特許 6861207 高分解能電子顕微鏡用ロスレス低温グリッド調製ステージ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6861207

(24)【登録日】2021年3月31日

(45)【発行日】2021年4月21日

(54)【発明の名称】高分解能電子顕微鏡用ロスレス低温グリッド調製ステージ

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/42 20060101AFI20210412BHJP

   G01N 1/28 20060101ALI20210412BHJP

   G01N 1/00 20060101ALI20210412BHJP

【ＦＩ】

   G01N1/42

   G01N1/28 F

   G01N1/28 J

   G01N1/00 101K

【請求項の数】12

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2018-520018(P2018-520018)

(86)(22)【出願日】2015年7月6日

(65)【公表番号】特表2018-527584(P2018-527584A)

(43)【公表日】2018年9月20日

(86)【国際出願番号】EP2015065398

(87)【国際公開番号】WO2017005297

(87)【国際公開日】20170112

【審査請求日】2018年5月10日

(73)【特許権者】

【識別番号】518004543

【氏名又は名称】ウニヴェアズィテート バーゼル

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アーノルト、シュテファン アレクザンダー

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン、トマス

(72)【発明者】

【氏名】シュタールベルク、ヘニンク

【審査官】 西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１８１４９５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 欧州特許出願公開第０２３８１２３６（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０３６０２８６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−００８６５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１３３４１０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／００６８３７３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ １／００− １／４４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

電子顕微鏡用試料を調製するための調製システムであって、
‐吐き出しヘッド（１）を備える液体ハンドリングシステム（０）であって、前記吐き出しヘッド（１）を介してある容量の試料を吸引しそして吐き出すように構成されている液体ハンドリングシステム（０）と、
‐前記試料を収容できるように構成されている支持構造体（２）と、
‐前記支持構造体（２）が温度制御されたステージ（４）の上に配置されているときに、前記支持構造体（２）を予め定義された温度に保つように構成されている温度制御されたステージ（４）と、
‐前記支持構造体（２）を保持するように構成されている第１のアダプタ（３）と、
‐前記支持構造体（２）を保持する前記第１のアダプタ（３）に接続され、液体寒剤（８０）が入っている容器（８）に前記支持構造体（２）を移動させて、前記支持構造体（２）上の前記試料が前記寒剤（８０）に接触するように構成されている移送機構（６０）と、を備え、前記システムが、前記液体ハンドリングシステム（０）に対して前記温度制御されたステージ（４）を移動させ、その結果、前記吐き出しヘッド（１）および前記支持構造体（２）が、前記液体ハンドリングシステム（０）から前記支持構造体（２）まで前記試料を移送するように互いに接近させることができるように構成されている並進ステージアセンブリ（５）を備える、システム。

【請求項2】

前記移送機構（６０）が、前記第１のアダプタ（３）を前記支持構造体（２）と一緒に前記容器（８）の上方の垂直の位置に回転させ、前記回転の後、前記第１のアダプタ（３）および前記支持構造体（２）を下方に移動させ、その結果、前記支持構造体（２）上の前記試料が前記容器（８）の中の前記寒剤（８０）に接触するように構成されていることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記システムが、調整可能な様式で前記温度制御されたステージ（４）に対して前記第１のアダプタ（３）を保持するように構成されている調整手段（４０）を備えることを特徴とする、請求項１又は２に記載のシステム。

【請求項4】

前記調整手段（４０）が、前記第１のアダプタ（３）を解放可能に保持し、前記試料が前記支持構造体（２）の上に位置決めされたときに、前記第１のアダプタ（３）を自動的に解放するように構成されている、保持手段（５０）を備え、予め定義された温度であることを特徴とする、請求項３に記載のシステム。

【請求項5】

前記移送機構（６０）が、第２のアダプタ（３０）を備え、前記２つのアダプタ（３、３０）は、前記保持手段（５０）が前記第１のアダプタ（３）を解放するときに、互いに係合するように設計されていることを特徴とする、請求項４に記載のシステム。

