特許 6860489 ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物、およびそれを用いたＰＨＡの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6860489

(24)【登録日】2021年3月30日

(45)【発行日】2021年4月14日

(54)【発明の名称】ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物、およびそれを用いたＰＨＡの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20210405BHJP

   C12P 7/62 20060101ALI20210405BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20210405BHJP

   C12R 1/01 20060101ALN20210405BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12P7/62

   !C12N15/09 Z

   C12R1:01

【請求項の数】12

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2017-542721(P2017-542721)

(86)(22)【出願日】2016年9月15日

(86)【国際出願番号】JP2016004222

(87)【国際公開番号】WO2017056442

(87)【国際公開日】20170406

【審査請求日】2019年8月5日

(31)【優先権主張番号】特願2015-190269(P2015-190269)

(32)【優先日】2015年9月28日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000941

【氏名又は名称】株式会社カネカ

(74)【代理人】

【識別番号】110000556

【氏名又は名称】特許業務法人 有古特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】小林 新吾

(72)【発明者】

【氏名】指輪 仁之

(72)【発明者】

【氏名】藤木 哲也

【審査官】 水野 浩之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／１３３４６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１３３２３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１５−０２９４８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／１４６１９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 LU X. et al.，FEMS Microbiol.Lett.,2005,243(1),p.149-155，第１５４頁左欄下から第一段落−右欄等

【文献】 TSUGE T. et al.，FEMS Microbiol.Lett.,2007,277(2),p.217-222，要約、Ｔａｂｌｅ １，２等

【文献】 TSUGE T. et al.，Macromol.Biosci.,2007,7(6),p.846-854，要約、Ｔａｂｌｅ ３、Ｆｉｇ．２等

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属に由来する、３−ヒドロキシヘキサン酸に対する基質特異性が異なる２種類以上のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有し、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属を宿主とする形質転換体である微生物であって、
前記ＰＨＡ合成酵素のうち３−ヒドロキシヘキサン酸に対する基質特異性が高い方のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が、
配列番号１に記載するアミノ酸配列において１４９番目のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、
配列番号１に記載するアミノ酸配列において１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は、
配列番号１に記載するアミノ酸配列において１４９番目のアスパラギンがセリンに置換され、かつ、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、
前記ＰＨＡ合成酵素のうち３−ヒドロキシヘキサン酸に対する基質特異性が低い方のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が、
配列番号１に記載するアミノ酸配列を有する野生型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、又は、
３−ヒドロキシヘキサン酸に対する基質特異性が前記野生型ＰＨＡ合成酵素と同等又は低くなるように前記野生型ＰＨＡ合成酵素に対して人為的改変が導入された改変型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子である、微生物。

【請求項2】

前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が、モノマーユニットとして３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸を含む共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を含む、請求項１記載の微生物。

【請求項3】

前記改変型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１に記載するアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつＰＨＡ合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１又は２に記載の微生物。

【請求項4】

前記ＰＨＡ合成酵素のうち３−ヒドロキシヘキサン酸に対する基質特異性が低い方のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１に記載するアミノ酸配列において５０５番目のアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。

【請求項5】

前記微生物が、さらに、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。

【請求項6】

前記宿主が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。

【請求項7】

前記微生物が、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子をさらに有しており、当該Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が強化されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物を培養することにより、融点が互いに異なる３種類以上のＰＨＡを前記微生物の細胞内で生産する工程を含む、ＰＨＡ混合品の製造方法。

【請求項9】

前記ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち１種類以上が、少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合ＰＨＡである、請求項８に記載のＰＨＡ混合品の製造方法。

【請求項10】

前記ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち最も融点の高いＰＨＡが、１６０℃でアニール処理後のＤＳＣにおいて１６０〜１８５℃に吸熱ピークを呈するＰＨＡである、請求項８又は９に記載のＰＨＡ混合品の製造方法。

【請求項11】

前記ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち最も融点の低いＰＨＡが、ＤＳＣにおいて９０〜１３５℃に吸熱ピークを呈するＰＨＡである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＰＨＡ混合品の製造方法。

【請求項12】

ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち融点が中間的であるＰＨＡの少なくとも１種類が、１３０℃でアニール処理後のＤＳＣにおいて１３６〜１５５℃に吸熱ピークを呈するＰＨＡである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のＰＨＡ混合品の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＨＡを細胞内で生産するための微生物、およびそれを用いたＰＨＡの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ポリヒドロキシアルカン酸（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ；以下、「ＰＨＡ」と略す）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー貯蔵物質として生産、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって様々な天然の炭素源から生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解されるため、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることになる。したがって、ＰＨＡは生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチックであると言える。近年、環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から、合成プラスチックが深刻な社会問題となるに至り、ＰＨＡが環境にやさしいグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。

【0003】

微生物中に最初に発見されたＰＨＡは、３−ヒドロキシ酪酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「３ＨＢ」と略す）のホモポリマーであるポリヒドロキシブチレート（Ｐｏｌｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「ＰＨＢ」と略す）である。ＰＨＢは高結晶性であり、結晶化度が高いため硬くて脆く、しかも融点付近の温度（１８０℃）で速やかに熱分解するため、溶融加工性が低く実用範囲は極めて限られるという問題を有している。

【0004】

そこで、ＰＨＢの結晶化度を下げて脆性を改善するため、他の３−ヒドロキシアルカン酸をＰＨＢ骨格中に導入する試みがなされた。その一つとして、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ；以下、「３ＨＨ」と略す）の共重合ポリエステルＰｏｌｙ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）（以下、「ＰＨＢＨ」と略す）が発見された。３ＨＢと比べて長い側鎖構造を持つ３ＨＨをモノマーユニットとして含有するＰＨＢＨは、ＰＨＢと比べて結晶化度が低いため、しなやかで柔らかい物性を有し、脆性が改善されている。しかもＰＨＢＨは融点が低いため、溶融加工性の改善も期待できる。しかし、ＰＨＢＨは結晶固化速度が非常に遅く、加熱溶融後室温まで冷却しても、しばらくは柔らかく粘性を持つことや、粘着性があるため成形時にすぐに離型しないということがわかった。そのためＰＨＢＨの実用化には、連続的な加工が難しいという課題がある。また、結晶固化速度の速い既存の汎用樹脂の加工に使用している加工機器が、ＰＨＢＨの加工に利用できない場合があることも明らかとなった。フィルムやシート、繊維、発泡体、成形品、不織布への加工では、溶融加工したポリマーを冷却する際に当該ポリマーの結晶固化速度が速いことが、生産工程の連続化、ひいては生産性の向上と低コストに繋がるため非常に重要である。

【0005】

そこでＰＨＢＨの結晶固化速度を速める試みがされてきた。そのための一般的な方法として、結晶核剤を添加する方法が試みられている。例えば、特許文献１ではＰＨＢＨに結晶核剤として窒化ホウ素を使用し結晶化促進効果が得られている。しかし、これは高価な材料であり、しかも生分解性を持たない。このため、より安価で生分解性のある結晶核剤が検討された。

