特許 6860902 微細藻類の培養方法及びデータ解析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6860902

(24)【登録日】2021年3月31日

(45)【発行日】2021年4月21日

(54)【発明の名称】微細藻類の培養方法及びデータ解析装置

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/12 20060101AFI20210412BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20210412BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALN20210412BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/12 A

   C12M1/34 A

   !C12Q1/06

【請求項の数】5

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2017-38263(P2017-38263)

(22)【出願日】2017年3月1日

(65)【公開番号】特開2018-143108(P2018-143108A)

(43)【公開日】2018年9月20日

【審査請求日】2020年1月23日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 発行者名：平成２８年度公益社団法人日本水産学会秋季大会、刊行物名：平成２８年度公益社団法人日本水産学会秋季大会 講演要旨集 第２１頁、発行年月日：平成２８年９月８日 主催者名：公益社団法人日本水産学会、集会名：平成２８年度公益社団法人日本水産学会秋季大会、開催日：平成２８年９月１０日

(73)【特許権者】

【識別番号】504258527

【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100168114

【弁理士】

【氏名又は名称】山中 生太

(74)【代理人】

【識別番号】100133592

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100162259

【弁理士】

【氏名又は名称】末富 孝典

(72)【発明者】

【氏名】小谷 知也

(72)【発明者】

【氏名】松井 英明

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−１７４０３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−２５２７６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Bioresource Technology，２０１４年，Vol.156，p.408-411

【文献】 Aquaculture，１９９８年，Vol.166，p.105-116

【文献】 平成２７年度公益社団法人日本水産学会春季大会講演要旨集，２０１５年 ３月２７日，p.167，１１３５番

【文献】 J. Appl. Phycol.，２００９年，Vol.21，p.361-366

【文献】 Applied spectroscopy，２０１６年，doi:10.1177/0003702816641270

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／１２

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｃ１２Ｑ １／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）のハプト藻類を培養する培養ステップと、
前記ハプト藻類の４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定ステップと、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じた後、前記値が再度下降から上昇に転じてから３〜５日後、又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じた後、前記値が再度上昇から下降に転じてから３〜５日後に前記ハプト藻類を収穫する収穫ステップと、
を含む、微細藻類の培養方法。

【請求項2】

前記測定ステップでは、
前記ハプト藻類を含む培養液の４９０ｎｍにおける第３の吸光度と６８０ｎｍにおける第４の吸光度とを測定し、
前記ハプト藻類が除去された前記培養液の４９０ｎｍにおける第５の吸光度と６８０ｎｍにおける第６の吸光度とを測定し、
前記収穫ステップにおける前記第１の吸光度は、前記第３の吸光度から前記第５の吸光度を減じた値であって、
前記収穫ステップにおける前記第２の吸光度は、前記第４の吸光度から前記第６の吸光度を減じた値である、
請求項１に記載の微細藻類の培養方法。

【請求項3】

前記ハプト藻類は、
イソクリシス・エスピー（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）タヒチ株である、
請求項１又は２に記載の微細藻類の培養方法。

【請求項4】

イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）のハプト藻類の４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定部と、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じた後、前記値が再度下降から上昇に転じたこと、又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じた後、前記値が再度上昇から下降に転じたことをユーザーに通知する通知部と、
を備えるデータ解析装置。

【請求項5】

イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）のハプト藻類の４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定部と、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じた後、前記値が再度下降から上昇に転じてから３〜５日経過後に、又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じた後に、前記値が再度上昇から下降に転じてから３〜５日経過後に、収穫時期であることを前記ユーザーに通知する通知部と、
を備えるデータ解析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微細藻類の培養方法及びデータ解析装置に関する。

【背景技術】

【0002】

イソクリシス・エスピー（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）タヒチ株（以下、単に「タヒチ株」ともいう）等のイソクリシス属のハプト藻類は、海産魚介類の種苗生産で使用されている有用微細藻類である。タヒチ株は、海産魚類仔魚の餌料である海産ツボワムシ類の餌料、あるいは貝類幼生体の餌料として使用される。

【0003】

タヒチ株は、硝酸塩及びリン酸塩等の栄養塩、ミネラル類並びにビタミン類が混合された培養液に接種され、最大密度になるまで培養される。接種から最大密度に達する期間は、培養時の環境によって異なる。達する最大密度も培養環境によって異なるため、培養中の細胞密度のみを目安に収穫時期を決めることは難しい。

