特許 6860478 全体的に活性化された単球を得るための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6860478

(24)【登録日】2021年3月30日

(45)【発行日】2021年4月14日

(54)【発明の名称】全体的に活性化された単球を得るための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0786 20100101AFI20210405BHJP

   C12M 3/00 20060101ALN20210405BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0786ZNA

   !C12M3/00 Z

【請求項の数】7

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2017-520001(P2017-520001)

(86)(22)【出願日】2015年7月3日

(65)【公表番号】特表2017-525756(P2017-525756A)

(43)【公表日】2017年9月7日

(86)【国際出願番号】EP2015065199

(87)【国際公開番号】WO2016001405

(87)【国際公開日】20160107

【審査請求日】2017年3月16日

【審判番号】不服2019-3741(P2019-3741/J1)

【審判請求日】2019年3月20日

(31)【優先権主張番号】62/020,547

(32)【優先日】2014年7月3日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】1413665.9

(32)【優先日】2014年8月1日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】515181948

【氏名又は名称】トランシミューン アーゲー

(73)【特許権者】

【識別番号】515183023

【氏名又は名称】イェール ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100110663

【弁理士】

【氏名又は名称】杉山 共永

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】バウアー，ギュンター

(72)【発明者】

【氏名】ダックワース，ジャスティン

(72)【発明者】

【氏名】ティゲラー，ロバート

(72)【発明者】

【氏名】エデルソン，リチャード

(72)【発明者】

【氏名】ジラルディ，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ヘンコ，カーステン

(72)【発明者】

【氏名】ヘイデイ，エイドリアン

【合議体】

【審判長】 長井 啓子

【審判官】 千葉 直紀

【審判官】 小暮 道明

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０２１９４２０号明細書

【文献】 米国特許出願公開第２００５／００８４９６６号明細書

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N 1/00-7/08

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＤＷＰＩ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

全体的に活性化された単球を得るための方法であって、
単球を含む哺乳動物対象の血液試料を前記単球が全体的に活性化されるように物理的な力に供するステップを少なくとも含み、
前記全体的に活性化された単球が、(i)少なくともＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１の発現の増加と、(ii)ＧＩＬＺ発現の増加がないことと、(iii)前方散乱／側方散乱複雑度の増加と、によって特定され、
前記哺乳動物対象の血液試料が、前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される前記単球に剪断力が適用されるようにデバイスのフローチャンバーを通る前記哺乳動物対象の血液試料の流速の固定または調節可能な調整を可能にする前記デバイスの前記フローチャンバーに前記哺乳動物対象の血液試料を通すことによって物理的な力に供され、
血小板が、前記フローチャンバーに接着して活性化し、
前記単球が、活性化血小板との相互作用を通じて活性化され、全体的に活性化された単球に分化するように誘導され、ここで、前記血小板は、前記哺乳動物対象の血液試料内に含まれ得る、または少なくとも単球を含む前記哺乳動物対象の血液試料から分離されて提供され得るものであり、
前記方法は、光活性化可能作用因子およびＵＶＡの非存在下で実施され、
ただし、ｅｘ ｖｉｖｏでアポトーシス性細胞とのインキュベーションを含まない、
前記方法。

【請求項2】

前記全体的に活性化された単球が追加的に少なくともＡＢＣＡ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＤ６８、ＣＲＫ、ＦＡＳ、ＩＬ１０、ＲＡＢ７Ｂ、ＲＡＬＡ、ＳＣＡＲＦ１、および／またはＴＨＢＳ１の発現の増加によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記全体的に活性化された単球が追加的に少なくともＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１６、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＶ、ＭＭＰ９、ＭＳＲ１、ＯＬＲ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＩＭＰ１および／またはＴＮＦの発現の増加によって特徴付けられる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記全体的に活性化された単球が表６の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個のマーカーの発現の増加によって同定可能である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。

【表2】

【請求項5】

前記活性化血小板が４０：１から４００：１の高さ幅比を有する前記フローチャンバーを通される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記活性化血小板が、前記フローチャンバーを０．１から２０．０ｄｙｎ／ｃｍ^２の剪断力下で通される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記単球が、０．１から２０．０ｄｙｎ／ｃｍ^２の剪断力を産生するように前記フローチャンバーを１０ｍｌ／分から２００ｍｌ／分の流速で通される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、全体的に活性化された単球を産生するための方法およびその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

樹状細胞（ＤＣ）は、ヒトにおいて細胞性免疫応答の開始および制御のため強力な抗原提示細胞であると認識されている。ＤＣは、Ｔ細胞の応答性特異的クローンとの相互作用のときにそれらがその潜在的特性のどちらのセットを発現するかに依存して、免疫賦活性または免疫抑制性のいずれになる場合もあることから、Ｔ細胞媒介性免疫反応における非常に重要な中心的演者であると考えられている。広義だが広く支持された一般論として、未成熟ＤＣはそれらのより成熟した対応物よりも「免疫寛容原性」であり、一方成熟ＤＣはそれらの未成熟前駆体よりも「免疫原性」であると考えられている。単球からｅｘ ｖｉｖｏで生成され、特定の抗原を有し、いずれの免疫学的方向においても有効に機能するＤＣの能力は、患者に戻された後のそれらの生存率および活力に依存する。対抗的な免疫賦活と免疫抑制ＤＣとの間の均衡が、ＤＣ依存性治療用免疫応答の方向および強度の両方の主な決定要因であることが論理的に結論される。

【0003】

トランス免疫化と呼ばれるプロセスによる樹状細胞を含む免疫賦活または免疫抑制抗原提示細胞の産生は、それぞれＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１０およびＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１２に記載されている。それらに記載されている方法は、体外循環式光化学療法（extracorporeal photopheresis）（ＥＣＰ）の特定の機序的態様を解析することに基づいている。

【0004】

体外循環式光化学療法（ＥＣＰ）は、患者のサブセットにおいて皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を処置するために良好に使用されている。ＥＣＰではＣＴＣＬに罹患している患者は、光活性化可能化合物８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）を受ける。次いで患者は、バフィーコートを得るために白血球アフェレーシスされ、これらのバフィーコートは白血球アフェレーシスされたバフィーコートを照射するために連続的閉鎖環式紫外線曝露デバイスに通され、それにより曝露されたリンパ球に致死性の障害を与える。このやり方では８−ＭＯＰは、ＤＮＡの塩基対を共有結合的に架橋するように誘導される。ＥＣＰの構想は、ＣＴＣＬの増殖性転移性Ｔ細胞を破壊し、次いで死にかけた細胞を患者に静脈内で再導入することである。このプロセスが、外来性サイトカインの追加による刺激を必要とすることなく、通過された血液単球のＤＣへの変換を追加的に生じることが知られている。これらのＥＣＰ誘導ＤＣは、８−ＭＯＰとＵＶ照射との組合せによって破壊された腫瘍細胞から抗原をさらに内部移行、処理および提示すると想定されている。これらのロードされた樹状細胞の患者への再導入が、ＣＴＬＣを処置するときのＥＣＰの成功の少なくとも部分的な要因となっていることが仮定されている。

【0005】

しかし、ＥＣＰまたはＥＣＰ様プロセスが切断型、すなわち免疫抑制または免疫寛容原ＤＣをもたらし、骨髄幹同種移植後に一般に続く移植片対宿主病の処置においてＥＣＰの臨床的有効性に大きく貢献すると考えられることが見出されている。単球の免疫賦活または免疫抑制ＤＣへの分化でのＥＣＰの正確な機序的態様は、理解しにくいままである（ＥＣＰプロセスの概説についてGirardi et al. (2002), Transfusion and Apheresis Science, 26, 181-190を参照されたい）。

【0006】

したがってＥＣＰおよびＥＣＰ様プロセスは、免疫賦活および免疫抑制ＤＣの複合体混合物をもたらすと考えられる。当然のことながら、とりわけ臨床的展望から、ＥＣＰおよびＥＣＰ様プロセスがこれらの制限を克服するためにどのように改変でき、どのように合目的的および選択的優先的に免疫抑制ＤＣよりも免疫賦活ＤＣを得ることができるか、逆も同様、を理解することは重要である。さらに古典的ＥＣＰプロセスは、得られた樹状細胞混合物が患者に再注入されることから原理的にｉｎ ｖｉｖｏ法である。しかし、ヒトまたは動物の身体外で免疫抑制ＤＣよりも免疫賦活ＤＣの優先的産生を可能にする、逆も同様、方法を利用できるようにすることは望ましい。

【0007】

ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１０およびＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１２に記載されているトランス免疫化プロセスは、樹状細胞を含む免疫賦活または免疫抑制抗原提示細胞の優先的産生を可能にする。単球は、力学的ストレスなどの物理的な力および血小板などの血漿構成成分との潜在的な相互作用を通じて活性化される。これらの活性化単球は、樹状細胞などの抗原提示細胞に発達でき、例えばアポトーシス性疾患抗原排出細胞との同時インキュベーションによって支持され得る。活性化プロセスは、例えばＨＬＡ−ＤＲ^＋／ＣＤ８３^＋の共発現によってモニターされ得る。しかしこれらの活性化単球の分化は、例えば８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）およびＵＶ−Ａを適用することによって樹状細胞などの免疫抑制抗原提示細胞に向けても導かれ得る。樹状細胞などの免疫抑制抗原提示細胞への分化は、ＧＩＬＺの発現の増加によってモニターされ得る。

【0008】

ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１０およびＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１２に記載の樹状細胞などの免疫賦活または免疫抑制抗原提示細胞は、ある種の利益を提供する。それらは、他の因子によるごくわずかな影響を有して比較的多量に産生でき、患者特異的である。一般的方法以外に、そのような免疫賦活樹状細胞の生成は複雑でかなり高価なサイトカインカクテルを必要としない。これらの標準的方法ではサイトカインは、生理的条件下のｉｎ ｖｉｖｏで遭遇するよりも非常に高い濃度（しばしば桁で異なる）で用いられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明者らは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１０およびＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１２に記載のトランス免疫化プロセスが全体的に活性化された単球（ＧＡＭ）を得ることを可能にし、これらのＧＡＭが樹状細胞などの免疫賦活または免疫抑制抗原提示細胞を得るために使用され得るだけでなく、それらの貪食（phagocytizing）特性の観点から、例えば治療的に活性な抗体で例えば処置される腫瘍の直接腫瘍死滅のため、創傷治癒のため、および／または再生医学の目的のためにも使用され得ることを理解した。

【0010】

本発明の１つの目的は、全体的に活性化された単球を産生するための方法を提供することである。

【0011】

本発明の別の目的は、抗腫瘍治療、創傷治癒および再生医学のためのそのような全体的に活性化された単球の使用である。

【0012】

これらおよび他の目的は、それらが以下の記載から明らかになることから、独立請求項の主題によって解決される。本発明のいくつかの好ましい実施形態は、独立請求項の主題を形成する。本発明のさらに他の実施形態は、以下の記載から理解され得る。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１０およびＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５００１２に記載のトランス免疫化プロセスが全体的に活性化された単球（ＧＡＭ）を得ることを可能にするという理解にある程度基づいている。さらにそのようなＧＡＭは、貪食活性を有する場合があり、それによりがんの処置、創傷治癒および／または再生医学のために使用され得る。それらは、樹状細胞などの免疫賦活または免疫抑制抗原提示細胞への分化のためにも使用され得る。これらの態様は、図２４に模式的に要約されている。

【0014】

治療用抗体媒介治療がマクロファージによる抗体標識化腫瘍細胞の貪食を含む場合があると示されたことから、ＧＡＭは例えばそれらの貪食活性の方法によって腫瘍細胞を死滅するために使用できると想定される（例えばTseng et al., PNAS, 110 (27), 11103-11108 (2013)またはGul et al., The Journal of Clinical Investigation, 124(2), 812-823 (2014)を参照されたい）。

【0015】

同様に貪食マクロファージは、創傷治癒プロセスに関与している（例えばWillenborg et al. Blood, 120 (3), 613-625, 2012を参照されたい）。さらに創傷の発生および創傷治癒プロセスの開始は、ＧＡＭを得るための本明細書に記載の方法に多少類似している（図２５も参照されたい）。それにより本明細書に記載の方法において単球は、例えば力学的ストレスによって活性化される。

【0016】

単球由来細胞の構想およびそれらの使用は、例えばHume et al., J Leukoc Biol.; 92:433 (2012)においてさらに考察されている。

【0017】

本発明は、（ｉ）古典的ＥＣＰ手順のいくつかの態様を模倣すること、（ｉｉ）体外の量の血液における単球の免疫賦活自己樹状細胞への分化の誘導の細胞性、分子性機序および生物物理学的条件を解明することを可能にする小型化され拡張可能なデバイスについて以下に示されるデータにある程度基づいている。このデータは、血小板の活性化および剪断力の条件下でのそのような活性化血小板への単球の結合が免疫賦活自己樹状細胞を得るために有益であることを示している。以下に記載の実験によって示されるとおり、これらの免疫賦活自己樹状細胞は、免疫賦活自己樹状細胞の指標となる分子マーカーの発現によって特徴付けることができる。データは、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）の発現の増加を導く条件が単球の免疫抑制自己樹状細胞への分化を有利に可能にすることも示している。データは、免疫賦活樹状細胞を得るプロセスが、全体的な単球活性化ステップ、およびそれに続く単球から免疫賦活抗原提示細胞（例えば樹状細胞）への分化ステップを含むと考えられることをさらに示唆している。これらのステップは、例えば本明細書に記載のデバイスを通して最初に活性化された単球の通過は活性化および分化を改善できる場合があるが、例えば活性化に十分な単球の初期精製または濃縮の際に生じる物理的な力での単球の物理的活性化に最初に依存すると考えられる。さらに、活性化および分化が（ＥＣＰプロセスにおいて使用される、およびされた）光活性化可能作用因子およびＵＶ−Ａの非存在下で行われる場合、免疫抑制樹状細胞の形成は、ＧＩＬＺの発現が低減されると好都合に低減されると考えられる。本データは、免疫賦活樹状細胞を同定するために使用できる分子マーカーの性質をさらに明らかにする。

【0018】

このデータに基づく実施形態のいくつかは、以下により詳細に記載される。

【0019】

第１の態様では、本発明は、全体的に活性化された単球を得るための方法であって、
ａ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を前記単球が全体的に活性化されるように物理的な力に供するステップ
を少なくとも含み、
前記全体的に活性化された単球が少なくともＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１の発現の増加によって特徴付けられる方法に関する。

【0020】

一般に、好適な分子マーカーは、以下に記載され、例えば表６から選ばれてよい。ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１などのマーカーは、全体的な単球活性化の指標であると考えられる。全体的に活性化された単球は、追加的に少なくともＡＢＣＡ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＤ６８、ＣＲＫ、ＦＡＳ、ＩＬ１０、ＲＡＢ７Ｂ、ＲＡＬＡ、ＳＣＡＲＦ１、および／またはＴＨＢＳ１の発現の増加によって好ましくは特徴付けることができる。さらにそのような全体的に活性化された単球は、追加的に少なくともＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１６、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＶ、ＭＭＰ９、ＭＳＲ１、ＯＬＲ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＩＭＰ１、および／またはＴＮＦの発現の増加によって特徴付けることができる。それにより全体的に活性化された単球は、表６の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個のマーカーの発現の増加によって同定可能である場合もある。一般に、全体的に活性化された単球は、ＧＩＬＺの発現の増加を示さない。発現の増加は、力学的ストレスなどの物理的な力に細胞を供する前後でのこれらのマーカーの発現の比較を指す。

【0021】

この第１の態様の一実施形態では、単球の全体的な活性化は、とりわけ、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料が、前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される前記単球に剪断力が適用されるようにデバイスのフローチャンバーを通る前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料の流速の調整を可能にする前記デバイスの前記フローチャンバーに前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を通すまたは循環させることによって物理的な力に供されることにおいて達成される。

【0022】

したがって、単球の全体的な活性化および全体的に活性化された単球の誘導は、そのようなデバイスのフローチャンバーを通る体外量の哺乳動物対象の血液試料の流力を変更すること、フローチャンバーの流路の形状を変更すること、フローチャンバーの寸法を変更すること、フローチャンバーの、したがって体外量の哺乳動物対象の血液試料の温度を変更すること、流路の生物物理学的および形状の表面特性を変化させること、フローチャンバー内の体外量の哺乳動物対象の血液試料の可視またはＵＶ光への曝露を可能にすることなどによって達成され、影響を受け得る。

【0023】

以下に示すとおり、単球の全体的な活性化および例えばそれに続く免疫賦活自己樹状細胞への分化の誘導は、単球が以下に記載のデバイスによって提供され得る物理的な力を経験する状況での単球と活性化血小板および／または特異的血漿構成成分との相互作用に応じて最適化されてよい。

【0024】

この第１の態様の別の実施形態では、したがって本発明は、物理的な力を経験し、活性化血小板および／または、フィブリノーゲンもしくはフィブロネクチンなどの血漿構成成分と相互作用する単球の全体的な活性化に関する。活性化は次のステップ（ｉ）単離された構成成分としてまたは体外量の哺乳動物対象の血液試料の部分としてのいずれかでのフィブリノーゲンまたはフィブロネクチンなどの血漿構成成分を前記デバイスのフローチャンバーに固定するステップ（ｉｉ）体外量の哺乳動物対象の血液試料から精製画分としてまたは体外量の哺乳動物対象の血液試料の部分として得ることができる血小板を、血小板が血漿構成成分と相互作用でき、それによって活性化されるようにフローチャンバーを通すステップ、ならびに（ｉｉｉ）体外量の哺乳動物対象の血液試料から精製画分としてまたは体外量の哺乳動物対象の血液試料の部分として得ることができる単球を、単球が活性化血小板および／または血漿構成成分と相互作用でき、それによって活性化されるようにフローチャンバーを通すステップ、を含むプロセスであってよい。

【0025】

したがって、構造およびデバイスが操作される条件に関連する上に記載のパラメーターおよび変更に加えておよび／または代替的に、単球の全体的な活性化および例えばそれに続く免疫賦活自己樹状細胞への分化の誘導は、血漿構成成分の性質、純度および濃度、血小板の性質、純度および濃度、血漿構成成分および／または血小板がフローチャンバーに通されるおよび／または配置されるステップの順序、フローチャンバーが血漿構成成分および／または血小板でコートされる密度、体外量の哺乳動物対象の血液試料、具体的には血小板および／または単球がそのようなデバイスのフローチャンバーを通る流力、体外量の哺乳動物対象の血液試料、具体的には血小板および／または単球がそのようなデバイスのフローチャンバーを通る温度および／または時間など、体外量の哺乳動物対象の血液試料に、具体的には単球に添加される８−ＭＯＰおよび／またはサイトカインなどの追加的因子の性質、純度および濃度を、変更することによって達成され、影響を受け得る。

【0026】

しかし、そのようなデバイスが全体的な単球活性化を誘導することにおいて特に有効である場合がある一方で、単球が最初の精製または、以下に記載のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ濃縮などの濃縮の際に経験する物理的な力が単球を活性化し、全体的に活性化された単球へのそれらの分化およびそれに続く樹状細胞などの免疫賦活抗原提示細胞への誘導を誘導するために既に十分である場合があることは理解される必要がある。同様に活性化血小板および／または特異的血漿構成成分は、全体的な単球活性化および樹状細胞などの免疫賦活抗原提示細胞への分化を増加させることにおいて役立つ場合があるが、それらは絶対に必要でなくてもよい。全体的な単球活性化に影響を与えるために、したがって本発明は最少必要要件としての物理的な力の適用を企図する。可能な限り影響を受けずにこのプロセスを進行させるために、本発明は、好ましい実施形態として、単球の例えば免疫賦活自己樹状細胞への成熟および分化を達成するために、ならびに例えば、光活性化可能作用因子およびＵＶ−Ａの同時適用などのＧＩＬＺの発現の増加を導く条件を回避するために分子カクテルを適用しないことを常に考慮する。

【0027】

全体的に活性化された単球は、上のマーカーによって同定されてよく、樹状細胞などの免疫賦活抗原提示細胞から分化され得る。全体的に活性化された単球由来の免疫賦活樹状細胞についてのマーカーはＰＬＡＵＲ、ＮＥＵ１、ＣＤ８０、ＣＣＲ７、ＬＯＸ１、ＣＤ８３、ＡＤＡＭデシシン（Decysin）、ＦＰＲＬ２、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＣＤ８６を含む。

【0028】

これらの実施形態に追加的または代替的に、本発明は、ＧＩＬＺの発現の増加ならびに／またはＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞の数の増加ならびに／またはＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３の下方制御を回避する条件下で実施されるそのような方法にも関する。したがって本発明は、例えば、８−ＭＯＰなどの光活性化可能作用因子の非存在下で、ＵＶ−Ａなどの光への曝露を伴わずに実施される方法に関する。

【0029】

別の実施形態は、がんを処置する際の使用のための本明細書に記載の全体的に活性化された単球に関する。がんの処置は、全体的に活性化された単球による腫瘍細胞の貪食によって好ましくは起きる。このプロセスは、抗体によって認識されるがん細胞が全体的に活性化された単球によって貪食され得ることから、治療的に活性な抗体で処置されるがんに罹患している個体の処置によって開始され得る。がんの処置は、化学療法および／またはガンマ照射療法などの放射線療法を受けている患者について好ましくは検討され得る。本明細書に示すデータの観点において（具体的には実験９を参照されたい）、本明細書に記載の全体的に活性化された単球が、化学療法、放射線療法またはこれらの組合せの結果としてそのような患者において放出された腫瘍関連抗原を取り込むことができ、それにより腫瘍関連抗原を示す樹状細胞などの不変の（immutable）賦活抗原提示細胞にさらに発達し、それにより抗腫瘍応答を媒介すると想定することは合理的であると考えられる。そのような患者では、全体的に活性化された単球は、患者が治療的に活性な抗体での治療を受けていない場合でも抗腫瘍活性を提供できる。実際に、本明細書に記載され、本明細書に記載の方法によって得ることができる全体的に活性化された単球は、他の疾患に罹患している患者を処置する際の使用について、患者が疾患関連抗原の放出を媒介する治療を受けている場合に検討される。

【0030】

したがって本発明は、抗体治療を受けている個体におけるがんを処置する際の使用のための本明細書に記載の全体的に活性化された単球にも関する。したがって全体的に活性化された単球は、非抗原特異的なやり方でがんを処置するために使用され得る。

【0031】

本発明は、創傷治癒における使用のための本明細書に記載の全体的に活性化された単球にも関する。そのような創傷は、慢性創傷、糖尿病性創傷、静脈うっ血を含む血管不全（vascular compromised）創傷、手術後創傷などである。

【0032】

本発明は、変性関節疾患または変性神経および脳疾患（例えばアルツハイマー病）、発毛／再発毛（例えば男性型脱毛症）におけるものなどの組織修復（創傷治癒を超える）の刺激などの再生医学における使用のための本明細書に記載の全体的に活性化された単球にも関する。

