特許 6858185 増殖性および炎症性疾患の処置における抗ＴｆＲ抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6858185

(24)【登録日】2021年3月25日

(45)【発行日】2021年4月14日

(54)【発明の名称】増殖性および炎症性疾患の処置における抗ＴｆＲ抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20210405BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210405BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20210405BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210405BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210405BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210405BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210405BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20210405BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210405BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20210405BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20210405BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20210405BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210405BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C12N15/13

   C12P21/08

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C07K16/46

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P37/06

   A61K47/68

   A61K39/395 N

【請求項の数】16

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2018-522867(P2018-522867)

(86)(22)【出願日】2016年7月21日

(65)【公表番号】特表2018-521691(P2018-521691A)

(43)【公表日】2018年8月9日

(86)【国際出願番号】EP2016067465

(87)【国際公開番号】WO2017013230

(87)【国際公開日】20170126

【審査請求日】2019年7月18日

(31)【優先権主張番号】15306192.4

(32)【優先日】2015年7月22日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】518023555

【氏名又は名称】イナサリス

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】ローネー，ピエール

(72)【発明者】

【氏名】ベランガー，コラリー

(72)【発明者】

【氏名】スーシェ，エルヴェ

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００５／１１１０８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０２０１４０（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された抗ＴｆＲ抗体または抗ＴｆＲ抗体の抗原結合部位を有するタンパク質であって、
（ａ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
のいずれかを含み、前記抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質は、配列番号１６のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する、上記単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質。

【請求項2】

前記抗体またはタンパク質が、１０ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄで、好ましくは１ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄでトランスフェリン受容体に結合する、請求項１に記載の単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質。

【請求項3】

前記抗体またはタンパク質が、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを有する対応する参照キメラ抗体の誘導レベルに等しいかまたはそれより優れたレベルに、ＨＬ−６０細胞株のアポトーシスを誘導する、請求項１または２に記載の単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質。

【請求項4】

ヒトＩｇＧ４アイソタイプの定常領域、または突然変異したもしくは化学的に改変された定常領域を含み、ここで前記突然変異したまたは化学的に改変された定常領域は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を有する対応する抗体と比較した場合、前記抗体にＡＤＣＣ活性を付与しないかまたは減少したＡＤＣＣ活性を付与する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質。

【請求項5】

ヒトＩｇＧ１アイソタイプの定常領域、または突然変異したもしくは化学的に改変された定常領域を含み、ここで前記突然変異したまたは化学的に改変された定常領域は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を有する対応する抗体と比較した場合、前記抗体に増加したＡＤＣＣ活性を付与する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質。

【請求項6】

配列番号１８の重鎖および配列番号１７の軽鎖を含むｍＡｂ１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質。

【請求項7】

（ｉ）医薬としてまたは（ｉｉ）診断剤として使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質。

【請求項8】

腫瘍、例えば血液系腫瘍、より具体的にはリンパ腫または白血病の処置で使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質。

【請求項9】

固形腫瘍、または炎症性疾患または移植片対宿主病の処置で使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質。

【請求項10】

請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質を、医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体の１つまたはそれより多くと組み合わせて含み、任意選択で他の活性成分を含む、医薬組成物。

【請求項11】

治療成分にコンジュゲートされた、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体。

【請求項12】

前記治療成分が、細胞毒素、薬物または放射性毒素の中から選択される、請求項１１に記載の抗ＴｆＲ抗体。

【請求項13】

宿主細胞における請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体の組換え生産のための、前記抗ＴｆＲ抗体をコードする少なくとも１つの核酸を含むクローニングまたは発現ベクター。

【請求項14】

請求項６に記載のｍＡｂ１をコードする核酸の少なくとも１つを含む、請求項１３に記載のクローニングまたは発現ベクター。

【請求項15】

請求項１３または１４に記載のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項16】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質を生産するための方法であって、（ｉ）宿主細胞によって前記抗体またはタンパク質を発現させるために、請求項１５に記載の宿主細胞を培養すること；任意選択で（ｉｉ）前記抗体またはタンパク質を精製すること；および（ｉｉｉ）前記抗体またはタンパク質を回収することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

以下において、ＴｆＲ、すなわちトランスフェリン受容体に特異的に結合する抗体が開示される。このような抗体は、特定には、リンパ腫または白血病などの増殖性および炎症性疾患の処置において有用である。本開示は、より具体的には、Ａ２４の対応する親のマウス抗体と比較して等価なまたは向上した特性を有する特異的なヒト化抗ＴｆＲ抗体、またはヒトＩｇＧ１定常領域を有するそのキメラ型に関する。

【背景技術】

【0002】

トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）（以降「ＴｆＲ」と称する）は、それぞれおよそ９０ｋＤａの２つの７６０アミノ酸の単量体からなるジスルフィド結合したホモ二量体膜貫通糖タンパク質である。ＴｆＲは、鉄の取り込みおよび細胞成長の調節において重要な役割を果たす（Gillら、N Engl J Med.、332,1744〜1748、1995 - Hermineら、N Engl J Med.、332、1749〜1751、1995）。二鉄トランスフェリンは、その細胞表面受容体に結合すると、クラスリンでコーティングされた穴を介して酸性の小胞に内在化され、そこで鉄−トランスフェリン複合体が解離する。放出後、受容体およびアポ−トランスフェリンは、細胞表面に戻り再利用される。

【0003】

ＴｆＲは、例えば骨髄における血液細胞前駆体、肝臓における肝細胞、表皮におけるケラチノサイトおよび腸上皮の陰窩における腸細胞などの絶えず刷新される組織の細胞原形質膜で構成的に発現される。

【0004】

数々の研究から、ＴｆＲは、悪性組織中で、その健康な対応物より豊富に発現されることが示されてきた（Gatterら、J Clin Pathol.、36、539〜545、1983 - Faulkら、Lancet.、2、390〜392、1980 - Shindelmanら、Int J Cancer、27、329〜334、1981）。数人の著者は、この概念に基づいた、悪性細胞を殺滅するための薬物にコンジュゲートした抗ＴｆＲ抗体またはトランスフェリンそれ自体を使用する治療アプローチを報告している。

【0005】

また、トランスフェリンとＴｆＲとの相互作用をブロックする抗ＴｆＲ抗体を使用して、その結果として鉄の取り込みを防ぎ、鉄欠乏および細胞成長の負の調節をもたらすことも提唱されている。しかしながら、多くの出版物が抗ＴｆＲ抗体の調製を記載しているが、抗増殖作用を有する抗ＴｆＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の報告はほとんどない。

【0006】

TrowbridgeおよびLopez（Proc. Natl Acad Sci USA、79、1175〜1179、1982）は、４２／６と名付けられＩｇＡ（ｋ）とタイプ分けされたモノクローナル抗体の特性を報告しており、この抗体は、トランスフェリンのその受容体への結合をブロックし、さらに、細胞周期のＳ期で細胞をブロックすることによってインビトロでヒトＴ白血病細胞株の成長を阻害することができる。４２／６抗体およびそれを生産するハイブリドーマ（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０９４）は、米国特許第４，４３４，１５６号に開示されている。

【0007】

Lesleyら（Mol Cell Biol. 5、1814〜21、1985）は、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスのいずれかに属する抗マウストランスフェリン受容体モノクローナル抗体の、インビトロでのトランスフェリンの結合およびマウスリンパ腫細胞成長に対する作用を研究してきた。彼らは、ＩｇＭは細胞成長を阻害したが、ＩｇＧはＴｆＲの下方調節と分解を誘導できるにもかかわらず細胞成長を阻害しなかったことを観察した。しかしながら、抗免疫グロブリン抗体によって架橋されたＩｇＧは、細胞成長を阻害することができた。それに続く研究で、同じチーム（Lesleyら、Exp Cell Res.、182、215〜33、1989）は、ＩｇＧおよびＩｇＭモノクローナル抗ＴｆＲ抗体、ならびにそれらの１価および２価フラグメントの、マウスのリンパ腫の細胞成長およびＴｆＲ発現に対する作用を研究した。彼らは、これらの作用が、抗体の結合価の結果であるトランスフェリン受容体の抗体による架橋形成の程度に依存することを報告している。１価抗体フラグメントは、有意な作用はなかった。２価抗体フラグメントは、その内在化と再利用を損なうことなく、さらに細胞成長を損なうことなく細胞表面受容体発現の下方調節を誘導した。多価ＩｇＭは、細胞表面上での抗体と複合体化した受容体の累積を誘導し、その内在化をブロックし、結果として細胞成長の強い阻害を引き起こした。

【0008】

上記で引用された従来技術によれば、抗ＴｆＲ抗体の増殖抑制特性は、抗体ごとにかなり異なっており、彼らは、トランスフェリンのその受容体への結合をブロックするのかまたはしないのかをそれらの能力に基づき予測できないと考えられる。

【0009】

以前の出版物では（Mouraら、J Exp Med、194、417〜425、2001）、発明者らは、ヒトＴｆＲに結合するＡ２４と名付けられたマウスモノクローナルＩｇＧ（ＩｇＧ２カッパ）を報告している。

【0010】

ＷＯ２００５／１１１０８２は、Ｔ細胞の増殖をブロックできるマウス抗体であるＡ２４抗体を開示しており、これは、Ｔ細胞の増殖の阻害において以前に述べられたｍＡｂ４２／６より効率的であると考えられていた。Ａ２４は、競合的な方式でＴｆがＴｆＲに結合しないようにする。Ａ２４はまた、ＴｆＲ発現および機能が損なわれたＴｆＲの再利用も低減した。Ａ２４はまた、ＡＴＬの急性および慢性形態の両方からの悪性Ｔ細胞のエクスビボにおける増殖をブロックすることもできる（Mouraら、Blood、103、5、1838〜45、2004年3月1日、Callensら、2010； J. Exp. Med.、207巻、4号、731〜750頁）。この抗体はまた、インビトロとインビボの両方においてマントル細胞リンパ腫の腫瘍発達を予防することができるとも記載されている（Lepelletierら、Cancer Res 2007；67：1145〜1154；Callensら、2008、Leukemia、22、42〜48）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】ＷＯ２００５／１１１０８２

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Gillら、N Engl J Med.、332,1744〜1748、1995

【非特許文献2】Hermineら、N Engl J Med.、332、1749〜1751、1995

【非特許文献3】Gatterら、J Clin Pathol.、36、539〜545、1983

【非特許文献4】Faulkら、Lancet.、2、390〜392、1980

【非特許文献5】Shindelmanら、Int J Cancer、27、329〜334、1981

【非特許文献6】TrowbridgeおよびLopez（Proc. Natl Acad Sci USA、79、1175〜1179、1982）

【非特許文献7】Lesleyら（Mol Cell Biol. 5、1814〜21、1985）

【非特許文献8】Lesleyら、Exp Cell Res.、182、215〜33、1989

【非特許文献9】Mouraら、J Exp Med、194、417〜425、2001

【非特許文献10】Mouraら、Blood、103、5、1838〜45、2004年3月1日

【非特許文献11】Callensら、2010； J. Exp. Med.、207巻、4号、731〜750頁

【非特許文献12】Lepelletierら、Cancer Res 2007；67：1145〜1154

【非特許文献13】Callensら、2008、Leukemia、22、42〜48

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

ヒトに投与する場合、現在、免疫原性反応を回避するためにマウス起源の抗体をヒト化することが必須である。しかしながら、Ａ２４抗体の第１のヒト化プロセスを実行する場合、本発明者らは、全てのヒト化バリアントにおいて結合およびアポトーシス特性が損なわれることを見出した。したがって本発明者らは、Ａ２４親抗体の機能特性の維持とヒトへの免疫原性の予測された減少とを組み合わせる数々のヒト化工程で、Ａ２４の特定のバリアントを設計する必要があった。