【0006】

特許文献２および３では、ＰＨＢＨに対してより高い融点を有し、しかも生分解性であるＰＨＢを結晶核剤として添加して、結晶固化速度を速くする技術が開示されている。この先行文献では、ＰＨＢＨとＰＨＢの混合法として、例えばＰＨＢＨとＰＨＢを熱クロロホルム等の溶媒に溶解、混合後、クロロホルムを蒸発させることによるポリマーの析出や、２種類のポリマーをドライアイスで冷却しながら粉砕し混合する方法、ＰＨＢは溶融しないでＰＨＢＨのみ融解させた状態での混合、乾燥ポリマー粉末のミキシングによる混合などが試みられている。しかしながら、溶媒に溶解して混合する方法では、ＰＨＢＨの溶解や晶析のために非常に大量の溶媒が必要となり、コスト高となる。また、ＰＨＢＨとＰＨＢの混合法として、メタノールで晶析し混合ポリマーを回収する方法も知られているが、この方法では、晶析時にポリマーと結晶核剤の溶解度の違いから、均一に分散した状態で晶析が行われないなどの可能性があり、実用的でない。ポリマーを粉砕後混合する方法や乾燥ポリマー粉末をミキシングする方法では、ポリマーを均一に混合することは困難であり、結晶核剤の効果が低下することが予想される。特にＰＨＢＨおよび結晶核剤の粒子径は小さいほどよく混合し、また核形成部位の数が多くなるため高い効果が期待されるが、上記の混合法では微粒子での混合効果は期待できない。さらに、ＰＨＢをＰＨＢＨ中に均一に分散させるためにはＰＨＢの融点以上での加工が必要となるが、一般的なＰＨＢの融点は高く、しかも上記のようにその融点付近の温度で熱分解するため、ＰＨＢをＰＨＢＨ中に分散させる際の熱によるＰＨＢやＰＨＢＨの劣化、分子量低下などの問題が避けがたい。

【0007】

これらの問題を解消するため、培養を制御することで微生物にＰＨＢＨと結晶核剤となるＰＨＡを混ざった状態で生産させる手法が発明された。例えば特許文献４では、培養途中で炭素源を変化させることで、ＰＨＢＨと、ＰＨＢまたは３ＨＨモノマーの共重合比率の低いＰＨＢＨの混合物を微生物に生産させる手法が報告されている。また非特許文献１では、特定の植物油と吉草酸ナトリウムを炭素源として培養することで、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ；以下、「３ＨＶ」と略す）の共重合ポリエステルＰｏｌｙ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）（以下、「ＰＨＢＶ」と略す）とＰＨＢの混合物を細胞内で共生産できることが示唆されている。これらの方法では、ＰＨＢ等の結晶核剤成分を別途生産する必要がなく、コスト的にも大きなメリットがある。しかしながら、培養途中で炭素源を変化させる特許文献４の方法では非連続的に２種類のＰＨＡが生産されるため培養制御が非常に難しく、さらに生産性も低いため安定したポリマーの生産が困難である。また非特許文献１の方法では、特定の植物油を使った場合にしか目的の効果が得られない上に、２種類のＰＨＡの混合量比を制御することが難しく、実用的でない。

【0008】

その他に、２種類のＰＨＡを細胞内共生産した例として、以下の報告がある。例えば非特許文献２は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属の野生株６１−３株が３つのＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有することを報告している。この３つのＰＨＡ合成酵素のうち、２つは炭素鎖長６〜１２の３−ヒドロキシアルカン酸（以下、「中鎖ヒドロキシアルカン酸」と略す）を基質とし、残る１つは３ＨＢのみを基質とする。そのため、この６１−３株をオクタン酸やドデカン酸などの脂肪酸を含む培地で培養すると、中鎖ヒドロキシアルカン酸を主成分とするＰＨＡ（以下、「中鎖ＰＨＡ」と略す）とＰＨＢが細胞内で共生産されることになる。また非特許文献３と４では、中鎖ＰＨＡを合成するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（シュードモナス オレオボランス）に対し、様々な細菌由来のＰＨＢ合成酵素をコードする遺伝子を導入すると、中鎖ＰＨＡとＰＨＢが細胞内で共生産されることが報告されている。また非特許文献５では、ＰＨＢを合成するＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（ラルストニア ユートロファ）に対し、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ（アロクロマチウム ビノサム）由来の中鎖ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を導入すると、ＰＨＢと中鎖ＰＨＡが細胞内で共生産されることが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開平６−１５７８７８号公報

【特許文献2】特表平８−５１０４９８号公報

【特許文献3】国際公開第２００２／５０１５６号公報

【特許文献4】特開２００４−２５０６２９号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｗｉｎｇ−Ｈｉｎ Ｌｅｅ， Ｃｈｉｎｇ−Ｙｅｅ−Ｌｏｏ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔ． Ｎｏｍｕｒａ， Ｋｕｍａｒ Ｓｕｄｅｓｈ， Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．９９， ｐｐ．６８４４−６８５１， （２００８）

【非特許文献2】Ｈｉｒｏｍｉ Ｍａｔｓｕｓａｋｉ， Ｓｕｍｉｈｉｄｅ Ｍａｎｊｉ， Ｋａｚｕｎｏｒｉ Ｔａｇｕｃｈｉ， Ｍｉｋｉｙａ Ｋａｔｏ， Ｔｏｓｈｉａｋｉ Ｆｕｋｕｉ， Ｙｏｓｈｉｈａｒｕ Ｄｏｉ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．１８０， ｐｐ．６４５９−６４６７， （１９９８）

【非特許文献3】Ａｒｎｕｌｆ Ｔｉｍｍ， Ｄａｖｉｄ Ｂｙｒｏｍ， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓｔｅｉｎｂuｃｈｅｌ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．３３， ｐｐ．２９６−３０１， （１９９０）

【非特許文献4】Ｍａｔｔｈｉａｓ Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ， Ｆｒａｎｋ Ｍａｙｅｒ， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓｔｅｉｎｂuｃｈｅｌ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．４０， ｐｐ．２９２−３００， （１９９３）

【非特許文献5】Ｋａｗａｌｐｒｅｅｔ Ｋ． Ａｎｅｊａ， ＲｉｃｈａｒｄＤ． Ａｓｈｂｙ， Ｄａｎｉｅｌ Ｋ． Ｙ． Ｓｏｌａｉｍａｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ｖｏｌ．３１， ｐｐ．１６０１−１６１２， （２００９）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の課題は、結晶化の遅いＰＨＡ共重合体の結晶化速度を向上させ、射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などの加工におけるＰＨＡ共重合体の溶融加工性を改善し、生産性を向上することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（アエロモナス）属に由来する、異なる２種類以上のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物を用いることで、融点が互いと異なる３種類以上のＰＨＡを同一細胞内で共生産させることができ、さらに、得られるＰＨＡ混合品の結晶化速度が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0013】

即ち、本発明の第１は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（アエロモナス）属に由来する、異なる２種類以上のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物に関する。前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子としては、モノマーユニットとして３ＨＢと３ＨＨを含む共重合ＰＨＡを合成可能でかつ３ＨＨに対する基質特異性が異なる少なくとも２種類のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子であるのが好ましい。また、前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が、それぞれ配列番号１に記載するアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子および前記アミノ酸配列に対して９０％以上の配列相同性を有し、かつＰＨＡ合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択されるのが好ましい。さらに、前記ＰＨＡ合成酵素のうち３ＨＨに対する基質特異性が高い方のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１に記載するアミノ酸配列において１４９番目のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、および／または、配列番号１に記載するアミノ酸配列において１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であるのが好ましい。また、前記ＰＨＡ合成酵素のうち３ＨＨに対する基質特異性が低い方のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１に記載するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であるか、配列番号１に記載するアミノ酸配列において５０５番目のアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であるのが好ましい。さらにＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ（カプリアビダス）属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物であるのが好ましい。また本発明の微生物は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物を宿主とする形質転換体であるのが好ましく、前記Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（カプリアビダス ネカトール）であるのが好ましい。さらに、微生物がＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子をさらに有しており、当該Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が強化されているのが好ましい。

【0014】

本発明の第２は、上記微生物を培養することにより、融点が互いに異なる３種類以上のＰＨＡを前記微生物の細胞内で生産する工程を含む、ＰＨＡ混合品の製造方法に関する。前記ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち１種類以上が、少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合ＰＨＡであるのが好ましい。また、前記ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち最も融点の高いＰＨＡが、１６０℃でアニール処理後のＤＳＣにおいて１６０〜１８５℃に吸熱ピークを呈するＰＨＡであり、前記ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち最も融点の低いＰＨＡが、ＤＳＣにおいて９０〜１３５℃に吸熱ピークを呈するＰＨＡであり、ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち融点が中間的であるＰＨＡの少なくとも１種類が、１３０℃でアニール処理後のＤＳＣにおいて１３６〜１５５℃に吸熱ピークを呈するＰＨＡであるのがそれぞれ好ましい。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、結晶化の遅いＰＨＡ共重合体の結晶化速度を向上できるので、射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などの加工におけるＰＨＡ共重合体の溶融加工性または加工速度を改善することができる。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。