【0033】

一般に、本発明は、貪食細胞における使用のための本明細書に記載の全体的に活性化された単球にも関する。そのような貪食された細胞は、抗体コート腫瘍細胞、アポトーシス性腫瘍細胞を含むアポトーシス性細胞などを含む抗体コート細胞を含んでよい。貪食活性を有する細胞の形成は、ＥＣＰプロセスを受けた試料について観察されている。この観察は、本発明の方法がＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度の増加によって検出される全体的に活性化された単球を得ることを可能にするという発見と共に、全体的に活性化された単球も貪食活性を有することを示唆している。この貪食活性は、アポトーシス性または壊死性細胞によって発せられる情報を認識すること、例えば創傷治癒および／または再生医学の内容では、そのような破壊的な情報を止めること、損傷を除去することおよび再生を刺激することに関与する可能性がある。

【0034】

それらの貪食活性の観点から、全体的に活性化された単球は、炎症性疾患を処置するためにも使用され得る。

【0035】

全体的に活性化された単球は、細胞を身体に再注入することによって全身に、または例えば創傷または炎症が生じたところに局所送達によって投与されてよい。

【0036】

本発明が、専門用語「がんを処置する際の使用のための本明細書に記載の全体的に活性化された単球」または「創傷治癒における使用のための本明細書に記載の全体的に活性化された単球」などの「…を処置する際の使用のための本明細書に記載の全体的に活性化された単球」または「…における使用のための本明細書に記載の全体的に活性化された単球」を使用する場合は、これが全体的に活性化された単球を投与することによって対応する「処置の方法」または「使用の方法」、例えば「がんを処置する方法」または「創傷治癒の方法」を開示することを意味することは理解される必要がある。同様に、この表現は「がんを処置するための薬物の製造のための全体的に活性化された単球の使用」または「創傷治癒薬物の製造のための全体的に活性化された単球の使用」などの「処置するための薬物の製造のための全体的に活性化された単球の使用」または「における使用のための薬物の製造のための全体的に活性化された単球の使用」を開示することを意図する。

【0037】

さらなる実施形態は、以下に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】単球血小板相互作用の数および続く単球表現型への血小板密度の効果を示すグラフである。単球は、低、中または高密度の血小板でコートされた平行プレートに通された。（Ａ）単球−血小板相互作用の数は、高密度の血小板でコートされたプレートについて実質的に増加した。（Ｂ）一晩インキュベーション後、高レベルの血小板に曝露された単球は、膜ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲの発現によって評価されたとおり、ＤＣ分化に一致する表現型を有意に発達させやすかった（高密度対中または低密度：ｐ＜０．０００１、中密度対低密度：ｐ＜０．００５）。示されたデータは、少なくとも６回の独立した実験の平均（＋／−ＳＤ）である。ｌｐｆ、低倍率視野。

【図2】血小板への曝露後の遺伝子発現を示すグラフである。単球は流れにおいて高または低レベルの血小板に曝露された。一晩インキュベーション後、細胞はＲＴ−ＰＣＲを使用して遺伝子発現における差異について評価された。図２は、高レベルの血小板に曝露された単球における遺伝子発現変化を低レベルに曝露されたものと比較して示す。ＤＣ分化および／または機能に関連する７個の遺伝子が上方制御されたことが見出された一方で、３個は下方制御された。下方制御された遺伝子のＧＰＮＭＢおよびＦＰＲＬ２は、それぞれサイトカイン産生の減少およびＤＣ成熟の阻害において公知の機能を有する。上方制御された遺伝子は、すべて免疫促進機能またはＤＣ生物学の多岐にわたる役割のいずれかを有する。遺伝子の具体的な記載については本文を参照されたい。示されたデータは、２回の独立した実験の平均（＋／−ＳＤ）である。

【図3】静止条件での単球分化への血小板の影響を示すグラフである。単球は、低、中または高濃度の血小板と共に流れのない静止条件で１８時間、共培養された。これらの条件下で、ＤＣ分化への血小板の影響は観察されず、すべての条件は、低い、ベースラインレベルのＤＣマーカー発現細胞を生じた。さらに、培養物中のトロンビンでの血小板の活性化（青線）は、血小板を含有し、トロンビンによって活性化されない培養物のもの（赤線）と比較して単球分化において識別可能な差異を生じなかった。

【図4】プレートへの血小板接着での血漿タンパク質の影響を示すグラフである。血小板は、フィブリノーゲン、血漿、フィブロネクチンまたはＲＭＰＩでコートされたプレートをｘ軸によって示される剪断ストレスレベルで通された。流れの中の血小板は、フィブロネクチンに最適に接着した。すべてのタンパク質に関して、血小板接着は最大で０．５から１．０ｄｙｎ／ｃｍ^２ ｌｐｆ、低倍率視野の間で生じた。示されたデータは、少なくとも２回の独立した実験の平均（＋／−ＳＤ）である。

【図5】フィブリノーゲン（Ａ）またはフィブロネクチン（Ｂ）でコートされたプレートへの血小板接着についての血漿タンパク質の影響を示すグラフである。血小板は、未処置（ベースライン）、またはＲＧＤ断片（＋ＲＧＤ）もしくはガンマ断片（＋ガンマ）のいずれかで事前処置のいずれかであり、それらの続くフィブリノーゲン（左パネル）およびフィブロネクチン（右パネル）への接着が評価された。フィブリノーゲンへの血小板結合は、ガンマ断片によって減少し（ｐ＜０．０５）、一方フィブロネクチンへの結合はＲＧＤペプチドによって減少した（ｐ＜０．００１）。ｌｐｆ、低倍率視野。示されたデータは、少なくとも２回の独立した実験の平均（＋／−ＳＤ）である。

【図6】単球血小板相互作用へのタンパク質の関与を示すグラフである。単球は、ｘ軸によって示される条件下で、０．５ｄｙｎ／ｃｍ２の壁剪断ストレスで血小板コートプレート間を通された：血小板は抗Ｐ−セレクチン（Ｐ−）またはアイソタイプ対照（Ｐ＋）のいずれかで事前処置され、単球はＲＧＤペプチド（ＲＧＤ−）または対照断片（ＲＧＤ＋）のいずれかで事前処置された。単球血小板相互作用は、デジタル顕微鏡を使用して各セットの条件下で定量され、Ｐ＋／ＲＧＤ＋の条件下で見られた最大値の割合として図に表されている。相互作用は、３秒未満持続したもの（短期間、黒バー）と安定結合を含んで３秒を超えて持続したもの（長期間、灰色バー）とに分割された。抗Ｐ−セレクチン（Ｐ−）でのブロッキングを含むすべての条件は、短期間および長期間の両方の相互作用における有意な減少を生じた（＊＊、ｐ＜０．０１）、ＲＧＤ（ＲＧＤ−）だけのブロッキングは長期間の相互作用における有意な減少を生じた（＊、ｐ＜０．０５）が、短期間の相互作用に変化を生じなかった。示されたデータは、３回の独立した実験の平均（＋／−ＳＤ）である。

【図7】単球インテグリンへのｐ−セレクチン曝露の効果を示すグラフである。プラスチックプレートは、ｘ軸によって示される相対密度で血小板でコートされた。次いで血小板は、抗ｐ−セレクチン（破線）もしくはアイソタイプ対照（灰色線）で事前処置された、または事前処置を受けなかった（黒線）。単球は、０．５ｄｙｎ／ｃｍ２でプレートを通され、次いで活性β１インテグリンの発現についてフローサイトメトリーによってただちに評価された。ｙ軸は、インテグリンが開いたコンフォメーションにある場合にだけ曝露されるエピトープに方向付けられた抗体に結合した単球の百分率を示している。示されたデータは、３回の独立した実験の平均（＋／−ＳＤ）である。

【図8】一晩インキュベーション後の単球表現型へのＰ−セレクチン曝露の効果を示すグラフである。血小板コートプレートは、未処置（第１のカラム）、またはアイソタイプ対照（第２のカラム）もしくは抗Ｐ−セレクチン（第３のカラム）で事前処置のいずれかであった。単球は、０．５ｄｙｎ／ｃｍ２でプレートを通され、次いで一晩インキュベートされた。ｙ軸は、ＤＣ分化と一致する表現型、すなわち、膜ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ８３＋を生じた単球の百分率を示している。示されたデータは、３回の独立した実験の平均（＋／−ＳＤ）である。

【図9】ＤＣ分化への単球の誘導について提案された機序を示す図である。本原稿に表されたデータに基づいて、次の事象の配列が推論される：（１）血漿フィブリノーゲンがフローチャンバーのプラスチック表面をコートする、（２）それらのαＩＩｂβ３受容体を通じて、活性化されていない血小板が固定化フィブリノーゲンのガンマ構成成分に結合する、（３）血小板が活性化され、瞬間的に予め形成されているＰ−セレクチンおよび他の表面タンパク質を発現する、（４）通過した単球は、ＰＳＧＬ−１を介して一過的にＰ−セレクチンに結合し、部分的な単球活性化およびインテグリン受容体コンフォメーション変化を生じる、（５）部分的に活性化された単球は、ここでさらに相互作用でき、ＲＧＤドメインを含有するものを含む追加的血小板発現リガンドに結合する、（６）最終的に、そのように影響を受けた単球は、１８時間以内にＤＣ成熟経路に効率的に入る。ｉｎ−ｖｉｖｏで上記ステップ（１）は、局所内皮で作用する組織由来炎症性シグナルによって生理学的に置き換えられる場合があり、同様のやり方で血小板を動員および活性化するようにそれを生じることに注目されたい。

【図10】ＧＩＬＺの発現が、単球が未成熟ＭｏＤＣに分化すると急速に下方制御され、デキサメタゾンへの曝露後に上方制御されることを示す図である。Ａ．）ＣＤ１１ｃ＋ＭｏＤＣでのＧＩＬＺ ｍＲＮＡ発現は、新鮮に単離された単球と比較した倍数変化として表される。Ｂ．）０および３６時間後の細胞内および細胞表面マーカーについての蛍光強度中央値。Ｃ．）２４時間後のＣＤ１１ｃ＋ＭｏＤＣでのＧＩＬＺ ｍＲＮＡ発現はデキサメタゾンを受けていないＭｏＤＣと比較した倍数変化として表される。Ｄ．）ＣＤ１１ｃ＋ＭｏＤＣでのＧＩＬＺ ｍＲＮＡ発現は０時間でのＭｏＤＣと比較した倍数変化として表される。Ｅ．）２４時間後のＣＤ１１ｃ＋ＭｏＤＣでのＧＩＬＺ ｍＲＮＡ発現は未処置ＭｏＤＣと比較した倍数変化として表される。Ｆ．）ＣＤ１１ｃ＋ＭｏＤＣでのＧＩＬＺ ｍＲＮＡ発現は未処置ＭｏＤＣと比較した倍数変化として表される。すべてのデータは、最少３回の独立した実験についての平均±標準偏差として表される。差次的遺伝子発現について：＊≧２．５倍変化およびｐ＜０．０５、＊＊≧２．５倍変化およびｐ＜０．０１、＊＊＊≧２．５倍変化およびｐ＜０．００１

【図11】８−ＭＯＰに加えてＵＶＡ光が、未成熟ＭｏＤＣにおいてＧＩＬＺを線量依存的様式で上方制御することを示す図である。Ａ．）ＧＩＬＺ発現は、１Ｊ／ｃｍ２および２Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ光で８−ＭＯＰ濃度の関数として表される。ＰＵＶＡ処置２４時間後のＣＤ１１ｃ＋ＭｏＤＣにおけるＧＩＬＺ ｍＲＮＡ発現は、８−ＭＯＰを受けていないＭｏＤＣと比較した倍数変化として表される。Ｂ．）ＧＩＬＺ発現は、ＵＶＡ線量を乗じた８−ＭＯＰ濃度の関数として表される。Ｃ．）２４時間後の初期アポトーシス性ＣＤ１１ｃ＋細胞の百分率。Ｄ．）２４時間後の後期アポトーシス性ＣＤ１１ｃ＋細胞の百分率。Ｅ．）１Ｊ／ｃｍ２および２Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ線量でのＣＤ１１ｃ＋ゲート細胞のドットプロットは、４回の実験から代表的な１回について示されている。アネキシン−Ｖ＋／７−ＡＡＤ−またはアネキシン−Ｖ＋／７−ＡＡＤ＋表現型を示しているＣＤ１１ｃ＋細胞の百分率が示されている。初期および後期アポトーシス性マーカーを発現しているＦ．）ＣＤ１１ｃ＋細胞およびＧ．）ＣＤ３＋細胞の百分率は、８−ＭＯＰ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＵＶＡ光（１Ｊ／ｃｍ２）での処置の２４時間後に定量された。すべてのデータは、少なくとも４回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。差次的遺伝子発現について：＊≧２．５倍変化およびｐ＜０．０５、＊＊≧２．５倍変化およびｐ＜０．０１

【図12】８−ＭＯＰに加えてＵＶＡ光が、未成熟ＭｏＤＣにおいて線量依存的なやり方でＣＤ８３、ＣＤ８０およびＣＤ８６を下方制御し、ＨＬＡ−ＤＲを上方制御することを示すグラフである。Ａ．）ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８３、ならびにＢ．）ＣＤ８０およびＣＤ８６の膜発現についての相対蛍光強度は、ＰＵＶＡ処置の２４時間後にＵＶＡ線量（１または２Ｊ／ｃｍ２）を乗じた８−ＭＯＰ濃度（０から２００ｎｇ／ｍＬ）の関数として表される。未処置ＭｏＤＣは、対照となり、ＲＦＩ値１を与えられる。データは、４回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１

【図13】アポトーシス性リンパ球に曝露された未成熟ＭｏＤＣがＧＩＬＺを上方制御することを示す図である。Ａ．）共培養２４時間後のＣＤ１１ｃ＋ＭｏＤＣにおけるＧＩＬＺ ｍＲＮＡ発現は、単独で培養された未処置ＭｏＤＣと比較した倍数変化として表される。Ｂ．）共培養２４時間後のＣＤ１１ｃ＋ＭｏＤＣにおけるＧＩＬＺ ｍＲＮＡ発現は、単独で培養された未処置ＭｏＤＣと比較した倍数変化として表される。Ｃ．）共培養２４時間後の細胞内ＧＩＬＺについての相対蛍光強度。Ｄ．）ＣＤ８０およびＣＤ８６ならびにＥ．）ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８３についてのＬＰＳ刺激後から前の相対蛍光強度は、次のとおり算出された：（ＭＦＩ処置ＬＰＳ後−ＭＦＩ処置ＬＰＳ前）／（ＭＦＩ未処置ＬＰＳ後−ＭＦＩ未処置ＬＰＳ前）。データは、少なくとも４回の独立した実験についての平均±標準偏差を表す。差次的遺伝子発現について：＊≧２．５倍変化、ｐ＜０．０５

【図14】ＧＩＬＺを発現しているＭｏＤＣがＩＬ−１０の産生を増加させ、種々の炎症促進性サイトカインおよびケモカインの産生を減少させることを示す図である。ＬＰＳ刺激２４時間後に、培養上清はＡ．）ＩＬ−１０および炎症促進性サイトカインＢ．）ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γ、Ｃ．）ＩＬ−６およびＴＮＦ−αについての磁気ビーズ多重免疫アッセイによるサイトカイン定量のために採取された。同じ分析が炎症促進性ケモカインＤ．）ＩＬ−８ならびにＥ．）ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳについて実施された。データは、３回の独立した実験についての平均±標準偏差として表される。＊ｐ＜０．０５未処置ＭｏＤＣ群と比較。

【図15】ＧＩＬＺのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンは、免疫寛容原性ＤＣに特徴的なＩＬ−１０対ＩＬ−１２ｐ７０比の増加を消滅させることを示す図である。Ａ．）ＧＩＬＺ ｍＲＮＡ発現は、単独で培養された未処置ＭｏＤＣと比べた倍数変化として表される。＊≧２．５倍数変化およびｐ＜０．０５。Ｂ．）ＬＰＳ刺激後の培養上清におけるＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ７０タンパク質レベルの定量。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５、ｓｉＲＮＡで形質移入されていない、同一に処置されたＭｏＤＣと比較。

【図16】ＵＶＡおよび８−ＭＯＰの存在下での古典的ＥＣＰプロセスにおける単球の流れを示す図である。中央の単球は、チャネルの表面に向いた単球よりも低いＵＶＡ曝露を経験する。

【図17】古典的ＥＣＰプロセスにおいて使用されるデバイスのチャネルの設計を示す図である。

【図18-1】ａ）からｄ）は、本発明の方法のために使用できるデバイスのフローチャンバーのさまざまな形状を示す図である。

【図18-2】ａ）からｄ）は、本発明の方法のために使用できるデバイスのフローチャンバーのさまざまな形状を示す図である。

【図19】Ａ）実施例のいくつかにおいて使用されるデバイスの形状を示す図である。Ｂ）代替的デバイスの形状を示す図である。

【図20】図１９のデバイスを通じた単球の物理的活性化でのＨＬＡ−ＤＲの発現の増加を示すグラフである。

【図21】図１９のデバイスを通じた単球の物理的活性化でのＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度（complexity）の増加を示す図である。

【図22】図１９のデバイスを通すことによる単球の物理的活性化でのＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度の増加を示すグラフである。

【図23】図１９のデバイスを通じた単球の物理的活性化でのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１、ＰＬＡＵＲの発現およびまたはＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度の増加を示す図である。

【図24】例えば全体的に活性化されたマクロファージの連続体を示す、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３での単球の潜在的全体的な活性化を模式的に示す図である。

【図25】創傷治癒の模式的態様を示す図である。

【図26】Ａ）実験７、８および９において使用されたフローチャンバーを示す図である。Ｂ）Ａ）に示すフローチャンバーを組み立てる１つの選択肢を示す図である。

【図27】個々のマウスについてのＹＵＭＭ腫瘍の増殖阻害を示すグラフである。８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞は、ＰＢＭＣまたはＰＢＳと混合され、同じフローチャンバーを通され、８−ＭＯＰ／ＵＶＡに供された。破線は、フローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置されなかった個々の対照群マウスの腫瘍サイズを示す。実線は、フローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置された個々の処置群マウスの腫瘍サイズを示す。腫瘍容積は細胞計数によって決定された。

【図28】対照および処置群にわたって平均化された図２７のＹＵＭＭ腫瘍の複合増殖阻害を示すグラフである。破線は、マウスがフローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置されなかった対照群の腫瘍サイズを示す。実線は、マウスがフローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置された処置群の腫瘍サイズを示す。腫瘍容積は細胞計数によって決定された。

【図29】実験７の数匹の処置マウスを示す図である。

【図30】対照および処置群にわたって平均化されたＹＵＭＭ腫瘍の複合増殖阻害を示すグラフである。８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞は、ＰＢＭＣまたはＰＢＳと混合され、同じフローチャンバーを通過したが８−ＭＯＰ／ＵＶＡには供されなかった。破線は、フローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置されなかった個々の対照群マウスの腫瘍サイズを示す。実線は、フローチャンバー通過ＰＢＭＣで処置された個々の処置群マウスの腫瘍サイズを示す。腫瘍容積は細胞計数によって決定された。

【図31】対照および処置群にわたって平均化されたＹＵＭＭ腫瘍の複合増殖阻害を示すグラフである。３個の処置群（各マウス５匹）は、８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置フローチャンバー通過Ｙｕｍｍ１．７だけを受けた（ＹＵＭＭ単独）、フローチャンバーを通過したが８−ＭＯＰ／ＵＶＡに供されなかったＰＢＭＣだけを受けた（ＰＢＭＣ、ＰＰ ｗ／ｏ ＹＵＭＭ）、フローチャンバーを通過したが８−ＭＯＰ／ＵＶＡに供されなかったＰＢＭＣを受け、−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置フローチャンバー通過Ｙｕｍｍ１．７細胞（群４、Ｏ／Ｎ ＹＵＭＭ^ＵＶＡ ＰＰ^{ｎｏＵＶＡ}）またはＰＢＳと一晩同時インキュベートされた。腫瘍容積は細胞計数によって決定された。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本発明がそのいくつかの好ましい実施形態に関して詳細に記載される前に、次の全般的定義が示される。

【0040】

次に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限の非存在下で好適に実施できる。

【0041】

本発明は、具体的な実施形態に関しておよび特定の図を参照して記載されるが、本発明はそれらではなく特許請求の範囲によってのみ限定される。

【0042】

本記載および特許請求の範囲において用語「含む（comprising）」が使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために用語「からなる（consisting of）」は、用語「を構成する（comprising of）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、群が少なくとも一定数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態だけからなる群を開示するとも理解される。

【0043】

本発明の目的のために用語「得られた（obtained）」は、用語「得ることができる（obtainable）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で例えば抗体が具体的な供給源から得ることができると定義される場合、これはこの供給源から得られる抗体を開示するとも理解される。

【0044】

不定または定冠詞が単数名詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を参照して使用される場合、これは、他に具体的に述べられている場合を除いてその名詞の複数を含む。本発明の内容では、用語「約（about）」または「およそ（approximately）」は、当業者が問題となる特質の技術的効果をまだ確保すると理解する正確さの区間を記す。用語は、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％の示された数値からの偏差を典型的には示す。

【0045】

さらに、記載および特許請求の範囲における用語「第１の（first）」、「第２の（second）」、「第３の（third）」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」などは、逐次的または時間的順序を記載する必要がない、類似の要素間を識別するために使用される。そのように使用される用語が適切な環境下で互換的であり、本明細書に記載の本発明の実施形態が本明細書に記載または例示される以外の配列において運用できることは理解される。

【0046】

用語「第１の（first）」、「第２の（second）」、「第３の（third）」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」などが、方法または使用またはアッセイのステップに関する場合、他に示さない限りステップ間に時間または時間間隔の干渉性はない、すなわち本明細書上記または下記に明記された適用において他に示さない限り、ステップは同時に実行されてよいまたはそのようなステップ間に数秒、数分、数時間、数日、数週間、数カ月もしくは数年の時間間隔があってよい。

【0047】

技術的用語は、それらの一般的な意味で使用される。具体的な意味が特定の用語に移される（conveyed）場合、用語の定義は次の用語が使用される内容において示される。

【0048】

既に述べたとおり、本発明は、（ｉ）古典的ＥＣＰ手順のいくつかの態様を模倣すること、（ｉｉ）体外の量の血液における全体的な単球活性化および例えばそれに続くそのような全体的に活性化された単球の免疫賦活樹状細胞への分化の誘導の細胞性および分子性機序を解明することを可能にする小型化されたデバイスについて、以下に提示するデータにある程度基づいている。