【課題を解決するための手段】

【0014】

概要
したがって本開示は、単離された抗ＴｆＲ抗体または抗ＴｆＲ抗体の抗原結合部位を有するタンパク質であって、
（ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号８のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｅ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｆ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｇ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｈ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド
のいずれかを含み、ここで前記抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質は、配列番号１６のトランスフェリン受容体に特異的に結合する、上記抗体またはタンパク質に関する。

【0015】

具体的な実施態様において、前記抗体またはタンパク質は、１０ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄで、好ましくは１ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄでトランスフェリン受容体に結合する。
別の具体的な実施態様において、前記抗体またはタンパク質は、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを有する親マウスの可変領域を有する対応するキメラ抗体で測定された誘導レベルに等しいかまたはそれより優れたレベルに、ＨＬ−６０細胞株のアポトーシスを誘導する。

【0016】

好ましくは、本発明の開示に係るこのような抗ＴｆＲ抗体は、ヒト化抗ＴｆＲ抗体である。
前述の実施態様と組み合わせることができる別の具体的な実施態様において、前記抗ＴｆＲ抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの定常領域、または突然変異したもしくは化学的に改変された定常領域を含み、ここで前記突然変異したまたは化学的に改変された定常領域は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を有する対応する抗体と比較した場合、前記抗体にＡＤＣＣ活性を付与しないかまたは減少したＡＤＣＣ活性を付与する。代替として、前記抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの定常領域、または突然変異したもしくは化学的に改変された定常領域を含んでいてもよく、ここで前記突然変異したまたは化学的に改変された定常領域は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を有する対応する抗体と比較した場合、前記抗体に増加したＡＤＣＣ活性を付与する。

【0017】

本発明に係る抗体の例としては、以下に、特定には表１に記載されるような、ヒト化抗ＴｆＲ抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６が挙げられる。
また、医薬品として、または診断剤で使用するための、例えば腫瘍の処置で使用するための、上記で定義された単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質も本明細書で開示される。前記腫瘍は、好ましくは血液系腫瘍であり、例えばリンパ腫または白血病である。

【0018】

代替として、前記単離された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質は、ＨＴＬＶ−１関連疾患の処置においても、ＨＡＭ／ＴＳＰ、多発性筋炎、および関節炎などのＨＴＬＶ−１感染に関連する炎症性疾患におけるウイルス負荷量を低減させるために使用することができる。

【0019】

本開示はさらに、上記で定義された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質を、医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体の１つまたはそれより多くと組み合わせて含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、加えて、他の活性成分を包含していてもよい。

【0020】

具体的な実施態様において、前記組成物は、治療上許容できる量の上記で定義された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質を含む、凍結乾燥製剤、またはプレフィルドシリンジまたはプレフィルドバイアルである。

【0021】

本開示はまた、上記で定義された抗体またはタンパク質の少なくとも重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする単離された核酸；このような核酸の１つまたはそれより多くを含むクローニングまたは発現ベクター、または宿主細胞における上記で定義された抗ＴｆＲ抗体の組換え生産のためのクローニングもしくは発現ベクターにも関する。

【0022】

具体的な実施態様において、クローニングまたは発現ベクターは、以下の核酸、すなわち以下の実施例で定義されるようなｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６のいずれか１つの重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つのいずれかを含む。

【0023】

本発明の開示はまた、１つまたはそれより多くの上記で定義されたクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。
本開示はさらに、上記で定義された抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質を生産するためのプロセスであって、（ｉ）宿主細胞によって前記抗体またはタンパク質を発現させるために、本開示の宿主細胞を培養すること；任意選択で（ｉｉ）前記抗体またはタンパク質を精製すること；および（ｉｉｉ）前記抗体またはタンパク質を回収することを含む、プロセスに関する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】図１は、ＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイに従って測定された、親Ａ２４可変領域を有するキメラＩＮＡ０１抗体と比較した場合の、最初の６種のＩＮＡ０１のヒト化バリアント（ＩＮＡ０１バリアント１〜６）のアポトーシス誘導の欠如を示すグラフである。

【図2】図２は、ＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイに従って測定した場合、２回目のヒト化バリアント（ＩＮＡ０１バリアント７〜１１）によりアポトーシス作用は向上したが、それでもなお親Ａ２４可変領域を有するキメラＩＮＡ０１抗体未満であったことを示すグラフである。

【図3】図３は、ＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイに従って測定された、親Ａ２４可変領域を有するキメラＩＮＡ０１抗体より優れた３回目のヒト化バリアント（ＩＮＡ０１バリアント１２〜１７）の有効なアポトーシス誘導を示すグラフである。

【図4】図４は、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６の生産収量であり、生産された各抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６の量（ｍｇ）が、２つの生産バッチに基づき示される。

【図5a】図５ａは、本開示に係るＶＬ配列の親Ａ２４のＶＬとのアライメントを示す。

【図5b】図５ｂは、本開示に係るＶＨ配列の親Ａ２４のＶＨとのアライメントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

定義
本発明の開示をより容易に理解できるように、まず特定の用語を定義する。追加の定義は詳細な説明中で明示される。

【0026】

用語「免疫応答」は、例えばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記の細胞または肝臓によって生産された可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体など）の作用であって、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞、または自己免疫もしくは病的な炎症のケースでは正常なヒト細胞もしくは組織の選択的な損傷、それらの破壊、またはそれらの人体からの排除をもたらすものを指す。

【0027】

「シグナル伝達経路」または「シグナル伝達活性」は、一般的にタンパク質−タンパク質相互作用、例えば増殖因子の受容体への結合などによって始まり、結果的に細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達をもたらす生化学的な因果関係を指す。一般的に、伝達は、シグナル伝達を引き起こす一連の反応における、１つまたはそれより多くのタンパク質での１つまたはそれより多くのチロシン、セリン、またはスレオニン残基の特異的リン酸化を含む。最後から２番目のプロセスは、典型的には核での事象を包含し、結果として遺伝子発現の変化がもたらされる。

【0028】

ＣＤ７１またはトランスフェリン受容体またはＴｆＲという用語は、別段の記載がない限り配列番号１６で定義されるヒトＴｆＲを指す。
用語「抗体」は、本明細書で記載される場合、全抗体およびそのあらゆる抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部位」）または単鎖を包含する。

【0029】

天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより高度に保存された領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並べられる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子、例えば免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体第１成分（Ｃ１ｑ）などへの結合を媒介することができる。

【0030】

抗体の「抗原結合部位」（または単に「抗原部分」）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の全長または１つもしくはそれより多くのフラグメント（例えばＴｆＲの部分）を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによっても実行できることが示されている。抗体の「抗原結合部位」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントである、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント；Ｖ_ＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント；ヒンジ領域において改変されたＩｇＧ重鎖、例えばＩｇＧ４を有する単一アームからなるユニボディ、ドメイン抗体フラグメント（Wardら、1989 Nature 341：544〜546）、またはＶ_Ｈドメインからなるナノボディフラグメント；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはこのような抗原結合部位を含むあらゆる融合タンパク質が挙げられる。

【0031】

さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、これらをＶＬ領域とＶＨ領域とが対合して１価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Birdら、1988 Science 242：423〜426；および Hustonら、1988 Proc. Natl. Acad。Sci. 85：5879〜5883を参照）を形成する単鎖のタンパク質のようにすることができる合成リンカーによる組換え方法を使用して、ＶＬとＶＨとを接続することができる。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部位」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者公知の従来技術を使用して得られ、フラグメントは、無傷の抗体の場合と同じ方式で、有用性に関してスクリーニングされる。

【0032】

「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ＴｆＲに特異的に結合するが、ＴｆＲ以外の他の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない、単離された抗体）を指す。しかしながら、ＴｆＲに特異的に結合する単離された抗体は、例えば他の種由来のＴｆＲ分子などの他の抗原に交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まないものであり得る。

【0033】

用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用される場合、単一分子の組成を有する抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特異性および特定のエピトープへの親和性を表す。

【0034】

「アイソタイプ」は、本明細書で使用される場合、重鎖定常領域の遺伝子によって提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４など）を指す。

【0035】

成句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では用語「抗原に特異的に結合する抗体」と同義的に使用される。
「抗原に特異的に結合する」、例えば「ＴｆＲに特異的に結合する」抗体またはタンパク質は、本明細書で使用される場合、１００ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、１ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄで前記抗原（例えば配列番号１６のヒトＴｆＲ）に結合する抗体またはタンパク質を指すことが意図される。

【0036】

用語「Ｋ_Ｄ」は、本明細書で用いられる場合、Ｋ_ｄのＫ_ａに対する比率（すなわちＫ_ｄ／Ｋ_ａ）から得られる解離定数を指すことが意図され、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫ_Ｄ値は、当業界において十分に確立されている方法を使用して決定することができる。抗体のＫ_Ｄを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、または例えばビアコア（Biacore）（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる方法である。ビアコア（登録商標）システムで抗ＴｆＲ抗体のＫ_Ｄを測定するためのアッセイは、以下の実施例に記載される。

【0037】

用語「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」または「Ｋ_ａ」は、本明細書で用いられる場合、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を指すことが意図され、それに対して用語「Ｋ_ｄｉｓ」または「Ｋ_ｄ」は、本明細書で用いられる場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。

【0038】

用語「親和性」は、本明細書で使用される場合、単一の抗原性部位における抗体と抗原との相互作用の強度を指す。各抗原性部位内において、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位で弱い非共有結合の力を介して抗原と相互作用し、相互作用が多いと、親和性もより強くなる。

【0039】

用語「結合活性」は、本明細書で使用される場合、抗体−抗原複合体の全体的な安定性または強度の有益な尺度を指す。これは、３つの主要な要因、すなわち抗体エピトープ親和性；抗原と抗体両方の結合価；および相互作用部位の構造的な配列によって制御される。最終的にこれらの要因は、抗体の特異性、すなわち特定の抗体が正確な抗原エピトープに結合する見込みを定義する。具体的な実施態様において、本開示の前記抗ＴｆＲ抗体は、２価抗体である。

【0040】

用語「ＨＬ−６０細胞株」は、本明細書で使用される場合、Collinsら（PNAS1978、75：2458〜1462）によって誘導された前骨髄球細胞株を指し、これは、Gallagherら（Blood、1979、54：713〜733）にも記載されており、例えばＡＴＣＣ（登録商標）コレクションからカタログ番号ＣＣＬ−２４０（商標）で入手可能である。

【0041】

抗体Ａ２４は、本明細書で使用される場合、ＷＯ２００５／１１１０８２で開示されたもののような抗体を指す。
用語「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞傷害」活性は、本明細書で使用される場合、細胞を枯渇させる活性を指す。ＡＤＣＣ活性は、市販のＡＤＣＣアッセイによって、例えば、参照番号Ｇ７０１５のプロメガ（Promega）によって商品化されたような、さらに、実施例で簡単に説明されるようなＡＤＣＣレポーターバイオアッセイによって測定することができる。

【0042】

用語「対象」は、本明細書で使用される場合、あらゆるヒトまたはヒト以外の動物を包含する。用語「ヒト以外の動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えばヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを包含する。

【0043】

用語「最適化」は、本明細書で使用される場合、生産細胞または生物、一般的には真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列がコードされるように、ヌクレオチド配列が変更されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、開始のヌクレオチド配列によって元々コードされていたアミノ酸配列を完全にまたはできる限りを保持するように操作される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列は、最適化されたとも称される。

