特許 6861795 アモジアキンおよび抗糖尿薬物を有効成分として含有する糖尿病の予防または治療用薬学的組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6861795

(24)【登録日】2021年4月1日

(45)【発行日】2021年4月21日

(54)【発明の名称】アモジアキンおよび抗糖尿薬物を有効成分として含有する糖尿病の予防または治療用薬学的組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4706 20060101AFI20210412BHJP

   A61K 31/155 20060101ALI20210412BHJP

   A61K 31/4985 20060101ALI20210412BHJP

   A61K 31/351 20060101ALI20210412BHJP

   A61K 38/26 20060101ALI20210412BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20210412BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20210412BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210412BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/4706

   A61K31/155

   A61K31/4985

   A61K31/351

   A61K38/26

   A61P3/10

   A61P1/16

   A61P43/00 121

【請求項の数】5

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2019-507200(P2019-507200)

(86)(22)【出願日】2017年8月14日

(65)【公表番号】特表2019-524808(P2019-524808A)

(43)【公表日】2019年9月5日

(86)【国際出願番号】KR2017008852

(87)【国際公開番号】WO2018030879

(87)【国際公開日】20180215

【審査請求日】2019年2月14日

(31)【優先権主張番号】10-2016-0103174

(32)【優先日】2016年8月12日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】517288254

【氏名又は名称】ノブメタファーマ カンパニー リミテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】509191159

【氏名又は名称】ポステック アカデミー‐インダストリー ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110001416

【氏名又は名称】特許業務法人 信栄特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム，キョン タイ

(72)【発明者】

【氏名】ジュン，フィ ユン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ヒョン ジョン

【審査官】 新熊 忠信

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５４０８０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５２６５０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５１６４０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第０１８２９５３４（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 Biokemistri，１９９７年，Vol.7,No.2，pp.61-66

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｐ １／００

Ａ６１Ｐ ３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）下記化学式１で表されるアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩；および
（ｂ）メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、ブホルミン（ｂｕｆｏｒｍｉｎ）およびフェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）よりなる群から選ばれるビグアニド薬物（Ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）；
トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、シグリタゾン（ｃｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびエングリタゾン（ｅｎｇｌｉｔａｚｏｎｅ）よりなる群から選ばれるインスリン増感剤（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）；
シタグリプチン（Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（Ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、ビルダグリプチン（Ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）、ゲミグリプチン（Ｇｅｍｉｇｌｉｐｔｉｎ）、サクサグリプチン（Ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（Ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、テネリグリプチン（Ｔｅｎｅｌｉｇｌｉｐｔｉｎ）、アナグリプチン（Ａｎａｇｌｉｐｔｉｎ）およびエボグリプチン（Ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）よりなる群から選ばれるＤＰＰ−４抑制剤（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ４（ＤＰＰ−４）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；
ダパグリフロジン（Ｄａｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、カナグリフロジン（Ｃａｎａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、エンパグリフロジン（Ｅｍｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、イプラグリフロジン（Ｉｐｒａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、トホグリフロジン（Ｔｏｆｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ルセオグリフロジン（Ｌｕｓｅｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、レモグリフロジン（Ｒｅｍｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、レモグリフロジンエタボネート（Ｒｅｍｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ ｅｔａｂｏｎａｔｅ）およびエルツグリフロジン（Ｅｒｔｕｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）よりなる群から選ばれるナトリウムブドウ糖共輸送体抑制剤（Ｓｏｄｉｕｍ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２（ＳＧＬＴ２）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；
エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、リキシセナチド（Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）、アルビグルチド（Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ）およびデュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ）よりなる群から選ばれるグルカゴン様ペプチド−１作用剤（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １（ＧＬＰ１）ａｇｏｎｉｓｔ）；および
グリベンクラミド（ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ，ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）、グリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）、グリクラジド（ｇｌｉｃｌａｚｉｄｅ）、グリメピリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）、トラザミド（ｔｏｌａｚａｍｉｄｅ）、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）、アセトヘキサミド（ａｃｅｔｏｈｅｘａｍｉｄｅ）、カルブタミド（ｃａｒｂｕｔａｍｉｄｅ）、クロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄｅ）、グリボルヌリド（ｇｌｉｂｏｒｎｕｒｉｄｅ）、グリキドン（ｇｌｉｑｕｉｄｏｎｅ）、グリセンチド（ｇｌｉｓｅｎｔｉｄｅ）、グリソアミド（ｇｌｉｓｏｌａｍｉｄｅ）、グリソキセピド（ｇｌｉｓｏｘｅｐｉｄｅ）、グリクロピアミド（ｇｌｙｃｌｏｐｙａｍｉｄｅ）、グリシルアミド（ｇｌｙｃｙｌａｍｉｄｅ）、グリペンチド（ｇｌｉｐｅｎｔｉｄｅ）、レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）およびナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）よりなる群から選ばれるインスリン分泌促進剤（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ）；
アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）、ボグリボース（ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）、エミグリタート（ｅｍｉｇｌｉｔａｔｅ）およびミグリトール（ｍｉｇｌｉｔｏｌ）よりなる群から選ばれるアルファ−グルコシダーゼ抑制剤（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；
リモナバント（Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）、オテナバント（Ｏｔｅｎａｂａｎｔ）、イビナバント（Ｉｂｉｎａｂａｎｔ）およびスリナバント（Ｓｕｒｉｎａｂａｎｔ）よりなる群から選ばれるカンナビノイド受容体−１拮抗剤（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）；
シクロ−ヒスプロ、または亜鉛塩およびシクロ−ヒスプロ含有組成物よりなる群から選ばれる一つ以上の抗糖尿薬物を有効成分として含有する、
ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）の活性およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の活性の両方を促進することによって、第２型糖尿病および脂肪肝を同時に予防または治療するための薬学的組成物。

【化1】

【請求項2】

前記組成物は、さらに、ＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の活性を促進することによって、肥満、異常脂質血症および心血管系疾患よりなる群から選ばれる一つ以上を予防または治療するためのものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記異常脂質血症は、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高中性脂肪血症（Ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、および高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）よりなる群から選ばれる一つ以上である、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記アモジアキンおよび前記抗糖尿薬物の重量比は、１：０．０１〜１：５００である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記組成物の一日投与量は、８ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−αの両方を活性化させるアモジアキンおよび抗糖尿薬物を有効成分として含有する糖尿病の予防または治療用薬学的組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

糖尿病というのは、膵臓のベータ細胞で分泌される糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）調節ホルモンであるインスリンが、体内で要求する量を生成しないか、インスリンが細胞に正常に作用しないため、血液中のブドウ糖がエネルギーとして用いられず、血液中に蓄積され、高血糖を誘発し、尿中に糖が検出される症状をいう。一般的に、糖尿病は、治療のためにインスリンが必須的に要求されるか否かによって、インスリン依存型糖尿病（第１型糖尿病）と、インスリン非依存型糖尿病（第２型糖尿病）とに区分される。第２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿であって、インスリン抵抗性に起因してインスリン作用が十分でないか、インスリンが相対的に不足して発病するようになるが、全体糖尿病患者の９０％が第２型糖尿に属し、主に３０代以後に発病するので、成人型糖尿病とも言う。

【0003】

糖尿が長期間持続すると、体内ブドウ糖の吸収が正常に起こらないため、糖質代謝および脂質代謝、そして蛋白質代謝の異常を招き、高インスリン血症、神経合併症、糖尿性網膜症（非増殖性網膜症、増殖性網膜症、糖尿性白内障）、腎不全症、性機能障害、皮膚疾患（アレルギー）、高血圧、動脈硬化症、脳卒中（中風）、心臓病（心筋梗塞症、狭心症、心臓まひ）、壊疽のような様々な糖尿合併症が発病する。したがって、第２型糖尿病の多様な原因と病因を理解し、改善方案を設けるために、国内外的にブドウ糖の移送および代謝過程、インスリン信号伝達体系等に関する研究が活発に行われているが、まだ根源的に治療できる薬物を開発していないのが現況である。

【0004】

現在知られている第２型糖尿病治療剤は、大きく、４種類に分類できるが、インスリンの分泌を誘導するスルホニルウレア系薬物、筋肉細胞に糖を移動させ、肝で糖の合成を抑制する効果を示すビグアニド系、小腸でブドウ糖を作る酵素を抑制させるα−グルコシダーゼ阻害剤、脂肪細胞の分化に関係するＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）−γを活性化させるチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）系薬物等がある。しかしながら、このような経口用血糖降下剤の薬物は、低血糖症の誘発（スルホニルウレア系薬物）、腎臓毒性（ビグアニド系薬物）、乳酸アシドーシス（ビグアニド系薬物）、下痢と食もたれ（アルファ−グルコシダーゼ阻害剤）等の様々なの副作用を伴う。

【0005】

一方、ペルオキシゾーム（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ）は、このような代謝機能異常の原因となる細胞内小器官の一つであって、酸素、ブドウ糖、脂質、およびホルモンの代謝において重要な役割をし、細胞増殖および分化の調節、炎症媒介体の調節にも幅広く影響を及ぼす。また、ペルオキシゾームは、脂質代謝とブドウ糖代謝を通じてインスリン感受性だけでなく、細胞膜と肥満細胞の形成に影響を与え、酸化的ストレスに影響を与えて、老化および腫瘍発生において重要な役割をする。ペルオキシゾーム増殖体活性化受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＰＰＡＲ）は、リガンド（Ｌｉｇａｎｄ）結合により遺伝子発現を調節する核受容体の一つであって、様々な脂肪酸が内因性リガンドとして作用する。現在明らかにされたＰＰＡＲは、ペルオキシゾーム増殖体活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲ−α）、ペルオキシゾーム増殖体活性化受容体ベータ／デルタ（ＰＰＡＲ−β／δ）、およびペルオキシゾーム増殖体活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲ−γ）がある。

【0006】

ＰＰＡＲ−γは、脂肪組織で最も多く発見され、その他に血管内皮、大食細胞、および膵臓のβ細胞で発見され、脂肪細胞の分化を調節し、全身脂質の恒常性に決定的な役割をする。ＰＰＡＲ−γの全体的または部分的活性化化合物は、第２型糖尿病の治療に特に効果的である。ただし、ＰＰＡＲ−γの活性化時に副作用として発生する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患、脂肪肝等が問題になる。

【0007】

ＰＰＡＲ−αは、主に血管壁、肝、心臓、筋肉、腎臓、および褐色脂肪組織等で発見され、作用剤であるフィブラート（ｆｉｂｒａｔｅ）類と共に動脈硬化症を予防したり、発病を遅延させ、脂肪酸化促進を介した抗肥満作用をする。

【0008】

したがって、ＰＰＡＲの作用により調節される各種疾患の予防、改善、または治療のためにＰＰＡＲの活性をより効果的に調節できる新しい化合物の発掘に対する必要性が提起されている。

【0009】

これより、本発明者らは、優れた抗糖尿活性を有し、安全に適用され得る化合物について研究しているところ、アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）に注目するに至った。

