特許 6861803 ソノポレーションを使用した生物学的細胞の高効率トランスフェクション

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6861803

(24)【登録日】2021年4月1日

(45)【発行日】2021年4月21日

(54)【発明の名称】ソノポレーションを使用した生物学的細胞の高効率トランスフェクション

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/87 20060101AFI20210412BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20210412BHJP

   C12N 13/00 20060101ALI20210412BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20210412BHJP

   C12M 1/42 20060101ALN20210412BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20210412BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/87 Z

   C12N15/09 100

   C12N13/00

   !C07K16/00

   !C12M1/42

   !C12N5/10

【請求項の数】36

【全頁数】47

(21)【出願番号】特願2019-514219(P2019-514219)

(86)(22)【出願日】2017年9月15日

(65)【公表番号】特表2019-528727(P2019-528727A)

(43)【公表日】2019年10月17日

(86)【国際出願番号】US2017051909

(87)【国際公開番号】WO2018053350

(87)【国際公開日】20180322

【審査請求日】2020年9月14日

(31)【優先権主張番号】62/395,363

(32)【優先日】2016年9月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/439,458

(32)【優先日】2016年12月27日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】507301040

【氏名又は名称】ラブサイト インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ハーディー， ジェニファー エム．

(72)【発明者】

【氏名】エルソン， リチャード エヌ．

(72)【発明者】

【氏名】スターンズ， リチャード ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ハディミオグル， バブール

(72)【発明者】

【氏名】オレクノ， ジョセフ ディー．

(72)【発明者】

【氏名】ブラウカンプ， マーシャ エヌ．

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／１０５２５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／１１０９５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００１／００５３３８４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５３５７６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 MESTAS, J.L., et al.，"DEVELOPMENT OF A CONFOCAL ULTRASOUND DEVICE USING AN INERTIAL CAVITATION CONTROL FOR TRANSFECTION IN-VITRO."，JOURNAL OF PHYSICS: CONFERENCE SERIES，英国，INSTITUTE OF PHYSICS PUBLISHING，２０１５年１２月 ３日，Vol.656, No.1，012003(pp.1-4)，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1088/1742-6596/656/1/012003

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １３／００−１５／９０

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞に外因性物質をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）（ｉ）アレイで配置されている複数のレザバ―であって、各々のレザバ―が宿主細胞および前記宿主細胞内に導入しようとする前記外因性物質を含む、レザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
（ｂ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｃ）前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記第１のレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
（ｄ）前記音響放射発生器を前記第１のレザバーから音響的に分離するステップ、
（ｅ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｆ）前記第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ、ならびに
（ｇ）前記音響放射発生器を前記第２のレザバーから音響的に分離し、その後、前記複数のレザバーの追加のレザバーにつき、ステップ（ｂ）〜（ｆ）を繰り返すステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記複数のレザバーが、９６個のレザバー、３８４個のレザバー、１５３６個のレザバー、３４５６個のレザバー、または３４５６個よりも多くのレザバーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記レザバーが、一体型多重レザバーユニットを含む担体内に含まれている、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記一体型多重レザバーユニットが、ウェルプレートを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

ステップ（ｇ）が、最大で０．５秒のレザバー間移行時間で実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記レザバー間移行時間が、最大で０．１秒である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記レザバー間移行時間が、最大で０．００１秒である、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

各レザバー間移行が、前記レザバーを前記音響放射発生器に対して移動させることにより実施される、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

各レザバー間移行が、前記音響放射発生器を前記レザバーに対して移動させることにより実施される、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

前記音響放射発生器が、集束素子を含み、ステップ（ｃ）が、前記レザバー内へと指向させた音響放射が集束音響放射になるように、ステップ（ｃ）で発生させた音響放射を集束させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記宿主細胞および前記外因性物質が、流体媒体内に含まれている、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記宿主細胞のソノポレーションを誘導するための様式が、発生させた前記音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段が、トランスフェクション刺激物質を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記トランスフェクション刺激物質が、前記流体媒体内に複数の音響活性化可能な部分を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記音響活性化可能な部分が、局所化流体容積を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記局所化流体容積が、取り囲まれた流体容積である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記取り囲まれた容積が、気体充填マイクロバブルを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ステップ（ｃ）で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から１５％以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から１５％以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ステップ（ｃ）で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から５％以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から５％以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記システムが、前記マイクロバブルから前記細胞への音響放射の移転を可能にするように、前記マイクロバブルが前記宿主細胞と十分に接近することを確実にするための手段をさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項21】

前記手段が、ステップ（ｂ）の前に、前記マイクロバブルを前記宿主細胞にコンジュゲートすることを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

細胞に外因性物質をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）（ｉ）各々のレザバ―が音響活性化可能な気体充填マイクロバブルにコンジュゲートされた宿主細胞、および前記宿主細胞内に導入しようとする前記外因性物質を含む少なくとも２つのレザバーであって、前記宿主細胞および前記外因性物質が流体媒体内に包まれている、レザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
（ｂ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｃ）前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記マイクロバブルを音響的に活性化させる様式で前記第１のレザバー内へと指向させ、ここで、音響放射が前記マイクロバブルから前記宿主細胞へと移転されて、ソニポレートされた宿主細胞を提供し、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
（ｄ）前記音響放射発生器を前記第１のレザバーから音響的に分離するステップ、
（ｅ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｆ）前記第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含む、方法。

【請求項23】

各レザバー中の前記流体媒体の容積が、０．５μＬ〜５００μＬの範囲である、請求項１１に記載の方法。

【請求項24】

前記流体媒体が、等張性緩衝液を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項25】

前記細胞が、前記レザバーの表面で平板培養される、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記細胞が、非接着性である、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記外因性物質が、核酸、プラスミド、ペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカリド、小型分子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記外因性物質が、ＤＮＡプラスミドを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記外因性物質が、リボ核タンパク質を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記リボ核タンパク質が、宿主細胞核酸を変更することが可能である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ−プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡ、および触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ−プログラム可能なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

ステップ（ｃ）では、ソノポレートすることが、前記レザバーを、１５秒間〜４０秒間にわたって毎秒１０〜２５トーンバーストの速度の音響トーンバーストで照射することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項35】

各周期的音響トーンバーストが、およそ５サイクル〜１０サイクルのトーンバーストである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

細胞に外因性物質をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）（ｉ）宿主細胞および前記宿主細胞内に導入しようとする前記外因性物質を各々が含む少なくとも２つのレザバーであって、前記宿主細胞および前記外因性物質が流体媒体内に包まれている、レザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
（ａ’）音響的に活性化可能な気体充填マイクロバブルを前記流体媒体に添加し、前記マイクロバブルを前記宿主細胞にコンジュゲートさせるステップ、
（ｂ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｃ）前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記マイクロバブルを音響的に活性化させる様式で前記第１のレザバー内へと指向させ、ここで、音響放射が前記マイクロバブルから前記宿主細胞へと移転されて、ソニポレートされた宿主細胞を提供し、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進する
ステップ、
（ｄ）前記音響放射発生器を前記第１のレザバーから音響的に分離するステップ、
（ｅ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続
せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、ならびに
（ｆ）前記第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概してバイオテクノロジーに関し、より詳細には、生物学的細胞を効率的にトランスフェクトするための方法およびシステムに関する。本発明は、細胞研究および創薬を含む、生化学および医学の分野に有用性を見出す。

【背景技術】

【0002】

トランスフェクションは、細菌細胞、哺乳動物細胞、および他の細胞タイプを含む宿主細胞内に外来性物質を組み込むことを指す。バイオテクノロジーの領域では、トランスフェクションは、遺伝子改変細胞を産生するために、外来性ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞内に導入するのに使用される非常に重要なツールとなっている。トランスフェクションは、安定または一過性のいずれでもよい。安定トランスフェクションでは、導入された遺伝物質は、細胞および核膜を通過することにより宿主細胞核に送達され、宿主ゲノム内に統合され、すべての娘細胞は、付加された物質を有する。対照的に、一過性トランスフェクション（「形質転換」とも呼ばれる）では、核酸は、宿主細胞内に挿入されるが、そのゲノムには統合されない。その結果、外来性遺伝物質は、一時的に発現されるが、トランスフェクトされた細胞の将来世代には受け継がれない。したがって、大規模タンパク質産生、遺伝子療法、創薬、化合物スクリーニング、および長期研究には、安定トランスフェクションが必要であることが理解されると予想される。しかしながら、安定細胞株の開発は、複雑であり、時間および労力がかかり、高価である。

【0003】

生物学的、化学的、および物理的媒介技法を含む、外来性遺伝物質を真核生物宿主細胞内に導入するための種々の方法が存在する。研究に最も一般に使用されるトランスフェクション法は、生物学的であり、キャリアとしてウイルスを使用することを含む。哺乳動物細胞培養およびｉｎ ｖｉｖｏでは、アデノウイルス、レンチウイルス、およびオンコレトロウイルスベクターが、遺伝子送達に広く使用されている。ウイルス媒介性トランスフェクションまたはウイルス性「形質導入」は、トランスフェクトするのが難しい細胞タイプの場合でさえ、効率的であり、使用が比較的簡単である。しかしながら、選択したウイルスの免疫原性および細胞傷害ならびにウイルスベクター産生に伴う困難および時間を含む顕著な欠点がある。また、レンチウイルスベクターは、例えば、ユーザーに対して生物学的に有害であり、バイオセーフティレベル２（ＢＳＬ−２、米国疾病管理予防センターにより定められている）またはエンハンスドＢＳＬ−２（ＢＳＬ−２＋）作業条件が必要である。

【0004】

化学的トランスフェクション法が広く使用されている。それらは、外来遺伝子を哺乳動物宿主細胞内に導入するために最初に使用された方法である。一般に使用されている化学的方法としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：緩衝生理食塩水／リン酸塩溶液と組み合わせたリン酸カルシウム；ジエチルエタノールアミンおよびデキストランのコンジュゲート（または「ＤＥＡＥ−デキストラン」）またはポリエチレンイミンなどの陽イオン性ポリマー；商標名Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）として市販されているものなどの陽イオン性脂質処方物（追加の陽イオン性脂質処方物は、関連する本文および文献、例えばＦｅｌｇｎｅｒら（１９９４年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９巻（４号）：２５５０〜６１頁に記載されている）；および、ポリアミドアミンデンドリマーなどの活性化デンドリマー（Ｈｕｄｄｅら（１９９９年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６巻（５号）：９３９〜９４３頁を参照）。化学的トランスフェクション効率は、細胞タイプ、遺伝物質／化学的トランスフェクション剤比、溶液ｐＨ、および他の条件に応じて様々である。化学的トランスフェクション法は、ウイルス性トランスフェクション剤の潜在的な免疫原性および細胞傷害とは関連性がないが、一般的に不良なトランスフェクション効率を示す。さらに、前述の化学的トランスフェクション試薬の多くは、極めてわずかな細胞株、ロバストであり、特に感受性でないもの、例えば、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ−２９３細胞でしか使用することができない。

【0005】

物理的トランスフェクション法は、ウイルス性または化学的トランスフェクションのいずれよりも最近の方法であり、エレクトロポレーション、レーザに基づくトランスフェクション、微粒子銃粒子送達、細胞スクイージング（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、および直接マイクロインジェクションなどの技法が挙げられる。こうした方法は、トランスフェクションを達成するように確立されているが、試料に対する広範な物理的損傷の可能性を含む、多数の関連する問題が存在する。

【0006】

前述の方法で遭遇する問題の一部を克服するために、「ソノポレーション」技法を使用してトランスフェクションを達成するための努力がなされている。ソノポレーションは、超音波または音響エネルギーを使用して、宿主細胞による高分子の取込みを可能にするのに十分な細胞膜透過性の一過性変化を誘導することを含み、そうした高分子は、そうでなければ細胞膜を通過することができない。現在までこの領域で行われた研究は、超音波造影剤（ＵＣＡ）の使用に着目している。ほとんどのＵＣＡは、浮揚性気体が充填されたマイクロバブルであり、医学的超音波検査に使用して、後方散乱による音響反射率を増加させるように設計されている。ＵＣＡをソノポレーションに使用することが提案されており、ソノポレーションは、ＵＣＡが、まず膨張し、しかしながらその後急速に収縮または崩壊して、マイクロストリームまたは衝撃波を発生させ、それにより細胞膜に剪断応力を及ぼして一時的にまたは恒久的にそうした膜を破砕するように、宿主細胞の近傍でキャビテーションを起こすことによる。より最近では、キャビテーションを引き起こすことになる音響エネルギー未満の音響エネルギーでＵＣＡを使用し、ソノポレーションを生じさせることができることが示唆されている。例えば、Ｆｏｒｂｅｓら（２００８年）Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｉｎ Ｍｅｄ． ＆ Ｂｉｏｌ． ３４巻（１２号）：２００９〜２０１８頁を参照されたい。しかしながら、このプロセスは、液体媒体ではＵＣＡは液体表面に上昇することになり、その一方で宿主細胞は下方に沈降することになるという事実を含む様々な理由で、大規模には実施されていない。ソノポレーションによるトランスフェクションには、浮揚性マイクロバブルおよび宿主細胞が音響エネルギーの適用時に隣接していることが必要であるため、これは、問題である。別の問題は効率である。現在まで、細胞死を最小限に抑えつつ、トランスフェクトが成功した宿主細胞の数を最大化する、ソノポレーションに基づくトランスフェクション法は報告されていない。さらに、他のトランスフェクション技法と同様に、ソノポレーションは、現在まで、トランスフェクトするのが難しい細胞、例えば初代細胞、特に幹細胞のトランスフェクションには有効でない。

【0007】

理想的なトランスフェクション法は、以下をもたらすと予想される：

【0008】

細胞死を最小限に抑えつつ、トランスフェクトされる宿主細胞の割合を最大化すること、

【0009】

典型的にはトランスフェクションに耐性を示す細胞を含む様々な細胞タイプのトランスフェクションの成功を可能にすること、

【0010】

非哺乳動物細胞および哺乳動物細胞のトランスフェクションを可能にすること、

【0011】

コンフルエントな細胞およびコンフルエントではない細胞のトランスフェクションを可能にすること、

【0012】

ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびＤＮＡプラスミドなどの核酸の細胞へのトランスフェクションを可能にすること、