【0044】

２つの配列間のパーセント同一性は、本明細書で使用される場合、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れたそれらの配列に共通する同一な位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、後述するような数学的なアルゴリズムを使用して達成することができる。

【0045】

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り入れられているE. MeyersおよびW. Miller （Comput. Appl. Biosci.、4：11〜17, 1988）のアルゴリズムを、ＰＡＭ１２０重量残基表（weight residue table）、１２のギャップのレングスペナルティーおよび４のギャップペナルティーで使用して決定することができる。代替として、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http：//www.gcg.comで入手可能）に取り入れられているNeedlemanおよびWunsch（J. Mol, Biol. 48：444〜453、1970）のアルゴリズムを、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイト、および１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトで使用して決定することができる。

【0046】

２つのヌクレオチドアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、例えばアルゴリズムを使用して、例えば核酸配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムを、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較で使用して決定することもできる。

【0047】

組換え抗体
本開示の抗体としては、以下の表１に記載されるような、単離され、それらの可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列ならびにヒト定常アイソタイプによって構造的に特徴付けされたヒト化組換え抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６が挙げられる。

【0048】

【表1】

【0049】

ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６の生成に使用されるＩｇＧ４、ＩｇＧ１およびそれらの突然変異体型であるＩｇＧ１ ＡＡおよびＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａの定常アイソタイプ領域の対応するアミノ酸およびヌクレオチドコード配列は、当業界において周知である。

【0050】

以下の表２に、ｍＡｂ１の全長軽鎖および重鎖ならびに対応するコード配列を示す。

【0051】

【表2】

【0052】

表３に、本開示に係る一部の抗体のＶＨ ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１とも称される）、ＶＨ ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２とも称される）、ＶＨ ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ１とも称される）、ＶＬ ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１とも称される）、ＶＬ ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２とも称される）、ＶＬ ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３とも称される）のアミノ酸配列の例を示す。

【0053】

表３において、本発明の開示の一部の抗体のＣＤＲ領域を、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（Chothia C、Lesk AM. 1987、J Mol Biol 196、901〜917）を使用して詳述する。
読み取りを簡単にするために、ＣＤＲ領域は以降、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ばれる。

【0054】

【表3】

【0055】

一実施態様において、単離された組換え抗体は、配列番号１のＨＣＤＲ１；配列番号２のＨＣＤＲ２；配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；配列番号４のＬＣＤＲ１；配列番号５または８のＬＣＤＲ２；および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有し、ここで前記抗体は、配列番号１６のトランスフェリン受容体に特異的に結合する。

【0056】

具体的な実施態様において、本開示に係る単離された組換え抗体は、
（ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号８のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｅ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｆ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｇ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｈ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチド、および配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド
のいずれかを含み、ここで前記抗ＴｆＲ抗体は、配列番号１６のトランスフェリン受容体に特異的に結合する。

【0057】

具体的な実施態様において、上記で定義された前記組換え抗ＴｆＲ抗体は、以下の特性：
（ｉ）上記抗体が、例えば以下の実施例に記載されるようなＳＰＲによって測定した場合、１０ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄで、好ましくは１ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄでトランスフェリン受容体に結合すること；
（ｉｉ）上記抗体が、以下の実施例に記載されるようなＥＬＩＳＡアッセイで測定した場合、０．１μｇ／ｍｌまたはそれ未満、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌまたはそれ未満のＥＣ５０でトランスフェリン受容体に結合すること；
（ｉｉｉ）上記抗体が、例えばＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイを使用して測定した場合、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを含む親マウスの可変領域を有する対応する参照キメラ抗体で測定された誘導レベルに等しいかまたはそれより優れたレベルに、ＨＬ−６０細胞株のアポトーシスを誘導すること
の１つまたはそれより多くを有する。典型的には、１０μｇ／ｍｌの量の本発明の開示の組換え抗体は、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを含むＡ２４の親マウスの可変領域を有する同量の参照キメラ抗体と比較した場合のＨＬ−６０細胞株のアポトーシスの誘導に関してアッセイされてもよい。試験された抗体のＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイにおけるアポトーシス誘導は、試験された抗体を用いて測定された場合の陽性細胞のパーセンテージが、参照抗体を用いて測定した場合の陽性細胞のパーセンテージより有意に低くない場合、参照抗体に等しい。

【0058】

「対応する」参照キメラ抗体は、本明細書で使用される場合、特定の特性、例えばアポトーシスの誘導に関して試験しようとする抗体のアイソタイプの定常領域に１００％同一なアイソタイプの定常領域を有する参照抗体を指す。

【0059】

前述の実施態様と組み合わせることができる特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、上記で定義した抗体の抗体フラグメントである。
抗体フラグメントとしては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ユニボディ、およびｓｃＦｖフラグメント、ダイアボディ、単一ドメインまたはナノボディおよび他のフラグメントが挙げられる。

【0060】

用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントを指し、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合を許容するには短かすぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を作り出す。

【0061】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部または軽鎖可変ドメインの全てまたは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（ドマンティス社（Domantis, Inc.）、マサチューセッツ州ウォルサム；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）である。

【0062】

抗体フラグメントは、これらに限定されないが、無傷の抗体のタンパク質分解による消化、加えて本明細書に記載されるような組換え宿主細胞による生産などの様々な技術によって作製することができる。

【0063】

特定の実施態様において、本発明の開示の抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体と少なくとも同じ親和性（または優れた親和性）を有しながらヒトへの免疫原性が低減されるようにヒト化される。好ましい実施態様において、本発明の開示の抗体は、親抗体Ａ２４のヒト化抗体である。

【0064】

一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体、例えばマウスＡ２４抗体由来であり、ＦＲ（またはその一部）が、ヒト抗体配列由来である１つまたはそれより多くの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むと予想される。一部の実施態様において、ヒト化抗体における一部のＦＲ残基は、例えば抗体の特異性または親和性を回復または向上させるために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基の元となるＡ２４抗体）由来の対応する残基で置換されている。一部の具体的な実施態様において、ヒト化抗体における一部のＣＤＲ残基も、例えば抗体の特異性または親和性を回復または向上させるために置換されている。

【0065】

ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、AlmagroおよびFransson、Front. Biosci. 13：1619〜1633（2008）で総論されており、例えば、Riechmannら、Nature 332：323〜329（1988）；Queenら、Proc. Natl Acad. Sci. USA 86：10029〜10033（1989）；米国特許第５，８２１，３３７号、７，５２７，７９１号、６，９８２，３２１号、および７，０８７，４０９号；Kashmiriら、Methods 36：25〜34（2005）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトを記載）；Padlan、Mol. Immunol. 28：489〜498（1991）（「リサーフェシング（resurfacing）」を記載）；Dall’Acquaら、Methods 36：43〜60（2005）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；ならびにOsbournら、Methods 36：61〜68（2005）およびKlimkaら、Br. J. Cancer、83：252〜260（2000）（ＦＲシャッフリングへの「ガイド化選択（guided selection）」アプローチを記載）でさらに記載されている。

【0066】

好ましくは、本開示に係る組換え抗体は、ヒト化サイレント抗体、好ましくはヒト化サイレントＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。
用語「サイレント」抗体は、本明細書で使用される場合、ＡＤＣＣ活性アッセイで測定した場合、ＡＤＣＣ活性を示さないかまたは低いＡＤＣＣ活性を示す抗体を指す。

【0067】

一実施態様において、用語「ＡＤＣＣ活性を示さないかまたは低いＡＤＣＣ活性を示す」は、サイレント抗体が、野生型ヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する対応する抗体で観察されるＡＤＣＣ活性の少なくとも１０％未満、例えば５０％未満であるＡＤＣＣ活性を示すことを意味する。

【0068】

サイレント化されたエフェクター機能は、抗体のＦｃ定常部分中の突然変異により得ることができ、当業界において、Strohl 2009（ＡＡおよびＮ２９７Ａ）；Baudino 2008、Ｄ２６５Ａ（Baudinoら、J.Immunol. 181（2008）：6664〜69、Strohl、CO Biotechnology 20（2009）：685〜91）に記載されている。サイレントＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１Ｆｃアミノ酸配列中にＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含むいわゆるＡＡ突然変異体を含む。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、脱グリコシル化または非グリコシル化抗体を生じるＮ２９７Ａ突然変異を含む。

【0069】

突然変異アミノ酸配列を有する抗体は、コード化核酸分子を変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介変異誘発）し、続いて本明細書に記載の機能アッセイを使用して保持された機能（すなわち、上記で明示した機能）に関してコードされた変更された抗体を試験することにより得ることができる。

【0070】

保存的改変を有する抗体
特定の実施態様において、本開示の抗体（またはその抗原結合部分を含む結合タンパク質）は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、ここでこれらのＣＤＲ配列の１つまたはそれより多くは、本明細書に記載のｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６抗体に基づく特定されたアミノ酸配列またはそれらの保存的改変を有し、抗体またはタンパク質は、本開示の抗ＴｆＲ抗体の望ましい機能特性を保持する。

【0071】

抗ＴｆＲ抗体の望ましい機能特性としては、これらに限定されないが、
（ｉ）例えばビアコア（登録商標）を使用したＳＰＲアッセイによって測定した場合、１０ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄで、好ましくは１ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄでトランスフェリン受容体に結合すること；
（ｉｉ）上記抗体が、以下の実施例に記載されるようなＥＬＩＳＡアッセイで測定した場合、０．１μｇ／ｍｌまたはそれ未満、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌまたはそれ未満のＥＣ５０でトランスフェリン受容体に結合すること；
（ｉｉｉ）上記抗体が、例えばＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイを使用して測定した場合、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを含む親マウスの可変領域を有する対応する参照キメラ抗体で測定された誘導レベルに等しいかまたはそれより優れたレベルに、ＨＬ−６０細胞株のアポトーシスを誘導すること
が挙げられる。典型的には、１０μｇ／ｍｌの量の本発明の開示の組換え抗体は、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを含むＡ２４の親マウスの可変領域を有する同量の参照キメラ抗体と比較した場合のＨＬ−６０細胞株のアポトーシスの誘導に関してアッセイされてもよい。試験された抗体のＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイにおけるアポトーシス誘導は、試験された抗体を用いて測定された場合の陽性細胞のパーセンテージが、参照抗体を用いて測定した場合の陽性細胞のパーセンテージより有意に低くない場合、参照抗体に等しい。

【0072】

用語「保存的な配列改変」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるアミノ酸置換を指すことが意図される。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界においてすでに定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つまたはそれより多くのアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよく、変更された抗体は、本明細書に記載の機能アッセイを使用して保持された機能に関して試験されてもよい。

【0073】

改変は、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当業界において公知の標準的な技術によって本開示の抗体に導入することができる。
フレームワークまたはＦｃの操作
本開示の操作された抗体は、例えば抗体の特性を向上させるためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に改変がなされた抗体を包含する。典型的には、このようなフレームワークの改変は、抗体の免疫原性を減少させるためになされる。例えば、１つのアプローチは、１つまたはそれより多くのフレームワーク残基を対応する生殖細胞系の配列に「復帰突然変異」させることである。より具体的に言えば、体細胞変異を受けた抗体は、抗体の元となる生殖細胞系の配列とは異なるフレームワーク残基を含有していてもよい。このような残基は、抗体のフレームワーク配列を抗体の元となる生殖細胞系の配列と比較することによって同定することができる。フレームワーク領域の配列をそれらの生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞変異は、例えば部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発によって、生殖細胞系の配列に「復帰突然変異」させることができる。このような「復帰突然変異した」抗体も、本発明に包含されることが意図される。