【0010】

アモジアキンは、抗マラリア性化合物であり、マラリアに関する治療剤の研究が多数報告されている。また、従来、アモジアキンについての特許登録された技術を見ると、経口投与用抗マラリア配合製剤およびその製造方法（特許文献１（韓国特許登録第１０−０６２３３２２号））、抗マラリア製剤としてピペラジン誘導体（特許文献２（韓国特許登録第１０−１４２３７８５号））等がある。

【0011】

しかしながら、ＰＰＡＲの作用により調節される疾患であって、ＰＰＡＲ−γの活性化時に副作用として発生する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患、脂肪肝等を抑制し、同時に、糖尿病の予防または治療のためのアモジアキンおよび抗糖尿薬物の複合製剤に対する研究および技術は、全然ないのが現状である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】韓国特許登録第１０−０６２３３２２号明細書

【特許文献2】韓国特許登録第１０−１４２３７８５号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、（ａ）アモジアキン化合物またはその薬剤学的に許容可能な塩；および（ｂ）抗糖尿薬物を有効成分として含有する組成物の新しい用途、すなわち、ＰＰＡＲ−γの活性化による副作用を抑制しつつ、糖尿病を予防または治療用としての新規用途を提供することをその目的とする。

【0014】

しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解され得る。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明は、（ａ）下記化学式１で表されるアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩；および
（ｂ）メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、ブホルミン（ｂｕｆｏｒｍｉｎ）およびフェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）よりなる群から選ばれるビグアニド薬物（Ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）；
トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、シグリタゾン（ｃｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびエングリタゾン（ｅｎｇｌｉｔａｚｏｎｅ）よりなる群から選ばれるインスリン増感剤（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）；
シタグリプチン（Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（Ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、ビルダグリプチン（Ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）、ゲミグリプチン（Ｇｅｍｉｇｌｉｐｔｉｎ）、サクサグリプチン（Ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（Ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、テネリグリプチン（Ｔｅｎｅｌｉｇｌｉｐｔｉｎ）、アナグリプチン（Ａｎａｇｌｉｐｔｉｎ）およびエボグリプチン（Ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）よりなる群から選ばれるＤＰＰ−４抑制剤（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ４（ＤＰＰ−４）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；
ダパグリフロジン（Ｄａｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、カナグリフロジン（Ｃａｎａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、エンパグリフロジン（Ｅｍｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、イプラグリフロジン（Ｉｐｒａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、トホグリフロジン（Ｔｏｆｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ルセオグリフロジン（Ｌｕｓｅｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、レモグリフロジン（Ｒｅｍｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、レモグリフロジンエタボネート（Ｒｅｍｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ ｅｔａｂｏｎａｔｅ）およびエルツグリフロジン（Ｅｒｔｕｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）よりなる群から選ばれるナトリウムブドウ糖共輸送体抑制剤（Ｓｏｄｉｕｍ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２（ＳＧＬＴ２）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；
エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、リキシセナチド（Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）、アルビグルチド（Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ）およびデュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ）よりなる群から選ばれるグルカゴン様ペプチド−１作用剤（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １（ＧＬＰ１）ａｇｏｎｉｓｔ）；および
グリベンクラミド（ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ，ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）、グリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）、グリクラジド（ｇｌｉｃｌａｚｉｄｅ）、グリメピリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）、トラザミド（ｔｏｌａｚａｍｉｄｅ）、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）、アセトヘキサミド（ａｃｅｔｏｈｅｘａｍｉｄｅ）、カルブタミド（ｃａｒｂｕｔａｍｉｄｅ）、クロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄｅ）、グリボルヌリド（ｇｌｉｂｏｒｎｕｒｉｄｅ）、グリキドン（ｇｌｉｑｕｉｄｏｎｅ）、グリセンチド（ｇｌｉｓｅｎｔｉｄｅ）、グリソアミド（ｇｌｉｓｏｌａｍｉｄｅ）、グリソキセピド（ｇｌｉｓｏｘｅｐｉｄｅ）、グリクロピアミド（ｇｌｙｃｌｏｐｙａｍｉｄｅ）、グリシルアミド（ｇｌｙｃｙｌａｍｉｄｅ）、グリペンチド（ｇｌｉｐｅｎｔｉｄｅ）、レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）およびナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）よりなる群から選ばれるインスリン分泌促進剤（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ）；
アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）、ボグリボース（ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）、エミグリタート（ｅｍｉｇｌｉｔａｔｅ）およびミグリトール（ｍｉｇｌｉｔｏｌ）よりなる群から選ばれるアルファ−グルコシダーゼ抑制剤（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；
リモナバント（Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）、オテナバント（Ｏｔｅｎａｂａｎｔ）、イビナバント（Ｉｂｉｎａｂａｎｔ）およびスリナバント（Ｓｕｒｉｎａｂａｎｔ）よりなる群から選ばれるカンナビノイド受容体−１拮抗剤（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）；
シクロ−ヒスプロ、または亜鉛塩およびシクロ−ヒスプロ含有組成物よりなる群から選ばれる一つ以上の抗糖尿薬物を有効成分として含有するＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）の活性化による副作用を抑制しつつ、糖尿病を予防または治療するための薬学的組成物を提供する：

【0016】

【化1】

【0017】

前記組成物は、ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）の活性化に反応する第２型糖尿病およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の活性化に反応する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患および脂肪肝よりなる群から選ばれる一つ以上を同時に予防または治療するためのものであってもよい。

【0018】

前記異常脂質血症は、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高中性脂肪血症（Ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、および高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）よりなる群から選ばれる一つ以上であってもよい。

【0019】

前記アモジアキンおよび前記抗糖尿薬物の重量比は、１：０．０１〜１：５００であってもよい。

【0020】

前記組成物の一日投与量は、８ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであってもよい。

【発明の効果】

【0021】

本発明によるＰＰＡＲ−γの活性化による副作用を抑制しつつ、糖尿病を予防または治療するための薬学的組成物は、（ａ）アモジアキン化合物またはその薬剤学的に許容可能な塩；および（ｂ）抗糖尿薬物を有効成分として含有するものであって、アモジアキンは、ＰＰＡＲ−αとＰＰＡＲ−γの活性を促進することができる。

【0022】

したがって、このようなアモジアキンまたはその薬剤学的に許容可能な塩にメトホルミン等のビグアニド薬物のような抗糖尿薬物を混合した複合製剤の場合、単独製剤の場合に比べて糖新生作用の抑制および脂質代謝関連中性脂肪とリン脂質の生合成の抑制等に大きい相昇効果を示すところ、本発明の組成物は、ＰＰＡＲ−γの活性化に反応する第２型糖尿病およびＰＰＡＲ−αの活性化に反応する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患および脂肪肝よりなる群から選ばれる一つ以上を同時に予防または治療するのに有用に活用できるものと期待される。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1a】アモジアキンのＰＰＡＲ−γの活性化効果を測定したグラフである。

【図1b】アモジアキンのＰＰＡＲ−γの活性化効果を測定したグラフである。

【図1c】ＰＰＡＲ−αの活性化効果を測定したグラフである。

【図1d】ＰＰＡＲ−αの活性化効果を測定したグラフである。

【図2】アモジアキンをマウス由来筋肉細胞であるＣ２Ｃ１２筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）細胞株に２４時間処理した時、ブドウ糖類似体の吸収値を測定したグラフである。

【図3a】アモジアキン摂取がマウスの空腹血糖濃度に及ぼす影響を確認したグラフである。

【図3b】アモジアキン摂取がマウスにブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図4】アモジアキン摂取がマウスの糖化血色素値に及ぼす影響を確認したグラフである。

【図5a】高脂肪食で誘導する肥満マウス（Ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ ｍｉｃｅ）を対象として高脂肪摂取と同時にアモジアキン投与をしたとき、マウスの肥満抑制現象を示すグラフである。

【図5b】マウスの一日平均飼料摂取量を示したグラフである。

【図5c】高脂肪食で長期（２０週）誘導した肥満マウス（Ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ ｍｉｃｅ）にアモジアキン投与による肥満治療現象を示したグラフである。

【図5d】各マウスの一日平均飼料摂取量を確認したグラフである。

【図6】アモジアキンの摂取による低温度への露出時に高脂肪食誘導性マウスの熱生産を示したグラフである。

【図7a】高脂肪食と同時にアモジアキン投与を共に進めたマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図7b】高脂肪食と同時にアモジアキン投与を共に進めたマウスを対象としてインスリン注射後に時間経過による血糖濃度の変化を確認したインスリン負荷試験（ＩＰＩＴＴ）を示したグラフである。

【図7c】高脂肪食で長期（２０週）誘導したマウスを対象としてアモジアキンを投与した後にインスリンを注射して時間経過による血糖濃度の変化を確認したインスリン負荷試験（ＩＰＩＴＴ）を示したグラフである。

【図8a】アモジアキンと高脂肪食で１４週間飼育した実験動物で肝をヘマトキシリン・エオジンでそれぞれ染色して、脂肪の蓄積による肝細胞の組織学的変化を確認したグラフである。

【図8b】アモジアキンと高脂肪食で２２週間飼育した実験動物で肝をヘマトキシリン・エオジンでそれぞれ染色して、脂肪の蓄積による肝細胞の組織学的変化を確認したグラフである。

【図9a】アモジアキンを摂取した高脂肪食誘導性マウスの肝組織において、脂肪酸の酸化と関連した遺伝子の発現を測定した結果をそれぞれ示したグラフである。

【図9b】アモジアキンを摂取した高脂肪食誘導性マウスの筋肉組織において、脂肪酸の酸化と関連した遺伝子の発現を測定した結果をそれぞれ示したグラフである。

【図9c】アモジアキンを摂取した高脂肪食誘導性マウスの脂肪組織において、脂肪酸の酸化と関連した遺伝子の発現を測定した結果をそれぞれ示したグラフである。

【図10】アモジアキンを摂取した高脂肪食誘導性マウスの脂肪組織で抗炎症に関連した遺伝子の発現を測定した結果を示したグラフである。

【図11】アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤をヒト由来肝細胞であるＨｅｐＧ２細胞株に２４時間処理したとき、糖新生作用に関連した遺伝子ＰＥＰＣＫの発現を測定した結果を示したグラフである。

【図12】アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤をヒト由来肝細胞であるＨｅｐＧ２細胞株に２４時間処理したとき、脂質代謝関連中性脂肪とリン脂質の生合成に関連した遺伝子ＳＲＥＢＰ−１の発現を測定した結果を示したグラフである。

【図13】インスリン抵抗性誘導のためのパルミチン酸と共に、アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤を分化したマウス由来筋肉細胞であるＣ２Ｃ１２細胞に１６時間処理したとき、インスリン反応性に関連した遺伝子ＧＬＵＴ４の発現を測定した結果を示したグラフである。

【図14a】アモジアキンおよびメトホルミンを１：５０の重量比で投与したマウス、を対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図14b】アモジアキンおよびメトホルミンを１：１５０の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図14c】アモジアキンおよびメトホルミンを１：３００の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図14d】アモジアキンおよびメトホルミンを１：５００の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図15a】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：１の重量比で投与したマウスを対象として空腹血糖の変化に及ぼす影響を確認した結果を示したグラフである。