【0004】

タヒチ株は高度不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を細胞内に含有している。ＤＨＡは海産魚類仔魚の必須脂肪酸の一つである。上記の海産ツボワムシ類はＤＨＡが欠乏している。このため、海産ツボワムシ類を仔魚に給餌する前に、タヒチ株を栄養強化用藻類として与えることで、海産ツボワムシ類のＤＨＡを強化することができる。タヒチ株の細胞内のＤＨＡ含量は培養中に変化する。タヒチ株を栄養強化用藻類として利用する場合、ＤＨＡ含量が最大のときにタヒチ株を収穫することが望ましい。しかし、ＤＨＡ含量を測定するには時間を要するため、ＤＨＡ含量に応じてタヒチ株の収穫時期を判断することは困難である。

【0005】

非特許文献１では、微細藻類であるナンノクロロプシスオキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ）の増殖相と細胞内のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含量との関係が解析されている。非特許文献１には、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）、ドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）及びポルフィリディウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）と同様に、ナンノクロロプシスオキュラータのＥＰＡ含量が増殖期に多く、定常期に低下することが記されている。

【0006】

微細藻類の収穫のタイミングを決定する方法に関して、例えば、特許文献１には、培養液における赤色光の吸光度と緑色光の吸光度との比が、微細藻類の比増殖速度と相関することを利用して、微細藻類の培養状態を判断する方法が開示されている。当該方法によれば、培養状態に応じて微細藻類の収穫のタイミングを決定することができる。

【0007】

特許文献２には、脂溶性成分が微細藻類に十分に蓄積したタイミングで微細藻類を収穫するために、微細藻類を含む培養液から検出した２つ以上の波長域の光に関する吸光度比に基づいて、微細藻類の脂溶性成分含量の多寡を判断する方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０１４−１４３９２１号公報

【特許文献2】特開２０１４−１７４０３４号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】岡内正典、外４名、「異なる増殖相におけるナンノクロロプシス Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａの栄養価の相違」、１９９０年、Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ、５６（８）、ｐ．１２９３−１２９８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

上記非特許文献１の知見に基づいて、細胞密度の経時変化から判明する増殖相に基づいて収穫適期を決定するには、細胞数を計数しなければならない。細胞数は顕微鏡の視野下で血球計算盤を用いて計数するため、正確性が十分ではないうえに煩雑で時間を要する。

【0011】

上記特許文献１に係る方法では、微細藻類としてのイカダモで検討した結果、比増殖速度が減少に転じたタイミングでイカダモを収穫する。しかし、比増殖速度が減少したときにイカダモが最大密度となっているかは不明である。また、イカダモとタヒチ株とでは吸光度特性が異なるため、上記特許文献１に係る方法を、タヒチ株の収穫のタイミングの判断に適用することはできない。

【0012】

上記特許文献２では、脂溶性成分と吸光度比との相関関係はイカダモとクロレラとで異なることが示されている。このため、当然ながらタヒチ株における脂溶性成分の含量と吸光度特性との関係については研究が必要である。また、脂溶性成分には、ＤＨＡ以外の脂質、ワックス成分及びトリテルペン系炭化水素等が含まれており、ＤＨＡ含量と吸光度比との相関については明らかになっていない。

【0013】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、最適な時期にイソクリシス属のハプト藻類を収穫することができる微細藻類の培養方法及びデータ解析装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明の第１の観点に係る微細藻類の培養方法は、
イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）のハプト藻類を培養する培養ステップと、
前記ハプト藻類の４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定ステップと、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じた後、前記値が再度下降から上昇に転じてから３〜５日後、又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じた後、前記値が再度上昇から下降に転じてから３〜５日後に前記ハプト藻類を収穫する収穫ステップと、
を含む。

【0016】

また、前記測定ステップでは、
前記ハプト藻類を含む培養液の４９０ｎｍにおける第３の吸光度と６８０ｎｍにおける第４の吸光度とを測定し、
前記ハプト藻類が除去された前記培養液の４９０ｎｍにおける第５の吸光度と６８０ｎｍにおける第６の吸光度とを測定し、
前記収穫ステップにおける前記第１の吸光度は、前記第３の吸光度から前記第５の吸光度を減じた値であって、
前記収穫ステップにおける前記第２の吸光度は、前記第４の吸光度から前記第６の吸光度を減じた値である、
こととしてもよい。

【0018】

また、前記ハプト藻類は、
イソクリシス・エスピー（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）タヒチ株である、
こととしてもよい。

【0019】

本発明の第２の観点に係るデータ解析装置は、
イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）のハプト藻類の４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定部と、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じた後、前記値が再度下降から上昇に転じたこと、又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じた後、前記値が再度上昇から下降に転じたことをユーザーに通知する通知部と、
を備える。
本発明の第３の観点に係るデータ解析装置は、
イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）のハプト藻類の４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定部と、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じた後、前記値が再度下降から上昇に転じてから３〜５日経過後に、又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じた後に、前記値が再度上昇から下降に転じてから３〜５日経過後に、収穫時期であることを前記ユーザーに通知する通知部と、
を備える。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、最適な時期にイソクリシス属のハプト藻類を収穫することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】実施の形態に係るデータ解析装置の構成を示す図である。