【0013】

タンパク質および小型分子を含む他のタイプの外因性物質の細胞へのトランスフェクションを可能にすること、

【0014】

（ａ）Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡで構成されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）および（ｂ）関連プロモーターを有するＣＲＩＳＰＲプラスミドを含む、遺伝子発現を実行するための標的細胞機能および機構の修飾のために選択された核酸配列および関連タンパク質と共に機能すること、

【0015】

過度な量の時間または労力を必要としない簡単な実装を含むこと、および

【0016】

実装の速度および容易さの結果として、ハイスループットトランスフェクションでの使用に適合可能であること。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４年）２６９巻（４号）：２５５０〜６１頁

【非特許文献2】Ｈｕｄｄｅら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９年）６巻（５号）：９３９〜９４３頁

【非特許文献3】Ｆｏｒｂｅｓら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｉｎ Ｍｅｄ．＆Ｂｉｏｌ．（２００８年）３４巻（１２号）：２００９〜２０１８頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0018】

したがって、本発明は、上記で考察した当技術分野における必要性に対処し、宿主細胞をトランスフェクトするための、ソノポレーションに基づく方法を提供する。

【0019】

一実施形態では、本発明は、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、以下のステップを含む方法を提供する：

【0020】

（ａ）（ｉ）宿主細胞および宿主細胞内に導入しようとする外因性物質を各々が含む少なくとも２つのレザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、

【0021】

（ｂ）音響放射発生器をレザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、音響放射発生器をレザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、

【0022】

（ｃ）音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で第１のレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた宿主細胞内への外因性物質の導入を促進するステップ、

【0023】

（ｄ）音響放射発生器を第１のレザバーから音響的に分離するステップ、

【0024】

（ｅ）音響放射発生器をレザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、音響放射発生器をレザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、および

【0025】

（ｆ）第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ。

【0026】

この実施形態の一態様では、少なくとも２つのレザバーは、複数のレザバー内に含まれており、上記方法は、（ｇ）音響放射発生器を第２のレザバーから音響的に分離し、その後追加のレザバーにつき、ステップ（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すことをさらに含む。レザバーは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートなどのマイクロウェルプレートなどの一体型多重レザバーユニット内に含まれていてもよい。この実施形態の一態様では、レザバー内に指向された音響放射は、集束音響放射である。

【0027】

この実施形態の別の態様では、上記方法は、複数の多重レザバーの各々にある宿主細胞が引き続いて迅速にソノポレートされるハイスループットトランスフェクションシステムの状況内で実施される。これは、レザバー間移行時間が、最大で約０．５秒、０．１秒、または０．００１秒であることを意味する場合がある。関連する態様では、各レザバーの流体媒体の容積は、約０．５μＬ〜約５００μＬの範囲であってもよい。

【0028】

この実施形態の別の態様では、ソノポレーションを誘導するための様式は、発生させた音響放射を宿主細胞に付与するための手段、一般的には、音響活性化可能な局所化流体容積など、流体媒体内に複数の音響活性化可能な部分を含むトランスフェクション刺激物質を含む。局所化流体容積は、照射されたマイクロバブルから宿主細胞への音響エネルギーの移転を促進するために宿主細胞にコンジュゲートされていてもよい気体充填マイクロバブルであってもよい。

【0029】

別の実施形態では、以下のステップを含む、宿主細胞をトランスフェクトするための方法が提供される：

【0030】

（ａ）宿主細胞と適合する流体媒体に、第１の結合部分で表面機能化された複数の気体充填マイクロバブルを懸濁することにより、マイクロバブル組成物を調製するステップ、

【0031】

（ｂ）マイクロバブルを、宿主細胞タイプに特異的であり、第１の結合部分に連結する第２の結合部分で機能化されている抗体と、流体媒体中でマイクロバブルを抗体と混合することによりコンジュゲートし、それによりマイクロバブル−抗体コンジュゲートを生成するステップ、

【0032】

（ｃ）マイクロバブル−抗体コンジュゲートを、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質と混合することにより、負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートを調製するステップ、

【0033】

（ｄ）任意選択で、負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートを宿主細胞適合性流体媒体で希釈して、それにより、トランスフェクション効率の最適化に有効な負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲート濃度を有する希釈物を提供するステップ、

【0034】

（ｅ）レザバー中の宿主細胞を希釈物と接触させるステップ、および

【0035】

（ｆ）マイクロバブルを、それらの平均共鳴周波数から約１５％以内の、またはそれらの平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内の周波数で共鳴させる条件下でレザバーを音響放射で照射することにより、（ｅ）で提供した宿主細胞−希釈物混合物をソノポレートするステップ。

【0036】

別の実施形態では、本発明は、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含むレザバーと音響的に接続するステップ；および音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、音響放射を、約１０℃よりも大きな流体媒体の温度上昇をもたらさずに宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式でレザバー内に指向させるステップを含む方法を提供する。

【0037】

別の実施形態では、本発明は、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、少なくとも１５３６個のレザバーを含む一体型多重レザバーユニット内に含まれる選択されたレザバーと音響的に接続するステップであって、選択されたレザバーが、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含む、ステップ；ならびに音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、音響放射を、宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式でレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進するステップを含む方法を提供する。

【0038】

別の実施形態では、本発明は、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；および音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、局所化流体容積が音響的に活性化されて、局所化流体容積の平均共鳴周波数から約１５％以内のまたは局所化流体容積の平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内の周波数で振動する様式で、音響放射をレザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進するステップを含む方法を提供する。

【0039】

別の実施形態では、本発明は、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、音響放射を、選択されたサイズから約１５％以内のサイズを有する局所化流体容積が音響的に活性化される様式でレザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進するステップを含む方法を提供する。

【0040】

関連する実施形態では、本発明は、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、（ａ）音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および多峰形サイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；（ｂ）音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、音響放射を、第１のモーダルピーク（ｍｏｄａｌ ｐｅａｋ）から約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積が音響的に活性化される様式でレザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された局所化流体容積が、音響エネルギーを宿主細胞付近に移転させるステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）を繰り返して、第２のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップ；ならびに（ｄ）任意選択で、ステップ（ｂ）を繰り返して、１つまたは複数の追加のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップを含む方法を提供する。

【0041】

追加の実施形態では、本発明は、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた音響照射を、宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式でレザバー内へと指向させるステップであって、発生させた音響放射の周波数成分が、音響活性化可能な局所化流体容積のサイズ分布と関連するように選択される、ステップを含む方法を提供する。

【0042】

関連する実施形態では、本発明は、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続し、トランスフェクション刺激物質が、レザバー内で空間分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているステップ；ならびに音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた音響放射を、宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式でレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた音響放射の周波数成分が、音響活性化可能な局所化流体容積の空間分布と関連するように選択される、ステップを含む方法を提供する。

【0043】

別の実施形態では、ソノポレーションは、協同して（好ましくは同時に、しかしながら必ずしも同時とは限らない）、ただし異なる周波数で作動する２つの変換器を使用して実施され、変換器の一方は、環状変換器であり、周囲に作動可能に設置され、標準的変換器を封入する。この実施形態では、環状変換器および標準的変換器は、一般的には、異なる周波数で作動することになる。この実施形態の一態様では、環状変換器は、ソノポレーションを引き起こすように選択された周波数で作動させてもよく、標準的変換器は、ソノポレートされた細胞の、例えば、レザバー内への、担体上への、または分析のための分析機器への音響射出（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｅｊｅｃｔｉｏｎ）をもたらすのに有効な周波数で作動させることができる。この実施形態の別の態様では、２つの変換器の一方は、主に、ソノポレーションのための音響エネルギーを供給するように機能し、他方の変換器は、マイクロバブル−細胞コンジュゲーションを使用しない場合、宿主細胞に対するマイクロバブルの相対的位置を変化させるための音響エネルギーを送達する。

【0044】

別の実施形態では、ソノポレーションは、異なるサイズのマイクロバブルをソノポレートするのに有効な異なる音響周波数を各々が有する複数の音響トーンバースト（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｎｅｂｕｒｓｔ）を引き続いて照射することにより実施される。複数の音響トーンバーストの各々の音響周波数は、典型的には、約１．５ＭＨｚ〜約５．０ＭＨｚの範囲、より通常は、約２．０ＭＨｚ〜約２．５ＭＨｚの範囲である。