【0017】

本発明は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属に由来する、異なる２種類以上のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物（以下、「本発明の微生物」と略す）に関する。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属に由来するＰＨＡ合成酵素は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属に由来する野生型ＰＨＡ合成酵素であってもよいし、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属に由来する野生型ＰＨＡ合成酵素に対して人為的改変を施した改変型ＰＨＡ合成酵素であってもよい。

【0018】

本発明の微生物は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属に由来する異なる２種類以上のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する限り、特に限定されないが、いずれの遺伝子も、モノマーユニットとして３ＨＢと３ＨＨを含む共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子であるのが好ましく、この場合、これらＰＨＡ合成酵素は、３ＨＨに対する基質特異性が互いと異なる少なくとも２種類のＰＨＡ合成酵素であるのが好ましい。本明細書においては、３ＨＨに対する基質特異性が互いと異なる２種類のＰＨＡ合成酵素のうち、３ＨＨに対する基質特異性の高い方のＰＨＡ合成酵素を「ＰＨＡ合成酵素Ａ」と、３ＨＨに対する基質特異性の低い方のＰＨＡ合成酵素を「ＰＨＡ合成酵素Ｂ」とそれぞれ定義する。なお、ここでいう「３ＨＨに対する基質特異性が高い」とは、当該ＰＨＡ合成酵素が、共重合ＰＨＡの合成においてモノマーユニットとして３ＨＨを取り込む能力が他のＰＨＡ合成酵素より高いことを意味する。また、本発明の微生物がＡｅｒｏｍｏｎａｓ属に由来する３種類以上のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する場合は、当該ＰＨＡ合成酵素が示す３ＨＨに対する基質特異性を基準に、これら３種類以上の酵素を適宜２つのグループに分けて各グループをＰＨＡ合成酵素ＡまたはＰＨＡ合成酵素Ｂとみなしてもよいし、中間的な基質特異性を有するＰＨＡ合成酵素がある場合には、それをＰＨＡ合成酵素Ａ及びＰＨＡ合成酵素Ｂとは別のＰＨＡ合成酵素として取り扱ってもよい。

【0019】

本発明において、ＰＨＡ合成酵素Ａをコードする遺伝子及びＰＨＡ合成酵素Ｂをコードする遺伝子は、いずれも、配列番号１に記載するアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の配列相同性を有し、かつＰＨＡ合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるのが好ましい。本発明においては、配列番号１に記載するアミノ酸配列を有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（アエロモナス キャビエ）由来の野生型ＰＨＡ合成酵素、及び、当該野生型ＰＨＡ合成酵素に対しアミノ酸の置換、挿入、欠失などの人為的改変を施し、その改変の種類や程度などによって３ＨＨに対する基質特異性を変化させた改変型ＰＨＡ合成酵素から、ＰＨＡ合成酵素Ａ及びＰＨＡ合成酵素Ｂを選択し、組み合わせて用いることが好ましい。

【0020】

ＰＨＡ合成酵素Ａは、配列番号１に記載するアミノ酸配列を有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来の野生型ＰＨＡ合成酵素よりも３ＨＨに対する基質特異性が高いことが好ましく、３ＨＨに対する基質特異性が高くなるように前記野生型ＰＨＡ合成酵素に対して人為的改変が導入された改変型ＰＨＡ合成酵素であることがより好ましい。その一例として、本発明の微生物が有するＰＨＡ合成酵素Ａをコードする遺伝子としては、配列番号１に記載するアミノ酸配列において１４９番目のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、配列番号１に記載するアミノ酸配列において１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。なかでも、配列番号１に記載するアミノ酸配列において１４９番目のアスパラギンがセリンに置換され、かつ、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が特に好ましい。そのような遺伝子としては配列番号１３に示される塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。

【0021】

一方、ＰＨＡ合成酵素Ｂは、配列番号１に記載するアミノ酸配列を有する野生型ＰＨＡ合成酵素と比べて、３ＨＨに対する基質特異性が同等か、又はそれ未満であることが好ましい。具体的には、ＰＨＡ合成酵素Ｂをコードする遺伝子として、配列番号１に記載するアミノ酸配列を有する野生型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、または、３ＨＨに対する基質特異性が同等又は低くなるように前記野生型ＰＨＡ合成酵素に対して人為的改変が導入された改変型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子であることが好ましい。後者の具体例としては、配列番号１に記載するアミノ酸配列において５０５番目のアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が好ましい。前記他のアミノ酸としては、例えば、トリプトファン等が挙げられる。

【0022】

本発明の微生物において、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の２種類以上のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を同一細胞内に保有させる方法としては特に限定されない。本発明の微生物は自然界でこれまでに発見されていないが、遺伝子組み換え技術などを用いて、宿主となる微生物に前記ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を導入することで本発明の微生物を製造することができる。例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属に属する微生物を宿主とし、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の別のＰＨＡ合成酵素（当該宿主が保有するＰＨＡ合成酵素とは異なるＰＨＡ合成酵素）をコードする遺伝子を１種類以上導入しても良いし、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の微生物を宿主とし、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を２種類以上導入しても良い。また、宿主となる微生物は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の生物由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有していても良い。一例として、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物に、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を２種類、またはそれ以上導入するのが好ましい。その場合、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物が本来有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子については、そのまま存在していても良く、破壊または欠失していても良い。

【0023】

本発明の微生物は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の２種類以上のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の他に、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の生物由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有していても良い。一例として、本発明の微生物は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有することが好ましく、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の配列相同性を有し、かつＰＨＡ合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有することがより好ましい。これにより、ＰＨＡ共重合体の結晶化速度をより向上させることができる。

【0024】

本発明の微生物が有する、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の生物由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子は、１つであっても良いし、複数であっても良い。

【0025】

Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来やＡｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の生物由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する場合、本発明の微生物が当該ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を保持する形式としては、プラスミドで保持する形式であっても良いし、染色体の任意の位置に導入する形式であっても良いし、これらの形式を併用しても良い。ただしプラスミドで保持する形式の場合、培養中にプラスミドが脱落する可能性があるため、染色体上に保持する形式がより好ましい。

【0026】

本発明の微生物は、上記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来やＡｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の生物由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の発現を調整／制御する発現調節配列をその遺伝子の上流に有しているのが好ましい。そのような発現調節配列としては特に限定されず、宿主の本来有する発現調節配列を用いても良いし、公知のプロモーターやシャイン・ダルガノ配列（ＳＤ配列）、あるいはそれらの改変体などを適宜組み合わせて使用することも出来る。本発明の微生物において、ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子に使用される発現調節配列としては、例えば、ｌａｃプロモーター、配列番号４記載のｔｒｐプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔａｃＩＩプロモーター、ｔｉｃプロモーター、配列番号５記載のｔｒｃプロモーター、配列番号３２記載のｌａｃＮ１５プロモーター（ｌａｃプロモーターの改変体）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のｐｈａＣＡＢオペロンのプロモーター（ＲＥＰプロモーター）やその改変体、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のｐｈａｓｉｎをコードするｐｈａＰ１遺伝子のプロモーターなどと、配列番号６に記載のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のｐｈａＣ１遺伝子のＳＤ配列（ＲＥＰ−ＳＤ）やその改変体とを組み合わせて使用することもできるし、配列番号３に記載のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のｐｈａＣＡＢオペロンの発現調節配列や、その他任意の公知の発現調節配列を利用することもできる。さらに、上記の発現調節配列に対し、塩基の欠失、置換、挿入により改変を加えた発現調節配列も使用することもできる。本発明においては、使用する上記発現調節配列を適宜選択することで、それぞれのＰＨＡ合成酵素の細胞内存在量を調整し、得られるＰＨＡ各成分の生産量とその割合をコントロールすることができる。