【図2】通知処理のフローチャートを示す図である。

【図3】タヒチ株の細胞密度の経時変化を示す図である。

【図4】タヒチ株の吸光度を示す図である。

【図5】タヒチ株の細胞密度及び４９０ｎｍと６８０ｎｍとの吸光度比の経時変化を示す図である。

【図6】タヒチ株の培養液中の栄養塩の濃度の経時変化を示す図である。（Ａ）はリン酸濃度の経時変化を示す図である。（Ｂ）は硝酸態窒素濃度の経時変化を示す図である。

【図7】タヒチ株の非極性脂質に占めるＤＨＡの含有量の経時変化を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。

【0023】

（実施の形態）
本実施の形態に係る微細藻類の培養方法は、培養ステップと、測定ステップと、収穫ステップと、を含む。

【0024】

まず、培養ステップについて説明する。培養ステップでは、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）のハプト藻類を培養する。本実施の形態に係る微細藻類の培養方法を適用できるハプト藻類は、イソクリシス属に属するものであれば任意である。ハプト藻類としては、イソクリシス・エスピー（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）及びイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）等が挙げられる。具体的には、イソクリシス・エスピーとしては、ＣＣＡＰ９２７／１２、ＣＣＡＰ９２７／１４、ＵＴＥＸ ＬＢ１２９２及びＵＴＥＸ２３０７等が挙げられる。イソクリシス・ガルバナとしては、ＣＣＡＰ９２７／１及びＵＴＥＸ ＬＢ９８７等が挙げられる。ハプト藻類としては、イソクリシス・エスピー タヒチ株が特に好ましい。

【0025】

ハプト藻類は培養液中で培養される。培養液は特に限定されず、ハプト藻類が増殖可能な任意の培養液を用いることができる。好ましくは、培養液としてｆ培地が用いられる。ｆ培地は、例えば、海水に対して、硝酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、珪酸ナトリウム九水和物、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、塩化マンガン四水和物、硫酸銅五水和物、硫酸亜鉛七水和物、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物、モリブデン酸ナトリウム二水和物、ビタミンＢ１２、ビオチン及びチアミン塩酸塩等を適量添加することで調製できる。好ましくは、培地に使用する海水は濾過滅菌してから用いる。培地として市販のギラード（Ｆ／２）海水栄養液又は各種ビタミン及びアミノ酸を配合した微細藻類用培養液等を用いてもよい。

【0026】

ハプト藻類は、培養液の温度を１８〜２５℃程度、好ましくは２０℃に維持し、通気下で培養すればよい。通気される空気は、好ましくは、濾過フィルター等で無菌にされる。

【0027】

好ましくは、ハプト藻類は、光照射下で培養される。光の強さは任意であるが、例えば、光量子束密度が５０〜３００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓ、１００〜２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓ、好ましくは１５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓの光である。

【0028】

上記培養ステップには、ハプト藻類の予備培養を含んでもよい。予備培養では、例えば、対数増殖期におけるハプト藻類の細胞を新しい培養液に接種することを複数回繰り返せばよい。

【0029】

次に、測定ステップについて説明する。測定ステップでは、ハプト藻類の所定の波長における吸光度を複数の時点で測定する。吸光度の測定では、例えば、光源から発せられた光をハプト藻類の細胞に当て、透過した光の放射照度を分光放射照度計で測定すればよい。

【0030】

ハプト藻類は、４４０ｎｍ、４９０ｎｍ及び６８０ｎｍ付近の吸光度が比較的大きい。測定ステップでは、好ましくは、４８０〜５２０ｎｍの範囲内の波長λ１（第１の波長）における吸光度Ｄ１（第１の吸光度）及び６６０〜７００ｎｍの範囲内の波長λ２（第２の波長）における吸光度Ｄ２（第２の吸光度）を測定すればよい。より好ましくは、λ１は４８５〜５００ｎｍの範囲内、好適には４９０ｎｍである。λ２は６７０〜６９０ｎｍの範囲内、好適には６８０ｎｍである。以下では、λ１として４９０ｎｍを、λ２として６８０ｎｍを採用した場合について説明する。

【0031】

当該測定ステップでは、培養液を測定対象とすることでもＤ１及びＤ２を測定することができる。例えば、当該測定ステップでは、ハプト藻類を含む培養液の４９０ｎｍにおける吸光度Ｄ３（第３の吸光度）と６８０ｎｍおける吸光度Ｄ４（第４の吸光度）とを測定する。さらに、ハプト藻類が除去された培養液の４９０ｎｍにおける吸光度Ｄ５（第５の吸光度）と６８０ｎｍにおける吸光度Ｄ６（第６の吸光度）とを測定する。この場合、Ｄ１はＤ３からＤ５を減じた値となり、Ｄ２はＤ４からＤ６を減じた値となる。