【図15b】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：２の重量比で投与したマウスを対象として空腹血糖の変化に及ぼす影響を確認した結果を示したグラフである。

【図15c】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：１０の重量比で投与したマウスを対象として空腹血糖の変化に及ぼす影響を確認した結果を示したグラフである。

【図15d】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：２０の重量比で投与したマウスを対象として空腹血糖の変化に及ぼす影響を確認した結果を示したグラフである。

【図15e】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：１の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図15f】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：２の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図15g】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：１０の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図15h】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：２０の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図15i】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：１の重量比で投与したマウスを対象として糖化血色素値に及ぼす影響を確認したグラフである。

【図15j】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：２の重量比で投与したマウスを対象として糖化血色素値に及ぼす影響を確認したグラフである。

【図15k】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：１０の重量比で投与したマウスを対象として糖化血色素値に及ぼす影響を確認したグラフである。

【図15l】アモジアキンおよびシタグリプチンを１：２０の重量比で投与したマウスを対象として糖化血色素値に及ぼす影響を確認したグラフである。

【図16a】アモジアキンおよびダパグリフロジンを１：０．０２の重量比で投与したマウスを対象として空腹血糖の変化に及ぼす影響を確認した結果を示したグラフである。

【図16b】アモジアキンおよびダパグリフロジンを１：０．２の重量比で投与したマウスを対象として空腹血糖の変化に及ぼす影響を確認した結果を示したグラフである。

【図16c】アモジアキンおよびダパグリフロジンを１：２の重量比で投与したマウスを対象として空腹血糖の変化に及ぼす影響を確認した結果を示したグラフである。

【図16d】アモジアキンおよびダパグリフロジンを１：０．０２の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図16e】アモジアキンおよびダパグリフロジンを１：０．２の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図16f】アモジアキンおよびダパグリフロジンを１：２の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図16g】アモジアキンおよびダパグリフロジンを１：０．０２の重量比で投与したマウスを対象として糖化血色素値に及ぼす影響を確認したグラフである。

【図16h】アモジアキンおよびダパグリフロジンを１：０．２の重量比で投与したマウスを対象として糖化血色素値に及ぼす影響を確認したグラフである。

【図16i】アモジアキンおよびダパグリフロジンを１：２の重量比で投与したマウスを対象として糖化血色素値に及ぼす影響を確認したグラフである。

【図17a】アモジアキンおよびエキセナチドを１：０．００１の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【図17b】アモジアキンおよびエキセナチドを１：０．００５の重量比で投与したマウスを対象としてブドウ糖の投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖負荷試験（ＯＧＴＴ）結果を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明者らは、ＰＰＡＲ−αとＰＰＡＲ−γの両方を活性化させることができるアモジアキンまたはその薬剤学的に許容可能な塩に抗糖尿薬物を混合した複合製剤の場合、単独製剤の場合に比べて血糖調節および脂肪蓄積抑制（特に、肝組織の中性脂肪蓄積抑制）に大きい相昇効果を示すところ、ＰＰＡＲ−γの活性化による副作用を抑制しつつ、糖尿病を予防または治療することができることを確認し、本発明を完成した。

【0025】

本発明の一実施例では、アモジアキンがＰＰＡＲ−γとＰＰＡＲ−αの二重リガンドとして作用するかを調べるために、ベクターを使用してＰＰＡＲ−γとＰＰＡＲ−αの活性を測定し（実施例１参照）、アモジアキンのブドウ糖吸収能が増加して血糖阻害効果があるか否かを確認するために、マウスの筋肉細胞株でブドウ糖吸収能の評価実験を行った（実施例２参照）。また、アモジアキンによる血糖降下および血糖調節効果、糖化血色素（ＨｂＡ１Ｃ）の減少効果、体重の減少効果、熱生産効果および脂肪肝予防効果をマウスで調べた（実施例３〜８参照）。また、アモジアキン投与が肝、筋肉、脂肪組織内ＰＰＡＲ−αの活性化によるターゲット遺伝子（ＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ）の発現を調節して脂肪酸の分解を促進させることができることを確認し（実施例９参照）、アモジアキン投与が脂肪組織内の抗炎症反応によるターゲット遺伝子（ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ）の発現を抑制させることができることを確認した（実施例１０参照）。

【0026】

その結果、アモジアキン処理によるＰＰＡＲ−γとＰＰＡＲ−αの活性化とそれに応じた一連の反応が血糖調節および脂肪蓄積の抑制に効果的であることを確認した。

【0027】

一方、本発明の他の実施例では、アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤の処理による糖新生作用の抑制に対する相昇効果を測定し（実施例１１参照）、脂質代謝関連中性脂肪とリン脂質の生合成抑制に対する相昇効果を測定し（実施例１２参照）、パルミチン酸により誘導されたインスリン抵抗性状態で筋肉細胞内ＧＬＵＴ４遺伝子の発現を増加させることができることを確認した（実施例１３参照）。

【0028】

また、本発明のさらに他の実施例では、アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤の投与によるマウスの血糖調節効果に及ぼす影響を確認し（実施例１４参照）、本発明のさらに他の実施例では、アモジアキンおよびシタグリプチンの複合製剤の投与によるマウスの血糖降下、血糖調節効果および糖化血色素の含量に及ぼす影響を確認し（実施例１５）、本発明のさらに他の実施例では、アモジアキンおよびダパグリフロジンの複合製剤の投与によるマウスの血糖降下、血糖調節効果および糖化血色素の含量に及ぼす影響を確認し（実施例１６）、本発明のさらに他の実施例では、アモジアキンおよびエキセナチドの複合製剤の投与によるマウスの血糖調節効果に及ぼす影響を確認した（実施例１７）。

【0029】

その結果、アモジアキンおよび抗糖尿薬物の複合製剤を処理した場合、単独製剤を処理した場合に比べて血糖調節および脂肪蓄積の抑制（特に、肝組織の中性脂肪蓄積の抑制）に大きい相昇効果を有することを確認した。

【0030】

したがって、本発明は、
（ａ）下記化学式１で表されるアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩；および
（ｂ）メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、ブホルミン（ｂｕｆｏｒｍｉｎ）およびフェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）よりなる群から選ばれるビグアニド薬物（Ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）；
トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、シグリタゾン（ｃｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびエングリタゾン（ｅｎｇｌｉｔａｚｏｎｅ）よりなる群から選ばれるインスリン増感剤（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）；
シタグリプチン（Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（Ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、ビルダグリプチン（Ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）、ゲミグリプチン（Ｇｅｍｉｇｌｉｐｔｉｎ）、サクサグリプチン（Ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（Ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、テネリグリプチン（Ｔｅｎｅｌｉｇｌｉｐｔｉｎ）、アナグリプチン（Ａｎａｇｌｉｐｔｉｎ）およびエボグリプチン（Ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）よりなる群から選ばれるＤＰＰ−４抑制剤（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ４（ＤＰＰ−４）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；
ダパグリフロジン（Ｄａｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、カナグリフロジン（Ｃａｎａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、エンパグリフロジン（Ｅｍｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、イプラグリフロジン（Ｉｐｒａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、トホグリフロジン（Ｔｏｆｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ルセオグリフロジン（Ｌｕｓｅｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、レモグリフロジン（Ｒｅｍｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、レモグリフロジンエタボネート（Ｒｅｍｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ ｅｔａｂｏｎａｔｅ）およびエルツグリフロジン（Ｅｒｔｕｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）よりなる群から選ばれるナトリウムブドウ糖共輸送体抑制剤（Ｓｏｄｉｕｍ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２（ＳＧＬＴ２）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；
エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、リキシセナチド（Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）、アルビグルチド（Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ）およびデュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ）よりなる群から選ばれるグルカゴン様ペプチド−１作用剤（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １（ＧＬＰ１）ａｇｏｎｉｓｔ）；および
グリベンクラミド（ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ，ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）、グリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）、グリクラジド（ｇｌｉｃｌａｚｉｄｅ）、グリメピリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）、トラザミド（ｔｏｌａｚａｍｉｄｅ）、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）、アセトヘキサミド（ａｃｅｔｏｈｅｘａｍｉｄｅ）、カルブタミド（ｃａｒｂｕｔａｍｉｄｅ）、クロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄｅ）、グリボルヌリド（ｇｌｉｂｏｒｎｕｒｉｄｅ）、グリキドン（ｇｌｉｑｕｉｄｏｎｅ）、グリセンチド（ｇｌｉｓｅｎｔｉｄｅ）、グリソアミド（ｇｌｉｓｏｌａｍｉｄｅ）、グリソキセピド（ｇｌｉｓｏｘｅｐｉｄｅ）、グリクロピアミド（ｇｌｙｃｌｏｐｙａｍｉｄｅ）、グリシルアミド（ｇｌｙｃｙｌａｍｉｄｅ）、グリペンチド（ｇｌｉｐｅｎｔｉｄｅ）、レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）およびナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）よりなる群から選ばれるインスリン分泌促進剤（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ）；
アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）、ボグリボース（ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）、エミグリタート（ｅｍｉｇｌｉｔａｔｅ）およびミグリトール（ｍｉｇｌｉｔｏｌ）よりなる群から選ばれるアルファ−グルコシダーゼ抑制剤（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）；
リモナバント（Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）、オテナバント（Ｏｔｅｎａｂａｎｔ）、イビナバント（Ｉｂｉｎａｂａｎｔ）およびスリナバント（Ｓｕｒｉｎａｂａｎｔ）よりなる群から選ばれるカンナビノイド受容体−１拮抗剤（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）；
シクロ−ヒスプロ、または亜鉛塩およびシクロ−ヒスプロ含有組成物よりなる群から選ばれる一つ以上の抗糖尿薬物を有効成分として含有する、
ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）の活性化による副作用を抑制しつつ、糖尿病を予防または治療するための薬学的組成物を提供する：

【0031】

【化2】

【0032】

前記抗糖尿薬物は、現在臨床等で開発中にあるか、製品化している薬物であって、具体的に、ビグアニド薬物、インスリン増感剤、ＤＰＰ−４抑制剤、ナトリウムブドウ糖共輸送体抑制剤、グルカゴン様ペプチド−１作用剤、インスリン分泌促進剤、アルファ−グルコシダーゼ抑制剤、カンナビノイド受容体−１拮抗剤、およびシクロ−ヒスプロまたは亜鉛塩およびシクロ−ヒスプロ含有組成物であってもよく、ビグアニド薬物、ＤＰＰ−４抑制剤、ナトリウムブドウ糖共輸送体抑制剤およびグルカゴン様ペプチド−１作用剤であることが好ましいが、これらに限定されない。