【請求項6】

前記移送機構（６０）は、前記第１のアダプタ（３）が前記第２のアダプタ（３０）と係合されて前記保持手段（５０）から解放されたときに、前記容器（８）の上方に前記第２のアダプタ（３０）を回転させるように設計されていることを特徴とする、請求項５に記載のシステム。

【請求項7】

前記移送機構（６０）は、前記第１のアダプタ（３）および前記支持構造体（２）が前記垂直の位置で前記容器（８）の上方に位置決めされたときに、前記第２のアダプタ（３０）を下方に移動させ、その結果、前記支持構造体（２）の上の前記試料が、前記容器（８）の中の前記寒剤（８０）と接触するように構成されている、好ましくはソレノイドを含む移動発生手段を備えることを特徴とする、請求項２に従属する請求項５または請求項２に従属する請求項６に記載のシステム。

【請求項8】

前記システムが、前記支持構造体の上に堆積された試料層の膜厚を推定するための手段を備えることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項9】

前記吐き出しヘッド（１）は、前記液体ハンドリングシステム（０）の端部に、毛細管、特に微小毛細管により形成され、前記毛細管が、吸引された試料を収容するための先端部を備えることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項10】

前記システムは、第１のリザーバ（１００）を備え、試料のナノリットル容量を含んでいる前記吐き出しヘッド（１）は、拡散律速された試料の調整を可能にするように、前記第１のリザーバの中に浸漬されることができることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項11】

前記システムは、第２のリザーバを備え、試料のナノリットル容量を含んでいる前記吐き出しヘッドは、前記第２のリザーバから、認知分子を含んでいるわずかな容量を吸引することができることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項12】

支持構造体（２）の上の試料を調製するための方法であって、前記方法は、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステムを使用し、前記方法は、
‐温度制御されたステージ（４）の上に支持構造体（２）を設け、前記支持構造体（２）の温度を環境の露点温度に調整するステップと、
‐予め定義された前記試料の分量を液体ハンドリングシステム（０）の中に吸引するステップと、
‐前記試料を前記支持構造体（２）上に向けて吐き出すステップと、
‐前記支持構造体（２）を前記温度制御されたステージ（４）から自動的に取り出すステップと、
‐前記支持構造体（２）を液体寒剤（８０）が入っている容器（８）の上の垂直の位置に自動的に移動させ、そして前記試料が非晶質固体になるまで冷却されるように、前記支持構造体（２）を前記液体寒剤（８０）の中に挿入するステップと、
‐前記ガラス固化された試料と一緒に前記支持構造体（２）を前記液体寒剤（８０）から取り出すステップと、を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、電子顕微鏡用試料を調製するための調製システムおよび対応する方法に関する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0002】

近年、電子顕微鏡のための直接電子検出（ＤＥＤ）カメラにより、生物物理学および構造生物学に急速でかつ持続的な変化がもたらされた。現在、これらのカメラは、低温電子顕微鏡（低温ＥＭ）により、単粒子法を使った原子分解能でまたはその原子分解能の近傍で、巨大な生体分子の構造決定を可能にしている（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０４，１０７‐１１２（２０１３）；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５１２，１６６‐１７０（２０１４））。画像の取得および処理は、その新しいＤＥＤカメラから多くの恩恵を得ているが、試料調製は、依然としてＤＥＤ以前の時代の中にある。ある程度の自動化および制御は、工業用ガラス固化ロボット（例えば、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ，ＦＥＩ；Ｌｅｉｃａ ＥＭ ＧＰ，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって導入されているが、現在の方法は、２つの重要な欠点に悩まされている。第１に、高濃度の生体試料（０．１ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌのタンパク質）を含有する多量の試料容量（約３μｌ）が必要とされる。第２に、試料の９９％超を除去する大量の吸い取りステップが採用されている。さらに、この後者は、ＥＭグリッド上に代表的でない試料の母集団をもたらす下位クラスの試料を優先的に除去することに直結する。これらの問題を解決しようとした研究者は、それほど多くはなかった。Ｊａｉｎらは、ある装置を開発し、その装置は、インクジェット式ピコリットル吐き出しおよび急速凍結装置を組み合わせている（Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７９（１），６８‐７５（２０１２））。これは、グリッド毎に消費される試料の分量を効率的に減らす興味深いアプローチである。しかしながら、インクジェット式吐き出しは、その液滴が試料リザーバから放出されることができる、充填された当該試料リザーバを必要とする。このことは、そのリザーバを充填するのに利用可能の必要性がある最小限の試料容量に制限をもたらす。いくつかの検体、例えば単細胞からの溶解物またはマイクロ流体デバイスからの抽出物は、それ自体、単にマイクロリットル未満の容量でのみ利用可能である。その上、いくつかの試料は、インクジェット技術との親和性がない。