【0032】

培養期間中、吸光度は、複数回、好ましくは４回以上、異なる時点で測定すればよい。好適には、吸光度は、培養期間が終わるまでに所定時間間隔で複数回測定される。時間間隔は、増殖速度に応じて適宜調整されるが、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１２時間、好ましくは２４時間である。好適には、当該測定ステップでは、毎日同じ時刻に吸光度が測定される。

【0033】

続いて、収穫ステップについて説明する。収穫ステップでは、Ｄ１とＤ２との吸光度比の複数の時点間での比較に基づいて、ハプト藻類を収穫する。収穫ステップでは、例えば、Ｄ１とＤ２との吸光度比（Ｄ１／Ｄ２）に基づいてハプト藻類を収穫する。Ｄ１／Ｄ２は、Ｄ１をＤ２で除した値である。具体的には、Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じた後、Ｄ１／Ｄ２が再度下降から上昇に転じてから３〜５日後にハプト藻類を収穫する。例えば、測定ステップで２４時間毎に測定されたＤ１／Ｄ２を記録し、収穫ステップでは、当該記録を参照し、Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じた後、Ｄ１／Ｄ２が再度下降から上昇に転じてから３〜５日後、好適には３日後又は４日後にハプト藻類を収穫すればよい。

【0034】

なお、収穫ステップでは、Ｄ１とＤ２との比としてＤ２／Ｄ１を用いてもよい。Ｄ２／Ｄ１を複数の時点で比較する場合は、Ｄ２／Ｄ１が上昇から下降に転じた後、Ｄ２／Ｄ１が再度上昇から下降に転じてから３〜５日後にハプト藻類を収穫すればよい。

【0035】

上述のように培養液を測定対象とした場合、具体的には、収穫ステップでは、Ｄ３からＤ５を減じた値と、Ｄ４からＤ６を減じた値との比に基づいて、ハプト藻類を収穫すればよい。

【0036】

ハプト藻類の収穫の方法は特に限定されない。ハプト藻類は、例えば、培養を停止し、培養液の遠心分離等の公知の方法でハプト藻類を濃縮することで収穫できる。

【0037】

ここで、本実施の形態に係る微細藻類の培養方法に好適なデータ解析装置の一例としてデータ解析装置１００について説明する。図１は、データ解析装置１００の構成を示す機能ブロック図である。データ解析装置１００は、測定部１と、通知部２と、記憶部３と、表示部４と、を備える。

【0038】

データ解析装置１００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）と、外部記憶装置と、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）と、を備える。データ解析装置１００では、ＣＰＵが外部記憶装置に記憶されたソフトウェアプログラムをＲＡＭに読み出して、ソフトウェアプログラムを実行制御することにより、以下に説明する測定部１、通知部２、記憶部３及び表示部４の機能を実現する。

【0039】

測定部１は、入力装置と、光源と、分光放射照度計と、タイマーと、を備える。測定部１は、ハプト藻類のＤ１及びＤ２を測定するために、上述のＤ３〜Ｄ６を測定する。具体的には、測定部１は、入力装置を介して入力されたユーザーの指示に応じて、透明シャーレ等に保持されたハプト藻類を含む培養液又はハプト藻類が除去された培養液に対して光源から光を照射し、分光放射照度計でＤ３〜Ｄ６を測定する。測定部１は、タイマーを参照し、測定した時刻とともにＤ３〜Ｄ６を通知部２に出力する。ここでは、ユーザーは、毎日同時刻における培養液についてＤ３〜Ｄ６の測定を測定部１に指示するものとする。

【0040】

通知部２は、測定部１によって入力されたＤ３〜Ｄ６から上述のようにＤ１／Ｄ２を算出する。通知部２は、測定部１によって入力された時刻とともにＤ１／Ｄ２を記憶部３に記憶させる。記憶部３は、測定部１によって入力されたＤ１／Ｄ２を時刻に関連付けて記憶する。

【0041】

通知部２は、Ｄ１／Ｄ２の複数の時点間での比較に基づいて、ユーザーに通知を行う。より詳細には、通知部２は、記憶部３を参照し、測定部１によって入力されたＤ３〜Ｄ６から算出したＤ１／Ｄ２と前日までのＤ１／Ｄ２とを比較し、下降していたＤ１／Ｄ２の上昇が２回見られたときに表示部４に通知指示を入力する。