【0027】

本発明の微生物は、さらに、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子を有していることが好ましく、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼが強化されていることがより好ましい。Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼを強化する方法としては特に限定されないが、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の発現を強化する方法が好ましい。Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の発現を強化する方法としては、例えば宿主が有するＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子のプロモーターを強発現プロモーターに置換しても良いし、強発現プロモーターを遺伝子の上流に挿入しても良いし、プロモーターを一部改変して発現を強化しても良い。あるいは、プラスミドで保持する形式、または染色体の任意の位置に導入する形式によって、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子を宿主に導入しても良い。ただしプラスミドで保持する形式の場合、培養中にプラスミドが脱落する可能性があるため、染色体上に保持する形式がより好ましい。この際、導入するＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子は、宿主由来であっても良いし、宿主以外の生物由来であっても良いし、あるいはそれらの遺伝子を人工的に改変した遺伝子であっても良いし、導入する遺伝子が複数あっても良い。例えば、宿主がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである場合、染色体上にはＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子としてｐｈａＪ４ａ、ｐｈａＪ４ｂ、ｐｈａＪ４ｃの３つが存在するが、これら３つのうち１つまたは複数についてその発現を強化することができる。発現を強化する方法の一例として、ｐｈａＪ４ｂの直上流に強発現プロモーターとＳＤ配列からなる発現調節配列を挿入する方法がある。ここで使用する発現調節配列としては、例えば配列番号３に記載のｐｈａＣＡＢオペロンの発現調節配列を用いることができる。あるいは、配列番号４に記載のｔｒｐプロモーターあるいは配列番号５記載のｔｒｃプロモーターを、配列番号６記載のＳＤ配列と連結して用いても良い。これらＤＮＡの導入、挿入、又は置換の方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、宿主となる微生物の染色体上に存在するＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の直上流にあるプロモーターを置換、あるいは直上流に別のプロモーターを挿入するには、相同組換え法等が利用できる。

【0028】

本発明の微生物において、宿主は特に限定されないが、一例としてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（アシネトバクター）属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（アルカリゲネス）属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ（アロクロマチウム）属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（アゾリゾビウム）属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ（アゾトバクター）属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（バークホルデリア）属、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ（カウロバクター）属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（クロモバクテリウム）属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ（コマモナス）属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ（エクトチオロドスピラ）属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（クレブシエラ）属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（メチロバクテリウム）属、Ｎｏｃａｒｄｉａ（ノカルディア）属、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ（パラコッカス）属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（ラルストニア）属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（リゾビウム）属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ（ロドバクター）属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ（ロドスピリルム）属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ（リケッチア）属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス）属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（シノリゾビウム）属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ（スフィンゴモナス）属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（シネコシスティス）属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ（チオコッカス）属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ（チオキスチス）属、Ｖｉｂｒｉｏ（ビブリオ）属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ（ウォーテルシア）属、Ｚｏｏｇ／Ｌｏｅａ（ゾオグ／ロエア）属に属する微生物を宿主として用いることが好ましい。宿主とする微生物としては、この中でもＡｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属等に属する微生物がより好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属に属する微生物がより好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物がさらにより好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒが特に好ましい。

【0029】

本発明の微生物を培養することにより、当該微生物の細胞内に、融点が互いと異なる３種類以上のＰＨＡを生産させ、菌体からＰＨＡを回収することで、これら融点が互いと異なる３種類以上のＰＨＡを含むＰＨＡ混合品を製造することができる。

【0030】

培養時の炭素源としては、本発明のＰＨＡ生産微生物が資化可能であればどんな炭素源でも使用可能であるが、好ましくは、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類；パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体等が好ましい。より好ましくは、パーム油、パーム核油などの植物油脂のほか、パーム油やパーム核油を分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレインやパーム核油オレイン、また特に食糧との競合を避ける観点から、ＰＦＡＤ（パーム油脂肪酸蒸留物）やＰＫＦＡＤ（パーム核油脂肪酸蒸留物）、菜種油の脂肪酸蒸留物といった油脂の精製副産物等が挙げられる。

【0031】

本発明のＰＨＡの生産においては、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。窒素源としては、例えばアンモニア、尿素、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。

【0032】

培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、使用する微生物において通常使用されるような培養条件でよい。

【0033】

本発明において、菌体からのＰＨＡ混合品の回収方法は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡ混合品を抽出する。このＰＨＡ混合品を含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体由来の不溶物を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡ混合品を沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡ混合品を回収する。

【0034】

一般に、ＰＨＡ合成酵素はダイマーとして機能することが知られている。本発明の微生物は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の２種類以上のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有するため、ＰＨＡ合成酵素ダイマーとしては、同じＰＨＡ合成酵素２分子からなるホモダイマーだけでなく、異なる２種類のＰＨＡ合成酵素が組み合わされた１種類以上のヘテロダイマーも形成可能である。その場合、それぞれのＰＨＡ合成酵素ダイマーは異なる基質特異性を有するため、本発明の微生物を培養することによって生産されるＰＨＡは、共重合比率の異なる３種以上のＰＨＡ混合品（以下、「本発明のＰＨＡ混合品」と略す）となる。このようなＰＨＡ混合品は、一般に、融点の異なる３種類以上のＰＨＡを含む。これらＡｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素により作られたＰＨＡとしては、少なくとも３ＨＢと３ＨＨをモノマーユニットとして含有する共重合ＰＨＡであるのが好ましい。

【0035】

一方、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の生物由来のＰＨＡ合成酵素とはダイマーを形成しない。そのため、本発明の微生物がＡｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の生物由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子をさらに有する場合には、上記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素により作られたＰＨＡとは異なる融点を持つ別のＰＨＡも生産されることとなる。この場合のＡｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の生物由来のＰＨＡ合成酵素により作られたＰＨＡとしては、３ＨＢのホモポリマーであるＰＨＢであっても良いし、ＰＨＢＨやＰＨＢＶなどの共重合ＰＨＡであっても良いが、ＰＨＢであるのが好ましい。

【0036】

本発明のＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち、最も融点の高いＰＨＡ（Ａ）は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素により作られた共重合ＰＨＡであっても良いし、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属とは異なる属の生物由来のＰＨＡ合成酵素により作られたＰＨＢあるいは共重合ＰＨＡであっても良い。ＰＨＡ（Ａ）が共重合ＰＨＡである場合、ＰＨＡ（Ａ）はＰＨＢＨであってもＰＨＢＶであっても、それ以外の共重合体であっても良いが、ＰＨＡ（Ａ）は、モノマーユニットとして３ＨＢを９５モル％以上含むものが好ましく、３ＨＢを９７モル％以上含むものがより好ましく、３ＨＢを９９モル％以上含むものがさらに好ましい。また、ＰＨＡ（Ａ）は、１６０℃以上に融点を有するものが好ましいが、ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡ（Ａ）の含有量が低い場合は、通常のＤＳＣにおいては明確な吸熱ピークを有さないこともある。その場合、ＰＨＡ混合品を後述の実施例の方法に準じて１６０℃でアニール処理し、その後のＤＳＣにおいて１６０〜１８５℃に吸熱ピークを呈するＰＨＡであるのが好ましい。

