特許 6860103 新規抗ヒトＴｉｅ２抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6860103

(24)【登録日】2021年3月30日

(45)【発行日】2021年4月14日

(54)【発明の名称】新規抗ヒトＴｉｅ２抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20210405BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210405BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210405BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210405BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210405BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210405BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20210405BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13

   C12N15/63 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   !C07K16/28

【請求項の数】6

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2020-32764(P2020-32764)

(22)【出願日】2020年2月28日

(62)【分割の表示】特願2016-534433(P2016-534433)の分割

【原出願日】2015年7月14日

(65)【公開番号】特開2020-103302(P2020-103302A)

(43)【公開日】2020年7月9日

【審査請求日】2020年2月28日

(31)【優先権主張番号】特願2014-145135(P2014-145135)

(32)【優先日】2014年7月15日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000006677

【氏名又は名称】アステラス製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100137464

【弁理士】

【氏名又は名称】濱井 康丞

(74)【代理人】

【識別番号】100117846

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 ▲頼▼子

(74)【代理人】

【識別番号】100158089

【弁理士】

【氏名又は名称】寺内 輝和

(74)【代理人】

【識別番号】100158252

【弁理士】

【氏名又は名称】飯室 加奈

(74)【代理人】

【識別番号】100172546

【弁理士】

【氏名又は名称】影山 路人

(74)【代理人】

【識別番号】100177482

【弁理士】

【氏名又は名称】川濱 周弥

(74)【代理人】

【識別番号】100191639

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 啓明

(72)【発明者】

【氏名】蒲原 正純

(72)【発明者】

【氏名】八木 繁典

(72)【発明者】

【氏名】石井 芳則

(72)【発明者】

【氏名】奈良 裕美

【審査官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５２５１０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０２８４４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０２００６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 植田充美監修，抗体医薬の最前線，２００７年 ７月２０日，第１刷，p.3-13

【文献】 Journal of Pharmaceutical Sciences，２００８年 ７月，Vol.97, No.7，p.2426-2447

【文献】 Biomaterials，２０１５年 ２月１７日，Vol.51，p.119-128

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

Ｃ０７Ｋ １６／００−４６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）および（ｂ）を含むポリヌクレオチド：
（ａ）４つの重鎖可変領域及び４つの軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該重鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなり、
該軽鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、
１つの該重鎖可変領域と１つの該軽鎖可変領域が１つの抗原結合部位を構成し、該抗体又はその抗原結合フラグメントが４つの抗原結合部位を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド；及び
（ｂ）該抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項2】

以下の（ａ）および（ｂ）を含むポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド；及び
（ｂ）該抗ヒトＴｉｅ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項4】

請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項5】

以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、発現ベクターで形質転換された宿主細胞：
（ａ）４つの重鎖可変領域及び４つの軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該重鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなり、
該軽鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、
１つの該重鎖可変領域と１つの該軽鎖可変領域が１つの抗原結合部位を構成し、該抗体又はその抗原結合フラグメントが４つの抗原結合部位を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）４つの重鎖可変領域及び４つの軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該重鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなり、
該軽鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、
１つの該重鎖可変領域と１つの該軽鎖可変領域が１つの抗原結合部位を構成し、該抗体又はその抗原結合フラグメントが４つの抗原結合部位を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【請求項6】

以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、発現ベクターで形質転換された宿主細胞：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規な抗ヒトＴｉｅ２抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｔｉｅ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＥＧＦ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ ２）は受容体型チロシンキナーゼである。Ｔｉｅ２は主に血管内皮細胞に発現していることが知られている。そのリガンドとしては、多量体型分泌糖蛋白質であるアンジオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１；Ａｎｇ−１）及びアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）が知られている。

【0003】

Ａｎｇ−１はＴｉｅ２に対してアゴニストとして機能する。Ｔｉｅ２はＡｎｇ−１と結合すると、多量体を形成することによって自己リン酸化し、細胞内にシグナルを伝達して、血管内皮細胞の抗アポトーシス作用、血管の透過性阻害作用等の血管安定化、成熟化及びリモデリングを促進することが示されている（Ｃｅｌｌ、１９９６、Ｖｏｌ．８７、ｐ．１１７１−１１８０。Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１９９４、Ｖｏｌ．８、ｐ．１８９７−１９０９。Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９、Ｖｏｌ．２８６、ｐ．２５１１−２５１４。Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２００３、Ｖｏｌ．１０、ｐ．３８−４４）。また、Ａｎｇ−１はＴｉｅ２活性化を介して一酸化窒素産生を介した血管拡張及び血流亢進作用を発揮することも知られている（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．、２０１４、Ｖｏｌ．８０、ｐ．４３−５１）。さらに、Ａｎｇ−１はＴｉｅ２活性化を介して血管内皮カドヘリンのインターナリゼーションを抑制することで血管の安定化に寄与していると考えられている（Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ、２００８、Ｖｏｌ．１４、ｐ．２５−３６）。一方、Ａｎｇ−２は血管内皮細胞上でＴｉｅ２を活性化できるとされているが、その活性化はＡｎｇ−１に比して部分的であるとされている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００９、Ｖｏｌ．２９、ｐ．２０１１−２０２２）。Ａｎｇ−２はＡｎｇ−１とＴｉｅ２の同じ部位へ同程度の親和性で結合するため、結果的にＡｎｇ−１によるＴｉｅ２の活性化を部分的な活性に置き換えてしまうことからＡｎｇ−２は内因性のＴｉｅ２アンタゴニストとして機能することが示唆されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７、Ｖｏｌ．２７７、ｐ．５５−６０）。

【0004】

血中Ａｎｇ−２濃度の上昇が、糖尿病、糖尿病網膜症、敗血症及び急性腎不全などの、血管の脆弱性が病因の一つとして考えられている疾患で報告されている（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２００５、Ｖｏｌ．１８０、ｐ．１１３−１１８。Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、２００４、Ｖｏｌ．８８、ｐ．１５４３−１５４６。Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ、２００９、Ｖｏｌ．１３、ｐ．２０７。Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、２０１０、Ｖｏｌ．３６、ｐ．４６２−４７０）。

【0005】

糖尿病網膜症及び糖尿病黄斑浮腫との関連としては、患者の血漿中又は硝子体液中でＡｎｇ−２濃度が上昇している報告がある（Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、２００４、Ｖｏｌ．８８、ｐ．１５４３−１５４６。Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、２００５、Ｖｏｌ．８９、ｐ．４８０−４８３）。また、糖尿病網膜症患者の網膜血管においては、Ａｎｇ−１の主たる産生細胞である周皮細胞（Ｃｅｌｌ、１９９６、Ｖｏｌ．８７、ｐ．１１６１−１１６９）の脱落が特徴的な病変のひとつとして知られている（Ｒｅｔｉｎａ、２０１３、Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．９２５−９３９）。病態の一つとして黄斑部が肥厚する糖尿病黄斑浮腫が知られているが、硝子体除去の手術によって眼内Ａｎｇ−１濃度が上昇した患者では黄斑部の肥厚が減少しているとの報告もある（Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、２００５、Ｖｏｌ．８９、ｐ．４８０−４８３）。さらに、網膜血管の周皮細胞を脱落させた網膜浮腫マウスモデルにおいて、網膜の浮腫や出血が観察され、Ａｎｇ−１の硝子体内投与で病態発症が阻害されたこと（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００２、Ｖｏｌ．１１０、ｐ．１６１９−１６２８）、及びマウス糖尿病網膜症モデルを用いた試験において、Ａｎｇ−１をコードする遺伝子を含むアデノウイルスを投与すると網膜における血管内皮細胞障害が抑制されたこと（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００２、Ｖｏｌ．１６０、ｐ．１６８３−１６９３）から、Ａｎｇ−１の病態改善作用が示唆されている。一方で、Ａｎｇ−２を網膜に特異的に過剰発現させた遺伝子改変マウスでは網膜の細胞障害が亢進することが報告されている（Ａｃｔａ．Ｄｉａｂｅｔｏｌ．２０１０、Ｖｏｌ．４７、ｐ．５９−６４）。

【0006】

重症下肢虚血との関連としては、末梢動脈疾患において血漿中Ａｎｇ−２が増加していることや、重症下肢虚血患者の虚血肢筋又は皮膚組織においてＡｎｇ−２発現量が高いことが報告されている（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉａｌ．、２００８、Ｖｏｌ．５２、ｐ．３８７−３９３。Ｉｎｔ Ａｎｇｉｏｌ．、２０１１、Ｖｏｌ．３０、ｐ．２５−３４）。また、ラット後肢虚血モデルを用いた試験において、Ａｎｇ−１をコードする遺伝子を含むウイルスベクターの投与により、虚血肢の血流回復が促進され、抗アポトーシス効果が誘導されることが示されている（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００９、Ｖｏｌ．１２、ｐ．２４３−２４９）。２型糖尿病モデル動物であるｄｂ／ｄｂマウスの冠動脈結紮モデルでは、Ａｎｇ−１をコードする遺伝子を含むウイルス投与により、梗塞境界域において平滑筋細胞に覆われた成熟血管が増加することが報告されていることから（Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００８、Ｖｏｌ．５７、ｐ．３３３５−３３４３）、Ｔｉｅ２シグナルの活性化により、不安定な新生血管の成熟を促す効果が期待できる。

【0007】

ヒトＴｉｅ２に対してアゴニスト作用を示す抗体としては、マウスモノクローナル抗体１５Ｂ８（特許文献１）が報告されている。１５Ｂ８はヒトＴｉｅ２に結合し、ヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣの抗アポトーシス作用を誘導することが報告されている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０００／０１８８０４号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の課題は、ヒトＴｉｅ２に結合し、ヒトＴｉｅ２を活性化させることで糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血を予防又は治療する抗ヒトＴｉｅ２抗体を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、抗ヒトＴｉｅ２抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体を作製し（実施例１〜８）、当該抗ヒトＴｉｅ２抗体がヒトＴｉｅ２に結合すること（実施例１２）、ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞の抗アポトーシス作用を誘導すること（実施例９及び１１）、並びに、ラット血管透過性亢進モデルにおいて血管透過性亢進を阻害すること（実施例１０及び１３）を見出した。これらの結果、前記抗ヒトＴｉｅ２抗体を提供し、本発明を完成した。