【0033】

より具体的に、前記ビグアニド薬物は、メトホルミン、ブホルミンおよびフェンホルミンよりなる群から選ばれ得；前記インスリン増感剤は、トログリタゾン、シグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾンおよびエングリタゾンよりなる群から選ばれ得；前記ＤＰＰ−４抑制剤は、シタグリプチン、リナグリプチン、ビルダグリプチン、ゲミグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、テネリグリプチン、アナグリプチンおよびエボグリプチンよりなる群から選ばれ得；前記ナトリウムブドウ糖共輸送体抑制剤は、アカナグリフロジン、ダパグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン、ルセオグリフロジン、レモグリフロジン、レモグリフロジンエタボネートおよびエルツグリフロジンよりなる群から選ばれ得；前記グルカゴン様ペプチド−１作用剤は、エキセナチド、リキシセナチド、リラグルチド、アルビグルチドおよびデュラグルチドよりなる群に選ばれ得；前記インスリン分泌促進剤は、グリベンクラミド、グリピジド、グリクラジド、グリメピリド、トラザミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、カルブタミド、クロルプロパミド、グリボルヌリド、グリキドン、グリセンチド、グリソアミド、グリソキセピド、グリクロピアミド、グリシルアミド、グリペンチド、レパグリニドおよびナテグリニドよりなる群から選択され得、前記アルファ−グルコシダーゼ抑制剤は、アカルボース、ボグリボース、エミグリタートおよびミグリトールよりなる群から選ばれ得；前記カンナビノイド受容体−１拮抗剤は、リモナバント、オテナバント、イビナバントおよびスリナバントよりなる群から選択され得る。

【0034】

一方、シクロ−ヒスプロ（Ｃｙｃｌｏ−ｈｉｓ−ｐｒｏ）または亜鉛塩およびシクロ−ヒスプロ含有組成物において、シクロ−ヒスプロは、亜鉛と亜鉛代謝を促進する酵素であって、精製されたシクロ−ヒスプロを使用することができ、亜鉛塩は、亜鉛カチオンおよび塩化物、硫酸塩等のアニオンを含むことができる。このような組成物は、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）の合成を促進させ、活性度を増加させて、インスリン抵抗性を改善させることができる。

【0035】

すなわち、アモジアキンまたはその薬剤学的に許容可能な塩を単独製剤として使用するか、メトホルミン等のビグアニド薬物のような抗糖尿薬物を単独製剤として使用する場合にも、血糖を調節し、脂肪蓄積を抑制する等、ある程度効果を示すが、これは、僅かな水準に過ぎない。しかしながら、これらに対する複合製剤の場合には、血糖調節および脂肪蓄積の抑制（特に、肝組織の中性脂肪蓄積の抑制）等に大きい相昇効果を有し得る。

【0036】

これらに対する複合製剤を含む組成物は、ＰＰＡＲ−γの活性化に反応する第２型糖尿病およびＰＰＡＲ−αの活性化に反応する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患および脂肪肝よりなる群から選ばれる一つ以上を同時に予防または治療するためのものであってもよい。前記肥満、異常脂質血症、心血管系疾患および脂肪肝よりなる群から選ばれる一つ以上は、ＰＰＡＲ−γの活性化による副作用として見られる。この際、前記異常脂質血症は、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高中性脂肪血症（Ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、および高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）よりなる群から選ばれる一つ以上であってもよい。

【0037】

前記アモジアキンおよび前記抗糖尿薬物の重量比は、１：０．０１〜１：５００であってもよい。具体的に、前記抗糖尿薬物がビグアニド薬物である場合、前記アモジアキンおよび前記抗糖尿薬物の重量比は、１：５０〜１：５００であることが好ましく、１：３００〜１：５００であることがより好ましいが、これらに限定されない。また、前記抗糖尿薬物がＤＰＰ−４抑制剤である場合、前記アモジアキンおよび前記抗糖尿薬物の重量比は、１：１〜１：２０であることが好ましく、１：１０〜１：２０であることがより好ましいが、これらに限定されない。また、前記抗糖尿薬物がナトリウムブドウ糖共輸送体抑制剤である場合、前記アモジアキンおよび前記抗糖尿薬物の重量比は、１：０．０２〜１：２であることが好ましく、１：１〜１：２であることがより好ましいが、これらに限定されない。また、前記抗糖尿薬物がグルカゴン様ペプチド−１作用剤である場合、前記アモジアキンおよび前記抗糖尿薬物の重量比は、１：０．０１〜１：０．０５であることが好ましく、１：０．０２〜１：０．０５であることがより好ましいが、これらに限定されない。

【0038】

この際、アモジアキンの重量比があまり大きくなれば、細胞毒性による問題点があり、抗糖尿薬物の重量比があまり大きくなれば、相対的なアモジアキンの重量比が小さくなって、ＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−αを十分に活性化させないという問題点がある。

【0039】

本発明で使用される用語「治療」というのは、本発明による薬学的組成物の投与により糖尿病に対する症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味する。

【0040】

これより、薬学的組成物として製造するために通常的に使用する適切な担体、賦形剤、および希釈剤をさらに含むことができる。また、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口型剤形、外用剤、坐剤、および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。

【0041】

前記組成物に含まれ得る担体、賦形剤、および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、および鉱物油等がある。前記組成物を製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調製される。

【0042】

本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レべルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、およびその他医学分野によく知られている要素に応じて決定され得る。

【0043】

本発明による薬学的組成物は、治療効果を増進させるために、好ましくは、併用される薬物と同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、別途に（ｓｅｐａｒａｔｅ）、または順次に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）投与され得、単一または多重投与され得る。上記した要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。具体的に、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内で活性成分の吸収度、不活性率および排泄速度、疾病の種類、併用される薬物によって変わり得る。

【0044】

本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与され得る。投与のすべての方式は、予想され得るが、例えば、経口投与、鼻腔内投与、経気管支投与、動脈注射、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、または腹腔内注射により投与され得る。一日投与量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは８ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回〜数回に分けて投与することが好ましいが、これに制限されるものではない。前記薬学的組成物の一日投与量が８ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇを維持する場合、ＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−αの両方を活性化させることができると共に、細胞毒性による問題点を最小化することができるという利点を有する。

【0045】

本発明の薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重、および疾患の重症度等の様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類によって決定される。

【0046】

本発明の他の様態として、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含むＰＰＡＲ−γの活性化による副作用を抑制しつつ、糖尿病を治療する方法を提供する。

【0047】

本発明で「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス、ラット、犬、猫、馬、および牛等の哺乳類を意味する。

【0048】

しかも、本発明は、前記薬学的組成物を含むＰＰＡＲ−γの活性化による副作用を抑制しつつ、糖尿病を予防または治療するための用途を提供する。

【実施例】

【0049】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

【0050】

［準備例］
下記実施例で使用したアモジアキン、メトホルミンは、シグマアルドリッチ社から購入して使用し、シタグリプチンは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入して使用し、ダパグリフロジン、エキセナチドは、ＳＵＮＧＷＯＯ ＢＩＯＰＨＡＲＭ社から購入した。

【0051】

［実施例］
実施例１．アモジアキンによるＰＰＡＲ−γまたはＰＰＡＲ−αの活性化の測定
アモジアキンがＰＰＡＲ−γまたはＰＰＡＲ−αのリガンドとして作用するかを調べるために、三つのベクターを使用した。ｐＺｅｏベクターのＳＶ４０プロモーターに酵母の転写因子であるＧＡＬ４−ＤＢＤ（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）とヒトＰＰＡＲ−γ−ＬＢＤ（ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）またはＰＰＡＲ−α−ＬＢＤ（ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を発現するベクターとＧＡＬ４遺伝子が結合できる塩基配列（５’−ＣＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＧ−３’）が８回繰り返された遺伝子をレポータ遺伝子であるルシフェラーゼに結合させたベクターおよびトランスフェクション対照群としてβ−ガラクトシダーゼを発現するベクターを使用して公知の方法（Ｃｅｌｌ、６８：８７９−８８７，１９９２）により行った。

【0052】

ルシフェラーゼ発現の活性化は、ＢＥ（２）Ｃ細胞をＧＡＬ４−ＰＰＡＲ−γ−ＬＢＤプラスミドまたはＧＡＬ４−ＰＰＡＲ−α−ＬＢＤプラスミドとＧＡＬ４−ルシフェラーゼベクター、β−タガラクトシダーゼベクターで形質変形させた６時間後、アモジアキンを２０時間処理した細胞を５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した後に測定した。この際、アモジアキンを濃度別（０．０１〜５０μＭ）に一緒に処理した実験群、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．３％を処理した対照群、ＰＰＡＲ−γリガンドとして公知となった化合物であるロシグリタゾン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を濃度別（０．００１〜５０μＭ）に一緒に処理した陽性対照群、ＰＰＡＲ−αリガンドとして公知となった化合物であるＷＹ−１４，６４３（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を濃度別（０．０１〜５０μＭ）に一緒に処理した陽性対照群およびアモジアキンの類似体として公知となった化合物であるクロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）（７−ｃｈｌｏｒｏ−４−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を濃度別（０．００１〜５０μＭ）に一緒に処理した陽性対照群を比較した。前記実験結果は、実験群と対照群のｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した。

【0053】

その結果、図１（ａ）および図１（ｂ）に示したように、ＰＰＡＲ−γリガンドとして公知となった化合物であるロシグリタゾンを処理した陽性対照群に比べて、アモジアキンを処理した群が濃度依存的にさらに高いＰＰＡＲ−γ活性を示すことが分かるが、ＰＰＡＲ−αリガンドとして公知となった化合物であるＷＹ−１４，６４３を処理した陽性対照群およびアモジアキンの類似体として公知となった化合物であるクロロキンでは、ＰＰＡＲ−γ活性が示されなかった。また、図１（ｃ）および図１（ｄ）に示したように、ＰＰＡＲ−αリガンドとして公知となった化合物であるＷＹ−１４，６４３を処理した陽性対照群と類似にアモジアキンを処理した群において濃度依存的に高いＰＰＡＲ−α活性を示したが、ＰＰＡＲ−γリガンドとして公知となった化合物であるロシグリタゾンを処理した陽性対照群およびアモジアキンの類似体として公知となった化合物であるクロロキンでは、ＰＰＡＲ−α活性がないことが分かった。

【0054】

したがって、アモジアキン処理がＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−αの活性の両方を促進する効能があることを確認し、前記アモジアキンをＰＰＡＲ−γと関連した疾病である第２糖尿病等に対する予防または治療用に用いることができることが分かり、ＰＰＡＲ−α信号により調節される肥満、異常脂質血症、心血管系疾患、脂肪肝等に対する予防または治療用に用することができることが分かった。

【0055】

また、図１（ｂ）および図１（ｄ）の結果から、アモジアキンは、ベンゼン環とヒドロキシル基が置換されている構造的特徴によってＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−αの活性の両方を促進するものであって、アモジアキンの類似体であるとしても、同じ活性を促進しないことが分かった。