【0042】

表示部４は、ディスプレイを備え、通知部２によって入力された通知指示に応じて、例えば、「３〜５日後に収穫」等をディスプレイに表示する。これにより、ユーザーは培養中のハプト藻類の収穫のタイミングを把握できる。

【0043】

続いて、データ解析装置１００による通知処理を図２に示すフローチャートを参照して説明する。通知部２は、ハプト藻類の培養を開始したユーザーの指示によって通知処理が開始されると、記憶部３に記憶されたフラグＦａ及びＦｂをそれぞれ「０」に設定する（ステップＳ１）。測定部１は、ユーザーによってセットされた培養液についてＤ３〜Ｄ６の測定指示を待つ（ステップＳ２；Ｎｏ）。測定指示があると（ステップＳ２；Ｙｅｓ）、測定部１は、Ｄ３〜Ｄ６を測定する（ステップＳ３）。

【0044】

続いて、通知部２は、Ｄ１／Ｄ２を算出し、記憶部３にＤ１／Ｄ２を時刻に関連付けて記憶させる（ステップＳ４）。通知部２は、記憶部３を参照し、算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より下降したか否かを判定する（ステップＳ５）。算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より下降した場合（ステップＳ５；Ｙｅｓ）、通知部２は、記憶部３に記憶されたＦａを「１」に更新し（ステップＳ６）、ステップＳ２に戻る。

【0045】

一方、算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より下降していない場合（ステップＳ５；Ｎｏ）、通知部２は、算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より上昇したか否かを判定する（ステップＳ７）。算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より上昇していない場合（ステップＳ７；Ｎｏ）、通知部２はステップＳ２に戻る。なお、前日のＤ１／Ｄ２が記憶部３に記憶されてない場合も、算出したＤ１／Ｄ２は前日のＤ１／Ｄ２より下降していないため、ステップＳ５は「Ｎｏ」である。

【0046】

算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より上昇した場合（ステップＳ７；Ｙｅｓ）、通知部２は、Ｆａが「１」であるか否かを判定する（ステップＳ８）。Ｆａが「１」でない場合（ステップＳ８；Ｎｏ）、通知部２はステップＳ２に戻る。一方、Ｆａが「１」の場合（ステップＳ８；Ｙｅｓ）、通知部２は、記憶部３に記憶されたＦｂに「１」を加算し、かつＦａを「０」に更新する（ステップＳ９）。

【0047】

続いて、通知部２は、Ｆｂが「２」であるか否かを判定する（ステップＳ１０）。Ｆｂが「２」でない場合（ステップＳ１０；Ｎｏ）、通知部２はステップＳ２に戻る。一方、Ｆｂが「２」の場合（ステップＳ１０；Ｙｅｓ）、通知部２は、表示部４を介して「３〜５日後に収穫」をユーザーに通知し（ステップＳ１１）、通知処理を終了する。

【0048】

上記の通知処理において、データ解析装置１００は、ハプト藻類の培養開始後、Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じた後、Ｄ１／Ｄ２が再度下降から上昇に転じた際に、ステップＳ１１を実行する。これにより、データ解析装置１００は、Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じた後、Ｄ１／Ｄ２が再度下降から上昇に転じたことをユーザーに通知することができる。

【0049】

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る培養方法及びデータ解析装置１００によれば、Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じた後、Ｄ１／Ｄ２が再度下降から上昇に転じて３〜５日後にハプト藻類を収穫することができる。下記実施例に示すように、下降していたＤ１／Ｄ２の上昇が２回見られてから３〜５日後は、培養液中のハプト藻類の細胞密度が大きく、ＤＨＡ含量が高い。このため、ハプト藻類を最適な時期に収穫することができる。

【0050】

なお、データ解析装置１００の通知部２は、下降していたＤ１／Ｄ２の上昇が２回見られたことを通知するようにしたが、これに限らない。通知部２は、下降していたＤ１／Ｄ２の上昇が２回見られてから３〜５日経過後に、収穫時期であることをユーザーに通知するようにしてもよい。

【0051】

なお、通知部２は、測定又は記憶されたＤ３〜Ｄ６及び算出又は記憶されたＤ１／Ｄ２を、表示部４を介して表示してもよい。また、通知部２は、Ｄ１／Ｄ２を時間に対してプロットした経時変化を示すグラフを、表示部４を介して表示してもよい。

【0052】

また、収穫ステップでは、Ｄ１／Ｄ２が所定の閾値以上に変化した場合に、Ｄ１／Ｄ２が下降又は上昇したとしてもよい。また、測定ステップにおいて、ハプト藻類の培養液から採取した複数のサンプルについてＤ３〜Ｄ６を測定し、収穫ステップでは、各時点における複数のＤ１／Ｄ２に基づいて統計的な有意差がある場合にＤ１／Ｄ２の下降又は上昇したとしてもよい。なお、収穫ステップでは、所定期間におけるＤ１／Ｄ２の平均を算出し、該平均の比較に基づいて、ハプト藻類を収穫してもよい。