【0011】

すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含んでもよい。
［１］４つの重鎖可変領域及び４つの軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該重鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含み、
該軽鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号２４から３９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５５から６１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９４から１０２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含み、
１つの該重鎖可変領域と１つの該軽鎖可変領域が１つの抗原結合部位を構成し、該抗体又はその抗原結合フラグメントが４つの抗原結合部位を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［２］以下の（１）又は（２）から選択される、［１］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント：
（１）４つの重鎖可変領域及び４つの軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該重鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなり、
該軽鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、
１つの該重鎖可変領域と１つの該軽鎖可変領域が１つの抗原結合部位を構成し、該抗体又はその抗原結合フラグメントが４つの抗原結合部位を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント；並びに
（２）（１）の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３］［１］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体であって、該抗体は２つの重鎖及び４つの軽鎖を含み、
各重鎖は、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造を２つ、並びにＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、一方の該構造のカルボキシ末端（Ｃ末端）がリンカーを介してもう一方の該構造のアミノ末端（Ｎ末端）と連結されており、
各軽鎖は、配列番号４のアミノ酸番号２４から３９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５５から６１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９４から１０２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［４］以下の（１）又は（２）から選択される、［３］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体：
（１）２つの重鎖及び４つの軽鎖を含み、
各重鎖は、配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造を２つ、並びにＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、一方の該構造のＣ末端がリンカーを介してもう一方の該構造のＮ末端と連結されており、
各軽鎖は、配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体；並びに
（２）（１）の抗ヒトＴｉｅ２抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［５］［４］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体であって、該抗ヒトＴｉｅ２抗体は、２つの重鎖及び４つの軽鎖を含み、
各重鎖は、配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造を２つ、並びにＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、一方の該構造のＣ末端がリンカーを介してもう一方の該構造のＮ末端と連結されており、
各軽鎖は、配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［６］［５］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［７］翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、［６］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［８］ヒトＩｇγ１定常領域又はヒトＩｇγ４定常領域である重鎖定常領域を含む、［３］〜［７］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［９］ヒトＩｇγ１定常領域がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域、又は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３３１Ｓ、及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である、［８］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１０］ヒトＩｇγ４定常領域がＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ４定常領域である、［８］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１１］ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、［３］〜［７］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１２］ヒトＩｇγ１定常領域又はヒトＩｇγ４定常領域である重鎖定常領域を含み、ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、［３］〜［７］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１３］ヒトＩｇγ１定常領域がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域、又は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３３１Ｓ、及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である、［１２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１４］ヒトＩｇγ４定常領域がＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ４定常領域である、［１２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１５］リンカーが５〜７０アミノ酸からなるペプチドリンカーである、［３］〜［７］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１６］リンカーがヒンジ領域又はその一部分のアミノ酸配列を含む、［１５］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１７］リンカーが配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる、［１６］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１８］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、［４］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［１９］配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、［４］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［２０］配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、［４］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［２１］［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［２２］翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、［２１］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［２３］配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、［２１］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［２４］［１８］又は［２３］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体と同じヒトＴｉｅ２エピトープに結合する、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［２５］ヒトＴｉｅ２エピトープが、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００４５０．２のアミノ酸番号１９２、１９５及び１９７のアミノ酸を含むヒトＴｉｅ２エピトープである、［２４］に記載の４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［２６］［２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
［２７］［２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
［２８］［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
［２９］［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
［３０］［２６］及び／又は［２７］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［３１］［２８］及び／又は［２９］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［３２］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、［３０］に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（ａ）［２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）［２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）［２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［３３］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、［３１］に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（ａ）［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［３４］以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法：
（ａ）［２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）［２］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［３５］以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＴｉｅ２抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＴｉｅ２抗体を生産する方法：
（ａ）［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）［１８］〜［２０］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗ヒトＴｉｅ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［３６］［３４］に記載の方法で生産された抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３７］［３５］に記載の方法で生産された抗ヒトＴｉｅ２抗体。
［３８］［１］〜［２３］、［３６］及び［３７］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［３９］［５］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体、［６］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［４０］［１８］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体、［２３］に記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［４１］糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血の予防又は治療用医薬組成物である、［３８］〜［４０］のいずれかに記載の医薬組成物。
［４２］［１］〜［２３］、［３６］及び［３７］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血を予防又は治療する方法。
［４３］糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血の予防又は治療に使用するための、［１］〜［２３］、［３６］及び［３７］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４４］糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血の予防又は治療用医薬組成物の製造における、［１］〜［２３］、［３６］及び［３７］のいずれかに記載の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。

【0012】

前記抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントには、他のペプチド及び蛋白質との融合抗体や、修飾剤を結合させた修飾抗体も含まれる。

【発明の効果】

【0013】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体は、ヒトＴｉｅ２に結合して、ヒトＴｉｅ２を活性化させることで糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血の予防又は治療剤として使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明の４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体のフォーマットの一例を示す。

【0015】

【図2】完全ヒト型２−１６Ａ２及びＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴの、ラット血管透過性モデルにおける血管透過性阻害作用を示す。縦軸はエバンスブルー色素漏出量を示す。（＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１ ｖｓ Ｖｅｈｉｃｌｅ群）。

【0016】

【図3】ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのラット血管透過性モデルにおける血管透過性阻害作用を示す。縦軸はエバンスブルー色素漏出量を示す。（＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１ ｖｓ Ｖｅｈｉｃｌｅ群）。

【0017】

【図4】ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのマウス網膜血管周皮細胞脱落モデルにおける網膜浮腫阻害作用を示す。縦軸は網膜神経線維層及び網膜神経節細胞層の面積の和を示す。（＃＃：ｐ＜０．００５ ｖｓ Ｃｏｎｔ．群、＊：ｐ＜０．０５ ｖｓ Ｖｅｈ．群）。

【0018】

【図5】ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡの後肢虚血マウスモデルにおける血流改善作用を示す。縦軸は血流量を示す。（＊：ｐ＜０．０５ ｖｓ対照群、＊＊：ｐ＜０．０１ ｖｓ対照群）。

【0019】

【図6】ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのエピトープ解析の一環として、表面プラズモン共鳴現象の結果の代表例を示す。縦軸は結合応答性（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ：ＲＵ）を、横軸は時間（秒）を示す。

【0020】

【図7】ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのエピトープ解析の一環として、ＥＬＩＳＡの結果を示す。縦軸は発光強度を、横軸はＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下に、本発明について詳述する。

【0022】

抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在し、その抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。

【0023】

鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにアミノ末端（Ｎ末端）に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域とよばれている。可変領域よりカルボキシ末端（Ｃ末端）側のアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれている。

【0024】

抗体の抗原結合部位は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）によって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とよんでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。

【0025】

定常領域に関して、重鎖定常領域は３つの領域から構成されており、可変領域側から順に、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域とよばれている。軽鎖定常領域は１つの領域から構成されている。ＣＨ１領域及びＣＨ２領域の間にはヒンジ領域と呼ばれるペプチド配列が存在する。ヒンジ領域は、重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造の可動性に関与している。

【0026】

抗体のＶＨ及びＶＬを含む各種抗原結合フラグメントも抗原結合活性を有し、このような代表的な抗原結合フラグメントとして、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２が挙げられる。Ｆａｂは、軽鎖と、ＶＨ、ＣＨ１領域とヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントである。Ｆａｂ’は、軽鎖と、ＶＨ、ＣＨ１領域とヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した二価の抗体フラグメントである。ｓｃＦｖは、リンカーで連結されたＶＨとＶＬから構成される、一価の抗体フラグメントである。

【0027】

２つ以上の抗原結合部位を有する抗体を多価抗体という。そのうち、抗原結合部位を４つ有する抗体を４価抗体という。４価抗体には種々のフォーマット（構造）が報告されている（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０、Ｖｏｌ．１０、ｐ．３０１−３１６。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、Ｖｏｌ．１７０、ｐ．４８５４−４８６１。Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、Ｖｏｌ．３７、ｐ．１０６７−１０７７。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００７、Ｖｏｌ．４０６、ｐ．２３７−２４６。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００３、Ｖｏｌ．２７９、ｐ．２１９−２３２）。例えば、２価抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＮ末端にリンカーを介してさらに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ連結された４価抗体、２つの重鎖及び４つの軽鎖を含み、各重鎖が重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造を２つ含む４価抗体、４量体ストレプトアビジンの各ストレプトアビジンにｓｃＦｖのＣ末端が１つずつ結合した４価抗体、４量体ｐ５３の各ｐ５３にｓｃＦｖのＣ末端が１つずつ結合した４価抗体、及び、２量体ｓｃＦｖのＣ末端にリンカーを介してＣＨ３領域のＮ末端が連結された４価抗体等が報告されている。

【0028】

＜本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体＞
本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントには、以下の特徴を有する抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。
４つの重鎖可変領域及び４つの軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該重鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなり、
該軽鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、
１つの該重鎖可変領域と１つの該軽鎖可変領域が１つの抗原結合部位を構成し、該抗体又はその抗原結合フラグメントが４つの抗原結合部位を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント。

【0029】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントは４価抗体である限り、抗体のフォーマットは特に限定されず、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、例えば、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０、Ｖｏｌ．１０、ｐ．３０１−３１６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、Ｖｏｌ．１７０、ｐ．４８５４−４８６１、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、Ｖｏｌ．３７、ｐ．１０６７−１０７７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００７、Ｖｏｌ．４０６、ｐ．２３７−２４６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００３、Ｖｏｌ．２７９、ｐ．２１９−２３２等に記載されるような、種々の４価抗体のフォーマットを用いることができる。

【0030】

好ましくは、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体は、２つの重鎖及び４つの軽鎖を含み、
各重鎖は、配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造を２つ、並びにＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、一方の該構造のＣ末端がリンカーを介してもう一方の該構造のＮ末端と連結されており、
各軽鎖は、配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体である。
以下、当該フォーマットの４価抗体をタンデム抗体とも称し、その一例を図１に示す。

【0031】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体がタンデム抗体である場合、定常領域としては、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖定常領域としてＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４の定常領域、軽鎖定常領域としてＩｇλ又はＩｇκの定常領域）も選択可能であり得る。好ましくは、重鎖定常領域（ＣＨ１領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む）は、ヒトＩｇγ１定常領域又はヒトＩｇγ４定常領域である。好ましくは、軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域である。

【0032】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖定常領域としてヒトＩｇγ１定常領域を用いる場合、ヒトＩｇγ１定常領域のＣＨ１領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域としては、例えば、配列番号８のアミノ酸番号３５０から４４７までのアミノ酸配列からなるＣＨ１領域、配列番号８のアミノ酸番号４６３から５７２までのアミノ酸配列からなるＣＨ２領域、及び配列番号８のアミノ酸番号５７３から６７９までのアミノ酸配列からなるＣＨ３領域が挙げられる。