【0049】

以下に提示するデータは、原理上は剪断ストレスが全体的な単球活性化およびそれに続くＤＣの誘導の原因であることを示唆している。例えば、以下に記載の小型化されたモデルデバイスを使用することにより、白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって得られたのではない実質的に少ない量の体外血液が使用される場合でも、８−ＭＯＰが体外の量の血液に加えられない場合でさえ、およびＵＶ−Ａでの照射が行われない場合でさえ、免疫賦活ＤＣの誘導が生じることが示された。したがって、古典的ＥＣＰ手順の中心的ステップの削除にもかかわらず全体的な単球活性化およびＤＣの誘導が生じた。しかし、剪断ストレスは、最初に単球を全体的に活性化するためおよびそれに続いて免疫賦活ＤＣを得るための決定的な一要因であると考えられる。全体的な単球活性化および例えばそれに続くＤＣ形成の誘導に肯定的な影響を有する他のステップは、血漿構成成分による血小板の活性化およびそのような活性化血小板による単球の活性化であると考えられる。データは、剪断ストレスが８−ＭＯＰおよびＵＶＡでの照射の存在下で行われるＤＣ形成の誘導を誘導する場合、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）の発現が増加し、次に切断型、すなわち免疫抑制免疫寛容原ＤＣの形成を導く経路を活性化する（実施例２を参照されたい）ことをさらに示唆している。剪断ストレスが誘導した免疫賦活ＤＣの誘導が、８−ＭＯＰの添加を伴わず、ＵＶ−Ａでの照射も伴わずに剪断ストレスを適用することによって達成できたという事実は、古典的ＥＣＰ手順では、プラスチックチャネルの寸法のために、最初に剪断ストレスに誘導されたＤＣの一部は、これらのＤＣが免疫賦活ＤＣにさらに発達できた結果から効果的に照射されなかったことをさらに示唆している（図１６を参照されたい）。この以前のデータは、図１７の全体構造を有するデバイスを使用して得られた。しかし古典的ＥＣＰおよびＥＣＰ様手順では、免疫賦活自己と免疫抑制自己樹状細胞との混合物が得られた。以下に示すデータに基づいて、例えば、先行技術のＥＣＰおよびＥＣＰ様プロセスの必要要件のいくつか、例えば白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって処理される必要がある多量の血液を使用することは省略できる。さらに、免疫賦活自己または免疫抑制自己樹状細胞のいずれかを意図的に得るために、物理的な力を単球に発揮するために使用されるプロセスパラメーターおよびデバイスの設計を意図的に適合させることができる。

【0050】

さらに本明細書に提示するデータおよび結論は、免疫賦活樹状細胞を得るプロセスが全体的な単球活性化ステップおよび単球から免疫賦活抗原提示細胞（例えば樹状細胞）への分化ステップを含むと考えられることを示唆している。これらのさまざまなステップは、上に記載の分子マーカーによって、ＦＡＣＳ分析によって決定可能である前方散乱／側方散乱複雑度（ＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度）によっておよびＥＣＰを受けている細胞について観察された貪食活性によって追跡可能であると考えられる。分子マーカーは、それらの公知の機能、例えば抗原提示の分子マーカー、細胞接着の分子マーカーなどによりさらにグループ分けできる。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８０は、抗原提示を代表するものであると考えられる。ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１は、細胞接着を代表するものであると考えられる。ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１などのマーカーならびにＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度は、全体的な単球活性化の指標であるとさらに考えることができる一方で、例えばＣＤ８３、ＡＤＡＭ−デシシン、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＬＡＭＰ−３およびＣＣＲ７の発現の増加は、単球から樹状細胞への分化の指標であると考えられる。

【0051】

以下に記載の方法は、全体的な単球活性化および例えばそれに続く免疫賦活自己樹状細胞などの抗原提示細胞への成熟および分化を達成するために分子カクテルの必要性なく実施できる。さらに、本発明が体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される全体的な活性化単球に基づくことから、活性化およびそれに続く分化プロセスは典型的サイトカインカクテルによって引き起こされる場合がある分子事象に限定されない。どちらかといえば、以下に記載の方法で得ることができる全体的に活性化された単球および樹状細胞は、これらの樹状細胞の広い機能性の代表であると考えられる同期化されたパターンだがさらに複雑な分子を有すると考えられる。

【0052】

第１の態様では、したがって本発明は、全体的に活性化された単球を得るための方法であって、
ａ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を前記単球が全体的に活性化されるように物理的な力に供するステップ
を少なくとも含み、
前記全体的に活性化された単球が少なくともＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１の発現の増加によって特徴付けられる方法に関する。

【0053】

一般に好適な分子マーカーは、以下に記載され、例えば表６から選ばれてよい。ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１などのマーカーは、全体的な単球活性化の指標であると考えられる。全体的に活性化された単球は、追加的に少なくともＡＢＣＡ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＤ６８、ＣＲＫ、ＦＡＳ、ＩＬ１０、ＲＡＢ７Ｂ、ＲＡＬＡ、ＳＣＡＲＦ１、および／またはＴＨＢＳ１の発現の増加によって好ましくは特徴付けることができる。さらにそのような全体的に活性化された単球は、追加的に少なくともＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１６、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＶ、ＭＭＰ９、ＭＳＲ１、ＯＬＲ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＳＩＲＰα、ＴＩＭＰ１および／またはＴＮＦの発現の増加によって特徴付けることができる。全体的に活性化された単球は、したがって表６の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個のマーカーの発現の増加によっても同定可能である場合もある。全体的に活性化された単球は、ＧＩＬＺの発現の増加を示さない場合がある。発現の増加は、力学的ストレスなどの物理的な力に細胞を供する前後でのこれらのマーカーの発現の比較を指す。

【0054】

既に述べたとおり以下に記載の方法は、全体的な単球活性化後に免疫賦活および免疫抑制細胞の産生を可能にすると示されており、これは、それらの分子マーカーが樹状細胞と一般に称される細胞に対応しない場合でも関連すると考えられるためである。したがって本発明による免疫賦活細胞は、免疫賦活樹状細胞と名付けられている。しかし樹状細胞は抗原提示細胞と称することができる細胞の広範なクラスの代表である。したがって以下に記載の方法は、免疫賦活樹状細胞が好ましい免疫賦活抗原提示細胞の産生に一般に言及する。

【0055】

用語「免疫賦活自己樹状細胞」は、したがって、前記体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を本明細書に記載のとおり処置することによって単球に由来でき、次に記載の分子マーカーによって同定可能である細胞を指す。これらの分子マーカーはＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩの方法によって抗原を提示できる樹状細胞に関する文献において考察されている。本明細書に記載の方法により得ることができ、本明細書に記載の分子マーカーによって同定可能である免疫賦活自己樹状細胞は、既に十分に分化し、内部移行されている樹状細胞であると考えられてよく、それぞれの体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有されている細胞傷害性Ｔ細胞などのアポトーシス性細胞由来の、例えば腫瘍特異的抗原、またはそれぞれの体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有されている例えばウイルス性もしくは細菌性抗原でさえそれらが免疫賦活抗原提示樹状細胞と見なされてよいように提示することは理解される。しかしプロセスは、樹状細胞が、まだ内部移行されず、抗原を提示していない免疫賦活樹状細胞の指標となる分子マーカーを発現するような方法で実施してもよい。一実施形態では用語「免疫賦活自己樹状細胞」は、免疫賦活自己抗原提示樹状細胞を包含する。樹状細胞などの免疫賦活抗原提示細胞が本明細書で述べられる場合、これは、これらの細胞がそのような抗原と接触した後に、例えば疾患特異的抗原をそれらの表面に提示する能力を有する樹状細胞などの免疫賦活抗原提示細胞を指すことは、理解される必要がある。

【0056】

実施例に記載のとおり、本明細書に記載の方法により得ることができる免疫賦活自己樹状細胞の指標である分子マーカーは、健常志願者のいずれかに由来する体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を小型化されたデバイスを使用するプロセスに供することによって同定された（表１のマーカー８８から９９を参照されたい）。さらに、実施例においても記載されるとおり、免疫賦活自己樹状細胞の指標である分子マーカーは、健常志願者またはＣＴＣＬもしくはＧｖ疾患（ＧｖＨＤ）に罹患している患者のいずれかに由来する体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球をＥＣＰプロセスに供することによって同定された（表１のマーカー１から８７を参照されたい）。次いで樹状細胞は、単離され、免疫賦活樹状細胞において役割を演じることが公知であるまたは疑われる分子マーカーの発現の上方制御が分析された。免疫賦活および免疫抑制樹状細胞の複合混合物を生じると想定されるＥＣＰプロセスに関して同定されたマーカーのいくつかは、免疫賦活樹状細胞だけを導くはずである、小型化されたデバイスでのプロセスによって得られた樹状細胞について観察されたものと同じである。したがって、ＥＣＰプロセスが樹状細胞機能と関連する場合がある分子マーカーの上方制御を導く範囲で、これらのマーカーが、免疫賦活樹状細胞を同定するためにも好適であると想定することは、それらが小型化されたデバイスなどの本明細書に記載のプロセスによって得ることができることから正当であると考えられる。全体で９９個の分子マーカーは、本明細書に記載の方法により得ることができる免疫賦活自己樹状細胞について上方制御されるとして同定された。このセットは、比較分析を通じて将来的にはさらなる分子マーカーによって拡大される可能性がある。

【0057】

これにより実施例１および３のデータは、免疫賦活自己樹状細胞の指標であると考えられる９９個のマーカーのセットをもたらす。これらのマーカーを表１に要約する。

【0058】

【表1-1】

【0059】

【表1-2】

【0060】

免疫賦活ＤＣ機能の表面マーカー／機能メディエーターを表す８７個の遺伝子（表１のマーカー１から８７）の内、６６個は「古典的」樹状細胞についての発現データベースとの比較後にＥＣＰ誘導プロセス（プレートを通過し、一晩培養された、実施例を参照されたい）樹状細胞において、独自に同定されたことが見出された。これらは、ＡＢＣＡ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＴＰ６Ｖ０Ｂ、ＢＡＳＰ１、ＢＥＳＴ１、ＣＰＭ、ＣＲＫ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＴＮＮＤ１、ＣＴＳＢ、ＣＸＣＬ１６、ＥＮＧ、ＦＬＯＴ１、ＧＮＡ１５、ＧＰＲ１３７Ｂ、ＧＰＲ１５７、ＨＥＸＢ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＣＡＭ１、ＩＲＡＫ１、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ８、ＫＣＴＤ１１、ＬＡＭＰ２、ＬＥＰＲＯＴ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＭＣＯＬＮ１、ＭＦＡＰ３、ＭＧＡＴ４Ｂ、ＭＲ１、ＭＲＡＳ、ＭＳＲ１、ＮＥＵ１、ＯＬＲ１、ＯＭＧ、ＰＩ４Ｋ２Ａ、ＰＬＡＵＲ、ＰＭＰ２２、ＰＶＲＬ２、ＲＡＢ１３、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＡＢ９Ａ、ＲＡＬＡ、ＲＮＡＳＥ１、ＳＣ５ＤＬ、ＳＥＭＡ６Ｂ、ＳＩＲＰＡ、ＳＬＣ１Ａ４、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ３１Ａ１、ＳＬＣ３５Ｅ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＴＸ３、ＳＴＸ６、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＭＢＩＭ１、ＴＭＥＭ３３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ９、ＹＫＴ６である。

【0061】

免疫賦活自己樹状細胞は、したがって本明細書に記載の方法によって得ることができる免疫賦活自己樹状細胞に対する少なくとも１つの分子マーカーの発現を決定すること、および体外量の哺乳動物対象の血液試料内に含有される単球についてその発現を比較することによって同定可能である。免疫賦活自己樹状細胞対単球について発現の増加が観察される場合、これは単球の免疫賦活自己樹状細胞への分化の指標である。

【0062】

好ましくは、免疫賦活自己樹状細胞は、表１から選択可能である少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個以上の分子マーカーについての発現を決定することによって同定可能である。例えば、ＰＬＡＵＲ、ＮＥＵ１、ＣＴＳＢ、ＣＸＣＬ１６、ＩＣＡＭ１、ＭＳＲ１、ＯＬＲ１、ＳＩＲＰａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ９、ＰＭＢ２２、ＣＤ４０、ＬＡＭＰ３、ＣＤ８０、ＣＣＲ７、ＬＯＸ１、ＣＤ８３、ＡＤＡＭデシシン、ＦＰＲＬ２、ＧＰＮＭＢおよび／またはＣＤ８６を含む群から選択可能な少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個または２２個の分子マーカーについて発現を決定することによって免疫賦活自己樹状細胞を同定できる。より好ましくは、ＰＬＡＵＲ、ＮＥＵ１、ＣＤ８０、ＣＣＲ７、ＬＯＸ１、ＣＤ８３、ＡＤＡＭデシシン、ＦＰＲＬ２、ＧＰＮＭＢおよび／またはＣＤ８６を含む群から選択可能な少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の分子マーカーについての発現を決定することによって免疫賦活自己樹状細胞を同定できる。免疫賦活自己樹状細胞の指標であると考えられる最も好ましいマーカーは、ＰＬＡＵＲ、ＮＥＵ１、ＣＤ８０、ＣＤ８３および／またはＣＤ８６である。

【0063】

本明細書に提示するデータおよび結論は、免疫賦活樹状細胞を得るプロセスが全体的な単球活性化ステップおよび単球から免疫賦活抗原提示細胞（例えば樹状細胞）への分化ステップを含むと考えられることを示唆している。これらのさまざまなステップは、上に記載の分子マーカー、およびＦＡＣＳ分析によって決定可能である前方散乱／側方散乱複雑度（ＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度）によって追跡可能であると考えられる。分子マーカーは、それらの公知の機能、例えば抗原提示の分子マーカー、細胞接着の分子マーカーなどによりさらにグループ分けできる。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８０は、抗原提示を代表するものであると考えられる。ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１は、細胞接着を代表するものであると考えられる。ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１などのマーカーならびにＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度は、全体的な単球活性化の指標であるとさらに考えることができる一方で、例えばＣＤ８３、ＡＤＡＭ−デシシン、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＬＡＭＰ−３およびＣＣＲ７の発現の増加は、単球から樹状細胞への分化の指標であると考えられる。

【0064】

全体的に活性化された単球の同定のためおよび免疫賦活抗原提示細胞または免疫抑制抗原提示細胞に対する識別のために使用できるマーカーのセットは、下の表６に見出される。ＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度の増加（実験５を参照されたい）によって全体的な単球活性化を同定した後、実験３および４の結果は、上方制御された遺伝子（＞２倍の変化を有する４６６遺伝子、Ｐ＜０．０５）を貪食または創傷治癒と関連すると文献においてまたは商業的セットとして同定された遺伝子と比較することによって再評価された。これは、実験３および４において同定され、貪食または創傷治癒と関連した２６遺伝子のセットをもたらした。ＧＥＯ２Ｒソフトウェアは、すべてのＰｒｅＥＣＰ試料対実験３および４におけるすべてのＰｏｓｔＥＣＰ試料を比較するために使用された。ＧＥＯ２Ｒは、Ｌｏｇ２倍数変化および調整されたＰ＜０．０５値を報告する。

【0065】

【表2】

【0066】

本明細書に記載のとおり、方法がＧＩＬＺ（配列番号１００）、ＩＤＯ（インドールアミン）（配列番号１０１）、ＫＭＯ（キヌレニン３−ヒドロキシラーゼ）（配列番号１０２）、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）（配列番号１０３）および／またはＩＬ−１０（インターロイキン１０）（配列番号１０４）の発現の増加を可能にするように実施される場合、体外量の哺乳動物対象の血液試料内に含有される全体的に活性化された単球は免疫賦活自己樹状細胞へ分化せず、むしろ未成熟、いわゆる切断型または免疫抑制樹状細胞になる。したがって、全体的に活性化された単球および免疫賦活自己樹状細胞は、前述の分子マーカーの発現を決定することによってだけでなく、ＧＩＬＺ、ＩＤＯ、ＫＭＯ、ＴＧＦβおよび／またはＩＬ−１０の発現が免疫賦活自己樹状細胞対単球について増加していないことを決定することによっても同定可能である。ＧＩＬＺ、ＩＤＯ、ＫＭＯ、ＴＧＦβおよび／またはＩＬ−１０発現の増加が決定された場合、これは免疫抑制樹状細胞が少なくとも一部は形成されたことの指標であると考えられる。免疫抑制樹状細胞についての指標であると考えられる好ましい分子マーカーは、現在のところＧＩＬＺである。

【0067】

上に述べたとおり以下に記載の方法は、全体的単球活性化ならびにそれに続く単球の免疫賦活自己樹状細胞への成熟および分化を達成するために分子カクテルの必要性なく実施できる。そのようなカクテルは、例えばＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αなどの因子を含む場合がある。

【0068】

理解および対応するツール、例えば全体的に活性化された単球、免疫賦活自己抗原提示細胞と免疫抑制自己抗原提示細胞との間を識別するために手元にある分子マーカーをここに有することを考えると、体外量の哺乳動物対象の血液試料、したがって単球が物理的な力を経験するために通るデバイスおよびフローチャンバーの設計、ならびに全体的な単球活性化ならびにそれに続く単球の全体的に活性化された単球およびそれに続く免疫賦活自己樹状細胞への分化の誘導のプロセスが実施されるパラメーターを、意図的に変更することがいまやできる。

【0069】

上に述べたとおり、体外量の哺乳動物対象の血液試料はデバイスのフローチャンバーを前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される前記単球に剪断力が適用されるように通される。単球の全体的な活性化に影響を与える、デバイスおよびフローチャンバーの設計の修正は、流力の変更、フローチャンバーの流路の形状の変更、フローチャンバーの寸法の変更、温度調整の実現性、フローチャンバー中の体外量の哺乳動物対象の血液試料の可視またはＵＶ光への曝露の実現性などを含む。物理的な力の適用は、例えば体外の量の血液試料をフローチャンバーに通すことによってだけでなく、体外の量の血液試料を例えばＭａｃｏｐｈａｒｍａから得ることができるＥＶＡプラスチックバッグに入れ、この血液試料を満たしたバッグを穏やかに動かすまたは振ることによっても達成できる（例えばAndreu et al., (1994), Trans. Sci., 15(4), 443-454を参照されたい）。

【0070】

上に述べ、以下で示すとおり単球の全体的な活性化およびそれに続く免疫賦活自己樹状細胞への分化の誘導は、単球が以下に記載のデバイスによって提供され得る物理的な力を経験する状況での単球と活性化血小板および／または特異的血漿構成成分との相互作用に依存している。したがってプロセスパラメーターの変更は、血漿構成成分の性質、純度および濃度、血小板の性質、純度および濃度、血漿構成成分および／または血小板がフローチャンバーに通されるおよび／または配置されるステップの順序、フローチャンバーが血漿構成成分および／または血小板でコートされる密度、体外量の哺乳動物対象の血液試料、具体的には血小板および／または単球がそのようなフローチャンバーのフローチャンバーを通る流力、体外量の哺乳動物対象の血液試料、具体的には血小板および／または単球がそのようなデバイスのフローチャンバーを通る温度および／または時間など、体外量の哺乳動物対象の血液試料に、具体的には単球に加えられる８−ＭＯＰおよび／またはサイトカインなどの追加的因子の性質、純度および濃度を、変更することを含む。

【0071】

デバイスおよびフローチャンバーの設計ならびにプロセスパラメーターに関連する因子は、単球の全体的な活性化およびそれに続く免疫賦活自己樹状細胞への分化に対するそれらの関連に関して、ここでより詳細に考察される。次に考察される任意の実施形態について、単球の全体的な活性化は達成され、全体的に活性化された単球は上に記載の分子マーカーの発現を決定すること、および／またはＧＩＬＺの発現を決定することによって同定可能であることは理解される。さらに次に考察されるすべての実施形態について、体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球が全体的に活性化されるために剪断ストレスなどの物理的な力に供されることは理解される。

【0072】

第１の態様の一実施形態では、本発明は、体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を全体的に活性化する方法に関し、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料は、前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される前記単球に剪断力が適用されるように、前記デバイスの前記フローチャンバーを通る前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料の流速の調整を可能にする、デバイスのフローチャンバーに前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を通すことによって物理的な力に供される。

【0073】

第１の態様の別の実施形態では、本発明は、体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を全体的に活性化する方法に関し、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料は、前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される前記単球に剪断力が適用されるように、デバイスのフローチャンバーを通る前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料の流速の調整を可能にする、前記デバイスの前記フローチャンバーに前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を通すことによって物理的な力に供され、前記デバイスの前記フローチャンバーは前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される前記単球に剪断力が適用されるようにする設計を有する。

【0074】

第１の態様の別の実施形態では、本発明は、体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を全体的に活性化する方法に関し、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料は、前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される前記単球に剪断力が適用されるように、デバイスのフローチャンバーを通る前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料の流速の調整を可能にする、前記デバイスの前記フローチャンバーに前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を通すことによって物理的な力に供され、前記デバイスは温度および露光を含む群から選択される少なくとも１つのパラメーターの調整を追加的に可能にする。

【0075】

第１の態様の別の実施形態では、本発明は、体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を全体的に活性化する方法に関し、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料は、前述のデバイスのフローチャンバーに前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を通すことによって物理的な力に供され、前記単球は活性化血小板および／または血漿構成成分との相互作用を通じて全体的に活性化される。

【0076】

例えば、第１の態様の一実施形態では、本発明は、体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を全体的に活性化する方法に関し、前記方法は、
ａ）少なくとも単球を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料が通ることができるフローチャンバーを提供するように構成されているデバイスに適用するステップ、
ｂ）前記体外量の前記哺乳動物対象の血液内に含まれ得る、または少なくとも単球を含む前記哺乳動物対象の血液試料から分離されて提供され得る血小板を活性化するステップ、
ｃ）前記単球がステップｂ）において得られた前記活性化血小板に結合することによって全体的に活性化されるように前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される単球に物理的な力を適用することによって、少なくとも単球を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を前記デバイス中で処置するステップ
を少なくとも含む。

【0077】

第１の態様の別の実施形態では、本発明は、体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を全体的に活性化する方法に関し、前記方法は、
ａ）少なくとも単球を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料が通ることができるフローチャンバーを提供するように構成されているデバイスに適用するステップ、
ｂ）前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料内に含まれ得る、または前記哺乳動物対象の血液試料から分離されて提供され得る血漿構成成分を通すステップ、
ｃ）前記単球がステップｂ）において得られた前記血漿構成成分に結合することによって全体的に活性化されるように前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される単球に物理的な力を適用することによって、少なくとも単球を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を前記デバイス中で処置するステップ
を少なくとも含む。

【0078】

第１の態様のさらに別の実施形態では、本発明は、体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を全体的に活性化する方法に関し、前記方法は、
ａ）少なくとも単球を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料が通ることができるフローチャンバーを提供するように構成されているデバイスに適用するステップ、
ｂ）前記体外量の前記哺乳動物対象の血液内に含まれ得る、または前記哺乳動物対象の血液試料から分離されて提供され得る血漿構成成分を通すステップ、
ｃ）前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料内に含まれ得る、または少なくとも単球を含む前記哺乳動物対象の血液試料から分離されて提供され得る血小板を活性化するステップ、
ｄ）前記単球がステップｂ）およびｃ）において得られた前記活性化血小板および／または血漿構成成分に結合することによって全体的に活性化されるように前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される単球に物理的な力を適用することによって、少なくとも単球を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液を前記デバイス中で処置するステップ
を少なくとも含む。

【0079】

第１の態様のさらに別の実施形態では、本発明は、体外量の哺乳動物対象の血液試料に含有される単球を全体的に活性化する方法に関し、前記方法は、
ａ）任意選択で、血小板に富む血漿を、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料が通ることができるフローチャンバーを提供するように構成されているデバイスを通すステップ、
ｂ）少なくとも単球を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料が通ることができるフローチャンバーを提供するように構成されているデバイスに適用するステップ、
ｃ）前記単球がステップａ）の前記血小板に富む血漿に任意選択で結合することによって全体的に活性化されるように前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される単球に物理的な力を適用することによって、少なくとも単球を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液を前記デバイス中で処置するステップ
を少なくとも含む。

