特許 6858876 ＢＫウイルスの検出のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6858876

(24)【登録日】2021年3月26日

(45)【発行日】2021年4月14日

(54)【発明の名称】ＢＫウイルスの検出のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20210405BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20210405BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20210405BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALI20210405BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20210405BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/04ZNA

   C12Q1/6844 Z

   C12Q1/6813 Z

   C12Q1/6888 Z

   !C12N15/09 Z

【請求項の数】13

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2019-544779(P2019-544779)

(86)(22)【出願日】2017年10月20日

(65)【公表番号】特表2020-501600(P2020-501600A)

(43)【公表日】2020年1月23日

(86)【国際出願番号】EP2017076832

(87)【国際公開番号】WO2018086845

(87)【国際公開日】20180517

【審査請求日】2019年7月2日

(31)【優先権主張番号】62/419,853

(32)【優先日】2016年11月9日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】15/726,732

(32)【優先日】2017年10月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(72)【発明者】

【氏名】メヘター，ロチャク

(72)【発明者】

【氏名】サン，ジーンタオ

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２４６７５４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５１２１６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０２３４４９７０（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５０２１９６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中のＢＫウイルスを検出する方法であって、下記を含む方法：
試料を１セット以上のプライマーと接触させることを含む増幅工程を実施して、試料中にターゲット核酸が存在すれば増幅生成物を生成させる；
試料中にターゲット核酸が存在すれば、その増幅生成物を１以上のプローブと接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施する；そして
増幅生成物の存在または非存在を検出し、その際、増幅生成物の存在は試料中にＢＫウイルスが存在することの指標となり、増幅生成物の非存在は試料中にＢＫウイルスが存在しないことの指標となる；
その際：
（ｉ）１セット以上のプライマーにおける１セットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および５を含む２つのプライマーを含み、１以上のプローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体を含むプローブを含むか；
（ｉｉ）１セット以上のプライマーにおける１セットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および７を含む２つのプライマーを含み、１以上のプローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはその相補体を含むプローブを含むか；
（ｉｉｉ）１セット以上のプライマーにおける１セットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む２つのプライマーを含み、１以上のプローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体を含むプローブを含むか；あるいは
（ｉｖ）１セット以上のプライマーにおける１セットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０を含む２つのプライマーを含み、１以上のプローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１またはその相補体を含むプローブを含む。

【請求項2】

ハイブリダイゼーション工程が増幅生成物をドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識されたプローブと接触させることを含み；検出工程がプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在または非存在を検出することを含み、その際、蛍光の存在または非存在は試料中におけるＢＫウイルスの存在または非存在の指標となる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

アクセプター部分がクエンチャーのＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）−２（ＢＨＱ−２）である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ドナー蛍光部分がＨＥＸである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

さらに、並行して１以上の他の微生物に由来する第２ターゲット核酸を検出する方法を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

１以上の他の微生物が、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ジカウイルス、デング熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、および／またはチクングニヤウイルスからなる群から選択されるウイルスである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

１セット以上のプライマー；および１以上の蛍光検出可能な状態に標識されたプローブを含み、その際、蛍光検出可能な状態に標識されたプローブは少なくとも２つのプライマーにより生成したアンプリコンにハイブリダイズするように構成されている、ＢＫウイルスの核酸を検出するためのキットであって、その際
（ｉ）１セット以上のプライマーにおける１セットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および５を含む２つのプライマーを含み、１以上のプローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体を含むプローブを含むか；
（ｉｉ）１セット以上のプライマーにおける１セットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および７を含む２つのプライマーを含み、１以上のプローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはその相補体を含むプローブを含むか；
（ｉｉｉ）１セット以上のプライマーにおける１セットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む２つのプライマーを含み、１以上のプローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体を含むプローブを含むか；あるいは
（ｉｖ）１セット以上のプライマーにおける１セットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０を含む２つのプライマーを含み、１以上のプローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１またはその相補体を含むプローブを含む、
キット。

【請求項8】

さらにヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を含む、請求項７に記載のキット。

【請求項9】

検出可能な状態に標識されたオリゴヌクレオチド配列がドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分を含み、アクセプター部分がクエンチャーのＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）−２（ＢＨＱ−２）であり、ドナー蛍光部分がＨＥＸである、請求項７または８に記載のキット。

【請求項10】

試料中のＢＫウイルスを検出するためのプライマーのセットおよびプローブを含む反応混合物であって：
（ｉ）プライマーのセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および５を含む２つのプライマーを含み、プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体を含むプローブを含むか；
（ｉｉ）プライマーのセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および７を含む２つのプライマーを含み、プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはその相補体を含むプローブを含むか；
（ｉｉｉ）プライマーのセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む２つのプライマーを含み、プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体を含むプローブを含むか；あるいは
（ｉｖ）プライマーのセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０を含む２つのプライマーを含み、プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１またはその相補体を含むプローブを含む、
反応混合物。

【請求項11】

試料をプライマーのセットと接触させることを含む増幅工程を実施して、試料中にターゲット核酸が存在すれば増幅生成物を生成させる；その増幅生成物を１以上のプローブと接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施する；そして増幅生成物の存在または非存在を検出し、その際、増幅生成物の存在は試料中にＢＫウイルスが存在することの指標となり、増幅生成物の非存在は試料中にＢＫウイルスが存在しないことの指標となる、請求項１０に記載の反応混合物。

【請求項12】

ハイブリダイゼーション工程が増幅生成物をドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識されたプローブと接触させることを含み；検出工程がプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分の間のＦＲＥＴの存在または非存在を検出することを含み、その際、蛍光の存在または非存在は試料中におけるＢＫウイルスの存在または非存在の指標となり、アクセプター部分がクエンチャーのＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）−２（ＢＨＱ−２）であり、ドナー蛍光部分がＨＥＸである、請求項１１に記載の反応混合物。

【請求項13】

５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を増幅工程に使用する、請求項１２に記載の反応混合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、インビトロウイルス診断の分野に関する。この分野において、本発明は、試料中に存在する可能性があるターゲット核酸の増幅および検出、特にプライマーおよびプローブを用いてＢＫウイルスの配列バリエーションおよび／または個々の変異を含むターゲット核酸を増幅、検出および定量することに関する。本発明は、さらにＢＫウイルスの増幅および検出のためのプライマーおよびプローブを含む反応混合物およびキットを提供する。

【背景技術】

【0002】

ポリオーマウイルス(Polyomaviridae)(polyomavirus)科のメンバーであるＢＫウイルスは１９７１年に初めて、イニシャル“Ｂ．Ｋ．”をもつ尿管狭窄を伴う腎移植レシピエントの尿から分離された。ポリオーマウイルス科にはジョン・カニンガムウイルス(John Cunningham virus)（ＪＣＶ）およびシミアンウイルスＳＶ４０が含まれる。ＢＫウイルス感染症は広く分布しているが、感染個体は通常は無症候であるか、あるいは軽度の症状（たとえば、呼吸器感染症または発熱）を示すにすぎない。ＢＫウイルスは環状二本鎖ＤＮＡウイルスである。それのゲノムは３つのキャプシド構造タンパク質（すなわち、ウイルスキャプシドタンパク質１(viral capsid protein 1)（ＶＰ１）、ＶＰ２、およびＶＰ３）、ならびにラージＴ(large T)およびスモールｔ(small t)抗原をコードする。

【0003】

一次感染の後、ウイルスは一般に尿路上皮および腎尿細管上皮の細胞中に潜在性を樹立する。集団の最大８０％が潜在型のこのウイルスをもつと考えられる。たとえば臓器移植の状況における免疫抑制状態および／または免疫無防備状態の個体についてのＢＫウイルス感染症の症状は、より著しく重篤である。そのような症例では、臨床症状発現には腎機能不全、ならびに尿中における腎尿細管細胞および炎症細胞の存在が含まれる可能性がある。特に、免疫抑制および／または免疫無防備の状況では、ウイルスが再活性化および複製して、尿細管細胞溶解およびウイルス尿症に始まる一連の事象の引き金を引く。ウイルスは次いで間質内で増殖し、尿細管周囲毛細血管内へ進入してウイルス血症を引き起こし、最終的には同種移植片に侵入して種々の尿細管間質病変およびＢＫ腎症（ＢＫＶＮ）に至る。ＢＫウイルスは移植片喪失の確率増大に著しく関与する。ＢＫウイルスは一般的な移植後日和見ウイルス感染体であり、移植後１年目の腎移植レシピエントのおおよそ１５％に感染する。対処しなければ、ＢＫ腎症は進行して同種移植失敗に至るであろう。

【0004】

免疫抑制状態および／または免疫無防備状態であることがＢＫウイルス感染のリスク因子であることに変わりはないが、他のリスク因子には男性、高齢のレシピエント、以前の拒絶エピソード、ヒト白血球抗原不適合の程度、長期間の寒冷虚血、ＢＫ血清状態(serostatus)、および尿管ステント設置が含まれる。症候性ＢＫウイルス感染個体の治療選択肢は限られており、有効な予防法は無い。治療の基本は単純に免疫抑制を低減することであり、それは同種移植片拒絶のリスクを高める。抗ウイルス薬も用いられるが、結果には一貫性が無い。ＢＫウイルスは現在では腎移植レシピエントにおける間質性腎炎および同種移植失敗の主因であると認識されている。

