定する。サイクル（すなわち、段階ＡからＥまたは段階ＡからＦ）を繰り返すことにより、核酸分子の配列決定が可能になる。段階Ｄにおいて、放出されたタグは、ナノポアを通過する。

【0016】

[0030]いくつかの場合では、図４の段階Ｆに見られるように、成長している核酸分子内に組み込まれていないタグ付けされたヌクレオチドも、ナノポアを通過することになる。組み込まれていないヌクレオチドは、いくつかの例では、ナノポアによって検出され得るが、その方法は、組み込まれたヌクレオチドと組み込まれなかったヌクレオチドとを、ヌクレオチドがナノポア内で検出される時間に少なくとも部分的に基づいて区別するための手段を提供する。組み込まれなかったヌクレオチドに結合したタグは、ナノポアを迅速に通過し、短期間（例えば、１０ｍｓ未満）の間検出され、一方、組み込まれたヌクレオチドに結合したタグは、ナノポア内に装填され、長期間（例えば、少なくとも１０ｍｓ）の間検出される。

【0017】

[0031]図５は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセル５００の一実施形態を示す。セル５００は、２つの側壁および底部を有する凹部５０５を含む。ある実施形態では、各側壁は、誘電体層５０４を備え、底部は、作用電極５０２を備える。ある実施形態では、作用電極５０２は、上面および底面を有する。別の実施形態では、５０２の上面は、凹部５０５の底部を構成し、一方、５０２の底面は、誘電体層５０１と接触している。別の実施形態では、誘電体層５０４は、誘電体層５０１の上にある。誘電体層５０４は、作用電極５０２が底部に配置されている、凹部５０５を囲む側壁を形成する。本発明で使用するのに適した誘電体材料（例えば、誘電体層５０１または５０４）は、それだけには限らないが、磁器（セラミック）、ガラス、マイカ、プラスチック、酸化物、窒化物（例えば、一窒化ケイ素すなわちＳｉＮ）、酸窒化ケイ素、金属酸化物、金属窒化物、金属ケイ酸塩、遷移金属酸化物、遷移金属窒化物、遷移金属ケイ酸塩、金属酸窒化物、金属アルミン酸塩、ジルコニウムケイ酸塩、ジルコニウムアルミン酸塩、ハフニウム酸化物、絶縁材料（例えば、重合体、エポキシ、フォトレジスト、など）、またはそれらの組合せを含む。当業者には、本発明での使用に適切である他の誘電体材料を識別されよう。

【0018】

[0032]ある態様では、セル５００は、１つまたは複数の撥水性層をさらに含む。図５に示すように、各誘電体層５０４は、上面を有する。ある実施形態では、各誘電体層５０４の上面は、撥水性層を備え得る。ある実施形態では、シラン処理は、誘電体層５０４の上面の上に撥水性層５２０を形成する。例えば、（ｉ）６〜２０炭素長の鎖を含む（例えば、オクタデシル−トリクロロシラン、オクタデシル−トリメトキシシラン、またはオクタデシル−トリエトキシシラン）、（ｉｉ）ジメチルオクチルクロロシラン（ＤＭＯＣ）、あるいは（ｉｉｉ）有機官能性アルコキシシラン分子（例えば、ジメチルクロロ−オクトデシル−シラン、メチルジクロロ−オクトデシル−シラン、トリクロロ−オクトデシル−シラン、トリメチル−オクトデシル−シラン、またはトリエチル−オクトデシル−シラン）、を含むシラン分子を有するシラン処理が、誘電体層５０４の上面に施され得る。ある実施形態では、撥水性層は、シラン処理された層またはシラン層である。ある実施形態では、シラン層は、１分子の厚さであり得る。ある態様では、誘電体層５０４は、膜の粘着に適した上面を備える（例えば、ナノポアを備える脂質二重層）。ある実施形態では、膜の粘着に適した上面は、本明細書で説明されるようなシラン分子を含む。いくつかの実施形態では、撥水性層５２０は、ナノメートル（ｎｍ）またはマイクロメートル（μｍ）で提供される厚さを有する。他の実施形態では、撥水性層は、誘電体層５０４の全体または一部に沿って下方に延在し得る（その全体が引用することにより本明細書に組み込まれる、ＤａｖｉｓらのＵ．Ｓ．２０１４００３４４９７も参照）。

【0019】

[0033]別の態様では、凹部５０５（誘電体層壁５０４によって形成される）は、作用電極５０２の上層の塩類溶液５０６の体積をさらに含む。全体に、本発明の方法は、浸透圧調節物質を含む溶液（例えば、塩類溶液、塩類緩衝溶液、電解質、電解液、またはバルク電解質）の使用を含む。本明細書で使用する場合、用語「浸透圧調節物質」は、溶液内に溶かされるとき、その溶液の浸透圧モル濃度を増大させる任意の可溶性化合物を示す。本発明では、浸透圧調節物質は、ナノポア配列決定システムの構造、例えば、本明細書で説明されるような塩類溶液またはバルク電解質を収容する凹部、の内部の溶液内に可溶性を有する化合物である。したがって、本発明の浸透圧調節物質は、浸透性、詳細には脂質二重層を横切る浸透性に影響を及ぼす。本発明で使用される浸透圧調節物質は、それだけには限らないが、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ_２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）などのイオン塩類と、グリセロール、エリトリトール、アラビトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マンニサイドマンニトール、グリコシルグリセロール、ブドウ糖、フルクトース、蔗糖、トレハロース、およびイソフルオロサイドなどの多価アルコールと砂糖と、デキストラン、レバン、およびポリエチレングリコールなどの重合体と、グリシン、アラニン、アルファ−アラニン、アルギニン、プロリン、タウリン、ベタイン、オクトピン、グルタミン酸塩、サルコシン、ｙ−アミノ酪酸、およびトリメチルアミンＮ−オキシド（「ＴＭＡＯ」）などのいくつかのアミノ酸とそれらの派生物とを含み得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＦｉｓｈｅｒらのＵ．Ｓ．２０１１００５３７９５をさらに参照）。ある実施形態では、本発明は、浸透圧調節物質を含む溶液を利用し、浸透圧調節物質は、イオン性塩である。当業者には、本発明での使用に適切な浸透圧調節物質である他の化合物を識別されよう。別の態様では、本発明は、２つ以上の異なる浸透圧調節物質を含む溶液を提供する。