【0074】

別のタイプのフレームワーク改変は、フレームワーク領域内の１つまたはそれより多くの残基を突然変異させることを含み、または１つまたはそれより多くのＣＤＲ領域内の残基も突然変異させてもよく、それによりＴ細胞エピトープを除去して、可能性のある抗体の免疫原性を低減させる。

【0075】

特定には、アンチトープ（Antitope）社（英国ケンブリッジ）は、治療抗体およびタンパク質中のＴ細胞エピトープの配置を同定することに基づく、評価および免疫原性の除去のための様々な権利を有する技術を開発してきた。以下にこれらの技術を要約する：
・ ｉＴｏｐｅ（商標）−ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に結合するペプチドを予測するためのインシリコ技術（Perryら 2008 Drugs in R&D、9（6）：385〜396）。

【0076】

・ ＴＣＥＤ（商標）−特に抗体のＶ領域のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングアッセイを使用した研究で同定された公知のＴ細胞エピトープのデータベース（Brysonら 2010 Biodrugs 24（1）：1〜8）。データベースは、共通のモチーフを同定するためのＢＬＡＳＴ検索によって照合することができる（Altschulら 1997 Nucleic Acids Res.（1997） 25：3389〜3402）。

【0077】

フレームワークまたはＣＤＲ領域内になされる改変に加えて、またはその代りに、典型的には抗体の１つまたはそれより多くの機能特性、例えば血清中半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害などを変更するために、本開示の抗体は、Ｆｃ領域内に改変を包含するように操作されてもよい。

【0078】

さらに本開示の抗体は、ここでも抗体の１つまたはそれより多くの機能特性を変更するために、化学的に改変されていてもよいし（例えば、１つまたはそれより多くの化学成分が、抗体に付着していてもよい）、またはそのグリコシル化が変更されるように改変されていてもよい。これらの実施態様のそれぞれは、以下のさらなる詳細に記載される。

【0079】

用語「アイソタイプの定常領域」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で使用される場合、天然の配列のＦｃ領域やバリアントのＦｃ領域など、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに同義的に使用される。ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、一般的に、Ｃ２２６位またはＰ２３０位からＩｇＧ抗体のカルボキシル末端までのアミノ酸残基を含むと定義されている。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けである。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｋ４４７残基）は、例えば抗体の生産または精製中に除去されてもよい。したがって、本開示の抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４４７残基を有するおよび有さない抗体の混合物を有する抗体集団を含んでいてもよい。

【0080】

具体的な一実施態様において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更されるように、例えば増加または減少するように改変される。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第５，６７７，４２５号でさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば軽鎖および重鎖の集合が容易になるように、または抗体の安定性が増加もしくは減少するように変更される。

【0081】

別の実施態様において、抗体のＦｃヒンジ領域が突然変異して、抗体の生物学的半減期が減少する。より具体的には、抗体におけるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の結合が天然のＦｃ−ヒンジドメインのＳｐＡ結合に比べて損なわれるように、１つまたはそれより多くのアミノ酸の突然変異が、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメインの境界領域に導入される。このアプローチは、Wardらによる米国特許第６，１６５，７４５号でさらに詳細に記載されている。

【0082】

別の実施態様において、抗体は、その生物学的半減期が増加するように改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardの米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるように、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの１つまたはそれより多くを導入することができる。代替として、生物学的半減期を増加させるために、Prestaらによる米国特許第５，８６９，０４６号および６，１２１，０２２号に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、抗体はＣＨ１またはＣＬ領域内で変更されていてもよい。

【0083】

さらに他の実施態様において、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能が変更されるように少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによって変更される。例えば、抗体がエフェクターリガンドに関して変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、１つまたはそれより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、両方ともWinterらによる米国特許第５，６２４，８２１号および５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。

【0084】

別の実施態様において、抗体が、Ｃ１ｑ結合を変更したり、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低減もしくは壊滅させたりするように、アミノ酸残基から選択される１つまたはそれより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。

【0085】

別の実施態様において、補体を固定する抗体の能力が変更されるように、１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が変更される。このアプローチは、BodmerらによるＰＣＴ公報ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。

【0086】

さらに別の実施態様において、Ｆｃ領域は、１つまたはそれより多くのアミノ酸を改変することによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させる、および／またはＦｃγ受容体への抗体の親和性を増加させるように改変される。このアプローチは、PrestaによるＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎのための結合部位がマッピングされており、結合が向上したバリアントが記載されている（Shields、R.L.ら、2001 J. Biol. Chem 276：6591〜6604を参照）。

【0087】

他の実施態様において、Ｆｃ領域は、１つまたはそれより多くのアミノ酸を改変することによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を減少させる、および／またはＦｃγ受容体への抗体の親和性を減少させるように改変される。このようなエフェクター機能が減少した、特定にはＡＤＣＣが減少した抗体としては、サイレント抗体が挙げられる。

【0088】

特定の実施態様において、ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインが使用される。一部の具体的な実施態様において、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントの突然変異バリアントが使用され、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するおよび／またはＦｃγ受容体に結合する融合ポリペプチドの能力を低減または排除するサイレントＩｇＧ１ Ｆｃが使用される。ＩｇＧ１アイソタイプのサイレント突然変異体の例は、HezarehらによるJ. Virol 2001年12月；75（24）：12161〜8に記載されるような、２３４および２３５のアミノ酸位置でロイシンがアラニンで置き換えられたＩｇＧ１である。

【0089】

特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの２９７位でのグリコシル化を防ぐサイレントＦｃ突然変異体である。例えば、Ｆｃドメインは、２９７位にアスパラギンのアミノ酸置換を含有する。このようなアミノ酸置換の例は、Ｎ２９７のグリシンまたはアラニンによる置き換えである。

【0090】

さらに別の実施態様において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、脱グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠如している）。グリコシル化は、例えば抗原への抗体の親和性を増加させるように変更されてもよい。このような炭水化物の改変は、例えば抗体配列内の１つまたはそれより多くのグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つまたはそれより多くの可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除を引き起こす１つまたはそれより多くのアミノ酸置換を作製することができ、それによってその部位でのグリコシル化が排除される。このような脱グリコシル化は、抗原への抗体の親和性を増加させる可能性がある。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第５，７１４，３５０号および６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。

【0091】

加えて、または代替として、変更されたタイプのグリコシル化を有する抗体、例えばフコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を増加させた抗体などを作製することもできる。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。このような炭水化物の改変は、例えばグリコシル化機構が変更された宿主細胞で抗体を発現することによって達成することができる。グリコシル化機構が変更された細胞は、当業界においてすでに説明されており、本開示の組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用することができ、それによってグリコシル化が変更された抗体が生産される。例えば、HangらによるＥＰ１１７６１９５は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に崩壊させた細胞株を記載しており、その結果、このような細胞株で発現された抗体は低フコシル化を示すようになる。それゆえに、一実施態様において、本開示の抗体は、低フコシル化パターンを示す細胞株、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の発現が不十分な哺乳類細胞株での組換え発現によって生産される。PrestaによるＰＣＴ公報ＷＯ０３／０３５８３５は、バリアントＣＨＯ細胞株であるＬｅｃｌ３細胞を記載しており、これは、Ａｓｎ（２９７）が連結された炭水化物にフコースを結合させる能力が低減されており、結果としてその宿主細胞で発現された抗体の低フコシル化も引き起こす（Shields, R.L.ら、2002 J. Biol. Chem. 277：26733〜26740も参照）。UmanaらによるＰＣＴ公報ＷＯ９９／５４３４２は、操作された細胞株で発現された抗体がバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、結果として抗体のＡＤＣＣ活性の増加を引き起こすように糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株を記載している（Umanaら、1999 Nat. Biotech. 17：176〜180も参照）。

【0092】

本発明の開示によって予期される本明細書における抗体の別の改変は、ＰＥＧ化もしくはＨＥＳ化（hesylation）または関連技術である。抗体は、例えば抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるために、ＰＥＧ化することができる。抗体をＰＥＧ化するために、抗体またはそれらのフラグメントは、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などと、１つまたはそれより多くのＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに付着するようになる条件下で反応させる。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。用語「ポリエチレングリコール」は、本明細書で使用される場合、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどを誘導体化するのに使用されてきたＰＥＧの形態のいずれかを包含することが意図される。特定の実施態様において、ＰＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は当業界において公知であり、本開示の抗体に適用することができる。例えば、NishimuraらによるＥＰ０１５４３１６およびIshikawaらによるＥＰ０４０１３８４を参照されたい。

【0093】

本発明の開示によって予期される抗体の別の改変は、得られた分子の半減期を増加させるための、少なくとも本開示の抗体の抗原結合領域の、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントなどへのコンジュゲートまたはタンパク質融合である。このようなアプローチは、例えばBallanceら、ＥＰ０３２２０９４に記載されている。

【0094】

別の可能性は、得られた分子の半減期を増加させるための、少なくとも本開示の抗体の抗原結合領域の、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合することが可能なタンパク質への融合である。このようなアプローチは、例えばNygrenら、ＥＰ０４８６５２５に記載されている。

【0095】

具体的な一実施態様において、本開示に係る抗体のエフェクター機能または補体活性化機能は、同じアイソタイプの野生型抗体に比べて低減または排除されている。一形態において、エフェクター機能は、抗体のグリコシル化の低減、抗体アイソタイプを天然にエフェクター機能が低減または排除されたアイソタイプに改変すること、およびＦｃ領域の改変から選択される方法によって低減または排除される。具体的な関連する実施態様において、前記エフェクター機能が低減または排除されたアイソタイプは、ＩｇＧ４アイソタイプである。

【0096】

本開示の抗体をコードする核酸分子
また、本発明の開示の抗ＴｆＲ抗体または関連タンパク質をコードする核酸分子も本明細書で開示される。可変軽鎖ヌクレオチド配列の例は、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６のいずれか１つの可変軽鎖アミノ酸配列をコードする配列であり、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６の配列は、表１および表２から、さらに遺伝子コードを使用して、任意選択で宿主細胞種に応じたコドンバイアスを考慮に入れて、容易に得られる。

【0097】

本発明の開示はまた、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞株でのタンパク質発現に最適化されたｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６の配列に由来する核酸分子にも関する。
核酸は、全細胞で提供されてもよいし、細胞溶解産物で提供されてもよいし、または一部精製された形態または実質的に純粋な形態の核酸であってもよい。核酸は、標準的な技術、例えばアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当業界において周知の他の技術などによって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸またはタンパク質から精製されている場合、「単離されている」または「実質的に純粋にされている」。F. Ausubelら編、1987 Current Protocols in Molecular Biology、Greene PublishingおよびWiley Interscience、ニューヨークを参照されたい。本開示の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含有していてもよいし、または含有していなくてもよい。一実施態様において、核酸は、例えばファージディスプレイベクターなどのベクター中に、または組換えプラスミドベクター中に提供されてもよい。

【0098】

本開示の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して得ることができる。例えばＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントはさらに、例えば可変領域遺伝子が全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂフラグメント遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換されるように、標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作されてもよい。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメント（例えば表１で定義されるＶＬおよびＶＨ）は、別のＤＮＡ分子に、または例えば抗体定常領域またはフレキシブルなリンカーなどの別のタンパク質をコードするフラグメントに作動可能に連結される。用語「作動可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、例えば、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされたアミノ酸配列がフレーム内に残るように、または望ましいプロモーターの制御下でタンパク質が発現されるように２つのＤＮＡフラグメントが機能的な方式で接続されることを意味することが意図される。