【0037】

本発明のＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち、最も融点の低いＰＨＡ（Ｂ）は、共重合ＰＨＡであることが好ましく、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素により作られた共重合ＰＨＡであることがより好ましく、少なくとも３ＨＢと３ＨＨをモノマーユニットとして含有する共重合ＰＨＡであるのがさらに好ましい。その場合、ＰＨＡ（Ｂ）は、モノマーユニットとして３ＨＨを７モル％以上含むものが好ましく、３ＨＨを８モル％以上含むものがより好ましく、３ＨＨを１０モル％以上含むものがさらに好ましい。また、ＰＨＡ（Ｂ）は、モノマーユニットとして３ＨＢを８０モル％以上含むものが好ましい。なお、ＰＨＡ（Ｂ）は、３ＨＢと３ＨＨ以外に、３−ヒドロキシプロピオン酸、３ＨＶ、４−ヒドロキシ酪酸などをモノマーユニットとして含んでいても良いが、ＰＨＢＨであるのがより好ましい。ＰＨＡ（Ｂ）は、ＤＳＣにおいて９０〜１３５℃に吸熱ピークを呈するＰＨＡであることが好ましい。

【0038】

本発明のＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡのうち、ＰＨＡ（Ａ）の融点とＰＨＡ（Ｂ）の融点の中間にある融点を示すＰＨＡ（Ｃ）は、共重合ＰＨＡであることが好ましく、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素により作られた共重合ＰＨＡであることがより好ましく、少なくとも３ＨＢと３ＨＨをモノマーユニットとして含有する共重合ＰＨＡであることがさらに好ましい。なお、ＰＨＡ（Ｃ）は１種類でもよく、２種類以上の混合物であっても良い。ＰＨＡ（Ｃ）は（混合物である場合はその全体として）、モノマーユニットとして３ＨＢを９０モル％以上含むものが好ましく、３ＨＢを９２モル％以上含むものがより好ましく、３ＨＢを９３モル％以上含むものがさらに好ましい。また、ＰＨＡ（Ｃ）は、モノマーユニットとして３ＨＨを３モル％以上含むものが好ましく、３ＨＨを４モル％以上含むものがより好ましく、３ＨＨを５モル％以上含むものがさらに好ましい。ＰＨＡ（Ｃ）は、３ＨＢと３ＨＨ以外に、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシ酪酸などをモノマーユニットとして含んでいても良い。ＰＨＡ（Ｃ）は、ＰＨＡ（Ａ）とＰＨＡ（Ｂ）の中間的な融点として通常１３６〜１５５℃の間に融点を有するが、ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡ（Ｃ）の含有量が低い場合は、通常のＤＳＣにおいては明確な吸熱ピークを有さないこともある。その場合、ＰＨＡ混合品を後述の実施例の方法に準じて１３０℃でアニール処理し、その後のＤＳＣにおいて１３６〜１５５℃に吸熱ピークを呈するＰＨＡであることが好ましい。

【0039】

本発明のＰＨＡ混合品において、最も融点の低いＰＨＡ（Ｂ）が主要なポリマー成分を形成する。最も融点の高いＰＨＡ（Ａ）の含有量は特に限定されないが、ＰＨＡ（Ａ）、ＰＨＡ（Ｂ）及びＰＨＡ（Ｃ）の合計を１００重量％とした時に、０．０１〜１０重量％が好ましく、０．０５〜８重量％がより好ましい。中間的な融点を有するＰＨＡ（Ｃ）の含有量も特に限定されないが、ＰＨＡ（Ａ）、ＰＨＡ（Ｂ）及びＰＨＡ（Ｃ）の合計を１００重量％とした時に、１〜３０重量％が好ましく、２〜２５重量％がより好ましい。

【0040】

本発明により生産されるＰＨＡ混合品は、結晶化速度が改善されたものであるが、その他の添加剤、例えば酸化防止剤、紫外線吸収剤、染料・顔料などの着色剤、可塑剤、滑剤、無機充填剤、帯電防止剤、防カビ剤、抗菌剤、発泡剤、難燃剤等を必要に応じて含有することができる。また、他の結晶核剤を含有してもよい。

【0041】

以上のようにして得られる樹脂組成物を成形加工することにより成形体を製造することができる。成形加工方法としては従来公知の方法でよく、例えば射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などが挙げられる。なお、本発明の製造方法によって得られるＰＨＡ混合品は、結晶化速度が改善されているだけでなく、融点の異なる３種類以上のＰＨＡが分子レベルで分散しているため、共重合ＰＨＡと結晶核剤となる高融点ＰＨＡをそれぞれ個別に生産してブレンドした場合に比べて、より簡易な方法で結晶核剤を微細に分散させられるだけでなく、より低い温度、例えば１７０℃以下の温度で成形加工することも可能である。

【0042】

前記成形体は、例えば各種容器、包装材、農園芸用のフィルム、医療材料等に用いることが出来る。

【実施例】

【0043】

以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、菌株の育種、ＰＨＡのモノマー組成分析、結晶化の評価方法は以下の通りである。

【0044】

（菌株の育種）
本明細書の実施例、製造例、参考例、および比較例における遺伝子操作は、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ． ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，J．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている方法で行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主などは市場の供給者から購入し、その取扱説明書にしたがって使用することができる。なお、実施例等に用いられる酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。

【0045】

（ＰＨＡに含まれるモノマーユニットの共重合比率の分析）
得られたＰＨＡのモノマー組成分析はガスクロマトグラフィーによって測定した。得られたＰＨＡあるいはその混合品約２０ｍｇに２ｍＬの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍＬのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することによってメチルエステル化した。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍＬのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中の３ＨＢメチルエステルと３ＨＨメチルエステルの組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析し、３ＨＨモノマー比率を算出した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μＬを注入した。温度条件は、初発温度１００℃から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００℃から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。なお、この分析方法により測定されるモノマーユニットの共重合比率は、ＰＨＡ混合品に含まれるＰＨＡ全体の平均値となる。

【0046】

（ＰＨＡの結晶化の評価）
得られたＰＨＡの結晶化は、示差走査熱量計（エスアイアイ・ナノテクノロジー（株）製ＤＳＣ２２０）を用いて測定を行うことにより評価した。示差走査熱量測定において、２〜５ｍｇのＰＨＡ又はその混合品を２５℃から１７０℃まで１０℃／分で昇温して５分間保持したあと、１７０℃から２５℃まで１０℃／分で冷却した。その後、２５℃で５分間保持した後、再度１７０℃まで１０℃／分で昇温した。冷却時に得られた発熱曲線における結晶化ピーク温度（Ｔｃ）および結晶化発熱量（Ｈｃ）から結晶化のし易さを評価した。結晶化ピーク温度（Ｔｃ）が高く、結晶化発熱量（Ｈｃ）が大きいほど結晶化が優れている。

【0047】

（融点９０〜１３５℃のＰＨＡ成分の融点の測定）
培養後精製して得られたＰＨＡに含まれる低融点成分の融点を以下の方法で測定した。示差走査熱量測定において、２〜５ｍｇのＰＨＡ又はその混合品を２５℃から１７０℃まで１０℃／分で昇温して５分間保持したあと、１７０℃から２５℃まで１０℃／分で冷却した。その後、２５℃で５分間保持した後、再度１７０℃まで１０℃／分で昇温した。２回目の昇温時に得られた吸熱曲線において、９０〜１３５℃にピークトップがあるピークを低融点成分とし、そのピークトップ温度を融点（Ｔｍ−Ｌｏｗ）とした。

【0048】

（アニール法による融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の融点及び含量の測定）
培養後精製して得られたＰＨＡについて、示差走査熱量計を用いて以下の方法でアニール法による評価を行った。

【0049】

ＤＳＣにおいて、４．５〜５．５ｍｇのＰＨＡ又はその混合品を、２３℃から１６０℃まで１０℃／分の速度で昇温し、１６０℃で３０分保持してアニール処理を行った後に、２３℃まで１０℃／分の速度で降温し、その後、２３℃から２００℃まで１０℃／分の速度で昇温したときのＤＳＣ曲線を得た。当該２回目の昇温時に得られたＤＳＣ曲線において、１６０〜１８５℃にピークトップを有する吸熱ピークについて、吸熱ピーク熱量を測定した。またそのピークトップ温度を、高融点成分の融点（Ｔｍ−Ｈｉｇｈ）とした。