【0020】

[0034]本明細書で説明するナノポアベースの配列決定チップの構造は、１アトリットル〜１ナノリットルの容量を有する凹部（例えば、図５）のアレイを備える。

【0021】

[0035]図５に示すように、膜は、誘電体層５０４の上面に形成され、凹部５０５全体に及ぶ。例えば、膜は、疎水性層５２０の上面に形成された脂質一重層５１８を含む。膜が凹部５０５の開口に達したとき、脂質一重層は、凹部の開口全体に及ぶ脂質二重層５１４に遷移する。脂質一重層５１８はまた、誘電体層５０４の垂直面（すなわち、側壁）の全体または一部に沿って延在してもよい。ある実施形態では、一重層５１８が沿って延在する垂直の表面５０４は、撥水性層を備える。タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含むバルク電解質５０８は、凹部の上に直接配置される。単一のＰＮＴＭＣ／ナノポア５１６は、脂質二重層５１４内に挿入される。ある実施形態では、二重層内への挿入は、電気穿孔法による。ナノポア５１６は、脂質二重層５１４を横切り、バルク電解質５０８から作用電極５０２へのイオン電流のための唯一の経路を提供する。

【0022】

[0036]セル５００は、バルク電解質５０８に電気的に接する対電極（ＣＥ）５１０を含む。セル５００は、参照電極５１２を任意選択で含み得る。いくつかの実施形態では、対電極５１０は、複数のセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称される。共通電極は、共通の電位を、測定セル内のナノポアと接触するバルク液体に印加するように構成可能である。共通の電位および共通電極は、測定セルのすべてに共通である。

【0023】

[0037]いくつかの実施形態では、作用電極５０２は、金属電極である。非ファラデー性伝導のために、作用電極５０２は、腐食および酸化に耐性を示す、例えば、白金、金などの金属、チタン窒化物、およびグラファイトで形成され得る。例えば、作用電極５０２は、電気めっきを用いた白金電極であってもよい。別の例では、作用電極５０２は、チタン窒化物（ＴｉＮ）作用電極であってもよい。

【0024】

[0038]図５に示すように、ナノポア５１６は、凹部５０５上に浮かべられた平面脂質二重層５１４内に挿入される。電解液は、凹部５０５の内側、すなわちトランス側（塩類溶液５０６を参照）、およびかなりさらに大きい外部貯蔵部５２２、すなわち、シス側（バルク電解質５０８を参照）の両方に存在する。外部貯蔵部５２２内のバルク電解質５０８は、ナノポアベースの配列決定チップの複数の凹部の上にある。脂質二重層５１４は、凹部５０５を覆って延在し、一重層が撥水性層５２０に付着されたところである脂質一重層５１８に遷移する。この形状は、電気的かつ物理的に凹部５０５を封止し、凹部をより大きい外部貯蔵部から分離する。水および溶存ガスなどの中性分子は、脂質二重層５１４を通過し得るのに対して、イオンは通過し得ない。脂質二重層５１４内のナノポア５１６は、イオンが、凹部５０５の内外に伝導される単一の経路を提供する。

【0025】

[0039]核酸配列決定のために、ポリメラーゼがナノポア５１６に付着される。核酸の鋳型（例えば、ＤＮＡ）は、ポリメラーゼによって保持される。例えば、ポリメラーゼは、鋳型に対して不足するものを補う溶液から六リン酸モノヌクレオチド（ＨＭＮ）を取り込むことによって、ＤＮＡを合成する。固有で重合体のタグが、各ＨＭＮに取り付けられる。取り込みの間、タグは、対電極５１０と作用電極５０２との間の電圧により生み出される電界の勾配の支援のもと、ナノポアに装填される。タグは、ナノポア５１６を部分的に閉塞し、ナノポア５１６を通過するイオン電流での測定可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態では、交流（ＡＣ）バイアスまたは直流（ＤＣ）電圧が、電極間に印加される。

【0026】

[0040]図６は、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００の一実施形態を示す。上述したように、タグがナノポア６０２内に保たれるとき、固有のコンダクタンス信号（例えば、図２の信号２１０を参照）は、タグの異なる化学構造により生成され、それにより、付加された塩基を電子的に同定する。図６の回路は、電流が測定されるとき、ナノポア６０２全体の定電圧を維持する。特に、回路は、演算増幅器６０４およびパスデバイス６０６を含み、これらによって、ナノポア６０２全体にわたり、定電圧をＶ_ａまたはＶ_ｂに維持する。ナノポア６０２を通じて流れる電流は、コンデンサｎ_ｃａｐ６０８に蓄積され、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）６１０により測定される。

【0027】

[0041]しかしながら、回路６００には、多くの欠点が存在する。欠点の１つは、回路６００が一方向電流のみを測定するということである。他の欠点は、回路６００の演算増幅器６０４が多くの性能問題を導入し得るということである。例えば、演算増幅器６０４のオフセット電圧および温度ドリフトによって、ナノポア６０２全体に印加される実際の電圧が、異なるセル全体にわたり変化する場合がある。ナノポア６０２全体に印加される実際の電圧は、目標値の上下に数十ミリボルトもドリフトし得るので、それにより、測定が著しく不正確になる。さらに、演算増幅器のノイズによって、さらなる検出エラーが生じる場合がある。他の欠点は、電流測定の間、ナノポア全体の定電圧を維持するための回路の部分が、領域集中的（ａｒｅａ−ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）であるということである。例えば、演算増幅器６０４は、他の構成要素より著しく多くのセル内の空間を占有する。ナノポアベースの配列決定チップが、ますます多くのセルを含むために拡大されるので、演算増幅器によって占有される領域は、到達不能なサイズに増加する場合がある。残念なことに、大型のアレイを有するナノポアベースの配列決定チップ内の演算増幅器のサイズを縮小することは、他の性能問題を引き起こす可能性があり、例えば、セル内のオフセットおよびノイズの問題をさらに悪化させ得る。それゆえ、ナノポアを用いて分子を分析するために、改善された回路および改善された方法が、所望されるであろう。