【0080】

血小板を活性化するステップならびに続く単球の活性化は（ｉ）血漿タンパク質などの血漿構成成分はデバイスのフローチャンバーを通され、それによりこれらの構成成分はフローチャンバーの壁に接着する、（ｉｉ）血小板はフローチャンバーを通され、血漿構成成分への結合によって活性化される、および（ｉｉｉ）少なくとも単球を含む体外量の前記哺乳動物対象の血液などの単球含有画分は、フローチャンバーを通され、活性化血小板への結合によって活性化される、実施形態について次に考察される。しかし、これらの活性が、全血画分が下に記載のとおり体外の量の血液から得られた場合と同様に血漿画分または血漿タンパク質もしくはその断片、血小板画分および単球含有画分が、チャネルまたはチャネル様構造を同時に通る場合にも生じることは理解される。プロセスが、血漿構成成分だけをフローチャンバーの壁に接着させ、単球を血漿構成成分と相互作用させることによっても同じ有効性ではないが実施できることもさらに理解される。それでも次にこれらの態様は、好ましい実施形態、すなわちステップ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が実現される場合に関して次に考察される。

【0081】

第１のステップに関して、フィブリノーゲンもしくはフィブロネクチン、またはフィブリノーゲンのガンマ構成成分などのその断片などのタンパク質を含む血漿構成成分は、体外の量の血液試料から得られた画分としてまたは他の供給源から精製された形態、例えば組換え的に発現されたタンパク質の形態のいずれかで提供されてよい。フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンなどの血漿タンパク質による血小板の活性化は十分であり、これらのタンパク質の組換え的に発現された形態が十分であると考えられるが、体外の量の血液試料から得られ、これらのタンパク質を含む血漿画分を使用することは、これらの血漿画分がさらに複雑な組成を有し、血小板の最適な活性化を提供するすべての血漿構成成分を含み得ることから、好ましい場合がある。

【0082】

血漿タンパク質画分、血漿タンパク質またはその断片は、チャネルまたはチャネル様構造の壁に接着させるためにプラスチックまたはガラスなどの非プラスチック材料で作ることができるフローチャンバーを通すことができる。血漿画分または血漿タンパク質が、例えば具体的な圧力などの具体的な物理的な力でフローチャンバーを通される必要性はない。しかしプロセスを能率化するために、血漿画分または血漿タンパク質をフローチャンバーに、下により詳細に記載される単球活性化のために必要とされる剪断ストレスと同一でなくとも同等である剪断ストレスで通すことが構想される。一般に、血漿画分または血漿タンパク質は、フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンを含む血漿タンパク質でその表面をコートするために最初にフローチャンバーをポンプで通される。フローチャンバーを通る血漿タンパク質画分、血漿タンパク質またはその断片の流速は、プラスチック表面へのタンパク質接着の所望のレベルを得るために制御される。所望により流れは一定時間停止される場合があり、血漿構成成分はフローチャンバーの表面を「浸漬」する場合がある。フローチャンバーを通して血漿構成成分を進ませるポンプの速度および時間を制御することによって、コーティングの程度を制御できる。一手法では、血漿画分または血漿タンパク質は、フローチャンバー構造の表面に約１から６０分の間、約１から約３０分の間、約１から約２０分の間または約１から約１０分の間の時間曝露される。フローチャンバーの表面への血漿タンパク質接着を増強するために、流れは一時的に中止してよく（約６０分間まで）、再開の前に、または手順のこの相の際に流速は充填速度（１００ｍｌ／分まで）から５ｍｌ／分まで遅くしてよい。

【0083】

フローチャンバーの表面が、例えば精製された血漿タンパク質またはフィブリノーゲンのガンマ構成成分などのその断片でプレコートされているフローチャンバーを有するデバイスが使用される筋書きも構想できる。そのようなプレコートされたデバイスは、例えば１回限りの使用のために構成されている、フローチャンバーを備えるカートリッジを含む手持ち式のデバイスでプロセスが実施される場合に使用できる。フローチャンバーの表面が、例えば血小板に富む血漿でプレコートされているフローチャンバーを有するデバイスのために使用される筋書きも構想できる。

【0084】

血漿画分もしくは血漿タンパク質またはその断片がチャネルまたはチャネル様構造を通され、その表面が血漿タンパク質でコートされた後に、血小板画分は、例えばポンプによってチャネルまたはチャネル様構造に入れられて通される。チャネルまたはチャネル様構造内での血小板の流速および滞留時間は、チャネルまたはチャネル様構造の表面に既に接着しており、それにより活性化されている、血漿構成成分またはタンパク質もしくはその断片への血小板の結合を可能にするように選択される。

【0085】

本明細書に提示するデータは血漿構成成分による血小板の活性化が、不活性化血小板が最初にフィブロネクチンのガンマ構成成分に結合し、それにより活性化され、次いでフィブロネクチンまたはフィブリノーゲンなどの多くの血漿タンパク質において見出されるＲＧＤモチーフ（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）に結合する場合がある逐次的プロセスであることを示唆している。精製されたおよび／または組換え的に発現された血漿タンパク質またはその断片が血小板の活性化のために使用される場合、それにより少なくともフィブリノーゲンのガンマ構成成分および任意選択で追加的にＲＧＤペプチドを有するプレコートチャネルまたはチャネル様構造が構想できる。これらの血漿タンパク質断片およびペプチドは、血小板の効率的な活性化、および同時にチャネルまたはチャネル様構造の表面のコーティングプロセスの最適な制御を可能にできる。当然のことながらこれらすべての構成成分は、体外の量の血液から得られた血漿画分がコーティングおよび活性化のために使用される場合に、存在する。

【0086】

血小板の血漿構成成分への効率的な結合およびそれによる活性化のために、流速は血漿構成成分のコーティングステップと比較して上方にまたは下方に調整される場合がある、または流れは血漿構成成分に結合した所望のレベルの血小板を得るために一定時間停止されてよい。血漿活性化のための流速は、選択されたデバイスに依存して典型的には約５ｍｌ／分から約２００ｍｌ／分、約１０ｍｌ／分から約１５０ｍｌ／分、約１０ｍｌ／分から約１００ｍｌ／分または約５ｍｌ／分から約５０ｍｌ／分の範囲であってよい。典型的には、約１から６０分の間、約１から約３０分の間、約１から約２０分の間、または約１から約１０分の間、血小板を血漿構成成分に結合できるようにすることが望ましい。

【0087】

剪断ストレスが血小板の活性化について、単球の全体的な活性化についてと同じ重要性であるとは考えないが、血小板画分を、約０．２から約０．４まで、約０．５まで、約０．６まで、約０．７まで、約０．８まで、約０．９まで、約１まで、約２まで、約３まで、約４まで、約５までまたは約６ｄｙｎ／ｃｍ^２までなどの約０．０１から約１００．０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２、約０．０５から約５０．０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２、約０．１から約２０．０ｄｙｎ／ｃｍ^２、約０．２から約１５．０ｄｙｎ／ｃｍ^２、約０．３から約１０．０ｄｙｎ／ｃｍ^２の剪断力下でフローチャンバーを通すことは好ましい場合がある。血小板含有画分の典型的流速は、それぞれのデバイスに依存して約５ｍｌ／分から約２００ｍｌ／分、約１０ｍｌ／分から約１５０ｍｌ／分、約１０ｍｌ／分から約１００ｍｌ／分または約５ｍｌ／分から約５０ｍｌ／分の範囲である場合がある。流速は、フローチャンバーのサイズおよび形状にある程度依存し、下に述べる寸法のフローチャンバーが使用される場合に具体的に使用できる。一般に、前述の剪断ストレス値を達成するために流速を選択できる。

【0088】

したがって、約０．１から約１０．０ｄｙｎ／ｃｍ^２の剪断力を産生するために約１０ｍｌ／分から約２００ｍｌ／分の流速で、血小板含有画分をチャネルまたはチャネル様構造に通すことが企図される。

【0089】

血小板がチャネルまたはチャネル様構造を通され、チャネルまたはチャネル様構造の表面に配置されている血漿タンパク質またはその断片によって活性化された後に、単球含有画分、例えば前記体外量の哺乳動物対象の血液試料または体外の量の血液試料から得られた下に述べる白血球もしくはバフィーコート画分は、物理的な力を適用することによって、例えばポンプによってチャネルまたはチャネル様構造に入れられて通されることによって通される。血漿構成成分との相互作用を通じた血小板の活性化が血漿構成成分への血小板の接着を導くことは理解される。

【0090】

血小板および血漿構成成分を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料がフローチャンバーを通される場合に上記と同じ事象が起きることも理解される。この場合血漿構成成分は、フローチャンバーの壁に接着し、次いで血小板を活性化する。しかしこの筋書きでは、プロセスは制御可能ではない場合があり、血小板および血漿構成成分を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料のフローチャンバーでの滞留時間が増加することによりこのことが考慮される場合がある。

【0091】

活性化血小板の代わりに、単球を活性化するために十分である血小板由来の因子を使用できることはさらに注目される。これらの因子は、例えばフィブロネクチンを含み、Ｐ−セレクチン、インテグリンα５β１Ｃ型レクチン受容体、ＣＤ６１、ＣＤ３６、ＣＤ４７ならびにＣＤ５５およびＣＤ５９などの補体阻害剤、またはＴＲＥＭ様転写物−１などの因子も含む場合がある。そのような血小板由来因子は、例えば精製された構成成分の混合物または、例えば体外量の哺乳動物対象の血液試料内に含有される血小板の溶解によって得られた構成成分の混合物としてのいずれかでフローチャンバーの表面に直接配置されてもよい。この場合、例えばフローチャンバーの表面を血漿構成成分でコーティングする必要性は、省くことができる。

【0092】

本明細書に示すデータは、血小板が一度活性化されると、Ｐ−セレクチンおよびＲＧＤ含有リガンドなどのタンパク質が活性化血小板によって発現され、次いで単球と相互作用し、免疫賦活樹状細胞へのそれらの分化を活性化することを示唆している。さらに、活性化血小板による単球活性化および樹状細胞誘導は、静止条件下では生じないことが見出された。むしろ単球は、物理的な力の適用下でチャネルまたはチャネル様構造を通される必要がある。活性化において血小板が、次いで単球を活性化するＰ−セレクチンなどの因子を発現するために約６０から約１２０分間を必要とすることを考えると、単球の通過は血小板がこれらの因子を発現し始めるまで、例えば約６０から約１２０分間、遅らせてもよい。単球、血小板および血漿構成成分を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料がフローチャンバーを通される場合、この時間はより長い時間に調整してよい。

【0093】

単球と活性化血小板、血小板由来因子または血漿構成成分との相互作用が、同時の物理的な力の適用なしでは単球の全体的な活性化のために不十分であることは理解される。

【0094】

フローチャンバーを通して単球含有画分を動かすための物理的な力の適用は、好ましくは体外量の哺乳動物対象の血液試料などの単球含有画分が剪断ストレス下でフローチャンバーを通って動かされることを意味できる。典型的には、単球含有画分は、約０．２から約０．３まで、約０．４まで、約０．５まで、約０．６まで、約０．７まで、約０．８まで、約０．９まで、約１まで、約１．５までまたは約２ｄｙｎ／ｃｍ^２までなどの約０．０１から約１００．０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２、約０．０５から約５０．０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２、約０．１から約２０．０ｄｙｎ／ｃｍ^２、約０．２から約１０．０ｄｙｎ／ｃｍ^２の剪断力下でフローチャンバーを通してよい。流速は、フローチャンバーのサイズおよび形状にある程度依存し、下に述べる寸法のチャネルまたはチャネル様構造が使用される場合に具体的に使用できる。一般に、前述の剪断ストレス値を達成するために流速を選択できる。

【0095】

単球の活性化を可能にする好適な剪断力は、約５０：１から約３００：１または約５０：１から約２５０：１などの約４０：１から約４００：１の前述の高さ幅比を有するフローチャンバーによって達成され得る。温度は、単球の全体的な活性化に影響を与える別の因子である。本発明による方法は、約１８℃から約４２℃の範囲、好ましくは約２２℃から約４１℃の範囲およびより好ましくは約３７℃から約４１℃の範囲で実施してよい。

【0096】

単球の全体的な活性化を調節するために変更してよい１つのパラメーターは、フローチャンバーが血漿構成成分およびしたがって血漿構成成分に結合する血小板でコートされる密度である。一般に、フローチャンバーの表面が血漿構成成分および血小板でより高密度にコートされればされるほど、単球活性化はより効率的になる。

【0097】

血小板が血漿構成成分への結合によって活性化されることは上に述べられている。本発明による用語「活性化血小板」は、フィブロネクチンおよび／またはフィブリノーゲンなどの血漿構成成分への血小板の結合の結果としてＰ−セレクチン、αＩＩｂ−β３インテグリンおよび／またはフィブロネクチン、フィブリノーゲンもしくはビトロネクチンなどのＲＧＤ含有タンパク質の発現の増加を示す血小板を指して使用される。発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロッティングまたはＦＡＣＳ分析などの従来の方法によって決定できる。本発明による用語「非活性化血小板」は、フィブロネクチンまたはフィブリノーゲンなどの血漿タンパク質へのその結合が、血小板をフィブリノーゲンのガンマ構成成分と事前インキュベートすることによって低減できない血小板を指して使用される。

【0098】

単球が、剪断ストレス条件下での活性化血小板への結合によって全体的に活性化され、免疫賦活自己樹状細胞への分化を始めることは上に述べられている。

【0099】

単球の活性化およびそれに続くこれらの単球の免疫賦活自己ＤＣへの分化の誘導が小型化されたデバイスにおいて達成できるという発見は、少量の体外血液試料で全体的な単球活性化のプロセスを実施できるようにする。上に述べたとおり古典的ＥＣＰ手順は、単球ならびに血漿構成成分および血小板を含む白血球を含む約２００ｍｌから５００ｍｌの最終容量を得るために、白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって患者から典型的には得られる２．５Ｌから６Ｌの血液の処理を必要とする。

【0100】

しかし、本発明による方法は、実質的に少ない量の血液試料を必要とする可能性があり、それにより患者への考慮すべき負担である白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスまたは他のプロセスの必要性を省くことができる。

【0101】

したがって本発明は、白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスに対する必要性なく実施でき、そのような全体的に活性化された単球を得るプロセス全体が手持ち式のデバイスで実施できる。

【0102】

したがって上に記載の実施形態と組み合わせることができる本発明の第１の態様の一実施形態では、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液が白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって得られない第１の態様による方法を実施することが企図される。

【0103】

前記体外量の前記哺乳動物対象の血液は、典型的にはそれぞれの対象の全血液量の０．１％〜１０％の間であってよい。前記哺乳動物対象の血液の量は、体外の量の哺乳動物の血液試料の約１ｍｌから約１００ｍｌの間、約１ｍｌから約５０ｍｌの間、約１ｍｌから約４０ｍｌの間、または約１ｍｌから約３０ｍｌの間の最終容量をもたらすように、前記哺乳動物対象の体外血液の約５ｍｌから約５００ｍｌの間、約１０ｍｌから約４５０ｍｌの間、約２０ｍｌから約４００ｍｌの間、約３０ｍｌから約３５０ｍｌの間、約４０ｍｌから約３００ｍｌの間、または約５０ｍｌから約２００ｍｌの間または約５０ｍｌから約１００ｍｌの間であってよい。

【0104】

採血され、デバイスに適用された体外血液の量は、全血であってよい。代替的に、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液は、０．５＊１０^６〜５０＊１０^６個の間の単核細胞から白血球を単離することによって得られてもよい。白血球は、約５ｍｌから約５００ｍｌ、約１０ｍｌから約４５０ｍｌの間、約２０ｍｌから約４００ｍｌの間、約３０ｍｌから約３５０ｍｌの間、約４０ｍｌから約３００ｍｌの間または約５０ｍｌから約２００ｍｌの間または約５０ｍｌから約１００ｍｌの間の前記哺乳動物対象の体外全血から単離されてもよい。

【0105】

前記体外量の前記哺乳動物対象の血液は、約５ｍｌから約５００ｍｌの間、約１０ｍｌから約４５０ｍｌの間、約２０ｍｌから約４００ｍｌの間、約３０ｍｌから約３５０ｍｌの間、約４０ｍｌから約３００ｍｌの間または約５０ｍｌから約２００ｍｌの間また約５０ｍｌから約１００ｍｌの間の前記哺乳動物対象の体外全血からバフィーコートを単離することによっても得ることができる。

【0106】

前述のすべての場合（全血、白血球画分、バフィーコート）において、前記体外の量の血液は、典型的には単核細胞約５×１０^６個／ｍｌなどの約１×１０^４個から約１×１０^８個の間を含む。

【0107】

当業者は、ろ過、分画遠心分離を含む、全血、その白血球画分またはそのバフィーコート画分をどのように得るかに精通している（例えばBruil et al., Transfusion Medicine Reviews (1995), IX (2), 145-166を参照されたい）。好ましい方法は、例えばＰａｌｌから入手可能であるフィルターによる。そのようなフィルターは、体外試料の処理を手持ち式のデバイス中で行えるようにデバイスに組み入れられてよい。供給源として、例えば臍帯の血液も使用できる。

【0108】

遠心分離を使用する場合、例えば１７または１８ゲージゲージ針を有するシリンジを通して全血を得ることができる。そのような全血試料は、デブリおよび他の構成成分を除去するために遠心分離されてよい。次いで全血試料は、Ｐａｌｌから得られるなどの一般的フィルターを通してろ過されてよい。

【0109】

単核白血球画分を得るために、記載の全血試料を得る場合があり、次いでそのような試料を例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅに重層できる。続いて遠心分離ステップが例えば１８０ｇなどの約１００ｇから約２００ｇで実施され、次いで単核白血球画分は界面から収集され、ＨＢＳＳなどの一般的緩衝液で洗浄されてよい。次いで洗浄された単核白血球画分は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）などの血清不含有細胞培養培地に再懸濁されてよい。単核白血球画分を得るための他の方法は、水簸、ろ過、密度遠心分離などを含む。

【0110】

全体的な活性化の前は、単球は、血液試料中でＣＤ１３^＋細胞として同定され得る。

【0111】

上で指摘したとおり、全体的な単球活性化およびＤＣ形成の誘導のための決定的ステップは、血漿構成成分による血小板の活性化およびそのような活性化血小板による単球の活性化を含むと考えられる。原理上は、剪断ストレス下で全血試料をデバイスに通すことができる。次いでそのような試料の血漿構成成分は、フローチャンバーの表面に結合し、血漿構成成分によるそのような試料内の血小板の接着および活性化を可能にする。そのような試料の単球は、次いで活性化血小板に結合し、それら自体が活性化される。

【0112】

同様に、上に記載のとおり得られた全血試料を全血試料のデブリを分離するために約１５０ｇなどの約１００ｇから約１８０ｇで、約１５分間などの約１０分間から約２０分間遠心分離することによって得ることできる画分を含有する血小板に富む血漿などの種々の構成成分の組合せを得ることができる。血小板に富む血漿層は、次いで収集され、約９００ｇなどの約７００ｇから約１０００ｇで、約５分間などの約３分間から約１０分間再遠心分離される。生じたペレットは、次いで血清不含有細胞培養培地に再懸濁される。

【0113】

しかし、プロセス全体について最良の制御を得るために、最初に血漿構成成分をフローチャンバーに通し、それらを接着させ、次いで血小板、次いで単球含有画分であることは望ましい。この手法について、単球または単球を含むバフィーコート画分を含み、血漿構成成分を含まず、血小板を含まない白血球画分を得ることは望ましい場合がある。そのような血漿および血小板を含まない単球含有画分は、当技術分野において記載のとおり得ることができる。白血球またはバフィーコート画分が上に記載のとおり得られる場合、それらは血漿または血小板を本発明の目的のために十分な程度含まない。この手法のために血小板および／または血漿画分を有することは望ましい。

【0114】

したがって本発明は、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液が前記デバイスに適用される前に体外量の前記哺乳動物対象の血液から分離されている血小板を使用することを企図する。次いでこれらの血小板は、フィブロネクチンなどの血漿構成成分でコートされたフローチャンバーを通してよい。

【0115】

別の実施形態では、本発明は、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液が前記デバイスに適用される前に体外量の前記哺乳動物対象の血液から分離されている血漿構成成分を使用することを考慮する。次いでこれらの血漿構成成分は、それらが接着できるようにフローチャンバーを通してよい。

【0116】

体外の量の血液から得られた血漿構成成分を使用する代わりに、例えば組換えタンパク質発現などの他の供給源から単離された血漿構成成分を使用することもできる。そのような血漿構成成分は、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｐ−セレクチン、およびフィブリノーゲンのガンマ構成成分などのその断片を含む。

【0117】

白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって得られなかった体外の量の血液を使用することは好ましい場合があるが、白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって得られた体外の量の血液を使用することは、本発明によって排除されない。

【0118】

したがって本発明の第１の態様の別の実施形態では、上に記載の方法を実施することが企図され、前記体外量の前記哺乳動物対象の血液は、白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって得られる。

【0119】

白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスは、当技術分野において公知のとおり実施できる。したがって、２．５Ｌから６ｌなどの体外量の血液が対象から得られ、３つの画分、すなわち血漿、血小板およびバフィーコートを得るために従来の白血球アフェレーシスによって処置されてよい。フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンなどのタンパク質を含有する血漿は、最も軽い血液画分であり、したがって遠心分離によって選択的に除去され、チャネルまたはチャネル様構造を通される血液の第１の部分である。血漿がチャネルまたはチャネル様構造をポンプで通され、その表面が血漿タンパク質でコートされた後に、白血球アフェレーシス遠心分離物において二番目に軽い構成成分、血小板画分が、チャネルまたはチャネル様構造をポンプで入れられて通される。白血球アフェレーシス遠心分離物から溶出される三番目に軽い画分は、白血球細胞を含有するバフィーコートであり血液単球を含む。次いで単球を含むバフィーコートは、チャネルまたはチャネル様構造をポンプで通される。血液試料はＴｈｅｒａｋｏｓデバイス、Ｓｐｅｃｔｒａ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Andreu et al., (1994), Transf. Sci., 15(4), 443-454を参照されたい）、またはＭａｃｏｐｈａｒｍａからのＴｈｅｒａｆｌｅｘデバイスを使用して得られてもよい。

【0120】

したがって本発明は、一実施形態において本発明は、単球を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液が前記デバイスに適用される前に体外量の前記哺乳動物対象の血液から白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって分離されている血小板を使用することを考慮する。

【0121】

別の実施形態では、本発明は、単球および／または血小板を含む前記体外量の前記哺乳動物対象の血液が前記デバイスに適用される前に体外量の前記哺乳動物対象の血液から白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって分離されている血漿構成成分を使用することを考慮する。

【0122】

体外の量の血液から得られた血漿構成成分を使用する代わりに、例えば組換えタンパク質発現などの他の供給源から単離された血漿構成成分も使用できる。そのような血漿構成成分は、フィブリノーゲン、フィブロネクチンまたはＰ−セレクチンを含む。アミノ酸４００〜４１１（配列番号１０５、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）に対応するフィブリノーゲンのガンマ構成成分などの血漿タンパク質の断片も使用できる。このガンマ構成成分は、血小板を活性化できることが本明細書において表されるデータによって示されている。したがって、主にではなくても少なくともフィブロネクチンを含む血漿画分を使用することが好ましい場合がある。同様に、例えば組換え的に発現されたおよび／または精製されたフィブロネクチンまたはそのガンマ構成成分を、血小板を活性化するために使用することが好ましい場合がある。