【0033】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖定常領域としてヒトＩｇγ１定常領域を用いる場合、抗体の抗体依存細胞傷害活性や補体依存傷害活性を低下させるためにＬ２３４Ａ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２３４位のロイシンのアラニンでの置換）、Ｌ２３５Ａ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２３５位のロイシンのアラニンでの置換）及びＰ３３１Ｓ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸３３１位のプロリンのセリンでの置換）等のアミノ酸変異を導入したヒトＩｇγ１定常領域を用いることもできる（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．５、ｐ．６３３−６３９）。さらに、体内動態の観点から、血液中より速やかに消失させるためにＩ２５３Ａ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２５３位のイソロイシンのアラニンでの置換）等のアミノ酸変異を導入したヒトＩｇγ１定常領域を用いることもできる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、Ｖｏｌ．１５８、ｐ．２２１１−２２１７）。本明細書中で使用される抗体の定常領域におけるアミノ酸変異導入に関する残基番号については、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、 ５ｔｈ Ｅｄ．、 Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に従う。

【0034】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖定常領域としてヒトＩｇγ１定常領域を用いる場合、好ましくは、該ヒトＩｇγ１定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３３１Ｓ及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である。Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域のＣＨ１領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域としては、例えば、配列番号２のアミノ酸番号３５０から４４７までのアミノ酸配列からなるＣＨ１領域、配列番号２のアミノ酸番号４６３から５７２までのアミノ酸配列からなるＣＨ２領域、及び配列番号２のアミノ酸番号５７３から６７９までのアミノ酸配列からなるＣＨ３領域が挙げられる。Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３３１Ｓ及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域のＣＨ１領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域としては、例えば、配列番号６のアミノ酸番号３５０から４４７までのアミノ酸配列からなるＣＨ１領域、配列番号６のアミノ酸番号４６３から５７２までのアミノ酸配列からなるＣＨ２領域、及び配列番号６のアミノ酸番号５７３から６７９までのアミノ酸配列からなるＣＨ３領域が挙げられる。

【0035】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖定常領域としてヒトＩｇγ４定常領域を用いる場合、Ｆａｂアーム交換を抑制するためにＳ２２８Ｐ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２２８位のセリンのプロリンでの置換）及びＬ２３５Ｅ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２３５位のロイシンのグルタミン酸での置換）等のアミノ酸変異を導入したヒトＩｇγ４定常領域を用いることもできる（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ．、２０１０、Ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．１、ｐ．８４−９１）。

【0036】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖定常領域としてヒトＩｇγ４定常領域を用いる場合、好ましくは、該ヒトＩｇγ４定常領域は、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ４定常領域である。Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ４定常領域のＣＨ１領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域としては、例えば、配列番号１０のアミノ酸番号３５０から４４７までのアミノ酸配列からなるＣＨ１領域、配列番号１０のアミノ酸番号４６０から５６９までのアミノ酸配列からなるＣＨ２領域、及び配列番号１０のアミノ酸番号５７０から６７６までのアミノ酸配列からなるＣＨ３領域が挙げられる。

【0037】

ヒトＩｇκ定常領域としては、例えば、配列番号４のアミノ酸番号１１４から２１９までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇκ定常領域が挙げられる。

【0038】

好ましくは、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体がタンデム抗体である場合、重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域又はヒトＩｇγ４定常領域であり、軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である。重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域の場合、好ましくは、該ヒトＩｇγ１定常領域が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３３１Ｓ及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である。重鎖定常領域がヒトＩｇγ４定常領域の場合、好ましくは、該ヒトＩｇγ４定常領域が、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ４定常領域である。

【0039】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体がタンデム抗体である場合、重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造同士を連結するリンカーとしては、抗体がその機能を有する限り、任意のペプチド（ペプチドリンカー）を使用し得る。ペプチドリンカーの長さ及びアミノ酸配列は当業者に適宜選択され得る。好ましくは、ペプチドリンカーの長さは５〜７０アミノ酸である。好ましくは、ペプチドリンカーは、ヒンジ領域又はその一部分のアミノ酸配列を含む。ヒンジ領域とは、抗体のＣＨ１領域とＣＨ２領域の間に存在する領域を意味し、使用するヒンジ領域としては、例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のヒンジ領域が挙げられる。ヒンジ領域の一部分とは、ヒンジ領域中の少なくとも５アミノ酸連続する領域を意味し、好ましくはヒンジ領域のＮ末端から少なくとも５アミノ酸連続する領域を意味する。ヒンジ領域の一部分としては、例えば、ＩｇＧ１のヒンジ領域の場合、Ｎ末端から５アミノ酸連続する領域（配列番号１３のアミノ酸番号１から５までのアミノ酸配列からなる）、及び、ＩｇＧ３のヒンジ領域の場合、Ｎ末端から１２アミノ酸連続する領域（配列番号１４のアミノ酸番号１から１２までのアミノ酸配列からなる）が挙げられる。１つの実施形態において、リンカーは、ヒンジ領域のＮ末端から少なくとも５アミノ酸連続する領域のアミノ酸配列を含み、該リンカーのＣ末端にアミノ酸配列ＧｌｙＳｅｒを含む。このようなリンカーとしては、配列番号１３〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーが挙げられ、好ましくは、リンカーは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる。

【0040】

１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体は、以下のｉ）〜ｉｖ）のいずれかの特徴を有する抗ヒトＴｉｅ２抗体である。
ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
ｉｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
ｉｖ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。

【0041】

抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００８、Ｖｏｌ．９７、ｐ．２４２６−２４４７）。

【0042】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントには、翻訳後修飾を受けた抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。翻訳後修飾を受けた本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの例としては、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失を受けた抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントが挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化又はＣ末端リジン欠失による翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．２４−３９）。

【0043】

１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体は、以下の（１）〜（４）のいずれかの特徴を有する抗ヒトＴｉｅ２抗体である。
（１）配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び／又は配列番号２のアミノ酸番号６７９のリジンを欠くアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、並びに配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（２）配列番号６のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び／又は配列番号６のアミノ酸番号６７９のリジンを欠くアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、並びに配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（３）配列番号８のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び／又は配列番号８のアミノ酸番号６７９のリジンを欠くアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、並びに配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（４）配列番号１０のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び／又は配列番号１０のアミノ酸番号６７６のリジンを欠くアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、並びに配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。

【0044】

１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体は、下記の特徴を有する抗ヒトＴｉｅ２抗体である。
配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。

【0045】

本発明には、以下の特徴を有する抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。
４つの重鎖可変領域及び４つの軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該重鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含み、
該軽鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号２４から３９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５５から６１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９４から１０２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含み、
１つの該重鎖可変領域と１つの該軽鎖可変領域が１つの抗原結合部位を構成し、該抗体又はその抗原結合フラグメントが４つの抗原結合部位を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント。

【0046】

また、本発明には、以下の特徴を有する抗ヒトＴｉｅ２抗体も含まれる。
２つの重鎖及び４つの軽鎖を含み、
各重鎖は、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造を２つ、並びにＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、一方の該構造のカルボキシ末端がリンカーを介してもう一方の該構造のアミノ末端と連結されており、
各軽鎖は、配列番号４のアミノ酸番号２４から３９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５５から６１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９４から１０２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む、
抗ヒトＴｉｅ２抗体。

【0047】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体は、ヒトＴｉｅ２に結合する抗体である。抗体がヒトＴｉｅ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００４５０．２）に結合するか否かは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、例示的な方法において、ヒトＴｉｅ２及びヒトＦｃを融合させた蛋白質をＥＬＩＳＡプレートに固相化し、これに対して被験抗体を添加して反応させる。ビオチン標識した抗ＩｇＧ抗体等の２次抗体を反応させ、洗浄した後、アルカリフォスファターゼ等の酵素が結合したストレプトアビジンを反応させる。洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、アルカリフォスファターゼの場合、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｕｌｔｒａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＡＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ａｎｄ／ｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（４５０ｎｍ）（ＢｉｏＦＸ社、ＡＰＵ４−０１００−０１）等）を用いた活性測定を行うことによって、被験抗体がヒトＴｉｅ２に結合するか否かを確認することができる。活性の具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例１２に記載されるような方法を用いることができる。

【0048】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体には、ヒトＴｉｅ２に結合する抗体であれば、ヒトＴｉｅ２への結合に加え、他の動物由来のＴｉｅ２（例えば、サルＴｉｅ２）にも結合する抗体も含まれる。

【0049】

好ましくは、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体は、ヒトＴｉｅ２に結合し、かつ、ヒトＴｉｅ２発現細胞に対して抗アポトーシス活性を有する。抗体がヒトＴｉｅ２発現細胞に対する抗アポトーシス活性を有することを評価するための具体的な方法としては、例えば、後記実施例４に記載されるような方法を用いることができる。

【0050】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントには、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体と同じヒトＴｉｅ２エピトープに結合する、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。ここでエピトープとは抗体が認識する抗原部位をいう。

【0051】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントには、ヒトＴｉｅ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００４５０．２）のアミノ酸番号１９２、１９５及び１９７のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＴｉｅ２エピトープに結合する、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。

【0052】

また、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントには、ヒトＴｉｅ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００４５０．２）のアミノ酸番号１９２、１９５及び１９７を含むヒトＴｉｅ２エピトープに結合する、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。

【0053】

配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体と同じヒトＴｉｅ２エピトープに結合する、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントは、公知のエピトープ決定方法を用いて取得することができる。エピトープを決定する方法としては、例えば、水素重水素交換質量分析法、Ｘ線結晶構造解析、並びに、ヒトＴｉｅ２のアミノ酸置換変異体又はヒトＴｉｅ２部分ペプチド等を用いたＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴現象等の方法が挙げられる。

【0054】

被験抗体が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体と同じヒトＴｉｅ２エピトープに結合するか否かは、上記の公知エピトープ決定方法を用いて確認することができる。水素重水素交換質量分析法を用いる場合、被験抗体非存在下で重水素置換したヒトＴｉｅ２と被験抗体存在下で重水素置換したヒトＴｉｅ２をそれぞれペプチドに分解し、各ペプチドの分子量を測定することで重水素置換の割合を算出する。被験抗体の有無によるヒトＴｉｅ２の重水素置換の割合の差から被験抗体のヒトＴｉｅ２エピトープを決定することができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトＴｉｅ２の点変異体を作製する。変異体ヒトＴｉｅ２を固相化し、これに対して被験抗体を添加して反応させる。反応後、ビオチン標識抗ヒトカッパー軽鎖抗体等の二次抗体を反応させ、洗浄する。その後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２１３２４）を反応させて、洗浄する。そして、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｕｌｔｒａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＡＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ａｎｄ／ｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（４５０ｎｍ）等を用いた活性測定を行うことによって、被験抗体が当該変異体ヒトＴｉｅ２に結合するか否かを確認することができる。種々の変異体ヒトＴｉｅ２に対する結合活性を評価することにより、被験抗体のエピトープを決定することができる。被験抗体のエピトープが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体のエピトープ中の１アミノ酸を少なくとも１つ含む場合、被験抗体が、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体と同じヒトＴｉｅ２エピトープに結合すると判断できる。