【0005】

ＢＫウイルス感染はＢＫウイルス血液検査またはデコイ細胞(decoy cell)についての尿検査により診断される。デコイ細胞の存在は高感度の尺度であるが、ＢＫ腎症の診断については低い陽性予測値（２９％）をもつ(参照：Mbianda, et al. Journal of Clinical Virology 71:59-62 (2015)。ウイルスのＤＮＡまたはｍＲＮＡによる血漿および尿におけるウイルス負荷の定量も、ＢＫ腎症を診断するために用いられている。しかし、移植腎生検は依然としてＢＫウイルス腎症診断のゴールドスタンダードである。

【0006】

分子診断の分野で、核酸の増幅および検出はかなりの重要性をもつ。そのような方法を用いて多数の微生物、たとえばウイルスおよび細菌を検出できる。最も卓越した広く用いられている手法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。他の増幅法にはリガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、Ｇａｐ−ＬＣＲ、修復連鎖反応(Repair Chain Reaction)、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換型増幅(Strand Displacement Amplification)（ＳＤＡ）、転写仲介増幅(Transcription Mediated Amplification)（ＴＭＡ）、およびＱβ増幅が含まれる。

【0007】

ＰＣＲベースの分析のための自動化システムは、しばしばＰＣＲプロセスに際して同一反応器内で生成物増幅のリアルタイム検出を利用する。そのような方法に対する鍵は、レポーター基または標識を保有する修飾オリゴヌクレオチドの使用である。

【0008】

ＢＫウイルス感染症の症状はきわめて軽度であるかまたは存在しないので、集団の推定８０％がＢＫウイルスを潜伏状態で宿しており、彼らの多くはそのことを知らない。ＢＫ腎症を診断するためのゴールドスタンダードは移植腎生検であり、それは時間がかかり、侵襲性であり、かつ労力を要する操作である。したがって、当技術分野には、生体試料中のＢＫウイルスの存在を検出および定量するための迅速で信頼性があり、特異的かつ高感度である方法に対するニーズがある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Mbianda, et al. Journal of Clinical Virology 71:59-62 (2015)

【発明の概要】

【0010】

本開示におけるある態様は、生体試料または非生体試料中のＢＫウイルスの存在または非存在の迅速検出のための方法、たとえば単一の試験管または容器内でのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＢＫウイルスのマルチプレックス検出および定量に関する。態様には、増幅工程およびハイブリダイゼーション工程を含むことができる少なくとも１サイクルの工程を実施することを含むＢＫウイルスの検出方法が含まれる。さらに、態様には、単一の試験管または容器内でＢＫウイルスを検出するために設計されたプライマー、プローブ、およびキットが含まれる。

【0011】

本発明の一態様は、試料中のＢＫウイルスを検出する方法を目的とし、その方法は下記を含む：（ａ）試料を１セット以上のプライマーと接触させることを含む増幅工程を実施して、試料中にＢＫウイルスのターゲット核酸が存在すれば増幅生成物を生成させる；（ｂ）試料中にターゲット核酸が存在すれば、その増幅生成物を１以上のプローブと接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施する；そして（ｃ）増幅生成物の存在または非存在を検出し、その際、増幅生成物の存在は試料中にＢＫウイルスが存在することの指標となり、増幅生成物の非存在は試料中にＢＫウイルスが存在しないことの指標となる；その際、１セット以上のプライマーは、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４、５、６、７、９、および１０、またはその相補体からなる群から選択される少なくとも２つのプライマーを含み、その際、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、８、および１１、またはその相補体からなる群から選択される。関連する態様において、１セット以上のプライマーは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体からなるプローブを含む。関連する態様において、１セット以上のプライマーは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および５、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体からなるプローブを含む。関連する態様において、１セット以上のプライマーは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および７、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはその相補体からなるプローブを含む。関連する態様において、１セット以上のプライマーは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１またはその相補体からなるプローブを含む。他の態様において、ハイブリダイゼーション工程は増幅生成物をドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識されたプローブと接触させることを含み；検出工程はプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動(fluorescence resonance energy transfer)（ＦＲＥＴ）の存在または非存在を検出することを含み、蛍光の存在または非存在は試料中におけるＢＫウイルスの存在または非存在の指標となる。他の態様において、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を増幅工程に使用する。他の態様において、アクセプター部分はクエンチャー、たとえばＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）−２（ＢＨＱ−２）である。他の態様において、ドナー蛍光部分はＨＥＸである。他の態様において、試料は生体試料であり、それには血液、血漿、または尿が含まれるが、それらに限定されない。他の態様において、本方法はさらに、並行して１以上の他の微生物に由来する第２ターゲット核酸を検出することを含む。関連する態様において、１以上の他の微生物は細菌である。関連する態様において、１以上の他の微生物は下記のものを含む（ただし、それらに限定されない）ウイルスである：Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ジカウイルス(Zika virus)、デング熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、および／またはチクングニヤウイルス(chikungunya virus)。

【0012】

本発明の他の態様は、ＢＫウイルスの核酸を検出するための下記のものを含むキットを目的とする：（ａ）核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４、５、６、７、９、および１０、またはその相補体からなる群から選択される少なくとも２つのプライマーを含むプライマーのセット；（ｂ）核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、８、および１１、またはその相補体からなる群から選択される１以上の蛍光検出可能な状態に標識されたプローブを含み、その際、検出可能な状態に標識されたプローブは少なくとも２つのプライマーにより生成したアンプリコンにハイブリダイズするように構成されている。関連する態様において、プライマーのセットは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体からなるプローブを含む。関連する態様において、プライマーのセットは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および５、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体からなるプローブを含む。関連する態様において、プライマーのセットは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および７、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはその相補体からなるプローブを含む。関連する態様において、プライマーのセットは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１またはその相補体からなるプローブを含む。他の態様において、検出可能な状態に標識されたオリゴヌクレオチド配列はドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分を含む。一態様において、アクセプター部分はクエンチャー、たとえばＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）−２（ＢＨＱ−２）である。他の態様において、ドナー蛍光部分はＨＥＸである。一態様において、試料は生体試料であり、それには血液、血漿、または尿が含まれるが、それらに限定されない。他の態様において、キットはさらに、１以上の他の微生物に由来する第２ターゲットを増幅および検出するためのプライマーおよびプローブを含む。一態様において、１以上の微生物は細菌である。一態様において、１以上の他の微生物は下記のものを含む（ただし、それらに限定されない）ウイルスである：Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ジカウイルス、デング熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、および／またはチクングニヤウイルス。さらに他の態様において、キットはさらにヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を含む。他の態様において、少なくとも２つのプライマーまたは蛍光検出可能な状態に標識されたプローブのうち、少なくとも１つは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。

【0013】

本発明の他の態様は、試料中のＢＫウイルスを検出するためのプライマーのセットおよび１以上のプローブを目的とし、そのプライマーのセットは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４、５、６、７、９、および１０、またはその相補体からなる群から選択される少なくとも２つのプライマーを含み；１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、８、および１１、またはその相補体からなる群から選択される。関連する態様において、プライマーのセットは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体からなるプローブを含む。関連する態様において、プライマーのセットは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および５、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその相補体からなるプローブを含む。関連する態様において、プライマーのセットは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および７、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはその相補体からなるプローブを含む。関連する態様において、プライマーのセットは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０、またはその相補体からなる２つのプライマーを含み、１以上のプローブは核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１またはその相補体からなるプローブを含む。他の態様において、試料をプライマーのセットと接触させることを含む増幅工程を実施して、試料中に核酸が存在すれば増幅生成物を生成させる；その増幅生成物を１以上のプローブと接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施する；そして増幅生成物の存在または非存在を検出し、その際、増幅生成物の存在は試料中にＢＫウイルスが存在することの指標となり、増幅生成物の非存在は試料中にＢＫウイルスが存在しないことの指標となる。他の態様において、ハイブリダイゼーション工程は増幅生成物をドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識されたプローブと接触させることを含み；検出工程はプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分の間のＦＲＥＴの存在または非存在を検出することを含み、その際、蛍光の存在または非存在は試料中におけるＢＫウイルスの存在または非存在の指標となる。他の態様において、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を増幅工程に使用する。他の態様において、アクセプター部分はクエンチャー、たとえばＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）−２（ＢＨＱ−２）である。一態様において、ドナー蛍光部分はＨＥＸである。一態様において、試料は生体試料であり、それには血液、血漿、または尿が含まれるが、それらに限定されない。

【0014】

他の態様は、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１またはその相補体から選択されるヌクレオチドの配列を含むかあるいはそれからなるオリゴヌクレオチドを提供し、そのオリゴヌクレオチドは１００以下のヌクレオチドをもつ。他の態様において、本開示は、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１またはその相補体の１つに対して少なくとも７０％（たとえば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％など）の配列同一性をもつ核酸を含むオリゴヌクレオチドを提供し、そのオリゴヌクレオチドは１００以下のヌクレオチドをもつ。一般に、これらの態様において、これらのオリゴヌクレオチドはプライマー核酸、プローブ核酸などであってもよい。これらのうち特定の態様において、オリゴヌクレオチドは４０以下のヌクレオチド（たとえば、３５以下のヌクレオチド、３０以下のヌクレオチド、２５以下のヌクレオチド、２０以下のヌクレオチド、１５以下のヌクレオチドなど）をもつ。