【0053】

なお、収穫ステップでは、Ｄ１／Ｄ２の経時変化を示すグラフの所定の時点での接線を求め、接線の傾きが負から０を経て正になったときを、Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じたときとしてもよい。

【0054】

また、本実施の形態に係る培養方法は、ハプト藻類の収穫方法であってもよい。また、当該培養方法によれば、ＤＨＡ含量が高いハプト藻類を収穫できるため、当該培養方法はＤＨＡの製造方法としても利用できる。

【0055】

なお、上記実施の形態において、実行されるソフトウェアプログラムは、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｃ Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｄｉｓｃ）、ＭＯ（Ｍａｇｎｅｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ ｄｉｓｃ）などのコンピュータで読み取り可能な記録媒体に格納して配布し、そのプログラムをインストールすることにより、上述の動作を実行するシステムを構成することとしてもよい。

【実施例】

【0056】

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【0057】

（培養）
本実施例に用いるタヒチ株は、国立大学法人長崎大学より入手した。タヒチ株の培養には、ガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ社製）で濾過し、塩分２３ＰＳＵになるように蒸留水で希釈した後、高圧滅菌を行った海水を用いた。タヒチ株は、当該希釈した海水にＫｗ２１培地（第一製網社製）を添加し、水温２０°Ｃ、１５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓの光を２４時間連続照射し通気下で、１Ｌフラスコ内でバッチ培養によって維持した。このタヒチ株を、１週間に一度新しい培地に接種した。予備培養のために、タヒチ株を培養してから３日目の対数増殖期と推定される細胞を新しいｆ培地に３回接種した。ｆ培地に用いる海水は、ＧＦ／Ｃフィルターを通して濾過した後、メンブレンフィルター（孔径０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過滅菌を行った。

【0058】

タヒチ株の培養には、濾過フィルター（マイレクス、孔径０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を通した無菌の空気で曝気しながら通気を行った。３回の予備培養を経た培養液を採集してから遠心分離した（３６００ｒｐｍ、２０分間）。新しい培地の栄養塩が希釈されるのを防ぐため、できる限り上澄み液を取り除いた。乾熱滅菌したパスツールピペットを用いて細胞群を新しい培地が入っている１Ｌ三角フラスコ内に植え継ぎ、培養実験を開始した。培養液を、予備培養と同じ環境条件下で１４日間維持した。なお、培養実験における初期細胞密度は、１．０×１０^５細胞／ｍｌとした。

【0059】

（採集と保存）
培養液から毎日同じ時刻にクリーンベンチ内でコニカルビーカーへサンプルを取り出した。タヒチ株の密度、吸光度、及び培養液中の栄養塩濃度を測定するために、それぞれ約５ｍｌ、２０ｍｌ、及び５０ｍｌのサンプルを、遠沈管に分注した。各脂質中の脂肪酸組成の測定のために、残りの培養液から１００〜４５０ｍｌを取り出した。

【0060】

吸光度を測定するための培養液の内、半分はＧＦ／Ｃフィルターで濾過し、ブランクとして濾過液を別の遠沈管で回収した。もう半分はサンプルとして測定するまで固定せず残した。各脂質中の脂肪酸組成を測定するために、培養液を遠心分離し（３６００ｒｐｍ、２０分間）、上澄み液を取り除いた後、細胞群をガラス製ねじ口試験管にパスツールピペットを用いて移した。脱塩のために０．５Ｍギ酸アンモニウム溶液を加えて撹拌して細胞群を洗った後、遠心分離して上澄み液を取り除いた。細胞の脱塩操作と遠心分離を二度行った。細胞群を−８０°Ｃで凍結した後、凍結乾燥し、脂質を抽出するまで−８０°Ｃで保存した。栄養塩濃度を測定するための培養液については、遠心分離した後（３６００ｒｐｍ、２０分間）、上澄み液をＧＦ／Ｃフィルターで濾過した。その濾過液を５０ｍｌ遠沈管へ取り出し、測定するまで−２０°Ｃで保存した。

【0061】

（細胞密度）
細胞は倍率２００倍の生物顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ ５５ｉ、ニコン社製）及び血球計算盤（０．１ｍｍ ｄｅｐｔｈ、サンリード硝子社製）を用いて４回計数した。増殖速度（μ、／日）は、対数増殖期における細胞密度を以下の式１で算出した。