【0055】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示される、本発明の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体を生産する方法及び該方法により生産された抗ヒトＴｉｅ２抗体＞に記載の方法に従い製造することができる。

【0056】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントは、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、敗血症、急性肝障害、急性腎障害、急性肺障害、全身性炎症反応症候群、末梢動脈閉塞症又は重症下肢虚血等の血管関連疾患の予防又は治療に用いることができる。

【0057】

＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。

【0058】

１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0059】

配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列に示される重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基番号１から３６６までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

【0060】

好ましい実施形態において、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0061】

配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号９に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

【0062】

１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0063】

配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列に示される軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３の塩基番号１から３３９までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

【0064】

好ましい実施形態において、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0065】

配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

【0066】

本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。また、本発明のポリヌクレオチドを一旦取得すれば、このポリヌクレオチドの所定の部位に変異を導入することによって、本発明の他のポリヌクレオチドを取得することも可能である。このような変異導入方法としては、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．、１９８７、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．１−８．５）等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。

【0067】

＜本発明の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。当該分野において種々のフォーマットの４価抗体及びその生産方法が公知であり、本発明の発現ベクターは、これらの生産方法に従って、発現させる４価抗体のフォーマットに応じて当業者に容易に構築され得る。

【0068】

好ましい本発明の発現ベクターとしては、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが挙げられる。

【0069】

本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス）等が挙げられ、好ましくは、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を使用することができる。また、ＡＧ−γ１やＡＧ−κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有する発現ベクターを用いて抗体遺伝子を発現することもできる。

【0070】

本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。また、酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。

【0071】

宿主細胞として、動物細胞、昆虫細胞、又は酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、本発明の抗体又はその重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。

【0072】

＜本発明の形質転換された宿主細胞＞
本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【0073】

１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
（ａ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【0074】

好ましい本発明の形質転換された宿主細胞としては、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が挙げられる。

【0075】

形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、抗体を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、好ましくは、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞など）、２９３細胞、ＮＳ０細胞等の培養細胞を使用することができる。

【0076】

宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。

【0077】

＜本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体を生産する方法及び該方法により生産された抗ヒトＴｉｅ２抗体＞
本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【0078】

１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体を生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＴｉｅ２抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＴｉｅ２抗体を生産する方法が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【0079】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＴｉｅ２抗体を発現させる工程を包含している限り、特に限定されるものではない。該方法で使用される好ましい宿主細胞としては、前述の好ましい本発明の形質転換された宿主細胞が挙げられる。

【0080】

形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５９、Ｖｏｌ．１３０、Ｎｏ．３３７３、ｐ．４３２−７）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９）、１９９培地（Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１−８）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４）等を用いることができる。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜４０℃で約１５〜１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源又は有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合、好ましい培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌ．Ｃｌｏ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４〜３９℃で約３〜２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０５）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させることができる。

【0081】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程に加えて、さらには、該形質転換された宿主細胞から抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。

【0082】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体には、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法で生産された抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。

【0083】

＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物には、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、眼内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。

【0084】

本発明の医薬組成物は、複数種の本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含み得る。例えば、翻訳後修飾を受けていない抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物も本発明に含まれる。

【0085】

１つの実施形態において、抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。
４つの重鎖可変領域及び４つの軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該重鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなり、該軽鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、１つの該重鎖可変領域と１つの該軽鎖可変領域が１つの抗原結合部位を構成し、該抗体又はその抗原結合フラグメントが４つの抗原結合部位を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物。

【0086】

１つの実施形態において、抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。
２つの重鎖及び４つの軽鎖を含み、各重鎖は、配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造を２つ、並びにＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、一方の該構造のＣ末端がリンカーを介してもう一方の該構造のＮ末端と連結されており、各軽鎖は、配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体、並びに、該抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する医薬組成物。

【0087】

本発明の医薬組成物には、重鎖Ｃ末端リジンの欠失抗体、Ｎ末端翻訳後修飾を受けた抗体又はその抗原結合フラグメント、重鎖Ｃ末端リジンを欠失しＮ末端翻訳後修飾を受けた抗体、及び／又は重鎖Ｃ末端リジンを有しＮ末端翻訳後修飾を受けていない抗体を含有する医薬組成物も含まれる。

【0088】

１つの実施形態において、抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記（１）〜（４）のうち２種以上の抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（１）配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（３）配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。

【0089】

１つの実施形態において、抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記（１）〜（４）のうち２種以上の抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（１）配列番号６のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（２）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（３）配列番号６のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。

【0090】

１つの実施形態において、抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記（１）〜（４）のうち２種以上の抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（１）配列番号８のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（２）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（３）配列番号８のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（４）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。

【0091】

１つの実施形態において、抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記（１）〜（４）のうち２種以上の抗ヒトＴｉｅ２抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（１）配列番号１０のアミノ酸番号１から６７５までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（３）配列番号１０のアミノ酸番号１から６７５までのアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。
（４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体。

【0092】

１つの実施形態において、抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体、配列番号２のアミノ酸番号１から６７８までのアミノ酸配列からなる重鎖を２つ及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を４つ含む抗ヒトＴｉｅ２抗体、並びに、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

【0093】

製剤化における本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、又は抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。

【0094】

本発明の医薬組成物は、血管関連疾患、例えば、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、敗血症、急性肝障害、急性腎障害、急性肺障害、全身性炎症反応症候群、末梢動脈閉塞症又は重症下肢虚血等の予防又は治療剤として用いることができる。

【0095】

本発明には、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体を含む、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血の予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血を予防又は治療する方法が含まれる。また、本発明には、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血の予防又は治療に使用するための、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体が含まれる。さらに、本発明には、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症又は重症下肢虚血の予防又は治療用医薬組成物製造における、本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体の使用が含まれる。

【0096】

＜融合抗体及び修飾抗体＞
当業者であれば、当該分野で公知の方法を用いて、抗体又はその抗原結合フラグメントを、他のペプチド又は蛋白質を融合した融合抗体として作製することや、修飾剤を結合させた修飾抗体として作製することも可能である。本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントには、このような融合体や修飾体の形態の抗体又は抗原結合フラグメントも含まれる。例えば、４つの重鎖可変領域及び４つの軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該重鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなり、該軽鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、１つの該重鎖可変領域と１つの該軽鎖可変領域が１つの抗原結合部位を構成し、該抗体又はその抗原結合フラグメントが４つの抗原結合部位を含む、抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントには、他のペプチド又は蛋白質と融合した抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメント、或いは修飾剤を結合させた抗ヒトＴｉｅ２抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは融合抗体としてヒトＴｉｅ２との結合活性を有している限り、融合に用いられる他のペプチド又は蛋白質は特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種タグペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチド又は蛋白質等が挙げられる。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは修飾抗体としてヒトＴｉｅ２との結合活性を有している限り、修飾に用いられる修飾剤は特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。

【0097】

本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0098】

市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。また、便宜上、濃度ｍｏｌ／ＬをＭとして表す。例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。

【0099】

（実施例１：抗ヒトＴｉｅ２抗体産生ハイブリドーマの作製）
ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いて抗体を作製した。ベロシミューンマウスに、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、組換えヒトＴｉｅ２−Ｆｃキメラ蛋白質（Ｒ＆Ｄ社、３１３−ＴＩ−１００）を免疫した。常法に従い、免疫したマウスのリンパ節を摘出しリンパ球を回収し、これをマウス由来ミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマのモノクローン化を行い、各クローンについて、無血清培地であるＣＤハイブリドーマメディウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養した。得られた培養上清からプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて抗体を精製した。ベロシミューン技術により得られた抗体は、ヒト抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（キメラ抗体とも称する）である。

【0100】

（実施例２：細胞ＥＬＩＳＡアッセイ）
抗体の抗原結合活性を測定するために、ヒトＴｉｅ２発現ＣＨＯ細胞、サルＴｉｅ２発現ＣＨＯ細胞、ラットＴｉｅ２発現ＣＨＯ細胞及びマウスＴｉｅ２発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞ＥＬＩＳＡアッセイにより、ヒト、サル、ラット及びマウスＴｉｅ２に対する抗体の結合を評価した。

【0101】

（実施例３：Ａｎｇ−１改変体を用いた拮抗活性評価）
抗体のＡｎｇ−２拮抗活性を評価するために、Ａｎｇ−１改変体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００４、Ｖｏｌ．１０１、ｐ．５５４７−５５５２。ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１とも称する。）とＴｉｅ２との結合阻害を評価した。ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１はＴｉｅ２への結合に関与しない部位を改変したＡｎｇ−１改変体であり、Ｔｉｅ２への結合能を保持していること（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００４、Ｖｏｌ．１０１、ｐ．５５４７−５５５２）及びＡｎｇ−１とＡｎｇ−２はＴｉｅ２の同じ部位へ同程度の親和性で結合すること（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７、Ｖｏｌ．２７７、ｐ．５５−６０）から、ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１への拮抗作用を評価することで、Ａｎｇ−２への拮抗作用を評価することができる。

【0102】

ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１の発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。当該ＨＥＫ２９３細胞の培養上清からＣＯＭＰ−Ａｎｇ１を精製し、ビオチン標識した。組換えヒトＴｉｅ２−Ｆｃキメラ蛋白質で固相化したプレートに、上記のビオチン標識したＣＯＭＰ−Ａｎｇ１と実施例１で得た精製抗体とを混和して添加した。結合したビオチン標識ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１の検出にはストレプトアビジン標識ＨＲＰを用いた。ＴＭＢ発色試薬（Ｄａｋｏ社、Ｓ１５９９）を添加して静置した後、２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。これにより、抗体のＣＯＭＰ−Ａｎｇ１への拮抗作用を評価した。

【0103】

（実施例４：ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞を用いた抗アポトーシス活性評価）
ヒトＴｉｅ２を安定的に発現するマウスプロＢ細胞株ＢａＦ３細胞（以下、ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞と称する）は、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９８、Ｖｏｌ．９、ｐ．６７７−６８６に記載の方法に従い、配列番号２１で示されるヒトＴｉｅ２遺伝子を含むプラスミドを当該細胞にエレクトロポレーションにて導入することで作製した。以後、同細胞を用いて、抗体の抗アポトーシス活性を評価した。