【0003】

したがって、本発明の根底に横たわる課題は、試料のほんのわずかな分量（数ナノリットル）しか消費せず、しかもいかなる吸い取りステップも伴わない、ロスレスの低温ＥＭ調製を可能にする方法、装置およびシステムを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0004】

この課題は、請求項１に記載の特徴を備える低温グリッド調製システム（また、低温グリッド調製システムとも称される）により解決される。好ましい実施形態は、その対応する下位の請求項の中に記述されており、また以下に説明されている。

【0005】

請求項１によれば、電子顕微鏡（ＥＭ）、特に透過ＥＭ用の試料を調製するための調製システムは、
‐吐き出しヘッドを備える（高精度）液体ハンドリングシステムであって、その吐き出しヘッドの吸入口／放出口を介して（例えば、異種混在の）試料の（好ましくは、１ｎｌと少ない）容量を吸引しそして吐き出すように構成されている当該液体ハンドリングシステムと、
‐当該試料を収容できるように構成されている支持構造体と、
‐温度制御されたステージであって、当該支持構造体が当該温度制御されたステージの上に配置されているときに、当該支持構造体を予め定義された温度に保つように構成されているステージ（例えば、その環境の露点温度で、例えばその支持構造体の近くで、蒸発／凝縮を引き起こすわずかな温度の偏差が確立する可能性がある場合、その露点は、周囲の気温および相対湿度に依存する（液体は蒸発も凝縮もしない））と、
‐当該支持構造体を（好ましくは、放出可能な仕方で）保持するように構成されている第１のアダプタであって、当該第１のアダプタは、好ましくは、当該アダプタが当該温度制御されたステージに熱的に接触しているように、当該温度制御されたステージの上に搭載されているアダプタと、
‐移送機構（また、持ち上げ／引き渡し機構または簡潔に引き渡し機構とも称する）であって、当該移送機構は、当該支持構造体を保持する当該第１のアダプタに接続され、当該支持構造体を液体寒剤を含んでいる容器の中へ移動させるように構成されており、その結果、当該支持構造体上の試料は、当該寒剤（好ましくは、エタンまたはエタンおよびプロパンの混合物を含む当該寒剤）と接触し、その結果、当該支持構造体上の当該試料（例えば、液膜）は、好ましくは非晶質固体水の膜に変換される移送機構と、を含む。

【0006】

本明細書において、ｎｌ（ナノリットル）の分量または容量は、好ましくは１ｎｌ〜１００ｎｌ、好ましくは１ｎｌ〜１０ｎｌの範囲の容量である。

【0007】

本発明の１つの実施形態によれば、第１のアダプタは、支持構造体を保持するためのピンセットを含む。

【0008】

本発明の好ましい実施形態によれば、この移送機構は、容器の上方の位置に支持構造体と一緒に第１のアダプタを回転させ、支持構造体上の試料が容器の中で寒剤と接触するように、当該回転後にそのアダプタおよび支持構造体を下方に移動させるように構成されている。

【0009】

この支持構造体は、穴のある炭素膜または任意の他の好適な構造を有する公知の電子顕微鏡（ＥＭ）グリッドとすることができ、またはそのようなグリッドを含むことができる。

【0010】

本発明の好ましい実施形態によれば、このシステムは、液体ハンドリングシステムに対して温度制御されたステージを移動させるように構成されている並進ステージアセンブリを備え、その結果、吐き出しヘッドおよび支持構造体は、液体ハンドリングシステムから支持構造体まで試料を移送するように互いに接近させることができる。