【0062】

μ＝ｌｎ（Ｎ_１／Ｎ_０）／（ｔ_１−ｔ_０） （式１）

【0063】

ここで、Ｎ_０とＮ_１はそれぞれｔ_０時及びｔ_１時における細胞数を示す。

【0064】

（吸光度）
サンプルの細胞密度が各日でできる限り一定になるように濃縮又は希釈した。ブランクをプラスチックシャーレ（φ、４０ｍｍ）に５ｍｌ乗せた後、白色ハロゲンランプから発せられた白色光をブランクに対して垂直に当てた。ブランクを透過した光の放射照度（３６０〜７８０ｎｍ）を、分光放射照度計（ＣＬ−５００Ａ、コニカミノルタ社製）を用いて暗所下で１０回測定した。同じシャーレに乗せたサンプルを透過した光の放射照度も同様に測定した。それぞれの測定値を以下の式２により細胞の吸光度（Ａλ）を算出した。

【0065】

Ａλ＝−ｌｏｇ_１０（Ｉ／Ｉ_０） （式２）
ここで、ＩとＩ_０はそれぞれサンプル及びブランクを透過した光の放射照度を示す。

【0066】

（培養液中の栄養塩濃度の測定）
硝酸態窒素とリン酸の濃度を測定するために、公知の比色定量法に従ってＨａｃｈの既製試薬（Ｈａｃｈ社製）を用いて培養液を発色させた。硝酸態窒素の測定には培養液１５ｍｌを使用して、リン酸の測定には培養液１０ｍｌを使用した。それぞれの培養液は１インチの丸型ガラスセルに入れ、吸光度をポータブル吸光光度計（Ｈａｃｈ社製、ＤＲ ９００）によってそれぞれ３回ずつ測定した。ブランクには蒸留水を用いた。硝酸態窒素及びリン酸の濃度を決定するための検量線を、標準物質としてそれぞれ硝酸ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを用いて作成した。

【0067】

（極性脂質と非極性脂質の分離及び脂質含量の測定）
細胞中の総脂質を次のように抽出した。凍結乾燥させた細胞が入った１５ｍｌガラス製ねじ口試験管にクロロホルム−メタノール−水混合液（１：２：１．８）を９．５ｍｌ加え、３０分間超音波洗浄機（ＡＳＵ−３、ＡＳ ＯＮＥ社製）を用いて１５°Ｃ以下で細胞を破砕した。その後、クロロホルム：メタノール：水の比が２：２：１．８になるようにクロロホルムと水とを２．５ｍｌずつ加えてから溶液を２層に遠心分離させた（２０００ｒｐｍ、５分間）。総脂質が含まれている下層のクロロホルムを、別の１５ｍｌガラス製ねじ口試験管にパスツールピペットを用いて移した後、３７℃で窒素ガスを吹き付けながら有機溶媒を飛ばした。その後、真空デシケーター内で吸引しながら試験管中の水分を十分に飛ばした。

【0068】

総脂質を１ｍｌ（０．２ｍｌ×５回）のクロロホルム−メタノール混合溶液（９８：２）に溶かしてパスツールピペットを用いてＳｅｐ−Ｐａｋシリカカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に移した。非極性脂質（以下、単に「ＮＬ」という）は、Ｓｅｐ−Ｐａｋシリカカートリッジに３０ｍｌのクロロホルム−メタノール混合溶液（９８：２）を１分間に約１滴の速度で流し落としながらナスフラスコに回収した。その後、極性脂質（以下、単に「ＰＬ」という）はＳｅｐ−Ｐａｋシリカカートリッジに３０ｍｌのメタノールを流し落としながらナスフラスコに回収した。それぞれの脂質が溶けている有機溶媒を、ロータリーエバポレーター（Ｎ−１１１０Ｅ、ＥＹＥＬＡ社製）を用いて３７℃で吸引しながら飛ばした。さらに、デシケーター内で吸引しながらナスフラスコ中の水分を飛ばした。各脂質を３ｍｌ（０．５ｍｌ×６回）のクロロホルム−メタノール混合溶液（１：１）に溶かして、それぞれ重量測定済みのガラス試験管に移した。それぞれの試験管内の有機溶媒を、総脂質と同様に３７℃で窒素ガスを吹き付けながら飛ばした。ＮＬとＰＬの含量を重量測定によって算出した。