【0050】

上記方法で測定した吸熱ピーク熱量を、別途作成した検量線と比較することにより、ＰＨＡ混合品中に含まれる融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の含量を推定した。検量線の作成方法を以下に示す。

【0051】

後述する比較例１と同様の方法で、ＰＨＢＨ（３ＨＨ共重合比率１０．４モル％）を生産した。また、同じく比較例３と同様の方法で、ＰＨＢを生産した。次に、得られたＰＨＢＨとＰＨＢを混合し、次の様にして共生産品を擬似的に再現したＰＨＢＨ／ＰＨＢ混合品を作製した。まずＰＨＢＨとＰＨＢをそれぞれクロロホルムに１０ｇ／Ｌの濃度で溶かし、各ポリマー溶液を得た。次にＰＨＢＨとＰＨＢの重量比が９０：１０となるように、各ポリマー溶液を混合した。ヘキサン４００ｍＬに対して、攪拌しながら穏やかに混合ポリマー溶液１００ｍＬを添加した。析出したポリマーを濾過分別し、６０℃で乾燥してＰＨＢＨ／ＰＨＢ混合品を得た。同様の方法で、ＰＨＢＨとＰＨＢの重量比が９３：７、８５：１５、８０：２０であるＰＨＢＨ／ＰＨＢ混合品を得た。得られた４種のＰＨＢＨ／ＰＨＢ混合品についてＤＳＣを行い、１６０℃より高い部分の融解熱量を測定した。得られた１６０℃より高い部分の融解熱量の結果から、ＰＨＡ混合品中のＰＨＢ含量を推定するための検量線を作成した。

【0052】

（アニール法による融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の融点及び含量の測定）
培養後精製して得られたＰＨＡについて、示差走査熱量計を用いて以下の方法でアニール法による評価を行った。

【0053】

ＤＳＣにおいて、４．５〜５．５ｍｇのＰＨＡ又はその混合品を、２３℃から１３０℃まで１０℃／分の速度で昇温し、１３０℃で３０分保持してアニール処理を行った後に、２３℃まで１０℃／分の速度で降温し、その後、２３℃から２００℃まで１０℃／分の速度で昇温したときのＤＳＣ曲線を得た。当該２回目の昇温時に得られたＤＳＣ曲線において、１３６〜１５５℃にピークトップを有する吸熱ピークについて、吸熱ピーク熱量を測定した。またそのピークトップ温度を、中融点成分の融点（Ｔｍ−Ｍｉｄ）とした。

【0054】

上記方法で測定した吸熱ピーク熱量を、別途作成した検量線と比較することにより、ＰＨＡ混合品中に含まれる融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の含量を推定した。検量線の作成方法を以下に示す。

【0055】

後述する比較例１と同様の方法で、ＰＨＢＨ−Ａ（３ＨＨ共重合比率１０．４モル％）を生産した。また、同じく比較例２と同様の方法で、ＰＨＢＨ−Ｂ（３ＨＨ共重合比率５．０モル％）を生産した。次に、得られたＰＨＢＨ−Ａについて、上記分析方法で融点１３６〜１５５℃にピークトップを有する吸熱ピークの熱量を測定した。同様に、ＰＨＢＨ−Ｂについても融点１３６〜１５５℃にピークトップを有する吸熱ピークの熱量を測定した。ＰＨＢＨ−Ａに含まれる融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の含量が０重量％、ＰＨＢＨ−Ｂに含まれる融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の含量が１００重量％となると仮定し、検量線を作成した。

【0056】

（製造例１）ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製
まず、染色体上のｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流にｐｈａＪ４ｂ遺伝子の発現を強化するための発現調節配列を挿入することを目的とし、発現調節配列挿入用プラスミドを作製した。Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７および配列番号８で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いた。同様に配列番号９および配列番号１０で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。さらに同様に、配列番号１１および配列番号１２で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号７および配列番号１０で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られた断片をＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼ（東洋紡社製）を用いて連結し、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子より上流のＤＮＡ配列、ｐｈａＣ１プロモーターとｐｈａＣ１ＳＤ配列からなる発現調節配列、およびｐｈａＪ４ｂ遺伝子配列を有する発現調節配列挿入用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂを作製した。

【0057】

次に発現調節配列挿入株を作製した。発現調節配列挿入用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂを大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）に導入し、ＫＮＫ−００５ ΔｐｈａＺ１，２，６株（国際公開第２０１４／０６５２５３号参照）とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。ＫＮＫ−００５ ΔｐｈａＺ１，２，６株は、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株を宿主とし、配列番号１３に記載の塩基配列を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、ＰＨＡ分解酵素をコードする遺伝子であるｐｈａＺ１、ｐｈａＺ２、およびｐｈａＺ６が破壊された菌株である。

【0058】

上記接合伝達後の菌株から、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育する菌株を選択し、前記プラスミドがＫＮＫ−００５ ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で２世代培養した後、１５％のショ糖を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地で生育する菌株を選択した。得られた菌株からｐｈａＪ４ｂ遺伝子の直上流に、ｐｈａＣ１プロモーターとｐｈａＣ１ＳＤ配列からなる発現調節配列が挿入されたものをＰＣＲにより選別し、うち１株をＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６株は、染色体上のｐｈａＺ１，およびｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失し、ｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号１３に記載の塩基配列を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の直上流にｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰプロモーター）とｐｈａＣ１ＳＤ（ＲＥＰ−ＳＤ）配列からなる発現調節配列が挿入された菌株である。

【0059】

（製造例２）ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株の作製
製造例１で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６株のｐｈａＺ１遺伝子を欠失した領域に、ＰＨＢ生産用の遺伝子発現カセットを導入することを目的とし、ＤＮＡ挿入用プラスミドを作製した。まずＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４および配列番号１５で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。同様に配列番号１６および配列番号１７で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１４および配列番号１７で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られた断片をＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐｈａＺ１遺伝子より上流のＤＮＡ配列、配列番号１８記載のＤＮＡ配列、およびｐｈａＺ１遺伝子より下流のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬを作製した。

【0060】

次に、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９および配列番号２０で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。得られた断片をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬをＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐｈａＺ１遺伝子より上流のＤＮＡ配列、配列番号２１記載の改変ＳＤ配列ＲＥＰ−ＳＤＭからなる発現調節配列、ｐｈａＣ_Ｒｅ遺伝子配列、およびｐｈａＺ１構造遺伝子より下流のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬ−ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅを作製した。

【0061】

次にｐＣＲ(R)２．１−ＴＯＰＯ(R)（インビトロジェン社製）を鋳型とし、配列番号２２および配列番号２３で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。同様に配列番号２４および配列番号２５で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２２および配列番号２５で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られた断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬ−ＳＤＭ−ｐｈａＣ_ＲｅをＭｕｎＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐｈａＺ１遺伝子より上流のＤＮＡ配列、ｌａｃＮ１５プロモーターおよびＲＥＰ−ＳＤＭからなる発現調節配列、ｐｈａＣ_Ｒｅ遺伝子配列、およびｐｈａＺ１遺伝子より下流のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬ−ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅを作製した。なおｌａｃＮ１５プロモーターは配列番号３２に記載の塩基配列を有し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のｌａｃプロモーターのスペーサー領域に改変を加えて発現強度を弱めた変異型プロモーターである。

【0062】

上記発現調節配列の挿入時と同様の方法で、ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬ−ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅを用いてｐｈａＺ１遺伝子欠失領域にＰＨＢ生産用の遺伝子発現カセットを挿入した。得られた株はＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株と命名した。ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株は、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６を全長欠失し、ｐｈａＺ２伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の直上流にＲＥＰプロモーターおよびＲＥＰ−ＳＤ配列からなる発現調節配列が挿入され、ｐｈａＺ１遺伝子を欠失した領域にｌａｃＮ１５プロモーター、ＲＥＰ−ＳＤＭ配列、およびＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子であるｐｈａＣ_Ｒｅ構造遺伝子配列が挿入され、染色体上に配列番号１３に記載の塩基配列を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する菌株である。