【0011】

１つの実施形態では、当該並進ステージアセンブリは、２つの別々の並進ステージを備えることができ、一方のステージは、温度制御されたステージまたは支持構造体をＸ‐方向およびＹ‐方向（例えば、水平面）に移動させるように構成されており、これに対して、他方のステージは、Ｚ‐方向（垂直方向）に吐き出しヘッド（例えば、毛細管または微小毛細管）を位置決めするように構成されている。

【0012】

別の選択肢として、１つの実施形態では、当該並進ステージアセンブリは、ＸＹＺステージアセンブリとすることができ、このＸＹＺステージアセンブリは、すべての次元（Ｘ、Ｙ、およびＺ）において、吐き出しヘッド（例えば、毛細管または微小毛細管）に対して温度制御されたステージを位置決めするように構成されている。

【0013】

さらにこれ以降説明される方法に関して、当該試料移送は、試料の物理的および化学的性質に依存する複数のやり方で実行されることができる。（ｉ）表面張力効果による支持表面上のナノリットル容量液滴の直接堆積およびその次に起こる拡大。（ｉｉ）支持表面上でのナノリットル容量液滴の堆積、続いて、初期に堆積した容量よりも少ない容量で試料の再吸引。（ｉｉｉ）支持構造体表面上でのナノリットル容量液滴の堆積、続いて、支持構造体と液体ハンドリングシステムとの間の相対的な移動、これに対して、支持構造体上の堆積された試料を拡大させるため、これら２者間の液体架橋が、依然として確立されている。（ｉｖ）支持構造体上の堆積された試料を拡大するため、堆積中に支持構造体と液体ハンドリングシステムとの間の相対的な移動を組み合わせた、支持構造体表面上でのナノリットル容量液滴の堆積。

【0014】

本発明の好ましい実施形態によれば、このシステムは、支持構造体の温度を適切な温度（例えば、露点温度）に調整するため、支持構造体が温度制御されたステージに接近するように、温度制御されたステージに対して第１のアダプタを移動させるように構成されている調整手段を備える。

【0015】

本発明の好ましい実施形態によれば、この調整手段は、好ましくは電磁石の形態の保持手段を備え、この保持手段は、第１のアダプタ（好ましくは、第１のアダプタのピンセット）を解放可能に保持するように、好ましくは試料が支持構造体上に置かれているときに、第１のアダプタを自動的に解放するように構成されており、またこの調整手段には、好ましくは予め定義された温度が含まれる。

【0016】

本発明の好ましい実施形態によれば、この移送機構は、第２のアダプタを備え、これら２つのアダプタは、その保持手段が第１のアダプタを解放するとき（例えば、ピンセットを解放するとき）、互いに係合するように設計されている。

【0017】

本発明の好ましい実施形態によれば、この移送機構は、第１のアダプタが第２のアダプタと係合して保持手段から解放されるとき、第２のアダプタを当該容器の上方に回転させるように設計されている。

【0018】

本発明の好ましい実施形態によれば、この移送機構は、好ましくはソレノイドを含む移動生成手段を備え、その移動生成手段は、第１のアダプタおよび支持構造体がその容器の上方に位置決めされているときに、第２のアダプタを下方に移動させるように構成されており、その結果、支持構造体上の試料は、容器の中の寒剤と接触する。

【0019】

本発明の好ましい実施形態によれば、このシステムは、支持構造体の上に堆積された試料層の膜厚を推定するための手段、例えば赤外線吸着、干渉法、または水晶発振子微量天秤測定による手段を含む。

【0020】

本発明の好ましい実施形態によれば、この吐き出しヘッドは、液体ハンドリングシステムの端部に、毛細管、特に微小毛細管により形成され、その毛細管は、吸引された試料を収容するための先端部を備える。