【0045】

さらなる実施形態では、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積を含むトランスフェクション刺激物質を含む選択されたレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、局所化流体容積が音響的に活性化される様式で音響放射をレザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進するステップを含み、発生される音響放射は、局所化流体容積の少なくとも５０％が照射後に依然としてインタクトのままであることを確実にするように選択された音響ソノポレーション圧力におけるものである、方法が提供される。この実施形態の一態様では、音響ソノポレーションは、局所化流体容積のキャビテーションをもたらすことになる最低音圧の約５０％〜約９０％の範囲である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）（ｉ）宿主細胞および前記宿主細胞内に導入しようとする外因性物質を各々が含む少なくとも２つのレザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
（ｂ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｃ）前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記第１のレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
（ｄ）前記音響放射発生器を前記第１のレザバーから音響的に分離するステップ、
（ｅ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、ならびに
（ｆ）前記第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記少なくとも２つのレザバーが、複数のレザバー内に含まれており、前記方法が、（ｇ）前記音響放射発生器を前記第２のレザバーから音響的に分離し、その後、前記複数のレザバーの追加のレザバーにつき、ステップ（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記複数のレザバーが、９６個のレザバー、３８４個のレザバー、１５３６個のレザバー、３４５６個のレザバー、または３４５６個よりも多くのレザバーを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記レザバーが、アレイで配置されている、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記レザバーが、一体型多重レザバーユニットを含む担体内に含まれている、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記一体型多重レザバーユニットが、ウェルプレートを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
ステップ（ｃ）〜（ｅ）が、最大で約０．５秒のレザバー間移行時間で実施される、項目１に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ｂ）〜（ｇ）の反復が、最大で約０．５秒のレザバー間移行時間で実施される、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記レザバー間移行時間が、最大で約０．１秒である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記レザバー間移行時間が、最大で約０．００１秒である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
各レザバー間移行が、前記レザバーを前記音響放射発生器に対して移動させることにより実施される、項目８に記載の方法。
（項目１２）
各レザバー間移行が、前記音響放射発生器を前記レザバーに対して移動させることにより実施される、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記音響放射発生器が、集束素子を含み、ステップ（ｃ）が、前記レザバー内へと指向させた音響放射が集束音響放射になるように、ステップ（ｃ）で発生させた音響放射を集束させることをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記宿主細胞および前記外因性物質が、流体媒体内に含まれている、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記宿主細胞のソノポレーションを誘導するための様式が、発生させた前記音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段が、トランスフェクション刺激物質を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記トランスフェクション刺激物質が、前記流体媒体内に複数の音響活性化可能な部分を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記音響活性化可能な部分が、局所化流体容積を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記局所化流体容積が、取り囲まれた流体容積である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記取り囲まれた容積が、気体充填マイクロバブルを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
ステップ（ｃ）で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から約１５％以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
ステップ（ｃ）で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から約５％以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から約５％以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記システムが、前記マイクロバブルから前記細胞への音響放射の移転を可能にするように、前記マイクロバブルが前記宿主細胞と十分に接近することを確実にするための手段をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記手段が、ステップ（ｂ）の前に、前記マイクロバブルを前記宿主細胞にコンジュゲートすることを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
ステップ（ａ）で提供された前記システム中の前記宿主細胞が、前記マイクロバブルにコンジュゲートされる、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
各レザバー中の前記流体媒体の容積が、約０．５μＬ〜約５００μＬの範囲である、項目１４に記載の方法。
（項目２７）
前記流体媒体が、等張性緩衝液を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２８）
前記細胞が、前記レザバーの表面で平板培養される、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が、非接着性である、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記外因性物質が、核酸、プラスミド、ペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカリド、小型分子、またはそれらの組み合わせを含む、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記外因性物質が、ＤＮＡプラスミドを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記外因性物質が、リボ核タンパク質を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記リボ核タンパク質が、宿主細胞核酸を変更することが可能である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ−プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡ、および触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ−プログラム可能なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
ステップ（ｃ）では、ソノポレートすることが、前記レザバーを、約１５秒間〜約４０秒間にわたって毎秒約１０〜約２５トーンバーストの速度の音響トーンバーストで照射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目３８）
各周期的音響トーンバーストが、およそ５サイクル〜１０サイクルのトーンバーストである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
宿主細胞をトランスフェクトするための方法であって、
（ａ）前記宿主細胞と適合する流体媒体に、第１の結合部分で表面機能化された複数の気体充填マイクロバブルを懸濁することにより、マイクロバブル組成物を調製するステップ、
（ｂ）前記マイクロバブルを、前記宿主細胞のタイプに特異的であり、かつ前記第１の結合部分に連結する第２の結合部分で機能化されている抗体と、前記流体媒体中で前記マイクロバブルを前記抗体と混合することによりコンジュゲートし、それによりマイクロバブル−抗体コンジュゲートを生成するステップ、
（ｃ）前記マイクロバブル−抗体コンジュゲートを、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質と混合することにより、負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートを調製するステップ、
（ｄ）任意選択で、前記負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートを宿主細胞適合性流体媒体で希釈して、それによりトランスフェクション効率の最適化に有効な負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲート濃度を有する希釈物を提供するステップ、
（ｅ）レザバー中の宿主細胞を前記希釈物と接触させるステップ、および
（ｆ）前記マイクロバブルを、それらの平均共鳴周波数から約１５％以内の、またはそれらの平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内の周波数で共鳴させる条件下で、音響放射を前記レザバーに照射することにより、（ｅ）で提供した前記宿主細胞−希釈物混合物をソノポレートするステップ
を含む、方法。
（項目４０）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、約１０℃よりも大きな前記流体媒体の温度上昇をもたらさずに、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させるステップ
を含む、方法。
（項目４１）
前記宿主細胞のソノポレーションが、約５℃よりも大きな前記流体媒体の温度上昇をもたらさない、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記宿主細胞のソノポレーションが、約２℃よりも大きな前記流体媒体の温度上昇をもたらさない、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ソノポレーションが、前記流体媒体の温度を約４０℃よりも高く上昇させない、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
前記レザバー内へと指向される音響放射が、集束音響放射である、項目４０に記載の方法。
（項目４５）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、少なくとも１５３６個のレザバーを含む一体型多重レザバーユニット内に含まれる選択されたレザバーと音響的に接続するステップであって、前記選択されたレザバーが、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含む、ステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記音響放射を、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ
を含む、方法。
（項目４６）
前記レザバー内へと指向される音響放射が、集束音響放射である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、前記局所化流体容積が、前記局所化流体容積の平均共鳴周波数から約１５％以内のまたは前記局所化流体容積の平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内の周波数で振動するように音響的に活性化される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ
を含む、方法。
（項目４８）
音響的に活性化された前記局所化流体容積が、前記局所化流体容積の平均共鳴周波数から約５％以内であるかまたは前記局所化流体容積の平均共鳴周波数の高調波から約５％以内である周波数で振動される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、選択されたサイズから約１５％以内のサイズを有する前記局所化流体容積が音響的に活性化される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ
を含む、方法。
（項目５０）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および多峰形サイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；
（ｂ）前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、第１のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積が音響的に活性化される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）を繰り返して、第２のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップ；ならびに
（ｄ）任意選択で、ステップ（ｂ）を繰り返して、１つまたは複数の追加のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップ
を含む、方法。
（項目５１）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた前記音響放射を、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた前記音響放射の周波数成分が、前記音響活性化可能な局所化流体容積のサイズ分布と関連するように選択される、ステップを含む、方法。
（項目５２）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップであって、前記トランスフェクション刺激物質は、前記レザバー内で空間分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されている、ステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた前記音響放射を、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた前記音響放射の周波数成分が、前記音響活性化可能な局所化流体容積の空間分布と関連するように選択される、ステップ
を含む、方法。
（項目５３）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積を含むトランスフェクション刺激物質を含む選択されたレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、前記音響放射を、前記局所化流体容積が音響的に活性化される様式で前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた前記音響放射が、前記局所化流体容積の少なくとも５０％が照射後に依然としてインタクトのままであることを確実にするように選択された音響ソノポレーション圧力におけるものである、ステップ
を含む、方法。
（項目５４）
前記音響ソノポレーション圧力が、前記局所化流体容積のキャビテーションをもたらすことになる最低音圧の約５０％〜９０％の範囲である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
宿主細胞をトランスフェクトするための方法であって、宿主細胞を、宿主細胞適合性流体媒体中にマイクロバブル−抗体コンジュゲートおよび前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質を含むレザバー中で接触させるステップ、ならびにこのようにして提供した宿主細胞−希釈物混合物を、協同して、ただし異なる周波数で作動する２つの変換器により発生された音響放射で前記レザバーを照射することによりソノポレートするステップを含み、前記変換器の一方が、環状変換器であり、周囲に作動可能に設置され、標準的変換器を封入する、方法。
（項目５６）
前記環状変換器が、約１ＭＨｚ〜約２．５ＭＨｚの範囲の周波数で作動する、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記標準的変換器が、約６ＭＨｚ〜約２０ＭＨｚの範囲の周波数で作動する、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記２つの変換器の一方が、主に、ソノポレーションのための音響エネルギーを供給するように機能し、他方の変換器が、ソノポレートされた細胞の前記流体媒体からの音響射出を可能にするように音響エネルギーを送達する、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
前記２つの変換器の一方が、主に、ソノポレーションのための音響エネルギーを供給するように機能し、他方の変換器が、前記宿主細胞に対する前記マイクロバブルの相対的位置を変化させるための音響エネルギーを送達する、項目５５に記載の方法。
（項目６０）
前記宿主細胞に対する前記マイクロバブルの相対的位置を、前記マイクロバブルおよび前記宿主細胞が互いに接近してソノポレーションが促進されるように変化させる、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記マイクロバブルおよび前記宿主細胞が、ソノポレーションを引き起こすのに有効な音響強度の領域中で互いに接近して位置決めされる、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
ソノポレーションを使用して宿主細胞をトランスフェクトするための方法において、以下：ソノポレーション事象後にトランスフェクション効率を評価すること、トランスフェクション効率を向上させるための候補解決策として少なくとも１つのソノポレーションパラメーターを調整すること、追加のソノポレーション事象を実施すること、および前記追加のソノポレーション事象のトランスフェクション効率を評価して、前記候補解決策の有効性を評価することを含む、向上。
（項目６３）
前記追加のソノポレーション事象のトランスフェクション効率に基づき、ソノポレーションパラメーターを変化させるステップをさらに含む、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記ソノポレーションパラメーターが、音響強度、変換器出力周波数、およびトーンバーストプロファイルの少なくとも１つから選択される、項目６２に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】図１は、実施例４に記載のＦＡＣＳ分析における、前方散乱の高さ 対 側方散乱の高さのプロットを提供する。

【0047】

【図2】図２も、実施例４に記載のＦＡＣＳ分析に由来し、ＦＬ１チャネルではトランスフェクトに成功したものが検出され、ＦＬ３チャネルでは死細胞が検出されたことを示す。

【0048】

【図3A】図３も、実施例４に記載のＦＡＣＳ分析に由来し、陽性対照で得られた結果を別々に示す。

【図3B】図３も、実施例４に記載のＦＡＣＳ分析に由来し、陽性対照で得られた結果を別々に示す。

【0049】

【図4】図４は、ウェル毎の結果を提供し、実施例４でトランスフェクトされた細胞の割合が、音響出力およびマイクロバブル濃度の両方と共に増加したことを示す。

【0050】

【図5】図５は、グラフ形態での結果を提供する。

【0051】

【図6】図６は、実施例１４において、ソノポレーション後に残る生細胞のパーセントが、より高い電圧、１．５Ｖが使用された場合でさえ、ほぼ１００％だったことを、ウェル毎に示す。

【0052】

【図7A】図７は、実施例４において、トランスフェクトされた細胞および陰性対照（つまり、マイクロバブルの非存在下でＤＰＢＳのみ）で得られたデータを示す。

【図7B】図７は、実施例４において、トランスフェクトされた細胞および陰性対照（つまり、マイクロバブルの非存在下でＤＰＢＳのみ）で得られたデータを示す。

【0053】

【図8】図８は、実施例５に記載のＣＲＩＳＰＲトランスフェクション実験の４つのプラスミド濃度の各々で得られたＧＦＰ陽性細胞のパーセントを示す。

【0054】

【図9】図９は、４つのプラスミド濃度の各々でのＧＦＰ陽性細胞の平均パーセントを示し、標準偏差エラーバーが表示されている。

【0055】

【図10】図１０は、実施例５に記載のように、４つのプラスミド濃度の各々に対する死細胞のパーセントを示す。

【0056】

【図11】図１１は、実施例６、ラン（ｒｕｎ）１のＣＲＩＳＰＲトランスフェクション実験のミスマッチ切断アッセイおよび分析の結果を示す。

【0057】

【図12】図１２は、実施例６、ラン２のＣＲＩＳＰＲトランスフェクション実験のミスマッチ切断アッセイおよび分析の結果を示す。

【0058】

【図13】図１３は、実施例６、ラン１および２で得られた切断パーセント結果を示す棒グラフである。

【0059】

【図14】図１４は、標識ｔｒａｃｒＲＮＡを検出するためのＲＦＰライトキューブを備えたＥＶＯＳ蛍光顕微鏡を使用して、実施例６、ラン２でトランスフェクトされた宿主細胞で得られた蛍光画像を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0060】

別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術的および科学用語はすべて、本発明が関する当業者により一般に理解される意味を有する。本発明の説明に特に重要な特定の用語は、下記で定義されている。

【0061】

本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、状況が明白にそうではないと示さない限り、複数の参照物を含む。したがって、例えば「要素」は、単一の要素だけでなく、２つまたはそれよりも多くの異なる要素の組み合わせなども指す。

【0062】

「音響放射」および「音響エネルギー」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、音波の形態をしたエネルギーの放出および伝搬を指す。他の波形と同様に、音響放射は、下記で考察されているような集束手段を使用して集束させることができる。

【0063】

「集束手段」および「音響集束手段」という用語は、レンズのように作用する音響エネルギー源と分離されているデバイス、または強めあう干渉および弱め合う干渉により焦点における音響エネルギーの収束を達成するように音響エネルギー源を空間的に配置することのいずれかにより、音響波を焦点に収束させるための手段を指す。集束手段は、曲面を有する固体部材のように単純であってもよく、または音響放射を指向させるために回折が使用されるフレネルレンズに見出されるものなど、複雑な構造を備えていてもよい。また、好適な集束手段としては、例えば、当技術分野で公知であり、Ｎａｋａｙａｓｕらの米国特許第５，７９８，７７９号およびＡｍｅｍｉｙａら（１９９７年）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １９９７ ＩＳ＆Ｔ ＮＩＰ１３ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、６９８〜７０２頁に記載されているフェーズドアレイ法が挙げられる。

【0064】

本明細書で使用される「音響接続」および「音響的に接続された」という用語は、音響エネルギーを実質的に喪失させずに音響放射を物体間で移転させることが可能になるように、物体が別の物体と直接的または間接的に接触して配置されている状態を指す。２つの物品が間接的に音響的に接続されている場合、それを介して音響放射を伝達することができる媒介物を提供するための「音響接続媒体」が必要である。したがって、エジェクタが、例えば、音響接続媒体をエジェクタと流体との間に挿入して、エジェクタが発生させた音響放射を、音響接続媒体を介して流体内に移転させることにより、レザバー中の流体と音響的に接続されていてもよい。

【0065】

「音響活性化可能な」部分は、特定の波長の音響エネルギーで照射されると超音波周波数での振動が引き起こされる部分である。

【0066】

用語「レザバー」は、本明細書で使用される場合、流体を保持または含むために容器またはチャンバーを指す。その最も単純な形態の１つでは、レザバーは、単に流体と表面とが接触することにより、流体を保持するのに十分な濡れ特性を有する固体表面から構成される。また、レザバーは、ウェルプレート内のウェルおよびチューブラックのチューブまたは他のそのような容器などであってもよい。

【0067】

用語「アレイ」は、本明細書で使用される場合、レザバーの配置、例えばウェルプレート内のウェルなどの、特徴の二次元配置を指す。アレイは、一般的に、例えば、直線グリッド、並列ストライプ、およびスパイラルなどに規則正しく整列されている特徴で構成されるが、不規則アレイも有利に使用することができる。アレイは、パターンが必ずしも規則正しく整列されている特徴を含まないという点で、パターンとは異なる。アレイは、典型的には、しかしながら必ずというわけではないが、少なくとも約４〜約１０，０００，０００個の特徴、一般的には約４〜約１，０００，０００個の範囲の特徴を含む。

【0068】

「流体媒体」などの用語「流体」は、本明細書で使用される場合、非固形物であり、少なくとも部分的に液体で構成されている物質を指す。流体は、最小限に、部分的に、または完全に溶媒和、分散、または懸濁されている固形物を含んでいてもよい。流体の例としては、限定されないが、水性液体（水をそれ自身および塩水を含む）および有機溶媒などの非水性液体などが挙げられる。また、流体は、細胞または生体分子などを含む生物学的流体であってもよい。

【0069】

用語「核酸」は、自然界で生成されたかまたは実験室で合成されたかに関わらず、オリゴヌクレオチドを含むヌクレオシド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを指し、したがって、プラスミドなどの非天然構築物を包含する。これらの用語は、特に別様に示されていない限り、または状況が異なる解釈を示さない限り、本明細書では交換可能に使用される。核酸としては、２−デオキシ−Ｄ−リボースおよびＤ−リボースを含むものが挙げられ、したがって、それぞれポリデオキシリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを包含し、従来のプリンおよびピリミジン塩基、つまりアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびにそれらに保護形態のいずれを含んでいてもよく、例えば、塩基は、当業者に公知であり、関連する本文および文献に記載されている、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、またはベンゾイル、ならびにプリンおよびピリミジン類似体などの保護基で保護されている。一般的な類似体としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ^６−メチルアデニン、Ｎ^６−−イソペンチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ^６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチル−アミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、クエオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、および２，６−ジアミノプリン。核酸は、本明細書では、限定されないが、以下のものを含む他のタイプの修飾を同様に含んでいてもよい：例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数が、ハロゲン原子または脂肪族基で置換されているか、またはエーテルもしくはアミンなどとして官能化されている、糖部分の修飾；メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アミノアルキルホスホルアミデート、およびアミノアルキルホスホトリエステルなどの非天然ヌクレオチド間連結；ペンダント部分による官能化；インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）の組込み；キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属）などの組込み。