【0028】

[0042]図７Ａは、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路７００の実施形態を示す図であり、ナノポア全体に印加される電圧は、ナノポアが特定の検出可能な状態にある期間にわたり変化するように構成可能である。ナノポアの可能な状態の１つは、タグが取り付けられたポリホスフェートがナノポアの筒に存在しない開放チャネル状態である。ナノポアの別の４つの可能な状態は、タグが取り付けられたポリホスフェートの４つの異なるタイプ（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）がナノポアの筒内に保たれるときの状態に対応する。ナノポアのさらに別の可能な状態は、膜が断裂するときである。回路７００では、演算増幅器は、もはや必要ではない。

【0029】

[0043]図７Ａは、膜７１２内に挿入されるナノポア７０２を示し、ナノポア７０２および膜７１２は、セル作用電極７１４と対電極７１６との間にあり、その結果、電圧は、ナノポア７０２全体に印加される。ナノポア７０２は、バルク液体／電解質７１８とも接触する。なお、作用電極７１４、ナノポア７０２、膜７１２、および対電極７１６が、図１の作用電極、ナノポア、膜、および対電極と比較して、上下反対に描かれていることに留意されたい。以下、セルは、少なくとも膜、ナノポア、作用セル電極および関連回路を含むことを意味する。いくつかの実施形態では、対電極は、複数のセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称される。共通電極は、共通電極を電圧源Ｖ_ｌｉｑ７２０に接続することによって、共通の電位を、測定セル内のナノポアと接触するバルク液体に印加するように構成可能である。共通の電位および共通電極は、測定セルのすべてに共通である。共通電極とは対照的に、作用セル電極は、各測定セル内に存在し、作用セル電極７１４は、他の測定セル内の作用セル電極から独立して、異なる電位を印加するように構成可能である。

【0030】

[0044]図７Ｂは、図７Ａに示した図と同様の、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路７００を示す。図７Ａと比較して、作用電極と対電極との間に、膜内に挿入されているナノポアを示す代わりに、ナノポアおよび膜の電気特性を表す電気モデル７２２を示す。

【0031】

[0045]電気モデル７２２は、異なる状態（例えば、開放チャネル状態またはナノポア内で異なるタイプのタグ／分子を有することに対応する状態）において、脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスをモデル化するコンデンサ７２６（Ｃ_二重層）と、ナノポア／脂質二重層に関連付けられた抵抗をモデル化する抵抗器７２８（Ｒ_二重層）と、を含む。

【0032】

[0046]電圧源Ｖ_ｌｉｑ７２０は、交流（ＡＣ）電圧源である。対電極７１６は、バルク液体７１８に浸漬され、ＡＣ非ファラデー性モードが利用され、方形波電圧Ｖ_ｌｉｑを調節し、それを測定セル内の脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加する。いくつかの実施形態では、Ｖ_ｌｉｑは、１００〜２５０ｍＶのピーク間の振幅不均一性および２０〜４００Ｈｚの周波数を有する方形波である。

【0033】

[0047]パスデバイス７０６は、脂質膜／二重層および電極を測定回路７００と接続または測定回路から切断するために使用され得るスイッチである。スイッチは、セル内の脂質膜／二重層を横断して印加され得る電圧刺激を有効化または無効化する。脂質が、脂質二重層を形成するためにセルに堆積される前では、２つの電極間のインピーダンスは、セルの凹部が封止されていないため、非常に低く、それゆえスイッチ７０６は、短絡状態を回避するために開放に維持される。スイッチ７０６は、脂質溶媒がセルに堆積されてセルの凹部を封止した後、閉じられ得る。

【0034】

[0048]回路７００は、チップ上に作り込まれた積分コンデンサ７０８（ｎ_ｃａｐ）をさらに含む。積分コンデンサ７０８は、リセット信号７０３を使用しスイッチ７０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ７０８が電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５に接続されることによって、予備充電される。いくつかの実施形態では、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５は、９００ｍＶの大きさの固定の正電圧を供給する。スイッチ７０１が閉じられているとき、積分コンデンサ７０８は、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５の正電圧レベルまで予備充電される。

【0035】

[0049]積分コンデンサ７０８が予備充電された後、リセット信号７０３が使用されスイッチ７０１が開放され、その結果、積分コンデンサ７０８は、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５から切断される。この時点では、Ｖ_ｌｉｑのレベルにより、対電極７１６の電位は、作用電極７１４の電位より高いレベルにあるか、その反対でもあり得る。例えば、方形波Ｖ_ｌｉｑの正位相の間（すなわち、ＡＣ電圧源信号サイクルの暗期間）、対電極７１６の電位は、作用電極７１４の電位より高いレベルにある。同様に、方形波Ｖ_ｌｉｑの負位相の間（すなわち、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間）、対電極７１６の電位は、作用電極７１４の電位より低いレベルにある。この電位差により、積分コンデンサ７０８は、ＡＣ電圧源信号サイクルの暗期間中に充電され、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間中に放電され得る。充電または放電は、ナノポアを通り流れるイオン電流をもたらす。

【0036】

[0050]積分コンデンサ７０８は、スイッチ７０１がリセット信号７０３によって開路される期間中、充電または放電し、その期間の終わりに、積分コンデンサ７０８内に蓄えられた電圧が、ＡＤＣ７１０によって読み出され得る。ＡＤＣ７１０によるサンプリングの後、積分コンデンサ７０８は、リセット信号７０３を使用しスイッチ７０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ７０８が電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５に再接続されることによって、再び予備充電され得る。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ７１０のサンプリング速度は、５００〜２０００Ｈｚである。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ７１０のサンプリング速度は、最高で５ｋＨｚである。例えば、１ｋＨｚのサンプリング速度で、積分コンデンサ７０８は、約１ｍｓの期間中、充電または放電され得、次に、積分コンデンサ７０８における電圧は、ＡＤＣ７１０によって読み出される。ＡＤＣ７１０によるサンプリングの後、積分コンデンサ７０８は、リセット信号７０３を使用しスイッチ７０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ７０８が電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５に再接続されることによって、再び予備充電される。積分コンデンサ７０８を予備充電するステップと、積分コンデンサ７０８が充電または放電する一定の期間を待機するステップと、積分コンデンサ内に蓄えられた電圧をＡＤＣ７１０によってサンプリングするステップとが、サイクルで繰り返される。以下で詳述するように、コンデンサの充電および放電によってもたらされる積分コンデンサの電圧減衰率は、監視され、ナノポア内部の分子を分析するために使用され得る。