【0104】

ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞を０．０５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社）で２ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、浮遊細胞用９６ウェルプレート（住友ベークライト社、ＭＳ−８０９６Ｒ）に１ウェルあたり８０μＬ播種した。その後、実施例１で得た精製抗体又はＡｎｇ−１を２０μＬ添加した。３７℃に設定したＣＯ_２インキュベータにて７２時間培養した後、白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社、２３６１０８）に細胞懸濁液５０μＬを移した。細胞内ＡＴＰ定量キットＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に従い、添付の緩衝液で希釈した基質溶液５０μＬを細胞懸濁液に添加することで、細胞の生存能を測定した。生存能を測定することで抗アポトーシス活性を評価した。

【0105】

実施例２〜４の結果、ヒト、サル、ラット及びマウスＴｉｅ２に対する結合活性、ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１拮抗活性、並びに抗アポトーシス活性を有する抗体を複数見出した。後述の２−１６と命名した抗ヒトＴｉｅ２抗体を含む精製抗体溶液は、実施例４において、Ａｎｇ−１と同程度の抗アポトーシス活性を示していたが、マウス抗ヒトＴｉｅ２抗体１５Ｂ８（特許文献１）を含む精製抗体溶液はＡｎｇ−１の６０％程度の最大活性しか示さなかった。

【0106】

（実施例５：サイズ排除クロマトグラフィー及び電気泳動を用いた精製抗体溶液の解析）
前述の実施例２〜４で同定した精製抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーで解析した。その結果、各精製抗体溶液から３つのフラクションが検出された。各フラクション溶液を電気泳動で解析した結果、各フラクションには抗体の単量体、２量体、及び３量体以上の多量体がそれぞれ含まれていることが明らかとなった。

【0107】

次に各フラクション溶液について実施例４に示す方法で抗アポトーシス活性を評価した。その結果、２量体を含むフラクション及び３量体以上の多量体を含むフラクションにおいて、強力な抗アポトーシス活性が認められた。一方、単量体を含むフラクションには抗アポトーシス活性はほとんど認められなかった。１５Ｂ８も上記と同様にサイズ排除クロマトグラフィーで解析した結果、２量体以上の多量体を示すフラクションが検出されたが、単量体のフラクションはほとんど検出されなかった。

【0108】

以上より、実施例２〜４で同定したいずれの抗体についても、２量体以上の多量体化した抗体を含むフラクションに強力な抗アポトーシス活性が含まれていることが明らかとなった。２量体を形成した抗体は４価抗体となることから、４価以上の価数をもつ抗体がヒトＴｉｅ２活性化を介した強力な抗アポトーシス活性を有することが示唆された。

【0109】

（実施例６：架橋抗体による抗アポトーシス活性評価）
実施例５の検討から、抗ヒトＴｉｅ２抗体の価数が４価以上であることがＴｉｅ２を介した抗アポトーシス活性を誘導するのに重要であると考えられた。そこで、抗マウスＩｇＧ抗体で架橋することで多量化した抗ヒトＴｉｅ２抗体の抗アポトーシス活性を評価した。細胞として、ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞及び内在的にヒトＴｉｅ２を発現しているヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣを用いた。

【0110】

ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞はＲＰＭＩ１６４０培地で、ＨＵＶＥＣはＥＢＭ−２無血清培地（ロンザ社）でそれぞれ培養し、実施例２〜４で同定した抗ヒトＴｉｅ２抗体を含む精製抗体溶液を添加した。さらに抗マウスＩｇＧ抗体を添加して、抗体を架橋させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いて細胞の生存能を測定した。生存能を測定することで抗アポトーシス活性を評価した。

【0111】

その結果、２−１６と命名した抗ヒトＴｉｅ２抗体（キメラ抗体）の架橋抗体が、ヒトＴｉｅ２に対して強力な抗アポトーシス活性を有することを見出した。

【0112】

（実施例７：２価の抗ヒトＴｉｅ２抗体の配列決定）
抗ヒトＴｉｅ２抗体２−１６を産生するハイブリドーマから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングし、配列決定した。

【0113】

抗体の配列決定後、抗体の物性及び安定性向上のため、２−１６の軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）を他のヒト抗体のＦＲと置き換えて、改変型の抗ヒトＴｉｅ２抗体２−１６Ａ２の可変領域を作製した。

【0114】

２−１６Ａ２の重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９８７、Ｖｏｌ．１、Ｎｏ．６、ｐ．４９９−５０５）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトＩｇγ１定常領域遺伝子（配列番号１１の塩基番号３６７から１３５６までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４に挿入した。また軽鎖可変領域遺伝子の５’側にはシグナル配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９８７、Ｖｏｌ．１、Ｎｏ．６、ｐ．４９９−５０５）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（配列番号３の塩基番号３４０から６５７までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入した。作製した抗体の重鎖遺伝子配列及び軽鎖遺伝子配列をシーケンサーで解析した。

【0115】

作製した２−１６Ａ２の完全ヒト型抗体（完全ヒト型２−１６Ａ２）の重鎖の塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１２に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。配列番号１２に示される重鎖の可変領域は、配列番号１２のアミノ酸番号１から１２２までのアミノ酸配列からなり、配列番号４に示される軽鎖の可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる。

【0116】

完全ヒト型２−１６Ａ２の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターを用いて、一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法で抗体発現を行った。一過性発現については、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で約１００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに培養されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対し、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターを遺伝子導入試薬２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクトし、５日間培養した。又は、Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で約３００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに培養されたＥｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対し、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターを遺伝子導入キットＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。又は、ＣＤ−ＣＨＯ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で約１０００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに培養されたＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）に対して、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターをエレクトロポレーション法を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。各培養上清をプロテインＡカラム又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製し、完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。恒常的発現については、抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、ライゲーション用キットＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮＧＥＮＥ社）又はライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。この発現ベクターのＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞へのトランスフェクションにより抗体を発現させた。培養上清をプロテインＡカラム、プロテインＧカラム又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社、１７−５４３８−０２）で精製し、完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。

【0117】

（実施例８：４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体の作製）
４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体を作製した。本実施例で作製した４価抗体は、２つの重鎖及び４つの軽鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造を２つ、並びにＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、一方の該重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造のＣ末端がリンカーを介してもう一方の該構造のＮ末端と連結されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む。本４価抗体のフォーマットを図１に示す。

【0118】

完全ヒト型２−１６Ａ２の重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造（配列番号１２のアミノ酸番号１から２２０からまでのアミノ酸配列からなる）のＣ末端に配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるリンカーを介して完全ヒト型２−１６Ａ２重鎖のＮ末端と連結した４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体重鎖をコードする遺伝子を作製した。当該重鎖遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９８７、Ｖｏｌ．１、Ｎｏ．６、ｐ．４９９−５０５）をコードする遺伝子をつなげ、ＧＳベクターｐＥＥ６．４に挿入した。当該重鎖ベクターと実施例７で作製した完全ヒト型２−１６Ａ２の軽鎖遺伝子が挿入されたＧＳベクターｐＥＥ１２．４を組み合わせて、実施例７に記載の抗体の発現及び精製法と同様の方法を用いて、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体を作製した。当該抗ヒトＴｉｅ２抗体をＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴと称する。

【0119】

ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴの重鎖における定常領域を、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅのアミノ酸変異を導入したヒトＩｇγ４定常領域（配列番号１０のアミノ酸番号１２３から２２０までのアミノ酸配列、及び、配列番号１０のアミノ酸番号３５０から６７６までのアミノ酸配列からなる。）に置き換えた４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体重鎖をコードする遺伝子を作製した。当該重鎖遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９８７、Ｖｏｌ．１、Ｎｏ．６、ｐ．４９９−５０５）をコードする遺伝子をつなげ、ＧＳベクターｐＥＥ６．４に挿入した。当該重鎖ベクターと実施例７で作製した完全ヒト型２−１６Ａ２の軽鎖遺伝子が挿入されたＧＳベクターｐＥＥ１２．４を組み合わせて、実施例７に記載の抗体の発現及び精製法と同様の方法を用いて、４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体を作製した。当該抗ヒトＴｉｅ２抗体をＴＩＥ−１−Ｉｇγ４−ＰＥと称する。

【0120】

ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴの重鎖の塩基配列を配列番号７に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。ＴＩＥ−１−Ｉｇγ４―ＰＥの重鎖の塩基配列を配列番号９に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。両抗体の軽鎖は完全ヒト型２−１６Ａ２の軽鎖と同じであり、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。

【0121】

同様の方法を用いて、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴの重鎖の定常領域にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を導入した４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体（ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡと称する）、並びにＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴの重鎖の定常領域にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３３１Ｓ、及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を導入した４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体（ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−Ｉ２５３Ａと称する）を作製した。

【0122】

ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡの重鎖の塩基配列を配列番号１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−Ｉ２５３Ａの重鎖の塩基配列を配列番号５に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。両抗体の軽鎖は完全ヒト型２−１６Ａ２の軽鎖と同じであり、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。

【0123】

配列番号２、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０で示される前記４種の４価抗ヒトＴｉｅ２抗体重鎖の可変領域は共通であり、配列番号２のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなり、該重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１１１までのアミノ酸配列からなる。

【0124】

配列番号４で示される前記４種の４価抗ヒトＴｉｅ２抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、該軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号２４から３９、５５から６１、９４から１０２までのアミノ酸配列からなる。

【0125】

精製したＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのアミノ酸修飾を分析した結果、精製抗体の大部分において、重鎖Ｃ末端のリジン欠失が生じていた。

【0126】

さらに、同様の方法を用いて、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴ及びＴＩＥ−１−Ｉｇγ４−ＰＥに関して、リンカー（配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる）を別のリンカー（ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴに関しては配列番号１７〜２０に示されるアミノ酸配列からなる４種のリンカー、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ４−ＰＥに関しては配列番号１４〜２０に示されるアミノ酸配列からなる７種のリンカー）にそれぞれ置き換えた４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体（合計１１種）を作製した。７アミノ酸（配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるリンカー）から６４アミノ酸（配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるリンカー）までの長さを有するリンカーを検討した。

【0127】

実施例４の方法に従ってＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴ、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ４−ＰＥ、及びリンカーを置き換えた１１種の抗体を評価した結果、いずれの抗ヒトＴｉｅ２抗体も同程度の抗アポトーシス活性を示すことが明らかとなった。

【0128】

（実施例９：２価の抗ヒトＴｉｅ２抗体及び４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体の抗アポトーシス作用評価）
実施例５の結果から、４価以上の価数をもつ抗体がヒトＴｉｅ２活性化を介した強力な抗アポトーシス活性を有することが示唆された。そこで、ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞に対する抗アポトーシス作用を指標として、２価の抗ヒトＴｉｅ２抗体及び４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体の薬効を比較した。