【0063】

（製造例３）ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株の作製
製造例１で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６株のｐｈａＺ１遺伝子を欠失した領域に、ＰＨＢ生産用の遺伝子発現カセットを導入することを目的とし、ＤＮＡ挿入用プラスミドを作製した。まず、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２６および配列番号２０で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。得られた断片をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、製造例１で作製したｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬをＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐｈａＺ１遺伝子より上流のＤＮＡ配列、配列番号６記載のＳＤ配列ＲＥＰ−ＳＤからなる発現調節配列、ｐｈａＣ_Ｒｅ遺伝子配列、およびｐｈａＺ１構造遺伝子より下流のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬ−ＳＤ−ｐｈａＣ_Ｒｅを作製した。

【0064】

次にｐＣＲ(R)２．１−ＴＯＰＯ(R)を鋳型とし、配列番号２７および配列番号２５で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られた断片をＥｃｏＲＩとＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬ−ＳＤ−ｐｈａＣ_ＲｅをＭｕｎＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐｈａＺ１遺伝子より上流のＤＮＡ配列、ｌａｃプロモーターおよびＲＥＰ−ＳＤからなる発現調節配列、ｐｈａＣ_Ｒｅ遺伝子配列、およびｐｈａＺ１遺伝子より下流のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬ−Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅを作製した。

【0065】

製造例１と同様の方法で、ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｄＺ１ＵＬ−Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅを用いてｐｈａＺ１遺伝子欠失領域にＰＨＢ生産用の遺伝子発現カセットを挿入した。得られた株はＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株と命名した。ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株は、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６を全長欠失し、ｐｈａＺ２伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の直上流にＲＥＰプロモーターおよびＲＥＰ−ＳＤ配列からなる発現調節配列が挿入され、ｐｈａＺ１遺伝子を欠失した領域にｌａｃプロモーター、ＲＥＰ−ＳＤ配列、およびｐｈａＣ_Ｒｅ構造遺伝子配列が挿入され、染色体上に配列番号１３に記載の塩基配列を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する菌株である。

【0066】

（製造例４）ｐｈａＣ_Ａｃ発現用プラスミド、ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃの作製
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来の野生型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子ｐｈａＣ_Ａｃを発現するためのプラスミドを作製した。まず、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２８および配列番号２９で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。次に、Ａ． ｃａｖｉａｅ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３０および配列番号３１で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２８および配列番号３１で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られた断片をＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで消化した。このＤＮＡ断片を、特開２００７−２５９７０８号公報記載のｐＣＵＰ２ベクターをＭｕｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ＲＥＰプロモーターおよびＲＥＰ−ＳＤからなる発現調節配列、ｐｈａＣ_Ａｃ遺伝子配列を有するｐｈａＣ_Ａｃ発現用プラスミドｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃを作製した。

【0067】

（製造例５）製造例１記載のＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とする、ｐｈａＣ_Ａｃ発現用プラスミド導入株の作製
製造例１で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地で一晩培養した。得られた培養液０．５ｍＬをＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地１００ｍＬに接種し、３０℃で３時間培養した。得られた培養液を氷上で速やかに冷却し、菌体を回収して氷冷した蒸留水で良く洗浄した後、得られた菌体を２ｍＬの蒸留水に懸濁した。菌体液を製造例４で作製したｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃプラスミド溶液と混合し、キュベットに注入してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（バイオ・ラッド社製）を使用し、電圧１．５ｋＶ、抵抗８００Ω、電流２５μＦの条件で行った。エレクトロポレーション後、菌体溶液を回収して５ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地を添加し、３０℃で３時間培養した。得られた培養液を、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地に塗布した。３０℃で３日間培養し、得られたコロニーからｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃが導入された菌株を取得した。得られた菌株を、ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株と命名した。

【0068】

（製造例６）製造例２記載のＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株を親株とする、ｐｈａＣ_Ａｃ発現用プラスミド導入株の作製
製造例５と同様の方法で、製造例２で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株に、製造例４で作製したｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃを導入した。得られた菌株を、ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株と命名した。

【0069】

（製造例７）製造例３記載のＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株を親株とする、ｐｈａＣ_Ａｃ発現用プラスミド導入株の作製
製造例５と同様の方法で、製造例３で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株に、製造例４で作製したｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃを導入した。得られた菌株を、ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株と命名した。

【0070】

（参考例１）ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株による、ＰＨＡ混合品の生産
製造例２で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株を以下の条件で培養、精製し、ＰＨＡ混合品を生産した。得られたＰＨＡ混合品について、モノマーユニットの共重合比率を測定し、かつアニール法により、融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の推定含有量、および融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の推定含有量を算出した。結果を表１に示した。また、得られたＰＨＡ混合品について結晶化速度の評価を行い、結果を表２に示した。

【0071】

（培養）
菌株は以下のように培養した。

【0072】

種培地の組成は、１０ｇ／Ｌ 肉エキス、１０ｇ／Ｌ バクトトリプトン、２ｇ／Ｌ イーストエキス、９ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．５ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、ｐＨ６．８とした。

【0073】

前培養培地の組成は、１１ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．９ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、１２．９ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、５ｍＬ／Ｌ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１６ｇ／Ｌ 塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、１０ｇ／Ｌ 塩化カルシウム二水和物、０．２ｇ／Ｌ 塩化コバルト六水和物、０．１６ｇ／Ｌ 硫酸銅五水和物、０．１２ｇ／Ｌ 塩化ニッケル六水和物を溶かしたもの）、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンとした。炭素源には、パームダブルオレイン油を２５ｇ／Ｌの濃度で用いた。

【0074】

ＰＨＡ生産培地の組成は、５．７８ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．０１ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、４．３７ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム、１．５ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、７．５ｍＬ／Ｌ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１６ｇ／Ｌ 塩化鉄（ＩＩ）六水和物、１０ｇ／Ｌ 塩化カルシウム二水和物、０．２ｇ／Ｌ 塩化コバルト六水和物、０．１６ｇ／Ｌ 硫酸銅五水和物、０．１２ｇ／Ｌ 塩化ニッケル六水和物を溶かしたもの）とした。炭素源はパームシングルオレイン油を用いた。

【0075】

各菌株のグリセロールストック５０μＬを種培地１０ｍｌに接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０％（ｖ／ｖ）接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／分とし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールしながら、２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

【0076】

ＰＨＡ生産培養は以下のように行った。まず２ＬのＰＨＡ生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を２５％（ｖ／ｖ）接種した。運転条件は、培養温度３２℃、攪拌速度４５０ｒｐｍ、通気量３．０Ｌ／分とし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は４５〜５４時間行った。

【0077】

（精製）
培養終了時に、培養ブロスをサンプリングし、遠心分離によって菌体を回収、エタノールで洗浄後真空乾燥し、乾燥菌体を取得した。

【0078】

得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣を濾別し、エバポレーターで総容量が３０ｍＬになるまで濃縮後、９０ｍＬのヘキサンに対し上記濃縮液を徐々に添加し、１時間穏やかに攪拌した。析出したＰＨＡを濾別後、５０℃で３時間真空乾燥し、精製ＰＨＡとして取得した。

【0079】

（参考例２）ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株による、ＰＨＡ混合品の生産
ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株に代えて、製造例３で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株を用いて、参考例１と同様の方法でＰＨＡ混合品を生産した。得られたＰＨＡ混合品について、モノマーユニットの共重合比率を測定し、かつアニール法により、融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の推定含有量、および融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の推定含有量を算出した。結果を表１に示した。また、得られたＰＨＡ混合品について結晶化速度の評価を行い、結果を表２に示した。