【0037】

[0051]図８は、膜内に挿入されているナノポア内の分子を分析するプロセス８００の一実施形態を示す図である。プロセス８００は、図７Ａおよび７Ｂに示される回路を用いて実行されてもよい。図９は、プロセス８００が実行され、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間内で３回繰り返される時間に対する、積分コンデンサ（Ｖ_ｎｃａｐ）における電圧のプロットの一実施形態を示す図である。積分コンデンサの放電により、ナノポア全体に印加される電圧は、一定に保たれない。その代わりに、ナノポア全体に印加される電圧は、時間とともに変化する。電圧減衰率（すなわち、時間に対する積分コンデンサにおける電圧のプロットの傾きの程度）は、セル抵抗（例えば、図７Ｂの抵抗器７２８の抵抗）に依存する。より詳しくは、異なる状態（例えば、開放チャネル状態、ナノポア内の異なるタイプのタグ／分子を有することに対応する状態、および、膜が断裂するときの状態）のナノポアに関連付けられた抵抗が、分子「／タグ」の異なる化学構造により異なるので、異なる対応する電圧減衰率が観察され得るようになり、それゆえ、ナノポアの異なる状態を同定するために用いられてもよい。

【0038】

[0052]図８および図７Ｂを参照すると、プロセス８００の８０２において、積分コンデンサは、積分コンデンサおよびナノポアを予備充電する電圧源に結合することによって、予備充電される。例えば、図７Ｂに示すように、積分コンデンサ７０８は、リセット信号７０３を使用しスイッチ７０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ７０８およびナノポアが電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５に結合されることによって、Ｖ_ｐｒｅに予備充電される。図９に示すように、積分コンデンサの初期電圧は、Ｖ_ｐｒｅである。スイッチ７０１が閉じられ、積分コンデンサが予備充電されているとき、膜に関連付けられたコンデンサも同時に充電され、エネルギーは膜全体の電界に保存される。

【0039】

[0053]プロセス８００の８０４において、ナノポアおよび膜を電圧源から切り離すことによって、膜に関連付けられたコンデンサ（コンデンサ７２６）および積分コンデンサは放電し、これにより、膜全体の電界に保存されたエネルギーは消散する。例えば、図７Ｂに示すように、スイッチ７０１がリセット信号７０３によって開放されると、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５は切断される。スイッチ７０１が開放された後、図９に示すように、積分コンデンサの電圧は、指数関数的な減衰を開始する。指数関数的な減衰は、ＲＣ時定数τ＝ＲＣを有し、Ｒは、ナノポアに関連付けられた抵抗（抵抗器７２８）であり、Ｃは、Ｒに並列のキャパシタンスであり、膜に関連付けられたキャパシタンスＣ_二重層７２６およびｎ_ｃａｐ７０８に関連付けられたキャパシタンスを含む。

【0040】

[0054]プロセス８００の８０６において、積分コンデンサの電圧の減衰率が決定される。図９に示すように、電圧減衰率は、時間に対する積分コンデンサの電圧のプロットの傾きの程度である。電圧減衰率は、異なる方法で決定されてもよい。

【0041】

[0055]いくつかの実施形態では、電圧減衰率は、一定の時間間隔の間に発生する電圧減衰を測定することによって決定される。例えば、図９に示すように、積分コンデンサの電圧は、最初に時間ｔ_１でＡＤＣ７１０により測定され、次に、電圧は、時間ｔ_２でＡＤＣ７１０により再び測定される。時間に対するＶ_ｎｃａｐ電圧の傾きがより急であるとき、電圧差ΔＶはより大きく、時間に対する電圧曲線の傾きがより緩やかなとき、電圧差ΔＶはより小さい。それゆえ、ΔＶは、積分コンデンサの電圧の減衰率を決定するための測定基準として用いられてもよい。いくつかの実施形態では、電圧減衰率の測定の精度を向上させるために、電圧は、追加の回数、一定の間隔で測定されてもよい。例えば、電圧は、時間ｔ_３、ｔ_４などで測定されてもよく、複数の時間間隔の間のΔＶの複数の測定値は、積分コンデンサの電圧の減衰率を決定するための測定基準としてともに用いられてもよい。いくつかの実施形態では、相関二重サンプリング（ＣＤＳ）を用いて、電圧減衰率の測定の精度を向上させてもよい。

【0042】

[0056]いくつかの実施形態では、電圧減衰率は、選択された電圧減衰量のために必要な持続時間を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、電圧が一定電圧Ｖ_１から第２の一定電圧Ｖ_２に降下するのに必要な時間が測定されてもよい。時間に対する電圧曲線の傾きがより急であるとき、必要な時間はより少なく、時間に対する電圧曲線の傾きがより緩やかなとき、必要な時間はより大きい。それゆえ、測定された必要な時間は、積分コンデンサの電圧の減衰率を決定するための測定基準として用いられてもよい。

【0043】

[0057]プロセス８００の８０８において、ナノポアの状態は、決定された電圧減衰率に基づいて決定される。ナノポアの可能な状態の１つは、タグが取り付けられたポリホスフェートがナノポアの筒には存在しない開放チャネル状態である。ナノポアの他の可能な状態は、異なるタイプの分子がナノポアの筒内に保たれるときの状態に対応する。例えば、ナノポアの別の４つの可能な状態は、４つの異なるタイプのタグが取り付けられたポリホスフェート（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）がナノポアの筒内に保たれるときの状態に対応する。ナノポアのさらに別の可能な状態は、膜が断裂するときである。ナノポアの状態は、決定された電圧減衰率に基づいて決定可能である。なぜなら、電圧減衰率は、セル抵抗、すなわち、図７Ｂの抵抗器７２８の抵抗に依存するからである。より詳しくは、異なる状態のナノポアに関連付けられた抵抗が、分子／タグの異なる化学構造に起因して異なるので、異なる対応する電圧減衰率は、観察され得るようになり、それゆえ、ナノポアの異なる状態を識別するために用いられてもよい。