【0099】

ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結させることによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当業界において公知であり（例えば、Kabat, E.A.ら、1991年、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であってもよい。一部の実施態様において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、例えばヒトＩｇＧ１アイソタイプのなかから選択される。他の実施態様において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプ、例えばヒトＩｇＧ４アイソタイプのなかから選択される。Ｆａｂフラグメントの重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されていてもよい。

【0100】

ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結させることによって、全長軽鎖遺伝子（同様にＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当業界において公知であり（例えば、Kabat, E. A.ら、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。

【0101】

ｓｃＦｖ遺伝子を作り出すために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、ＶＬおよびＶＨ領域がフレキシブルなリンカーによって接続された連続した単鎖タンパク質としてＶＨおよびＶＬ配列を発現できるように、フレキシブルなリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）_３をコードする別のフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Birdら、1988 Science 242：423〜426； Hustonら、1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879〜5883；McCaffertyら、1990 Bird 348：552〜554を参照）。

【0102】

モノクローナル抗体を生産するトランスフェクトーマの生成
本発明の開示の抗体は、例えば当業界において周知の組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション方法との組合せを使用して、宿主細胞のトランスフェクトーマで生産することができる（例えば、Morrison, S.（1985）Science 229：1202）。

【0103】

例えば、抗体、またはその抗体フラグメントを発現させるために、部分的または全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学または生化学的技術（例えば、ＤＮＡ化学合成、ＰＣＲ増幅または目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）によってより得ることができ、このようなＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターに挿入することができる。用語「作動可能に連結される」は、この文脈において、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、それらの意図された抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する機能を提供するように、抗体遺伝子がベクターにライゲートされていることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選ばれる。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されていてもよく、またはより典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメント上の相補的制限部位とベクターとのライゲーション、または制限部位が存在しない場合、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、望ましいアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターにそれらを挿入することによってあらゆる抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作り出すのに使用することができる。加えて、または代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードしていてもよい。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがフレーム内で抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよいし、または異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。

【0104】

抗体鎖遺伝子に加えて、本明細書で開示された組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含することが意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185、アカデミック・プレス（Academic Press）、カリフォルニア州サンディエゴ、1990）に記載されている。当業者であれば、調節配列の選択を包含する発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現のレベルなどの要因に依存する可能性があることが理解されると予想される。哺乳類宿主細胞発現のための調節配列としては、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどが挙げられる。代替として、例えばユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列も使用することができる。さらにその上、調節エレメントは、例えばＳＶ４０初期プロモーター由来の配列を含有するＳＲａプロモーター系、およびヒトＴ細胞性白血病ウイルス１型のロングターミナルリピートなどの異なる源由来の配列で構成されていてもよい（Takebe、Y.ら、1988 Mol. Cell. Biol. 8：466〜472）。

【0105】

抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の開示の組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子などを有していてもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てのAxelらによる米国特許第４，３９９，２１６号、４，６３４，６６５号および５，１７９，０１７号を参照）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を用いたｄｈｆｒ−宿主細胞で使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。

【0106】

軽鎖および重鎖を発現させるために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、原核または真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般的に使用される多種多様の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションおよび同種のものを包含することが意図される。原核または真核宿主細胞のどちらでも本発明の開示の抗体を発現させることが、理論上可能である。真核細胞、例えば哺乳類宿主細胞、酵母または糸状菌における抗体の発現が論じられているが、これは、このような真核細胞、特定には哺乳類細胞が、適切にフォールディングした免疫学的に活性な抗体を集合させ分泌させる可能性が原核細胞より高いためである。

【0107】

具体的な一実施態様において、本開示に係るクローニングまたは発現ベクターは、好適なプロモーター配列に作動可能に連結されたｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６のいずれか１つの重鎖および軽鎖のコード配列の１つを含む。

【0108】

本開示の組換え抗体を発現させるための哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、R.J.KaufmanおよびP.A.Sharp、1982 Mol. Biol. 159：601〜621に記載されるように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用される、UrlaubおよびChasin、1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216〜4220に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞など）、ＣＨＯＫ１ ｄｈｆｒ＋細胞株、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞、例えばＧＳ Ｘｃｅｅｄ（商標）遺伝子発現系（ロンザ（Lonza））と併用されるＧＳ ＣＨＯ細胞株が挙げられる。

【0109】

抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入されると、抗体は、宿主細胞中で抗体を発現させるのに十分な期間、任意選択で宿主細胞を成長させている培養培地に抗体が分泌されるのに十分な期間にわたり宿主細胞を培養することによって生産される。抗体は、例えば培養培地から、それらの分泌後に、標準的なタンパク質精製方法を使用して回収および精製することができる（例えばAbhinavら、2007、Journal of Chromatography 848： 28〜37を参照）。

【0110】

具体的な一実施態様において、本開示の宿主細胞は、それぞれ好適なプロモーター配列に作動可能に連結されたｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６の発現に好適なコード配列を有する発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞である。

【0111】

次いで上記宿主細胞は、それぞれｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６からなる群から選択される本開示の抗体の発現および生産に好適な条件下でさらに培養してもよい。
イムノコンジュゲート
別の形態において、本発明の開示は、治療成分、例えば細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素などにコンジュゲートされた、本明細書で開示される抗ＴｆＲ抗体、またはそのフラグメントを特徴とする。このようなコンジュゲートは、本明細書では、「イムノコンジュゲート」と称される。１つまたはそれより多くの細胞毒素を包含するイムノコンジュゲートは、「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞傷害性物質としては、細胞に有害な（例えば細胞を殺滅する）あらゆる薬剤が挙げられる。例としては、タキサン（taxon）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。また治療剤としては、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アブレーション剤（ablating agent）（例えば、メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロラムブシル（chloraxnbucil）、メルファラン（meiphalan）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げられる。

【0112】

細胞毒素は、当業界において利用可能なリンカー技術を使用して本発明の開示の抗体にコンジュゲートされていてもよい。細胞毒素を抗体にコンジュゲートするのに使用されてきたリンカータイプの例としては、これらに限定されないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチドを含有するリンカーが挙げられる。例えば、リソソーム区画内で低いｐＨによって切断されやすい、またはプロテアーゼ、例えばカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの腫瘍組織で優先的に発現されるプロテアーゼなどによって切断されやすいリンカーを選ぶことができる。

【0113】

細胞毒素、リンカーのタイプ、および治療剤を抗体にコンジュゲートするための方法のさらなる議論については、抗体薬物コンジュゲートの総論に関するPanowksi Sら、2014年1月1日；6（1）：34〜45も参照されたい。

【0114】

また本発明の開示の抗体を放射性同位体にコンジュゲートして、ラジオイムノコンジュゲートとも称される細胞傷害性の放射性医薬品を生成してもよい。診断または治療に使用するための抗体にコンジュゲートすることができる放射性同位体の例としては、これらに限定されないが、ヨウ素^１３１、インジウム^１１１、イットリウム^９０、およびルテチウム^１７７が挙げられる。ラジオイムノコンジュゲートを調製するための方法は、当業界において確立されている。

【0115】

二重特異性または多重特異性分子
別の形態において、本発明の開示の抗ＴｆＲ抗体を含む二重特異性または多重特異性分子がさらに本明細書で開示される。抗体を、誘導体化するか、または別の機能的な分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体、または受容体の場合はリガンド）に連結して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。抗体を、実際に誘導体化するか、または１つより多くの他の機能的な分子に連結して、２つより多くの異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成することもでき、このような多重特異性分子も、本明細書で使用される場合、用語「二重特異性分子」に包含されることが意図される。二重特異性分子を作り出すために、本発明の抗体は、二重特異性分子が生じるように、例えば別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣剤などの１つまたはそれより多くの他の結合分子に（例えば、化学的カップリング、遺伝学的な融合、非共有結合による結合またはそれ以外の方法で）機能的に連結させることができる。

【0116】

したがって、本発明の開示は、ＴｆＲ、例えばｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６のいずれか１つの１つの抗原結合部位のための少なくとも１つの第１の結合特異性と、第２の標的エピトープのための第２の結合特異性とを含む二重特異性分子を包含する。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープとは異なるＴｆＲの別のエピトープである。

【0117】

加えて、二重特異性分子が多重特異性である実施態様の場合、分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて第３の結合特異性をさらに包含していてもよい。
一実施態様において、本明細書で開示される二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体、またはそれらの抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ユニボディまたは単鎖Ｆｖなどを含む。また抗体は、軽鎖または重鎖二量体、またはそれらのあらゆる最小のフラグメント、例えばLadnerらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるようなＦｖまたは単鎖コンストラクトなどであってもよい。

【0118】

本明細書で開示される二重特異性分子で採用することができる他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
本発明の開示の二重特異性分子は、当業界において公知の方法を使用して結合特異性を有する成分をコンジュゲートすることによって調製できる。例えば、二重特異性分子のそれぞれの結合特異性を別々に生成し、次いで互いにコンジュゲートしてもよい。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合によるコンジュゲーションのために様々なカップリング剤または架橋剤を使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、および４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovskyら、1984 J. Exp. Med. 160：1686； Liu、MAら、1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：8648を参照）。他の方法としては、Paulus、1985 Behring Ins. Mitt. 78号、118〜132；Brennanら、1985 Science 229：81〜83）、およびGlennieら、1987 J. Immunol. 139： 2367〜2375に記載されている方法が挙げられる。

【0119】

代替として、両方の結合特異性を同じベクターにコードして、同じ宿主細胞中で発現させ、集合させてもよい。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）_２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子、または２つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子であってもよい。

【0120】

二重特異性分子のそれらの特異的な標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害およびアポトーシス）、またはウェスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、一般的に、目的の複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を採用することによって、特定の関心のあるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。

【0121】

本発明の開示の抗体は、人工Ｔ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）としても公知）を調製するのにも使用することができる。例えば、抗体の可変領域を使用して、スペーサーを介してＴＣＲの膜貫通ドメインおよびシグナル伝達エンドドメイン（例えばＣＤ３ゼータ）に連結されたｓｃＦｖを形成することができ、さらにＴ細胞表面で生産させることができる。このようなＣＡＲは、例えば増殖性障害を処置するための養子移入療法で使用することができる。

【0122】

医薬組成物
別の形態において、本発明の開示は、医薬的に許容される担体と共に製剤化された、本明細書で開示された抗体の１つまたは組合せ、例えばｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６からなる群から選択される１つの抗体を含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。このような組成物は、上述したような（例えば、２つまたはそれより多くの異なる）抗体、またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性分子の１つまたは組合せを包含していてもよい。

【0123】

本明細書で開示される医薬組成物はまた、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの抗ウイルス剤、抗炎症剤または別の増殖抑制剤と組み合わされた、本発明の開示の抗ＴｆＲ抗体、例えばｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６からなる群から選択される１つの抗体を包含し得る。併用療法で使用できる治療剤の例は、以下の本開示の抗体の使用に関するセクションでより詳細に記載される。

【0124】

「医薬的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、および同種のものを包含する。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に好適なものと予想される。一実施態様において、担体は、皮下経路に好適なものと予想される。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、イムノコンジュゲート、または二重特異性分子は、化合物を不活性化する可能性がある酸および他の天然条件の作用から化合物を保護する材料でコーティングされていてもよい。

【0125】

医薬的に許容される担体の一例は、滅菌リン酸緩衝塩類溶液である。他の好適な担体は、当業者周知である（例えば、Gennaro（編）、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Company、第19版、1995）を参照）。製剤は、１つまたはそれより多くの賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を防止するアルブミンなどをさらに包含していてもよい。