【0069】

（各脂質中の脂肪酸組成の測定）
抽出後分離したＮＬとＰＬとを、内部標準物質のノナデカン酸（Ｃ１９：０）が１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶けたクロロホルム０．５ｍｌ、及び５％塩化水素メタノール溶液１ｍｌに溶かした後に、３時間８０°Ｃで加熱することでメチルエステル化させた。その後、有機溶媒を常温に戻し、１ｍｌのヘキサンと５．５ｍｌの水を加え、２層に遠心分離させた（２０００ｒｐｍ、５分間）。脂肪酸が溶けている上層を、１．５ｍＬ褐色バイアル瓶に入れ、水素炎イオン化型検出器（２６０℃）が装着されたガスクロマトグラフィー（ＧＣ−１７Ａ、島津製作所社製）に注入し、Ｃ２２：６（ＤＨＡ）等の脂肪酸組成を測定した。キャリアーガスにはヘリウムを用い、キャピラリーカラムにはＯｍｅｇａｗａｘ（商標） ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＧＣ ｃｏｌｕｍｎ（シグマアルドリッチ社製、３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍ）を用いた。

【0070】

（統計解析）
細胞の密度、吸光度、各脂質中の脂肪酸組成、及び培養液中の栄養塩濃度は、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ １１．０、Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）内のＳｔｕｄｅｎｔのｔ−テスト、そしてＳｔａｔｖｉｅｗ（ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０、Ａｂａｃｕｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）内の二元配置分散分析を用いて解析した。

【0071】

（結果）
増殖特性
図３は、タヒチ株の増殖曲線を示す。誘導期が培養してから１日目まで続き、その後対数増殖期が続いた。対数増殖期は４日目まで続いた。その後減速期に入り、９日目から定常期が培養期間の終わりまで続いた。タヒチ株の細胞密度が最大になったのは、９〜１０日目であった。

【0072】

吸光度
タヒチ株の増殖曲線とともに吸光度を図４に示す。タヒチ株の吸光度では、対数増殖期でも定常期でも、４４０ｎｍ、４９０ｎｍ及び６８０ｎｍ付近に比較的大きなピークが確認された。図５に示すように、４９０ｎｍと６８０ｎｍの吸光度比（ＯＤ_４９０／ＯＤ_６８０）は、増殖曲線よりも細かく変動した。ＯＤ_４９０／ＯＤ_６８０は、培養日数３日目まで下降し上昇に転じた。続いて、ＯＤ_４９０／ＯＤ_６８０は、５日目から再び下降し、７日目から上昇に転じた。

【0073】

栄養塩濃度
図６（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ培養液中のリン酸濃度及び硝酸態窒素濃度の経時変化を示す。図６（Ａ）によれば、培養液中のリン酸濃度は、培養日数とともに低下し、３日目以降はリン酸が制限された状態となり、６日目以降はリン酸が枯渇していた。硝酸態窒素濃度は、図６（Ｂ）に示すように、８日目以降は枯渇していた。培養液中のリン酸に対する硝酸態窒素のモル比（Ｎ／Ｐモル比）を図６（Ａ）に示す。Ｎ／Ｐモル比は、３日目以降に上昇していた。

【0074】

図５に示すＯＤ_４９０／ＯＤ_６８０の変動を考慮すると、リン酸が制限される３日目にＯＤ_４９０／ＯＤ_６８０が下降から上昇に転じ、硝酸態窒素が枯渇する８日目の前日である７日目にＯＤ_４９０／ＯＤ_６８０が再び下降から上昇に転じていた。このことから、タヒチ株の栄養塩利用形態は、培養日数０〜３日目まではリン酸依存で、３〜５日目にリン酸依存から硝酸態窒素依存に転換し、５日目から７日目まで硝酸態窒素依存になると考えられる。

【0075】

ＮＬにおけるＤＨＡの含有率の変化
図７は、ＮＬに占めるＤＨＡの含有率の経時変化を示す。ＤＨＡの含有率は、栄養塩利用形態に応じて変化することが示された。詳細には、ＤＨＡの含有率は、リン酸が制限される３日目に上昇から下降に転じ、リン酸依存から硝酸態窒素依存に転換した５日目以降は上昇した。ＤＨＡの含有率は、ＯＤ_４９０／ＯＤ_６８０が２回目に下降から上昇に転じた７日目から３〜５日後である１０〜１２日目に最大になることが示された。タヒチ株のＤＨＡ含量は、対数増殖期ではなく、定常期に最大となることがわかった。

【0076】

以上の結果より、ＯＤ_４９０／ＯＤ_６８０の経時変化を追跡することで、タヒチ株の栄養塩の利用形態を把握できる。また、ＯＤ_４９０／ＯＤ_６８０が下降から上昇に転じた後、再度下降から上昇に転じてから３〜５日後が、細胞密度が大きく、ＤＨＡ含量が高い収穫に最適な時期である。

【0077】

上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

【産業上の利用可能性】

【0078】

本発明は、ハプト藻類の培養に好適である。

【符号の説明】

【0079】

１ 測定部
２ 通知部
３ 記憶部
４ 表示部
１００ データ解析装置

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】