【0015】

ある態様において、オリゴヌクレオチドは、たとえば非修飾ヌクレオチドと対比して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変更するために、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。場合により、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの標識および場合により少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。ある態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの保存的修飾バリエーションを含む。特定の核酸配列の“保存的修飾バリエーション(Conservatively modified variation)”または簡単に“保存的バリエーション”は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列（または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列）をコードする核酸を表わす。コード配列において単一ヌクレオチドまたは小パーセントのヌクレオチド（一般的に５％未満、より一般的には４％、２％または１％未満）を変更、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は“保存的修飾バリエーション”であることを当業者は認識しているであろう；その際、それらの変更によりアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換が生じる。

【0016】

一側面において、増幅には５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用できる。そして、ドナー蛍光部分とアクセプター部分、たとえばクエンチャーとは、プローブの長さに沿って互いに５〜２０ヌクレオチドを越えない範囲内（たとえば、８または１０ヌクレオチド以内）にある可能性がある。他の側面において、プローブは二次構造形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造形成によって第１蛍光部分と第２蛍光部分が空間的に接近する可能性がある。この方法によれば、プローブ上の第２蛍光部分はクエンチャーであってもよい。

【0017】

本開示は、個体からの生体試料中のＢＫウイルスまたはＢＫウイルス核酸の存在または非存在を検出する方法も提供する。これらの方法は、血液スクリーニングおよび診断検査に使用するために、血漿中におけるＢＫウイルス核酸の存在または非存在を検出するのに使用できる。さらに、当業者が同じ検査を用いて尿および他の試料タイプを査定して、ＢＫウイルス核酸を検出および／または定量することができる。そのような方法には一般に、増幅工程および色素結合工程を含む少なくとも１サイクルの工程を実施することが含まれる。一般に、増幅工程は試料を複数のオリゴヌクレオチドプライマー対と接触させて試料中に核酸分子が存在すれば１以上の増幅生成物を生成させることを含み、色素結合工程はその増幅生成物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。そのような方法は、増幅生成物内への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の存在または非存在を検出することも含み、その際、結合の存在はその試料中にＢＫウイルス核酸が存在することの指標となり、結合の非存在はその試料中にＢＫウイルス核酸が存在しないことの指標となる。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は臭化エチジウムである。他の核酸結合色素には、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）、ならびにシアニン色素、たとえばＹＯ−ＹＯ（登録商標）およびＳＹＢＲ（登録商標）グリーンが含まれる。さらに、そのような方法は増幅生成物と二本鎖ＤＮＡ結合色素の間の融解温度の判定も含むことができ、その際、融解温度によりＢＫウイルス核酸の存在または非存在が確認される。

【0018】

さらなる態様において、１以上のＢＫウイルス核酸を検出および／または定量するためのキットを提供する。キットは、遺伝子ターゲットの増幅について特異的な１セット以上のプライマー；および増幅生成物の検出について特異的な１以上の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。

【0019】

一側面において、キットは、ドナー部分、および対応するアクセプター部分、たとえば他の蛍光部分またはダーククエンチャー(dark quencher)で既に標識されたプローブを含むことができ、あるいはプローブを標識するための発蛍光部分を含むことができる。キットは、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をも含むことができる。キットは、プライマー、プローブおよび発蛍光部分を用いて試料中のＢＫウイルス核酸の存在または非存在を検出するためのパッケージ挿入物および指示を含むこともできる。

【0020】

別に規定しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家が一般的に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載するものと類似または同等な方法および材料を本発明の対象の実施または試験に使用できるが、適切な方法および材料を以下に記載する。さらに、それらの材料、方法および例は説明のためのものにすぎず、限定するためのものではない。

【0021】

本発明の１以上の態様の詳細を添付の図面および以下の記載に述べる。本発明の他の特徴、目的および利点は図面および詳細な記載ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、ＢＫウイルスに特異的なプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および５）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）によるＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料（４×１０^５ゲノム／μｌ）の検出を示すリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。

【図2】図２は、プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および５）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）によるＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料（４×１０^５ゲノム／μｌ）の特異的検出を示すリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。ＢＫウイルスのプライマーおよびプローブは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）、ＨＳＶ−２、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの他のウイルスＤＮＡ試料に由来するゲノムＤＮＡと交差反応性ではない；１×１０^８コピー／μｌで試験。ＢＫウイルス以外のゲノムＤＮＡ試料については信号がみられなかった。

【図3】図３は、プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）によるＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料（４×１０^５ゲノム／μｌ）の検出感度を示すリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。下記の種々の濃度のＤＮＡ試料を含む希釈パネルを用いた：１×１０^１ゲノム／μｌ、１×１０^２ゲノム／μｌ、１×１０^３ゲノム／μｌ、１×１０^４ゲノム／μｌ、１×１０^５ゲノム／μｌ、および４×１０^５ゲノム／μｌ。結果はこれらのプライマーおよびプローブの感度を立証し、１×１０^１ゲノム／μｌという低いレベルのＢＫウイルスＤＮＡを検出する能力を示す。

【図4】図４は、プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および７）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）によるＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料の検出感度を示すリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。下記の種々の濃度のＤＮＡ試料を含む希釈パネルを用いた：１×１０^１ゲノム／μｌ、１×１０^２ゲノム／μｌ、および１×１０^３ゲノム／μｌ。結果はこれらのプライマーおよびプローブの感度を立証し、１×１０^１ゲノム／μｌという低いレベルのＢＫウイルスＤＮＡを検出する能力を示す。

【図5】図５は、プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）によるＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料の検出感度を示すリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。下記の種々の濃度のＤＮＡ試料を含む希釈パネルを用いた：１×１０^１ゲノム／μｌ、１×１０^２ゲノム／μｌ、および１×１０^３ゲノム／μｌ。結果はこれらのプライマーおよびプローブの感度を立証し、１×１０^１ゲノム／μｌという低いレベルのＢＫウイルスＤＮＡを検出する能力を示す。

【図6】図６は、２つの異なるセットのオリゴヌクレオチドセット（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６〜８）を用いたＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料のマルチプレックス検出を示すリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。結果は、２セットのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６〜８）がマルチプレックス設定でＢＫウイルスを増幅および検出することを立証する。

【図7】図７は、２つの異なるセットのオリゴヌクレオチドセット（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６〜８）を用いたＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料のマルチプレックス検出を示すリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。結果は、２セットのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９〜１１）がマルチプレックス設定でＢＫウイルスを増幅および検出することを立証する。

【発明を実施するための形態】

【0023】

核酸増幅によるＢＫウイルス感染症の診断は、ＢＫウイルス感染症を迅速、精確に、信頼性をもって、特異的に、高感度で検出および／または定量するための方法を提供する。非生体試料または生体試料中のＢＫウイルスを検出および／または定量するためのリアルタイムＰＣＲアッセイを本明細書に記載する。ＢＫウイルスを検出および／または定量するためのプライマーおよびプローブを提供し、そのようなプライマーおよびプローブを収容した製品またはキットも提供する。他の方法と比較して向上したＢＫウイルス検出のためのリアルタイムＰＣＲの特異度および感度、ならびに試料の封じ込め(containment)ならびに増幅生成物のリアルタイム検出および定量を含めて改善されたリアルタイムＰＣＲの特徴により、この技術を臨床検査室におけるＢＫウイルス感染症のルーティン診断のために実施することが可能になる。さらに、この技術は血液スクリーニングおよび予後判定に使用できる。このＢＫウイルス検出アッセイを、他の核酸、たとえば他の細菌および／またはウイルスの検出のための他のアッセイと並行してマルチプレックス化することもできる。

【0024】

本開示は、たとえばＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を用いてＢＫウイルスを特異的に同定するための、ＢＫウイルスゲノムにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーおよび蛍光標識した加水分解プローブを含む。

【0025】

開示した方法は、１対以上のプライマーを用いて試料に由来する核酸分子遺伝子ターゲットの１以上の部分を増幅することを含む少なくとも１サイクルの工程の実施を含むことができる。本明細書中で用いる“ＢＫプライマー（単数または複数）”は、ＢＫウイルスゲノム中にある核酸配列に特異的にアニールし、適切な条件下でそれからＤＮＡ合成を開始してそれぞれの増幅生成物を生成する、オリゴヌクレオチドプライマーを表わす。ＢＫウイルスゲノム中にある核酸配列の例には、ＢＫウイルスゲノムのウイルスキャプシドタンパク質領域、たとえばＶＰ２領域内の核酸が含まれる。考察したＢＫウイルスプライマーはそれぞれターゲットにアニールし、したがってそれぞれの増幅生成物の少なくとも一部はターゲットに対応する核酸配列を含む。試料中に１以上の核酸が存在する限り１以上の増幅生成物が生成し、よって１以上の増幅生成物の存在は試料中にＢＫウイルスが存在することの指標となる。増幅生成物は、ＢＫウイルスについて１以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含むはずである。本明細書中で用いる“ＢＫウイルスプローブ（単数または複数）”は、ＢＫウイルスゲノム中にある核酸配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを表わす。各サイクル工程は増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、および検出工程を含み、その際、試料中のＢＫウイルスの存在または非存在を検出するために、試料を１以上の検出可能なＢＫウイルスプローブと接触させる。