【0021】

好ましくは、その微小毛細管の内径は、１ナノメートル〜９００マイクロメートルの範囲内、特に１ｎｍ〜１００マイクロメートルの範囲内とすることができる。

【0022】

本発明の好ましい実施形態によれば、このシステムは、第１のリザーバを備え、（場合によっては）試料のナノリットル容量を含んでいる吐き出しヘッドが、拡散律速された試料調整を可能にするように、例えば試料緩衝液を交換し、洗浄剤を添加し、または電子顕微鏡の妨げとなる問題物質を取り除くように、この第１のリザーバの中に浸漬されることができる。さらに、このシステムは、モリブデン酸アンモニウムなどの生物学上のエフェクタ分子またはコントラスト増強剤の中に吐き出しヘッドを導き入れることができる。

【0023】

本発明の好ましい実施形態によれば、このシステムは、第２のリザーバを備え、試料のナノリットル容量を含む吐き出しヘッドは、その第２のリザーバから、認知分子、例えば試料中の標的分子または標的粒子と結合する抗体を含んでいる、わずかな容量を吸引することができる。これらの認知分子は、例えば超常磁性のナノビーズの表面に結合されることができ、例えば診断目的で高電子密度標識として使用されることができる。この結合は、安定な化学結合または光分解性リンカーを形成する結合とすることができる。このアセンブリの磁気特性により、吐き出しヘッドの中で発生した磁気勾配による、そのアセンブリおよび結合された標的分子のトラッピングを可能にする。保温および洗浄ステップの後、この標的分子は、外部磁界が停止されている間、または試料が、光分解性リンカーを切断するのに必要とされる適切な波長の光で照射された後に、試料を吐き出すことによって選択的に放出されることができる。

【0024】

本発明のさらなる態様は、特に透過電子顕微鏡用の支持構造体の上の試料を調製するための方法に関し、この方法は、特に本発明に基づくシステムを使用した方法であり、またこの方法は、次のステップ、すなわち、
‐温度制御されたステージの上に支持構造体を設け、好ましくは当該試料の当該容量を一定に保つように、当該支持構造体の当該温度を環境の露点温度に調整するステップと、
‐予め定義された試料の分量［ｎｌの分量］を毛細管、好ましくは微小毛細管の形態の中に吸引するステップと、
‐当該試料を当該支持構造体の上に向けて吐き出すステップと、
‐当該支持構造体を当該温度制御されたステージから自動的に取り出すステップと、
‐当該支持構造体をある垂直の位置に自動的に持ってきて好ましくは回転させて、当該試料が非晶質固体（また、ガラス固化とも称される）になるまで冷却されるように、当該支持構造体を液体寒剤の中に挿入するステップと、
‐ガラス固化された試料を伴った当該支持構造体を当該液体寒剤から取り出すステップと、を含む。

【0025】

本発明のさらなる特徴および利点は、以下の図を参照しながら実施形態の詳細な記載により説明されている。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は、本発明に基づく低温グリッド調製システムの概略図である。

【図2】図２は、吐き出しヘッド中の試料の中の分子と交換リザーバ中の分子との間の拡散交換を例示する略図である。

【図3】図３は、認知分子、例えば抗体による標的分子の小型隔離機構の概略を示す図である。

【図4】図４は、本発明に基づくシステムの斜視図である。

【図5A】図５Ａは、図１および４に示されたシステムを使用して調製された低温グリッドの外観を示す図であり、穴のある炭素膜の上に吐き出された５ｎｌの液滴を示している。

【図5B】図５Ｂは、非晶質緩衝液中に埋め込まれたタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のより高倍率の低温ＥＭ画像を示す図である。

【図5C】図５Ｃは、非晶質緩衝液中に埋め込まれたＰＤＭＳ系小胞のより高倍率の低温ＥＭ画像を示す図である。

【0027】

図１は、本発明に基づく低温グリッド調製システムの概略図を示し、このシステムは、高精度吐き出しシステム０、吐き出しヘッド１、支持構造体２（また、本明細書ではグリッドを指す）、当該支持構造体２を可逆的に保持するアダプタ３、温度制御されたステージ４、並進ステージ５、持ち上げ／引き渡し機構６０、および寒剤容器８を備える。この並進ステージ５は、すべての次元ＸＹおよびＺにおいて、または次元ＸＹにおいてのみ、ステージ４を移動させるように構成されていることができる。後者の場合、別個のＺステージ１０ａが、当該並進ステージの一部を形成して存在し、このため、そのＺステージ１０ａは、Ｚ（垂直）方向に吐き出しヘッド１を移動させるように構成されている。