【0126】

医薬組成物の形態、投与経路、投薬およびレジメンは、当然ながら、処置しようとする状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重、および性別などによって決まる。
本開示の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼球内投与などのために製剤化することができる。

【0127】

好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のために医薬的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特定には、等張の滅菌塩類溶液（リン酸モノナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムおよび同種のもの、またはこのような塩の混合物）であってもよいし、または場合に応じて滅菌水または生理的塩類溶液の添加時に、注射用溶液の調製を許容する、乾燥した、特にフリーズドライした組成物であってもよい。

【0128】

投与に使用される用量は、様々なパラメーターに応じて、特定には使用される投与様式に応じて、関連する病状に、または代替として処置の望ましい持続時間に適合させることができる。

【0129】

医薬組成物を調製するために、有効量の抗体は、医薬的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散させてもよい。
注射用途に好適な医薬の形態としては、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコールを包含する製剤；および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末または凍結乾燥物が挙げられる。いずれの場合でも、このような形態は、滅菌されていなければならず、さらに、容易に注射器で使用できる程度に流体でなければならない。これらは、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、さらに、例えば細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。

【0130】

遊離塩基または薬理学的に許容できる塩としての活性化合物の溶液は、好適には例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と混合された水中で調製することができる。また分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で調製することもでき、油中で調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含有する。

【0131】

本開示の抗体は、中性または塩の形態で組成物に配合することができる。医薬的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基で形成される）が挙げられ、例えば塩化水素酸またはリン酸などの無機酸で、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される酸付加塩が挙げられる。また遊離のカルボキシル基で形成された塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基から、さらに、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。

【0132】

担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、および同種のもの）、好適なそれらの混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒度の維持によって、界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、および同種のものによって行うことができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを包含することがより好ましいと予想される。注射用組成物の持効性吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによって行うことができる。

【0133】

滅菌注射用溶液は、活性化合物を、必要な量で適切な溶媒に、必要に応じて上記で列挙された様々な他の成分と共に取り込むこと、それに続いてろ過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌した活性成分を、基礎となる分散媒および上記で列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌したビヒクルに取り込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ技術であり、それにより、前もって滅菌ろ過した活性成分に加えてあらゆる追加の望ましい成分の溶液からそれらの粉末が得られる。

【0134】

極めて迅速に浸透させて、高濃度の活性薬剤を小さい腫瘍領域に送達するために、溶媒としてＤＭＳＯの使用が想定される場合、直接注射のためのより濃縮された、または高度に濃縮された溶液の調製も予期される。

【0135】

製剤化されたら、溶液は、投与製剤に適合する方式で、さらに治療上有効であるような量で投与されると予想される。製剤は、例えば上述した注射用溶液のタイプなどの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルおよび同種のものも採用することができる。

【0136】

水溶液中での非経口投与の場合、例えば、溶液は、好適には必要に応じて緩衝化され、液体希釈剤はまず十分な塩類溶液またはグルコースで等張にされると予想される。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下および腹膜内投与に好適である。この点について、採用することができる滅菌水性媒体は、本発明の開示の観点から当業者公知であると予想される。例えば、１回の投薬量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解させて、１０００ｍｌの皮下注入用流体に添加してもよいし、または提唱される注入部位に注射してもよい（例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照）。処置される対象の状態に応じて、多少の投薬量の変動が必然的に生じる可能性がある。いずれの場合においても、投与の担当者が個々の対象につき適切な用量を決定すると予想される。

【0137】

本開示の抗体は、約０．０００１から１．０ミリグラム、または約０．００１から０．１ミリグラム、または約０．１から１．０、またはさらには１．０から約１０ミリグラム／用量が含まれるように治療混合物中に配合されてもよい。また複数回の用量を投与することもできる。

【0138】

例えば静脈内または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、他の医薬的に許容される形態としては、例えば、経口投与のための錠剤または他の固体；持続放出カプセル；および現在使用されている他のあらゆる形態が挙げられる。

【0139】

特定の実施態様において、抗体を宿主細胞に導入するために、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が予期される。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は、当業者公知である。

【0140】

ナノカプセルは、一般的に、化合物を安定で再現可能な方法で閉じ込めることができる。細胞内におけるポリマーの過剰負荷による副作用を回避するために、このような超微細な粒子（約０．１μｍのサイズ）は、一般的に、インビボで分解可能なポリマーを使用して設計される。これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子が本発明の開示で使用するために予期され、このような粒子は、容易に作製することができる。

【0141】

リポソームは、水性媒体中に分散されているリン脂質から形成され、自発的に多層同軸の二分子層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成する。ＭＬＶは、一般的に２５ｎｍから４μｍの直径を有する。ＭＬＶを超音波破砕すると、２００から５００Åの範囲の直径を有し、コア中に水溶液を含有する小型単層小胞（ＳＵＶ）の形成が起こる。リポソームの物理特性は、ｐＨ、イオン強度および２価カチオンの存在に依存する。

【0142】

本開示の抗体またはタンパク質の使用および方法
本発明の開示の抗体またはタンパク質は、インビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、例えばインビトロまたはインビボで培養物中の細胞に投与してもよいし、または様々な障害を処置、予防または診断するために例えばインビボで対象に投与してもよい。

【0143】

本開示の抗体は、細胞の増殖を阻害できることに加えて、例えばＴ細胞などの高度に増殖する細胞のアポトーシスも誘導することができる。
本発明の開示の抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質を、薬物として、特定には、細胞増殖性の障害、例えば、高いレベルのＴｆＲを発現する腫瘍、より具体的には、血液系腫瘍、例えばリンパ腫など、特定にはＡＴＬ、ＭＣＬ、ホジキン病、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、急性白血病（骨髄性およびリンパ性）、加えて固形腫瘍、例えば腎臓癌、肺がん（小細胞）などを処置、予防または診断することにおいて使用するための薬物として使用することが、本明細書において予期される。

【0144】

ＨＴＬＶ−１関連障害を処置、予防または診断することにおいて使用するための、特定には、ＨＡＭ／ＴＳＰ、多発性筋炎、および関節炎などのＨＴＬＶ−１感染に関連する炎症性疾患におけるウイルス負荷量を低減するための、本発明の開示の抗体がさらに開示される。

【0145】

本開示はまた、治療上効率的な用量の本発明の抗体を含む組成物を投与することによって、ヒト血液細胞におけるトランスフェリンの取り込みを減少または抑制するための方法にも関する。

【0146】

上記で開示されたように使用するための抗体またはタンパク質は、例えば上述の疾患を処置または予防するために、唯一の活性成分として、または他の薬物、例えば抗ウイルス剤、抗炎症剤または細胞傷害剤、増殖抑制剤、化学療法剤もしくは抗腫瘍剤と併用して、例えばこれらの薬物に対するアジュバントとして、またはこれらの薬物と併用されるアジュバントとして、投与されてもよい。

【0147】

例えば、上記で開示されたように使用するための抗体は、ＡＺＴ、ＩＦＮ−アルファ、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、抗ＣＤ２５ｍＡｂ、化学療法剤と組み合わせて使用してもよい。
好適な抗新生物剤としては、これらに限定されないが、アルキル化剤（例えばシクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ニトロソウレア（nitrosurea）、テモゾロミドなど）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシンなど）、タキサン（例えばパクリタキセル、ドセタキセルなど）、エポチロン、トポイソメラーゼＩの阻害剤（例えばイリノテカンまたはトポテカンなど）、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤（例えばエトポシド、テニポシド、またはタフルポシド（tafluposide）など）、ヌクレオチド類似体および前駆類似体（例えばアザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル（flurouracil）、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキセート、またはチオグアニンなど）、ペプチド系抗生物質（例えばカルボプラチン、シスプラチンおよびオキサリプラチンなど）、レチノイド（例えばトレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテンなど）、ビンカアルカロイドおよび誘導体（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンなど）、キナーゼ阻害剤などの標的療法（例えばイブルチニブ、イデラリシブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブなど）、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ、カーフィルゾミブなど）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばボリノスタットまたはロミデプシンなど）を挙げることができる。

【0148】

前述の内容に従って、本発明の開示はよりさらなる形態を提供する：
上記で定義された方法は、治療有効量の本開示の抗ＴｆＲ抗体またはタンパク質と、少なくとも１つの第２の医薬物質とを、例えば同時または順番に共投与することを含み前記第２の医薬物質は、例えば上記で示したような抗ウイルス剤または増殖抑制剤である。

【0149】

一実施態様において、本開示の抗体またはタンパク質は、ＴｆＲのレベル、またはＴｆＲを含有する細胞のレベルを検出するのに使用することができる。これは、例えば、抗体とＴｆＲとの間で複合体の形成を可能にする条件下でサンプル（例えばインビトロのサンプルなど）および対照サンプルを抗ＴｆＲ抗体と接触させることによって達成することができる。抗体とＴｆＲとの間で形成されたあらゆる複合体が検出され、サンプルと対照とで比較される。例えばＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイなどの標準的な検出方法が当業界において周知であり、本開示の組成物を使用して実行することができる。

【0150】

したがって、一形態において、本開示はさらに、サンプル中のＴｆＲ（例えば、ヒトＴｆＲ抗原）の存在を検出する、またはＴｆＲの量を測定するための方法であって、抗体またはその部分とＴｆＲとの複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルおよび対照サンプルを、本開示の抗体もしくはタンパク質、またはＴｆＲに特異的に結合するそれらの抗原結合領域と接触させることを含む、方法を提供する。次いで複合体の形成が検出され、ここでサンプルと対照サンプルとを比較した複合体形成における差が、サンプル中のＴｆＲの存在を示す。

【0151】

また、本明細書で開示された組成物（例えば、抗体、タンパク質、ヒト化抗体、コンジュゲート抗体および多重特異性分子）および使用説明書からなるキットも本発明の開示の範囲内である。キットはさらに、少なくとも１つの追加の試薬、または１つまたはそれより多くの追加の抗体またはタンパク質（例えば、第１の抗体とは異なる標的抗原上のエピトープに結合する相補活性を有する抗体）を含有していてもよい。キットは、典型的には、キット内容物の意図された使用を表示するラベルを包含する。ラベルという用語は、キット上にもしくはキットと共に供給された、またはそれ以外の方法でキットに付随するあらゆる書込みまたは記録材料を包含する。キットは、患者が、上記で定義されたような抗ＴｆＲ抗体処置に応答すると予想されるグループに属するかどうかを診断するためのツールをさらに含んでいてもよい。

【0152】

詳細に説明されてきた本発明をここで以下の実施例によってをさらに例示するが、これらは単なる例示にすぎず、さらなる限定を意味しない。

【実施例】

【0153】

方法
１．ＥＬＩＳＡによる親和性の試験
抗体の特異性を決定するために、ＥＬＩＳＡ試験を以下のプロトコールを使用して適用することができる。組換えヒトＴｆＲ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）から入手されるもの等、カタログ番号２４７４−ＴＲ）を９６ウェルのプレート上に一晩かけて直接コーティングし、抗体（マウスおよびヒト化ｍＡｂ）の数種の希釈物（１０種）と共にインキュベートする前に２回洗浄して（希釈は、５０μｇ／ｍｌの濃度から開始して０，００１μｇ／ｍｌまでであり得る）、室温で１時間インキュベートする。２回の洗浄後、二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧを室温で１時間、暗所でインキュベートし、２回洗浄し、４５０ｎｍで吸光度を読み取る前に１０分間ＴＭＢ溶液と共にインキュベートする。