【0056】

実施例２．アモジアキンによるＣ２Ｃ１２筋管細胞のブドウ糖吸収値（ｕｐｔａｋｅ）効果の測定
筋肉、脂肪、間細胞等では、インスリンによる信号伝達によりインスリン受容体の燐酸化が起こり、これに伴い、下位に位置している様々な蛋白質がリン酸化すると、ブドウ糖吸収能が増加するようになって、結果的に血糖を低下させる。したがって、アモジアキンが糖尿病に効果があるか否かを確認するために、ブドウ糖吸収能の評価実験を行った。筋肉細胞であるＣ２Ｃ１２筋芽細胞を１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が入っているＤＭＥＭで培養した。細胞密度が約８０〜９０％になったとき、２％ウマ血清が入っているＤＭＥＭ培養液に置換して、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を筋管細胞へ細胞分化を誘導して、完全に分化させた後、実験を行った。完全に分化したＣ２Ｃ１２筋管細胞に０．５％ＢＳＡが入っているＤＭＥＭ培地と共にそれぞれ１０および３０μＭ濃度のアモジアキンと、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１％およびブドウ糖吸収能の陽性対照群として公知された化合物であるロシグリタゾン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）５０μＭをよく混ぜた後、２４時間処理した。２４時間処理した後、培地を除去し、３７℃に維持されるプレートの上でＫＲＰ（０．１％ＢＳＡ＋５ｍＭのブドウ糖）バッファー３ｍｌで洗浄して、残余試料を除去した。洗浄は、２０分間隔で３回繰り返した。次に、１ｍｌのＫＲＰバッファーを注入し、３７℃で標識されない２−ＤＯＧと［^３Ｈ］２−ＤＯＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を共にＫＲＰバッファーに溶かした溶液（０．２ｍＭ、０．２μＣｉ）を加えて、正確に１０分間処理した。冷たいリン酸緩衝食塩水３ｍｌで洗浄して、ブドウ糖吸収能反応を中止させ、リン酸緩衝食塩水で２回さらに洗浄した後、細胞を１時間程度通風乾燥させた後、０．１％ＳＤＳ １ｍｌを加えて、ピペットで押し引きしながら溶解させ、溶解物３００μｌを取って、液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）で放射能を測定した。

【0057】

その結果、図２に示したように、アモジアキン処理群のブドウ糖吸収値が陽性対照群であるロシグリタゾン処理群のブドウ糖吸収値に比べてさらに増加したことを確認した。

【0058】

したがって、前記結果からアモジアキンが細胞内で糖尿病治療剤の代表的な標的蛋白質であるＰＰＡＲ−γの活性を増加させて、筋肉細胞の内部にブドウ糖吸収を促進させる効果があることが分かった。

【0059】

実施例３．アモジアキンによるマウスの血糖降下効果および血糖調節効果の測定
３−１．アモジアキンおよび陰性対照群の投与
Ｃｌｅａ Ｊａｐａｎ社から購入した５週齢のＫＫＡｙを１週間予備飼育した後、５匹ずつ２グループに分けた。

【0060】

第１グループは、リン酸緩衝食塩水を投与して陰性対照群に設定し、第２グループは、アモジアキン１８ｍｇ／ｋｇの濃度で６週間毎日経口投与した。

【0061】

３−２．マウスの空腹血糖降下効果および血糖調節効果の測定
６週間空腹血糖は、１２時間絶食させた後、１、２、５、６週に尾静脈から全血を採取して測定した。血糖の測定には、血糖ストリップ（韓国京畿道、ミドリ十字社）を利用した。前記実験結果は、実験群と対照群のｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。そして、血糖調節効果を確認するために、１６時間絶食させた後、対照および実験実行群動物の腹腔に２ｇ／ｋｇのブドウ糖を注入し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ，ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を利用した。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。

【0062】

その結果、図３（ａ）に示したように、空腹血糖は、対照群に比べてアモジアキンを摂取したマウスで顕著に減少したことを確認した。そして、図３（ｂ）に示したように、対照群に比べてアモジアキン投与群でブドウ糖を投与し、２時間後に血中ブドウ糖が早く減少したことを確認した。具体的に、対照群の空腹血糖は、１３２．４ｍｇ／ｄｌであったが、アモジアキン投与群の空腹血糖は、１００．２ｍｇ／ｄｌであり、対照群の糖負荷２時間後に、血糖は、２９３．２ｍｇ／ｄｌであったが、アモジアキンの血糖は、２０７ｍｇ／ｄｌだった。

【0063】

したがって、アモジアキンが血中ブドウ糖の濃度を減少させる優れた効果を示すので、アモジアキンを有効成分として含む薬学的組成物が糖尿病の予防または治療のために有用に使用することができることが分かり、空腹血糖を減少させる作用があるので、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤として有用に使用することができることが分かった。

【0064】

実施例４．アモジアキンによる糖化血色素（ＨｂＡ１Ｃ）の含量に及ぼす影響
血液中に分布するブドウ糖の一部が赤血球と堅固に結合をするようになるが、これを糖化血色素（ＨｂＡ１Ｃ）という。血糖調節は、血糖値だけでなく、必ず糖化血色素の数値を共に調査するようになる。これは、糖化血色素１％減少により糖尿による合併症２０％以上減少させる効果があるためである。本実施例では、アモジアキン摂取によるマウスの糖化血色素の含量を調べることとした。

【0065】

４−１．アモジアキンおよび陰性対照群の投与
アモジアキンによるマウスの糖化血色素を測定するために、５週齢のＫＫＡｙをＣｌｅａ Ｊａｐａｎ社から購入して、１週間予備飼育した後、５匹ずつ２グループに分けた。前記実施例３と同様に、実験動物の第１グループは、リン酸緩衝食塩水を投与して対照実行群に設定し、第２グループは、アモジアキンを１８ｍｇ／ｋｇの濃度で６週間毎日１ｍｌ注射器を介して経口投与した。

【0066】

４−２．マウスの糖化血色素の測定
アモジアキンの糖化血色素の低下効果を測定するために、対照および実験実行群の動物の尾静脈から全血を採取してｅａｓｙ Ａ１ｃカートリッジに注入した後、ｅａｓｙ Ａ１ｃアナライザー（韓国ソウル、アサン製薬社）を利用して測定した。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊＊ｐ＜０．００５）。

【0067】

その結果、図４に示したように、対照群マウスに比べてアモジアキンの摂取マウスで糖化血色素の生成が６９％近く抑制されたことを確認した。

【0068】

したがって、アモジアキンが糖化血色素を減少させる効果があることが分かった。

【0069】

実施例５．アモジアキンによる体重減少の測定
５−１．実験動物の設計および実験食の組成
アモジアキンによるマウスの体重減少を測定するために、７週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（日本東京、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ社）を購入して、一定の条件（温度：２２±２℃、相対湿度：５５±１０％、一周期：１２時間）で飼育した。７匹を一つの群としてケージで水と飼料を自由供給し、実験前に１週間純化を経て実験に使った。

【0070】

順応期間が終わった後、７個の群に分けて、下記表１のような期間中に飼料とアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３、ロシグリタゾン）投与を行った。

【0071】

【表1】

【0072】

５−２．マウスの体重変化の測定
体重変化の調査は、正常飼料を給与したマウスと、高脂肪を給与した高脂肪食誘導性マウス、および高脂肪にアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）を投与した高脂肪食誘導性マウスを、１週１回午前１０時を基準として２１週間電子秤（Ｄｒａｇｏｎ ２０４／Ｓ、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，ＵＳＡ）を使用して体重を測定した。体重平均は、グループ当たり７匹のマウスの体重を合算し、マウス数で割って、それぞれの平均体重とした。前記実験結果は、高脂肪食誘導性対照群と、アモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）間の集団別ｔ検定を実施してその有意性を検証し、統計学的に大きく有意な差異を示した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。

【0073】

実験結果、図５（ａ）に示したように、アモジアキン投与群の高脂肪食誘導性マウスの体重は、高脂肪食誘導性肥満マウスの体重より顕著に減少することを観察することができ、陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３）と類似していることを観察することができた。高脂肪で肥満を誘導した後、アモジアキンを投与した図５（ｃ）の場合にも、高脂肪食誘導性肥満マウスの体重より顕著に減少することを観察することができた。他方で、ＰＰＡＲ−γの作用剤である陽性対照群（ロシグリタゾン）の場合、高脂肪食誘導性肥満マウスと類似しているか、またはそれよりさらに体重が増加することを確認することができた。

【0074】

５−３．高脂肪食誘導性マウスの飼料摂取量の測定
飼料摂取量の調査は、正常飼料を食べて成長したマウスと、高脂肪を摂取した高脂肪食誘導性マウス、および高脂肪にアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）を投与した高脂肪食誘導性マウスを、毎日午前１１時を基準として摂取量を測定した。飼料摂取量の平均は、グループ当たり７匹であるので、７で割って、それぞれの平均飼料摂取量とした。毎日食べた摂取量は、ｋｃａｌに換算して示した。実験結果、図５（ｂ）および図５（ｄ）に示したように、アモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）を投与した高脂肪食誘導性マウスの飼料摂取量と高脂肪食誘導性マウスの飼料摂取量との間の差異がないことを観察することができた。

【0075】

前記結果は、アモジアキンが、飼料摂取量に関係なく、マウスの体重を減少させる効果があり、したがって、前記アモジアキンが抗肥満医薬品として用いることができることを示す。

【0076】

実施例６．アモジアキンによる熱生産効果の測定
脂肪細胞は、脂肪の蓄積に作用する白色脂肪細胞と、非常に少ない量であるが、熱生産に作用する褐色脂肪細胞とに区分される。褐色脂肪細胞は、食事後に身体が暖かくなる食事誘導性熱生産作用があり、気温が低くなると、活動が増加し、熱を生産して、体温を維持する機能をする。肥満の実験モデルである遺伝性肥満動物であるｏｂ／ｏｂマウスは、褐色脂肪細胞の機能が良くないので、４℃の低温に露出させると、体温が次第に下降し、４時間程度後には死んでしまう。褐色脂肪細胞の機能が正確に行われないと、日常温度で熱として失われるエネルギーが少ないので、過剰エネルギーが蓄積されて、肥満が発生する可能性が高い。したがって、本実施例では、アモジアキン投与による高脂肪食誘導性マウスの熱生産能力を調べることとした。

【0077】

６−１．高脂肪食誘導性マウスの熱生産能力の測定
実施例５で設計した実験動物のうち１４週間の高脂肪食を摂取したマウスを対象として熱生産能力を測定するために、４℃冷却試験を実施した（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ Ｂ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，．Ｃｅｌｌ ９２：８２９−８３９，１９９８）。以下、前記測定方法を詳しく説明する。高脂肪食誘導性マウスグループのマウスを４℃に露出させる前に体温を測定して、実験開始測定温度として記録し、４℃ルームに６時間まで露出して毎時ごとに体温を測定した。体温は、マウス用直腸温度計（ｔｅｓｔｏ ９２５，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して測定した。熱生産測定値は、毎時ごとに測定した温度を示した。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検定を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【0078】

実験結果、図６に示したように、アモジアキン投与群の高脂肪肥満誘導マウスが、高脂肪肥満誘導マウスに比べて体温の減少が少ないことが確認されて、熱生産効果に優れていることが分かった。