【0070】

用語「ポリペプチド」は、２つまたはそれよりも多くのアミノ酸で構成されている任意の構造も含むことが意図されており、したがって、ジペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を含み、こうした用語は、本文または状況がそうではないと示さない限り、本明細書では交換可能に使用される。ペプチドのすべてまたは一部を形成するアミノ酸は、２０個の従来の天然に存在するアミノ酸、つまりアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）、ならびに従来のアミノ酸の異性体および修飾などの非従来型のアミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾されたアミノ酸、酵素修飾されたアミノ酸、β−アミノ酸、アミノ酸を模倣するように設計された構築物または構造（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、β−アラニン、ナフチルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、およびノル−ロイシン）、および例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらの米国特許第５，６７９，７８２号に記載されているような他の非従来型のアミノ酸のいずれであってもよい。また、ペプチドは、天然に存在するアミド−ＣＯＮＨ−連結が、ペプチド骨格内の１つまたは複数の部位で、Ｎ置換アミド、エステル、チオアミド、レトロペプチド（ｒｅｔｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）（−ＮＨＣＯ−）、レトロチオアミド（ｒｅｔｒｏｔｈｉｏａｍｉｄｅ）（−ＮＨＣＳ−）、スルホンアミド（−ＳＯ_２ＮＨ−）、および／またはペプトイド（Ｎ置換グリシン）連結などの非従来型の連結と置換されている非ペプチド骨格連結を含んでいてもよい。したがって、ペプチドは、プソイドペプチドおよびペプチド模倣物を含むことができる。ペプチドは、（ａ）天然に存在していてもよく、（ｂ）化学合成により生成されてもよく、（ｃ）組換えＤＮＡ技術により生成されてもよく、（ｄ）より大きな分子の生化学的または酵素的断片化により生成されてもよく、（ｅ）上記に列挙されている方法（ａ）〜（ｄ）の組み合わせから生じる方法により生成されてもよく、または（ｆ）ペプチドを生成するための任意の他の手段により生成されてもよい。

【0071】

例えば「実質的に同一のレザバー」などの語句の「実質的に」という用語は、音響特性が大きく逸脱しないレザバーを指す。例えば、「実質的に同一のレザバー」の音響減衰は、互いに１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、および最も好ましくは最大で０．１％だけ逸脱する。用語「実質的に」の他の使用は、類似の定義を含む。

【0072】

本発明は、非哺乳動物細胞および哺乳動物細胞、コンフルエントな細胞およびコンフルエントではない細胞を含む様々な細胞タイプのトランスフェクションを可能にする様式で音響放射を使用して、細胞をトランスフェクトするための方法を提供する。本明細書に記載のソノポレーションを使用して、上記方法は、限定されないが、プラスミド、リボ核タンパク質、および他の種を含む外因性物質の宿主細胞への組込みを可能にする。下記に詳述することになるが、上記方法は、主に、多数の細胞含有レザバーで引き続いて実施することができるため、ハイスループットトランスフェクションでの使用に適している。

【0073】

一実施形態では、細胞をトランスフェクトするための方法は、（ａ）（ｉ）宿主細胞およびソノポレーションにより誘導されたトランスフェクションを介して宿主細胞内に導入しようとする外因性物質を各々が含む少なくとも２つのレザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、（ｂ）音響放射発生器をレザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、音響放射発生器をレザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、（ｃ）音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で第１のレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた宿主細胞内への外因性物質の導入を促進するステップ、（ｄ）音響放射発生器を第１のレザバーから音響的に分離するステップ、（ｅ）音響放射発生器をレザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、音響放射発生器をレザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、および（ｆ）第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップを含む。

【0074】

一般的には、しかしながら必ずというわけではないが、第１および第２のレザバーは、複数のレザバー内に含まれており、上記方法は、レザバーの一部またはすべてで繰り返される。これが該当する場合、上記方法は、（ｆ）の後に追加のステップ、すなわち（ｇ）音響放射発生器を第２のレザバーから音響的に分離し、他のレザバーにつき、ステップ（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップを含む。要素のモジュラリティおよび互換性を提供するため、デバイスは、時には、複数の取外し可能なレザバー、例えば、チューブラックのチューブなどと共に使用されることが好ましい場合がある。レザバーは、パターンでまたはアレイで、典型的には、各レザバーに個々の系統的なアドレス指定能力（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｄｄｒｅｓｓａｂｉｌｉｔｙ）を提供するようにアレイで配置されている。レザバーの各々は、個別のまたは独立型の容器として提供されていてもよいが、多数のレザバーが必要とされる状況では、例えば、ハイスループットトランスフェクション法では、レザバーは、一体型多重レザバーユニット内に含まれていることが好ましい。多重レザバーユニットは、レザバーとしての役目を果たす個々のウェルを有するウェルプレートであってもよい。デバイスでの使用に好適な多ウェルプレートは市販されており、例えば、１ウェルプレート当たり９６、３８４、１５３６、または３４５６個のウェルを含んでいてもよく、全スカートを有していてもよく、半スカートを有していてもよく、またはスカートを有していなくともよい。ウェルプレートまたはマイクロタイタープレートは、一般に使用される実験室物品になっている。Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＳＬＡＳ）が設立されており、米国国家規格協会と協力して、占有面積および寸法規格ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ １−２００４を含む、マイクロタイタープレートの規格を維持している。そのようなウェルプレートのウェルは、一般的に、直線的アレイの形態である。

【0075】

このような市販のウェルプレートが入手可能であるが、少なくとも約１０，０００個のウェル、または１００，０００〜５００，０００個ものもしくはそれよりも多くのウェルを含む他の幾何学的構成の注文仕様のウェルプレートの製造および使用を除外するものではない。さらに、レザバーの構築に使用される物質は、音響的に適合し、そこに含まれる流体試料と適合性でなければならない。水に基づく流体の場合、多くの物質が、レザバーの構築に好適であり、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：酸化ケイ素および酸化アルミニウムなどのセラミックス、ステンレス鋼および白金などの金属、ならびにポリエステル、ポリプロピレン、環式オレフィンコポリマー（例えば、Ｎｉｐｐｏｎ ＺｅｏｎのＺｅｏｎｅｘ（登録商標）およびＴｉｃｏｎａのＴｏｐａｓ（登録商標）などの市販されているもの）、ポリスチレン、およびポリテトラフルオロエチレンなどのポリマー。

【0076】

加えて、複数のレザバーの各々にある宿主細胞を迅速に引き続いてトランスフェクトするために必要な移動量および時間を低減するために、各レザバーの中心は、隣のレザバー中心から、約１センチメートル以内、例えば、約１．５ミリメートル以内、約１ミリメートル以内、および約０．５ミリメートル以内に位置することが望ましい。こうした寸法は、レザバーのサイズを最大容積に限定する傾向がある。レザバーは、典型的には、約１ｍＬ以下、好ましくは約５００μＬ以下、およびより好ましくは約２５０μＬ以下の流体、および一部の場合では、１００μＬ、５０μＬ、２５μＬ、１０μＬ、５μＬ、１μＬ、または０．５μＬ以下の流体を含むように構築されている。したがって、作業中、レザバーの流体媒体の容積は、約０．５μＬ〜約５００μＬの範囲にある。一貫性を容易にするために、レザバーは、実質的に音響的に区別不能であることも好ましい。

【0077】

超音波変換器を含む音響放射発生器を使用して音響放射を発生させ、発生させた音響放射を、トランスフェクトしようとする宿主細胞を含むレザバー内に指向させる。超音波変換器は、典型的には、アクチュエーター、およびアクチュエーターにより生成された音響エネルギーを集中させる集束素子を含み、アクチュエーターの例としては、圧電素子および磁歪素子（ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）が挙げられ、一般的に、これに限定されないが、本明細書では圧電変換器が好ましい。作動中、アクチュエーターは、超音波駆動周波数のシグナルにより駆動され、活性物理素子（ａｃｔｉｖｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）で超音波振動を生成する。こうした振動は、音響接続媒体内へと伝達され、それを介して、流体試料を収容するレザバー内へと伝達される。単一の変換器を使用してもよく、または一部の場合では、変換器アセンブリを含む多重素子音響放射発生器を使用してもよい。例えば、線形音響アレイ、曲線音響アレイ、またはフェーズド音響アレイを使用して、複数のレザバーに同時に伝達される音響放射を発生させることが有利である。好ましい実施形態では、単一の音響放射発生器が使用される。本明細書で有利に使用することができる音響放射発生器の幾つかの例は、Ｌａｂｃｙｔｅ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手可能なＡｃｏｕｓｔｉｃ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｅｊｅｃｔｉｏｎ（ＡＤＥ）システムに組み込まれているものであり、例えば、Ｓｔｅａｒｎｓらの米国特許第６，４１６，１６４号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，６６６，５４１号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，６０３，１１８号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，７４６，１０４号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，８０２，５９３号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，９３８，９８７号、Ｍｕｔｚらの第７，２７０，９８６号、Ｅｌｌｓｏｎらの第７，４０５，３９５号、およびＭｕｔｚらの第７，４３９，０４８号に記載されている。Ｌａｂｃｙｔｅの市販のＡＤＥシステムの例としては、Ｅｃｈｏ（登録商標）５２５、Ｅｃｈｏ（登録商標）５５０、およびＥｃｈｏ（登録商標）５５５液体ハンドラーを含むＥｃｈｏ（登録商標）５００シリーズの液体ハンドラーシステムが挙げられる。

【0078】

上記で説明されているように、本明細書の音響放射発生器は、好ましくは集束素子を含む。当技術分野で公知の曲面またはフレネルレンズを含む様々な集束手段はいずれも、本発明と共に使用することができる。そのような集束手段は、Ｌｏｖｅｌａｄｙらの米国特許第４，３０８，５４７号およびＱｕａｔｅらの米国特許第５，０４１，８４９号、ならびに米国特許出願公開第２００２０３７５７９号に記載されている。

【0079】

ウェルプレートまたは他のタイプのアレイ内などの、複数のレザバーの各々にある宿主細胞をトランスフェクトする場合、本方法は、各ソノポレーション事象後に、照射しようとする次のレザバーに音響放射発生器が整列されるように、音響接続関係にあるレザバーの各々および音響放射発生器を位置決めするための手段と合わせて実施される。位置決め手段は、レザバーを含む担体（例えば、移動可能なステージに位置決めされていてもよい）を音響エジェクタに対して移動させるために、またはその逆のために、トランスフェクションシステム内に組み込まれていてもよい。それにより、レザバーの迅速で引き続いた照射を容易に促進することができる。両タイプの位置決め手段、つまりエジェクタ位置決め手段またはレザバーもしくはレザバー担体位置決め手段は、例えば、モーター、レバー、プーリー、ギア、またはそれらの組み合わせ、または他の電気機械的もしくは機械的手段から構築することができる。レザバー間移行時間は、好ましくは、最大で約０．５秒、好ましくは最大で約０．１秒、および最適には最大で約０．００１秒である。

【0080】

注目すべきことには、音響放射発生器は、照射しようとするレザバーに、したがって同様にレザバーの内容物に対して音響接続関係になければならず、複数のレザバーを引き続いて照射する場合、音響放射発生器は、ソノポレーション後に、各々の照射されたレザバーから分離され、その後、次のソノポレーション事象のために次のレザバーと音響的に接続される。したがって、プロセスは、音響放射発生器を、照射しようとする第１のレザバーと音響的に接続して、第１のレザバーを照射すること、その後、音響放射発生器を第１のレザバーから音響的に分離すること、その後、音響放射発生器を次のレザバーと音響的に接続して、次のレザバーを照射することなど、ならびに所望の数のレザバーが照射されるまでプロセスを継続することを含む。レザバーの内容物と直接接触させることにより音響的接続を達成することが可能であるが、好ましい手法は、音響放射発生器の任意の部分（例えば、集束手段）を、レザバーの内容物と接触させずに、音響放射発生器を、レザバーと、およびしたがってその内容物と音響的に接続することである。

【0081】

音響放射発生器は、各レザバーの外部表面と直接的に接触してもまたは間接的に接触してもよい。直接的な接触の場合、音響放射発生器をレザバーと音響的に接続するためには、直接的な接触が、効率的な音響エネルギー移転を確実にするように完全に共形的（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ）であることが好ましい。すなわち、音響放射発生器およびレザバーは、嵌め合い接触に適した対応する表面を有するべきである。したがって、音響接続が、集束手段を介して音響放射発生器とレザバーとの間で達成される場合、レザバーは、集束手段の表面プロファイルに対応する外側表面を有することが望ましい。共形接触でない場合、音響エネルギー移転の効率および精度が損なわれる場合がある。加えて、多数の集束手段は曲面を有するため、直接接触手法は、特異的に形成された逆表面を有するレザバーの使用を必要とする場合がある。

【0082】

最適には、音響放射発生器と各レザバーとの間の間接的接触による音響接続は、以下の文献に記載されているように達成される：Ｓｔｅａｒｎｓらの米国特許第６，４１６，１６４号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，６６６，５４１号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，６０３，１１８号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，７４６，１０４号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，８０２，５９３号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，９３８，９８７号、Ｍｕｔｚらの第７，２７０，９８６号、Ｅｌｌｓｏｎらの第７，４０５，３９５号、およびＭｕｔｚらの第７，４３９，０４８号。これらは、上記で引用されている。一般的に、音響接続媒体は、音響放射発生器と照射しようとするレザバーの底部との間に配置される。音響接続媒体は、音響接続流体、好ましくは、音響放射発生器の最上部表面と、例えば、音響放射発生器の最上部表面に位置する音響集束手段と、レザバーの下側とで共形接触する音響的に均質な物質であってもよい。加えて、音響接続流体が、照射されているレザバーの流体媒体とは異なる音響特性を有する物質を実質的に含まないことを確実にすることが重要である。使用の際、第１のレザバーは、音響放射発生器により発生された音響放射が、例えば集束手段により音響接続媒体内へと指向され、次いで音響放射がレザバー内へと伝達されるように、音響放射発生器と音響的に接続される。システムは、単一の音響エジェクタを含んでいてもよく、または以前に注記されているように、複数のエジェクタを含んでいてもよい。単一エジェクタ設計は、液滴配置の精度ならびに液滴サイズおよび速度の一貫性が、単一エジェクタを用いるとより容易に達成されるため、一般的に、複数のエジェクタ設計よりも好ましい。しかしながら、本発明は単一エジェクタ設計に限定されない。

【0083】

本明細書で以前に説明されているように、ソノポレーションによりトランスフェクトしようとする宿主細胞を含むレザバーは、宿主細胞および宿主細胞内に導入しようとする外因性物質を含む。宿主細胞および外因性物質は、流体媒体、つまり、緩衝液、例えばダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）などの等張性緩衝液などの宿主細胞適合性流体媒体中に含まれていることが有利である。「適合性」流体媒体とは、細胞が、少なくとも５分間生存することができる媒体を意味する。