【0129】

実施例４の方法に従い、２価抗体である完全ヒト型２−１６Ａ２及び４価抗体であるＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴを用いて、ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞に対する抗アポトーシス作用を評価した。被験抗体である完全ヒト型２−１６Ａ２及びＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅで精製後、サイズ排除クロマトグラフィーにて単量体画分に分画し、それぞれ９９．９８％及び９９．７４％の単量体純度として取得した。各抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５ｎｇ／ｍＬから５０００ｎｇ／ｍＬまで約３倍公比で７段階希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。コントロールとして、被験抗体の代わりにＰＢＳ、又は、ＰＢＳで希釈したＡｎｇ−１（Ｒ＆Ｄ社、９２３−ＡＮ−０２５／ＣＦ。最終濃度１ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬまでの約３倍公比で７段階希釈）を添加したウェルをそれぞれ準備した。被験抗体の各濃度における抗アポトーシス活性を算出するにあたり、被験抗体の代わりにＰＢＳを添加したウェルの測定値を０％とし、被験抗体の代わりにＡｎｇ−１を３００ｎｇ／ｍＬ及び１０００ｎｇ／ｍＬをそれぞれ添加したウェルの測定値の平均値を１００％と設定した。算出された抗アポトーシス活性を解析し、Ｓｉｇｍｏｉｄ−Ｅｍａｘモデル非線形回帰分析により被験抗体のＥＣ_５０値を算出した。
表１：２価の抗ヒトＴｉｅ２抗体及び４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体の抗アポトーシス活性

【表1】

【0130】

その結果、４価抗体であるＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴが強力な抗アポトーシス作用を有していることが明らかとなった。以上より、４価抗体の方が２価抗体よりも優れた抗アポトーシス活性を有することが明らかとなった。

【0131】

（実施例１０：２価の抗ヒトＴｉｅ２抗体及び４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体のラット血管透過性阻害作用評価）
マスタードオイル誘発血管透過性モデルは、血漿漏出評価系として広く使用されているＭｉｌｅｓ ａｓｓａｙ（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９５２、Ｖｏｌ．１１８、ｐ．２２８−２５７）に変更を加えたもので、本モデルにおいてＡｎｇ−１が血管透過性亢進を阻害することが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００、Ｖｏｌ．６、ｐ．４６０−４６３）。そこで、２価の抗ヒトＴｉｅ２抗体及び４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体の血管透過性阻害作用を比較するために、本モデルを用いて、完全ヒト型２−１６Ａ２及びＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴを評価した。

【0132】

ＳＤラット（雄、４−５週令、日本チャールス・リバー社）にＰＢＳで希釈した完全ヒト型２−１６Ａ２又はＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴを皮下投与した。処置群を以下のように設定した。
［処置群（各群６匹）］
Ｖｅｈｉｃｌｅ群：
抗体の代わりにＰＢＳを投与した群
完全ヒト型２−１６Ａ２投与群：
完全ヒト型２−１６Ａ２を投与した群（０．３ｍｇ／ｋｇ）
ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴ投与群：
ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴを投与した群（０．３ｍｇ／ｋｇ）

【0133】

抗体投与４８時間後に、生理食塩水に溶解したエバンスブルー色素（４５ｍｇ／ｋｇ、シグマアルドリッチ社、Ｅ２１２９）を静脈内投与し、直後にミネラルオイル（シグマアルドリッチ社、Ｍ８４１０）で５％に希釈したイソチオシアン酸アリル（マスタードオイルとも称する。ナカライテスク社、０１４１５−９２）を片耳に、対側耳にはミネラルオイルを各２０μＬ塗布した。３０分後に両耳を採材し、重量を測定後、１ｍＬのホルムアミドに浸漬し、７０℃で一晩インキュベートすることにより、耳組織中のエバンスブルー色素を抽出した。抽出液の吸光度（測定波長６２０ｎｍ、対照波長７４０ｎｍ）からエバンスブルー色素濃度を求め、抽出液中のエバンブルー色素量を算出した。その後、エバンスブルー色素量を耳重量で除することにより耳重量当たりの色素漏出量を算出した。同一個体のマスタードオイル塗布耳のエバンスブルー色素漏出量からミネラルオイル塗布耳のエバンスブルー色素漏出量を差し引いた値を最終的な各個体のエバンスブルー色素漏出量として算出した。当該エバンスブルー色素漏出量を血管透過性の指標として使用した。結果を図２に示す。

【0134】

各群の平均値及び標準誤差を求めた。Ｖｅｈｉｃｌｅ群と各抗体投与群との間の有意差検定にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。

【0135】

図２で示すように、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比較して、２価抗体である完全ヒト型２−１６Ａ２は色素漏出を阻害しなかったが、４価抗体であるＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴは色素漏出を有意に阻害した。４価抗体であるＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴが血管透過性亢進を阻害することが明らかとなった。以上より、４価抗体の方が２価抗体よりも優れた血管透過性亢進阻害作用を有することが明らかとなった。

【0136】

実施例９及び１０の結果から、４価の抗Ｔｉｅ２抗体がＴｉｅ２を介した作用を強力に誘導することが明らかとなった。

【0137】

（実施例１１：４価の抗ヒトＴｉｅ２抗体の抗アポトーシス作用評価（２））
ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡ及びＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−Ｉ２５３Ａについて、実施例９の方法に従い、ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞に対する抗体の抗アポトーシス活性を評価した。実施例９と同じ抗体濃度範囲で各４価抗ヒトＴｉｅ２抗体の評価を行った。但し、Ａｎｇ−１の１００、３００及び１０００ｎｇ／ｍＬをそれぞれ添加したウェルの測定値の平均値を１００％として、各抗体のＥＣ_５０値及び抗アポトーシス活性の最大活性を評価した。
表２：各４価抗ヒトＴｉｅ２抗体の抗アポトーシス活性

【表2】

【0138】

その結果、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡ及びＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−Ｉ２５３ＡともにＡｎｇ−１と同程度の抗アポトーシス活性を示すことが明らかとなった。

【0139】

（参考例１：１５Ｂ８の抗アポトーシス作用評価）
１５Ｂ８について、実施例９の方法に従い、ヒトＴｉｅ２発現ＢａＦ３細胞に対する抗アポトーシス活性を評価した。実施例９と同じ抗体濃度範囲で１５Ｂ８（特許文献１）の評価を行った。Ａｎｇ−２（Ｒ＆Ｄ社、６２３−ＡＮ−０２５）はＡｎｇ−１と同様に評価を行った。但し、Ａｎｇ−１の１０００ｎｇ／ｍＬを添加したウェルの測定値の平均値を１００％として、ＥＣ_５０値及び抗アポトーシス活性の最大活性を評価した。
表３：１５Ｂ８の抗アポトーシス活性

【表3】

【0140】

その結果、１５Ｂ８の抗アポトーシス活性はＡｎｇ−１の６４％程度であり、Ａｎｇ−２と同程度の活性であることが明らかとなった。

【0141】

実施例１１の結果と合わせると、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡはＡｎｇ−１と同程度の抗アポトーシス活性を示すのに対して、１５Ｂ８はＡｎｇ−２と同程度の部分的な抗アポトーシス活性しか示さないことが明らかとなった。

【0142】

（実施例１２：ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのＴｉｅ２に対する結合活性評価）
ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡについて、各種Ｔｉｅ２蛋白質に対する結合活性を評価した。組換えヒトＴｉｅ２−Ｆｃキメラ蛋白質（Ｒ＆Ｄ社、３１３−ＴＩ−１００）、組換えサルＴｉｅ２−Ｆｃキメラ蛋白質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、９０２９２−Ｃ０２Ｈ）、組換えラットＴｉｅ２−Ｆｃキメラ蛋白質（Ｒ＆Ｄ社、３８７４−Ｔ２−１００）又は組換えマウスＴｉｅ２−Ｆｃキメラ蛋白質（Ｒ＆Ｄ社、７６２−Ｔ２−１００）をＰＢＳにて１μｇ／ｍＬに調製し、白色マキシソープ３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社、４６０３７２）に１ウェルあたり２０μＬ添加し、一晩４℃でインキュベートすることで、固相化した。翌日固相液を除き、２０％のＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ（ナカライテスク社、０３９５３−９５）を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）−０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｗａｋｏ社、３１０−７３７５）（以下、ＴＢＳ−Ｔ溶液と称する）を１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で１時間静置した。被験抗体として、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡを、５％のＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅを含むＴＢＳ−Ｔ溶液を用いて０．０３ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまで約３倍公比で８段階希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。コントロールとして、被験抗体の代わりにＴＢＳ−Ｔ溶液を添加したウェルを準備した。室温で１．５時間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した。２次抗体として、ビオチン標識した抗ヒトカッパー軽鎖抗体（免疫生物研究所、１７２４９）を５％のＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅを含むＴＢＳ−Ｔ溶液で０．１μｇ／ｍＬに希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄し、５％のＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅを含むＴＢＳ−Ｔ溶液で０．１μｇ／ｍＬに希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２１３２４）を検出試薬として、１ウェルあたり２０μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄し、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有２０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ９．８）で５倍希釈したＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｕｌｔｒａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＡＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ａｎｄ／ｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（４５０ｎｍ）（ＢｉｏＦＸ社、ＡＰＵ４−０１００−０１）を基質として２０μＬ添加した。室温で３０分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ^ＴＭ マルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）にて発光強度を測定した。算出された結合活性を解析し、Ｓｉｇｍｏｉｄ−Ｅｍａｘモデル非線形回帰分析により被験抗体のＥＣ_５０値を算出した。
表４：ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡの結合活性

【表4】

【0143】

その結果、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡはヒト、サル、ラット及びマウスＴｉｅ２に対して同程度の高い結合活性を有することが明らかとなった。

【0144】

（参考例２：１５Ｂ８のＴｉｅ２に対する結合活性評価）
実施例１２の方法に従い、１５Ｂ８の各種Ｔｉｅ２蛋白質に対する結合活性を評価した。但し、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスカッパー軽鎖抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、１０５０−０５）を使用し、基質としてＴＭＢ発色試薬（を使用し、測定器としてＡＲＶＯマルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。また、被験抗体として１５Ｂ８を使用し、抗体濃度は１０００ｎｇ／ｍＬから０．３ｎｇ／ｍＬまで約３倍公比（８段階希釈）で実施した。算出された結合活性を解析し、Ｓｉｇｍｏｉｄ−Ｅｍａｘモデル非線形回帰分析により被験抗体のＥＣ_５０値を算出した（表５）。
表５：１５Ｂ８の結合活性