【0044】

[0058]図１０は、ナノポアが異なる状態にある時間に対する、積分コンデンサにおける電圧のプロットの一実施形態を示す図である。プロット１００２は、開放チャネル状態の間の電圧減衰率を示す。いくつかの実施形態では、開放チャネル状態のナノポアに関連付けられた抵抗は、１００Ｍｏｈｍから２０Ｇｏｈｍまでの範囲内にある。４つの異なるタイプのタグが取り付けられたポリホスフェート（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）がナノポアの筒内に保たれるとき、プロット１００４、１００６、１００８および１０１０は、４つの捕捉状態に対応する異なる電圧減衰率を示す。いくつかの実施形態では、捕捉状態のナノポアに関連付けられた抵抗は、２００Ｍｏｈｍから４０Ｇｏｈｍまでの範囲内にある。プロットの各々の傾きが互いに区別可能であることに留意されたい。

【0045】

[0059]プロセス８００の８１０において、プロセス８００が繰り返されるか否かが決定される。例えば、プロセスは、複数回繰り返され、ナノポアの各状態を検出するようにしてもよい。プロセスが繰り返されない場合、プロセス８００は終了し、さもなければ、プロセスは、再び８０２において再開する。８０２において、積分コンデンサは、積分コンデンサおよびナノポアを予備充電する電圧源に結合することによって、再び予備充電される。例えば、図７Ｂに示すように、積分コンデンサ７０８は、リセット信号７０３を使用しスイッチ７０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ７０８およびナノポアが電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５に結合されることによって、Ｖ_ｐｒｅに予備充電される。図９に示すように、積分コンデンサ（Ｖ_ｎｃａｐ）の電圧は、Ｖ_ｐｒｅのレベルまで迅速に戻る。プロセス８００が複数回繰り返されるので、鋸歯状の電圧波形は、時間とともに積分コンデンサで観測される。図９は、また、電圧Ｖ_ｐｒｅ７０５が再びアサートされない場合の時間に伴うＲＣ電圧減衰を示す外挿曲線９０４を説明する。

【0046】

[0060]上述したように、ナノポア全体に印加される電圧を、ナノポアが特定の検出可能な状態にある期間にわたって変化するように構成することは、多くの利点を有する。利点の１つは、そうでなければセル回路内にオンチップ作製される演算増幅器をなくすことにより、ナノポアベースの配列決定チップ内の単一のセルのフットプリントを著しく減少させることであり、それにより、（例えば、ナノポアベースの配列決定チップ内の数百万ものセルを有する）ますます多くのセルを含むためにナノポアベースの配列決定チップの拡大を容易にする。

【0047】

[0061]他の利点は、Ｖ_ｐｒｅが任意の介在回路なく、作用電極に直接印加されるので、セルの回路がオフセットされた不正確性を被らないということである。他の利点は、スイッチが測定間隔の間に開閉されていないので、電荷注入量が最小化されるということである。

【0048】

[0062]さらに、上述した技術は、正電圧または負電圧を用いて同じように良好に動作する。電圧は、交流（ＡＣ）電圧でもよい。二方向測定は、分子複合体を特徴付けるのに有効なことを示した。さらに、ナノポアを通じて流されるイオン流のタイプが非ファラデー性伝導を介するとき、二方向測定は役に立つ。２つのタイプ、すなわち、ファラデー性伝導および非ファラデー性伝導のイオン流は、ナノポアを通じて流すことができる。ファラデー性伝導において、化学反応は、金属電極の表面で発生する。ファラデー電流は、電極でのいくつかの化学物質の還元または酸化によって生成される電流である。非ファラデー性伝導の利点は、化学反応が金属電極の表面で発生しないということである。

【0049】

[0063]図１１は、ナノポアベースの配列決定チップのセルにおける複数の信号の時間信号プロットの一実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、信号は、図７Ａおよび７Ｂに示される回路によって供給され得る。一番上のＶ_ｌｉｑのプロットは、時間とともに電圧源Ｖ_ｌｉｑ７２０によって、共通電極７１６に印加される電圧を示す。中央のプロットは、時間に対するスイッチ７０１を制御するために用いられるリセット信号７０３を示す図であり、スイッチ７０１は、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜に接続し、または膜から切断する。下のプロットは、時間の関数として、リセット信号およびＶ_ｌｉｑに応答する積分コンデンサ（Ｖ_ｎｃａｐ）の電圧を示す。

【0050】

[0064]一番上のＶ_ｌｉｑのプロットは、時間とともに電圧源Ｖ_ｌｉｑ７２０によって、共通電極７１６に印加される電圧を示す。共通電極７１６は、バルク液体７１８に浸漬されるので、Ｖ_ｌｉｑは、測定セル内の脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加される。Ｖ_ｌｉｑは、液体電圧とも称される。いくつかの実施形態では、Ｖ_ｌｉｑは、２００〜２５０ｍＶのピーク間の振幅不均一性および２０〜４００Ｈｚ（例えば、４０Ｈｚ）の周波数を有する方形波である。例えば、Ｖ_ｌｉｑは、０．８Ｖと１．０Ｖとの値の間で切り換わり得る。Ｖ_ｌｉｑが下の値（例えば、０．８Ｖ）にある期間を、明期間、または、タグが分析用ナノポア内に引き込まれる得る期間であるので、タグ読取り期間と呼ぶ。下の電圧値は、タグ読取り電圧とも呼ばれる。Ｖ_ｌｉｑが上の値（例えば、１．０Ｖ）にある期間を、暗期間、または、タグが取り付けられたポリホスフェートが、ナノポアの筒から放出され存在しない間の期間であるので、開放チャネル期間と呼ぶ。高い方の電圧値は、開放チャネル電圧とも呼ばれる。