【0084】

宿主細胞および宿主細胞タイプ：細胞は、必要な因子をすべて有する適切な媒体で増殖されるべきであり、媒体は、夾雑物を含んでいてはならない。レザバー内に含まれる流体媒体中の細胞密度は最適化されるべきである。なぜなら、低すぎる密度は、細胞間接触の非存在下で増殖不良を引き起こす場合があり、高すぎる密度は、接触阻害をもたらして、細胞が核酸または他の高分子の取込みに対して耐性となる場合があるためである。宿主細胞は、一般に、細胞株など、被験体から採取された細胞に由来する。一般にうまくいく哺乳動物細胞株だけでなく、一部の場合、従来公知の方法ではトランスフェクトするのが非常に難しい細胞を含む、多数のタイプの哺乳動物細胞を、本発明の方法を使用してトランスフェクトすることができる。一般にうまくいく哺乳動物細胞株としては、例えば、以下のものが挙げられる：ヒト細胞株ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨＵＶＥＣ、ＭＣＦ７、Ｈ１ヒト胚性、ＧＭ１２８７８、Ｋ５６２、およびジャーカットＥ６．１；マウス細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３およびＭＥＦ（マウス胚性線維芽細胞）；およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびアフリカミドリザル腎臓（ＣＯＳ−７）細胞などの他の細胞株。通常はトランスフェクトが非常に難しいが、本方法を使用して効率的にトランスフェクトすることができる細胞としては、例として、Ｂ細胞およびＴ細胞を両方とも含むリンパ球；あらゆる起源の初代細胞；ニューロン；あらゆるタイプの幹細胞；および卵母細胞が挙げられる。この後者の群内の具体的な細胞株としては、ヒトリンパ芽球様株ＧＭ１２８７８およびジャーカットＥ６．１、ならびにＨ１ヒト胚性細胞が挙げられる。

【0085】

本方法を使用してトランスフェクトすることができる細胞株の具体的な例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ジャーカット、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚性線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３．ＢｘＰＣ３．Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、ジャーカット、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ １−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ １１、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、ベロ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック変種。細胞株は、当業者の公知の様々な供給源から入手可能である（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を参照。

【0086】

宿主細胞を含む流体媒体中の外因性物質、つまり、トランスフェクションにより宿主細胞内に組み込もうとする外因性物質は、生細胞内に導入して、意図されている機能、結果、または利益を提供することができる任意の物質であってもよい。トランスフェクションは、一般的に、細胞のＤＮＡに付加、変更、および／または調節するように分子をレシピエント細胞内に導入することであると定義されるが、本発明の状況では、この定義は、本発明の方法が、宿主細胞ＤＮＡの構造および機能に最終的に影響を及ぼす分子部分を含むがそれらに限定されない幅広く様々な分子部分の宿主細胞内への組込みを促進する限り、拡大されてもよい。「外因性物質」としては、この用語が本明細書で使用される場合、限定されないが、以下のものを含む：ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、宿主細胞でタンパク質を発現することになる遺伝子をコードするＤＮＡプラスミド、エンハンサーまたはＲＮＡ）を生成するような他の目的に有用なＤＮＡプラスミド、ＣＲＩＳＰＲのための相同組換えドナーなどの目的の部分をコードする小型線形ＤＮＡなどの核酸；キナーゼ、サイトカイン、クロマチンリモデリング酵素、視覚化用の蛍光タンパク質、および通常タンパク質の変異体バージョンを含むタンパク質およびポリペプチド；ならびに小型分子、特に、特定の経路（例えば、薬物または毒素経路）の阻害剤または活性化因子、放射性標識ヌクレオチドまたはアミノ酸、コレステロール、グルコース、および他の糖などの、生物学的に有用な（例えば、生物学的プロセスの調節を支援することができる）低分子量の（＜約９００ダルトン）有機化合物（例えば、「小型分子」下のＮＣＢＩ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓデータベースエントリーを参照）；脂質、リポタンパク質、リポポリサッカリド、リポポリサッカリド、およびポリサッカリドなどの脂質性およびサッカリド性物質；ならびにＣＲＩＳＰＲ編集に使用されるＣａｓタンパク質およびタンパク質複合体などのリボ核タンパク質。

【0087】

好ましい実施形態では、外因性物質は、ＤＮＡプラスミドなどの核酸、またはＣａｓ：ガイドＲＮＡリボ核タンパク質などのリボ核タンパク質を含む。

【0088】

核酸：宿主細胞内に導入することができる外因性核酸は、遺伝子、遺伝子断片、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの形態であってもよく、または生物学的活性または他の利益を有する任意の他のタイプの核酸であってもよい。本方法を使用して宿主細胞内に導入される核酸は、一般的には、しかしながら必ずというわけではないが、好適な調節領域（例えば、プラスミドであってもよいベクターのプロモーター配列）の転写および翻訳制御下にある少なくとも１つの構造遺伝子を含む構築物の形態であり、次いで、前述の構造遺伝子によりコードされるペプチドまたはタンパク質の発現を可能にする。当技術分野で公知のように、そのような構築物は、通常、プロモーター以外の１つまたは複数の調節エレメントを含む。最も一般には、外因性核酸は、本方法を使用して、ＤＮＡプラスミドにより宿主細胞内に導入される。他の好適なベクターが公知であり、関連する本文および文献に記載されている。核酸による宿主細胞のトランスフェクションは、一部の場合では、陽イオン性脂質処方物、陽イオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン）、またはデンドリマーなどのトランスフェクション促進剤を必要とする場合がある。上記で示唆されている本発明の方法は、実施例５で確立されているＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート：ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）プラスミドと組み合わせてもうまく機能する。ＣＲＩＳＰＲプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする場合、幾つかの軽微な修飾が必要または望ましい場合がある。例えば、ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、比較的大型であるため、上流処理に供して、その全体的サイズを低減してもよい。その代わりにまたは加えて、ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）などのトランスフェクションヘルパ−試薬を使用してもよい。

【0089】

ＣＲＩＳＰＲおよびＲＮＰ：本方法は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む幅広く様々なタンパク質との併用に有用であることが強調されるべきである。ＲＮＰは、ＲＮＡと結合したタンパク質である。つまり、ＲＮＰは、リボ核酸およびＲＮＡ結合タンパク質の複合体である。そのような複合体は、ＤＮＡ複製および遺伝子発現の調節を含む、多くの生物学的機能に重要である。本状況では、ゲノム編集分野で最近急速に重要性を増しているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ機序を強化する操作されたＲＮＰが特に重要である。例えば、Ｄｏｎｏｈｏｕｅら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７年８月１日）を参照されたい。当技術分野で公知のように、ＣＲＩＳＰＲに基づくトランスフェクションは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質または「Ｃａｓ」タンパク質、ならびにＲＮＡ、つまりｃｒＲＮＡ（宿主ＤＮＡの標的配列の位置を特定する）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡと塩基対合して、ＲＮＡ二重鎖を形成する）の組み合わせ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を組み込む単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のいずれでもよい「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）で構成されているＲＮＰを使用することを含む。

【0090】

Ｃａｓタンパク質、通常はＣａｓ９またはその相同体、およびガイドＲＮＡ、「単鎖ガイド」ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組み合わせのいずれかは、ＣＲＩＳＰＲトランスフェクション系の主成分である。ＣＲＩＳＰＲ成分のバリエーションが可能であり、例えば、Ｚｈａｎｇらの米国特許第８，７７１，９４５号に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するＣａｓ９などのＣａｓ９が、最も一般に使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであるが、他のＣａｓタンパク質、特にＣｆｐ１を、Ｃａｓ９の代わりに使用することができ、他のＣａｓタンパク質としては、限定されないが、以下のものが挙げられることが理解されると予想される：Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２．Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、またはそれらの修飾されたバージョン。本明細書でＣＲＩＳＰＲトランスフェクションと共に使用されるＣａｓタンパク質は、種々の方法の１つで変更または修飾されていてもよく、例えば、標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠如する変異したＣａｓヌクレアーゼが、多くの状況で有用であり得る。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインのアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａニッカーゼは、二本鎖ではなく、ポリヌクレオチド二重鎖の一本鎖を切断する。別の例として、前述の変異およびＨＮＨドメインにＨ８４０Ａ変異を含む、「ｄＣａｓ９」は、ポリヌクレオチドを切断する能力を完全に欠如する。例えば、Ｑｉら（２０１３年）Ｃｅｌｌ １５２巻：１１７３〜１１８３頁を参照されたい。さらなる例として、Ｃａｓヌクレアーゼは、融合タンパク質ドメインが、追加の機能、例えば転写活性化または抑制活性または核酸結合活性などを提供するように選択されている融合タンパク質の一部である。

【0091】

一般的に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列、特に標的ゲノムに固有な配列である。ガイド配列は、いくつもの目的のために、宿主細胞のポリヌクレオチドの標的化を可能にして、標的とする領域を欠失、挿入、転座、不活化、または活性化することにより標的ポリヌクレオチドを修飾するように選択することができる。したがって、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断および予後を含む多数の分野に幅広い適用を有する。したがって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、多くの疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドならびにシグナル伝達生化学的経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドを含むことができる。多数の疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドが、当技術分野で公知であり、シグナル伝達生化学的経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドも同様である。例えば、上記のＺｈａｎｇらの米国特許第８，７７１，９４５号を参照されたい。

【0092】

宿主細胞をソノポレートするための本方法は、音響放射発生器により発生された音響放射を宿主細胞に付与するための手段を含む。一般的には、しかしながら必ずというわけではないが、音響放射を宿主細胞に付与するための手段は、トランスフェクション刺激物質、つまり音響放射発生器による照射時に超音波的な振動を引き起こし、超音波振動を近隣の宿主細胞に移転する物質を含む。トランスフェクション刺激物質は、粒子、ビーズ、または局所化流体容積の形態の複数の音響活性化可能な部分を含んでいてもよく、「局所化流体容積」は、輪郭形成特徴（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅ）により取り囲まれていても取り囲まれていなくともよい空間的に局所化された容積の流体を指し、局所化流体容積は、通常は、周囲流体とは異なる物理的特性を有するが、それが必要というわけではない。取り囲まれていない局所化流体容積としては、局所化された脂質性または疎水性領域が、親水性（例えば、水性）流体内に含まれているか、または局所化された親水性（例えば、水性）領域が、脂質性または疎水性流体内に含まれている流体組成物が挙げられる。取り囲まれた局所化流体容積としては、流体含有マイクロカプセル、例えば、液体含有およびゲル含有マイクロカプセルが挙げられ、カプセル壁は、カプセル内部と外部流体との間である程度の物質交換が可能であってよくまたは可能でなくともよく、流体は、懸濁粒子を含んでいてもよくまたは含んでいなくともよい。さらに他のタイプの取り囲まれた容積は、含まれている流体と不混和性であってもよくまたは不混和性でなくともよい第１の流体で構成されており、不混和性物質の分子層が、流体内部と流体外部との間に障壁を提供するように第１の流体を取り囲む。例えば、Ｍｕｔｚらの米国特許第７，２７０，９８６号を参照されたい。

【0093】

本発明の一実施形態では、トランスフェクション刺激物質は、宿主細胞および外因性物質と共に流体媒体内に組み込まれる気体充填マイクロバブルを含む。

【0094】

本明細書の好ましい実施形態で使用されるマイクロバブルは、例えば、標的化リガンドの付着により機能化することができる外側表面を有するシェル内部に気体コアを被包する小型球体である。以降、標的化リガンドは、宿主細胞に特異的な抗体に存在する第２の結合部分に会合することができ、第１および第２の結合部分の会合が、マイクロバブル−宿主細胞複合体をもたらすことができる限り、時には「第１の結合部分」と称されることになる。マイクロバブル−宿主細胞複合体の形成は、マイクロバブルにより受け取られ、それらを振動させる音響放射が宿主細胞に伝達され、ソノポレーションを促進することを確実にするための１つの技法である。理論により束縛されることは望まないが、音響放射の宿主細胞への伝達は、細胞膜または細胞壁を物理的に破壊し、ＤＮＡまたはＲＮＰなどの大型分子の細胞取込みを可能にする一過性の細孔を生成することにより、ソノポレーションを促進すると考えられる。

【0095】

典型的なマイクロバブル物質、つまり典型的なシェル物質の例としては、限定されないが、脂質、ポリマー、アルブミン、およびガラクトースが挙げられるが、最も一般には脂質性物質が使用される。また、より長期間持続する、つまり分解（生分解または他のプロセスによる）に耐性の他のタイプのシェル物質、例えば、被覆ガラスビーズまたは架橋ポリマーを使用することができる（Ｃｏｈｅｎらの米国特許第５，４８７，３９０号を参照）。好適なマイクロバブルとしては、医学的造影画像法（つまり、コントラスト増強超音波での）、細胞単離、および細胞分離に使用されるマイクロスフェア型の製品が挙げられる。したがって、種々の状況におけるマイクロバブル造影剤の使用に関し、好適なマイクロバブルシェル物質および表面機能化技法を開示するＲｙｃｈａｋらの米国特許出願公開第２０１５／０２１９６３６号Ａ１（出願人Ｔａｒｇｅｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に記載されているシェル物質も、本方法と共に使用することができる。本発明と共に使用するための好ましいマイクロバブルシェル物質は、ソノポレーション中のキャビテーションの可能性を最小限に抑えるために、比較的弾性である。マイクロバブルの気体コアは、ペルフルオロカーボン、空気、または窒素であってもよいが、ペルフルオロカーボンが最も一般である。超音波周波数場で振動し、次いで、本トランスフェクション法中にマイクロバブルの共鳴を引き起こすのは、マイクロバブルの気体コアである。根底にある機序は、明確には特定されていないが、本明細書に記載のような、宿主細胞に繋留されたマイクロバブルの音響誘導共鳴は、トランスフェクションが成功する要因であることが強調されるべきである。