【0028】

特に、この低温グリッド調製は、好ましくは、Ａ）温度制御されたステージ４の上の（例えば、ＥＭグリッドおよび特にそのグリッド上に配置された、穴のある炭素膜を備える）支持構造体２の上に向けて試料を吐き出すステップと、Ｂ）持ち上げ／引き渡し機構６０が、アダプタ３および支持構造体２をつかむステップと、Ｃ）アダプタ３、３０により形成された支持構造体ホルダが、下方へ回転して並進機構を作動させるステップと、（Ｄ）その支持構造体２を容器８の中の寒剤８０の中へ速やかに移送するステップと、を使って達成される。

【0029】

図２は、吐き出しヘッドの中の試料中の分子と交換リザーバ中の分子との間の拡散交換を例示する概略図を示す。

【0030】

図３は、認知分子、例えば抗体によって、標的分子に対して、本発明に基づくシステムと併せて使用されることができる小型化された隔離機構の概略図を示す。当該機構は、常磁性ビーズ９を用いた磁気トラップＮ、Ｓを構築する磁石を備える。図３は、常磁性ビーズ９に連結された抗体１０と、標的分子１１、例えばタンパク質複合体と、その標的分子の結合パートナー１２および第２の認知分子１３、例えば結合パートナー１２を認識する抗体と、ならびに第２の認知分子１３に接合された電子密度の高いマーカ１４をさらに示す。

【0031】

図４は、本発明に基づいたシステムの１つの実施形態を、図１と併せて示す。このシステムは、吐き出しシステム０、および例えば、微小毛細管１（図１を参照）により形成された吐き出しヘッド１とは別に、温度制御されたステージ４と、支持構造体２（例えば、ＥＭグリッド）を保持するアダプタ３のピンセット２０と、ピンセット２０を保持する電磁石５０と、温度制御されたステージ４上のＥＭ２グリッドの水平の位置決めを確実にするための、例えばｘｙｚ手動位置合わせ４０の形態の調整手段４０と、を備え、当該調整手段４０は、温度制御されたステージ４の上に搭載され、第１のアダプタ３は、アダプタ３のピンセット２０を開閉するねじと一緒にピンセット２０の上に搭載され、移送機構６０（また、インジェクタアセンブリとも称される）上の第２のアダプタ３０から間隙Ｇだけ離間されている。２つの引き付け合うネオジム磁石は、アダプタ３、３０の端部の中に挿入され、図４に示すように、第３のネオジム磁石は、その第２のアダプタ３０を水平の位置に保持している。このシステム／移送機構６０は、例えば３０ｍｍのハブを有するソレノイド６と、二次回路スイッチ７であってピンセット２０がそのスイッチに命中したときに閉じられる当該スイッチとをさらに備え、このスイッチは、ソレノイド６を作動させそして容器８の中に含まれている寒剤８０の中へＥＭグリッド２を下方へと移動させる。

【0032】

詳細には、この液体ハンドリングシステム０は、吐き出しヘッド１を形成している溶融石英微小毛細管に接続された高精度の注射器ポンプから成る。これら微小毛細管および注射器ポンプ両方とも、システム液（例えば、水）で完全に満たされている。この注射器ポンプは、その微小毛細管の先端部１の自由端を介して、異種混在の試料（例えば、２０Ｓプロテアソーム、タバコモザイクウイルス、リポソーム）の１ｎｌのわずかな容量を吸引しそして吐き出すことができる。

【0033】

この試料は、システム液と直接接触させて吸引されることができ、または数ナノリットルのわずかなエアプラグは、試料吸引前に吸引されて試料およびシステム液を効果的に分離することができる。

【0034】

この微小毛細管の先端部１は、特定の内径に対して真っ直ぐとするかまたはテーパ形状とすることができる。ここでは、内径４０μｍのテーパ形状先端部を有する内径２５０μｍの微小毛細管を使用した。