【0123】

体外の量の血液が白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって得られたまたは得られていない本発明の第１の態様の両方の実施形態について、３つすべての画分、すなわち血漿構成成分、血小板および単球含有画分を、例えば全血試料の形態であってもまたは全血の事前精製だけされた画分を使用することによってでも同時にフローチャンバーを通すことは、これらの画分を前述の逐次的通過でフローチャンバーを通すことがプロセス全体のより良い制御を提供できる場合もあるが、考慮することができる。全血の事前精製された画分は、例えば血液バッグを遠心分離し、白血球細胞および血小板が濃縮されている上清を絞り出すことによって得ることができる。

【0124】

前述のとおり、フローチャンバーを通る流速、およびそれにより生じる剪断ストレスは、単球の全体的な活性化に影響を与えるように調整されてよい。フローチャンバーの設計および寸法は、単球への物理的な力の適用を操作し、さらに改善するためにも使用されてよい。

【0125】

チャネルまたはチャネル様構造を含むフローチャンバーを有するデバイスは、好適である場合がある。古典的ＥＣＰ手順のために使用されるデバイスの全体構造、より小さな寸法だが、を有するそのようなフローチャンバーは、図１７に示されている。

【0126】

しかし図１８ａ）からｄ）または図２６に示すものなどの他の形状も使用できる。したがって本明細書に記載の発見は、プロセスの際に生じる乱流および剪断ストレスに関してプロセス全体に良い制御を有することを可能にする顕著に簡易化された形状のフローチャンバーを考慮することを可能にする。

【0127】

多数のフローチャンバーを有するデバイスは、好適である場合がある。古典的ＥＣＰ手順のために使用されるデバイスの全体構造、より小さな寸法だが、を有するフローチャンバーは、図１７に示されている。

【0128】

チャネルなどのフローチャンバーは、原理上は上に記載の目的のために好適な任意の断面形状を有してよい。したがってそれらは、矩形、円形、楕円形、または他の断面形態を有する場合がある。そのようなフローチャンバーの寸法は、下で主に矩形断面に関して考察されているが、楕円形または円形断面を有するチャネルなどのフローチャンバーが使用されることは、そのような断面が例えば血漿構成成分でのさらに均質なコーティングおよび／または乱流をあまり含まないさらに継続的な流れ特性を可能にするはずであることから好ましい場合がある。

【0129】

フローチャンバーは、一般に約２０μｍの高さから約２０００μｍまでの高さ、約５ｍｍから約２００ｍｍの幅および約１０ｍｍの長さから約４００ｍｍの長さを有してよく、単球が付着し、それにより活性化されるために十分な表面を有することを確実にすることによって効率的な活性化を可能にする。

【0130】

さらにより好ましい実施形態は、約５０：１から約３００：１または約５０：１から約２５０：１などの約４０：１から約４００：１の高さ幅比を有するフローチャンバーに関する。そのような寸法は、単球の効率的な活性化を可能にする。

【0131】

矩形断面を有する場合、チャネルなどのフローチャンバーは、約５μｍから約５００μｍまでの高さおよび約５μｍから約５００μｍまでの幅の寸法を有する場合がある。チャネルまたはチャネル様構造は、約１０μｍから約４００μｍを含むそれ以下の高さおよび約５ｍｍから約２０００ｍｍを含むそれ以下の幅、約１０μｍから約３００μｍを含むそれ以下の高さおよび約１０μｍから約３００μｍを含むそれ以下の幅、約１０μｍから約２５０μｍを含むそれ以下の高さおよび約１０μｍから約２５０μｍを含むそれ以下の幅、約１０μｍから約１００μｍを含むそれ以下の高さおよび約１０μｍから約１００μｍを含むそれ以下の幅、または約１０μｍから約５０μｍを含むそれ以下の高さおよび約１０μｍから約５０μｍを含むそれ以下の幅の寸法を有してよい。そのようなフローチャンバーは、約５０：１から約３００：１または約５０：１から約２５０：１などの約４０：１から約４００：１の高さ幅比を有してよい。

【0132】

楕円形断面のチャネルなどのフローチャンバーが使用される場合、前述の高さおよび幅の寸法は、相当する容積を可能にするように相応に適合される必要がある。

【0133】

円形断面のチャネルなどのフローチャンバーが使用される場合、直径は、典型的には約５μｍから約５００μｍを含むそれ以下、約１０μｍから約４００μｍを含むそれ以下、約１０μｍから約３００μｍを含むそれ以下、約１０μｍから約２５０μｍを含むそれ以下、約１０μｍから約１００μｍを含むそれ以下、または約１０μｍから約５０μｍを含むそれ以下の範囲であってよい。

【0134】

さらに小さな寸法は、５０μｍなどの１００μｍ未満の高さ、幅または直径について具体的な優先性を有するフローチャンバーにとって一般に好ましく、その理由は、そのようなさらに小さな寸法について、血小板との単球の相互作用がさらに効率的および均一であり、フローチャンバーの表面および中心での流れ特性がさらに同等であることであると考えられる。

【0135】

チャネルチャネル様構造などのフローチャンバーの長さは、フローチャンバーが体外血液の容量の通過を可能にするように通常選択される。例えばフローチャンバーおよびデバイスは、約１ｍｌから約５０ｍｌの間、約１ｍｌから約４０ｍｌの間、または約１ｍｌから約３０ｍｌの間の全容量の通過を可能にするように構成されていてよい。

【0136】

図２６に示されるフローチャンバーは、特に好ましい。そのようなフローチャンバーは、約２０μｍの高さから約２０００μｍまでの高さ、約５ｍｍから約１００ｍｍの幅および約４０ｍｍの長さから約１００ｍｍの長さを有してよく、単球が付着し、それにより活性化されるために十分な表面を有することを確実にすることによって効率的な活性化を可能にする。さらにより好ましい実施形態は、約５０：１から約３００：１または約５０：１から約２５０：１などの約４０：１から約４００：１の高さ幅比を有するフローチャンバーに関する。

【0137】

前述の高さ幅比は、単球を活性化するために本明細書に記載の方法を実施する場合に特に好ましいパラメーターである場合がある。それらは、上に述べたとおり流速および剪断ストレスと組み合わされてよい。

【0138】

フローチャンバーは、表面積を増加させるためまたは流れの状態を不均一でないようにするために内部サブ構造を有してよい。

【0139】

フローチャンバーは、表面積を増加させるためまたは流れの状態を不均一でないようにするために粒子で満たされてよい。

【0140】

フローチャンバーの材料はプラスチックまたは非プラスチックであってよい。

【0141】

非プラスチック材料を考慮する場合、ガラスを使用してよい。

【0142】

チャンバーの表面は、共有結合的にまたは吸着を介してコートしてよい。

【0143】

補助チューブ、チャンバー、バルブなどのための材料は、血液構成成分との相互作用を低減するように選択してよい。

【0144】

補助チューブ、チャンバー、バルブなどの表面は、血液構成成分との相互作用を低減するように処置／コートしてよい。

【0145】

プラスチック材料を考慮する場合、アクリル、ポリカーボネート、ポリエーテルイミド、ポリスルホン、ポリフェニルスルホン、スチレン、ポリウレタン、ポリエチレン、テフロンまたは任意の他の適切な医療グレードプラスチックを使用してよい。本発明の好ましい実施形態ではフローチャンバーは、アクリルプラスチックから作られている。

【0146】

フローチャンバーは、単球含有画分などのフローチャンバー内の試料を可視またはＵＶ光、好ましくはＵＶ−Ａで照射できるようなある程度の透明度を提供する材料で作ることができる。実験によって示されるとおり、ＵＶ−Ａおよび８−ＭＯＰへの曝露は、ＧＩＬＺの発現の増加、ならびにそれによる単球の全体的な活性化および免疫抑制自己樹状細胞への分化を導く。したがってＵＶ−Ａなどの光および８−ＭＯＰなどのＤＮＡ架橋剤への曝露は、全体的に活性化された単球を産生する場合には、一般に回避されるべきである。

【0147】

典型的なフローチャンバーは、図１９Ａ）に示す形状を有してよい。流路は、２０ｍｍ×８０ｍｍの寸法を有する。チャンバーは、ポリスチレン、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＭＭＡ（ポリ（メチルメタクリレート））およびシリコンで作られている。血液試料は、例えば細胞１０^１０個／ｍｌの白血球細胞の濃度を有する試料例えば８ｍｌを得るためにＦｉｃｏｌｌ勾配を通して低速で遠心してよい。チャンバーは、血小板に富む血漿でプレコートしてよい。試料は約０．０２８Ｐａで数分間チャンバーを通してよい。次いでチャンバーは、ＲＰＭＩ約３ｍｌ、０．０２８Ｐａで洗浄されてよい。ＲＰＭＩ ３０〜５５ｍｌでの２回目の洗浄は、約１．２Ｐａで実施してよい。収集された活性化単球を次いで組み合わせ、さらなる分析のために使用する。

【0148】

全体的に活性化された単球が本発明による方法によって得られると、それらは具体的な目的のために一般にさらに処理されてよい。それらは、免疫賦活樹状細胞または免疫抑制樹状細胞に分化されてよい。免疫賦活樹状細胞は、例えば、それらの成熟を完了させるために標準的条件下でインキュベートされてよい。これらの免疫賦活樹状細胞の培養は、標準的条件下、例えば３７℃、５％ＣＯ_２、１５％ＡＢ血清（例えばＧｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手できる）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（例えばＧＩＢＣＯから入手できる）などのヒト細胞の培養のための標準的培地中で実施してよい。

【0149】

しかし、全体的に活性化された単球は、上に述べたとおり、例えばがんの処置などの治療的処置のためまたは創傷治癒のためにも使用されてよい。全体的に活性な単球はいくらかの貪食活性を有することが想定されることから、それらは例えば、治療的に活性な抗体での治療を受けているがん患者の処置のために使用されてよい。

【0150】

全体的に活性化された単球は、第１の態様およびその実施形態による方法を上に記載のとおり、いかなるアポトーシス剤も非存在下で、具体的には８−ＭＯＰ／ＵＶＡの非存在下で（例えばフローチャンバー、血小板および／または血漿構成成分などを使用することによって）実施することによって得ることができる。したがって第１の態様による方法は、単球がヒトまたは動物の身体の外にある限り、いかなるアポトーシス剤も非存在下で、具体的には８−ＭＯＰ／ＵＶＡの非存在下でヒトまたは動物の身体の外にある単球を活性化するために使用される。第１の態様のこの実施形態によって得られた全体的に活性化された単球は、化学療法、ガンマ照射療法などの放射線療法またはそれらの組合せを受けている患者におけるがんを処置するために具体的には好適である。化学療法は、治療的に活性な抗体での処置を含んでよいが、治療的に活性な抗体の非存在下でのドセタキセルおよびパクリタキセルを含むタキサン、アントラサイクリン、シクロホスファミド、ビンカアルカロイド、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロ−ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ナベルビンまたはゾレドロネートなどの細胞傷害性物質での処置も含んでよい。放射線療法は、Ｘ線療法およびガンマ照射療法などの光子療法；ならびに電子、プロトン、中性子、炭素イオン、アルファ粒子およびベータ粒子療法などの粒子療法を含んでよい。

【0151】

そのような患者では、例えば化学療法、ガンマ照射療法などの放射線療法またはそれらの組合せによって放出される場合がある腫瘍関連抗原がある。全体的に活性化された単球は、単球がヒトまたは動物の身体の外にある限りそれらが第１の態様による方法によって具体的にはアポトーシス剤の非存在下で得られることから、そのような患者に再導入される場合、そのような腫瘍関連抗原が取り込まれ、それにより抗腫瘍応答を始められる樹状細胞などの抗原を提示している抗原提示細胞に成熟すると想定された。しかし、単球がアポトーシス剤の非存在下、具体的には８−ＭＯＰ／ＵＶＡの非存在下でヒトまたは動物の身体の外で活性化されることから、８−ＭＯＰ／ＵＶＡの切断および／または寛容原性効果が低減されることが想定される。結果として免疫賦活抗原提示細胞は、寛容原性樹状細胞を超えて有利に形成されるはずであり腫瘍が免疫監視を免れる可能性を低減する。

【0152】

そのような全体的に活性化された単球は、化学療法および／または放射線療法を受けているならびにリンパ腺がんまたは、肺がん、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、脳がん、卵巣、筋肉、結合組織、腎臓がんもしくはメラノーマなどの皮膚がんを含む群から選択される固形腫瘍などの固形腫瘍のいずれかに罹患している患者におけるがんの処置のために使用されてよい。

【0153】

そのような全体的に活性化された単球は、がんに罹患しており、化学療法、放射線療法または治療的に活性な抗体での処置を含むその組合せを受けている患者においても当然のことながら使用されてよい。実際に、そのような全体的に活性化された単球は、ヒト身体において疾患関連抗原の放出を導く処置レジメンを受けている患者におけるがん以外の他の疾患の処置を可能にすることが想定される。

【0154】

本発明は、いくつかの具体的な実施例に関してここに記載されるが、それは例示的な目的であり、限定的なやり方で解釈されない。

【0155】

実験
実験１−単球活性化を誘導するための剪断ストレスおよび血小板活性化
材料および方法
白血球および血小板の調達
すべての試料は、アスピリンを含む血小板機能に影響を与えることが公知である薬物療法を受けていない若年の健康な対象から取得された。試料は、Ｙａｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄのガイドラインの下で得られ、インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って提供された。末梢血検体は、前腕前部の血管からヘパリンを含有するシリンジに１９−ゲージ針を通して収集され、次いでＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｇａｌｌａｒｄ−Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃａｒｌｅ Ｐｌａｃｅ、Ｎ．Ｙ．）に重層された。１８０ｇでの遠心分離後、単核白血球画分を含有する界面は収集され、ＨＢＳＳ中で２回洗浄され、次いで単核細胞５×１０^６個／ｍｌの最終濃度でＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に再懸濁された。細胞は取得の１時間以内に利用された。

【0156】

血小板に富む血漿の調製
全血は１５０ｇで１５分間、室温で遠心分離された。血小板に富む血漿（ＰＲＰ）層は収集され、９００ｇで５分間遠心分離され、血小板ペレットはＲＰＭＩ １６４０中、所望の濃度に再懸濁された。

【0157】

平行プレートの調製
平行プレートフローチャンバー様のもの２個がＥＣＰの流動力学をモデル化するために使用された。流れ後の細胞表現型の評価を含む実験がｌａｒｇｅｒ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して実施された。この系は、流量路容積測定２００００×１００００×２５４ミクロン（長さ×幅×高さ）からできていた。この系の下部プレートは、ガスケットによって分けられた１５ｍｍペトリ皿（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）からできており、上部プレートを形成するアクリルフローデッキに真空接続されていた。血小板でプレコートされたプレートを必要とする実験のために、フローチャンバーを組み立てる前に、所望の濃度のＰＲＰの２０滴がペトリ皿の中央に置かれ、血小板を２０分間、室温で定着させた。ペトリ皿はＲＰＭＩ ２ｍｌで２回洗浄され、次いでフローチャンバーが組み立てられた。

【0158】

流れ後の細胞の収集および表現型決定を含まない実験のために、Ｖｅｎａ８ ｂｉｏｃｈｉｐｓ（Ｃｅｌｌｉｘ Ｌｔｄ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）が層流を作るために使用された。Ｖｅｎａ８ ｂｉｏｃｈｉｐｓのチャネルについての流量路容積は２００００×４００×１００ミクロン（長さ×幅×高さ）と測定された。これらのチップのタンパク質コーティングは、下の適切なセクションに記載されている。

【0159】

平行プレートを使用する実験
平行プレートフローチャンバーは、対物レンズ１０×を有する位相差光学顕微鏡（ＣＫ４０、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）のステージにマウントされた。すべての実行は室温で実施された。均一な層流場はほとんど一定の容積流量を生成できるシリンジポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ、ＰＡ）の使用によってシミュレートされた。立体配置の構成成分は、管を最少にするように考案された。プレートを通して細胞懸濁物を注入する前に、系はＲＰＭＩ ５ｍｌ、およそ１ｄｙｎ／ｃｍ^２の壁剪断ストレスを生じる流速で洗浄された。次いで目的の細胞懸濁物は固定の流速および壁剪断ストレスでチャンバーを通された。

【0160】

すべての実験はリアルタイムで見られ、ＤＰ２００デジタルカメラおよびソフトウェア（ＤｅｌｔａＰｉｘ、Ｍａａｌｏｖ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して１秒あたり１５．２コマで記録され、Ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）を使用して分析された。

【0161】

一晩培養
一晩培養が必要であった場合、細胞は遠心分離され、１５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に最終濃度、細胞５×１０６個／ｍｌで再懸濁した。細胞を１２ウエルポリスチレン組織培養プレート（１ウエルあたり２ｍｌ）中、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間、一晩培養した。

【0162】

免疫表現型検査
免疫表現型検査のためのモノクローナル抗体は、ＣＤ１４（ＬＰＳ受容体、単球）、ＣＤ１１ｃ（インテグリンサブユニット、単球およびＤＣ）、ＨＬＡ−ＤＲ（クラスＩＩ ＭＨＣ分子）、ＣＤ８３（ＤＣマーカー）、ＣＤ６２ｐ（Ｐ−セレクチン、活性化血小板）およびＣＤ６１（インテグリンサブユニット、血小板）を含んでいた。抗体はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ８３）またはＳｉｇｍａ（ＣＤ６２ｐ、ＣＤ６１）から得られ、それらの予め決定された最適希釈で使用された。バックグラウンド染色は適切なアイソタイプ対照で確立され、免疫蛍光はＦＣ５００ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析された。２色膜染色は、ＦＩＴＣまたはＰＥに直接コンジュゲートされた両方の抗体を予め決定された最適濃度で加え、２０分間、４℃でインキュベートすることによって実施され、次に未結合抗体を除去するために洗浄された。膜および細胞質の組合せ染色は細胞固定および透過処理についての製造業者の説明書（Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ ｋｉｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に従って実施された。

【0163】

定量的リアルタイムＰＣＲ
遺伝子発現が平行プレートを通って流れる際に血小板の低（１０±５／低倍率視野［ｌｐｆ］）対高（１０２±３２／ｌｐｆ）レベルに曝露され、次に一晩培養された細胞間で比較された。細胞ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ ｃｏｌｕｍｎｓ ｗｉｔｈ ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ ＤＮａｓｅ Ｉ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離された。ＲＮＡ収量および純度はＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定された。ＲＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡに逆転写された。逆転写は、９６−ｗｅｌｌ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００）で次の条件で実行された：２５℃１０分間、３７℃１２０分間、８５℃５秒間。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲは、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ４０、ＡＤＡＭデシシン、Ｌｏｘ１、ＣＣＲ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＦＰＲＬ２およびＧＰＮＭＢの転写物を検出するために使用された。各配列に対するプライマーおよびプローブは、一覧のＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）として得られた。ＨＰＲＴ１は参照遺伝子として使用された。

【0164】

単球との血小板の共培養
追加的血小板を含む単球の共培養を含む実験は、いくつかの必要な改変を伴って一晩培養セクションにおいて記載のとおり実施された。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分離に続いて、単核細胞は、３０％ＡＢ血清／ＲＭＰＩに最終濃度細胞１０×１０６個／ｍｌで再懸濁され、その１ｍｌは１６ウエルプレートの各ウエルに配分された。血小板（ＲＰＭＩ中に懸濁、所望の最終濃度の２×）または血小板を含まないＲＰＭＩの追加的な１ｍｌを次いで各ウエルに加えた。血小板を活性化するために、トロンビン２単位を含有する５００μｌを半分のウエルに加え、ＲＰＭＩの５００μｌを、容量を揃えるために他に加えた。次いで細胞を既に記載のとおりインキュベートした。

【0165】

血小板接着研究
血小板接着実験は、上に記載のＶｅｎａ８フローチャンバーを使用して実施された。フィブリノーゲンおよびフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）はＰＢＳに最終濃度２００ｍｃｇ／ｍｌで溶解された。Ｖｅｎａ８ ｃｈｉｐｓのチャネルは、室温、加湿したチャンバー中で２時間、タンパク質溶液、自己血漿またはＰＢＳ単独と共にインキュベートされた。チャネルは、５×容量のＲＰＭＩで洗浄された。次いで血小板に富む血漿は一定に保たれた表示の剪断ストレスでタンパク質コートチャネルを通じて灌流された。各チャネルについてさらに画像が流路に沿って位置付けられた４個の予め定めた低倍率視野（視野は、注入の開始点から２５００、７５００、１２５００および１７５００ミクロンに中心を置いた）での実験で正確に９０秒間取得された。

【0166】

いくつかの実験は、チャネルを通じた注入の前にタンパク質断片での血小板に富む血漿の事前処置を含む。アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを含有する小さなＲＧＤペプチド、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含有するＤＲＧペプチドまたはアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌを含有するフィブリノーゲンの４００〜４１１断片は、２ｍＭの濃度にてＰＲＰで２０分間、室温でインキュベートされた。次いでＰＲＰは、既に記載のとおりチャネルを通じて灌流された。

【0167】

受容体リガンド研究
血小板コートＶｅｎａ８チャネルは、４０μｇ／ｍｌ抗Ｐ−セレクチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または４０μｇ／ｍｌアイソタイプ対照のいずれかで３０分間、室温で事前処置され、次いで５×容量のＲＰＭＩで洗浄された。単核細胞懸濁物はＲＧＤまたはＤＧＲペプチドのいずれかの濃度２．５ｍＭで事前処置された。４００コマ（２６．３秒間）継続するビデオ試料を、流れの開始点から７５００ミクロンに中心を置いた４００ミクロンにわたる視野の低倍率視野を使用して、流れの開始後６０秒間記録した。

【0168】

β−１インテグリンコンフォメーションは、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈフローチャンバーを使用して評価された。１５ｍｍ血小板コートペトリ皿（上に記載）は、４０μｇ／ｍｌ抗Ｐ−セレクチンまたはアイソタイプ対照で２０分間、室温で事前処置され、次いで５×容量のＲＰＭＩで洗浄された。血小板を通す灌流の直後に、細胞は、抗ＣＤ２９ ＨＵＴＳ−２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、β１インテグリンの活性（開いた）コンフォメーションに特異的に結合する抗体で免疫表現型検査された。

【0169】

結果
流れ中の単球は固定化された血小板と一過的に相互作用する
ＥＣＰは、紫外線Ａ（ＵＶＡ）活性化８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）、ＤＮＡ架橋薬への病原性白血球の体外化学療法的曝露を可能にする手段として最初は開発された。したがってＥＣＰは、１ｍｍ離された大きな透明のプラスチック平行プレートの間の白血球アフェレーシスされた血液の流れを含む。ＥＣＰの際に関連する流動力学の詳細な分析を可能にするために、ＵＶＡ／８−ＭＯＰ曝露とは無関係に、ＥＣＰの流れの条件は、０．８ｍｍ^２だけの表面積を有し、１００ミクロン離された縮小型平行プレートを使用して再産生された。このモデルは、デジタル顕微鏡を使用する視覚化を可能にした。モデルを使用する研究は、次の配列（ビデオ分析によって決定された）：流れからプレートへの血小板の最初の接着、続く固定化された血小板への通過単球の一過的結合を明らかにした。