【0154】

２．表面プラズモン共鳴（ビアコア（Biacore）システム）を使用した親和性の決定
Ｋ_Ｄ値の決定のために、表面プラズモン共鳴技術を、後述するようなビアコア（Biacore）（商標）技術を使用して適用することができる：
ヒスチジンタグを有するヒトＴｆＲ（Ｒ＆Ｄシステムズから入手されるもの等、カタログ番号２４７４−ＴＲ）を、共有結合で固定されたペンタ−Ｈｉｓ ｍＡｂ ＣＭ５センサーチップ上に通過させた後に結合させた。１０種の異なる抗体濃度（１〜５００ｎＭ）を抗Ｈｉｓ／ＴｆＲ−Ｈｉｓ表面全体に４分かけて注入し、複合体の解離を５分間追跡した。時間の単一指数関数を使用したＢＩＡｅｖａｌｕｔｉｏｎソフトウェアに実装された非線形二乗アルゴリズムを用いて、結合および解離プロファイルの両方を分析する。

【0155】

３．ＡＤＣＣアッセイ
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害は、抗体ベースの薬物を使用した標的がん細胞の殺滅にとって望ましいメカニズムである。抗体は、細胞表面上の標的抗原に結合する。さらに標的が結合した抗体のＦｃエフェクター部分がエフェクター細胞（優勢にはナチュラルキラー細胞）の細胞表面上のＦｃγＲＩＩＩａ受容体にも結合したら、２つの細胞型の複数の架橋が生じ、ＡＤＣＣの経路活性化がもたらされる。標的細胞の殺滅は、この経路活性化の終点であり、エフェクター細胞としてドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の部分集団を使用する典型的なＡＤＣＣバイオアッセイで使用される。ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイコンプリートキット（ADCC Reporter Bioassay Complete Kit、プロメガ（Promega）、Ｇ７０１５）は、抗ＣＤ２０ベースのＡＤＣＣレポーターバイオアッセイを実行するのに必要な要素および試薬の全てを含有する。ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、ＡＤＣＣ経路活性化における初期のポイントでは、代替の読み出し、エフェクター細胞におけるＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核内因子）経路を介した遺伝子転写の活性化を使用する。加えて、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、エフェクター細胞としてホタルルシフェラーゼの発現を開始させるＦｃγＲＩＩＩａ受容体およびＮＦＡＴ応答エレメントを安定して発現する操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を使用する。ＡＤＣＣにおける抗体生物活性は、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として生産されたルシフェラーゼを介して定量化され、エフェクター細胞におけるルシフェラーゼ活性は、発光の読み出しで定量化される。ヒト化ｍＡｂと比較するための陽性対照として、キットは、抗ＣＤ２０抗体を提供する。

【0156】

４．ＨＬ−６０およびＰＨＡで活性化されたＴ細胞のアポトーシス誘導アッセイ
アポトーシスアッセイのために、２４ウェルプレートで、４００μｌ中細胞１００×１０^３個／ウェルの濃度で細胞をインキュベートした。その後、細胞は、マウスまたはヒト化抗体での数種の希釈物（２００μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌまで）の存在下で３および４日インキュベートされる。インキュベーション時間後、細胞を遠心分離して、アネキシンＶおよびＴｒｏｐｏ３の存在下でフローサイトメトリー分析の前に１５分間標識する。

【0157】

５．生産性アッセイ（４００ｍｌ）
生産性の試験のために、重鎖について、ＶＨ遺伝子を合成し、発現ベクターｐＸＣＩｇＧ（ΔＫ）にクローニングした。軽鎖はこれまでにｐＸＣカッパベクターにサブクローニングされていた。４００ｍｌの体積（振盪フラスコ）で、１６種の抗体をＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ細胞で一時的に発現させた。生産された抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。全ての抗体バリアントにつき、予測された吸光係数（１．４９）を使用して抗体濃度を決定した。バリアントの完全性を、還元および非還元条件の両方でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。

【0158】

実施例ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６
表１に記載される実施例ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６は、従来の抗体組換え生産および精製プロセスを使用して生産することができる。
例えば、コード配列は、哺乳類生産細胞株での組換え発現のために生産ベクターにクローニングされる。
以下の表４および５に、本発明を実施するのに有用な、特定には本発明の開示の核酸、発現ベクターおよび抗体を生産するための、詳細なアミノ酸およびヌクレオチド配列を提供する。

【0159】

【表4】

【0160】

【表5-1】

【0161】

【表5-2】

【0162】

結果
Ａ２４の機能的なヒト化抗体の設計
ヒト化
ヒト化手順を下記で概説されるようにして実行した：
１．親抗体のドメインおよび領域を同定した。
２．親抗体の配列を一連の参照配列と並べた。
３．親タンパク質の３次元構造モデルを構築した。
４．収集されたデータに基づいて各位置を置換する可能性に関する最初の評価を行い、位置を類別した。
５．必要であればヒト化バリアントの構造モデルを構築して、可能性のある置換の構造的な分析に関して親のモデルと比較した。
６．親配列とアクセプター配列との間で異なる位置を分析することによってＣＤＲグラフティングを行った。寄与する位置は概ね保持されたが、アクセプターフレームワークとの親和性および適合性へのそれらの生じ得る影響に基づき、このような置換が比較的好都合である場合のみ置換された。
７．ヒト化軽鎖および重鎖のバリアントの組合せの最終的なセットを設計した。

【0163】

配列の注釈
保存されたドメインデータベース（ＣＤＤ）（Marchler-Bauerら、2011）を使用して、各アミノ酸鎖のドメインの内容および各ドメインの隣接する境界を決定した。可変ドメインの境界を、数々の一般的に使用される定義（KabatおよびWu、1991、ChothiaおよびLesk、1987年であり、これらは、Al-Lazikaniら、1997、HoneggerおよびPlucktuhn、2001でアップデートされた）に従って相補性決定領域（ＣＤＲ）の境界と共に正確に決定した。アップデート済みのChothiaのＣＤＲ定義（Al-Lazikaniら、1997）が使用されており、その場合の位置的な番号付けには1987年のChothiaの番号付けが使用されている。

【0164】

配列アライメント
親配列のマウスおよびヒト生殖細胞系配列に対する多重アライメントを、ＭＡＦＦＴ（Katohら、2002）を使用して生成し、各アライメントにおけるエントリーを親配列に対する配列同一性（ＳｅｑＩＤ）に従って順番付けした。１００％のＳｅｑＩＤでクラスター化し、冗長なエントリーを排除することによって、参照セットを配列の固有のセットにまで減らした。

【0165】

臨界的な位置における残基の同定
抗体Ｆｖは、ＶＨ／ＶＬの鎖間境界を構成するか、またはＣＤＲのうち５つにつき定義された正規の構造の別個のセットに関与する多数の臨界的な位置を有し（ChothiaおよびLesk、1987、MartinおよびThornton、1996、Al Lazinikiら、1997）、これらの位置は、それらに置換が提唱される前に、詳細に考慮されると予想される。親抗体のヒト生殖細胞系に対する配列アライメントに基づき、最も近くに適合したエントリーを同定した。最適なヒト生殖細胞系のアクセプターとしての同定は、以下に列挙した順番付けされた基準：
１．フレームワーク全体にわたる配列同一性、
２．同一なまたは適合する鎖間境界の残基、
３．親ＣＤＲの正規のコンフォメーションを有する支持ループ、
４．生殖細胞系の重鎖および軽鎖の組合せが発現された抗体に見出されること
に基づきなされた。

【0166】

３Ｄモデルの構築
親マウスの抗体およびそのバリアントのＦｖ領域の構造モデルを、ロンザのモデリングプラットフォームを使用して生成した。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）に加えて全長Ｆｖの候補の構造テンプレートフラグメントを、標的に対するそれらの配列同一性、加えてテンプレート構造の定性的な結晶学的尺度、例えば解像度（オングストローム（Å）で）などに基づいて社内の抗体データベースからスコア付けし、ランク付けし、選択した。

【0167】

ＦＲテンプレートに対してＣＤＲを構造的に並べるために、ＣＤＲテンプレート中にＣＤＲのいずれかの側に５つの残基を入れた。オーバーラップするセグメントに基づいてフラグメントのアライメントを生成し、構造的な配列アライメントを生成した。テンプレートフラグメントをアライメントと共にＭＯＤＥＬＬＥＲによって加工した（Saliら、1993）。

【0168】

このプロトコールは、並べられた構造テンプレートのセットから生じるコンフォメーション上の制約を作り出す。制約を満たす構造の全体的調和は、コンジュゲートの勾配と模擬されたアニーリング最適化手順によって作り出される。この全体的調和から、タンパク質構造およびコンフォメーション上の制約の達成のスコアから得られるエネルギースコアに基づき１つまたはそれより多くのモデル構造が選択される。モデルを検査し、標的とテンプレートとで異なる位置の側鎖を、側鎖最適化アルゴリズムを使用して最適化し、エネルギーを最小化した。

【0169】

一連の可視化およびコンピューターツールを使用して、コンフォメーション上のＣＤＲの変動に加えて、ドメインおよび領域のコアのおよび局所的なパッキングならびに表面分析を評価し、１つまたはそれより多くの好ましいモデルを選択した。

【0170】

モデル化された構造の比較
親のおよびヒト化Ｆｖ領域の構造モデルを上述したように個々にモデル化して、バリアントモデルが、親のモデル構造へのいかなる固有のバイアスも伴わずに構築されたことを確認する。しかしながら、ヒト化バリアントの親の配列に対する高い配列同一性のために、しばしば同一な構造テンプレートが多くのモデルで選択されることになる。

【0171】

異なる置換の親和性および安定性への影響を評価するために、多数の構造的な基準が使用される。主要な基準は、溶媒の接近性、局所的な原子のパッキング、および予測された抗原結合境界またはＦｖ二量体の境界に対する置換の配置である。主要な位置において、不利な溶媒和状態、悪い原子間の接触または不適切な残基の不良な設置が観察されれば、可能性のある置換が却下される。他の基準、例えば静電作用、水素結合パターンまたは可能性のある水素結合パターンなども、置換の適性を評価するために使用される。一連の臨界的な位置が、正規のＣＤＲクラス、個々のドメインコアのパッキング、またはドメイン間の境界を支持することにおいて役割を果たしていることから、置換の承認に関して一部の位置が他の位置より好適である。

【0172】

可能性のある置換の評価
親のフレームワークとアクセプターフレームワークとで異なる、または予測されたエピトープに近い全ての位置を、結合親和性および安定性に対するそれらの可能性のある影響に基づいて評価した。

【0173】

この類別に寄与する、親和性および安定性の両方に関する関係から生じる多くの要因がある。分類に寄与する要因は、以下の通りである：
● 抗原結合に関与する位置
● 臨界的な位置
〇 ＶＨ／ＶＬ境界中の保存された残基
〇 正規のＣＤＲクラスを決定する位置
● ＣＤＲからの距離
● 参照アライメント中の位置における保存または変動
● 溶媒の接近性
● 局所的な原子のパッキング
● 局所的な二次構造
● 静電作用
● 水素結合パターン
● 可能性のある水素結合
● 翻訳後修飾
〇 Ｎ−グリコシル化
〇 脱アミド。

【0174】

初期において、臨界的な位置は、ＶＨ／ＶＬ境界中の臨界的な位置、すなわちＣＤＲコンフォメーションの決定を助ける位置、または参照アライメント中で高度に保存された位置にあることが決定されたＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲでの位置と定義される。多くの位置は保存されており、少数の群の、または１つのみのタイプのアミノ酸しか受容しないと予想される。