【0035】

試料を含む微小毛細管の先端部１は、図２に示すように、第１のリザーバ１００、例えば試料から第１のリザーバ１００の中へ塩イオン１０３の拡散律速交換を可能にするエッペンドルフチューブの中へ浸漬されることができる。巨大な分子またはタンパク質１０２は、より小さい拡散定数を示し、培養時間中は喪失しない。生物学上のエフェクタ分子またはコントラスト増強剤、例えばモリブデン酸アンモニウムなどの他の小さい分子１０１は、微小毛細管１に含まれている試料の中に拡散することができる。この交換は、吸引の間中（試料とシステム液との間には空気間隙はない）、その試料をシステム液（この場合は、Ｈ_２Ｏ）と直接接触させることによって増強されることができる。

【0036】

一般に、すべての実施形態において、温度制御されたステージ４は、ペルチエコントローラにより制御された水冷式ペルチエ素子を備えることができる。このペルチエコントローラは、そのステージ４の上に搭載された温度センサからそのステージの温度を取得している。実際の露点温度は、実験用チャンバ内部の周囲温度および相対湿度の両方を測定する露点センサにより送り出され、そして連続的にその露点温度を計算し、その計算された露点温度は、制御ソフトウエアを介してペルチエコントローラにフィードバックされる。制御ソフトウエアを通じて、わずかな温度偏差を加えて蒸発または凝縮を増やすことが可能である。

【0037】

穴のある炭素膜を有するＥＭグリッドの形態の支持構造体２は、アダプタ３の小型ピンセット２０により保持されている。このピンセット２０は、例えば２本のねじにより当該第１のアダプタ３の中にしっかりと固定して搭載されている。例えば、第３のねじにより、ピンセット上に圧力を加えることによって、そのピンセット２０の開閉を可能にする。この第１のアダプタ３の後端には、ネオジウム磁石が挿入されている。

【0038】

この支持構造体２、ピンセット２０、および第１のアダプタ３は、１つのアセンブリを形成する。このアセンブリは、例えばピンセット２０と接触している当該電磁石５０の形態の保持手段５０により水平の位置に保持されている。この電磁石５０自体は、当該調整手段４０に取り付けられ、この調整手段により、あらゆる次元での手動による位置合わせをすることができ、その結果、支持構造体／グリッド２を、温度制御されたステージ４と完全に位置合わせすることが可能となり、そこではグリッド２が、良好な熱接触および効果的な試料堆積のために、水平に置かれていなければならない。

【0039】

例えば、複数のモータ駆動式リニアステージの組み合わせを備える並進ステージアセンブリ５（例えば、図１を参照）により、温度制御されたステージ４上の支持構造体２の表面の上方にある微小毛細管の先端部１を正確に位置決めすることが可能となる。吐き出しヘッド１およびグリッド２の表面は、微小毛細管の先端部１から支持構造体（例えば、グリッド）２まで試料を移送するように接近している。

【0040】

特に、調整手段４０は、温度制御されたステージ４の上に搭載されているが、これに対して、微小毛細管１は、その温度制御されたステージ４に接続されていないので、その結果、後者は、図４に示されていない好適な保持手段により保持されることができる毛細管１に対して、ステージアセンブリ５によって少しずつ移動することができる。特に、当該微小毛細管（吐き出しヘッド）１は、別個のＺ‐軸ステージ１０ａ（図１を参照）の上に搭載されており、このＺ‐軸ステージにより、支持構造体２に対して、微小毛細管の垂直の位置の調整が可能となる。特に、ステージアセンブリ５により、ステージ４が伸長するＸＹ平面で、その温度制御されたステージ４を自動的に移動させることが可能となる。