【0170】

ＤＣ誘導は、単球血小板相互作用の数と相関する
上に記載の最初の定性的観察に基づいて、血小板は流れの条件下で単球からＤＣへの分化を誘導すると仮定された。単球からＤＣへの分化についての血小板の影響を検査するために、単球は低（１０±５／低倍率視野［ｌｐｆ］）、中（４４±２０／ｌｐｆ）および高（１０２±３２／ｌｐｆ）密度での自己血小板でプレコートされた平行プレートの間を通された。細胞は、後毛細血管細動脈での壁剪断ストレスと類似の、０．５ｄｙｎ／ｃｍ^２の壁剪断ストレスを生じる流速でプレートを通された。単位時間あたりの単球血小板相互作用の数は、血小板の密度（ビデオ分析によって決定された）の増大に比例して増加した。１秒あたりｌｐｆあたり平均５２．３±１５の単球血小板相互作用が高密度プレートで観察され、中および低密度プレートで相互作用１秒あたり１８．３±１４および３．４±１にそれぞれ下がった（図１ａ）。

【0171】

一晩インキュベーション後、ＤＣ表現型を発達させた細胞の百分率と、前日に観察された単球血小板物理的相互作用の頻度との間に相関が観察された（図１ｂ）。単球血小板相互作用の数の増加は、ＤＣ分化と一致するマーカー、膜ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８３を発現している細胞の割合の増加と相関していた。高密度血小板コートプレートに曝露された単球の平均１４．２％は一晩インキュベーション後にＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ８３＋であり、中および低レベルの血小板でコートされたプレートに曝露された単球のそれぞれ４．９％および０．８％と比較された。

【0172】

血小板への単球の曝露は遺伝子発現における変化を生じる
血小板曝露後に観察された単球表現型での記載した変化に捕捉して、ＲＴ−ＰＣＲが遺伝子発現での変化を評価するために実施された。単球は、前のセクションにおいて記載のとおり高または低密度の血小板でコートされた平行プレートを通された。一晩インキュベーション後、ＲＮＡは抽出され、ＲＴ−ＰＣＲがＤＣに関連する１０個の遺伝子についての発現レベルを決定するために実施された（図２）。ＣＤ４０、成熟ＤＣ上での公知の発現を有する同時刺激分子（Cella et al., 1996、参考文献表を参照されたい）は、高密度の血小板に曝露された単球では低レベルに曝露された単球と比較して５６７％を超えて上方制御されることが見出された。ＬＡＭＰ３、ＤＣ分化に特異的なマーカー（de Saint-Vis at al., 1998、参考文献表を参照されたい）は、３９８％まで上方制御された。ＣＤ８０は、ＡＰＣ活性化において上方制御されることが公知の同時刺激分子であり（Slavik et al., 1999、参考文献表を参照されたい）、高レベルの血小板に曝露された単球においては２２０％まで上方制御される。ＣＣＲ７、リンパ器官へのＤＣ遊走において役割を演じることが公知のケモカイン受容体は、３７６％まで上方制御された。ＬＯＸ１、ＣＤ８３、ＣＣＲ７およびＡＤＡＭデシシン、ＤＣに関連するすべての遺伝子も（Berger et al., 2010、参考文献表を参照されたい）、高レベルの血小板に曝露された単球で上方制御された。ＦＰＲＬ２、ＧＰＮＭＢおよびＣＤ８６は、高レベルの血小板に曝露された単球において、すべて下方制御された。ＦＰＲＬ２は、活性化された場合にＤＣ成熟を阻害することが公知の受容体である（Kang et al., 2005、参考文献表を参照されたい）ＧＰＮＭＢは、サイトカイン産生減少に関与するタンパク質である（Ripoll et al., 2007、参考文献表を参照されたい）、ＣＤ８６はＡＰＣによって発現される同時刺激分子である。

【0173】

血小板の存在下でのＤＣ誘導は静止条件下では生じない
血小板は、受容体リガンド相互作用を通じて直接、またはサイトカインおよび他の分泌メディエーターを介して単球に影響を与える可能性がある。単球からＤＣへの分化の血小板誘導が流動力学を必要とするどうかを決定するために、本発明者らは静止条件下で血小板の役割を検査した。単球は、低（＜５０，０００／ｍｍ^３）、中（１００〜２００，０００／ｍｍ^３）および高（＞４００，０００／ｍｍ^３）濃度の血小板と、血小板が不活性または活性状態（トロンビンの添加によって誘導された）のいずれかで共培養された。静止条件での一晩インキュベーション後（剪断ストレス＝０）、本発明者らは、活性化または不活性化血小板のいずれも流れの非存在下では単球のＤＣ分化を誘導できなかったことを見出した（図３を参照されたい）。

【0174】

流れに懸濁された血小板は、プレートに吸着された血清タンパク質に結合する
フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンを含む、血漿中に多量に存在するいくつかのタンパク質は、ガラスおよびプラスチック表面に吸着することが周知であり、したがって血小板接着および活性化への接着血漿タンパク質の寄与が評価された。平行プレートは、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、血漿または生理食塩水のいずれかでプレコートされた。次いで非活性化血小板は０．２から６．０ｄｙｎ／ｃｍ^２の範囲の壁剪断ストレスを生じる剪断速度で通された。最も高い濃度の血小板がフィブリノーゲンでコートされたプレートに接着した（図４）。フィブロネクチンコート、血漿コートおよび未コートプレートへの接着は同様に観察されたが、有意に低い程度であった（ｐ＜０．０５）。流れの非存在下では、血小板接着は、すべてのタンパク質基質について同等であった。

【0175】

フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンの両方は、アミノ酸配列アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）、ＲＧＤを含むセグメントを含有する。ＲＧＤセグメントは、多数のインテグリン受容体、特にインテグリンが活性コンフォメーションにある場合に曝露されるベータサブユニットのＩ／Ａドメインと相互作用することが周知である（Xiongら、2002、参考文献を参照されたい）。フィブリノーゲンコートプレートを使用する実験では、血小板接着はＲＧＤペプチドとの血小板の事前インキュベーションによって顕著に変えられなかった、しかし接着は、フィブリノーゲンのアミノ酸４００〜４１１に対応するペプチド断片、タンパク質のガンマ構成成分での血小板の事前インキュベーションによって有意に減少された（ｐ＜０．０５）（図５ａ）。フィブロネクチンコートプレートを使用する実験では、ＲＧＤペプチドと事前インキュベートした血小板は接着が有意に減少した、一方フィブリノーゲンのアミノ酸４００〜４１１に対応するペプチド断片と事前インキュベートした血小板は影響されなかった（図５ｂ）。興味深いことに、タンパク質のＲＧＤドメインと相互作用することが公知であるインテグリンのＩ／Ａドメインとは異なり、フィブリノーゲンのガンマ構成成分と相互作用することが見出されたインテグリンの領域が、インテグリンの不活性状態で曝露されることは注目されるべきである（Weiselら、1992、参考文献を参照されたい）。したがってこのデータは、流れの中の非活性化血小板はフィブリノーゲンコートプレートのガンマ構成成分に結合することを示唆している。非活性化状態の血小板についてフィブリノーゲンに結合する能力は、前段落で説明したフィブリノーゲンコートプレートにおいて見られるより高い血小板接着レベルを説明できる。

【0176】

血小板はプレートへの接着によって活性化される
血小板は、細胞内顆粒中に保存されている多量のタンパク質と共に不活性状態で生理的には循環している。内皮の損傷またはトロンビンなどの刺激との遭遇で、血小板は活性化され、ほとんど瞬間的にこれらの細胞内タンパク質を血漿膜に移行させる（Kaplan et al., 1979、参考文献を参照されたい）。プラスチックプレート／吸収されたタンパク質への血小板接着は、周知の刺激によって生じるものに類似の血小板活性化を生じることが推論された。この仮説を検査するために、血小板活性化の周知のマーカー、Ｐ−セレクチンの表面発現が、接着の前後で評価された。接着の前に血小板の６±３％は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）１２．４±６．９でＰ−セレクチンを発現していることが見出され、接着後に、Ｐ−セレクチン陽性は６４±１３％（ＭＦＩ ９８．２±１４）に増加した。陽性対照、トロンビンで活性化した血小板は、７１±１８％Ｐ−セレクチン陽性（ＭＦＩ １０８．３±２３）であった。Ｐ−セレクチンの発現は、血小板接着後３０、６０および９０分でさらに評価され、Ｐ−セレクチン発現は、接着後９０分で７２±１１％の血小板がＰ−セレクチン陽性で、すべての時点で安定のままであり、血小板が手順の間に活性状態のままであることを示していた。同様の傾向がαＩＩｂ−β３、フィブリノーゲン結合インテグリンの評価において、このタンパク質の表面発現の接着前４±３％から接着後４９±１８％への増加を伴って見出された。

【0177】

単球は、活性化血小板で発現されたＰ−セレクチンおよびＲＧＤ含有リガンドと相互作用する
ビデオで観察された単球血小板相互作用は、２つの種類に分割される：（１）短期作用型、３秒間（４６コマ）未満について生じる接触として任意に定義される、および（２）長期作用型、安定結合を含んで３秒間より長い接触として定義される。ＥＣＰ系における血小板は活性状態にあり、活性化血小板はＰ−セレクチンおよびＲＧＤ含有タンパク質（例えばフィブロネクチン、フィブリノーゲンおよびビトロネクチン）を含む多量のタンパク質を発現することが既に判定されていることから、存在する場合、これらのタンパク質の関与が短期間のまたは長期間のいずれの相互作用にあるかを決定することが試みられた。プレートは、血小板でプレコートされ、４種の条件が検査された：（１）無関係なアイソタイプ対照で事前処置された血小板、および単球未処置（Ｐ＋ＲＧＤ＋）、（２）無関係なアイソタイプ対照で事前処置された血小板、およびＲＧＤペプチドで事前インキュベートされた単球（Ｐ＋ＲＧＤ−）、（３）抗Ｐ−セレクチンで事前処置された血小板、および未処置単球（Ｐ−ＲＧＤ＋）、（４）抗Ｐ−セレクチンで事前処置された血小板、およびＲＧＤペプチドで事前処置された単球（Ｐ−ＲＧＤ−）。ＲＧＤペプチドで単球を事前処置することは、血小板によって発現されるＲＧＤ含有タンパク質と相互作用できる遊離ＲＧＤ認識受容体の数の減少を生じるはずであることが想定された。したがって検査した４種の条件は、２個の血小板リガンド、Ｐ−セレクチンおよびＲＧＤ含有タンパク質との潜在的相互作用のすべての順列を表している。図６に示すとおり、ＲＧＤおよびＰ−セレクチンがどちらもブロッキングされなかった場合（Ｐ＋ＲＧＤ＋）に、短期作用型および長期作用型相互作用の両方が最大になった、他のすべての条件における相互作用のレベルは、この最大値の百分率として表された。抗Ｐ−セレクチン単独でのブロッキング（Ｐ−ＲＧＤ＋）は、短期および長期の両方の単球血小板相互作用におけるほぼゼロ（ｐ＜０．０１、図６、ビデオ分析によっても確認された）への減少を生じた。対照的にＲＧＤ単独（Ｐ＋ＲＧＤ−）のブロッキングは、短期間相互作用の数を有意に変えなかったが、長期間単球血小板相互作用を４４％（ｐ＜０．０５、図６）まで減少させた。Ｐ−セレクチンおよびＲＧＤの両方の同時のブロッキング（Ｐ−ＲＧＤ−）は、長期および短期相互作用の両方がほぼゼロに低減して、Ｐ−セレクチンだけがブロッキングされた場合に見られるものと類似のパターンを生じた。４種の条件それぞれにおいて観察された相互作用のパターンに基づいて最適な結論は、次のとおりである：（１）Ｐ−セレクチンは、主に短期間相互作用に関与する、（２）血小板によって発現されるＲＧＤ含有タンパク質は長期間相互作用に関与するが、短期間相互作用にはしない、（３）Ｐ−セレクチンとの単球相互作用は血小板によって発現されるＲＧＤ含有タンパク質との単球相互作用の上流で生じなければならない。この最終結論は、Ｐ−ＲＧＤ＋の条件が短期間および長期間相互作用の両方をほとんどゼロに減少させ、一方Ｐ＋ＲＧＤ−条件が長期相互作用だけを減少させた観察に基づいている。相互作用が逐次的でなかった場合、Ｐ−ＲＧＤ＋の条件は、長期相互作用に関してＰ＋ＲＧＤ＋と同様の結果をもたらすはずである。さらに相互作用の順序、すなわちＰ−セレクチンがＲＧＤ相互作用の上流で作用することは、Ｐ＋ＲＧＤ−の条件だけが長期相互作用に影響を与え、一方Ｐ−ＲＧＤ＋の条件がＰ−ＲＧＤ−のものと同様の結果をもたらすという発見から明らかである。

【0178】

Ｐ−セレクチンへの単球曝露は下流単球インテグリン活性化を生じる
インテグリン受容体は、それらの開いたコンフォメーションで、ＲＧＤ含有リガンドと相互作用することが公知である（Ruoslathi et al., 1996、参考文献を参照されたい）。β１インテグリンがその開いたコンフォメーションにある場合だけ曝露されるエピトープを認識する抗体を使用して、本発明者らはモデルを通って流れる前後での単球インテグリンのコンフォメーションを評価した。図７は、短期作用型単球血小板相互作用の数が増加すると流れの直後に、開いたコンフォメーションでインテグリンを発現している単球の百分率における対応する増加があったことを示している。黒線は、少数（＜５．１＋２／ｌｐｆ×秒）の血小板相互作用を受けた単球の９％と比較して、多数（＞６１±１９／ｌｐｆ×秒）の血小板相互作用を受けた単球の平均７１％がβ１を活性形態で発現したことを示している。これらの結果は、無関係なアイソタイプ対照で接着血小板を事前処置することによって顕著な影響を受けなかった（灰色線）。対照的に抗Ｐ−セレクチンで事前処置した血小板は、単球血小板相互作用をほとんどゼロに低減し、これらの条件で流れから現れた単球（破線）は、それらが曝露された血小板の密度とは無関係に低レベルの活性β１インテグリンを示した。すべての細胞集団がプレートの通過前には同様の低レベルのベースラインインテグリン活性化（＜１０％）を実証したことは注目に値し、したがって、短期間単球血小板相互作用において見られる差異は、流れの前のインテグリンコンフォメーションにおける差異の結果ではなかった。

【0179】

Ｐ−セレクチンへの単球曝露はＤＣ分化のために必要である
単球血小板相互作用の血小板Ｐ−セレクチンへの依存を仮定して、本発明者らは、時間０でのＰ−セレクチンへの単球の曝露と、一晩インキュベーション、１８時間後に単球によって後から現れる表現型との間に関連があるかどうかを判定することを計画した（図８）。単球は、未処置（非ブロッキング）、または抗Ｐ−セレクチンもしくはアイソタイプ対照のいずれかで事前処置のいずれかの高密度の血小板（１０８±３６／ｌｐｆ）でコートされた平行プレートを通された。非ブロッキング血小板に曝露された単球の１５．５±４％は一晩インキュベーション後に膜ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ８３＋（成熟ＤＣのマーカー）になり、無関係なアイソタイプ対照でブロッキングされた血小板に曝露されたものは１３±４％であった。対照的に抗Ｐ−セレクチンでブロッキングされた血小板に曝露された単球の３±２％だけが一晩インキュベーション後にＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ８３＋になった。

【0180】

実験２−免疫抑制樹状細胞に対する分子マーカーの同定
材料および方法
試料収集および単球濃縮
末梢血検体は、健康な対象からＹａｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄのガイドラインの下で取得され、インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って提供された。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（Ｉｓｏｌｙｍｐｈ、ＣＴＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で遠心分離によって単離された。単球は、新鮮に単離されたＰＢＭＣから：１）デキサメタゾン用量漸増実験のためにプラスチック接着（純度：７１．６±５．６％ＣＤ１４^＋）、２）ＰＵＶＡ用量漸増実験のためにＣＤ１４磁気ビーズ正の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）（純度：８８．１±３．５％ＣＤ１４^＋）、および３）ＬＰＳ刺激実験のためにＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）（純度：８３．８±３．８％ＣＤ１４^＋）によって濃縮された。

【0181】

単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ）の生成
単球は、細胞５×１０^６個／ｍＬの密度、６および１２ウエルポリスチレン組織培養プレート、３７℃、５％ＣＯ_２で、熱不活性化１５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）（ここで完全培地と呼ばれている）中で培養された。８００ＩＵ／ｍＬ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０００ＩＵ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、記載の単球からＤＣへの分化を誘導するために３６時間培養物に添加された。

【0182】

８−ＭＯＰおよびＵＶＡ光処置
培養物は、８−ＭＯＰ（Ｕｖａｄｅｘ、２０μｇ／ｍＬ）と共に３０分間、暗所でインキュベートされ、次いで連続した直管蛍光灯１２本を有する卓上ＵＶＡライトボックスで照射された。管は、３２０から４００ｎｍの範囲のＵＶＡ光を発光した。ＵＶＡ照射量（出力、Ｗ／ｍ^２）は光ダイオードを使用して測定された。測定された照射量および系の種々の構成成分の吸収特性を考えると、所与の線量のＵＶＡ照射（Ｊ／ｃｍ^２）を細胞に送るために曝露する必要がある時間（秒）を決定できた。

【0183】

ＭｏＤＣ／リンパ球共培養
プラスチック接着の間に除去された非接着細胞（純度：６６．０±４．５％ＣＤ３^＋）は、現在一般にリンパ球と呼ばれている。リンパ球は、８−ＭＯＰ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＵＶＡ（１Ｊ／ｃｍ^２）で処置され、ＰＢＳで洗浄され、完全培地３７℃、５％ＣＯ_２中で、ＰＵＶＡ処置または未処置ＭｏＤＣのいずれかとリンパ球を５または１０対ＭｏＤＣを１の比で共培養された。１００ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）で２４時間処置されたＭｏＤＣは、陽性対照群となった。２４時間後、細胞は採取され、ＭｏＤＣは再精製された。ＲＮＡがリンパ球からは相当量では単離されなかったことを確実にするために、ＣＤ１１ｃ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）正の選択を使用してすべての培養物からＭｏＤＣを再精製することは重要であった（純度：９６．４±１．０％ＣＤ１１ｃ^＋）。ＣＤ１１ｃ^＋ ＭｏＤＣは、細胞０．５〜１．０×１０^６個／ｍＬで完全培地に再び蒔かれ、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）で刺激された。ＬＰＳ刺激２４時間後、細胞はＲＮＡ単離および免疫表現型検査のために採取され、上清は、サイトカイン定量のために収集された。陰性対照として、並行群はＬＰＳを受けなかった。

【0184】

ｓｉＲＮＡ実験
Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔ ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ＧＩＬＺ ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、オフ標的予測アルゴリズムと共にＧＩＬＺ発現をノックダウンするために使用された。Ｍｏ−ＤＣはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して形質移入された。ＲＮＡ_ｉ二重鎖およびリポフェクタミン試薬は、一緒に２０分間インキュベートされ、次いでＭｏＤＣ培養物に加えられ、２時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートされた。形質移入ＭｏＤＣは、ＭｏＤＣ／リンパ球共培養物についての記載と同一の様式で処置された。ＭｏＤＣもスクランブルｓｉＲＮＡで形質移入された。

【0185】

免疫表現型検査
モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ３、ＣＤ８６、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃおよびＧＩＬＺを含んだ。抗体は、Ｂｅｃｋｍａｎ−ＣｏｕｌｔｅｒおよびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得られ、それらの予め決定された最適希釈で使用された。アポトーシスは、アポトーシス性細胞の表面上のホスファチジルセリン（ＰＳ）を認識するアネキシン−Ｖと共にＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して評価された。７−ＡＡＤが細胞生存率色素としてＰＩの代わりとなった。アネキシン−Ｖ^＋／７−ＡＡＤ⁻表現型を提示する細胞は初期アポトーシス性細胞として分類され、およびアネキシン−Ｖ^＋／７−ＡＡＤ^＋表現型を提示している細胞は後期アポトーシス性細胞として分類された。二重膜および細胞質内染色は、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ ｆｉｘ ａｎｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して実施された。バックグラウンド染色は、適切なアイソタイプおよび蛍光から１つの対照を引いて確立された。免疫蛍光は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ Ｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、２％パラホルムアルデヒドでの固定の２時間以内に分析された。最低１０，０００事象が各群について収集された。

【0186】

定量的リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡは、ＱＩＡＳｈｒｅｄｄｅｒ ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）およびＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ Ｄｎａｓｅ Ｉ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）と共に使用してＣＤ１１ｃ^＋ ＭｏＤＣから単離された。ＲＮＡ収量および純度はＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計を使用して評価された。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、９６−ｗｅｌｌ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００）で得られた。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲは、ＧＩＬＺ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の転写物を検出するために使用された。プライマーおよびプローブは、予め設計され、検証されたＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）として得られた。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファおよびＴＧＦ−βの転写物を検出するために使用された。プライマーは、プライマー３Ｐｌｕｓを使用してイントロン連結に広がるように設計された。プライマー融解曲線は単一の産生物を確認するために得られた。ＨＰＲＴ−１およびＧＡＰＤＨは、参照遺伝子として使用された。試料は７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で３連で実行された。三角三角Ｃ（ｔ）法が倍数変化を算出するために使用された。

【0187】

サイトカイン定量
培養上清は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、およびＭＩＰ−１βへの磁気ビーズ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を利用する多重フォーマットで分析された。ｓｉＲＮＡ実験のために上清は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットでＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＬ−１２ｐ７０（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）について分析された。すべての試料および標準物質は２連で実行され、ＬＵＭＩＮＥＸ ２００（ＬＵＭＩＮＥＸ）またはＢｉｏＴｅｋ ＥＬ８００（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して分析された。

【0188】

統計解析
スチューデントのｔ検定が、ｐ値＜０．０５を統計的に有意として群間の統計的比較のために使用された。差次的遺伝子発現は、≧２．５倍変化およびｐ値＜０．０５で統計的に有意と見なされた。

【0189】

結果
ＧＩＬＺの発現は、単球が未成熟ＭｏＤＣに分化する際に急速に下方制御される
新鮮に単離されたＣＤ１４^＋単球はＧＩＬＺを発現するが、それらが未成熟ＭｏＤＣに分化すると、９９％を超えてＧＩＬＺを急速に下方制御する（図１０Ａ）。ＧＩＬＺ ｍＲＮＡにおける低減は、ＧＩＬＺタンパク質レベルにおける６１％減少によって確認された（図１０Ｂ）。ＧＩＬＺ下方制御は、ＣＤ１４の発現の低減（単球特異的マーカー、Ｚｈｏｕら、参考文献を参照されたい）、および細胞質性ＣＤ８３の発現の増加と関連する（未成熟ＭｏＤＣマーカー、Ｋｌｅｉｎら、参考文献を参照されたい）。重要なことに、ＭｏＤＣは未成熟のままであり、低い膜ＣＤ８３（成熟ＤＣマーカー、Ｒｅｎｚｏら、参考文献を参照されたい、ｐ＝０．１６）を発現している。ＭｏＤＣは、デキサメタゾン（ｄｅｘ）での処置後に用量依存的なやり方でＧＩＬＺを上方制御する（図１０Ｃ）。２４時間の１００ｎＭ ｄｅｘでの処置がＭｏＤＣにおいてＧＩＬＺ発現を誘導することの陽性対照として選択された（Ｄｅｘ−ＤＣ）（図１０Ｄ）。