【0079】

したがって、前記結果から本発明によるアモジアキンが高脂肪食誘導性マウスの熱生産活性を高めて、熱として生産されるエネルギーが多いので、肥満になる可能性を低減する効果があることが分かった。

【0080】

実施例７．アモジアキンによるマウスの血糖調節効果の測定
本実施例では、実施例５で設計した実験動物を対象として血糖調節効果を測定するために、糖負荷試験とインスリン負荷試験を実施した。

【0081】

７−１．マウスの経口糖負荷試験の測定
１６時間絶食させた後、対照および実験実行群の動物を対象として２ｇ／ｋｇのブドウ糖を経口投与し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ，ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を利用した。前記実験結果は、高脂肪食誘導性マウス対照群と、アモジアキン、陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３）および正常飼料摂取マウス間の集団別ｔ検定を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【0082】

その結果、図７（ａ）に示したように、高脂肪食誘導性マウス対照群に比べてアモジアキン投与群においてブドウ糖を投与して２時間後に血中ブドウ糖が早く減少したことを確認した。具体的に、高脂肪食誘導性マウス対照群の糖負荷２時間後に、血糖は、１８０．５ｍｇ／ｄｌであったが、アモジアキンの血糖は、１３９．１ｍｇ／ｄｌであった。

【0083】

したがって、アモジアキンが血中ブドウ糖の濃度を減少させる優れた効果を示すので、アモジアキンを有効成分として含む薬学的組成物がインスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤および治療剤として有用に使用することができることが分かった。

【0084】

７−２．マウスのインスリン負荷試験の測定
１６時間絶食させた後、対照および実験実行群の動物を対象として０．５Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔に投与し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、インスリン負荷試験（ＩＰＩＴＴ，ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を利用した。前記実験結果は、高脂肪食誘導性マウス対照群と、アモジアキン、陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）および正常飼料摂取マウス間の集団別ｔ検定を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【0085】

その結果、図７（ｂ）に示したように、高脂肪食誘導性マウス対照群および実験群でインスリンを投与してインスリン抵抗性を測定した結果、すべての群において３０分で血糖が最も最低値を示し、その後、徐々に増加した。高脂肪食誘導性マウス対照群は、１２０分に血糖が空腹血糖まで上昇し、正常飼料摂取群、陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３）、アモジアキン投与群では、２時間後に血中ブドウ糖が空腹血糖より低いレベルに血糖が維持された。そして、図７（ｃ）の高脂肪誘導を介したインスリン抵抗性が作用した肥満マウス対照群と実験群にインスリンを投与し、初期血糖の％で示した。インスリン抵抗性を測定した結果、高脂肪食誘導性マウスとアモジアキン投与群では、３０分で最も最低値を示し、その後、徐々に増加した。陽性対照群（ロシグリタゾン）および正常飼料摂取群では、６０分で血糖が最も最低値を示し、その後、徐々に増加された。高脂肪食誘導性マウス対照群は、１２０分に血糖が初期血糖の７０％近くに上昇し、正常飼料摂取群、陽性対照群（ロシグリタゾン）、アモジアキン投与群では、２時間後に血中ブドウ糖が初期血糖の４０〜４５％程度に血糖が維持された。

【0086】

したがって、アモジアキンの摂取がインスリン感受性を増加させる作用があるので、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤として有用に使用することができることが分かった。

【0087】

実施例８．アモジアキンによる脂肪肝予防効果の測定
脂肪肝の原因は、アルコールの過多摂取に起因して発生するアルコール性脂肪肝を除いて、高熱量と高脂肪食、単純糖の摂取と関連した栄養不均衡が挙げられる。特に高熱量または高脂肪食の持続的な摂取は、肝での脂肪合成と分解間の脂質代謝障害を招き、脂肪肝を誘発する。

【0088】

これより、本実施例では、アモジアキンの処理による脂肪肝の誘発に及ぼす影響を検討した。

【0089】

８−１．高脂肪食誘導性マウスグループの組織採取
実施例５で設計した実験動物のうち１４週間高脂肪と共に薬物を給与した高脂肪食誘導性マウスグループと１５週間高脂肪で誘導した後に７週間高脂肪と共に薬物を給与した高脂肪食誘導性マウスを頚椎脱骨法で犠牲にさせた後、解剖用固定フレームに固定し、手術用メスで腹部を切開して、肝を摘出した。摘出された肝組織は、縮化した変形を防止するために１０％ホルマリン溶液に固定した。固定された組織は、２４時間後に流れる水に水洗した後、一般的な組織の脱水、透明および浸透過程を自動組織処理装置（６４６０Ｂ、Ｓａｋｕｒａ，Ｊａｐａｎ）を使用して１４時間処理し、パラフィンブロックの製作と冷却は、自動包埋装置（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，Ｊａｐａｎ）を使用した。製作されたパラフィンブロックを回転式ミクロトーム（Ｒｏｔａｒｙ Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ ２０４０，Ｊａｐａｎ）を使用して組織を垂直方向に厚さ４〜５μｍで連続切片して、浮遊温水槽と伸展器の過程を経てスライドに付着させた。

【0090】

８−２．アモジアキンによる脂肪肝予防効果の観察
薄切した組織切片をヘマトキシリンで染色した後、過染色された部分は、流れる水道水に水洗した後、１％ＨＣＬ、７０％Ａ／Ｃ溶液に３〜５回浸漬することによって、核を青化した。次に、水洗を５〜１０分程度十分に水洗して、核が清明な色になるように細胞質対照染色で染色した後、１５秒間過度なエオシン溶液を流れる水で洗浄し、脱水および透明過程を経た。光学顕微鏡（ＢＸ５０，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）を使用してそれぞれの肝組織を観察し、顕微鏡に装着されたＣＣＤカメラ（ＰＭ−Ｃ３５ＤＸ，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）で各群の組織を撮影した。

【0091】

実験結果、図８（ａ）と図８（ｂ）に示したように、高脂肪食誘導性マウスの肝は、脂肪で満たされているのに対し、アモジアキン投与群の高脂肪食誘導性マウスの肝の場合、ほぼ正常マウスの肝と同じ形態を有することを確認することができた。

【0092】

したがって、前記結果から本発明によるアモジアキンが脂肪肝抑制効果に優れていることが分かった。

【0093】

実施例９．アモジアキン投与による肝、筋肉、脂肪組織内ＰＰＡＲ−αの活性化によるターゲット遺伝子の発現確認
ＰＰＡＲ−αは、脂肪酸の酸化代謝経路に関与する酵素の遺伝子であるＡＣＯＸ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｏｘｉｄａｓｅ）、ＣＰＴ−１（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１）、およびｍＣＡＤ（ｍｅｄｉｕｍ ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現を誘導して、脂肪酸の合成を減少させると知られている。したがって、前記ＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ遺伝子の発現量を測定すると、脂肪酸の酸化効能を把握することができる。これより、本実施例では、肝、筋肉、脂肪組織にアモジアキンの投与がＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ遺伝子の発現量に及ぼす影響を調べた。

【0094】

各組織は、実施例５で設計した実験動物のうち１４週間高脂肪を給与した高脂肪食誘導性マウスグループのマウスを頚椎脱骨法で犠牲にさせた後、解剖用固定フレームに固定し、手術用メスで切開して、肝、筋肉、脂肪組織を摘出して使用し、β−アクチン、ＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤのプライマー塩基配列は、それぞれ次の通りである。

【0095】

β−アクチン フォワード：５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＣＡ ＴＴＧ−３’
リバース：５’−ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＡＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＴ−３’
ＡＣＯＸ フォワード：５’−ＡＣＡ ＣＴＡ ＡＣＡ ＴＡＴ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧ−３’
リバース：５’−ＣＡＴ ＴＧＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＧＡＣ ＣＡＧ−３’
ＣＰＴ−１ フォワード：５’−ＣＣＡ ＣＣＴ ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＣＴ ＣＴＡ Ｔ−３’
リバース：５’−ＴＴＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＣＣ Ａ−３
ｍＣＡＤ フォワード：５’−ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＧＴ ＴＧＧ ＣＧＴ ＡＴＧ−３’
リバース：５’−ＡＧＣ ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＡＴ Ｔ−３’

【0096】

各組織を粉砕機を利用して粉砕した後、Ｔｒｉｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ，ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用してｃＤＮＡを合成した。対照群としては、β−アクチンを使用し、ＰＰＡＲ−αの活性化によるターゲット遺伝子および脂肪酸の分解に関与するＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ遺伝子の発現量を調べるために、それぞれのプライマーを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ，Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った（９５℃で３分、＜９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で３０秒＞３９回、９５℃で１０秒、６５℃で５秒）。ＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤをβ−アクチンで補正して、結果値を算出した。前記実験結果は、高脂肪食誘導性マウス対照群とアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３）マウス間の集団別ｔ検定を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【0097】

その結果、図９（ａ）、図９（ｂ）、図９（ｃ）に示したように、アモジアキンを投与した実験群において対照群に比べてほぼ２１５倍以上遺伝子発現量が増加したことを確認した。

【0098】

したがって、アモジアキンの処理がＰＰＡＲ−αの活性化によるターゲット遺伝子であり、脂肪酸の分解に関与するＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ遺伝子の発現を各組織で増加させることから見て、アモジアキンがＰＰＡＲ−αを活性化させて、ＰＰＡＲ−αのターゲット遺伝子の発現を調節することができることを意味し、脂肪酸の酸化を促進させて、脂肪蓄積を抑制させることができるものと判断された。

【0099】

実施例１０．アモジアキン投与による脂肪組織内抗炎症反応によるターゲット遺伝子の発現確認
脂肪細胞は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）および前駆脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）から分化し、脂質代謝機能、糖代謝機能、ひいてはアディポサイトカイン分泌に変化をもたらす。肥満患者において増加するＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ等は、脂肪細胞の炎症発現で脂肪分化を促進し、その他成人病罹患率を増加させる。ＴＮＦ−αは、炎症反応で重要な作用をする細胞分泌物質であり、ＭＣＰ−１は、炎症性ケモカインであって、脂肪細胞で分泌されて、肥満、インスリン抵抗性、動脈硬化症に影響を及ぼすものと知られている。また、ｉＮＯＳは、炎症性前駆物質であって、炎症反応を促進させるものと知られている。

【0100】

したがって、前記ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ遺伝子の発現量を測定すると、抗炎症効能を把握することができる。これより、本実施例では、脂肪組織でアモジアキン投与がＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ遺伝子の発現量に及ぼす影響を調べた。

【0101】

各組織は、実施例５で設計した実験動物のうち１４週間高脂肪を給与した高脂肪食誘導性マウスグループのマウスを頚椎脱骨法で犠牲にさせた後、解剖用固定フレームに固定し、手術用メスで切開して、脂肪組織を摘出して使用し、β−アクチン、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳのプライマー塩基配列は、それぞれ次の通りである。