【0026】

本明細書中で用いる用語“増幅させる”は、鋳型核酸分子（たとえば、ＢＫウイルスゲノムに由来する核酸分子）の一方または両方の鎖に相補的である核酸分子を合成するプロセスを表わす。核酸分子の増幅は一般に、鋳型核酸を変性させ、プライマーの融解温度より低い温度でプライマーを鋳型核酸にアニールさせ、そしてプライマーから酵素によって伸長させて増幅生成物を生成させることを含む。増幅には一般に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（たとえば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） Ｔａｑ）、ならびにポリメラーゼ酵素の最適活性を得るために適切な緩衝液および／または補因子（たとえば、ＭｇＣｌ_２および／またはＫＣｌ）の存在が必要である。

【0027】

本明細書中で用いる用語“プライマー”は当業者に知られており、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を“プライムする(prime)”ことができるオリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを表わすが、修飾オリゴヌクレオチドをも表わす；すなわち、たとえばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’−ＯＨ基を備えており、そこに鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによりさらに“ヌクレオチド”が結合して、３’−５’ホスホジエステル結合が樹立し、それによりデオキシヌクレオシド三リン酸が使われ、それによりピロリン酸が放出される。

【0028】

用語“ハイブリダイズする”は、１以上のプローブが増幅生成物にアニールすることを表わす。“ハイブリダイゼーション条件”には、一般にプローブの融解温度より低いけれどもプローブの非特異的ハイブリダイゼーションが避けられる温度が含まれる。

【0029】

用語“５’→３’ヌクレアーゼ活性”は、一般に核酸鎖合成に関連する核酸ポリメラーゼの活性であって、それによりヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去されるものを表わす。

【0030】

用語“熱安定ポリメラーゼ”は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を表わし、すなわち、その酵素は鋳型に相補的なプライマー伸長生成物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性を行なわせるのに必要な時間、高い温度に曝されても不可逆的に変性することはない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始し、鋳型鎖に沿って５’→３’方向に進行する。熱安定ポリメラーゼは、サーマス・フラバス(Thermus flavus)、サーマス・ルベル(T. ruber)、サーマス・サーモフィルス(T. thermophilus)、サーマス・アクアティカス(T. aquaticus)、サーマス・ラクテウス(T. lacteus)、サーマス・ルーベンス(T. rubens)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、およびメタノサーマス・フェルビダス(Methanothermus fervidus)から分離された。しかしながら、必要であれば熱安定性ではないポリメラーゼも、その酵素が補充される限りＰＣＲアッセイに使用できる。

【0031】

用語“その相補体”は、特定の核酸と同じ長さであり、かつそれに対して厳密に相補的である核酸を表わす。
用語“伸長(extension)”または“延長(elongation)”は、核酸に関して用いられる場合、追加ヌクレオチド（または他の類似分子）がその核酸に取り込まれる場合を表わす。たとえば、核酸は、場合により、ヌクレオチドを取り込む生体触媒、たとえば、一般にヌクレオチドを核酸の３’末端に付加するポリメラーゼによって伸長する。

【0032】

２以上の核酸配列に関して用語“同一(identical)”または“同一性(identity)”パーセントは、たとえば当業者が利用できる配列比較アルゴリズムの１つを用いるかあるいは視覚精査により判定して最大一致が得られるように比較およびアラインした際に、同一であるかあるいは特定したパーセントの同じヌクレオチドをもつ、２以上の配列またはサブ配列を表わす。配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに適した代表的なアルゴリズムはＢＬＡＳＴプログラムであり、それらはたとえば下記に記載されている：Altschul et al. (1990) “Basic local alignment search tool” J. Mol. Biol. 215:403-410、Gish et al. (1993) “Identification of protein coding regions by database similarity search” Nature Genet. 3:266-272、Madden et al. (1996) “Applications of network BLAST server” Meth. Enzymol. 266:131-141、Altschul et al. (1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402、およびZhang et al. (1997) “PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation” Genome Res. 7:649-656。

【0033】

オリゴヌクレオチドに関して“修飾ヌクレオチド”は、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、希望する特性をそのオリゴヌクレオチドに付与する異なるヌクレオチドで置き換えられた変更を表わす。本明細書に記載するオリゴヌクレオチドにおいて置換できる代表的な修飾ヌクレオチドには、たとえば下記のものが含まれる：ｔ−ブチルベンジル、Ｃ５−メチル−ｄＣ、Ｃ５−エチル−ｄＣ、Ｃ５−メチル−ｄＵ、Ｃ５−エチル−ｄＵ、２，６−ジアミノプリン、Ｃ５−プロピニル−ｄＣ、Ｃ５−プロピニル−ｄＵ、Ｃ７−プロピニル−ｄＡ、Ｃ７−プロピニル−ｄＧ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＣ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＵ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＡ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＧ、７−デアザ−２−デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジンアナログ、シュード−ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’−０−メチル リボ−Ｕ、２’−０−メチル リボ−Ｃ、Ｎ４−エチル−ｄＣ、Ｎ６−メチル−ｄＡ、５−プロピニル ｄＵ、５−プロピニル ｄＣ、７−デアザ−デオキシグアノシン（デアザＧ（ｕ−デアザ））など。オリゴヌクレオチドにおいて置換できる他の多数の修飾ヌクレオチドが本明細書に述べられており、あるいは当技術分野で知られている。特定の態様において、修飾ヌクレオチド置換は、対応する非修飾オリゴヌクレオチドの融解温度に対比してオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を改変する。さらに説明すると、ある態様において、特定の修飾ヌクレオチド置換は非特異的な核酸増幅を低減する（たとえば、プライマーダイマー形成を最小限に抑えるなど）、意図するターゲットアンプリコンの収率を増大させる、および／または同様なことが可能である。これらのタイプの核酸修飾の例は、たとえばU.S. Patent No. 6,001,611に記載されている。他の修飾ヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチドの安定性を変更し、あるいは他の望ましい特徴をもたらすことができる。

【0034】

ＢＫウイルスターゲット核酸の検出／定量
本開示は、たとえばＢＫウイルス核酸配列の一部を増幅することによりＢＫウイルスを検出する方法を提供する。具体的には、ＢＫウイルス核酸分子ターゲットを増幅および検出および／または定量するためのプライマーおよびプローブを本開示における態様により提供する。

【0035】

ＢＫウイルスの検出および／または定量のために、ＢＫウイルスを増幅および検出／定量するためのプライマーおよびプローブを提供する。本明細書に例示するもの以外のＢＫウイルス核酸を用いて試料中のＢＫウイルスを検出することもできる。たとえば、当業者はルーティン方法を用いて機能性バリアントを特異度および／または感度について評価することができる。代表的な機能性バリアントには、たとえば本明細書に開示するＢＫウイルス核酸における１以上の欠失、挿入、および／または置換を含めることができる。

【0036】

より具体的には、オリゴヌクレオチドの態様はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１から選択される配列をもつ核酸、その実質的同一バリアントであって少なくともたとえばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１の１つに対して８０％、９０％または９５％の配列同一性をもつもの、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１およびそのバリアントの相補体を含む。

【0037】

【表1-1】

【0038】

【表1-2】

【0039】

一態様において、前記のＢＫウイルスプライマーおよびプローブのセットは、ＢＫウイルスを含有する疑いがある生体試料中のＢＫウイルスの検出を提供するために用いられる（表１）。プライマーおよびプローブのセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１の核酸配列を含むかあるいはそれらからなる、ＢＫウイルス核酸配列に対して特異的なプライマーおよびプローブを含むかあるいはそれらからなることができる。他の態様において、ＢＫウイルスターゲットに対するプライマーおよびプローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１のプライマーおよびプローブのいずれかの機能活性バリアントを含むかあるいはそれらからなる。

【0040】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１のプライマーおよび／またはプローブのいずれかの機能活性バリアントは、開示した方法にそれらのプライマーおよび／またはプローブを使用することにより同定できる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１のプライマーおよび／またはプローブのいずれかの機能活性バリアントは、記載した方法またはキットにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１のそれぞれの配列と比較して類似するかまたはより高い特異度および感度をもたらすプライマーおよび／またはプローブに関係する。

【0041】

バリアントは、たとえば１以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換、たとえばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１のそれぞれの配列の５’末端および／または３’末端における１以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１の配列と異なる可能性がある。前記のように、プライマーおよび／またはプローブを化学的に修飾することができ、すなわちプライマーおよび／またはプローブは修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含むことができる。その場合、プローブ（またはプライマー）は修飾オリゴヌクレオチドである。“修飾ヌクレオチド”（または“ヌクレオチドアナログ”）はある修飾によって天然“ヌクレオチド”と異なるが、それでもなお、塩基もしくは塩基様の化合物、ペントフラノシル糖もしくはペントフラノシル糖様の化合物、ホスフェート部分もしくはホスフェート様の部分、またはその組合せからなる。たとえば、“標識”を“ヌクレオチド”の塩基部分に結合させることができ、それにより“修飾ヌクレオチド”が得られる。“ヌクレオチド”中の天然塩基をたとえば７−デアザプリンにより置き換えることもでき、それによっても“修飾ヌクレオチド”が得られる。用語“修飾ヌクレオチド”または“ヌクレオチドアナログ”は、本出願において互換性をもって用いられる。“修飾ヌクレオシド”（または“ヌクレオシドアナログ”）は、“修飾ヌクレオチド”（または“ヌクレオチドアナログ”）について上記に概説したように、ある修飾によって天然ヌクレオシドと異なる。