【0096】

本発明と共に有利に使用することができる市販の超音波造影剤としては、例として、以下のものが挙げられる：Ｔａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ（登録商標）およびＴａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ（登録商標）ＳＡ（Ｔａｒｇｅｓｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能；Ｔｌａｘａら（２０１０年）Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．３６巻（１１号）：１９０７〜１８頁を参照）；Ｏｐｔｉｓｏｎ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、オクタフルオロプロパン気体コアを有するアルブミンマイクロバブル；脂質／ガラクトースシェルおよび空気コアを有するＬｅｖｏｖｉｓｔ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ペルフレキサンコアを有するＩｍａｇｅｎｔ（登録商標）脂質マイクロスフェア；オクタフルオロプロパン気体コアを有するＤｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）脂質マイクロスフェア；ならびにＬｕｍａｓｏｎ（登録商標）六フッ化硫黄脂質マイクロバブル（以前は、Ｓｏｎｏｖｕｅ（登録商標））およびＭｉｃｒｏＭａｒｋｅｒマイクロバブル（Ｂｒａｃｃｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓ．ｐ．Ａ．／Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｖｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ）。Ａｋａｄｅｕｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）から入手可能なストレプトアビジン被覆ガラスマイクロバブルなど、他の目的が意図されているマイクロバブルも使用することができる。

【0097】

本発明の一実施形態では、マイクロバブルは、照射されたマイクロバブルから細胞への音響エネルギーの移転を促進するために、宿主細胞にコンジュゲートされており、それにより、刺激された細胞膜または細胞壁を介した細胞内への外因性物質のトランスフェクションが可能になる。マイクロバブル−抗体コンジュゲートの調製は、典型的には、マイクロバブルを第１の結合部分で機能化し、その後、機能化されたマイクロバブルを宿主細胞タイプに特異的な抗体と組み合わせることを含み、抗体は、マイクロバブルに存在する第１の結合部分と連結する第２の結合部分で機能化されている。混合は、宿主細胞適合性流体媒体中で実施される。マイクロバブル−抗体コンジュゲートを調製する際、質量／容積比は、典型的には、２×１０^７個のマイクロバブルに対して約０．５μｇ〜５μｇ抗体の範囲であり、より典型的には、２×１０^７個のマイクロバブルに対して約０．５μｇ〜３μｇ抗体の範囲であり、最も通常は、２×１０^７個のマイクロバブルに対して約０．５μｇ〜１．５μｇ抗体の範囲である。

【0098】

第１の結合部分と第２の結合部分との間の付着、つまりマイクロバブル−細胞複合体をもたらす連結を形成する「結合対」は、共有結合性であってもよく、または非共有結合性であってもよいが、典型的には非共有結合性である。共有結合性付着の例としては、第１および第２の結合部分の一方としての役目を果たす遊離アミノ基と、第１および第２の結合部分の他方としての役目を果たすカルボキシル基との間で形成されるアミド連結が挙げられる。非共有結合性付着の様式としては、例えば、イオン結合、水素結合、吸着、または物理的な固定化が挙げられる。例示的な結合対としては、以下のものが挙げられる：対応する抗体またはその結合部分もしくは断片と組み合わせた任意のハプテン性または抗原性化合物（例えば、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン；マウス免疫グロブリンおよびヤギ抗マウス免疫グロブリン）および非免疫学的結合対（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ホルモン［例えば、チロキシンおよびコルチゾール］−ホルモン結合タンパク質、受容体−受容体アゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、アセチルコリン受容体−アセチルコリンまたはその類似体）、ＩｇＧ−プロテインＡ、レクチン−炭水化物、酵素−酵素コファクター、酵素−酵素阻害剤、ならびに核酸二重鎖を形成可能な相補的ポリヌクレオチド対）など。典型的には、市販のビオチン化抗体およびストレプトアビジンで表面機能化されているマイクロバブルが使用されるビオチン−ストレプトアビジン付着が最も一般に使用される。

【0099】

その後、マイクロバブル−抗体コンジュゲートを外因性物質と混合することにより、「負荷」マイクロバブル−抗体コンジュゲートを調製することができ、外因性物質は、本明細書で以前に記載されている通りであり、例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰである。マイクロバブル−抗体コンジュゲートに負荷するための好ましい濃度／個数比は、１．２５×１０^７個のコンジュゲート（１ｍＬ当たり５×１０^８個）に対して約１〜１０μＭの範囲のＲＮＰであり、最適には、１．２５×１０^７個のコンジュゲートに対して約３〜６μＭの範囲のＲＮＰである。これらは代表的な範囲に過ぎず、任意の外因性物質の好適な濃度／個数比を経験的に決定することができる限りで、限定することは意図されていない。この点で、例えば、宿主細胞適合性流体で希釈することにより、流体媒体中の負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートの濃度を調整することができ、流体は、ステップ（ａ）で使用される流体媒体と同じであってもよくまたは同じでなくともよい。希釈の程度は、細胞健康状態、およびしたがってより良好なトランスフェクション効率にもつながる環境を提供するように最適化される。希釈の程度の最適化は、実施例に記載されている。一般的に、あまりに希薄な懸濁物は、十分な度合いのトランスフェクションを提供せず、濃縮され過ぎた懸濁物も、理由は異なるが、同様に不十分な度合いのトランスフェクションを提供することになり、後者の場合、宿主細胞がマイクロバブル−抗体コンジュゲートによるトーンバーストから本質的に遮蔽されることになるため、宿主細胞の多くに音響エネルギーが到達しない場合があることが留意されるべきである。

【0100】

ソノポレーション：その後、トランスフェクションをもたらすように選択されたソノポレーションパラメーターを使用して、以前に記載のように、音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、流体媒体中の負荷コンジュゲートを含むレザバー内へと指向させることにより、負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートを照射する。好適なソノポレーションパラメーターは、観察されたトランスフェクション効率を、音響強度、変換器出力周波数、およびトーンバーストプロファイル（例えば、トーンバースト幅）などの１つまたは複数のソノポレーションパラメーターに対して関連させることにより、経験的に選択することができる。例えば、以前に説明されているように、宿主細胞、マイクロバブル、および選択された外因性物質を含むレザバーの照射に使用される音圧は、マイクロバブルの共鳴を誘導するのに十分であるべきだが、好ましい実施形態では、通常はレザバー底部の内側表面に位置する音響焦点スポット近傍の流体領域にマイクロバブルキャビテーションを引き起こすほど高くなるべきではない。焦点スポットでの典型的な音圧は、約１ＭＰａ〜約２ＭＰａの範囲である。最適なソノポレーションパラメーターは、日常的な実験作業を使用して当業者により決定することができ、一般的には細胞タイプに応じて様々であろう。しかしながら、一般的に、ソノポレーションは、各々が数十ミリ秒程度またはそれより短く、約１５〜４０秒間にわたって毎秒約１０〜約２５回生じる周期的音響トーンバーストの短いバーストでレザバーを照射することにより、例えば、約３０秒間にわたって毎秒１０回（１０Ｈｚ）で１ｍｓ未満の継続期間で照射することにより実施される。説明のためであるが、実施例６には、前述のプロトコールを使用して、各トーンバーストが８サイクルの出力からなる１０Ｈｚのバースト反復率での３００回の周期的音響トーンバースト（上記に示されるように、約３０秒間のソノポレーション期間に対応する）の照射を用いたソノポレーションが記載されている。実施例６では、トーンバースト継続期間は、およそ３．５μｓだった（２．２５ＭＨｚの公称出力周波数で分割された８サイクル）。照射は、所望の場合、任意の１つのレザバー内で繰り返して、ビームの焦点の位置または幅を変化させて、ソノポレートされるマイクロバブルの数および面積を最大化し、次いでトランスフェクション効率を最大化することができる。

【0101】

通常、発生させた音響放射は、照射されたマイクロバブルが、レザバー中のマイクロバブルの平均共鳴周波数から約１５％以内の、好ましくはレザバー中のマイクロバブルの平均共鳴周波数から約５％以内の、またはレザバー中のマイクロバブルの平均周波数の高調波から約１５％以内の、好ましくはレザバー中のマイクロバブルの平均周波数の高調波から約５％以内の波長を有する励起放射を受け取ることを確実にするように選択された周波数および強度であることが好ましい。関連する実施形態では、発生させた音響放射は、特定のサイズの、または特定のサイズ範囲内の照射されたマイクロバブルが、レザバー中のマイクロバブルの平均共鳴周波数から約１５％以内の、好ましくはレザバー中のマイクロバブルの平均共鳴周波数から約５％以内の、またはレザバー中のマイクロバブルの平均周波数の高調波から約１５％以内の、好ましくはレザバー中のマイクロバブルの平均周波数の高調波から約５％以内の波長を有する励起放射を受け取ることを確実にするように選択された周波数および強度であってもよい。マイクロバブルが組成物中で多峰形サイズ分布を有する場合、マイクロバブルを１回よりも多く照射してもよく、各照射事象は、各モーダルピークを有するかまたは付近のマイクロバブルを標的とする。

【0102】

加えて、一部のマイクロバブルは、照射の結果としてキャビテーションを起こす場合があるが、一般的には、キャビテーションを回避することが好ましい。そのため、ソノポレーションは、通常、マイクロバブルキャビテーションをもたらすことになる最低音圧の約５０％〜９０％の範囲の音響ソノポレーション圧力を使用してマイクロバブルを照射するように音響放射発生器を調整することにより実施される。音響ソノポレーション圧力は、例えば、約０．２ＭＰａ〜約２ＭＰａの範囲であり、典型的には約１．５ＭＰａ未満である。多くの細胞株では、キャビテーション限界未満の音響出力レベルが、ソノポレーションによる良好なトランスフェクション結果を提供することになるが、キャビテーション限界未満で作動させる追加の利益は、その後のマイクロバブルの再使用が可能であるということである。すなわち、キャビテーション未満の音響エネルギーで照射すると、照射後に依然としてインタクトのままであるマイクロバブルの数は、一般的に、ソノポレーション前のマイクロバブルの元の数の約５０％、８０％、９０％、または９９％以内である。ソノポレーション後にインタクトなマイクロバブルは、最初にソノポレートされた宿主細胞と同じレザバー中にあってもなくてもよい同じ宿主細胞と共に再使用することができる。その代わりに、ソノポレーション後にインタクトなマイクロバブルは、自然にまたは処理の結果としてのいずれかでコンジュゲート抗体から分離されれば、異なる宿主細胞タイプと共に再使用することができる。また、キャビテーション未満の音響レベルで作動させることにより、同じレザバーで照射を反復することが可能になり、例えば、最初のソノポレーション事象の後、音響放射発生器により発生された音響ビームを使用して、インタクトであり、既に照射されたマイクロバブルを、レザバー内の異なる空間位置にある宿主細胞と接触させる。

【0103】

本発明の他の実施形態では、下記で説明されるように、ソノポレーションは、音響接続および分離ステップの反復を必要としない。宿主細胞、外因性物質、流体媒体、トランスフェクション刺激物質、および他の要素に関する上記の記載、ならびにトランスフェクション方法論の態様は、そうでなければ以下の実施形態に適用可能である。

【0104】

本発明の追加の実施形態では、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含むレザバーと音響的に接続すること；および音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、音響放射を、約１０℃よりも大きな流体媒体の温度上昇をもたらさずに宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式でレザバー内へと指向させることにより、細胞をトランスフェクトするための音響的方法が提供される。例えば、上記方法は、約５℃、２℃、または１℃よりも大きな温度上昇をもたらさずにソノポレーションを誘導することができる。関連する実施形態では、ソノポレーションは、流体媒体の温度を約４０℃より高く上昇させずに生じる。発生させた音響放射を、集束手段を使用してレザバー内へと指向させ、集束音響放射を使用してソノポレーションを実施することが好ましい。また、流体媒体は、本明細書で以前に説明されているようなトランスフェクション刺激物質を含むことが好ましい。

【0105】

別の実施形態では、音響放射発生器を、少なくとも１５３６個のレザバーを含む一体型多重レザバーユニット内に含まれる選択されたレザバーと音響的に接続することであって、選択されたレザバーが、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含む、接続すること；および音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、音響放射を、宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進することにより、細胞をトランスフェクトするための音響的方法が提供される。したがって、一体型多重レザバーユニットは、１５３６個のウェルまたは３４５６個のウェルなどを有するマイクロウェルプレートであってもよい。上記の実施形態と同様に、発生させた音響放射を、集束手段を使用してレザバー内へと指向させること、および流体媒体がトランスフェクション刺激物質を含むことが好ましい。

【0106】

別の実施形態では、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続すること；および音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、局所化流体容積が、局所化流体容積の平均共鳴周波数から約１５％以内であるかまたは局所化流体容積の平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内である周波数で振動するように音響的に活性化される様式で、音響放射をレザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進することにより、細胞をトランスフェクトするための音響的方法が提供される。例えば、局所化流体容積は、局所化流体容積の平均共鳴周波数から約５％以内であるかまたは局所化流体容積の平均共鳴周波数の高調波から約５％以内である周波数で振動するように音響的に活性化されてもよい。この場合も、好ましい実施形態では、レザバー内へと指向される音響放射は、集束音響放射である。

【0107】

別の実施形態では、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；および音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、音響放射を、選択されたサイズから約１５％以内のサイズを有する局所化流体容積が音響的に活性化される様式でレザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進するステップを含む方法が提供される。

【0108】

関連する実施形態では、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、（ａ）音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および多峰形サイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；（ｂ）音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、第１のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積が音響的に活性化される様式で、音響放射をレザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された局所化流体容積が、音響エネルギーを宿主細胞付近に移転させるステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）を繰り返して、第２のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップ；および（ｄ）任意選択で、ステップ（ｂ）を繰り返して、１つまたは複数の追加のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップを含む方法が提供される。