【0080】

（実施例１）ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株による、ＰＨＡ混合品の生産
ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株に代えて、製造例５で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株を用いて、参考例１と同様の方法でＰＨＡ混合品を生産した。ただし、種培地としてカナマイシン硫酸塩を５０ｍｇ／Ｌとなるよう添加したものを使用した。得られたＰＨＡ混合品について、モノマーユニットの共重合比率を測定し、かつアニール法により、融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の推定含有量、および融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の推定含有量を算出した。結果を表１に示した。また、得られたＰＨＡ混合品について結晶化速度の評価を行い、結果を表２に示した。

【0081】

（実施例２）ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ，ΔｐｈａＺ２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株による、ＰＨＡ混合品の生産
ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株に代えて、製造例６で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡ混合品を生産した。得られたＰＨＡ混合品について、モノマーユニットの共重合比率を測定し、かつアニール法により、融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の推定含有量、および融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の推定含有量を算出した。結果を表１に示した。また、得られたＰＨＡ混合品について結晶化速度の評価を行い、結果を表２に示した。

【0082】

（実施例３）ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ，ΔｐｈａＺ２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株による、ＰＨＡ混合品の生産
ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株に代えて、製造例７で作製したＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：Ｐｌａｃ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６／ｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＣ_Ａｃ株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡ混合品を生産した。得られたＰＨＡ混合品について、モノマーユニットの共重合比率を測定し、かつアニール法により、融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の推定含有量、および融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の推定含有量を算出した。結果を表１に示した。また、得られたＰＨＡ混合品について結晶化速度の評価を行い、結果を表２に示した。

【0083】

（比較例１）ＫＮＫ−６３１株による、ＰＨＢＨの生産
培養生産にはＫＮＫ−６３１株（国際公開第２００９／１４５１６４号参照）を用いた。
培養は以下のように行った。

【0084】

種母培地の組成は１０ｇ／Ｌ 肉エキス、１０ｇ／Ｌ バクトトリプトン、２ｇ／Ｌ イーストエキス、９ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．５ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、ｐＨ６．８、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン硫酸塩とした。

【0085】

前培養培地の組成は１１ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．９ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、１２．９ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、２５ｇ／Ｌ パーム核油オレイン、５ｍＬ／Ｌ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１６ｇ／Ｌ 塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、１０ｇ／Ｌ 塩化カルシウム二水和物、０．２ｇ／Ｌ 塩化コバルト六水和物、０．１６ｇ／Ｌ 硫酸銅五水和物、０．１２ｇ／Ｌ 塩化ニッケル六水和物を溶かしたもの。）、とした。

【0086】

ＰＨＡ生産培地の組成は３．８５ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム１２水和物、０．６７ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、２．９１ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、５ｍＬ／Ｌ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１６ｇ／Ｌ 塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、１０ｇ／Ｌ 塩化カルシウム二水和物、０．２ｇ／Ｌ 塩化コバルト六水和物、０．１６ｇ／Ｌ 硫酸銅五水和物、０．１２ｇ／Ｌ 塩化ニッケル六水和物を溶かしたもの。）、０．５ｇ／Ｌ ＢＩＯＳＰＵＭＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。炭素源としてはパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを用いた。流加用のリン酸塩水溶液としては、４０ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム１２水和物、６．９ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、となるよう調製したものを用いた。

【0087】

ＫＮＫ−６３１株のグリセロールストック（５０μＬ）を種母培地（１０ｍＬ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０％（ｖ／ｖ）接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／分とし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

【0088】

次に、ＰＨＡの生産培養は４．３ＬのＰＨＡ生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０％（ｖ／ｖ）接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量６Ｌ／分とし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は培養全般を通じ、パーム核油オレインを、比基質供給速度が０．１〜０．１２（ｇ油脂）×（ｇ正味乾燥菌体重量）^−１×（ｈ）^−１となるように流加した。ここで、比基質供給速度とは、単位時間に正味の菌体重量あたり供給される油脂の量、つまり、正味の乾燥菌体重量あたりの油脂流加速度として定義される培養変数である。また、正味の乾燥菌体重量とは、全乾燥菌体重量から含有するポリエステル重量を差し引いた乾燥菌体重量である。すなわち、比基質供給速度は以下の式より求められる値である。
比基質供給速度＝油脂流加速度（ｇ／ｈ）／正味の乾燥菌体重量（ｇ）＝単位時間あたりの油脂の供給量（ｇ／ｈ）／（全乾燥菌体重量（ｇ）−ポリエステル含有量（ｇ））
また、リン酸塩水溶液を培養２０時間目以降、Ｃ／Ｐ比が６００〜８００となるような流速にて連続的に添加した。培養は約６４時間行った。これによりＰＨＡを生産した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニットの共重合比率を測定し、かつアニール法により、融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の推定含有量、および融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の推定含有量を算出した。結果を表１に示した。また、得られたＰＨＡについて結晶化速度の評価を行い、結果を表２に示した。

【0089】

（比較例２）ＫＮＫ−００５株による、ＰＨＢＨの生産
ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株に代えて、ＫＮＫ−００５株（米国特許第７３８４７６６号公報参照）を用いて、参考例１と同様の方法でＰＨＢＨを生産した。得られたＰＨＢＨについて、モノマーユニットの共重合比率を測定し、かつアニール法により、融点１３６〜１５５℃のＰＨＡ成分の推定含有量、および融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の推定含有量を算出した。結果を表１に示した。

【0090】

（比較例３）Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株による、ＰＨＢの生産
ＫＮＫ−００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ ΔｐｈａＺ１：：ＰｌａｃＮ１５ＳＤＭ−ｐｈａＣ_Ｒｅ ΔｐｈａＺ２，６株に代えて、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株を用いて、参考例１と同様の方法でＰＨＢを生産した。得られたＰＨＢについて、平均モノマー共重合比率を測定し、かつアニール法により、融点１３６〜１５５℃のＰＨＡの推定含有量、および融点１６０〜１８５℃のＰＨＡ成分の推定含有量を算出した。結果を表１に示した。

【0091】

【表1】

【0092】

【表2】

【0093】

まず表１について、参考例１および参考例２の結果から、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来の１種類のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子と、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を共発現した場合には、融点１１０℃付近の低融点ＰＨＡ成分と、融点１６０℃以上の高融点ＰＨＡ成分が共生産されるが、融点１３６〜１５５℃の中融点ＰＨＡ成分は生産されなかった。

【0094】

一方、実施例１〜３の結果から、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の基質特異性の異なる２種類のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を共発現した場合（実施例１）、あるいはこれら２種類のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子に加えてＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子もさらに共発現した場合（実施例２および実施例３）には、低融点ＰＨＡ成分および高融点ＰＨＡ成分に加え、中融点ＰＨＡ成分も生産されることが明らかとなった。

【0095】

また、ＰＨＡの結晶化評価結果について、表２に示した。まず、低融点ＰＨＡ成分および高融点ＰＨＡ成分を共生産した場合（参考例１および参考例２）には、低融点ＰＨＡ成分を生産した比較例１と比べて、Ｔｃの上昇、およびＨｃの増加が認められた。このことから、低融点ＰＨＡ成分および高融点ＰＨＡ成分を共生産すると、ＰＨＢＨの結晶化が速くなることがわかる。

【0096】

一方、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来で、基質特異性の異なる２種類のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を共発現した場合（実施例１）には、融点の異なる３種のＰＨＢＨが生産され、比較例１と比べてＨｃの増加が認められた。このことから、融点の異なる３種のＰＨＢＨを共生産すると、ＰＨＢＨの結晶化が速くなることが明らかとなった。

【0097】

さらに、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来で、基質特異性の異なる２種類のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子に加えて、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子も共発現した場合（実施例２および実施例３）には、明らかなＴｃの上昇、およびＨｃの増加が認められた。特に、実施例２と実施例３の比較から、高融点ＰＨＡ成分の含量が少ない場合であっても、中融点ＰＨＡ成分の含量が多ければ、ＰＨＡの結晶化は速くなることが明らかとなった。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]