【0042】

ＢＫウイルスターゲットをコードする核酸分子（たとえば、ＢＫウイルスの選択的(alternative)部分をコードする核酸）を増幅する、修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログを含めたオリゴヌクレオチドは、たとえばコンピュータープログラム、たとえばＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．，コロラド州カスケード）を用いて設計することができる。増幅プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドを設計する際に重要な特徴には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：検出（たとえば、電気泳動による）を容易にするのに適したサイズの増幅生成物、プライマー対のメンバーについて類似する融解温度、および各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは配列特異的にアニールして合成を開始するのに十分なほど長い必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に適合度(fidelity)が低減するほど長くはない）。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーは８〜５０ヌクレオチドの長さ（たとえば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、または５０ヌクレオチドの長さ）である。

【0043】

さらに、プライマーのセットのほかに、本方法はＢＫウイルスの存在または非存在を検出するために１以上のプローブを使用できる。用語“プローブ”は、合成または生体により生成した核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を表わし、それらは設計または選択によって、特定の前決定された緊縮条件下でそれらを特異的に（すなわち、優先的に）“ターゲット核酸”に、本発明の場合にはＢＫウイルス（ターゲット）核酸に、ハイブリダイズさせることができる特異的ヌクレオチド配列を含む。“プローブ”は“検出プローブ”とも呼ぶこともでき、これはそれがターゲット核酸を検出することを意味する。

【0044】

ある態様において、記載したＢＫウイルスプローブを少なくとも１つの蛍光標識で標識することができる。一態様において、ＢＫウイルスプローブをドナー蛍光部分、たとえば蛍光色素、および対応するアクセプター部分、たとえばクエンチャーで標識することができる。一態様において、プローブは蛍光部分を含むかまたはそれからなり、核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、８、および１１を含むかまたはそれからなる。

【0045】

プローブとして用いるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様な方法で実施できる。態様には、単一プローブまたは一対のプローブを増幅生成物の検出のために使用できる。その態様に応じて、プローブ（単数または複数）の使用は少なくとも１つの標識部分および／または少なくとも１つのクエンチャー部分を含むことができる。プライマーと同様に、プローブ類は通常は類似の融解温度をもち、各プローブの長さは配列特異的ハイブリダイゼーションが起きるのに十分でなければならないが、合成中に適合度が低減するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５〜４０（たとえば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドの長さである。

【0046】

構築体には、それぞれ１つのＢＫウイルスプライマーおよびプローブ核酸分子（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および１１）を含有するベクターを含めることができる。構築体を、たとえば対照鋳型核酸分子として使用できる。使用するのに適したベクターは市販されており、および／または当技術分野でルーティンな組換え核酸技術による方法によって製造される。ＢＫウイルス核酸分子は、たとえば化学合成、ＢＫウイルスからの直接クローニング、または核酸増幅により得ることができる。

【0047】

本方法に使用するのに適した構築体は、一般にＢＫウイルス核酸分子（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１のうち１以上の配列を含む核酸分子）のほかに、目的とする構築体および／または形質転換体を選択するための選択マーカーをコードする配列（たとえば、抗生物質耐性遺伝子）、ならびに複製起点を含有する。ベクター系の選択は、通常は宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性、および回収の容易さを含めた幾つかの要因（これらに限定されない）に依存する。

【0048】

ＢＫウイルス核酸分子を含有する構築体を宿主細胞において発現させることができる。本明細書中で用いる宿主細胞という用語には、原核細胞、ならびに真核細胞、たとえば酵母、植物および動物の細胞が含まれるものとする。原核細胞には、大腸菌(E. coli)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、枯草菌(Bacillus subtilis)を含めることができる。真核細胞宿主には、酵母、たとえばサッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)、分裂酵母(S. pombe)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、哺乳動物細胞、たとえばＣＯＳ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、昆虫細胞、ならびに植物細胞、たとえばシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)およびタバコ(Nicotiana tabacum)が含まれる。当業者に一般的に知られているいずれかの手法を用いて、構築体を宿主細胞に導入することができる。たとえば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ヒートショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス仲介核酸伝達が、核酸を宿主細胞に導入するための一般的方法である。さらに、裸のＤＮＡを細胞に直接送達することができる(参照：たとえば、U.S. Patent No. 5,580,859および5,589,466)。

【0049】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
U.S. Patent No. 4,683,202、4,683,195、4,800,159、および4,965,188には、一般的なＰＣＲ手法が開示されている。ＰＣＲは、一般に選択した核酸鋳型（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。ある態様に有用なプライマーには、記載したＢＫウイルス核酸配列内で核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドが含まれる（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４、５、６、７、９、および１０）。プライマーは制限消化物から常法により精製でき、あるいはそれは合成により製造できる。プライマーは最大効率を得るために好ましくは一本鎖であるが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーはまず変性され、すなわち鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる方法の１つは加熱によるものである。

【0050】

鋳型核酸が二本鎖であれば、それをＰＣＲに鋳型として使用できるにはその前に２つの鎖を分離する必要がある。鎖の分離は、物理的、化学的または酵素による手段を含めたいずれか適切な変性方法により達成できる。核酸鎖を分離する１方法は、その大半が変性する（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％より多くが変性する）まで核酸を加熱することを伴う。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、たとえば緩衝塩濃度ならびに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するであろうが、一般的には約９０℃から約１０５℃までの範囲で、その反応の特徴、たとえば温度および核酸の長さに応じた時間である。変性は一般に約３０秒〜４分（たとえば、１分〜２分３０秒、または１．５分）実施される。

【0051】

二本鎖鋳型核酸を熱によって変性させる場合、各プライマーがそれのターゲット配列にアニールするのを推進する温度にまで反応混合物を放冷する。アニーリングのための温度は、通常は約３５℃から約６５℃まで（たとえば、約４０℃〜約６０℃；約４５℃〜約５０℃）である。アニーリング時間は約１０秒から約１分まで（たとえば、約２０秒〜約５０秒；約３０秒〜約４０秒）であってよい。次いで反応混合物をポリメラーゼの活性が増強または最適化される温度、すなわちアニールしたプライマーから伸長が起きて鋳型核酸に相補的な生成物が生成するのに十分な温度に調整する。その温度は、核酸鋳型にアニールしている各プライマーから伸長生成物を合成するのに十分でなくてはならないが、伸長生成物をそれの相補的鋳型から変性させるほど高くてはならない（たとえば、伸長のための温度は一般に約４０℃から約８０℃までの範囲（たとえば、約５０℃〜約７０℃；約６０℃）である。伸長時間は約１０秒から約５分まで（たとえば、約３０秒〜約４分；約１分〜約３分；約１分３０秒〜約分）であってよい。

【0052】

レトロウイルスまたはＲＮＡウイルスのゲノムは、リボ核酸、すなわちＲＮＡから構成されている。そのような場合、鋳型核酸であるＲＮＡをまず酵素である逆転写酵素の作用により相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写しなければならない。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型およびそのＲＮＡの３’末端に対して相補的な短いプライマーを使って第１鎖ｃＤＮＡの合成を指令し、それを次いでポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型として直接使用できる。

【0053】

ＰＣＲアッセイにはＢＫウイルス核酸、たとえばＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を使用できる。鋳型核酸を精製する必要はない；それは、複雑な混合物の小画分、たとえばヒト細胞に内包されたＢＫウイルス核酸であってもよい。ＢＫウイルス核酸分子を、ルーティン手法、たとえばDiagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Persing et al. (eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.)に記載された手法により生体試料から抽出してもよい。核酸は多数の供給源のいずれか、たとえばプラスミド、あるいは細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、または高等生物、たとえば植物もしくは動物を含めた天然供給源から得ることができる。

【0054】

オリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４、５、６、７、９、および１０）を、プライマー伸長を誘発する反応条件下でＰＣＲ試薬と混和する。たとえば、鎖伸長反応物は一般に５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．００１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、０．５〜１．０μｇの変性した鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、および１０％のＤＭＳＯを含有する。反応物は通常はそれぞれ１５０〜３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、またはその１以上のアナログを含有する。

【0055】

新たに合成された鎖は二本鎖分子を形成し、それを後続反応工程に使用できる。連鎖分離、アニーリング、および伸長の工程を、ターゲットＢＫウイルス核酸分子に対応する目的量の増幅生成物を製造するのに必要な回数、反復することができる。反応の律速因子は、反応物中に存在するプライマー、熱安定酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）を、好ましくは少なくとも１回反復する。検出に使用するためには、サイクリング工程の回数はたとえば試料の性質に依存するであろう。試料が複雑な核酸混合物であれば、ターゲット配列を検出に十分なほど増幅するためにはより多くのサイクリング工程が必要であろう。一般に、サイクリング工程を少なくとも約２０回反復するが、４０回、６０回、または１００回すら反復することができる。