【0190】

８−ＭＯＰまたはＵＶＡ処置単独は、ＧＩＬＺ発現に影響を与えなかった（図１０Ｅ）。しかしＭｏＤＣが８−ＭＯＰおよびＵＶＡ光の組合せで処置された場合（ＰＵＶＡ−ＤＣ）、ＧＩＬＺ発現は５．５倍増加した。ＧＩＬＺの誘導は、処置２４時間後にピークに達し、７２時間顕著に上昇したままになる遅い経時変化を示した（図１０Ｆ）。比較してＤｅｘ−ＤＣは、処置わずか２時間後にＧＩＬＺを上方制御した。

【0191】

８−ＭＯＰおよびＵＶＡ光の組合せで処置された未成熟ＭｏＤＣはＧＩＬＺを上方制御し、免疫寛容原性、免疫抑制性の表現型をとる
ＧＩＬＺ発現にＰＵＶＡ用量依存的効果があるかどうかが次に試験された。１Ｊ／ｃｍ^２ ＵＶＡおよび１００または２００ｎｇ／ｍＬ ８−ＭＯＰで処置されたＭｏＤＣは、ＧＩＬＺを２．９および４．４倍それぞれ上方制御した（図１１Ａ）。類似の用量依存的現象は、８−ＭＯＰの濃度５０ｎｇ／ｍＬで開始した２Ｊ／ｃｍ^２で観察された。０．５Ｊ／ｃｍ^２での処置は、８−ＭＯＰ濃度が２００ｎｇ／ｍＬに達するまでＧＩＬＺ発現に効果を有さず、４Ｊ／ｃｍ^２での処置は高レベルの非特異的細胞死を生じた（データ未記載）。塩基対１０^６個あたりで形成された光付加体の数は、８−ＭＯＰ濃度とＵＶＡ投与量との積に直接関連する、Ｇａｓｐａｒｒｏら、参考文献を参照されたい。８−ＭＯＰとＵＶＡとの積が１００に達すると、ＧＩＬＺは３倍上方制御され、積が２００および４００に増加すると、ＧＩＬＺはそれぞれ４．８および８．６倍に上方制御された（図１１Ｂ）。

【0192】

初期アポトーシス性ＣＤ１１ｃ^＋細胞の百分率は、検査した８−ＭＯＰのすべての用量についての１Ｊ／ｃｍ^２と比較して２Ｊ／ｃｍ^２で少なくとも高かった（ｐ＞０．０５）（図１１Ｃ）。２Ｊ／ｃｍ^２および２００ｎｇ／ｍＬでは、初期アポトーシス性ＣＤ１１ｃ^＋細胞の百分率において未処置ＭｏＤＣと比較して増加があった（図１１Ｃ）。後期アポトーシス性ＣＤ１１ｃ^＋細胞の百分率は、検査した８−ＭＯＰのすべての用量について１Ｊ／ｃｍ^２で１３％未満、および２Ｊ／ｃｍ^２で１６％未満でのままであった（図１１Ｄ）。さらに、ドットプロットは、ＰＵＶＡの増量に伴うＭｏＤＣのプロアポトーシス性効果への相対的抵抗性を強調している（図１１Ｅ）。培養物から回収された細胞の数は、１または２Ｊ／ｃｍ^２で処置されたいずれの群においても統計的に異ならず（データ未記載）、９０％を超えるＣＤ１１ｃ^＋細胞（９１．０〜９７．５％の範囲）が処置後に採取された。

【0193】

対照的にリンパ球は、１Ｊ／ｃｍ^２および１００ｎｇ／ｍＬでの処置後わずか２時間でアネキシン−Ｖを示す（データ未記載）。１００ｎｇ／ｍＬおよび１Ｊ／ｃｍ^２で処置したＭｏＤＣ（図１１Ｆ）とは対照的に、同じ用量のＰＵＶＡで処置した２４時間後に、初期アポトーシス性リンパ球の百分率は未処置ＭｏＤＣでの６．６％からＰＵＶＡ−ＤＣでの４４．３％に増加し、後期アポトーシス性リンパ球の百分率は４．５％から３３．７％に増加した（図１１Ｇ）。リンパ球の６４．３±３．２％が処置２４時間後にアネキシン−Ｖ^＋であったと考えて、ＰＵＶＡ処置リンパ球は、次にアポトーシス性リンパ球と呼ばれる（ＡｐｏＬ）。

【0194】

ＧＩＬＺのＰＵＶＡ用量依存的誘導は、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３の細胞表面発現における減少と関連した（図１２Ａ、３Ｂ）。これらのマーカーの下方制御はＧＩＬＺの誘導と平行し（図１１Ｂを参照されたい）、１および２Ｊ／ｃｍ^２の両方について１００ｎｇ／ｍＬの８−ＭＯＰ濃度で始まる。８−ＭＯＰとＵＶＡとの積が１００を超えると、ＣＤ８３、ＣＤ８０およびＣＤ８６発現はそれぞれ３１％、３０％および５４％まで低減され、ＨＬＡ−ＤＲ発現は３８％まで増加した。

【0195】

アポトーシス性リンパ球に曝露されたＭｏＤＣは、ＧＩＬＺを上方制御し、ＬＰＳ誘導完全成熟に抵抗性である
ＰＵＶＡおよびアポトーシス性細胞への曝露の個々の寄与を精査するために、ＭｏＤＣは最初にＡｐｏＬと比を変化させて共培養された。ＧＩＬＺは、ＡｐｏＬに用量依存的様式で上方制御された（図１３Ａ）。ＰＵＶＡ−ＤＣがＡｐｏＬに曝露された場合、ＧＩＬＺは、単独で培養されたＰＵＶＡ−ＤＣにおいてよりも高いレベルで発現された（図１３Ｂ）。ＡｐｏＬに曝露されたＰＵＶＡ−ＤＣもＡｐｏＬに曝露された未処置ＭｏＤＣにおいてよりもＧＩＬＺを高いレベルで発現した（それぞれ６．７倍および３．６倍高い）。ＧＩＬＺ ｍＲＮＡが上方制御されたすべての群においてＧＩＬＺタンパク質レベルにおける対応する１．５倍増加があった（図１３Ｃ）。ＧＩＬＺの上方制御を実証したすべての群において＜１２％の初期アポトーシス性（３．８〜１１．４％範囲）および後期アポトーシス性（６．３〜１１．５％範囲）ＣＤ１１ｃ^＋細胞があったことから、ＧＩＬＺの誘導は初期または後期アポトーシス性ＣＤ１１ｃ^＋細胞の数における増加と関連しなかった。

【0196】

未処置ＭｏＤＣよりも２．５倍を超えるＧＩＬＺを発現しているＭｏＤＣは、ＬＰＳによる完全成熟に抵抗性であり、半成熟、免疫寛容原性表現型を表した。ＬＰＳ刺激は、ＧＩＬＺを上方制御しているＭｏＤＣにおいてＣＤ８０発現を、未処置ＭｏＤＣにおけるＬＰＳ刺激後に見られるレベルの５０％だけ増加させ（図１３Ｄ、０．４８〜０．５７％範囲）、ＣＤ８６発現を未処置ＭｏＤＣの４５％だけ増加させた（図１３Ｄ、０．４２〜０．４７％範囲）。同様の結果がＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８３から得られた（図１４Ｅ、ＬＰＳ後にそれぞれ未処置ＭｏＤＣの４７〜６５％および２３〜５７％範囲）。さらに、ＧＩＬＺを上方制御しているＭｏＤＣは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価されたとおり未処置ＭｏＤＣのＣＤ８０ ｍＲＮＡの６％（４．５〜７．５％範囲）を発現し、未処置ＭｏＤＣのＣＤ８６ ｍＲＮＡの５０％を発現した（１２．４〜８５．１％範囲）。

【0197】

ＧＩＬＺを発現しているＭｏＤＣは、免疫寛容原性サイトカインプロファイルを示し、ＧＩＬＺのノックダウンはＩＬ−１０対ＩＬ−１２ｐ７０比を低減する
上清は、図１３Ｂに記載のとおり共培養から採取された。Ｄｅｘ−ＤＣは、ＧＩＬＺを４．２９倍に上方制御し（図１３Ｂを参照されたい）、ＩＬ−１０の産生を増加させ（図１４Ａ）、検査したすべての炎症促進性サイトカイン（図１４Ｂ、１４Ｃ）およびケモカイン（図１４Ｄ、１４Ｅ）の産生を減少させた。比較して、ＰＵＶＡ−ＤＣは、ＧＩＬＺを２．７８倍に上方制御し（図１３Ｂを参照されたい）、ＩＬ−１０の産生を増加させ、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを除く検査したすべての炎症促進性サイトカインおよびケモカインの産生を減少させた。ＡｐｏＬに曝露されたＰＵＶＡ−ＤＣまたは未処置ＭｏＤＣは、ＧＩＬＺを単独で培養されたＰＵＶＡ−ＤＣよりも高レベルで発現した（それぞれ３．６および６．７倍高い、図１３Ｂを参照されたい）。これら２群はＩＬ−１０の産生が増加し、検査したすべての炎症促進性サイトカインおよびケモカインの産生が減少した。サイトカインレベルは、ＧＩＬＺを上方制御するＭｏＤＣが未処置ＭｏＤＣよりも８倍のＩＬ−１０ ｍＲＮＡの上方制御を実証して（５．５〜１１．８範囲、ｐ＜０．０１）、ＲＮＡレベルで確認された。ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６における低減もＲＮＡレベルで確認された（データ未記載）。ＴＧＦ−βは、ＧＩＬＺを上方制御しているＭｏＤＣにおいて２．５倍上方制御された（データ未記載）。ＴＧＦ−βは、多重分析に含まれず、したがってｍＲＮＡレベルで分析されただけであった。

【0198】

免疫寛容原性ＤＣがＩＬ−１０対ＩＬ−１２ｐ７０比の増加によって特徴付けられることから、ＩＬ−１０対ＩＬ−１２ｐ７０比は、免疫寛容原性の有用な指標である、Ｓｔｅｉｎｍａｎら、参考文献を参照されたい）。ＩＬ−１０対ＩＬ−１２ｐ７０の比は、未処置ＭｏＤＣでの６．７からＤｅｘ−ＤＣにおける６７．７に増加した。同様にＩＬ−１０対ＩＬ−１２ｐ７０比は、ＰＵＶＡ−ＤＣにおいて３８．７に、未処置ＭｏＤＣおよびＡｐｏＬに曝露されたＰＵＶＡ−ＤＣにおいてそれぞれ８９．４および１１４．９に増加した（ｐ＜０．０５）。

【0199】

ＧＩＬＺの誘導が免疫寛容原性サイトカインプロファイルを媒介するかどうかを評価するために、ＭｏＤＣは、ＧＩＬＺ発現をノックダウンするためにｓｉＲＮＡで形質移入された。ＧＩＬＺ ｓｉＲＮＡでの形質移入はＭｏ−ＤＣにおいてＧＩＬＺ発現を６８％まで低減した（図１５Ａ、５９〜７９％範囲）。スクランブルｓｉＲＮＡでの形質移入は、ＧＩＬＺ発現を顕著に変化させなかった。非形質移入群と比較して、ｓｉＲＮＡで形質移入した任意の群から回収された細胞の数においても顕著な差異はなかった（データ未記載）。

【0200】

未処置ＭｏＤＣよりもＧＩＬＺを２．５倍高く上方制御している処置ＭｏＤＣは、より高いレベルのＩＬ−１０を産生し（図１５Ｂ）、ＧＩＬＺのノックダウンは３９％まで（３４〜４８％範囲、ｐ＜０．０５）ＩＬ−１０産生を低減した。未処置ＭｏＤＣよりもＧＩＬＺを２．５倍高く上方制御している処置ＭｏＤＣは、少量のＩＬ−１２ｐ７０も産生し（図１５Ｃ）、ＧＩＬＺのノックダウンはＩＬ−１２ｐ７０産生を１８８％まで（１４９〜２１４％範囲、ｐ＜０．０５）増加させた。スクランブルｓｉＲＮＡでの処置は、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２ｐ７０の産生に感知できる効果を有さなかった。ＧＩＬＺのノックダウンは、ＧＩＬＺ誘導後に上昇していたＩＬ−１０対ＩＬ−１２ｐ７０比を低減させた。ＧＩＬＺ ｓｉＲＮＡで処置したＤｅｘ−ＤＣは、ＩＬ−１０対ＩＬ−１２ｐ７０比における、非形質移入ＭｏＤＣでの１５．３から形質移入Ｄｅｘ−ＤＣでの３．９への低減を実証した。ＰＵＶＡ−ＤＣでは、比は非形質移入ＭｏＤＣでの８．４からＰＵＶＡ−ＤＣでの２．９に減少し、未処置ＭｏＤＣおよびＡｐｏＬに曝露されたＰＵＶＡ−ＤＣでは、それぞれ１８．１から７．８および２８．４から８．３の比の低減が観察された。

【0201】

これらの結果は、他の免疫抑制メディエーターと同様に、ＰＵＶＡがＧＩＬＺの発現を誘導し、同時刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびに成熟マーカーＣＤ８３の低い発現によって特徴付けられる免疫寛容原性免疫抑制樹状細胞を生成することを実証している。ＧＩＬＺ誘導は、ＩＬ−１０産生の増加、ＩＬ−１２ｐ７０を含む炎症促進性サイトカインおよびケモカイン産生の減少によって特徴付けられる免疫寛容原性サイトカインプロファイルへの分極のために必要である。これらの結果は、さらにＧＩＬＺをアポトーシス性細胞の免疫抑制効果を媒介する分子スイッチとして関連付ける。

【0202】

実験３−免疫賦活樹状細胞に対するさらなる分子マーカーの同定
材料および方法
患者試料
ＥＣＰを受けている患者由来の白血球は、ＵＶＡＲ ＸＴＳ Ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒａｋｏｓ）を使用して、Ｙａｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄのガイドラインの下で得られ、インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って提供された。アリコートは、３つの時点で調達された：処置前（ＥＣＰ前）、８−ＭＯＰ／紫外線Ａ（ＵＶＡ）曝露直後（ＥＣＰ ０日目）または処置された血液単核白血球の１−Ｌ血小板保存バッグ（ＰＬ−２４１０、Ｂａｘｔｅｒ）での１８時間インキュベーション後（ＥＣＰ １日目）。

【0203】

正常対象
ＥＣＰが健康な対象由来の単球のＤＣへの変換を誘導するかどうかを決定するために、正常対象由来の単核白血球は２つの方法で試験された。正常対象由来の白血球アフェレーシスされた白血球（Ｎ＝３）は、処置前（ＥＣＰ前）、ＥＣＰ直後（ＥＣＰ ０日目）、およびＥＣＰ後１８時間（ＥＣＰ １日目）に研究された。ＵＶＡ光源およびプラスチック曝露プレートを組み入れている卓上装置は、臨床ＥＣＰ系の実験室での再現および平行するＲＮＡ単離、免疫表現型検査および機能研究への試料利用を可能にした。代替的に正常対象由来の血液単位は、輸送用バッグに入れられ、処置患者のもの（Ｎ＝３）と同一の様式でＥＣＰ処置装置を通された。正常血液の単位から得られた細胞は、マイクロアレイおよび抗原提示アッセイのために使用された。

【0204】

ソラレン添加
ＥＣＰの際に日常的に行われるとおり、標準８−ＭＯＰ濃度溶液（Ｔｈｅｒａｋｏｓ）は、臨床ＥＣＰ装置、および実験室モデル系に直接加えられた。導入のモードは、臨床手順および実験の間にわたって正確な１００〜２００ｎｇ／ｍＬの濃度を可能にした。

【0205】

一晩培養
ＥＣＰでは、処置された単球が患者にただちに再注入されることから、処置された単球の表現型的機能的変化を試験することは不可能である。したがってＥＣＰ後に細胞は、誘導された単球の遺伝子活性化、成熟および機能を研究するために１８時間培養された（ＲＰＭＩ １６４０／１５％自己血清）。ＥＣＰの前（ＥＣＰ前）および直後に（ＥＣＰ ０日目）、患者および正常対象の試料は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上での遠心分離によって単離された。細胞は、７．５％ＡＢ血清、７．５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁され、６ウエルポリスチレン組織培養プレート中、細胞５＊１０^６個／ｍＬの密度で（患者について）、およびＢａｘｔｅｒ血小板保存バッグ（正常対象について３７℃、５％ＣＯ_２）中で培養された。一晩培養後（ＥＣＰ １日目）、細胞は単球濃縮を受ける前に採取された。比較表現型分析用のＤＣを生成するために、細胞はＲＰＭＩ １６４０ １５％血清中、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ４（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１ｍＬの存在下で６日間培養された。

【0206】

単球集団の磁気ビーズ濃縮
ＥＣＰが単球を樹状細胞成熟経路に方向付ける遺伝子を活性化するかどうかの決定を可能にするために、単球の物理的または細胞膜摂動を最少化しながらトランスクリプトーム分析へのリンパ球の寄与を除外する、陰性単球の穏やかな濃縮方法を開発する必要があった。単球は、親和性カラムの単回通過によって単核細胞プールから濃縮された。この陰性選択法は、物理的摂動を限定する一方で、関連モノクローナル抗体（抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９）にコンジュゲートした磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に接着したリンパ球は枯渇した。しかし、ＥＣＰ損傷リンパ球によるリンパ球マーカーの表面提示の減少が、ＴおよびＢ細胞の画分のカラムでの保持を免れさせることから、６０％〜８０％を超えるＥＣＰ １日目の単球の濃縮は、課題であると証明された。単球純度をさらに増強するための、反復的な親和性カラム通過は、この手法が受動的にろ過された単球の物理的摂動を複雑にすることから、選択肢ではなかった。幸運にも、一連の分析は、リンパ球のＥＣＰ選択的損傷が、ＤＣ遺伝子活性化レベルの正確な評価のための単球の完全な精製の必要性をなくすことを明らかにした。ＵＶＡ活性化８−ＭＯＰへのそれらの極端な感受性のために、ＥＣＰ処理リンパ球の９９％が、一晩インキュベーション後にアポトーシス性であった（ＡＰＯ２−ＰＥ、トリパンブルーおよび／またはアネキシンフルオレセインイソチオシアネートＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウムでの染色によって決定されたとおり）。ＥＣＰが全体的なリンパ球アポトーシスを生じることから、ＥＣＰ １日目画分中の生単核白血球の９０％〜９５％は単球であった。この現象が次のとおり実施され、９５％を超える単球純度をもたらすアポトーシス性リンパ球の複数ステップ磁気ビーズ除去が、研究した細胞集団において観察された遺伝子発現レベルを変えないという観察の主な理由である。比較を成し遂げるために、本発明者らは、磁気ビーズおよびＥａｓｙＳｅｐ ｍａｇｎｅｔを使用する陰性選択プロトコールを適合させることによって単球精製手順を改変した。末梢血単核細胞は、血小板を除去するために低速（１２０ｇ、１０分間）で遠心分離された。次いで細胞は、次の改変と共に製造業者の手順に従ってＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して標識された：（１）緩衝液は２％自己血清および１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水からなる、（２）ブロッキング時間は１０分間に延ばされた、（３）ビオチン抗体カクテルでの標識は２０分間に延ばされた、および（４）細胞はビオチン抗体カクテルでと抗Ｂｉｏｔｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄでの標識化との間に１度洗浄された。単球をカラムに通過させることにより単球を刺激することを回避するために、代わりに磁気的に標識化された細胞は、未標識単球からＥａｓｙＳｅｐ ｍａｇｎｅｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分離された。５ｍＬポリスチレンチューブ中緩衝液２ｍｌ中の細胞は、磁石中に１０分間置かれ、次いで未標識細胞は新たなチューブに注意深く捨てられた。この手順は単球純度を最大に増強するために２回反復された。この点で純度がまだ不十分であったことから、細胞はＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ試薬で再標識化され、ＥａｓｙＳｅｐ ｍａｇｎｅｔ中に追加的に１０分間置かれ、未標識単球は溶出された。最終純度（Ｘ＝９６％＋４．５）は、ＣＤ１４染色のフローサイトメトリー分析によって評価された。

【0207】

免疫表現型検査
単球および樹状細胞に対して特異的なモノクローナル抗体は、ＣＤ１４（リポ多糖類［ＬＰＳ］受容体、単球）、ＣＤ３６（アポトーシス性細胞に対する受容体、単球）、ヒト白血球抗原ＤＲ−１（ＨＬＡ−ＤＲ、クラスＩＩ主要組織適合性複合体［ＭＨＣ］分子）、ＣＤ８３（樹状細胞マーカー）、細胞質性樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質（ＤＣ−ＬＡＭＰ、樹状細胞マーカー）ならびにＣＤ８０およびＣＤ８６（Ｂ７．１およびＢ７．２同時刺激分子）を含む。抗体は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから得て、それらの予め決定された最適希釈で使用された。バックグラウンド染色は、適切なアイソタイプ対照で確立され、免疫蛍光はＦＣ５００ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析された。膜および細胞質の組合せ染色は細胞固定および透過処理についての製造業者の説明書（Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ ｋｉｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に従って実施された。

【0208】

抗原提示アッセイ
志願者の新鮮に単離された、磁気ビーズ濃縮、抗原を経験したＣＤ４^＋集団（２＊１０^６／ｍＬ、５０μＬ／ウエル）は、破傷風トキソイド（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウエル）およびＲＰＭＩ培地１６４０／１５％自己血清の存在下で単球（２＊１０^６／ｍＬ、５０μＬ／ウエル）に加えられた。５日間の培養後、細胞は１μＣｉの［^３Ｈ］−チミジンを受け、一晩インキュベートされ、採取され、ベータ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で計数された。結果は、５回反復培養の平均および標準偏差として表される。

【0209】

ＭＬＲ／ＣＭＬアッセイ
ＥＣＰ処理単球がＣＤ８Ｔ細胞によるＭＨＣクラスＩ限定細胞傷害性を機能的に刺激できるかどうかを評価するために、３名の正常対象由来の単核白血球が研究された。ＨＬＡ−Ａ２陽性志願者３名それぞれから新鮮に調達された抗凝固血液１単位は、実際のＥＣＰ手順と同一のやり方で臨床ＥＣＰ装置を通じて処理される前後に、刺激単球／樹状細胞の供給源となった。単核画分は、ＥＣＰ処理の直前（ＥＣＰ前）およびＥＣＰ直後（ＥＣＰ Ｄ０）に血液から単離された。一方向性のＴ細胞刺激を確実にするためのガンマ照射（３０００ｒａｄ、セシウム源）後、ＥＣＰ前画分は、ＲＰＭＩ １６４０／１５％自己血清中に系列希釈され、細胞２５０００から２５０個を含有する１００μＬは、円形底マイクロタイタープレートウエルに、５回反復で蒔かれた。ＥＣＰ Ｄ０画分は、１８時間、ラージウエルプレートでインキュベートされ、接着細胞を剥がすためにウエルをこすることによって採取された。次いで再懸濁細胞は、系列希釈され、上に記載のとおり蒔かれた。Ａ−２−陰性正常ドナーは、応答者ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の供給源となり、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気ビーズカラムでの陽性選択によって精製された（平均純度９８％）。次いで応答者Ｔ細胞（５００００／ウエル１００μＬ中）は、ＥＣＰ前またはＥＣＰ−Ｄ０刺激因子のいずれかを含有するウエルに加えられ、プレートは７日間、３７℃、ＣＯ２インキュベーター中で培養された。標的細胞について、Ａ−２陽性Ｔ−Ｂ融合細胞リンパ芽球細胞系、１７４×ＣＷＭ．Ｔ１、は^５１Ｃｒで標識され、ＭＬＲ培養物に細胞１０^４個／ウエルで加えられた。４時間インキュベーション後、プレートは遠心分離され、ガンマカウンターでの計数のために各ウエルから上清１００μＬが除去された。「比溶解百分率」は、次の割合：
平均ｃｐｍ（試料）−平均ｃｐｍ（Ｔ細胞のみ）
平均ｃｐｍ（界面活性剤最大遊離）−平均ｃｐｍ（Ｔ細胞のみ）
の１００倍として定義された。