【0051】

[0065]中央のプロットは、時間に対するスイッチ７０１を制御するために用いられるリセット信号７０３を示す図であり、スイッチ７０１は、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜（また、ｎ_ｃａｐ７０８）に接続し、または膜から切断する。リセット信号が期間ｔ_予備充電の間高位に保たれるとき、スイッチ７０１は閉じられ、リセット信号が期間ｔ_積分の間低位に保たれるとき、スイッチ７０１は開放される。１つのｔ_積分期間とともに組み合わせた１つのｔ_予備充電期間が、単一のフレームを形成する。いくつかの実施形態では、フレームレートは、単一のフレーム持続時間５００μｓを有する、２ｋＨｚである。他の実施形態では、フレームレートは、２００Ｈｚ〜１５ｋＨｚの範囲内にある。説明を容易にするために、図１１では、リセット信号の３つのフレームだけが、Ｖ_ｌｉｑの単一の明期間内に描かれている。しかしながら、各明期間または暗期間内に数十または数百のフレームが存在し得ることを理解されたい。

【0052】

[0066]期間ｔ_予備充電中にスイッチ７０１が閉じられたとき、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５は作用電極７１４に接続され、電圧Ｖ_ｐｒｅをセル作用電極に印加し、膜（Ｃ_二重層７２６）に関連付けられたコンデンサおよび積分コンデンサｎ_ｃａｐ７０８は、電圧Ｖ_ｐｒｅに予備充電される。したがって、積分コンデンサの電圧Ｖ_ｎｃａｐ（図１１の下のプロットを参照）は、各期間ｔ_予備充電内のＶ_ｐｒｅに等しい。いくつかの実施形態では、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５は、０．９Ｖの大きさの固定の正電圧を供給する。他の実施形態では、Ｖ_ｐｒｅは、０．７〜１．２Ｖの範囲内から選択される定電圧である。

【0053】

[0067]コンデンサが予備充電された後、スイッチ７０１は、期間ｔ_積分の間、下位リセット信号によって開放され、ナノポア、膜、およびｎ_ｃａｐ７０８を電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５から切り離す。期間ｔ_積分の間、コンデンサは、Ｖ_ｌｉｑのレベルにより、放電または充電のどちらかを行い、Ｖ_ｎｃａｐは、指数関数的に減衰または増大する。期間ｔ_積分が、Ｖ_ｌｉｑの明期間内にあるとき、Ｖ_ｌｉｑは、Ｖ_ｎｃａｐより低い電圧レベルにあり、この電位差は、コンデンサが放電し、Ｖ_ｎｃａｐが指数関数的に減衰する原因となる。期間ｔ_積分が、Ｖ_ｌｉｑの暗期間内にあるとき、Ｖ_ｎｃａｐは、Ｖ_ｌｉｑより低い電圧レベルにあり、この電位差は逆に、コンデンサが充電し、Ｖ_ｎｃａｐが指数関数的に増大する原因となる。指数関数的な電圧変化は、ＲＣ時定数τ＝ＲＣを有し、Ｒは、ナノポアに関連付けられた抵抗（Ｒ_二重層７２８）であり、Ｃは、Ｒに並列のキャパシタンスであり、膜に関連付けられたキャパシタンスＣ_二重層７２６およびｎ_ｃａｐ７０８に関連付けられたキャパシタンスを含む。図１１内で、Ｖ_ｎｃａｐの傾きの程度は、正確な縮尺率ではないことを理解されたい。コンデンサの放電によってもたらされるＶ_ｎｃａｐの減衰率は、フレームからフレームへ変化し得、異なる減衰率は、ナノポア内部の分子を分析するために使用され得る。コンデンサの充電によってもたらされるＶ_ｎｃａｐの増大率もまた、フレームからフレームへ変化し得て、Ｖ_ｎｃａｐの異なる増大率は、ドリフト補正などの開放チャネル状態を較正するために監視され得る。

【0054】

[0068]図１１で示した実施形態では、リセット信号は、短時間（０．５〜５０マイクロ秒）ｔ_予備充電期間だけ高位に維持され、コンデンサがＶ_ｐｒｅに予備充電されるとすぐにリセット信号は、スイッチを開放するために低位に設定され、積分コンデンサｎ_ｃａｐ７０８の電圧が、浮動しＶ_ｐｒｅ以外の電圧に変化することを可能にする。リセット信号の迅速な遷移、特に、Ｖ_ｌｉｑが暗期間から明期間へ、またはその逆に転換するときのリセット信号の迅速な遷移は、ナノポアベースの配列決定チップの多くの性能問題の原因となり得る、ある一定のＶ_ｎｃａｐ時間特性を引き起こすことが分かっている。例えば、リセット信号の迅速な遷移および対応するＶ_ｎｃａｐ時間特性は、脂質二重層での予測不能な過渡特性をもたらし得て、積分期間中のＶ_ｎｃａｐの変化率測定に影響を及ぼす。リセット信号の迅速な遷移はまた、充填確率、すなわち、明期間中にナノポアの筒内に捕捉されつつあるタグの確率を低下させる。したがって、改善されたリセット信号パターンおよびＶ_ｎｃａｐ電圧パターンが所望されよう。

【0055】

[0069]図１２は、スイッチを制御するのに用いられるリセット信号の別の実施形態を示し、スイッチは、電圧源をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜に接続し、または膜から切断し、膜に関連付けられたコンデンサが繰り返し充電および放電されるようにする。いくつかの実施形態では、信号は、図７Ａおよび７Ｂに示される回路によって供給されてもよい。一番上のＶ_ｌｉｑのプロットは、図１１でのＶ_ｌｉｑのプロットと同一である。中央のプロットは、時間に対するスイッチ７０１を制御するために用いられる改善されたリセット信号７０３を示す図であり、スイッチ７０１は、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜に接続し、または膜から切断する。下のプロットは、時間の関数として、新たな改善されたリセット信号およびＶ_ｌｉｑに応答する積分コンデンサ（Ｖ_ｎｃａｐ）の電圧を示す。