【0102】

β−アクチン フォワード：５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＣＡ ＴＴＧ−３’
リバース：５’−ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＡＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＴ−３’
ＴＮＦα フォワード：５’−ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＴＣＣ ＣＡＡ ＡＴＧ ＧＣ−３’
リバース：５’−ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＴＣ ＴＧＡ ＧＴＧ ＴＧＡ Ｇ−３’
ＭＣＰ−１ フォワード：５’−ＡＡＴ ＧＡＧ ＴＡＧ ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＡＧ−３’
リバース：５’−ＴＣＴ ＣＴＴ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＧＡＣ−３
ｉＮＯＳ フォワード：５’−ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＡＣＴ ＧＡＧ ＴＡＡ−３’
リバース：５’−ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＴ−３

【0103】

脂肪組織を粉砕機を用いて粉砕した後、Ｔｒｉｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いてｃＤＮＡを合成した。対照群としては、β−アクチンを使用し、炎症反応に関与するＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ遺伝子の発現量を調べるために、それぞれのプライマーを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行った（９５℃で３分、＜９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で３０秒＞３９回、９５℃で１０秒、６５℃で５秒）。ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳをβ−アクチンで補正して結果値を算出した。前記実験結果は、高脂肪食誘導性マウス対照群とアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３）マウス間の集団別ｔ検定を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。

【0104】

その結果、図１０に示したように、アモジアキンを投与した実験群において対照群に比べてほぼ５４０％近く遺伝子発現量が減少したことを確認した。

【0105】

したがって、アモジアキンの処理が抗炎症反応に関与するＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ遺伝子の発現を各組織で抑制させることから見て、アモジアキンが炎症反応に重要な作用をする因子を抑制することによって、肥満、インスリン抵抗性、動脈硬化症に影響を及ぼすと判断された。

【0106】

実施例１１．アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤の投与による肝細胞内の糖新生作用の抑制に対する相昇効果の測定
血糖調節ホルモンであるインスリンとグルカゴンは、肝組織の糖代謝酵素であるＰＥＰＣＫ活性度を調節するものと知られている。インスリンは、糖新生酵素であるＰＥＰＣＫの活性度を低減することによって、糖新生作用を抑制して肝組織の糖生成過程を減らす。他方で、グルカゴンは、グルコキナーゼの遺伝子発現を抑制し、肝組織のＧ６Ｐａｓｅ活性度およびｍＲＮＡ発現とＰＥＰＣＫ転写過程を促進するので、少量のグルカゴン濃度の増加が糖新生作用を増加させる。ＰＥＰＣＫは、糖新生過程の律速酵素であって、オキサロアセテートがホスホエノールピルベートに転換される反応を触媒すると知られている。したがって、前記ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現量を測定すると、糖新生作用を把握することができる。これより、本実施例では、肝細胞にアモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤の処理がＰＥＰＣＫ遺伝子の発現量に及ぼす影響を調べた。

【0107】

細胞は、韓国細胞株銀行から購入したヒト肝細胞を使用し、β−アクチンおよびＰＥＰＣＫのプライマー塩基配列は、それぞれ次の通りである。

【0108】

β−アクチン フォワード：５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＣＡ ＴＴＧ−３’
リバース：５’−ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＡＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＴ−３’
ＰＥＰＣＫ フォワード：５’−ＣＡＧ ＴＴＧ ＡＧＴ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＡＡ−３’
リバース：５’−ＧＡＴ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＴＧ ＡＣＣ ＴＴＧ ＡＡ−３’

【0109】

細胞は、５％ＣＯ_２、３７℃培養器でＨｅｐＧ２肝細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン）に培養した後、血清が入っていないＤＭＥＭと共にアモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤を処理して２４時間培養した後、Ｔｒｉｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いてｃＤＮＡを合成した。対照群としては、β−アクチンを使用し、ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現量を調べるために、プライマーを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行った（９５℃で３分、＜９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で３０秒＞３９回、９５℃で１０秒、６５℃で５秒）。ＰＥＰＣＫをβ−アクチンで補正して結果値を算出した。前記実験結果は、実験群と対照群のｔ検定（ｔ−ｔｅｓｔ）で比較検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【0110】

その結果、図１１に示したように、アモジアキン１０μＭおよびメトホルミン２ｍＭの複合製剤の処理が、アモジアキン１０μＭ単独またはメトホルミン２ｍＭ単独処理の場合より大きい相昇作用が確認された。したがって、アモジアキン１０μＭおよびメトホルミン２ｍＭの複合製剤の処理が、肝で糖新生過程の主な酵素であるＰＥＰＣＫ遺伝子発現を抑制することによって、空腹時に血糖を低減することができるものと判断されて、関連した疾病である糖尿病に対する治療用に用いることができることが分かった。

【0111】

実施例１２．アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤の投与による肝細胞内脂質代謝関連中性脂肪とリン脂質の生合成抑制に対する相昇効果の測定
ＳＲＥＢＰ−１は、脂質代謝関連中性脂肪とリン脂質の生合成に関連した遺伝子の調節に関与して脂肪生成と体脂肪蓄積を抑制すると知られており、或る研究では、高度肥満とインスリン抵抗性が特徴であるｏｂ／ｏｂマウスで発生した脂肪肝の病変でＳＲＥＢＰ−１遺伝子を不活性化させるようになると、肝組織の中性脂肪の蓄積が減少すると報告された。したがって、前記ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の発現量を測定すると、肝組織の中性脂肪の蓄積が減少する効能を把握することができる。これより、本実施例では、肝細胞にアモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤の処理がＳＲＥＢＰ−１遺伝子の発現量に及ぼす影響を調べた。

【0112】

細胞は、韓国細胞株銀行から購入したマウス肝細胞を使用し、β−アクチン、およびＳＲＥＢＰ−１のプライマー塩基配列は、それぞれ次の通りである。

【0113】

β−アクチン フォワード：５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＣＡ ＴＴＧ−３’
リバース：５’−ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＡＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＴ−３’
ＳＲＥＢＰ−１ フォワード：５’−ＣＧＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＣＣＧ ＣＴＴ ＣＴＴ Ｇ−３’
リバース：５’−ＧＧＴ ＣＣＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＧＣ ＴＴ−３’

【0114】

細胞は、５％ＣＯ_２、３７℃培養器でＨｅｐＧ２肝細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）に培養した後、血清が入っていないＤＭＥＭと共にアモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤を処理して２４時間培養した後、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＲＮＡを分離した後、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いてｃＤＮＡを合成した。対照群としては、β−アクチンを使用し、ＳＲＥＢＰ−１遺伝子の発現量を調べるためにプライマーを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行った（９５℃で３分、＜９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で３０秒＞３９回、９５℃で１０秒、６５℃で５秒）。ＳＲＥＢＰ−１をβ−アクチンで補正して結果値を算出した。前記実験結果は、実験群と対照群のｔ検定で比較検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。

【0115】

その結果、図１２に示したように、アモジアキン１０μＭおよびメトホルミン２ｍＭの複合製剤の処理が、アモジアキン１０μＭ単独またはメトホルミン２ｍＭ単独処理の場合より大きい相昇作用が確認された。したがって、アモジアキン１０μＭおよびメトホルミン２ｍＭの複合製剤の処理が肝組織で脂肪酸と中性脂肪の合成に関与する主な蛋白質であるＳＲＥＢＰ−１遺伝子発現を抑制することによって、脂肪肝の病変で肝組織の中性脂肪の蓄積を減少させることができるものと考えられて、関連した脂肪肝に対する治療用に用いることができることが分かった。

【0116】

実施例１３．アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤の投与によるパルミチン酸により誘導されたインスリン抵抗性状態で筋肉細胞内ＧＬＵＴ４遺伝子の発現確認
グルコーストランスポーター４型（ＧＬＵＴ４）の発現は、骨格筋内の多様な転写因子により増加し、ＧＬＵＴ４発現の量的な増加が示されると、インスリン反応性も増加させるとよく知られている（Ｊ Ｍ Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９５：４２９−４３２，１９９５）。したがって、骨格筋内ＧＬＵＴ４のレベルは、身体の血糖調節のために重要なので、前記ＧＬＵＴ４遺伝子の発現量を測定すると、インスリン反応性を把握することができる。これより、本実施例では、パルミチン酸により誘導されたインスリン抵抗性状態でアモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤の処理による筋肉細胞にＧＬＵＴ４遺伝子の発現量に及ぼす影響を調べた。

【0117】

細胞は、韓国細胞株銀行から購入したマウス筋芽細胞を使用し、β−アクチン、およびＧＬＵＴ４のプライマー塩基配列は、それぞれ次の通りである。

【0118】

β−アクチン フォワード：５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＣＡ ＴＴＧ−３’
リバース：５’−ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＡＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＴ−３’
ＧＬＵＴ４ フォワード：５’−ＡＡＡ ＴＣＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＧＣＣ ＴＣＣ−３’
リバース：５’−ＧＣＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＧＴＣ ＣＴＴ ＧＣＣ−３’

【0119】

１×１０^７のＣ２Ｃ１２（マウス筋芽細胞）を２％馬血清で分化させて根冠細胞に製造した後、インスリン抵抗性の条件で実験するために、４００μＭパルミチン酸とアモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤を１６時間処理した後、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）でＲＮＡを抽出した。分離したＲＮＡは、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）を用いて完全性を確認し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いてｃＤＮＡを合成した。対照群としては、β−アクチンを使用し、ＧＬＵＴ４遺伝子の発現量を調べるために、プライマーを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行った（９５℃で３分、＜９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で３０秒＞３９回、９５℃で１０秒、６５℃で５秒）。ＧＬＵＴ４をβ−アクチンで補正して結果値を算出した。前記実験結果は、実験群と対照群のｔ検定で比較検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【0120】

その結果、図１３に示したように、インスリン抵抗性状態を誘導するために分化したＣ２Ｃ１２骨格筋細胞に４００ｕＭのパルミチン酸を１６時間処理したとき、インスリンによりＧＬＵＴ４の発現が大きく増加しないのに対し、アモジアキン１０μＭおよびメトホルミン２ｍＭの複合製剤の処理が、アモジアキン１０μＭ単独またはメトホルミン２ｍＭ単独処理の場合より大きい相昇作用が確認された。したがって、アモジアキン１０μＭおよびメトホルミン２ｍＭの複合製剤の処理が、インスリン抵抗性状態の筋肉細胞内ＧＬＵＴ４遺伝子発現の増加を通じて血糖調節および糖代謝改善に肯定的な影響を及ぼしていることを確認して、関連疾病である糖尿病に対する治療用に用いることができることが分かった。

【0121】

実施例１４．アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤の投与によるマウスの血糖調節効果の測定
１４−１．アモジアキンおよびメトホルミンの単独および複合製剤の投与
アモジアキンおよびメトホルミンの複合製剤による血糖調節効果を測定するために、６週齢のＫＫＡｙをＣｌｅａ Ｊａｐａｎ社から購入して、一定の条件（温度：２２±２℃、相対湿度：５５±１０％、一周期：１２時間）で飼育した。７匹を一つの群としてケージで水と飼料を自由供給し、実験前に１週間純化を経て実験に使用した。