【0175】

最適なアクセプターフレームワーク選択
親の可変ドメインをヒト生殖細胞系と比較する配列アライメントを生成した。全体的な配列同一性、適合している境界の位置および同様にクラス分けされたＣＤＲの正規の位置を考慮したところ、軽鎖はそれでもなお数々の等しく好適なアクセプターフレームワークを有していた。しばしばあるアクセプターフレームワークがある領域にとってわずかに好適であったが、別の領域にとってはそれほど好適ではなかった。結果として２つの軽鎖アクセプターフレームワーク、ＶＫ６−Ａ２６およびＶＫ３−Ｌ６が選択された。

【0176】

重鎖は、ヒト生殖細胞系ＶＨ７−７−４．１と最もよく適合した。ＶＨ７生殖細胞系ファミリーは、ＶＨ１ファミリーに取り入れることができる唯一のメンバーを含有する（Knappikら、２０００）。ＶＨ７生殖細胞系はＶＨ１生殖細胞系より低い頻度で見出される可能性が高いため、後者をアクセプターフレームワークとして使用するのにより好ましいとみなした。しかしながら、復帰突然変異が起こる可能性がある位置を分析したところ、ＶＨ７生殖細胞系はすでに適切な残基を含有していたことが明確になった。したがって２つのＩＧＨＶ生殖細胞系；ＶＨ７−７−４．１およびＶＨ１−１−０３をアクセプターフレームワークとして使用した。

【0177】

ＦＲ４およびＪ−セグメントにわたり、Ｊ−セグメント遺伝子をＡ２４親配列と比較した。ＪＫ４およびＪＨ４が軽鎖および重鎖それぞれにとって最良の適合であると同定し、それゆえにＪ−セグメントのアクセプターフレームワークとして選択した。

【0178】

ヒト化
親のフレームワークとアクセプターフレームワークとで異なる残基を有する全ての位置のリストを作成した。全ての位置を分析して、単離と他の可能性のある置換の状況の両方を検討した。各位置をランク付けし、ヒト化バリアントにおいてどの残基を置換および評価すべきかに関する示唆を提案した。軽鎖について、３つのヒト化された鎖が提案され、そのうち１つはアクセプターＶＫ３−Ｌ６を使用し、２つはアクセプターＶＫ６−Ａ２６を使用しており、そのうち１つは、親配列から保持された追加の寄与位置を有していた（復帰突然変異）。重鎖について、２つのヒト化された鎖が提案され、そのうち１つはそれぞれ選択されたアクセプターを使用していた。ＶＨ７−７−４．１グラフトは、より保存的である。表６を参照されたい。

【0179】

【表6】

【0180】

６つのヒト化抗体の第１の世代はＡ２４の機能特性を維持できなかった
前のセクションに記載した方法に基づいて、本発明者らはまず、Ａ２４の３つのヒト化軽鎖バリアント（以降、ＶＬ１、ＶＬ２およびＶＬ３と呼ばれる）およびＡ２４の２つのヒト化重鎖バリアント（以降、ＶＨ１およびＶＨ２と呼ばれる）を設計した。本発明者らは、Ａ２４の対応するＶＨおよびＶＬをＶＨ０およびＶＬ０と呼んだ。

【0181】

本発明者らは、以下のヒト化ＶＨおよびＶＬならびにヒトＩｇＧ１アイソタイプの組合せを有する以下の６つのヒト化抗体を生成した：
ＩＮＡ０１バリアント１ヒト化抗体：ＶＨ１／ＶＬ１
ＩＮＡ０１バリアント２ヒト化抗体：ＶＨ２／ＶＬ１
ＩＮＡ０１バリアント３ヒト化抗体：ＶＨ１／ＶＬ２
ＩＮＡ０１バリアント４ヒト化抗体：ＶＨ２／ＶＬ２
ＩＮＡ０１バリアント５ヒト化抗体：ＶＨ１／ＶＬ３
ＩＮＡ０１バリアント６ヒト化抗体：ＶＨ２／ＶＬ３。

【0182】

本発明者らは、これらの６つのヒト化抗体を、上述したアッセイに従ってＨＬ−６０細胞のアポトーシス誘導に関してアッセイし、このようなアポトーシスを誘導する特性を、同じヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する参照マウス抗体Ａ２４（ＶＨ０／ＶＬ０）のキメラ形態と比較した。図１に結果を示す。

【0183】

図１に示されるように、本発明者らは、驚くべきことに、全ての試験ヒト化抗体がそれらの結合特性を失っていたことを見出した。これは、バリアントの一部が、その親マウスのＡ２４抗体に共通する全ての６つのＣＤＲを有していたことを考慮すると、特に驚くべきことである。

【0184】

５つの新しいヒト化抗体の生成
次いで本発明者らは新しい重鎖（ＶＨ３）を設計し、以下のヒト化抗体を生成した：
ＩＮＡ０１バリアント７ヒト化抗体：ＶＨ０／ＶＬ１
ＩＮＡ０１バリアント８ヒト化抗体：ＶＨ３／ＶＬ１
ＩＮＡ０１バリアント９ヒト化抗体：ＶＨ３／ＶＬ２
ＩＮＡ０１バリアント１０ヒト化抗体：ＶＨ３／ＶＬ３
ＩＮＡ０１バリアント１１ヒト化抗体：ＶＨ３／ＶＬ０。

【0185】

ここでも本発明者らは、これらのヒト化抗体を、上述したＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイに基づき、親マウスのＡ２４可変領域およびヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体に相当するキメラＩＮＡ０１と比較した場合のそれらのアポトーシスを誘導する能力に関して試験した。図２に結果を示す。

【0186】

図２に示されるように、ヒト化抗体は、ここでも少なくとも部分的にそれらのアポトーシスを誘導する特性を失っていた。
６つの新しいヒト化抗体の生成
上記の３つの新しい抗体で得られた結果に基づき、本発明者らはここでも３つの新しい軽鎖および２つの新しい重鎖を設計した。

【0187】

特定には、本発明者らは、親抗体Ａ２４の有利な特性をなお維持しながら免疫原性を低減させるアミノ酸の変化を予測するためのインシリコ分析を（フレームワーク中かまたはＣＤＲ領域中かにかかわらず）使用した。

【0188】

現行の分析において、ｉＴｏｐｅ（商標）を使用して、ヒトＭＨＣクラスＩＩへのプロミスカスな高親和性結合剤に関するＡ２４由来の配列を分析した。プロミスカスな高親和性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、Ｔ細胞エピトープの存在と相関すると考えられているが（Hillら、2003 Arthritis Res Ther.（2003） 1：R40〜R48）、中程度のおよび低い親和性の結合剤もＴ細胞応答を開始させる可能性がある。したがってｉＴｏｐｅ（商標）を使用して、可能性のあるＴ細胞エピトープの配置に関する有用な最初の「低い解像度」のスクリーニングを提供した。加えて、配列をＴＣＥＤ（商標）ＢＬＡＳＴサーチによって分析して、これまでに他のタンパク質配列のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）分析によって同定されたあらゆるＴ細胞エピトープを位置決めした。

【0189】

表７に示されるように、インシリコ分析のｉＴｏｐｅ（商標）から、ＬＣＤＲ２におけるアミノ酸置換Ｌ５３Ｒおよび／またはＳ５５Ｔは、免疫原性を低減させる可能性があることが解明された。

【0190】

【表7】

【0191】

それゆえに本発明者らは、３つの新しい軽鎖、すなわちＡ２４のＬＣＤＲ２と比較した場合、ＬＣＤＲ２中に２つのアミノ酸置換を包含する軽鎖（ＶＬ４）、ＬＣＤＲ２中に１つのみのアミノ酸置換を包含する軽鎖（ＶＬ５）、およびＡ２４と比較した場合、同一なＬＣＤＲ２を有する軽鎖（ＶＬ６）を試験することを決定した。

【0192】

以下の６つの新しいヒト化抗体をＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を用いて生成した。
ＩＮＡ０１バリアント１２ＶＨ４／ＶＬ４
ＩＮＡ０１バリアント１３ＶＨ５／ＶＬ４
ＩＮＡ０１バリアント１４ＶＨ４／ＶＬ５
ＩＮＡ０１バリアント１５ＶＨ５／ＶＬ５
ＩＮＡ０１バリアント１６ＶＨ４／ＶＬ６
ＩＮＡ０１バリアント１７ＶＨ５／ＶＬ６。

【0193】

図５ａは、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６のアライメントをＡ２４抗体のＶＬと共に示す。
図５ｂは、ＶＨ４およびＶＨ５のアライメントをＡ２４抗体のＶＨと共に示す。
本発明者らは、これらのヒト化抗体を、上述したＨＬ−６０ ７２ｈアポトーシスアッセイに基づき、親マウスのＡ２４可変領域およびヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体に相当するキメラＩＮＡ０１と比較した場合のそれらのアポトーシスを誘導する能力に関して試験した。図３に結果を示す。

【0194】

図３に示されるように、全ての６つの新しい試験されたヒト化抗体は、親マウスのＡ２４可変領域およびヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体に相当するキメラＩＮＡ０１と比較して、現状で類似する、またはよりいっそう優れた特性を有する。

【0195】

ここで驚くべきことに、特定の抗体において、ＬＣＤＲ２に２つのアミノ酸置換を有するバリアント１２およびバリアント１３は、親キメラＩＮＡ０１抗体と比較して優れた誘導特性を示した。

【0196】

ＩｇＧへの変換
４つのリード候補の全長ＩｇＧ、重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変ドメインフラグメントを発現させるために、バリアント１２、１４、１５および１７を、Ｆａｂ発現ベクターから、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ１野生型、ヒトＩｇＧ１ Ｌ２３４ＡＬ２３５ＡおよびヒトＩｇＧ１Ｎ２９７Ａにとって適切な発現ベクターにサブクローニングした。ここで前記ヒトＩｇＧ１ Ｌ２３４ＡＬ２３５Ａは、本明細書において「ＡＡ」と称される。その結果として、以下の表８に記載されるように、１６種の本発明に係る抗体、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６を生産するための発現ベクターが得られた。

【0197】

【表8】

【0198】

ヒトＩｇＧの一過性発現および精製
細胞を、ＩｇＧ ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６の重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターＤＮＡでトランスフェクトした。

【0199】

図４に結果を示す。結果から、生産されたＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体は、他のアイソタイプ、ＩｇＧ１および突然変異体サイレントＩｇＧ１と比較してより優れた収量で生産されることが解明された。

【0200】

ｍＡｂ１に関するプロファイリングデータ

【0201】

【表9】

【0202】

意外にも、本発明の抗体は、１０ｎＭ未満の、さらには１ｎＭ未満ものＫ_Ｄ親和性およびＥＣ_５０を有し、ＨＬ−６０アポトーシスアッセイで測定した場合、Ａ２４より優れたアポトーシス誘導を有することから、薬物として使用するのに特に好適である。

【0203】

さらに、これらは、予測された免疫原性の低減により、特定には真核細胞株での生産およびヒトへの投与のための、有利な発展特性を有する。
可変領域をコードするコード配列は、例えばＬ２３４ＡＬ２３５Ａ突然変異を含有するＩｇＧ１ Ｆｃバリアント、またはＮ２９７Ａ突然変異を含有するＩｇＧ１ Ｆｃバリアントを含むサイレントＩｇＧ１抗体を生成するために、好適な発現ベクターおよび細胞株に容易に移すことができる。

【0204】

代替として、可変領域をコードするコード配列はまた、例えばＩｇＧ１ Ｆｃ野生型を含む、および／またはＮ２９７アミノ酸位にグリカンのバイセクティングＧｌｃＮＡｃもしくは低フコシル化を有する、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を生成するために、発現ベクターおよび細胞株に移すこともできる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]