【0056】

[0070]一番上のプロットのＶ_ｌｉｑは、時間とともに電圧源Ｖ_ｌｉｑ７２０によって、共通電極７１６に印加される電圧を示す。いくつかの実施形態では、Ｖ_ｌｉｑは、２００〜２５０ｍＶのピーク間の振幅不均一性および２０〜４００Ｈｚ（例えば、４０Ｈｚ）の周波数を有する方形波である。例えば、Ｖ_ｌｉｑは、０．８Ｖと１．０Ｖとの値の間で切り換わり得る。Ｖ_ｌｉｑが下の値（例えば、０．８Ｖ）にある期間を、明期間、または、タグ読取り期間と呼ぶ。Ｖ_ｌｉｑが上の値（例えば、１．０Ｖ）にある期間を、暗期間、または、開放チャネル期間と呼ぶ。

【0057】

[0071]中央のプロットは、時間に対するスイッチ７０１を制御するために用いられる改善されたリセット信号７０３を示す図であり、スイッチ７０１は、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜（また、ｎ_ｃａｐ７０８）に接続し、または膜から切断する。リセット信号が期間ｔ_予備充電の間高位に保たれるとき、スイッチ７０１は閉じられ、リセット信号が期間ｔ_積分の間低位に保たれるとき、スイッチ７０１は開放される。１つのｔ_予備充電と、その後に続く１つのｔ_積分期間が、単一のフレームを形成する。

【0058】

[0072]図１１のフレームとは対照的に、図１２のフレームの持続時間は、時間とともに一定に維持されない。リセット信号には２つの種類のフレームが存在する。異なるタイプのフレームは、異なるＶ_ｎｃａｐパターンをもたらし、それゆえ、対応する改善された技術は、ハイブリッドモード刺激を伴う電圧モードと呼ばれる。フレームの１つの種類（例えば、フレーム１２０２を参照）が、図１１のフレームと同等である。これらのフレームでは、リセット信号は、ごく短時間ｔ_予備充電期間だけ高位レベルに維持され、コンデンサがＶ_ｐｒｅに予備充電されるとすぐにリセット信号は、スイッチを開放するために低位に設定され、積分コンデンサｎ_ｃａｐ７０８の電圧が、浮動しＶ_ｐｒｅ以外の電圧に変化することを可能にする。第２の種類のフレーム（例えば、フレーム１２０４を参照）は、第１の種類のフレームよりも長い予備充電期間を有する。フレーム１２０４に示すように、リセット信号は、より長いｔ_予備充電期間高位レベルに維持される。具体的には、リセット信号は、Ｖ_ｌｉｑの暗期間の終了部分およびＶ_ｌｉｑの明期間の開始部分の間高位レベルに維持され、その結果、Ｖ_ｌｉｑが暗期間から明期間に転換するとき、リセット信号の迅速な遷移は存在しない。

【0059】

[0073]フレーム１２０４の予備充電期間を延長することによって、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５は、より長い期間作用電極７１４に接続され、積分コンデンサＶ_ｎｃａｐ（図１２の下のプロットを参照）の電圧は、Ｖ_ｌｉｑが暗期間から明期間に転換するとき、Ｖ_ｐｒｅに維持される。いくつかの実施形態では、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５は、０．９Ｖの大きさの固定の正電圧を供給する。他の実施形態では、Ｖ_ｐｒｅは、０．７〜１．２Ｖの範囲内から選択される定電圧である。

【0060】

[0074]Ｖ_ｌｉｑが暗期間から明期間に転換するときＶ_ｎｃａｐを一定の高いレベルに維持することは、多くの利点を有する。利点のうちの１つは、充填確率、明期間中にナノポアの筒内に捕捉されつつあるタグの確率を増大させることである。Ｖ_ｌｉｑの明期間の開始部分で、Ｖ_ｎｃａｐを一定のより高い電圧に維持することは、ナノポア内にタグを引き込み得る電気的な力が、より長い期間高いままとなるので、充填確率を増大させ、それによりタグが測定するナノポア内に捕捉される機会を増大させ、ナノポア内にすでに捕捉されているタグがナノポアから逃げ得る機会を減少させる。Ｖ_ｌｉｑが暗期間から明期間に転換するときＶ_ｎｃａｐを一定のより高いレベルに維持することの別の利点は、それが、ＲＣ時定数などの脂質二重層内の過渡特性を減少させることである。脂質二重層内により安定した特性を有することによって、積分期間中のＶ_ｎｃａｐの変化率測定は、より信頼できるようになる。

【0061】

[0075]図１２に示すように、リセット信号は、Ｖ_ｌｉｑの暗期間の終了部分およびＶ_ｌｉｑの明期間の開始部分の両方において、高位レベルに維持される。しかしながら、いくつかの他の実施形態では、リセット信号は、Ｖ_ｌｉｑの暗期間の終了部分においてのみ、高位レベルに維持され得る。いくつかの他の実施形態では、リセット信号は、Ｖ_ｌｉｑの明期間の開始部分においてのみ、高位レベルに維持され得る。

【0062】

[0076]いくつかの実施形態では、フレーム１２０２の予備充電期間は、構成変更可能である。フレーム１２０２の予備充電期間ｔ_予備充電は、５０マイクロ秒〜１ミリ秒の範囲の所定の持続時間に構成される。いくつかの実施形態では、フレーム１２０４の予備充電期間は、構成変更可能である。フレーム１２０４の予備充電期間ｔ_予備充電は、１００マイクロ秒〜５０ミリ秒の範囲の所定の持続時間に構成される。Ｖ_ｌｉｑの暗期間と重複する予備充電期間は、５０マイクロ秒〜２５ミリ秒である。Ｖ_ｌｉｑの明期間と重複する予備充電期間は、５０マイクロ秒〜２５ミリ秒である。

【0063】

[0077]図１２内で、Ｖ_ｎｃａｐの傾きの程度は、正確な縮尺率ではないことを理解されたい。コンデンサの放電によってもたらされるＶ_ｎｃａｐの減衰率は、フレームからフレームへ変化し得、異なる減衰率は、ナノポア内部の分子を分析するために使用され得る。コンデンサの充電によってもたらされるＶ_ｎｃａｐの増大率もまた、フレームからフレームへ変化し得、Ｖ_ｎｃａｐの異なる増大率は、ドリフト補正などの開放チャネル状態を較正するために監視され得る。