【表5】

【0145】

その結果、１５Ｂ８はヒト及びサルＴｉｅ２に対する結合活性が認められたが、ラット及びマウスＴｉｅ２に対する結合活性は極めて弱いことが明らかとなった。

【0146】

実施例１２の結果から、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡはヒト、サル、ラット及びマウスＴｉｅ２に対して、種差なく高い結合活性が認められた。一方で、１５Ｂ８は結合活性について種差が認められた。以上のことから、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのヒトＴｉｅ２エピトープは１５Ｂ８のエピトープとは異なることが示唆された。

【0147】

（実施例１３：ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのラット血管透過性阻害作用評価）
実施例１０の方法に従って、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのラット血管透過性阻害作用を評価した。但し、被験抗体としてＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡを使用し、抗体投与用量を０．１及び０．３ｍｇ／ｋｇで実施した。結果を図３に示す。

【0148】

各群の平均値及び標準誤差を求めた。Ｖｅｈｉｃｌｅ群と各抗体投与群の間の有意差検定にはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。

【0149】

図３で示すように、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比較して、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡは色素漏出を有意に阻害した。以上より、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡは血管透過性亢進を阻害することが明らかとなった。

【0150】

（実施例１４：周皮細胞脱落マウス網膜浮腫に対する阻害作用）
糖尿病性網膜症患者の網膜血管において、周皮細胞の脱落は特徴的な病変の１つである（Ｒｅｔｉｎａ、２０１３、Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．９２５-９３９）。糖尿病網膜症研究においては、ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットモデルが広く使用されているが、周皮細胞の脱落が観察されるまでには数か月の期間を要することや、周皮細胞の脱落がその成因の１つとされている毛細血管瘤は観察されないこと、周皮細胞と内皮細胞の割合がヒトとは異なること（Ｒｅｔｉｎａ、２０１３、Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．９２５−９３９）、及び、明らかな網膜浮腫が観察されないことなどから、このモデルの有用性には一定の限界がある（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．Ｊ．、２０１３、Ｖｏｌ．３７、ｐ．２１７−２２４）。一方、抗ＰＤＧＦ受容体β（ＰＤＧＦＲβ）抗体投与により周皮細胞を脱落した網膜血管を有するマウスでは、高血糖ではないが網膜血管の拡張や網膜の浮腫、出血など、糖尿病網膜症及び糖尿病黄斑浮腫に類似の病変が観察されたことから、周皮細胞の脱落と糖尿病網膜症及び糖尿病黄斑浮腫における血管脆弱化との関連が報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００２、Ｖｏｌ．１１０、ｐ．１６１９−１６２８）。したがって、糖尿病網膜症患者に特徴的な病変である周皮細胞の脱落を呈する病態モデルを用いて網膜浮腫に対する阻害作用を評価することは、糖尿病網膜症及び糖尿病黄斑浮腫に対する有効性を評価するために有用である。

【0151】

周皮細胞脱落誘発網膜浮腫は、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００２、Ｖｏｌ．１１０、ｐ．１６１９−１６２８で報告された方法を一部改変して誘導した。すなわち、生後２日齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）にＰＢＳで希釈した抗ＰＤＧＦＲβモノクローナル抗体１Ｂ３（国際公開第２００８／１３０７０４号）を２５ｍｇ／ｋｇ皮下投与し、網膜血管周皮細胞の脱落を惹起した。
［処置群］
Ｃｏｎｔｒｏｌ群（Ｃｏｎｔ．群とも称する）：１７匹
抗ＰＤＧＦＲβ抗体を投与せず、ＰＢＳを投与した群
Ｖｅｈｉｃｌｅ群（Ｖｅｈ．群とも称する）：２４匹
抗ＰＤＧＦＲβ抗体を投与し、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡの代わりにＰＢＳを投与した群
ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡ群（０．１、０．３及び１ｍｇ／ｋｇ）：それぞれ２３、２１及び２１匹
抗ＰＤＧＦＲβ抗体を投与し、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡを各用量投与した群

【0152】

抗ＰＤＧＦＲβ抗体投与９０分前に、ＰＢＳで希釈したＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡを０．１、０．３及び１ｍｇ／ｋｇ皮下投与した。抗体投与１週間後に網膜浮腫を評価した。具体的には、眼球を摘出し、１％グルタールアルデヒド及び２．５％ホルマリン含有溶液で固定後、パラフィン包埋薄切切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色した標本をバーチャルスライドスキャナ（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ＸＲ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社）で画像データに変換した。本病態モデルでは網膜神経線維層（ＮＦＬ）における網膜浮腫が報告されていること（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００２、Ｖｏｌ．１１０、ｐ．１６１９−１６２８）から、ＮＦＬ及びそれに隣接する網膜神経節細胞層の面積をＮＰＤ ｖｉｅｗ ２（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社）で測定することで、網膜浮腫として定量化した。結果を図４に示す。

【0153】

各群の平均値及び標準誤差を求めた。Ｖｅｈ．群とＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡ群との間の有意差検定にはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。Ｃｏｎｔ．群とＶｅｈ．群との間の有意差検定にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた。いずれの場合にも、ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。

【0154】

図４で示すように、Ｖｅｈ．群と比較して、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡ群（１ｍｇ／ｋｇ）は周皮細胞の脱落した網膜血管を有する網膜浮腫を有意に阻害することが明らかとなった。ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡは、周皮細胞の脱落した網膜血管により生じる網膜浮腫を阻害することから、糖尿病黄斑浮腫及び糖尿病網膜症に対して有効であることが示唆された。

【0155】

（実施例１５：後肢虚血マウス虚血肢血流改善作用）
後肢虚血モデルは、片側後肢の血管を結紮及び摘出することにより後肢組織の虚血を引き起こすモデルであり、虚血症状の改善を評価する代表的なモデルである（Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、２０１２、Ｖｏｌ．５６、ｐ．１６６９−１６７９）。

【0156】

１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア社）に左後肢の大腿動静脈の鼠頸部及び伏在動静脈を結紮した。さらに、その間の分枝血管を結紮した後、結紮部間の血管を摘出した。手術はペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、東京化成工業）麻酔下で施した。血管摘出１週間後に、ペントバルビタール麻酔下でレーザードップラー血流画像化装置ＭｏｏｒＬＤＩ２（Ｍｏｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、後肢の血流を測定した。施術肢の血流低下を確認した後、処置群を以下のように設定した。
［処置群（各群１０匹）］
対照群：
抗体の代わりにＰＢＳを投与した群
ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡ群（１ｍｇ／ｋｇ）：
ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡを投与した群

【0157】

ＰＢＳで希釈したＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡを１ｍｇ／ｋｇ皮下投与し、抗体投与１週間後の正常肢及び虚血肢の皮膚血流量を測定した。具体的には、ペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、保温台に載せ、麻酔投与１５分後に足の皮膚血流を測定した。足底部を関心領域（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ：ＲＯＩ）として血流量を計測した結果を図５に示す。

【0158】

各群の平均値及び標準誤差を求めた。対照群とＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡ群との間の有意差検定にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。

【0159】

図５で示すように、対照群と比較して、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡ群は正常肢及び虚血肢の血流量を有意に改善することが明らかとなった。したがって、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡの重症下肢虚血等の末梢動脈疾患に対する有効性が示唆された。

【0160】

（実施例１６：ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのエピトープ評価：水素重水素交換質量分析）
ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡの認識エピトープを同定するために、実施例７で作製した完全ヒト型２−１６Ａ２のＦａｂ（以下、完全ヒト型２−１６Ａ２−Ｆａｂと称する）を作製した。完全ヒト型２−１６Ａ２−ＦａｂはＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡと同じ可変領域を持つため、これらの抗体は同じエピトープを認識する。抗原として、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００４５０．２のアミノ酸番号１から４５２からなるヒトＴｉｅ２蛋白質（以下、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）と称する）を作製した。当該アミノ酸配列はＡｎｇ−２のＴｉｅ２結合部位を同定するときに用いられた部位である（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１３、ｐ．５２４−５３２）。

【0161】

具体的には、完全ヒト型２−１６Ａ２−Ｆａｂの作製は、完全ヒト型２−１６Ａ２の重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造（配列番号１２のアミノ酸番号１から２２１のアミノ酸配列からなる）をコードする重鎖遺伝子が挿入されたＧＳベクターｐＥＥ６．４と、完全ヒト型２−１６Ａ２の軽鎖遺伝子が挿入されたＧＳベクターｐＥＥ１２．４とを組み合わせて、実施例７に記載の抗体の発現方法及び精製方法と同様の方法を用いて、完全ヒト型２−１６Ａ２−Ｆａｂを作製した。

【0162】

ヒトＴｉｅ２（１−４５２）を得るために、まず、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）にトロンビン認識配列（配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる）をリンカーとしてヒトＦｃ（配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる）と融合させた蛋白質（以下、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質と称する）を作製した。具体的には、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質をコードする遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入し、実施例７に記載の発現方法及び精製方法と同様の方法を用いて、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質を作製した。次に、作製したヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質を、２２℃でトロンビン（ＧＥヘルスケア社、２７−０８４６−０１）と１６時間インキュベーションし、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）（ＧＥヘルスケア社）及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅによりトロンビン及びヒトＦｃを除去してＦｃ部分を切断することで、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）を作製した。

【0163】

エピトープ部位を同定する目的で、ＮａｎｏＡＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＤＸシステム（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて、水素重水素交換質量分析（以下、Ｈ／Ｄ交換質量分析と称する。Ａｎａｌ．Ｂｉｏｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１０、Ｖｏｌ．３９７、ｐ．９６７−９７９）を実施した。

【0164】

具体的には、１２０ｍＭ 塩化ナトリウム含有２０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を用いて完全ヒト型２−１６Ａ２−Ｆａｂ及びヒトＴｉｅ２（１−４５２）混合液（終濃度はそれぞれ５０μＭ及び２５μＭ）を調製し、３７℃で一晩静置した。対照として、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）のみを１２０ｍＭ 塩化ナトリウム含有２０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）で調製した溶液を用意した。その後、重水（関東化学）で調製したＰＢＳ緩衝溶液に添加し、２０秒間、１分間、１０分間、６０分間及び１２０分間それぞれ静置することで、重水素化を実施した。続いて０℃で１００ｍＭ ジチオトレイトール（ナカライ）及び４Ｍ グアニジン塩酸塩（和光純薬）含有水溶液（ｐＨ２．５）を加えた後に、ペプシンカラム（Ｐｒｏｓｚｙｍｅ（登録商標） Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｅｐｓｉｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて消化を実施し、トラップカラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ μｍ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ−Ｃｏｌｕｍｎ、Ｗａｔｅｒｓ社）にて消化されたペプチドを捕捉した。続いてＣ１８カラム（ＡＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社）を用いた逆相クロマトグラフィーで分離し、質量分析器（ＳｙｎａｐｔＧ２−Ｓｉ、Ｗａｔｅｒｓ社）で分子量を測定した。検出された全てのペプチドの重心値を算出し、重水素置換を行ったヒトＴｉｅ２（１−４５２）のみの重心値と比較し、重水素置換が起こっている変化量をそれぞれの重水素化時間で算出した。