【0056】

蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（参照：たとえば、U.S. Patent No. 4,996,143、5,565,322、5,849,489、および6,162,603)は、ドナー蛍光部分と対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離以内に位置した際にそれら２つの蛍光部分間でエネルギー移動が起き、それを視覚化するか、あるいは他の形で検出および／または定量することができるという概念に基づく。ドナーが適切な波長の光線によって励起されると、ドナーは一般にアクセプターへエネルギーを移動させる。アクセプターは一般にその移動したエネルギーを異なる波長の光線の形で再放出する。特定の系においては、実質的に非蛍光性のドナー部分を含む生体分子により、非蛍光エネルギーをドナー部分とアクセプター部分の間で移動させることができる（参照：たとえば、US Patent No. 7,741,467)。

【0057】

一例において、オリゴヌクレオチドプローブはドナー蛍光部分（たとえば、ＨＥＸ）および対応するクエンチャー（たとえば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標） （ＢＨＱ）（たとえば、ＢＨＱ−２））を含むことができ、クエンチャーは蛍光性であってもなくてもよく、移動したエネルギーを光以外の形で散逸させる。プローブが無傷であれば、一般にドナー部分とアクセプター部分の間でエネルギー移動が起き、したがってドナー蛍光部分からの蛍光放出はアクセプター部分によって消光している。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中に、増幅生成物に結合したプローブはたとえばＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によって開裂し、したがってもはやドナー蛍光部分の蛍光放出が消光することはない。この目的のための代表的なプローブは、たとえばU.S. Patent No. 5,210,015、5,994,056、および6,171,785に記載されている。一般的に用いられるドナー-アクセプター対には、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対が含まれる。一般的に用いられるクエンチャーはＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。一般的に用いられるダーククエンチャー(dark quencher)には、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標） （ＢＨＱ）、たとえばＢＨＱ２（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州ノバート）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．，アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標） Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ−６５０（Ｂｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃ．，ミシガン州デクスター）が含まれる。

【0058】

他の例において、それぞれ蛍光部分を含む２つのオリゴヌクレオチドプローブを、ＢＫウイルスターゲット核酸配列に対するそれらのオリゴヌクレオチドプローブの相補性により決定される特定の位置で増幅生成物にハイブリダイズさせることができる。それらのオリゴヌクレオチドプローブが増幅生成物核酸に適切な位置でハイブリダイズすると、ＦＲＥＴ信号が発生する。ハイブリダイゼーション温度は約３５℃から約６５℃の範囲で、約１０秒〜約１分であってもよい。

【0059】

蛍光分析は、たとえば光子計数落射蛍光顕微鏡システム(photon counting epifluorescent microscope system)（適宜なダイクロイックミラー(dichroic mirror)、および特定範囲の蛍光発光をモニターするためのフィルターを収容）、光子計数光電子増倍管システム、または蛍光光度計を用いて実施することができる。エネルギー移動を開始するための、または発蛍光団の直接検出を可能にするための励起は、希望する範囲での励起のためにフィルター処理したアルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、または他の高強度光源を用いて実施することができる。

【0060】

本明細書中でドナー部分および対応するアクセプター部分に関して用いる“対応する”は、ドナー蛍光部分の発光スペクトルとオーバーラップする吸光スペクトルをもつアクセプター蛍光部分またはダーククエンチャーを表わす。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値より少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。それによって、効果的な非放射エネルギー移動がそれらの間で生じることができる。

【0061】

蛍光ドナー部分および対応するアクセプター部分は、一般に下記のことが得られるように選択される：（ａ）高効率のフェルスター(Foerster)エネルギー移動；（ｂ）大きな最終ストークス(Stokes)シフト（＞１００ｎｍ）；（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤部分（＞６００ｎｍ）内への発光のシフト；および（ｄ）ドナー励起波長における励起により生じる水ラマン(Raman)蛍光発光より高い波長への発光のシフト。たとえば、レーザー線付近（たとえば、ヘリウム−カドミウム４４２ｎｍまたはアルゴン４８８ｎｍ）にそれの励起最大をもち、高い吸光係数、高い量子収量、およびそれの蛍光発光と対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好なオーバーラップをもつ、ドナー蛍光部分を選択できる。高い吸光係数、高い量子収量、それの励起とドナー蛍光部分の発光との良好なオーバーラップ、および可視スペクトルの赤部分（＞６００ｎｍ）における発光をもつ、対応するアクセプター蛍光部分を選択できる。

【0062】

ＦＲＥＴ技術において種々のアクセプター蛍光部分と共に使用できる代表的なドナー蛍光部分には、下記のものが含まれる：フルオレセイン、ルシファーイエロー(Lucifer Yellow)、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル １−ピレンブチレート、および４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体。代表的なアクセプター蛍光部分には、用いるドナー蛍光部分に応じて下記のものが含まれる：ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン ローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミン五酢酸、またはランタニドイオン（たとえば、ユーロピウムまたはテルビウム）の他のキレート。ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分は、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティー）またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から入手できる。

【0063】

ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、リンカーアームを介して適宜なプローブオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分の距離に影響を及ぼすであろうから、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さはヌクレオチド塩基から蛍光部分までの距離オングストローム（Å）である。一般に、リンカーアームは約１０Åから約２５Åまでである。リンカーアームはWO 84/03285に記載された種類のものであってもよい。WO 84/03285には、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させるための方法、および蛍光部分をリンカーアームに結合させるための方法も開示されている。

【0064】

アクセプター蛍光部分、たとえばＬＣ Ｒｅｄ ６４０を、アミノリンカー（たとえば、Ｃ６−アミノホスホルアミダイト：ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティー）またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手できる）を含むオリゴヌクレオチドと結合させて、たとえばＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを得ることができる。ドナー蛍光部分、たとえばフルオレセインをオリゴヌクレオチドにカップリングさせるためにしばしば用いられるリンカーには、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣから誘導されたもの、たとえばフルオレセイン−ＣＰＧ類，Ｇｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）から）、アミドリンカー（フルオレセイン−ＮＨＳ−エステルから誘導されたもの、たとえばＣＸ−フルオレセイン−ＣＰＧ，ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サン・ラモン）から）、またはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン−ＮＨＳエステルのカップリングを必要とする３’−アミノ−ＣＰＧが含まれる。

【0065】

ＢＫウイルス増幅生成物（アンプリコン）の検出
本開示は、生体試料または非生体試料中のＢＫウイルスの存在または非存在を検出するための方法を提供する。提供する方法により、試料汚染、偽陰性、および偽陽性の問題が回避される。本方法には、１以上のＢＫウイルスプライマー対を用いて試料からのＢＫウイルスターゲット核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程、およびＦＲＥＴ検出工程を実施することが含まれる。多重サイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで実施される。ＢＫウイルスプライマーおよびプローブを用いてＢＫウイルスの存在を検出する方法を実施することができ、ＢＫウイルスの検出は試料中にＢＫウイルスが存在することの指標となる。

【0066】

本明細書に記載するように、増幅生成物はＦＲＥＴ技術を利用する標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いて検出できる。あるＦＲＥＴフォーマットはＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を用いて、増幅生成物の存在または非存在、したがってＢＫウイルスの存在または非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、たとえば１つの蛍光色素（たとえば、ＨＥＸ）および蛍光性であってもなくてもよい１つのクエンチャー（たとえば、ＢＨＱ−２）で標識した、１つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを用いる。第１蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーはＦＲＥＴの原理に従って第２蛍光部分またはダーククエンチャーへ移動する。第２部分は一般にクエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中に、標識されたハイブリダイゼーションプローブはターゲットＤＮＡ（すなわち、増幅生成物）に結合し、後続の伸長期にたとえばＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分は互いに空間的に離れた状態になる。その結果、第１蛍光部分がクエンチャーの非存在下で励起されると、第１蛍光部分からの蛍光発光を検出できる。たとえば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）はＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を用いており、試料中のＢＫウイルスの存在または非存在を検出するための本明細書に記載する方法を実施するのに適している。

【0067】

ＦＲＥＴと組み合わせたモレキュラービーコン(molecular beacon)も、リアルタイムＰＣＲ法を用いて増幅生成物の存在を検出するために使用できる。モレキュラービーコン技術は、第１蛍光部分および第２蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いる。第２蛍光部分は一般にクエンチャーであり、それらの蛍光標識は一般にプローブのそれぞれの末端に位置する。モレキュラービーコン技術は、二次構造（たとえば、ヘアピン）を形成できる配列をもつプローブオリゴヌクレオチドを用いる。プローブ内での二次構造形成の結果、プローブが溶解した状態では両方の蛍光部分が空間的に近接している。ターゲット核酸（すなわち、増幅生成物）にハイブリダイズした後にプローブの二次構造は崩壊し、蛍光部分が互いに離れた状態になり、それによって適切な波長の光で励起した後に第１蛍光部分の発光を検出できる。