【0122】

順応期間が終わった後、１０個の群に分けて６週間アモジアキンおよびメトホルミン単独および複合製剤を下記表２の重量比で毎日経口投与を行った。

【0123】

【表2】

【0124】

１４−２．マウスの血糖調節効果の測定
血糖調節効果を確認するために、１６時間絶食させた後、対照および実験実行群の動物の腹腔に２ｇ／ｋｇのブドウ糖を注入し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、糖負荷試験（ＯＧＴＴ，ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を用いた。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【0125】

その結果、図１４（ａ）〜（ｄ）に示したように、アモジアキン：メトホルミンの重量比が１：５０および１：１５０より１：３００および１：５００の重量比で投与した複合製剤の投与群において単独投与群よりブドウ糖を投与して２時間後に血中ブドウ糖が早く減少したことを確認した。

【0126】

したがって、アモジアキン単独またはメトホルミン単独投与群の場合より複合製剤の投与群において血中ブドウ糖の濃度を減少させる優れた相昇作用が確認されたので、アモジアキン：メトホルミン１：３００または１：５００の重量比で投与した複合剤が糖尿病の予防または治療のために有用に使用することができることが分かり、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤として有用に使用することができることが分かった。

【0127】

実施例１５．アモジアキンおよびシタグリプチンの複合製剤の投与によるマウスの血糖降下、血糖調節効果および糖化血色素の含量に及ぼす影響
１５−１．アモジアキンおよびシタグリプチンの単独および複合製剤の投与
アモジアキンおよびシタグリプチンの複合製剤による血糖調節効果を測定するために、６週齢のＫＫＡｙをＣｌｅａ Ｊａｐａｎ社から購入して、一定の条件（温度：２２±２℃、相対湿度：５５±１０％、一周期：１２時間）で飼育した。７匹を一つの群としてケージで水と飼料を自由供給し、実験前に１週間純化を経て実験に使用した。

【0128】

順応期間が終わった後、１０個の群に分けて８週間アモジアキンおよびシタグリプチン単独および複合製剤を下記表３の重量比で毎日経口投与を行った。

【0129】

【表3】

【0130】

１５−２．マウスの空腹血糖降下効果の測定
空腹血糖は、１６時間絶食させた後、薬物処理８週に尾静脈から全血を採取して測定した。血糖の測定には、血糖ストリップ（韓国京畿道、ミドリ十字社）を用いた。前記実験結果は、実験群と対照群のｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５）。その結果、図１５の（ａ）〜（ｄ）に示したように、アモジアキン：シタグリプチンの重量比が１：１より１：２，１：１０および１：２０の重量比で投与した複合製剤の投与群において単独投与群より空腹血糖が顕著に減少する相昇効果を確認した。

【0131】

１５−３．マウスの血糖調節効果の測定
血糖調節効果を確認するために、１６時間絶食させた後、対照および実験実行群の動物の腹腔に２ｇ／ｋｇのブドウ糖を注入し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、糖負荷試験（ＯＧＴＴ，ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を用いた。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【0132】

その結果、図１５（ｅ）〜（ｈ）に示したように、アモジアキン：シタグリプチンの重量比が１：１および１：２より１：１０および１：２０の重量比で投与した複合製剤の投与群において単独投与群よりブドウ糖を投与して２時間後に血中ブドウ糖が早く減少したことを確認した。

【0133】

したがって、アモジアキン単独またはシタグリプチン単独投与群の場合より複合製剤の投与群において血中ブドウ糖の濃度を減少させる優れた相昇作用が確認されたので、アモジアキン：シタグリプチンが１：１０または１：２０の重量比で投与した複合剤が、糖尿病予防または治療のために有用に使用することが分かり、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤として有用に使用することができることが分かった。

【0134】

１５−４．マウスの糖化血色素の測定
血糖調節は、血糖値だけでなく、必ず糖化血色素の数値を共に調査するようになる。これは、糖化血色素１％減少により糖尿による合併症２０％以上減少させる効果があるためである。本実施例では、アモジアキンおよびシタグリプチンの複合製剤の摂取によるマウスの糖化血色素の含量を調べることとした。アモジアキンおよびシタグリプチンの複合製剤の糖化血色素の低下効果を測定するために、対照および実験実行群の動物の尾静脈から全血を採取して、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ１ｃ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔに注入した後、ＤＣＡ ｖａｎｔａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（米国、ニューヨーク、シーメンス）を用いて測定した。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５）。

【0135】

その結果、図１５（ｉ）〜（ｌ）に示したように、アモジアキン：シタグリプチンの重量比が１：１または１：２、または１：１０または１：２０の重量比で投与した複合製剤の投与群において単独投与群より糖化血色素生成抑制効果が上昇することを確認した。

【0136】

したがって、アモジアキンおよびシタグリプチンの複合製剤が糖化血色素を減少させる効果があるので、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤として有用に使用することができることが分かった。

【0137】

実施例１６．アモジアキンおよびダパグリフロジンの複合製剤の投与によるマウスの血糖降下、血糖調節効果および糖化血色素の含量に及ぼす影響
１６−１．アモジアキンおよびダパグリフロジンの単独および複合製剤の投与
アモジアキンおよびダパグリフロジンの複合製剤による血糖調節効果を測定するために、６週齢のＫＫＡｙをＣｌｅａ Ｊａｐａｎ社から購入して、一定の条件（温度：２２±２℃、相対湿度：５５±１０％、一周期：１２時間）で飼育した。７匹を一つの群としてケージで水と飼料を自由供給し、実験前に４週間純化を経て実験に使用した。

【0138】

順応期間が終わった後、８個の群に分けて８週間アモジアキンおよびダパグリフロジン単独および複合製剤を下記表４の重量比で毎日経口投与を行った。

【0139】

【表4】

【0140】

１６−２．マウスの空腹血糖降下効果の測定
空腹血糖は、１６時間絶食させた後、薬物処理８週に尾静脈から全血を採取して測定した。血糖の測定には、血糖ストリップ（韓国京畿道、ミドリ十字社）を用いた。前記実験結果は、実験群と対照群のｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．００５）。その結果、図１６（ａ）〜（ｃ）に示したように、アモジアキン：ダパグリフロジンの重量比が１：０．０２および１：０．２より１：２の重量比で投与した複合製剤の投与群において単独投与群より空腹血糖が顕著に減少する相昇効果を確認した。

【0141】

１６−３．マウスの血糖調節効果の測定
血糖調節効果を確認するために、１６時間絶食させた後、対照および実験実行群の動物の腹腔に２ｇ／ｋｇのブドウ糖を注入し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、糖負荷試験（ＯＧＴＴ，ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を用いた。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。

【0142】

その結果、図１６（ｄ）〜（ｆ）に示したように、アモジアキン：ダパグリフロジンの重量比が１：０．０２および１：０．２より１：２の重量比で投与した複合製剤の投与群において単独投与群よりブドウ糖を投与して２時間後に血中ブドウ糖が早く減少したことを確認した。

【0143】

したがって、アモジアキン単独またはダパグリフロジン単独投与群の場合より複合製剤の投与群において血中ブドウ糖の濃度を減少させる優れた相昇作用が確認されたので、アモジアキン：ダパグリフロジン１：２の重量比で投与した複合剤が糖尿病予防または治療のために有用に使用することができることが分かり、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤として有用に使用することができることが分かった。

【0144】

１６−４．マウスの糖化血色素の測定
糖尿病を診断する方法は、血中ブドウ糖測定等様々なものがあるが、血中ブドウ糖測定は、食事、運動等の様々な要因の影響を受けて不正確なので、糖尿病を管理し治療するためには、血液のうち糖化血色素を測定することが効果的な方法の一つである。１９８６年に米国糖尿協会ですべての形態の糖尿病を管理するために、年間２回ずつの糖化血色素の測定を提案することによって、比較的安定した指標である糖化血色素の量を糖尿病管理指標として使用し始めた（韓国公開特許１０−２００９−０００６９９９、２００９年１月１６日に公開）。本実施例では、アモジアキンおよびダパグリフロジンの複合製剤の摂取によるマウスの糖化血色素の含量を調べることとした。アモジアキンおよびダパグリフロジンの複合製剤の糖化血色素の低下効果を測定するために、対照および実験実行群の動物の尾静脈から全血を採取してＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ１ｃ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔに注入した後、ＤＣＡ ｖａｎｔａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（米国、ニューヨーク、シーメンス）を用いて測定した。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。

【0145】

その結果、図１６（ｇ）〜（ｉ）に示したように、アモジアキン：ダパグリフロジンの重量比が１：０．０２より１：０．２または１：２の重量比で投与した複合製剤の投与群において単独投与群より糖化血色素生成抑制効果が上昇することを確認した。

【0146】

したがって、アモジアキンおよびダパグリフロジンの複合製剤が糖化血色素を減少させる効果があるので、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤として有用に使用することができることが分かった。

【0147】

実施例１７．アモジアキンおよびエキセナチドの複合製剤の投与によるマウスの血糖調節効果に及ぼす影響
１７−１．アモジアキンおよびエキセナチドの単独および複合製剤の投与
アモジアキンおよびエキセナチドの複合製剤による血糖調節効果を測定するために、６週齢のｏｂ／ｏｂをＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで購入して、一定の条件（温度：２２±２℃、相対湿度：５５±１０％、一周期：１２時間）で飼育した。７匹を一つの群としてケージで水と飼料を自由供給し、実験前に１週間純化を経て実験に使用した。

【0148】

順応期間が終わった後、６個の群に分けて８週間アモジアキンおよびエキセナチド単独および複合製剤を下記表５の重量比で隔日で皮下注射で隔日投与を行った。

【0149】

【表5】

【0150】

１７−２．マウスの血糖調節効果の測定
血糖調節効果を確認するために、１６時間絶食させた後、対照および実験実行群の動物の腹腔に２ｇ／ｋｇのブドウ糖を注入し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、糖負荷試験（ＯＧＴＴ，ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を用いた。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検証を実施してその有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【0151】

その結果、図１７（ａ）および（ｂ）に示したように、アモジアキン：エキセナチドの重量比が１：０．００１より１：０．００５の重量比で投与した複合製剤の投与群において単独投与群よりブドウ糖を投与して２時間後に血中ブドウ糖が早く減少したことを確認した。

【0152】

したがって、アモジアキン単独またはエキセナチド単独投与群の場合より複合製剤の投与群において血中ブドウ糖の濃度を減少させる優れた相昇作用が確認されたので、アモジアキン：エキセナチド１：０．００５の重量比で投与した複合剤が糖尿病予防または治療のために有用に使用することができることが分かり、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤として有用に使用することができることが分かった。

【0153】

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14a】

【図14b】

【図14c】

【図14d】

【図15a】

【図15b】

【図15c】

【図15d】

【図15e】

【図15f】

【図15g】

【図15h】

【図15i】

【図15j】

【図15k】

【図15l】

【図16a】

【図16b】

【図16c】

【図16d】

【図16e】

【図16f】

【図16g】

【図16h】

【図16i】

【図17a】

【図17b】