【0165】

Ｈ／Ｄ交換質量分析の結果、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００４５０．２のアミノ酸番号２７〜３７、２９〜３７、２９〜３８、４３〜６０、８２〜１００、９８〜１０７、１１１〜１２４、１１６〜１２５、１１６〜１２９、１１９〜１２９、１８９〜１９８及び１９０〜１９８のペプチドが抗体共存下において重水素化が抑制されていることが示された。これらのペプチドの重複した領域を整理し、また重水素化が抑制されていないペプチドの情報も加え、さらにＮ末端側の２つのアミノ酸は測定中に容易に逆交換が起こってしまう（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１９９３、Ｖｏｌ．１７、７５−８６）ことを考慮し、重水素置換が抑制された領域、すなわちエピトープ候補部位として、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００４５０．２のアミノ酸番号２９〜３８、８４〜１０２、１１３〜１２０、１２６〜１２９及び１９１〜１９８の５つを見出した。なお、Ｈ／Ｄ交換質量分析の結果は、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡがこれら５つのアミノ酸セグメントからなる領域と相互作用すること、又は、抗体結合による立体構造変化若しくはアロステリック効果が生じることによりこれらの残基を水素／重水素交換から保護することを示している。

【0166】

（実施例１７：ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのエピトープ評価：表面プラズモン共鳴現象解析及びＥＬＩＳＡ）
実施例１６のＨ／Ｄ交換質量分析からＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのヒトＴｉｅ２に対するエピトープ候補が同定された。さらに詳細にエピトープ部分を推定するため、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質のアミノ酸変異体を作製し、表面プラズモン共鳴現象解析（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ解析）及びＥＬＩＳＡを用いた結合活性を評価した。

【0167】

Ｈ／Ｄ交換質量分析の結果、並びに、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２がＴｉｅ２に結合する領域の報告（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００６、Ｖｏｌ．１３、ｐ．５２４−５３２。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１３、Ｖｏｌ．１１０、７２０５−７２１０）に基づいて、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）のアミノ酸変異体として、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質のうち、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）の１個から４個のアミノ酸をアラニン（一部グルタミン酸）に置換したアミノ酸変異体を２３種類作製した（表６）。各種変異体は、実施例１６で作製したヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質を作製した方法と同様の方法で作製した。
表６：変異体ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質

【表6】

【0168】

作製したヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質及び２３種の変異体と完全ヒト型２−１６Ａ２−Ｆａｂの結合活性を評価するために、ＳＰＲ解析を実施した。

【0169】

ＳＰＲ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＣＭ５センサーチップにＡｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ） ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社）を固定した。ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（ＧＥヘルスケア社）で５μｇ／ｍＬに希釈したヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質及びその変異体をそれぞれ固相し、キャプチャー量を計測した。その後、ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファーで５０ｎＭに希釈した完全ヒト型２−１６Ａ２−Ｆａｂを添加し、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質及び２３種の変異体との結合量を測定した。そして、結合量をキャプチャー量で除することで、単位固相化抗原あたりの抗体の結合量（以下、結合比率と称する）を算出した。３試行の算術平均及びヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質の結合比率を１００％とした時の各変異体の結合比率の相対値を表７に示す。また、代表的な測定データを図６に示す。Ｂｉａｃｏｒｅにおいて結合量を相対比較する方法は、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、Ｖｏｌ．３１２、ｐ．１１３−１２４に記載されている。

【0170】

その結果、完全ヒト型２−１６Ａ２−ＦａｂはヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質と比較してヒトＴｉｅ２（１−４５２）ｇ１−Ｆｃ、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）ｇ２−Ｆｃ、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）ｇ３−Ｆｃ、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）ｇ４−Ｆｃ、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）ｇ５−Ｆｃ、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）ｍ３−Ｆｃ、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）Ａ１−Ｆｃ、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）Ａ２−Ｆｃ、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）Ａ３−Ｆｃ及びヒトＴｉｅ２（１−４５２）Ａ４−Ｆｃにおいて結合が低下したことが明らかとなった。
表７：ＳＰＲ解析結果

【表7】

【0171】

ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡとヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質及び２３種の変異体との結合活性を評価するために、実施例１２と同様の方法でＥＬＩＳＡを行った。

【0172】

ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質及び２３種の変異体をＰＢＳで１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、白色マキシソープ３８４ウェルプレートに、１ウェルあたり２０μＬを添加し、一晩４℃でインキュベートすることで固相化した。翌日固相液を除き、ＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄し、Ｂｌｏｃｋｅｒ^ＴＭ Ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、３７５３２）を５０μＬ添加し、６０分間インキュベートすることでブロッキングを行った。ＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライテスク社、２８３５３−８５）含有Ｂｌｏｃｋｅｒ^ＴＭ Ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ＴＢＳを用いて０．０３ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまでの８段階に希釈したＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡを１ウェルあたり２０μＬ添加した。室温にて９０分間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｂｌｏｃｋｅｒ^ＴＭ Ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ＴＢＳを用いて０．１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識抗ヒトカッパー軽鎖抗体を２０μＬ添加した。室温にて６０分間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｂｌｏｃｋｅｒ^ＴＭ Ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ＴＢＳを用いて０．１μｇ／ｍＬに希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを２０μＬ添加した。室温にて６０分間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄し、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有２０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ９．８）で５倍希釈したＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｕｌｔｒａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＡＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ａｎｄ／ｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（４５０ｎｍ）を基質として５０μＬ添加した。遮光室温にて４０分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ^ＴＭ マルチラベルカウンターにて発光強度を測定した。ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質及び２３種の変異体に対するＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡのＥＣ_５０値を算出した。また、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡがヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質に結合した際の収束値を１００％としたときに、最大適用濃度である１００ｎｇ／ｍＬ ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡがヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質及び２３種の各変異体に結合した際の発光強度の相対値を算出した（表８及び表９）。なお、ＥＣ_５０値及び収束値はＳｉｇｍｏｉｄ−Ｅｍａｘモデル非線形回帰分析により算出した。グラフを図７に示す。

【0173】

その結果、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質と比較して、変異体であるＴｉｅ２（１−４５２）ｇ１−Ｆｃ、Ｔｉｅ２（１−４５２）ｇ２−Ｆｃ及びＴｉｅ２（１−４５２）ｇ４−Ｆｃにおいて発光強度の相対値の大幅な低下が認められた。また、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質と比較して、Ｔｉｅ２（１−４５２）ｇ５−Ｆｃにおいて、発光強度の相対値の低下及びＥＣ_５０値の増大が認められた。以上より、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡは、ヒトＴｉｅ２（１−４５２）−Ｆｃキメラ蛋白質と比較して、Ｔｉｅ２（１−４５２）ｇ１−Ｆｃ、Ｔｉｅ２（１−４５２）ｇ２−Ｆｃ、Ｔｉｅ２（１−４５２）ｇ４−Ｆｃ及びＴｉｅ２（１−４５２）ｇ５−Ｆｃに対する結合活性が低下したことが明らかとなった。なお、Ｔｉｅ２（１−４５２）Ａ１−Ｆｃに対しては、発光強度の相対値の低下が認められたものの、ＥＣ_５０値に差が認められなかったことから、結合活性に変化がないと判断した。
表８：ＥＬＩＳＡ結果

【表8】

表９：ＥＬＩＳＡ結果

【表9】

【0174】

ＥＬＩＳＡ法とＳＰＲ解析法という独立した２種類の評価を実施した結果、両方の実験で共に結合活性が低下した変異体として、Ｔｉｅ２（１−４５２）ｇ１−Ｆｃ、Ｔｉｅ２（１−４５２）ｇ２−Ｆｃ、Ｔｉｅ２（１−４５２）ｇ４−Ｆｃ及びＴｉｅ２（１−４５２）ｇ５−Ｆｃが同定された。したがって、これらの変異体で変異を導入したアミノ酸、すなわちアミノ酸番号１９２、１９４、１９５、１９７及び１９８がＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡの結合に非常に重要なエピトープ候補であると考えられた。このうち、Ｉ１９４Ａ、Ｎ１９７Ａ及びＬ１９８Ａのアミノ酸変異を有するＴｉｅ２（１−４５２）ｇ１−ＦｃはＥＬＩＳＡ法で結合低下が認められたが、Ｉ１９４Ａのアミノ酸変異を有するＴｉｅ２（１−４５２）ｇ３−ＦｃはＥＬＩＳＡ法において結合低下が見られなかった。また、Ｌ１９８Ａのアミノ酸変異を有するＴｉｅ２（１−４５２）ｇ６−ＦｃはＥＬＩＳＡ法とＳＰＲ解析法の両方において結合低下が見られなかった。これらの結果から、Ｔｉｅ２（１−４５２）ｇ１−Ｆｃの結合低下に寄与するのはアミノ酸番号１９７であると考えられた。以上より、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００４５０．２のアミノ酸番号１９２、１９５及び１９７のアミノ酸をエピトープとして結合していることが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0175】

本発明の抗ヒトＴｉｅ２抗体は、各種血管関連疾患の予防又は治療に有用である。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞及び抗体を生産する方法は、前記抗ヒトＴｉｅ２抗体を生産するのに有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0176】

以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には配列表の配列番号１に示される塩基配列は、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡの重鎖の塩基配列であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１によりコードされる重鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号３で示される塩基配列は、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＬＡＬＡ、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−Ｉ２５３Ａ、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴ、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ４−ＰＥ、及び完全ヒト型２−１６Ａ２の軽鎖の塩基配列であり、配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３によりコードされる軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号５で示される塩基配列は、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−Ｉ２５３Ａの重鎖の塩基配列であり、配列番号６で示されるアミノ酸配列は、配列番号５によりコードされる重鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号７で示される塩基配列は、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ１−ＷＴの重鎖の塩基配列であり、配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７によりコードされる重鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号９で示される塩基配列は、ＴＩＥ−１−Ｉｇγ４−ＰＥの重鎖の塩基配列であり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号９によりコードされる重鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号１１で示される塩基配列は、完全ヒト型２−１６Ａ２の重鎖の塩基配列であり、配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１によりコードされる重鎖のアミノ酸配列である。配列番号１３〜２０で示されるアミノ酸配列は、リンカーのアミノ酸配列である。配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、トロンビン認識部位である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]