【0068】

他の一般的フォーマットのＦＲＥＴ技術は、２つのハイブリダイゼーションプローブを用いる。各プローブを異なる蛍光部分で標識することができ、一般にターゲットＤＮＡ分子（たとえば、増幅生成物）において互いに近接してハイブリダイズするように設計する。ドナー蛍光部分、たとえばフルオレセインを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光源により４７０ｎｍで励起する。ＦＲＥＴに際して、フルオレセインはそれのエネルギーをアクセプター蛍光部分、たとえばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ ６４０）またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ ７０５）へ移動させる。次いでアクセプター蛍光部分はより長い波長の光を発生し、それがＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光検出システムにより検出される。効果的なＦＲＥＴは、それらの蛍光部分が近接した位置にありかつドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸光スペクトルとオーバーラップしている場合にのみ起きる可能性がある。発光信号の強度を、元のターゲットＤＮＡ分子の数（たとえば、ＢＫウイルスゲノムの数）と相関させることができる。ＢＫウイルスターゲット核酸の増幅が起きて増幅生成物が生成すれば、ハイブリダイゼーション工程の結果、プローブ対のメンバー間でのＦＲＥＴに基づく検出可能な信号が生じる。

【0069】

一般に、ＦＲＥＴの存在は試料中にＢＫウイルスが存在することの指標となり、ＦＲＥＴの非存在は試料中にＢＫウイルスが存在しないことの指標となる。ただし、不適切な検体採集、輸送の遅れ、不適当な輸送条件、またはある種の採集スワブ（アルギン酸カルシウムまたはアルミニウムシャフト）の使用はすべて、試験結果の成功および／または精度に影響を及ぼす可能性がある条件である。

【0070】

本方法の実施に使用できる代表的な生体試料には、呼吸器検体、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、および軟組織感染体が含まれるが、これらに限定されない。生体試料の採集および貯蔵の方法は当業者に知られている。生体試料を処理して（たとえば、当技術分野で知られている核酸抽出法および／またはキットにより）ＢＫウイルス核酸を放出させることができ、あるいは場合により生体試料をそのままＰＣＲ反応成分および適宜なオリゴヌクレオチドと接触させることができる。

【0071】

融解曲線分析は、サイクリングプロフィールに含めることができる追加工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡが融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度で融解するという事実に基づく；それは、ＤＮＡデュプレックスの半分が分離して一本鎖になった温度と定義される。ＤＮＡの融解温度は、主にそれのヌクレオチド組成に依存する。たとえば、ＧおよびＣヌクレオチドに富むＤＮＡ分子は、ＡおよびＴヌクレオチドを多量に含むものより高いＴｍをもつ。信号が消失する温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定できる。同様に、信号が発生する温度を検出することにより、プローブのアニーリング温度を決定できる。ＢＫウイルス増幅生成物からのＢＫウイルスプローブの融解温度（単数または複数）により、試料中におけるＢＫウイルスの存在または非存在を確認できる。

【0072】

各サーモサイクラー操作内で、対照試料をイクリングさせることもできる。陽性対照試料は、たとえば対照プライマーおよび対照プローブを用いてターゲット核酸対照鋳型（記載するターゲット遺伝子の増幅生成物以外のもの）を増幅することができる。陽性対照試料は、たとえばターゲット核酸分子を含有するプラスミド構築体をも増幅することができる。そのようなプラスミド対照を、内部で（たとえば、試料内で）、または患者の試料と並行して操作される別個の試料内で、意図するターゲットの検出に用いたものと同じプライマーおよびプローブを用いて増幅させることができる。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション、および／またはＦＲＥＴ反応の成否の指標である。各サーモサイクラー操作は、たとえばターゲット鋳型ＤＮＡを欠如する陰性対照をも含むことができる。陰性対照により汚染を判断することができる。これによって、その系および試薬が偽陽性信号を生じないことが確認される。したがって、対照反応によって、たとえばプライマーが配列特異的にアニールして伸長を開始する能力、およびプローブが配列特異的にハイブリダイズしてＦＲＥＴを起こさせる能力を容易に判定できる。

【0073】

ある態様において、本方法は汚染を避けるための工程を含む。たとえば、サーモサイクラー操作間での汚染を低減または排除するためにウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを用いる酵素法がU.S. Patent No. 5,035,996、5,683,896および5,945,313に記載されている。

【0074】

一般的なＰＣＲ法をＦＲＥＴ技術と組み合わせて本方法の実施に使用できる。一態様において、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器を用いる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術に用いられるリアルタイムＰＣＲが下記の特許出願に記載されている: WO 97/46707、WO 97/46714、およびWO 97/46712。

【0075】

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）はＰＣワークステーションを用いて操作することができ、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴオペレーティングシステムを利用できる。機械がキャピラリーを光学ユニット上に逐次配置するのに伴って、試料からの信号が得られる。ソフトウェアは蛍光信号をそれぞれの測定の直後にリアルタイムでディスプレイすることができる。蛍光取得時間は１０〜１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光−対−サイクルの定量的ディスプレイをすべての試料について連続的に更新することができる。作成されたデータをさらなる分析のために保存することができる。

【0076】

ＦＲＥＴに代わるものとして、二本鎖ＤＮＡ結合色素、たとえば蛍光性のＤＮＡ結合色素（たとえば、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンまたはＳＹＢＲ（登録商標）ゴールド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を用いて増幅生成物を検出することができる。そのような蛍光性のＤＮＡ結合色素は、二本鎖核酸と相互作用すると適切な波長の光で励起された後に蛍光信号を発生する。核酸インターカレーション色素のような二本鎖ＤＮＡ結合色素も使用できる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いる場合、増幅生成物の存在を確認するために通常は融解曲線解析を実施する。

【0077】

他の核酸−または信号−増幅方法も使用できることを当業者は認識しているであろう。そのような方法の例には、限定ではなく、分枝ＤＮＡ信号増幅、ループ仲介等温増幅(loop-mediated isothermal amplification)（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベースの増幅(nucleic acid sequence-based amplification)（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製(self-sustained sequence replication)（３ＳＲ）、連鎖置換増幅(strand displacement amplification)（ＳＤＡ）、またはスマート増幅プロセス バージョン２(smart amplification process version 2)（ＳＭＡＰ ２）が含まれる。

【0078】

本開示の態様は１以上の市販機器の構造によって制限されないと解釈される。
製品／キット
本開示の態様は、さらにＢＫウイルスを検出するための製品またはキットを提供する。製品には、ＢＫウイルス遺伝子ターゲットを検出するために用いるプライマーおよびプローブを、適切なパッケージング材料と一緒に収容することができる。ＢＫウイルスを検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、ＢＫウイルスターゲット核酸分子にハイブリダイズすることができる。さらに、キットには、ＤＮＡの固定化、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な適切にパッケージングされた試薬および材料、たとえば固体支持体、緩衝液、酵素、およびＤＮＡ標準品も収容することができる。プライマーおよびプローブを設計する方法を本明細書に開示し、ＢＫウイルスターゲット核酸分子を増幅する、およびそれらにハイブリダイズする、プライマーおよびプローブの代表例を提示する。

【0079】

製品にはプローブを標識するための１以上の蛍光部分も収容することができ、あるいはキットと共に供給されるプローブが標識されていてもよい。たとえば、製品にはＢＫウイルスプローブを標識するためのドナーおよび／またはアクセプター蛍光部分を収容することができる。適切なＦＲＥＴドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分の例は前記に提示されている。

【0080】

製品には、ＢＫウイルスプライマーおよびプローブを用いて試料中のＢＫウイルスを検出するための指示が施されたパッケージ挿入物またはパッケージラベルも収容することができる。製品にはさらに、本明細書に開示する方法を実施するための試薬（たとえば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、または汚染を防止するための薬剤）を収容することができる。そのような試薬は、本明細書に記載する市販機器の１つに特異的である可能性がある。

【0081】

本開示の態様は、試料中のＢＫウイルスを検出するためのプライマーのセットおよび１以上の検出可能なプローブをも提供する。
本開示の態様をさらに以下の例に記載する。

【実施例】

【0082】

以下の実施例および図面は、本発明の対象を理解するのを補助するために提示され、その真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく本発明を改変できると解釈される。

【0083】

ＢＫウイルスゲノムのターゲット領域はＢＫウイルスゲノムのＶＰ２領域であった。すべての核酸配列をアラインさせ、すべてのプライマーおよびプローブを、すべての既知ＢＫウイルス分離株に対するそれらの予測包括性および他の特性について考慮および採点した。

【0084】

実施例１：リアルタイムＢＫウイルスＰＣＲの特異度
ＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料を４．０×１０^５ ＢＫウイルスゲノム／μｌの濃度でシングルプレックス(singleplex)リアルタイムＰＣＲアッセイに用いた。用いた試薬にはｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００ジェネリックＰＣＲマスターミックスが含まれ、それはｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００に使用するための、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術に使用するプロフィールおよび条件を備えている。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は０．１０〜０．４０μＭの範囲であった。用いたｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００ ＰＣＲプロフィールを下記の表２に示す：

【0085】

【表2】

【0086】

リアルタイムＰＣＲアッセイに用いた、ＢＫウイルス特異的なオリゴヌクレオチドは、フォワードプライマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、リバースプライマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、プローブについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であった。これらの例に用いたプローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。