【0041】

当該試料移送は、その試料の物理的なおよび化学的な特性に依存する複数のやり方で行われることができる。（ｉ）表面張力効果による支持構造体２（例えば、ＥＭグリッド）上でのナノリットル容量液滴の直接堆積およびその次に起こる拡大。（ｉｉ）支持構造体２（例えば、ＥＭグリッド）上でのナノリットル容量液滴の堆積、続いて、初期に堆積した容量よりも少ない容量を有する試料の再吸引。（ｉｉｉ）支持構造体２（例えば、ＥＭグリッド）上でのナノリットル容量液滴の堆積、続いて、そのＥＭグリッドと微小毛細管の先端部との間の相対的な移動、これに対して、ＥＭグリッド上の堆積された試料を拡大させるため、これら２者間の液体架橋が、依然として確立されている。（ｉｖ）支持構造体２上での堆積された試料を拡大するため、堆積中の支持構造体２（例えば、ＥＭグリッド）および微小毛細管の先端部の相対的な移動を組み合わせた、支持構造体２（例えば、ＥＭグリッド）上でのナノリットル容量液滴の堆積。

【0042】

好ましくは、その膜厚は、カメラを通じた目視検査により推定され、そのカメラは、当該厚さを検査するために好適ないかなる場所にでも配置されることができる。

【0043】

この移送機構（引き渡し機構）６０は、第２のアダプタ３０を備え、その第２のアダプタもまた、一方の端部にネオジム磁石が挿入され、他方の端部上には大きいソレノイド６を有する回転ヒンジ６１を介して接続されている。この第２のアダプタ３０を水平の位置に保つため、第３のネオジム磁石が、それに応じて設置されている。第１のおよび第２のアダプタ３、３０は、わずかな間隙Ｇにより離間されている。これら２つの挿入されたネオジムは、互いに引き合うが、しかしながら、これら２つの接合は、アセンブリ２、２０、３（例えば、ピンセット２０）に対して堅固に保持している電磁石５０によって阻止されている。

【0044】

試料堆積の後、ＥＭグリッド２を極低温の液体８０、通常、エタンまたはエタン／プロパン（４０／６０）の混合物の中に素早く投入する必要がある。この投入は、電磁石（ソフトウエア制御された）５０の電源を切ることにより実行され、この切断によりこれら２つのアダプタ３、３０が、一緒にパチンと合体しそして新しいより一層重いアセンブリを形成する。この新しいアセンブリは、第３のネオジム磁石により元の位置に保持されるには、重すぎる。そのアセンブリは、すぐさま垂直の位置（第２のアダプタ３０の他方の側面上にあるヒンジ６１）に落下する。そのアセンブリがその垂直の位置に到達すると、そのアセンブリは、それが前後にはね返るのを防ぐ別の磁石により適切な位置で保持される。同時に、電気回路は、落下するアセンブリの金属部分（例えば、スイッチ７）を通じて閉じられる。これにより、ソレノイドコントローラを制御する二次回路を作動させる。その結果、ソレノイド６が作動し、３０ｍｍハブが下方へ発射され、最後には支持構造体（例えば、ＥＭグリッド）２が容器８の寒剤８０の中に投入される。ソレノイド６の電源投入から支持構造体２が寒剤８０の中に発射されるまでの全工程は、３分の１秒以内に生じ、そして堆積された液膜のガラス固化を可能にする。

【0045】

実施例：本発明に基づいて調製された試料の画像
低温グリッドは、図１および４に示すシステムで調製された。

【0046】

図５Ａは、穴のある炭素膜上に吐き出された５ｎｌの液滴を示す低温ＥＭの概観画像を示す。その均質な非晶質水の層に注目せよ。黒い矢印は、吐き出された緩衝液の周辺を示す。スケールバーは、５０μｍである。挿入図は、穴の中の非晶質緩衝液（ＰＢＳ）のより高い倍率の拡大図を示す。「＊」で表示された黒い点は、試料堆積前のグロー放電処理の間に、ＥＭグリッドを支持しているアルミニウム表面からもたらされたものと思われる。その挿入図のスケールバーは、８０ｎｍである。

【0047】

図５Ｂは、ガラス状の氷に埋め込まれたタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の、より高い倍率の低温ＥＭ画像を示す。スケールバーは、８０ｎｍである。

【0048】

図５Ｃは、非晶質緩衝液中に包埋されたＰＤＭＳ系小胞の、より高倍率の低温ＥＭ画像を示す。そのスケールバーは、８０ｎｍである。この緩衝液の非晶質固体層は、均質であり、かつほとんど汚染されていない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】