【0109】

追加の実施形態では、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；および音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた音響放射を、宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式でレザバー内へと指向させるステップであって、発生させた音響放射の周波数成分が、音響活性化可能な局所化流体容積のサイズ分布と関連するように選択される、ステップを含む方法が提供される。「〜と関連する」とは、音響放射内の個々の周波数が、局所化容積分布内の個々のサイズおよびサイズ範囲を標的とし、音響的に活性化するように調整される（ｔｕｎｅ）ことを意味する。

【0110】

関連する実施形態では、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップであって、トランスフェクション刺激物質が、レザバー内で空間分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されている、ステップ；および音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた音響放射を、宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式でレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた音響放射の周波数成分が、音響活性化可能な局所化流体容積の空間分布と関連するように選択される、ステップによる方法が提供される。この場合、「〜と関連する」は、音響放射内の個々の周波数が、レザバー内の異なる位置の局所化容積を標的とし、音響的に活性化するように調整されることを示す。

【0111】

別の実施形態では、ソノポレーションは、協同して（好ましくは同時に、しかしながら必ずしも同時とは限らない）、ただし異なる周波数で作動する２つの変換器を使用して実施され、変換器の一方は、環状変換器であり、周囲に作動可能に設置され、標準的変換器を封入する。この実施形態では、環状変換器および標準的変換器は、一般的には、異なる周波数で作動することになる。例えば、ソノポレートされた細胞が、流体媒体から音響的に射出される場合、環状変換器は、ソノポレーションを引き起こすように選択された周波数で作動させてもよく、標準的変換器は、例えば、レザバー内への、担体への、または分析のための分析機器への輸送のために、ソノポレートされた細胞の音響射出をもたらすのに有効な周波数で作動させることができる。そのような場合に、環状変換器は、約１ＭＨｚ〜約２．５ＭＨｚの範囲の周波数で作動させてもよく、標準的変換器は、約６ＭＨｚ〜約２０ＭＨｚの範囲の、好ましくは約９ＭＨｚ〜約１４ＭＨｚの範囲の、および最適には約１１．５ＭＨｚの周波数で作動させてもよい。

【0112】

この実施形態の一態様では、２つの変換器の一方は、主に、ソノポレーションのための音響エネルギーを供給するように機能し、他方の変換器は、マイクロバブル−細胞コンジュゲーションを使用しない場合、宿主細胞に対するマイクロバブルの相対的位置を変化させるための音響エネルギーを送達する。理想的には、マイクロバブルおよび宿主細胞は、互いに接近して位置決めされるとき、ソノポレーションを引き起こすのに有効な音響強度の領域にあるべきである。

【0113】

追加の実施形態では、ソノポレーションは、異なるサイズのマイクロバブルをソノポレートするのに有効な異なる音響周波数を各々が有する複数の音響トーンバーストを引き続いて照射することを含む。複数の音響トーンバーストの各々の音響周波数は、典型的には、約１．５ＭＨｚ〜約５．０ＭＨｚの範囲、より通常には、約２．０ＭＨｚ〜約２．５ＭＨｚの範囲である。狭い分布のマイクロバブルサイズでは、広い分布のマイクロバブルサイズと同じレベルの励起を達成するのに、典型的にはより小さな範囲の音響周波数が必要とされ、ここで同じ効果を達成するには音響周波数を変動させる必要がある。最適には、音響周波数成分は、ソノポレーションの均一性を向上させるためにマイクロバブルの共鳴周波数分布に応じて、かつ最小量の送達される総音響エネルギーにおいて調整される。複数の音響トーンバーストは、一般に、５サイクル〜１０サイクルのトーンバーストであり、同じであってもよくまたは異なっていてもよい。

【0114】

さらなる実施形態では、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積を含むトランスフェクション刺激物質を含む選択されたレザバーと音響的に接続するステップ；および音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、音響放射を、局所化流体容積が音響的に活性化される様式でレザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進するステップを含み、発生される音響放射は、局所化流体容積の少なくとも５０％が照射後に依然としてインタクトのままであることを確実にするように選択された音響ソノポレーション圧力におけるものである、方法が提供される。この実施形態の一態様では、音響ソノポレーションは、局所化流体容積のキャビテーションをもたらすことになる最低音圧の約５０％〜約９０％の範囲である。

【0115】

また、本開示は、音響的トランスフェクションプロセスを最適化するための種々の方法を包含することが意図される。例えば、Ｅｌｌｓｏｎらの米国特許第６，９３２，０９７号、Ｅｌｌｓｏｎらの第６，９３８，９９５号、Ｅｌｌｓｏｎらの第７，３５４，１４１号、Ｑｕｒｅｓｈｉらの第７，８９９，６４５号、Ｅｌｌｓｏｎらの第７，９００，５０５号、Ｓｔｅａｒｎｓらの第８，１０７，３１９号、Ｅｌｌｓｏｎらの第８，４５３，５０７号、およびＳｔｅａｒｎｓらの第８，５０３，２６６号に記載されているように、レザバー中の流体を特徴付けるために、本明細書に記載の音響放射発生器を使用して、流体メニスカスの高さ、ならびに流体容積、粘度、密度、表面張力、組成、音響インピーダンス、音響減衰、流体中の音速などの他の特性を測定し、その後、それらのいずれかまたはすべてを使用して、音響出力、音響周波数、トーンバースト継続期間、および／または集束レンズのＦ値を含む、最適なソノポレーションパラメーターを決定することができる。別の例として、Ｓｔｅａｒｎｓらの米国特許第７，７１７，５４４号および第８，７７０，６９１号には、レザバー内の表面から反映する音響放射の波形を分析することにより、音響的液滴射出または他の音響プロセスに使用される音響放射の振幅を最適化するための方法が記載されている。加えて、Ｍｕｔｚらの米国特許第７，４８１，５１１号およびＥｌｌｓｏｎらの第７，７８４，３３１号には、音響プロセスパラメーターを制御して、レザバー特性の変動を説明するための方法が提供されている。

【実施例】

【0116】

実験

【0117】

材料
以下のリストには、これらの実施例で使用される材料が、材料の供給源と共に示される。

【0118】

Ｔａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ（登録商標）ＳＡ：ストレプトアビジン機能化マイクロバブルの陽イオン性分散物（Ｔａｒｇｅｓｏｎ）

【0119】

抗ＣＤ５１：ビオチン化抗ヒトＣＤ５１抗体、０．０９％アジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ中０．５μｇ／μＬ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３２７９０６）

【0120】

ＨＥＫ−２９３細胞：ヒト胚性腎臓細胞、細胞株２９３、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および１００Ｕ／μＬペニシリン−ストレプトマイシンで追加補充された高グルコース培地を有する標準細胞培養緩衝液ＤＭＥＭ中（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−１７７３）

【0121】

ＤＰＢＳ：カルシウムおよびマグネシウムを有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１４０４０１８２）

【0122】

ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質（全体にわたって、ｅＧＦＰすなわち高感度ＧＦＰを使用した）

【0123】

ｇＷｉｚ−ＧＦＰ：ｅＧＦＰをコードするプラスミド（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）

【0124】

ＣＲＩＳＰＲプラスミド：ｐＣａｓ−Ｇｕｉｄｅ−ＥＦ１ａ−ｅＧＦＰ（Ｏｒｉｇｅｎｅ ＃ＧＥ１０００１８）

【0125】

リポフェクタミン（登録商標）３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）

【0126】

実施例１〜５についての一般的プロトコール

【0127】

（１）マイクロバブル／ＤＰＢＳ分散物の調製：Ｔａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ ＳＡマイクロバブル分散物を含むバイアルを、混合物が均一に混濁するようにみえるまで、１０秒間穏やかに振盪し、反転した。１００μＬのＴａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ ＳＡ分散物を抽出し、新しい１．５ｍＬチューブに導入した。９００μＬのＤＰＢＳを添加し、分散物を穏やかに混合した。その後、混合物を、室温で直立させて２分間インキュベートし、その後Ｍｉｎｉｆｕｇｅ（登録商標）で２分間遠心分離して、マイクロバブルを懸濁液から分離した。注射針を使用して、マイクロバブルの白色ケークの下にある下澄み（ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ）をゆっくりと除去し、その後、マイクロバブルを、１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。（元のマイクロバブル媒体で見られた、表面張力問題およびバブルのウェル表面との接着を低減するために、元の媒体をＴａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ ＳＡマイクロバブル分散物から除去し、ＤＰＢＳで置換した。）実施例６では、その例で説明されているように、このプロトコールの改変版を使用した。

【0128】

（２）マイクロバブルとビオチン化抗体とのコンジュゲーション：１０μｇの抗ＣＤ５１ビオチン化抗体（つまり、２０μＬの０．５μｇ／μＬ溶液）を１００μＬのマイクロバブル分散物に添加し、抗ＣＤ５１抗体のＴａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ ＳＡ分散物に対する質量／容積比は、１：１０だった。バイアルを、穏やかに撹拌しながら室温で約２０分間インキュベートした。実施例６では、そこで説明されているように、このプロトコールの改変版を使用した。

【0129】

（３）プラスミド負荷マイクロバブルの調製（実施例１〜５）：ビオチン化抗体／Ｔａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ組成物を含むバイアルを、何回か反転させて均一に混合し、２４μＬの５μｇ／μＬ ｇＷｉｚ−ＧＦＰプラスミドを（１２０μｇのｇＷｉｚ−ＧＦＰに対応する）、（２）で調製した１２０μＬのマイクロバブル−ビオチン化抗体コンジュゲートに添加した。プラスミドのＴａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ ＳＡ分散物に対する質量／容積比は、１：１だった。バイアルを、再び穏やかに撹拌しながら室温で約２５分間インキュベートした。

【0130】

（４）細胞とのインキュベーション：以下のプラスミド負荷マイクロバブル希釈物を調製した：

【0131】

１：４容積／容積、１００μＬマイクロバブル分散物および３００μＬ ＤＰＢＳ；

【0132】

１：２０容積／容積、２０μＬマイクロバブル分散物および３８０μＬ ＤＰＢＳ；

【0133】

１：４０容積／容積、１０μＬマイクロバブル分散物および３９０μＬ ＤＰＢＳ；ならびに

【0134】

１：２００容積／容積、２μＬマイクロバブル分散物および３９８μＬ ＤＰＢＳ。

【0135】

マイクロバブルを含まない４００μＬ ＤＰＢＳを、対照として使用した。

【0136】

２０μＬのプラスミド負荷マイクロバブル（または対照）を、平板培養されたＨＥＫ−２９３細胞（これは、３８４ウェルプレートで８０％コンフルエンスまで培養され（１ウェル当たりおよそ２５，０００個の細胞が得られ、最大容積はおよそ１１５μＬ／ウェルだった）、培地は最初にピペット操作で細胞から除去しておいた）にピペットで入れた（ｐｉｐｅｔｔｅ）。以下の表では、処理濃度は、マイクロバブル希釈物、１ウェル当たりの負荷容積、およびマイクロバブル対細胞インキュベーション比と関連付けられている。

【表1】

【0137】

ウェルプレートを、上下逆さまに裏返して結合を促進し、３７℃のインキュベーターに５分間入れた。当初は、その後、プレートを５０μＬのＤＰＢＳで洗浄して、未結合マイクロバブルを除去したが、洗浄ステップで細胞も除去されてしまうことが判明したため、洗浄ステップを中止した（注：これは、異なる細胞タイプの場合、該当する場合もあり、または該当しない場合もある）。

【0138】

（５）ソノポレーション：予め加温しておいた８０μＬのＤＰＢＳをウェルに再充填して合計を１００μＬとし、１２５ＲＣＦで５分間遠心分離して大きなバブルを除去した（より速い回転速度では、細胞は、ほとんどではないとしても、その多くが死滅してしまう可能性が高いと予想される）。その後、細胞を、音響液体ハンドラー（Ｅｃｈｏ（登録商標）５００シリーズ液体ハンドラー、Ｌａｂｃｙｔｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）の改良型の音響放射発生器を使用して超音波でパルス処理し、ウェルプレートを一晩インキュベーターに戻した。１〜２日後、細胞を、ＤＮＡ取込みを示すＧＦＰ蛍光および生存について検査した。

【0139】

（実施例１）
上記のプロトコールを使用して、４枚のプレートのＨＥＫ−２９３細胞を試験した。ＤＰＢＳ単独対照ウェルを含む、４つすべてのプレートを同一にセットアップした。対照プレートは超音波処理しなかった。３８４ウェルプレートを、１ウェル当たり２５，０００個のＨＥＫ−２９３細胞で使用した。各プレートを、単一の電圧、０Ｖ（対照プレート）、０．５Ｖ（低出力）、１．０Ｖ（中出力）、または１．５Ｖ（高出力）のいずれかでパルス処理した。１．０Ｖは、焦点で約１．５ＭＰａの音圧をもたらした。ソノポレーションの２４時間後、細胞のＧＦＰ蛍光を検査した。ソノポレーションは、ＨＥＫ−２９３細胞がＧＦＰプラスミドを取り込み、発現することを可能にすることにおいて成功裏のものであり、そして取込みパーセントは、電圧およびプラスミド負荷マイクロバブルの濃度と共に増加したことが見出された。最も高い濃度のプラスミド負荷マイクロバブルおよび最も高い電圧で、蛍光が最高度であることが見出された。緑色（蛍光）細胞は、ウェルプレートを反転させた後のマイクロバブルの分布により、ウェルの周囲付近に濃縮されていた。対照プレートの一部の細胞が緑色になったが、極めてわずかだった。これは、数パーセントの細胞が、培地中のプラスミドを取り込んだことによるものだった。

【0140】

（実施例２）
１：２００希釈の代わりに「プラスミドのみ」の対照を用いた、つまりプラスミドを１：４ウェルに見出されるものと同じ濃度で添加したこと以外は、一般的プロトコールおよび実施例１の手順に従った。得られた結果により、高媒体濃度のプラスミド単独では、細胞の形質転換に十分ではないことが確認された。