【0210】

ＲＮＡ単離およびマイクロアレイハイブリダイゼーション
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ ｃｏｌｕｍｎｓ ｗｉｔｈ ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ ＤＮａｓｅ Ｉ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離された。ＲＮＡ収量および純度はＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定された。断片化ｃＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ｈｕｍａｎ ｃｈｉｐｓにハイブリダイズされ、ヒト遺伝子およそ４７４００個についてスクリーニングされ、ＥＳＴはｔｈｅ Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって実施された。マイクロアレイ結果は、遺伝子発現情報データベース受入番号ＧＳＥ２３６０４で利用可能である。

【0211】

データ分析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．２（ＧＣＯＳ １．２、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）から生成された標準化していない生データは、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．２（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を使用して分析された。データは、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉ−Ａｒｒａｙを使用して標準化された。最少倍数変化＞２．０と組み合わせて、白血球アフェレーシスまたは処置試料いずれかにおいて５００以上の平均シグナル強度を有するプローブセットだけを分析に含めた。差次的遺伝子発現は、＞２倍数変化およびＰ＜．０５とされた。誘導されたトランスクリプトームの主成分分析（ＰＣＡ）は、標準的方法によって実施された。シグナル伝達経路関与は、ＭｅｔａＣｏｒｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．０（ＧｅｎｅＧｏ）で同定された。

【0212】

定量的リアルタイムＰＣＲ
選択された遺伝子のマイクロアレイ発現は、同じＲＮＡ試料のアリコートにおいて定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して確認された。ＲＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡに逆転写された。逆転写は、９６−ｗｅｌｌ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００）で次の条件：２５℃１０分間、３７℃１２０分間、８５℃５秒間で実行された。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲは、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＣＲ７、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ１４の転写物を検出するために使用された。各配列に対するプライマーおよびプローブは、一覧のＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）として得られた。ＨＰＲＴ１は、参照遺伝子として使用された。

【0213】

結果
個々の遺伝子発現における大きなＥＣＰ誘導変化
単球における個々の遺伝子活性化のＥＣＰによる刺激は、関連遺伝子についてのＥＣＰ１日目対ＥＣＰ前発現の比として表される。単球濃縮の際の偶発性遺伝子誘導をなくすために、陰性カラム精製法が使用され、それによりリンパ球は保持され、単球は受動的にろ過された。結果は患者および正常対象の両方由来のＥＣＰ処理単球が、共有トランスクリプトームサインを再現性よく発現するために十分生存可能であることを明らかにした。

【0214】

遺伝子は、ＥＣＰ前と比較して倍数変化が＞２であり、有意性がＰ＜．０５であった場合に、ＥＣＰによって有意に上方または下方制御されたと見なされた。遺伝子およそ３０００個からのＲＮＡ転写物のレベルは、各患者群と正常対象において顕著に変化した（表２）。全体的に遺伝子１１２９個は、ＣＴＣＬおよびＧＶＨＤ患者および正常対象の両方由来のＥＣＰ処理単球によって共通して上方または下方制御され、ＥＣＰ誘導遺伝子活性化における共有性を示している。

【0215】

【表3】

【0216】

樹状細胞分化、接着、および機能に関連する多数の遺伝子の発現の増加（表３）は、単球の経路への進入のＥＣＰ刺激をさらに支持する。

【0217】

【表4】

【0218】

その発現が増加することが見出され、免疫賦活樹状細胞の分子マーカーであると考えられる場合があるさらなる遺伝子は、表１に示されている。

【0219】

単球から樹状細胞への成熟の際に予測されるとおり、ＥＣＰ処理単球の一晩培養後に、患者および正常対象すべての単球集団での平均蛍光強度を測定することによって評価されたとおり、ＣＤ１４（単球マーカー）発現は減少された。この結果は、患者のＥＣＰ後細胞のＲＴ−ＰＣＲ研究において確認された（結果未記載）。その発現の低減が単球から樹状細胞への成熟を示すさらなる因子を表４に示す。

【0220】

【表5】

【0221】

その発現が低減され、それにより単球から免疫抑制樹状細胞への成熟を示すさらなる因子は表５に示されている。

【0222】

【表6】

【0223】

実験４−免疫賦活ＤＣの表面分子マーカーおよび機能性メディエーター
ＥＣＰ誘導樹状細胞トランスクリプトームのさらなる分析は、免疫賦活樹状細胞のマーカーおよび機能メディエーターとしての表面分子遺伝子産生物のサブセットを同定するために実施された。ＥＣＰ誘導樹状細胞において上方制御された４６６個の遺伝子は、８７個の共有表面タンパク質を同定するためにおよそ２０００個の公知のまたは推定される全長ヒト膜貫通遺伝子と相互参照された。

【0224】

材料および方法
白血球および血小板の調達
すべての試料は、アスピリンを含む血小板機能に影響を与えることが公知である薬物療法を受けていない若年の健康な対象から取得した。試料は、Ｙａｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄのガイドラインの下で得られ、インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って提供された。末梢血検体は、前腕前部の血管からヘパリンを含有するシリンジに１９−ゲージ針を通して収集され、次いでＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｇａｌｌａｒｄ−Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃａｒｌｅ Ｐｌａｃｅ、Ｎ．Ｙ．）に重層された。１８０ｇでの遠心分離後、単核白血球画分を含有する界面は収集され、ＨＢＳＳ中で２回洗浄され、次いで単核細胞５×１０^６個／ｍｌの最終濃度でＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に再懸濁された。細胞は取得の１時間以内に利用された。

【0225】

血小板に富む血漿の調製
全血は１５０ｇで１５分間、室温で遠心分離された。血小板に富む血漿（ＰＲＰ）層は収集され、９００ｇで５分間遠心分離され、血小板ペレットはＲＰＭＩ １６４０中、所望の濃度に再懸濁された。

【0226】

プレートの調製
プレートの通過はＧｌｙｃｏｔｅｃｈ ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して行われた。この系は、流量路容積測定２００００×１００００×２５４ミクロン（長さ×幅×高さ）からできていた。この系の下部プレートは、ガスケットによって分けられた１５ｍｍペトリ皿（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）からできており、上部プレートを形成するアクリルフローデッキに真空接続されていた。血小板でプレコートするために、フローチャンバーを組み立てる前に、所望の濃度のＰＲＰの２０滴がペトリ皿の中央に置かれ、血小板を２０分間、室温で定着させた。ペトリ皿はＲＰＭＩ ２ｍｌで２回洗浄され、次いでフローチャンバーが組み立てられた。

【0227】

一晩培養
一晩培養が必要であった場合、細胞は遠心分離され、１５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に最終濃度、細胞５×１０６個／ｍｌで再懸濁した。細胞を１２ウエルポリスチレン組織培養プレート（１ウエルあたり２ｍｌ）中、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間、一晩培養した。

【0228】

免疫表現型検査
免疫表現型検査のためのモノクローナル抗体は、ＣＤ１４（ＬＰＳ受容体、単球）、ＣＤ１１ｃ（インテグリンサブユニット、単球およびＤＣ）、ＨＬＡ−ＤＲ（クラスＩＩ ＭＨＣ分子）、ＣＤ８３（ＤＣマーカー）、ＣＤ６２ｐ（Ｐ−セレクチン、活性化血小板）およびＣＤ６１（インテグリンサブユニット、血小板）を含む。抗体はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ８３）またはＳｉｇｍａ（ＣＤ６２ｐ、ＣＤ６１）から得られ、それらの予め決定された最適希釈で使用された。バックグラウンド染色は適切なアイソタイプ対照で確立され、免疫蛍光はＦＣ５００ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析された。２色膜染色は、ＦＩＴＣまたはＰＥに直接コンジュゲートされた両方の抗体を予め決定された最適濃度で加え、２０分間、４℃でインキュベートし、次に未結合抗体を除去するために洗浄することによって実施された。膜および細胞質の組合せ染色は細胞固定および透過処理についての製造業者の説明書（Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ ｋｉｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に従って実施された。

【0229】

結果
プレート通過および／またはＰＢＭＣ Ｄ１集団は、ＳＩＲＰａ、ＩＣＡＭ１、ＣＸＣＬ１６、ＬＩＧＨＴ、ＰＬＡＵＲ（ＣＤ８７、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ受容体）、ＭＳＲ１、Ｎｅｕ１（シアリダーゼ）、ＣＤ１３７ＬおよびＣＡＴＢ（ＣＴＳＢ、カテプシンＢ）の分析された表面発現の顕著な上方制御を示した。

【0230】

実験５−単球をフローチャンバーに通した後の分子マーカーの発現およびＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度の決定
材料および方法
単球は、図１９に示すデバイスを通された。簡潔には、血液試料は、例えば細胞１０^１０個／ｍｌの濃度の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む試料８ｍｌを例えば得るためにＦｉｃｏｌｌ勾配を通して低速で遠心した。チャンバーは、血小板でプレコートされた。試料は、約０．０２８Ｐａでチャンバーを通された。次いでチャンバーは、ＲＰＭＩ約３ｍｌ、０．０２８Ｐａで洗浄された。ＲＰＭＩ ３０〜５５ｍｌでの２回目の洗浄は、約１．２Ｐａで実施された。収集された活性化単球は、合わせられ、１日インキュベートされ、さらなる分析のために使用された（ＰＰ Ｄ１ ＰＢＭＣ）。対照としてＰＢＭＣは、デバイスを通されずに、１日インキュベートされた（Ｄ１ ＰＢＭＣ）。別の対照として未成熟ｆａｓｔ ＤＣは、ＰＢＭＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で直接培養することによって得られた（未成熟Ｆａｓｔ ＤＣ）。さらにＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を通じた採取直後に分析された（新鮮（Ｆｉｃｏｌｌ）ＰＢＭＣ）。

【0231】

次いで細胞および対照は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１およびＰＬＡＵＲの発現について分析された。それらは、ＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度についてさらに分析された。結果は、ＨＬＡ−ＤＲについては図２０に、ＦＳＣ／ＳＳＣ複雑度については図２１および２２に示されている。要約は図２３に示されている。

【0232】

結果
結果は、これらの細胞を１日インキュベートした（Ｄ１ ＰＢＭＣ）ことから明らかになるとおり、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を通じた遠心分離に供された細胞が分化し始めるために十分な物理的な力を既に経験したと考えられることを示している。しかし活性化および分化は、デバイスを通じたプレート通過でよりはっきりする（ＰＰ Ｄ１ ＰＤＭＣ）。例えば８−ＭＯＰおよびＵＶ−Ａの非存在下で本発明による方法によって得られた樹状細胞は、サイトカインカクテルで得られた未成熟Ｆａｓｔ ＤＣよりもさらに複雑で異なるパターンを有する。

【0233】

実験６−貪食活性の決定
実験３のプレート継代ＥＣＰ細胞は、Ｔ−細胞をマークする抗ＣＤ３抗体とインキュベートされ、記録される。貪食活性を有する細胞が形成されたことが観察される。

【0234】

実験７
材料および方法
メラノーママウスモデルの生成
公知のＹＵＭＭ１．７メラノーマ細胞株（Theodosakis, N et al., Mol Cancer Ther.Published OnlineFirst May 6, 2015; doi:10.1158/1535-7163.MCT-15-0080）がオスＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてメラノーマ腫瘍を生成するために使用された。ＰＢＳ中のＹＵＭＭ１．７細胞１０^５個は、腫瘍形成を誘導するために９匹の４週齢オスＣ５７ＢＬ／６マウス右側腹皮下に注入された。

【0235】

マウスは約１０ｍｍ^３の小さな腫瘍を確立するようにおよそ１１〜１３日間成長させた。次いでマウスは２個のコホートに分割された。１個のコホート（マウス４匹）は処置群（群１）と称され、第２のコホート（マウス５匹）はＰＢＳ対照群（群２）と称された。

【0236】

１１〜１３日後、群１についての各処置はマウスを採血し、マウス１匹あたり全血２００μｌを取ることによって開始された。血液は、赤血球を除去し、細胞８．３３＊１０^８個／ｍｌの量で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るためにＦｉｃｏｌｌ勾配を通して遠心された。並行して、同数のＹＵＭＭ１．７細胞はＰＢＳに懸濁され、Ｙｕｍｍ１．７細胞を図２６に示すフローチャンバーを通すことによって８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（４Ｊ／ｃｍ^２および１００ｎｇ／ｍｌ ８−ＭＯＰ）に供された。流速は０．１ｍｌ／分であった。

【0237】

次いで８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞は、ＰＢＭＣと混合され、同じフローチャンバーを通された。流速は０．１ｍｌ／分であり、８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（２Ｊ／ｃｍ^２および１００ｎｇ／ｍｌ ８−ＭＯＰ）に供された。

【0238】

細胞は遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、マウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された。

【0239】

群２についてＰＢＭＣがＰＢＳ緩衝液で置き換えられたことを除いて同じ手順が実施された。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。

【0240】

結果
個々のマウスについての結果は図２７に示されている。組み合わされた結果は、図２８に示されている。図４は数匹の処置マウスを示している。結果は、図２９に示されている。腫瘍容積の明らかな低減が群１について観察されるが、群２についてはされない。

【0241】

実験８
材料および方法
ＹＵＭＭ１．７細胞は、実験７に記載のとおり生成されるように皮下に注入された。

【0242】

マウスは約１０ｍｍ^３の小さな腫瘍を確立するようにおよそ１１〜１３日間成長された。次いでマウスは２個のコホートに分割された。１個のコホート（マウス５匹）は処置群（群１）と称され、第２のコホート（マウス５匹）はＰＢＳ対照群（群２）と称された。

【0243】

１１〜１３日後、群１についての各処置はマウスを採血し、マウス１匹あたり全血２００μｌを取ることによって開始された。血液は、赤血球を除去し、細胞８．３＊１０^８個／ｍｌの量でＰＢＭＣを得るためにＦｉｃｏｌｌ勾配を通して遠心された。並行して、同数のＹＵＭＭ１．７細胞はＰＢＳに懸濁され、Ｙｕｍｍ１．７細胞を図２６に示すフローチャンバーを通すことによって８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（４Ｊ／ｃｍ^２および１００ｎｇ／ｍｌ ８−ＭＯＰ）に供された。流速は０．１ｍｌ／分であった。

【0244】

次いで８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞はＰＢＭＣと混合され、８−ＭＯＰおよびＵＶＡに適用しないこと以外は実験７においてと同じフローチャンバーを通された。したがってＰＢＭＣはいかなるアポトーシス性チャレンジにも供されなかった。

【0245】

細胞は遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、マウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された。

【0246】

群２についてＰＢＭＣがＰＢＳ緩衝液で置き換えられたことを除いて同じ手順が実施された。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。

【0247】

結果
結果は図３０に示されている。腫瘍容積の明らかな低減が群１について観察されるが、群２についてはされない。

【0248】

実験９
材料および方法
ＹＵＭＭ１．７細胞は、実験７に記載のとおり生成されるように皮下に注入された。

【0249】

マウスは約１０ｍｍ^３の小さな腫瘍を確立するようにおよそ１１〜１３日間成長させた。次いでマウスは４個のコホートに分割された。１個のコホート（マウス５匹）はＰＢＳ対照群（群１）と称され、３個のコホート（群２から４、各マウス５匹）は処置群であった。

【0250】

１１〜１３日後、群２についての各処置はマウスを採血し、マウス１匹あたり全血２００μｌを取ることによって開始された。血液は、赤血球を除去し、細胞８．３＊１０^８個／ｍｌの量でＰＢＭＣを得るためにＦｉｃｏｌｌ勾配を通して遠心された。並行して、同数のＹＵＭＭ１．７細胞はＰＢＳに懸濁され、Ｙｕｍｍ１．７細胞を図２６に示すフローチャンバーを通すことによって８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（４Ｊ／ｃｍ^２および１００ｎｇ／ｍｌ ８−ＭＯＰ）に供された。流速は０．１ｍｌ／分であった。

【0251】

Ｙｕｍｍ１．７細胞は遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、ＰＢＭＣを含まずに（Ｙｕｍｍ単独）マウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。

【0252】

群１について純粋なＰＢＳ（Ｙｕｍｍ細胞またはＰＢＭＣを含まない）がマウスに注射されたことを除いて同じ手順が実施された。

【0253】

群３について、ＰＢＭＣは群１について記載のとおり得られた。ＰＢＭＣは、ＰＢＳに再懸濁され、図１のフローチャンバーに８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置を伴わずに０．１ｍｌ／分の流速で通された。フローチャンバー通過ＰＢＭＣは、遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、Ｙｕｍｍ細胞を含まずにマウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された（ＰＢＭＣ、ＰＰ ｗ／ｏ ＹＵＭＭ）。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。

【0254】

群４について、ＰＢＭＣは群３と同様に得られ、図１のフローチャンバーに８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置を伴わずに０．１ｍｌ／分の流速で通された。並行して、ＹＵＭＭ１．７細胞はＰＢＳに懸濁され、Ｙｕｍｍ１．７細胞を図２６に示すフローチャンバーを通すことによって８−ＭＯＰおよびＵＶＡ処置（４Ｊ／ｃｍ^２および１００ｎｇ／ｍｌ ８−ＭＯＰ）に供され、流速は０．１ｍｌ／分であった。

【0255】

次いで８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処置Ｙｕｍｍ１．７細胞およびＰＢＭＣは１５％マウス血漿を補充したＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩同時インキュベートされた。細胞は遠心で落とされ、マウスの血清（マウス１匹あたり１００μｌ）に再懸濁され、マウスの後眼窩洞内に静脈内注射で戻された（Ｏ／Ｎ ＹＵＭＭ^ＵＶＡ ＰＰ^{ｎｏＵＶＡ}）。この手順は次の３週間にわたって１週間に２回反復された（全体で処置６回）。続いて腫瘍容積は細胞計数によって決定された。

【0256】

結果
結果は図３１に示されている。腫瘍容積の明らかな低減が群２および群３対対照群１について観察される。腫瘍低減は群４で最も進歩している。
なお、本発明は、以下の態様をも包含するものである。
＜１＞ がんを処置する際の使用のための全体的に活性化された単球であって、
前記がんが抗腫瘍治療用抗体と組み合わせて処置され、
前記全体的に活性化された単球が、
ａ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を前記単球が全体的に活性化されるように物理的な力に供するステップ
を少なくとも含む方法によって得ることができ、
前記全体的に活性化された単球が少なくともＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１の発現の増加によって特徴付けられる、がんを処置する際の使用のための全体的に活性化された単球。
＜２＞ 全体的に活性化された単球を得るための方法であって、
ａ）単球を含む体外量の哺乳動物対象の血液試料を前記単球が全体的に活性化されるように物理的な力に供するステップ
を少なくとも含み、
前記全体的に活性化された単球が少なくともＨＬＡ−ＤＲ、ＰＬＡＵＲおよびＩＣＡＭ−１の発現の増加によって特徴付けられる方法。
＜３＞ 前記全体的に活性化された単球が前方散乱／側方散乱複雑度によって特徴付けられる、＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 前記全体的に活性化された単球が追加的に少なくともＡＢＣＡ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＤ６８、ＣＲＫ、ＦＡＳ、ＩＬ１０、ＲＡＢ７Ｂ、ＲＡＬＡ、ＳＣＡＲＦ１、および／またはＴＨＢＳ１の発現の増加によって特徴付けられる、＜２＞または＜３＞に記載の方法。
＜５＞ 前記全体的に活性化された単球が追加的に少なくともＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１６、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＶ、ＭＭＰ９、ＭＳＲ１、ＯＬＲ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＩＭＰ１および／またはＴＮＦの発現の増加によって特徴付けられる、＜２＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞ 前記全体的に活性化された単球が表６の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個のマーカーの発現の増加によって同定可能である、＜２＞〜＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞ 前記全体的に活性化された単球がＧＩＬＺ発現の増加を示さない、＜２＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞ 前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料が、前記哺乳動物対象の血液試料内に含有される前記単球に剪断力が適用されるようにデバイスのフローチャンバーを通る前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料の流速の固定または調節可能な調整を可能にする前記デバイスの前記フローチャンバーに前記体外量の前記哺乳動物対象の血液試料を通すことによって物理的な力に供される、＜２＞〜＜７＞のいずれかに記載の方法。
＜９＞ 前記単球が活性化血小板および／または血漿構成成分との相互作用を通じて活性化され、全体的に活性化された単球に分化するように誘導される、＜２＞〜＜８＞のいずれかに記載の方法。
＜１０＞ 前記血小板が約４０：１から４００：１の高さ幅比を有する前記フローチャンバーを通される、＜８＞または＜９＞に記載の方法。
＜１１＞ 前記血小板が、前記フローチャンバーを約０．１から約２０．０ｄｙｎ／ｃｍ^２の剪断力下で通される、＜８＞〜＜１０＞のいずれかに記載の方法。
＜１２＞ 前記単球が、約０．１から約２０．０ｄｙｎ／ｃｍ^２の剪断力を産生するように前記フローチャンバーを約１０ｍｌ／分から約２００ｍｌ／分の流速で通される、＜８＞〜＜１１＞のいずれかに記載の方法。
＜１３＞ ８−ＭＯＰおよびＵＶＡなどの光活性化可能作用因子の非存在下で実施される、＜８＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１４＞ ＜２＞〜＜１３＞のいずれかに記載の方法によって得ることができる全体的に活性化された単球。
＜１５＞ がんを処置する際の使用のための、＜１４＞に記載の全体的に活性化された単球。
＜１６＞ 処置される患者が化学療法、放射線療法またはその組合せを受けている、＜１５＞に記載の使用のための全体的に活性化された単球。
＜１７＞ 前記がんが抗腫瘍治療用抗体と組み合わせて処置される、＜１５＞または＜１６＞に記載の使用のための全体的に活性化された単球。
＜１８＞ 創傷治癒における使用のための、＜１４＞に記載の全体的に活性化された単球。
＜１９＞ 前記創傷が慢性創傷、糖尿病性創傷、静脈うっ血を含む血管不全創傷および／または手術後創傷である、＜１８＞に記載の使用のための全体的に活性化された単球。
＜２０＞ 再生医学における使用のための、＜１４＞、＜１８＞または＜１９＞に記載の全体的に活性化された単球。
＜２１＞ ＜２０＞に記載の使用のための、変性関節疾患、変性神経もしくは脳疾患、および／または（再）発毛における組織修復の刺激により全体的に活性化された単球。
＜２２＞ 貪食細胞における使用のための、＜１４＞に記載の全体的に活性化された単球。
＜２３＞ 前記貪食された細胞が抗体コート腫瘍細胞および／またはアポトーシス性細胞を含む抗体コート細胞である、＜２２＞に記載の使用のための全体的に活性化された単球。

【0257】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]