【0087】

このリアルタイムＢＫウイルスアッセイの結果は、リアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す図１に示される。さらに、ＢＫウイルスに特異的であり、交差反応性が無いことを確認するために、他のウイルスに由来するゲノムＤＮＡの存在下でリアルタイムＰＣＲ試験を実施した。図２に示す結果は、ＢＫウイルスプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および５）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）がＢＫウイルスに特異的であり、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）、ＨＳＶ−２、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの他のウイルス試料に由来するゲノムＤＮＡ（１×１０^８コピー／μｌで試験）と交差反応しないことを立証する。ＢＫウイルス以外のゲノムＤＮＡ試料については信号がみられなかった。

【0088】

よって、これらの結果は、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいてこれらのプライマーおよびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５）が特異的に増幅してＢＫウイルスの存在を検出することを立証する。

【0089】

実施例２：リアルタイムＢＫウイルスＰＣＲの感度
ＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料を、１×１０^１ゲノム／μｌ、１×１０^２ゲノム／μｌ、１×１０^３ゲノム／μｌ、１×１０^４ゲノム／μｌ、１×１０^５ゲノム／μｌ、および４×１０^５ゲノム／μｌを含む希釈パネルで種々の濃度においてリアルタイムＰＣＲアッセイに用いた。用いた試薬にはｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００ジェネリックＰＣＲマスターミックスが含まれ、それはｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００に使用するための、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術に使用するプロフィールおよび条件を備えている。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は０．１０〜０．４０μＭの範囲であった。用いたｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００ ＰＣＲプロフィールを前記の表２に示す。

【0090】

このリアルタイムＰＣＲアッセイに用いた、ＢＫウイルスに特異的なプライマーは、実施例１に用いたものと異なっていた。この場合、オリゴヌクレオチドはフォワードプライマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、リバースプライマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、プローブについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であった。これらの例に用いたプローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。

【0091】

このリアルタイムＢＫウイルスアッセイの結果は、希釈パネルのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す図３に示される。これらの結果は、プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）がＢＫウイルスを用量依存性様式で増幅および検出することを示す。

【0092】

よって、これらの結果は、リアルタイムＰＣＲアッセイで増幅してＢＫウイルスの存在を検出する際のこれらのプライマーおよびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜３）の感度を立証する。これらの結果は、プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が１×１０^１ゲノム／μｌに低下しても感度を達成できることを示す。

【0093】

実施例３：リアルタイムＢＫウイルスＰＣＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６〜８）の感度
ＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料を、１×１０^１ゲノム／μｌ、１×１０^２ゲノム／μｌ、および１×１０^３ゲノム／μｌを含む希釈パネルで種々の濃度においてリアルタイムＰＣＲアッセイに用いた。用いた試薬にはｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００ジェネリックＰＣＲマスターミックスが含まれ、それはｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００に使用するための、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術に使用するプロフィールおよび条件を備えている。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は０．１０〜０．４０μＭの範囲であった。用いたｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００ ＰＣＲプロフィールを前記の表２に示す。

【0094】

このリアルタイムＰＣＲアッセイに用いた、ＢＫウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドは、フォワードプライマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、リバースプライマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、プローブについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８であった。これらのオリゴヌクレオチドは、ＢＫウイルスゲノムのスモールｔ−抗原領域をターゲティングする。これらの例に用いたプローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。

【0095】

このリアルタイムＢＫウイルスアッセイの結果は、希釈パネルのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す図４に示される。これらの結果は、プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および７）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）がＢＫウイルスを用量依存性様式で増幅および検出することを示す。

【0096】

よって、これらの結果は、リアルタイムＰＣＲアッセイで増幅してＢＫウイルスの存在を検出する際のこれらのプライマーおよびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６〜８）の感度を立証する。これらの結果は、プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６および７）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）が１×１０^１ゲノム／μｌに低下しても感度を達成できることを示す。

【0097】

実施例４：リアルタイムＢＫウイルスＰＣＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９〜１１）の感度
ＢＫウイルスゲノムＤＮＡ試料を、１×１０^１ゲノム／μｌ、１×１０^２ゲノム／μｌ、および１×１０^３ゲノム／μｌを含む希釈パネルで種々の濃度においてリアルタイムＰＣＲアッセイに用いた。用いた試薬にはｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００ジェネリックＰＣＲマスターミックスが含まれ、それはｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００に使用するための、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術に使用するプロフィールおよび条件を備えている。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は０．１０〜０．４０μＭの範囲であった。用いたｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００ ＰＣＲプロフィールを前記の表２に示す。

【0098】

このリアルタイムＰＣＲアッセイに用いた、ＢＫウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドは、フォワードプライマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、リバースプライマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、プローブについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１であった。これらのオリゴヌクレオチドは、ＢＫウイルスゲノムのスモールｔ−抗原領域をターゲティングする。これらの例に用いたプローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。

【0099】

このリアルタイムＢＫウイルスアッセイの結果は、希釈パネルのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す図５に示される。これらの結果は、プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および１０）およびプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）がＢＫウイルスを用量依存性様式で増幅および検出することを示す。

【0100】

実施例５：二重ターゲット マルチプレックス リアルタイムＢＫウイルスＰＣＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６〜８）
オリゴヌクレオチドをマルチプレックス リアルタイムＰＣＲアッセイで試験し、それにより２つのターゲット（すなわち、“二重ターゲット”）を試験した（すなわち、ＶＰ２およびスモールｔ−抗原）。この試験において、ＢＫウイルス標準品をＥｘａｃｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＢＫＶ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ（Ｅｘａｃｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＥＤＸ），カタログ番号ＢＫＶＰ１００）から入手した。ＥＤＸ ＢＫＶ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌは多数の分子アッセイに有用な基準を、ＢＫウイルスについての１^ｓｔ ＷＨＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄに対して較正したものである。ＥＤＸ ＢＫＶ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌには無傷全ウイルスが含まれ、ポリオーマウイルス属ＢＫウイルスＤＮＡの存在を判定する（定量および定性）ために用いられる。これらの標準品を陰性ヒト血漿中に配合し、検体希釈液中へスパイクし、ｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００試料調製ワークフローを用いて抽出した。溶出液をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ上で走行させ、二重ターゲットマスターミックスで試験した。ＢＫウイルス標準品は０．２ＩＵ／反応（ｒｘｎ）から２×１０^４ＩＵ／反応（ｒｘｎ）までの範囲の濃度であった。

【0101】

このマルチプレックス リアルタイムＰＣＲアッセイに用いた、ＢＫウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドは、ＶＰ２領域をターゲティングする１セットのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５）およびスモールｔ−抗原をターゲティングする１セットのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６〜８）であった。これらの例に用いたプローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。

【0102】

このリアルタイムＢＫウイルスアッセイの結果は、希釈パネルのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す図６に示される。これらの結果は、２セットのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６〜８）がマルチプレックス設定において用量依存性様式でＢＫウイルスを増幅および検出できることを示す。

【0103】

実施例６：二重ターゲット マルチプレックス リアルタイムＢＫウイルスＰＣＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９〜１１）
オリゴヌクレオチドをマルチプレックス リアルタイムＰＣＲアッセイで試験し、それにより２つのターゲット（すなわち、“二重ターゲット”）を試験した（すなわち、ＶＰ２およびスモールｔ−抗原）。この試験において、ＢＫウイルス標準品をＥｘａｃｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＢＫＶ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ（Ｅｘａｃｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＥＤＸ），カタログ番号ＢＫＶＰ１００）から入手した。ＥＤＸ ＢＫＶ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌは多数の分子アッセイに有用な基準を、ＢＫウイルスについての１^ｓｔ ＷＨＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄに対して較正したものである。ＥＤＸ ＢＫＶ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌには無傷全ウイルスが含まれ、ポリオーマウイルス属ＢＫウイルスＤＮＡの存在を判定する（定量および定性）ために用いられる。これらの標準品を陰性ヒト血漿中に配合し、検体希釈液中へスパイクし、ｃｏｂａｓ（登録商標） ６８００／８８００試料調製ワークフローを用いて抽出した。溶出液をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ上で走行させ、二重ターゲットマスターミックスで試験した。ＢＫウイルス標準品は０．２ＩＵ／ｒｘｎから２×１０^４ＩＵ／ｒｘｎまでの範囲の濃度であった。

【0104】

このマルチプレックス リアルタイムＰＣＲアッセイに用いた、ＢＫウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドは、ＶＰ２領域をターゲティングする１セットのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５）およびスモールｔ−抗原をターゲティングする１セットのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９〜１１）であった。これらの例に用いたプローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。

【0105】

このリアルタイムＢＫウイルスアッセイの結果は、希釈パネルのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す図７に示される。これらの結果は、２セットのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９〜１１）がマルチプレックス設定において用量依存性様式でＢＫウイルスを増幅および検出できることを示す。

【0106】

以上の本発明は明確化および理解の目的で、ある程度詳細に記載されているが、この開示内容を読むことによって本発明の範囲から逸脱することなく形式および詳細事項の種々の変更をなしうることが当業者には明らかであろう。たとえば、前記のすべての手法および詳細装置を種々の組合せで使用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]