【0141】

（実施例３）
一般的プロトコール実施例１の手順を繰り返したが、各ウェルの中心に単一のパルスを適用するのではなく、各ウェルを異なる位置で数回パルス処理した。これは、各ウェルの全体にわたってＧＦＰ蛍光が存在することから推論することができるように、ウェルの周囲付近にトランスフェクトされた細胞が濃縮することを解消し、より均一な分布を提供したことが見出された。

【0142】

（実施例４）
実施例１の手順を以下のように改変して繰り返した。

【0143】

２つの陽性対照細胞集団が含まれていた：（１）リポフェクタミン３０００を使用し、製造業者により提供されたトランスフェクションプロトコールに従って、細胞をトランスフェクトし、（２）死細胞を熱ショックにより死滅させた。

【0144】

加えて、ソノポレーションの１〜２日後に、死細胞を陽性染色する細胞膜完全性色素、つまりＭｕｌｔｉＣｙｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｄｙｅ Ｐａｎｅｌ ＦＬ３ ｄｙｅ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ、Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＮＭ）で、細胞を染色した。

【0145】

トランスフェクション率および生存率を、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して分析した。結果は、図１〜図７に提供されている。図１は、ＨＥＫ−２９３細胞をマイクロバブルおよび他の物質と区別することを可能にする、前方散乱の高さ 対 側方散乱の高さのプロットを示し、死細胞は、生細胞のより高密度クラスターの上方のより高いＳＳＣ−Ｈ軸に、別個のグループとして出現する。図２では、ＧＦＰをコードするプラスミドがトランスフェクトされた細胞はＦＬ１チャネルで検出され、細胞膜完全性色素で染色された細胞、つまり死細胞は、ＦＬ３チャネルで検出された。プロットの「ＧＦＰ＋」および「死」というラベルは、手動で設定したものであり、こうした対照細胞集団は、図３では別々に示される。図４および図５から結論付けることができるように、トランスフェクションに成功した宿主細胞の割合は、音響出力およびマイクロバブル濃度の両方と共に増加した。また、図６に示されるように、トランスフェクション後に残る生細胞のパーセントは、使用された最も高い電圧、１．５Ｖでさえ、ほぼ１００％である。図７は、陰性対照、つまり、マイクロバブルの非存在下にてＤＰＢＳのみで得られたデータを示す。

【0146】

（実施例５）
この例には、ソノポレーションを使用したＣＲＩＳＰＲプラスミドのトランスフェクションが記載されている。ｇＷｉｚ−ＧＦＰプラスミドの代わりに、Ｃａｓ９およびＧＦＰを発現するＣＲＩＳＰＲプラスミドを用いたこと以外、一般的プロトコールおよび実施例１の手順に従った。１．５Ｖのソノポレーションパルスを使用した。マイクロバブル−抗体コンジュゲートの分散物を、ＤＰＢＳで調製した（一般的プロトコールに記載されているように）。マイクロバブル−抗体コンジュゲートの濃度は、ＤＰＢＳ １ｍＬ当たり５×１０^８個だった。その後、この分散物を、分散物１μＬ当たりのμｇプラスミドとして示されている、以下の比率でプラスミドと組み合わせた：１：１；２：１；４：１；および８：１。各比率で３回の反復を実施した。１つの「無プラスミド」陰性対照行および１つの「無ソノポレーション」陰性対照列が含まれていた。実施例４と同様に、ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ＦＡＣＳを使用して結果をアッセイした。ＧＦＰ陽性細胞は、ＣＲＩＳＰＲプラスミド取込みを示し、蛍光色素染色は死細胞を示した。

【0147】

結果は、図８および図９に示される。図８は、４つのプラスミド濃度の各々で得られたＧＦＰ陽性細胞のパーセントを示し、図９は、各濃度でのＧＦＰ陽性細胞の平均パーセントを示し、標準偏差エラーバーが表示されている。ＧＦＰ陽性細胞のパーセントは、バックグラウンドよりも高く、細胞がＣＲＩＳＰＲプラスミドを取り込み、発現したことを示す。また、得られたデータは、表２に要約されている。

【表2】

【0148】

得られたシングレット細胞数のデータは、表３に示される。

【表3】

【0149】

処理後の細胞死率は低いままである。図１０は、４つのプラスミド濃度の各々の死細胞のパーセントを示す。また、得られたデータは、表４に要約されている。

【表4】

【0150】

ＧＦＰ陽性細胞パーセントの傾向は、プラスミド濃度と共に増加し、バックグラウンド陰性対照よりも高く、このことより、ソノポレーションを使用してＣＲＩＳＰＲプラスミドをトランスフェクトすることができることが確認される。トランスフェクション成功率の増加は、例えば、ソノポレーションを使用して、リボ核タンパク質を標的細胞内に導入することを含む技法など、プラスミドに基づかない方法を使用することにより可能であるはずである。

【0151】

（実施例６）
この例には、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｓｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）から得たＡｌｔ−Ｒ（商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９ヌクレアーゼ３ＮＬＳ、ならびにＨＰＲＴ遺伝子を標的とするＡｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ＨＰＲＴ陽性対照ｃｒＲＮＡ、Ａｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９陰性対照ｃｒＲＮＡ、および無ヌクレアーゼ緩衝液を含むＡｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９キット（これもＩＤＴから得た）を使用した、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡリボヌクレオチド（ＲＮＰ）によるＨＥＫ−２９３細胞のトランスフェクションが記載されている。ｃｒＲＮＡと複合体形成するための蛍光標識ｔｒａｃｒＲＮＡを、別々に得た（ＡＴＴＯ（商標）５５０にコンジュゲートされたＡｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡ、これもＩＤＴから得た）。

【0152】

（ａ）マイクロバブル／ＤＰＢＳ分散物の調製：これは、マイクロバブル／ＤＰＢＳ分散物を調製するための一般的プロトコールに記載されている方法の改変版である。Ｔａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ ＳＡマイクロバブル分散物を含むバイアル（濃度２×１０^９マイクロバブル／ｍＬ）を、混合物が均一に混濁するようにみえるまで、１０秒間穏やかに振盪し、反転した。５０μＬのＴａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ ＳＡ分散物を抽出し、新しい１．５ｍＬチューブに導入した。９５０μＬのＤＰＢＳを添加し、分散物を穏やかに混合した。その後、混合物を、室温で直立させて２分間インキュベートし、その後Ｍｉｎｉｆｕｇｅ（登録商標）で２分間遠心分離して、マイクロバブルを分散液から分離した。注射針を使用して、マイクロバブルの白色ケークの下にある下澄みを、容積が５０μＬに達するまでゆっくりと除去した。

【0153】

（ｂ）マイクロバブルとビオチン化抗体とのコンジュゲーション：これは、マイクロバブルをビオチン化抗体にコンジュゲーションするための、一般的プロトコールに記載されている方法の改変版である。５μｇの抗ＣＤ５１ビオチン化抗体（つまり、１０μＬの０．５μｇ／μＬ溶液）を５０μＬのマイクロバブル／ＤＰＢＳ分散物に添加した。抗ＣＤ５１抗体のＴａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ ＳＡマイクロバブルに対する質量／個数比は、１：２×１０^７だった。バイアルを、穏やかに撹拌しながら室温で約２０分間インキュベートした。

【0154】

（ｃ）ガイドＲＮＡの形成：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、２００μＭにてＩＤＴ無ヌクレアーゼ二重鎖緩衝液に懸濁した。ｃｒＲＮＡを１：１の等モル比で組み合わせ、ガイドＲＮＡ終濃度は１００μＭだった（表５）。

【表5】

【0155】

混合物を９５℃で５分間加熱し、その後熱から取り外し、室温へ冷却させた。

【0156】

（ｄ）ＲＮＰ複合体の形成：Ｃａｓ９をガイドＲＮＡと組み合わせて、Ａｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ユーザーガイドに記載されているように、ＲＮＰを生成した。手短に言えば、ソノポレーションを受けた各ウェルについて、ガイドＲＮＡ（つまり、上記のステップで調製されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖）をＤＰＢＳで希釈し、Ｃａｓ９を、最後にゆっくりと約１：１．１５のＣａｓ９：ｇＲＮＡモル比で添加した。その後、混合物を室温で２０分間インキュベートした。濃度は、以下の通りだった。

【表6】

【0157】

（ｅ）負荷マイクロバブルの調製：抗体−マイクロスフェアコンジュゲート（「ａＣＤ５１ Ｔａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ」）を含むバイアルを穏やかに弾いて混合した。その後、抗体−マイクロスフェアコンジュゲートを、上記のステップで調製したＲＮＰと組み合わせ、２０分間インキュベートし、その後ＤＰＢＳで希釈して、４μＭ ＲＮＰおよび５×１０^８マイクロバブル（ｍｂ）／ｍＬの終濃度にした。

【表7】

【0158】

（ｆ）ａＣＤ５１ ＴａｒｇｅｓｐｈｅｒｅとＨＥＫ−２９３細胞とのインキュベーション：増殖培地（一般的プロトコールを参照）を、ＨＥＫ−２９３細胞からピペット操作で除去した。ａＣＤ５１ Ｔａｒｇｅｓｐｈｅｒｅ（つまり、抗体コンジュゲートマイクロバブル）をピペットで吸引排出してよく混合した。その後、２５μＬのａＣＤ５１ Ｔａｒｇｅｓｐｈｅｒｅを、組織培養コーティングでコーティングされた３８４ウェルポリプロピレンマイクロウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。プレートを、上下逆さまに裏返して、ａＣＤ５１ Ｔａｒｇｅｓｐｈｅｒｅと細胞との結合を促進し、３７℃のインキュベーターに５分間入れた。

【0159】

（ｇ）ソノポレーション：逆ピペット操作（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）を使用して、予め加温しておいた７５μＬの完全増殖培地を各ウェルに添加し、１ウェル当たりの合計流体容積を１００μＬとし、ＲＮＰ濃度を１μＭにした。２．２５ＭＨｚの変換器、０．５”の口径、および１インチの焦点距離（Ｆ値は２）を使用して、ソノポレーションを実施した。変換器を作動させて、各レザバーを、約１０Ｈｚのバースト反復率の３００回のトーンバーストで照射した。これは、トーンバーストが０．１秒間隔だったことを意味する。各トーンバーストは、およそ（８／２．２５）３．５μｓのトーンバースト継続期間に相当する、８サイクルの出力で構成されていた。ＲＦ周波数は、バースト出力の全体にわたって一定だった。

【0160】

（ｈ）分析：ＣＲＩＳＰＲ編集の成功率は、ＨＰＲＴ遺伝子内に導入されたインデルの数を測定することにより評価した。「インデル」は、ヌクレオチドの挿入または欠失により引き起こされるＤＮＡ配列の変化である。これは、ヘリックスの両鎖が互いに完全に塩基対合しない場合（つまり、片方がインデルを含む場合）に二本鎖ＤＮＡが切断される、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）消化アッセイを使用して定量化した。Ｔ７Ｅ１による消化後、ＤＮＡは、インタクトのままであるかまたは２つのより小さな断片へと切断されるかのいずれかである。消化されたＤＮＡを、ゲル電気泳動を使用して分析して、断片をサイズで分離し、切断断片対全長断片の量を分析した。

【0161】

Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ ＣＲＩＳＰＲインデル検出アッセイ：細胞を、ＤＰＢＳで洗浄し、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液を使用して溶解した。得られたゲノムＤＮＡを、目的の部位（つまり、ＨＰＲＴ遺伝子座）を隣接するプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、９５℃に加熱して変性させ、その後ゆっくりと室温に冷却し、ミスマッチ対の形成を促進した。その後、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩを添加し、３７℃で１時間インキュベートして、＞１塩基対ミスマッチを有するあらゆる二本鎖ＤＮＡを切断した。その後、消化したＤＮＡを希釈し、ＣＲＩＳＰＲ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙゲルキットを使用して、ＡＡＴＩ断片アナライザーに流して、切断パーセントを測定した。

【0162】

切断パーセントを測定するために、ＡＡＴＩ ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアにより、存在する「全長」ＤＮＡの量を、より小さな「断片１」および「断片２」のバンドで見出された量と比較した。この切断パーセントは、細胞集団中のＣＲＩＳＰＲにより実施された編集パーセントの代理指標である。しかしながら、Ｔ７Ｅ１酵素は、ＣＲＩＳＰＲ編集事象の最大３０％を占める場合がある１塩基対インデルを検出することができない。したがって、このアッセイにより測定される切断パーセントは、インデル形成の真の割合を著しく過小評価する。

【0163】

【化1】

【0164】

実験作業を繰り返し、第２のセットの結果を生成した。２つの実験は、下記ではラン１およびラン２と呼ばれる。

【0165】

結果：図１１は、ラン１のミスマッチ切断アッセイおよび分析の結果を示すキャピラリー電気泳動ゲルを示し、図１２は、ラン２の結果を提供するキャピラリー電気泳動ゲルである。１，０８３ｂｐ断片は全長ＰＣＲ産物であり、「断片１」は８２７ｂｐであり、「断片２」は、２５６ｂｐである。両図は、実験試料には切断があり、対照はすべて切断を欠如したことを示し、ＣＲＩＳＰＲトランスフェクションおよび編集が成功したことを示す。表８は、各ランの切断パーセントを示す。

【表8】

【0166】

切断パーセント結果は、図１３の棒グラフにも示されており、この図では、より暗色のバーは、ラン１の結果を表わし、より明色のバーは、ラン２の結果を表わす。

【0167】

図１４は、標識ｔｒａｃｒＲＮＡを検出するためにＲＦＰライトキューブを備えたＥＶＯＳ蛍光顕微鏡を使用して、ラン２で得られた蛍光画像である。この画像に見ることができるように、ＨＰＲＴおよび非標的化ＲＮＰは、実験条件下で細胞へのトランスフェクトが成功したが、陰性対照条件は、非常に低い取込みをもたらした。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】