【0064】

[0078]説明を容易にするために、図１２では、２つの積分時間だけが、Ｖ_ｌｉｑの単一の明期間内に描かれている。同様に、図１２では、１つの積分時間だけが、Ｖ_ｌｉｑの単一の暗期間内に描かれている。しかしながら、図１３に示したように、各明期間または暗期間内に数十または数百の積分時間が存在し得ることを理解されたい。

【0065】

[0079]図１４は、スイッチを制御するのに用いられるリセット信号のさらに別の実施形態を示し、スイッチは、電圧源をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜に接続し、または膜から切断し、膜に関連付けられたコンデンサが繰り返し充電および放電されるようにする。いくつかの実施形態では、信号は、図７Ａおよび７Ｂに示される回路によって供給されてもよい。一番上のＶ_ｌｉｑのプロットは、図１１および１２でのＶ_ｌｉｑのプロットと同一である。中央のプロットは、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５をナノポアベースの配列決定チップのセル内の膜に接続し、または膜から切断する、スイッチ７０１を制御するために用いられる別の改善されたリセット信号７０３を示す図である。下のプロットは、時間の関数として、新たな改善されたリセット信号およびＶ_ｌｉｑに応答する積分コンデンサ（Ｖ_ｎｃａｐ）の電圧を示す。

【0066】

[0080]図１１のフレームとは対照的に、図１４のフレームの持続時間は、時間とともに一定に維持されない。リセット信号には２つの種類のフレームが存在する。フレームの１つの種類（例えば、フレーム１２０２を参照）が、図１１のフレームと同等である。これらのフレームでは、リセット信号は、ごく短時間ｔ_予備充電期間だけ高位レベルに維持され、コンデンサがＶ_ｐｒｅに予備充電されるとすぐにリセット信号は、スイッチを開放するために低位に設定され、積分コンデンサｎ_ｃａｐ７０８の電圧が、浮動しＶ_ｐｒｅ以外の電圧に変化することを可能にする。第２の種類のフレーム（例えば、フレーム１４０２を参照）は、第１の種類のフレームよりも長い予備充電期間を有する。フレーム１４０２に示すように、リセット信号は、より長いｔ_予備充電期間高位レベルに維持される。具体的には、リセット信号は、Ｖ_ｌｉｑの明期間の終了部分およびＶ_ｌｉｑの暗期間の開始部分の間高位レベルに維持され、その結果、Ｖ_ｌｉｑが明期間から暗期間に転換するとき、リセット信号の迅速な遷移は存在しない。

【0067】

[0081]フレーム１４０２の予備充電期間を延長することによって、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５は、より長い期間作用電極７１４に接続され、積分コンデンサＶ_ｎｃａｐ（図１４の下のプロットを参照）の電圧は、Ｖ_ｌｉｑが明期間から暗期間に転換するとき、Ｖ_ｐｒｅに維持される。いくつかの実施形態では、電圧源Ｖ_ｐｒｅ７０５は、０．９Ｖの大きさの固定の正電圧を供給する。他の実施形態では、Ｖ_ｐｒｅは、０．７〜１．２Ｖの範囲内から選択される定電圧である。

【0068】

[0082]Ｖ_ｌｉｑが明期間から暗期間に転換するときＶ_ｎｃａｐを一定のより高いレベルに維持することは、その利点を有する。Ｖ_ｌｉｑが明期間から暗期間に転換するときＶ_ｎｃａｐを一定のより高いレベルに維持することの１つの利点は、それが、ＲＣ時定数などの脂質二重層内の過渡特性を減少させることである。脂質二重層内により安定した特性を有することによって、積分期間中のＶ_ｎｃａｐの変化率測定は、より信頼できるようになる。

【0069】

[0083]図１４に示すように、リセット信号は、Ｖ_ｌｉｑの明期間の終了部分およびＶ_ｌｉｑの暗期間の開始部分の両方において、高位レベルに維持される。しかしながら、いくつかの他の実施形態では、リセット信号は、Ｖ_ｌｉｑの明期間の終了部分においてのみ、高位レベルに維持され得る。いくつかの他の実施形態では、リセット信号は、Ｖ_ｌｉｑの暗期間の開始部分においてのみ、高位レベルに維持され得る。

【0070】

[0084]いくつかの実施形態では、フレーム１２０２の予備充電期間は、構成変更可能である。フレーム１２０２の予備充電期間ｔ_予備充電は、５０マイクロ秒〜１ミリ秒の範囲の所定の持続時間に構成される。いくつかの実施形態では、フレーム１４０２の予備充電期間は、構成変更可能である。フレーム１４０２の予備充電期間ｔ_予備充電は、１００マイクロ秒〜５０ミリ秒の範囲の所定の持続時間に構成される。Ｖ_ｌｉｑの明期間と重複する予備充電期間は、５０マイクロ秒〜２５ミリ秒である。Ｖ_ｌｉｑの暗期間と重複する予備充電期間は、５０マイクロ秒〜２５ミリ秒である。

【0071】

[0085]いくつかの実施形態では、リセット信号は、３つの種類のフレーム、フレーム１２０２、フレーム１２０４、およびフレーム１４０２を含む。リセット信号内にフレーム１２０４および１４０２を有することによって、積分コンデンサＶ_ｎｃａｐの電圧は、Ｖ_ｌｉｑが明期間から暗期間にまたはその逆に転換するとき、Ｖ_ｐｒｅで維持される。

【0072】

[0086]上述した実施形態は、理解の明確性のために多少詳細に記載されてきたが、本発明は、提供された詳細に限定されるものではない。本発明を実施する多くの代替の方法が存在する。開示された実施形態は、例示的であり限定的ではない。

【0073】

[0087]各々の個別の出版物、特許、特許出願書類、および／または他の文書が、個別に示され、あらゆる目的で参照により組み込まれるように、本明細書で引用されたすべての出版物、特許、特許出願書類、および／または他の文書は、開示全体であらゆる目的で参照することにより、同様に本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】